WO2017199418A1 - Ａｄａｍｔｓ５遺伝子の定量方法、プライマー対、プライマー対とプローブとの組合せ、及びキット - Google Patents

Ａｄａｍｔｓ５遺伝子の定量方法、プライマー対、プライマー対とプローブとの組合せ、及びキット Download PDF

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憲政 津坂
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株式会社ケイティーバイオ
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Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying ADAMTS5 gene in a sample by quantitative PCR, a primer pair used for quantifying ADAMTS5 gene in a sample by quantitative PCR, a combination of a primer pair and a probe, and quantification of ADAMTS5 gene in a sample by quantitative PCR. It relates to a kit used for the above.
  • ADAMTS a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5 is an enzyme related to cartilage destruction belonging to the ADAMTS family.
  • ADAMTS5 serves as an index for evaluating whether anti-TNF ⁇ antibody drugs are effective against rheumatoid arthritis (see, for example, Patent Documents 1 and 2).
  • gene mRNA is quantified using real-time PCR.
  • it is also expressed by the ratio of the amount of mRNA of the ADAMTS5 gene to the amount of mRNA of the control gene such as mRNA of the ⁇ -actin gene (hereinafter sometimes referred to as “relative ratio”).
  • relative ratio the ratio of the amount of mRNA of the ADAMTS5 gene to the amount of mRNA of the control gene such as mRNA of the ⁇ -actin gene
  • the MGB probe has an advantage that a probe having a Tm value of 70 ° C. can be designed with a length of 20 bases or less due to the MGB (minor groove binder) structure which is a Tm enhancer.
  • MGB minimum groove binder
  • ADAMTS5 gene content is an index for predicting drug efficacy, development of a method that can be measured with higher sensitivity is required.
  • the present invention provides an ADAMTS5 gene quantification method capable of performing quantification of an ADAMTS5 gene in a sample at a low cost and with high sensitivity, and a primer pair, a primer pair and a probe that can be suitably used in the quantification method. And a kit is provided.
  • Means for solving the problems are as follows. That is, ⁇ 1> including a step of measuring the amount of ADAMTS5 gene in the sample by quantitative PCR, As a primer pair for amplification for amplifying a region containing the ADAMTS5 gene, a primer consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 below and a primer consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 below are used. Is a method for quantifying ADAMTS5 gene.
  • a primer pair used for quantification of ADAMTS5 gene in a sample by quantitative PCR is a primer pair comprising a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 below and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 below.
  • a combination of a primer pair and a probe used for quantification of ADAMTS5 gene in a sample by quantitative PCR The primer pair is the primer pair described in ⁇ 2>, A combination of a primer pair and a probe, wherein the probe is a probe having a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 below.
  • the said various problems in the past can be solved, the said objective can be achieved, and the quantification method of ADAMTS5 gene which can implement
  • a primer pair, a combination of a primer pair and a probe, and a kit that can be suitably used for the quantification method can be provided.
  • FIG. 1A is a diagram showing an amplification curve obtained by real-time PCR in Test Example 1-1.
  • FIG. 1B is a diagram showing an amplification curve obtained by real-time PCR in Test Example 1-3.
  • FIG. 2A is a diagram showing an amplification curve obtained by real-time PCR in Test Example 2-1.
  • FIG. 2B is a diagram showing an amplification curve obtained by real-time PCR in Test Example 2-3.
  • the ADAMTS5 gene quantification method of the present invention includes at least a step of measuring the amount of ADAMTS5 gene (hereinafter sometimes referred to as “ADAMTS5 gene amount measurement step”), and further includes other steps as necessary.
  • the ADAMTS5 gene amount measuring step is a step of measuring the amount of ADAMTS5 gene in a sample by quantitative PCR.
  • the ADAMTS5 gene amount measurement step the amount of mRNA of the ADAMTS5 gene in the sample is quantified.
  • the sample is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • Examples thereof include peripheral blood, joint synovium, joint fluid, a sample obtained by extracting RNA from these, a sample obtained by using the RNA as cDNA, and the like.
  • peripheral blood, a sample obtained by extracting RNA from the peripheral blood, and a sample obtained by using the RNA as cDNA are preferable in terms of easy collection.
  • ADAMTS5 gene a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs
  • the base sequence of the ADAMTS5 gene is known, and the base sequence can be easily obtained through a public database such as GenBank (NCBI).
  • GenBank GenBank
  • the base sequence of the human ADAMTS5 gene is available as NCBI accession number NM_007038.3.
  • ADAMTS5 gene primer pair an amplification primer pair that amplifies a region containing the ADAMTS5 gene of the present invention.
  • the ADAMTS5 gene primer pair is composed of a forward primer composed of a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 below and a reverse primer composed of a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 below.
  • 5′-CTAAGCCCTGGTCCAAATGC-3 ′ (SEQ ID NO: 2)
  • 5′-CCAGCAAACAGTTACCATGC-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 corresponds to the 2nd to 149th to 2129th bases of NCBI accession number NM_007038.3 and corresponds to a part of exon 3 and a part of exon 4 To do.
  • “CCAGCAAACAGTTAC” on the 5 ′ end side corresponds to exon 3
  • “CATGGGC” on the 3 ′ end side corresponds to exon 4.
  • the method for producing the ADAMTS5 gene primer pair is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, it can be produced by chemical synthesis.
  • the ADAMTS5 gene detection probe is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, a probe having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 is preferred. 5′-TTCAGCCCACCATCACAGAATTCCTGGA-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
  • the ADAMTS5 gene detection probe preferably has its 5 'end modified with a reporter dye and its 3' end modified with a quencher dye.
  • the combination of the reporter dye and the quencher dye is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • the method for producing the ADAMTS5 gene detection probe is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, it can be produced by chemical synthesis.
  • the quantitative PCR is not particularly limited as long as the ADAMTS5 gene primer pair is used, and can be appropriately selected according to the purpose. Real-time PCR using a fluorescent probe is preferable, and the ADAMTS5 gene detection probe. Real-time PCR using is more preferable. In the quantitative PCR, it is possible to quantify at least one of the absolute amount of ADAMTS5 gene and the relative amount with respect to a control gene described later (amount of ADAMTS5 gene / amount of control gene).
  • reaction conditions for the quantitative PCR are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • reaction reagent used in the real-time PCR is not particularly limited, and a known reagent can be appropriately selected according to the purpose, but Premix Ex Taq (Probe qPCR) manufactured by Takara Bio Inc. is used. preferable.
  • the amount of template DNA used for the real-time PCR is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the reaction time of the real-time PCR is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • (2) The number of cycles at 95 ° C. for 15 seconds and then 60 ° C. for 60 seconds is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably about 50 cycles.
  • the calibration curve method is a method of creating a calibration curve and quantifying a sample from the calibration curve.
  • the DNA used as a template for the control curve of the calibration curve method is not particularly limited as long as the concentration is known, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, it is collected from a healthy person, and if necessary Examples include purified ADAMTS5 total cDNA and plasmids incorporating the ADAMTS5 cDNA.
  • the real-time PCR may be one that performs a reverse transcription reaction in a real-time PCR apparatus, or may be one that uses cDNA prepared in advance.
  • the apparatus used for the quantitative PCR is not particularly limited, and a known apparatus can be appropriately selected according to the purpose.
  • control gene also referred to as “gene used as an internal standard”
  • control gene amount measurement step a control gene amount measurement step
  • Control gene dosage measurement process is a step of measuring the amount of the control gene in the sample by quantitative PCR. In the control gene amount measurement step, the amount of the control gene mRNA in the sample is quantified.
  • sample-sample- The sample is the same as ⁇ Sample >> in the item of ⁇ ADAMTS5 gene dosage measurement step> described above.
  • control gene is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a ⁇ -actin gene and a GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) gene. Of these, ⁇ -actin gene is preferred.
  • the base sequence of the ⁇ -actin gene is known, and the base sequence can be easily obtained through a public database such as GenBank (NCBI).
  • NCBI GenBank
  • the base sequence of the human ⁇ -actin gene can be obtained from NCBI accession number NM — 001101.2.
  • the primer pair used for the quantitative PCR of the ⁇ -actin gene is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the following primer pair for amplification amplifying a region containing the ⁇ -actin gene
  • the probe used for the quantitative PCR of the ⁇ -actin gene is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, the following probes for detecting the ⁇ -actin gene are preferable.
  • the combination of the primer pair used for quantitative PCR of the ⁇ -actin gene and the probe is not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose.
  • the following primer pair for ⁇ -actin gene The combination with the ⁇ -actin gene detection probe is preferred.
  • the primer pair for ⁇ -actin gene consists of a forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 below and a reverse primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 below.
  • 5′-CCAGCTCACCATGGATGATG-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
  • 5′-CCTTGCCACATGCCGGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 corresponds to the 64th to 83rd bases of NCBI accession number NM — 001101.2, and corresponds to a part of exon 1 and a part of exon 2.
  • “CCAG” on the 5 ′ end side corresponds to exon 1
  • CTCACCCATGGATGATG” on the 3 ′ end side corresponds to exon 2.
  • the method for producing the ⁇ -actin gene primer pair is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, it can be produced by chemical synthesis.
  • the ⁇ -actin gene detection probe has a base sequence represented by SEQ ID NO: 8 below. 5′-CCCGCGCTCGTCGCGACAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 8)
  • the ⁇ -actin gene detection probe preferably has its 5 ′ end modified with a reporter dye and its 3 ′ end modified with a quencher dye.
  • the combination of the reporter dye and the quencher dye is the same as that described above in the section of “ADAMTS5 gene detection probe” in ⁇ ADAMTS5 gene dosage measurement step>.
  • the method for producing the ⁇ -actin gene detection probe is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, it can be produced by chemical synthesis.
  • the quantitative PCR of the ⁇ -actin gene is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Real-time PCR using a fluorescent probe is preferable.
  • the absolute amount of ⁇ -actin gene can be quantified by quantitative PCR of the ⁇ -actin gene. It can also be used for quantification of the relative amount of the ADAMTS5 gene in the sample.
  • reaction conditions for the quantitative PCR of the ⁇ -actin gene are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • reaction reagent used for the real-time PCR of the ⁇ -actin gene is not particularly limited, and a known reagent can be appropriately selected according to the purpose, but Premix Ex Taq (Probe qPCR manufactured by Takara Bio Inc.). ) Is preferably used.
  • the amount of template DNA used for the real-time PCR of the ⁇ -actin gene is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the amount of the forward primer used for real-time PCR of the ⁇ -actin gene is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but the final concentration is preferably about 900 nM.
  • the amount of the reverse primer used for real-time PCR of the ⁇ -actin gene is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but the final concentration is preferably about 300 nM.
  • the amount of the probe used for real-time PCR of the ⁇ -actin gene is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but the final concentration is preferably about 50 nM.
  • the reaction time of the ⁇ -actin gene real-time PCR is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • (2) The number of cycles at 95 ° C. for 15 seconds and then 60 ° C. for 60 seconds is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably about 50 cycles.
  • the method for quantifying the ⁇ -actin gene by real-time PCR is the same as that described in the section of “Quantitative PCR-” in the above-mentioned ⁇ ADAMTS5 gene amount measurement step>.
  • the real-time PCR of the ⁇ -actin gene may be one that performs a reverse transcription reaction in a real-time PCR apparatus, or one that uses cDNA prepared in advance.
  • the apparatus used for quantitative PCR of the ⁇ -actin gene is not particularly limited, and a known apparatus can be appropriately selected according to the purpose.
  • the primer pair of the present invention is a primer pair used for quantification of ADAMTS5 gene in a sample by quantitative PCR.
  • the primer pair is the same as that described in the above-mentioned (ADAMTS5 gene amount measurement step)-ADAMTS5 gene primer pair- in the ⁇ ADAMTS5 gene amount measurement step>.
  • the combination of the primer pair and the probe of the present invention is a combination of the primer pair and the probe used for quantification of the ADAMTS5 gene in the sample by quantitative PCR.
  • the primer pair is the same as that described in the above-mentioned (ADAMTS5 gene amount measurement step)-ADAMTS5 gene primer pair- in the ⁇ ADAMTS5 gene amount measurement step>.
  • the probe is the same as that described in the section “ADAMTS5 gene detection step” in ⁇ ADAMTS5 gene amount measurement step> in the above (ADAMTS5 gene quantification method).
  • kit The kit of the present invention is a kit used for quantification of ADAMTS5 gene in a sample by quantitative PCR, and includes at least the primer pair of the present invention, and further includes other components such as a probe as necessary.
  • the primer pair is the above-described ADAMTS5 gene primer pair of the present invention.
  • the other configuration is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • a region containing a probe for detecting ADAMTS5 gene and a control gene is amplified.
  • examples include amplification primer pairs (hereinafter sometimes referred to as “control gene primer pairs”), control gene detection probes, reagents used in PCR, and the like.
  • a probe for detecting ADAMTS5 gene >> The probe is the same as that described in the section “ADAMTS5 gene detection step” in ⁇ ADAMTS5 gene amount measurement step> in the above (ADAMTS5 gene quantification method).
  • Control gene primer pair, control gene detection probe The control gene is the same as that described in the item “Control gene” of ⁇ Control gene amount measurement step >> of ⁇ Other steps> of (ADAMTS5 gene quantification method) described above, and preferred genes are also the same. It is.
  • the kit preferably includes the ADAMTS5 gene detection probe as the other configuration, more preferably includes the ADAMTS5 gene detection probe, and the ⁇ -actin gene primer pair, and the ADAMTS5 gene. It is preferable that a detection probe for the ⁇ -actin gene, a primer pair for the ⁇ -actin gene, and a probe for detection of the ⁇ -actin gene.
  • the primer pair for the ⁇ -actin gene and the probe for detecting the ⁇ -actin gene are the same as those in ⁇ the other step> ⁇ the control gene amount measurement step >> in the above (Method for quantifying ADAMTS5 gene). This is the same as that described in the section of the primer pair for ⁇ -actin gene and the probe for detecting ⁇ -actin gene.
  • ADAMTS5 gene cDNA a DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 was inserted into a plasmid, followed by restriction enzyme treatment.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 corresponds to the 1,914th to 2,343rd (430 bp) bases of ADAMTS5 (NCBI Reference Sequence: NM_007038.3).
  • Preparation Example 2 Preparation of ADAMTS5 gene primer pair and probe
  • the following were prepared by chemical synthesis as a primer pair for amplification for amplifying a region containing the ADAMTS5 gene and a probe for detection of the ADAMTS5 gene.
  • ⁇ -actin gene cDNA a DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 was inserted into a plasmid, followed by restriction enzyme treatment.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 corresponds to the third to 469th (467 bp) bases of ⁇ -actin (NCBI Reference Sequence: NM — 001101.2).
  • Test Example 1 Quantification by real-time PCR
  • ADAMTS5 gene cDNA prepared in Preparation Example 1 was diluted to 1.0 ⁇ g / mL, 1.0 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ g / mL, or 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 ⁇ g / mL.
  • a primer pair and a probe the ADAMTS5 gene primer pair (SEQ ID NO: 2, 3) and probe (SEQ ID NO: 4) prepared in Preparation Example 2 were used.
  • Real-time PCR was performed using ABI PRISM 7000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) under the reaction conditions described in Table 1-1 and the reaction conditions described below.
  • the amplification curve obtained by the real-time PCR is shown in FIG. 1A (horizontal axis: number of cycles, vertical axis: fluorescence signal ( ⁇ Rn) corresponding to the amplified PCR product).
  • the solid line shows the results when 1.0 ⁇ g / mL of the control DNA was used
  • the dotted line shows the results when 1.0 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ g / mL of the control DNA was used
  • the one-dot chain line is The results in the case of using 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 ⁇ g / mL of control DNA are shown, and the lines with arrows at both ends indicate the baseline (Threshold Line).
  • a calibration curve was prepared by taking the concentration of control DNA on the vertical axis and the Ct value (number of cycles corresponding to Threshold) on the horizontal axis.
  • Example 1 Two types of healthy human cDNA (hereinafter sometimes referred to as “sample 1” and “sample 2”) were prepared, and this was diluted two times to prepare a sample.
  • a primer pair and a probe the ADAMTS5 gene primer pair (SEQ ID NO: 2, 3) and probe (SEQ ID NO: 4) prepared in Preparation Example 2 were used.
  • Real-time PCR was performed in the same manner as in Test Example 1-1 except that the control DNA in Test Example 1-1 was changed to Sample 1 or 2 as the reaction conditions for real-time PCR.
  • the ⁇ -actin gene cDNA prepared in Preparation Example 3 should be 1.0 ⁇ g / mL, 1.0 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ g / mL, or 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 ⁇ g / mL. The diluted one was used.
  • the primer pair (SEQ ID NO: 6, 7) and probe (SEQ ID NO: 8) for ⁇ -actin gene prepared in Preparation Example 4 were used.
  • Real-time PCR was performed using ABI PRISM 7000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) under the reaction conditions described in Table 1-2 and the reaction conditions described below.
  • the amplification curve obtained by the real-time PCR is shown in FIG. 1B (horizontal axis: number of cycles, vertical axis: fluorescence signal ( ⁇ Rn) corresponding to the amplified PCR product).
  • the solid line shows the results when 1.0 ⁇ g / mL of the control DNA was used
  • the dotted line shows the results when 1.0 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ g / mL of the control DNA was used
  • the one-dot chain line shows The results in the case of using 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 ⁇ g / mL of control DNA are shown, and the lines with arrows at both ends indicate the baseline (Threshold Line).
  • a calibration curve was prepared by taking the concentration of control DNA on the vertical axis and the Ct value (number of cycles corresponding to Threshold) on the horizontal axis.
  • the relative ratio (Index) of ADAMTS5 mRNA amount to ⁇ -actin mRNA amount in 2 types of healthy human cDNA is 2.14 Index in Sample 1. In Sample 2, it was 3.41 Index.
  • Test Example 2 Quantification by real-time PCR
  • ADAMTS5 gene cDNA prepared in Preparation Example 1 was diluted to 1.0 ⁇ g / mL, 1.0 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ g / mL, or 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 ⁇ g / mL. We used what we did.
  • a primer pair and a probe As a primer pair and a probe, a primer pair and probe set for ADAMTS5 gene (catalog number Hs00199841_m1; probe is MGB probe; primer and probe sequences are not disclosed) manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. were used. Real-time PCR was performed using ABI PRISM 7000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) under the reaction conditions described in Table 2-1 and the reaction conditions described below.
  • the amplification curve obtained by the real-time PCR is shown in FIG. 2A (horizontal axis: number of cycles, vertical axis: fluorescence signal ( ⁇ Rn) corresponding to the amplified PCR product).
  • the solid line shows the results when 1.0 ⁇ g / mL of the control DNA was used
  • the dotted line shows the results when 1.0 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ g / mL of the control DNA was used
  • the one-dot chain line shows The results in the case of using 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 ⁇ g / mL of control DNA are shown, and the lines with arrows at both ends indicate the baseline (Threshold Line).
  • a calibration curve was prepared by taking the concentration of control DNA on the vertical axis and the Ct value (number of cycles corresponding to Threshold) on the horizontal axis.
  • a primer pair and a probe As a primer pair and a probe, a primer pair and a probe set for ADAMTS5 gene (Catalog No. Hs00199841_m1; a probe is an MGB probe; a primer and a probe are not sequenced). Public) was used.
  • Real-time PCR was performed in the same manner as in Test Example 2-1, except that the control DNA in Test Example 2-1 was replaced with Sample 1 or 2.
  • the ⁇ -actin gene cDNA prepared in Preparation Example 3 should be 1.0 ⁇ g / mL, 1.0 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ g / mL, or 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 ⁇ g / mL.
  • the diluted one was used.
  • a primer pair and a probe a primer pair and probe set (catalog number 4333762F; probe is MGB probe; primer and probe sequences are not disclosed) manufactured by Thermo Fisher Scientific, Inc. were used.
  • Real-time PCR was performed using ABI PRISM 7000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) under the reaction conditions described in Table 2-2 and the reaction conditions described below.
  • the amplification curve obtained by the real-time PCR is shown in FIG. 2B (horizontal axis: cycle number, vertical axis: fluorescence signal ( ⁇ Rn) corresponding to the amplified PCR product).
  • the solid line shows the results when 1.0 ⁇ g / mL of the control DNA was used
  • the dotted line shows the results when 1.0 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ g / mL of the control DNA was used
  • the one-dot chain line shows The results in the case of using 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 ⁇ g / mL of control DNA are shown, and the lines with arrows at both ends indicate the baseline (Threshold Line).
  • a calibration curve was prepared by taking the concentration of control DNA on the vertical axis and the Ct value (number of cycles corresponding to Threshold) on the horizontal axis.
  • ⁇ Test Example 2-4 Two types of healthy human cDNAs (Sample 1 and Sample 2) were prepared and diluted 50 times to obtain samples.
  • the primer pair and probe, ⁇ -actin gene primer pair and probe set manufactured by Thermo Fisher Scientific (catalog number 4333762F; the probe is an MGB probe; primer and probe sequences) was not published).
  • Real-time PCR was performed in the same manner as in Test Example 2-3 except that the control DNA in Test Example 2-3 was changed to Sample 1 or 2 as the reaction conditions for real-time PCR.
  • the relative ratio (Index) of ADAMTS5 mRNA amount to ⁇ -actin mRNA amount in 2 types of healthy human cDNA is 2.77 Index in Sample 1. In Sample 2, it was 3.58 Index.
  • the ADAMTS gene expression level (Index value) (Test Example 1) in the cDNA of a healthy person quantified by real-time PCR using the primer pair and probe combination of the present invention is the commercially available MGB.
  • the expression level (Index value) of the ADAMTS5 gene in cDNA of a healthy person quantified by real-time PCR using a probe was almost the same value as Test Example 2. Therefore, by using the combination of the primer pair and the probe of the present invention, the relative ratio of the ADAMTS5 mRNA amount to the ⁇ -actin mRNA amount is lower than that in the case of using the conventional high-cost MGB probe, and the same. It was shown that it can be quantified by performance.
  • ADAMTS5 gene primer pair SEQ ID NO: 2, 3
  • probe SEQ ID NO: 4
  • Preparation Example 2 ADAMTS5 gene primer pair and probe set
  • commercially available ADAMTS5 gene primer pair and probe set manufactured by Thermo Fisher Scientific, The performance of real-time PCR was compared as follows for catalog number Hs00199841_m1; probe was MGB probe; primer and probe sequences were not disclosed.
  • ⁇ Test Example 3-2 Commercially available primer pair and probe> Real-time PCR was performed in the same manner as in Test Example 2-1. The control DNA at each concentration was subjected to real-time PCR five times, and the Ct value was determined for each. The results are shown in Table 4.
  • Test Example 3 From the results of Test Example 3, the Ct value when the control DNA at a low concentration (1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 ⁇ g / mL) was used as the sample DNA was obtained when the combination of the primer pair and the probe of the present invention was used (test Example 3-1: 32.32) was significantly lower (p ⁇ 0.01) than when a commercially available primer pair and probe combination was used (Test Example 3-2: 34.84). Therefore, it was shown that by using the combination of the primer pair and the probe of the present invention, the absolute amount of ADAMTS5 mRNA can be detected with higher sensitivity than in the case of using the conventional MGB probe.
  • Examples of the aspect of the present invention include the following. ⁇ 1> including a step of measuring the amount of ADAMTS5 gene in the sample by quantitative PCR, As a primer pair for amplification for amplifying a region containing the ADAMTS5 gene, a primer consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 below and a primer consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 below are used. Is a method for quantifying ADAMTS5 gene.
  • ADAMTS5 gene quantification method according to ⁇ 1>, wherein a probe having a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 is used as the ADAMTS5 gene detection probe.
  • the method includes a step of measuring the amount of ⁇ -actin gene in the sample by quantitative PCR, As an amplification primer pair for amplifying the region containing the ⁇ -actin gene, a primer consisting of a base sequence represented by the following SEQ ID NO: 6 and a primer consisting of the base sequence represented by the following SEQ ID NO: 7
  • the method for quantifying an ADAMTS5 gene according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 2>.
  • ⁇ 5> The method for quantifying ADAMTS5 gene according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the amount of ADAMTS5 gene to be quantified is at least one of an absolute amount and a relative amount with respect to the amount of ⁇ -actin gene It is.
  • a primer pair used for quantification of ADAMTS5 gene in a sample by quantitative PCR The primer pair is a primer pair comprising a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 below and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 below.
  • kits used for quantification of ADAMTS5 gene in a sample by quantitative PCR A kit comprising the primer pair according to ⁇ 6> above.
  • kit according to ⁇ 8> further including a probe having a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 below as a probe for detecting the ADAMTS5 gene.
  • amplification primer pair for amplifying a region containing the ⁇ -actin gene a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 below and a base sequence represented by SEQ ID NO: 7 below
  • 5′-CCAGCTCACCATGGATGATG-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
  • 5′-CCTTGCCACATGCCGGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 7)
  • 5′-CCCGCGCTCGTCGCGACAAC-3 ′ SEQ ID NO: 8
  • the ADAMTS5 gene in a sample can be quantified at low cost and with high sensitivity. Therefore, the efficacy of a drug using the amount of the ADAMTS5 gene in the sample as an index. It can be suitably used for prediction and the like.
  • the primer pair of the present invention, the combination of the primer pair and the probe, and the kit can be suitably used for the ADAMTS5 gene quantification method of the present invention.
  • Examples of drug efficacy prediction using the amount of ADAMTS5 gene in the sample as an index include a method of evaluating whether or not an anti-TNF ⁇ antibody drug is effective against rheumatoid arthritis.
  • an anti-TNF ⁇ antibody drug is effective against rheumatoid arthritis.
  • the expression level of ADAMTS5 mRNA is 0.6 ⁇ 1/25. If smaller, it can be assessed that infliximab is effective against rheumatoid arthritis.
  • the ADAMTS5 mRNA expression level (ADAMTS5 mRNA expression level / ⁇ -actin mRNA expression level) is 4.0 ⁇ 10 ⁇ 4 or more. Therefore, it can be evaluated that adalimumab is effective against rheumatoid arthritis.

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Abstract

定量ＰＣＲにより、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を測定する工程を含み、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーと、配列番号：３で表される塩基配列からなるプライマーとを用いるＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法などである。

Description

ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法、プライマー対、プライマー対とプローブとの組合せ、及びキット
　本発明は、定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法、定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対、プライマー対とプローブとの組合せ、及び定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるキットに関する。
　ＡＤＡＭＴＳ（ａ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｍｏｔｉｆｓ）５は、ＡＤＡＭＴＳファミリーに属する軟骨破壊に関連する酵素である。
　前記ＡＤＡＭＴＳ５は、その含有量が、関節リウマチに対して抗ＴＮＦα抗体薬が有効か否かを評価する際の指標となることが知られている（例えば、特許文献１、２参照）。
　一般的に、遺伝子のｍＲＮＡの定量は、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる。前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子のｍＲＮＡを定量化する場合も、β－ａｃｔｉｎ遺伝子のｍＲＮＡ等のコントロール遺伝子のｍＲＮＡの量に対するＡＤＡＭＴＳ５遺伝子のｍＲＮＡの量の比（以下、「相対比」と称することがある）で表すことが多い。
　近年、リアルタイムＰＣＲの手法として、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ（サーモ・フィッシャーサイエンティフィック社製）を用いた手法が広く普及している。前記ＭＧＢプローブは、ＴｍエンハンサーであるＭＧＢ（Ｍｉｎｏｒ　Ｇｒｏｏｖｅ　Ｂｉｎｄｅｒ）構造により、Ｔｍ値７０℃のプローブを２０塩基以下の長さで設計することができるなどの利点を有する。
　しかしながら、前記ＭＧＢプローブを用いるとコストが高くなってしまうという問題がある。
　また、上述のように、ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の含有量は、薬効予測の指標となることから、より高感度に測定することができる方法の開発が求められている。
　したがって、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量を低コストで、かつ高感度に実施することができる方法は、未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。
国際公開第２０１０／０３８８４０号 特開２０１１－１０９９２９号公報
　本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量を低コストで、かつ高感度に実施することができるＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法、前記定量方法に好適に用いることができるプライマー対、プライマー対とプローブとの組合せ、及びキットを提供することを目的とする。
　前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
　＜１＞　定量ＰＣＲにより、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を測定する工程を含み、
　前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプライマーとを用いることを特徴とするＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法である。
　５’－ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ－３’　（配列番号：２）
　５’－ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ－３’　（配列番号：３）
　＜２＞　定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対であって、
　前記プライマー対が、下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とするプライマー対である。
　５’－ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ－３’　（配列番号：２）
　５’－ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ－３’　（配列番号：３）
　＜３＞　定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対とプローブとの組合せであって、
　前記プライマー対が、前記＜２＞に記載のプライマー対であり、
　前記プローブが、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブであることを特徴とするプライマー対とプローブとの組合せである。
　５’－ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ－３’　（配列番号：４）
　＜４＞　定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるキットであって、
　前記＜２＞に記載のプライマー対を含むことを特徴とするキットである。
　本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量を低コストで、かつ高感度に実施することができるＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法、前記定量方法に好適に用いることができるプライマー対、プライマー対とプローブとの組合せ、及びキットを提供することができる。
図１Ａは、試験例１－１におけるリアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を示す図である。 図１Ｂは、試験例１－３におけるリアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を示す図である。 図２Ａは、試験例２－１におけるリアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を示す図である。 図２Ｂは、試験例２－３におけるリアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を示す図である。
（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法）
　本発明のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法は、ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を測定する工程（以下、「ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程」と称することがある）を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞
　前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程は、定量ＰＣＲにより、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を測定する工程である。
　前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程では、前記試料中における前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子のｍＲＮＡの量が定量される。
＜＜試料＞＞
　前記試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、末梢血、関節滑膜、関節液、これらからＲＮＡを抽出した試料、前記ＲＮＡをｃＤＮＡとした試料などが挙げられる。これらの中でも、末梢血、前記末梢血からＲＮＡを抽出した試料、前記ＲＮＡをｃＤＮＡとした試料が、採取が簡便である点で、好ましい。
　前記試料の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ヒトが好ましい。
　前記末梢血、関節滑膜、関節液を調製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
　前記末梢血などからＲＮＡを抽出する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
　前記ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
＜＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子＞＞
　前記ＡＤＡＭＴＳ（ａ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｍｏｔｉｆｓ）５は、ＡＤＡＭＴＳファミリーに属する軟骨破壊に関連する酵素である。
　前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の塩基配列は公知であり、その塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる。例えば、ヒトＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＮＭ＿００７０３８．３で入手可能である。
＜＜定量ＰＣＲ＞＞
　前記定量ＰＣＲは、本発明のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対（以下、「ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対」と称することがある）を用いて行う。
－ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対－
　前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対は、下記配列番号：２で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるリバースプライマーとからなる。
　５’－ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ－３’　（配列番号：２）
　５’－ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ－３’　（配列番号：３）
　なお、配列番号：３で表される塩基配列は、ＮＣＢＩ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＮＭ＿００７０３８．３の２，１４９番目～２，１２９番目の塩基に相当し、エクソン３の一部とエクソン４の一部とに対応するものである。配列番号：３で表される塩基配列中、５’端側の「ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣ」はエクソン３に、３’端側の「ＣＡＴＧＧＣ」はエクソン４に対応する。
　前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により製造することができる。
－ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ－
　前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
　５’－ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ－３’　（配列番号：４）
　前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブは、その５’末端がレポーター色素で修飾されており、３’末端がクエンチャー色素で修飾されていることが好ましい。
　前記レポーター色素と、クエンチャー色素との組合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＡＭとＴＡＭＲＡとの組合せ、ＨＥＸとＴＡＭＲＡとの組合せ、ＴＥＴとＴＡＭＲＡとの組合せ、ＦＡＭとＢＨＱ１との組合せ、ＨＥＸとＢＨＱ１との組合せ、ＴＥＴとＢＨＱ１との組合せ、ＴＡＭＲＡとＢＨＱ２との組合せ、Ｃｙａｎｉｎｅ５とＢＨＱ３との組合せなどが挙げられる。
　前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により製造することができる。
－定量ＰＣＲ－
　前記定量ＰＣＲとしては、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対を用いる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲが好ましく、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブを用いたリアルタイムＰＣＲがより好ましい。
　前記定量ＰＣＲでは、ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の絶対量、及び後述するコントロール遺伝子に対する相対量（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量／コントロール遺伝子の量）の少なくともいずれかを定量することができる。
　前記定量ＰＣＲの反応条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　例えば、前記リアルタイムＰＣＲに用いる反応試薬としては、特に制限はなく、公知の試薬を目的に応じて適宜選択することができるが、タカラバイオ株式会社製のＰｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（Ｐｒｏｂｅ　ｑＰＣＲ）を用いることが好ましい。
　前記リアルタイムＰＣＲに用いる鋳型ＤＮＡの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記リアルタイムＰＣＲに用いる前記フォワードプライマーの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、最終濃度が９００ｎＭ程度が好ましい。
　前記リアルタイムＰＣＲに用いる前記リバースプライマーの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、最終濃度が３００ｎＭ程度が好ましい。
　前記リアルタイムＰＣＲに用いる前記プローブの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、最終濃度が７５ｎＭ程度が好ましい。
　前記リアルタイムＰＣＲの反応時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、（１）９５℃、３０秒間の後、（２）９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間を複数サイクル行うことが好ましい。
　前記（２）９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間のサイクル数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０サイクル程度が好ましい。
　前記リアルタイムＰＣＲによる定量方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、検量線法などが挙げられる。
　前記検量線法は、検量線を作成し、その検量線からサンプルの定量を行う方法である。
　前記検量線法のコントロールＤＮＡの鋳型として用いるＤＮＡとしては、濃度が既知であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、健常人から採取し、必要に応じて精製したＡＤＡＭＴＳ５の全ｃＤＮＡや、前記ＡＤＡＭＴＳ５　ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドなどが挙げられる。
　前記リアルタイムＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲの装置の中で逆転写反応を行うものであってもよいし、予め作製したｃＤＮＡを用いるものであってもよい。
　前記定量ＰＣＲに用いる装置としては、特に制限はなく、公知の装置を目的に応じて適宜選択することができる。
＜その他の工程＞
　前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コントロール遺伝子（「内部標準として用いる遺伝子」と称することもある）の量を測定する工程（以下、「コントロール遺伝子量測定工程」と称することがある）などが挙げられる。
＜＜コントロール遺伝子量測定工程＞＞
　前記コントロール遺伝子量測定工程は、定量ＰＣＲにより、試料中のコントロール遺伝子の量を測定する工程である。
　前記コントロール遺伝子量測定工程では、前記試料中における前記コントロール遺伝子のｍＲＮＡの量が定量される。
－試料－
　前記試料は、上記した＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞の項目における＜＜試料＞＞と同様である。
－コントロール遺伝子－
　前記コントロール遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、β－アクチン遺伝子、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子などが挙げられる。これらの中でも、β－アクチン遺伝子が、好ましい。
－－β－アクチン遺伝子－－
　前記β－アクチン遺伝子の塩基配列は公知であり、その塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる。例えば、ヒトβ－アクチン遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＮＭ＿００１１０１．２で入手可能である。
－－定量ＰＣＲ－－
　以下、前記コントロール遺伝子として、前記β－アクチン遺伝子を用いる場合の定量ＰＣＲについて説明する。
　前記β－アクチン遺伝子の定量ＰＣＲに用いるプライマー対としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下のβ－アクチン遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対（以下、「β－アクチン遺伝子用プライマー対」と称することがある）が好ましい。
　前記β－アクチン遺伝子の定量ＰＣＲに用いるプローブとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下のβ－アクチン遺伝子の検出用プローブが好ましい。
　前記β－アクチン遺伝子の定量ＰＣＲに用いるプライマー対と、プローブとの組合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下のβ－アクチン遺伝子用プライマー対と、以下のβ－アクチン遺伝子の検出用プローブとの組合せが好ましい。
－－－β－アクチン遺伝子用プライマー対－－－
　前記β－アクチン遺伝子用プライマー対は、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、下記配列番号：７で表される塩基配列からなるリバースプライマーとからなる。
　５’－ＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ－３’　（配列番号：６）
　５’－ＣＣＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧ－３’　（配列番号：７）
　なお、配列番号：６で表される塩基配列は、ＮＣＢＩ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＮＭ＿００１１０１．２の６４番目～８３番目の塩基に相当し、エクソン１の一部とエクソン２の一部とに対応するものである。配列番号：６で表される塩基配列中、５’端側の「ＣＣＡＧ」はエクソン１に、３’端側の「ＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ」はエクソン２に対応する。
　前記β－アクチン遺伝子用プライマー対の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により製造することができる。
－－－β－アクチン遺伝子の検出用プローブ－－－
　前記β－アクチン遺伝子の検出用プローブは、下記配列番号：８で表される塩基配列からなる。
　５’－ＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣ－３’　（配列番号：８）
　前記β－アクチン遺伝子の検出用プローブは、その５’末端がレポーター色素で修飾されており、３’末端がクエンチャー色素で修飾されていることが好ましい。
　前記レポーター色素と、クエンチャー色素との組合せは、上記した＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞の－ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ－の項目において記載したものと同様である。
　前記β－アクチン遺伝子の検出用プローブの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により製造することができる。
－－－定量ＰＣＲ－－－
　前記β－アクチン遺伝子の定量ＰＣＲとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲが好ましい。
　前記β－アクチン遺伝子の定量ＰＣＲにより、β－アクチン遺伝子の絶対量を定量することができる。また、上記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の前記試料における相対量の定量に用いることができる。
　前記β－アクチン遺伝子の定量ＰＣＲの反応条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　例えば、前記β－アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲに用いる反応試薬としては、特に制限はなく、公知の試薬を目的に応じて適宜選択することができるが、タカラバイオ株式会社製のＰｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（Ｐｒｏｂｅ　ｑＰＣＲ）を用いることが好ましい。
　前記β－アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲに用いる鋳型ＤＮＡの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記β－アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲに用いる前記フォワードプライマーの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、最終濃度が９００ｎＭ程度が好ましい。
　前記β－アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲに用いる前記リバースプライマーの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、最終濃度が３００ｎＭ程度が好ましい。
　前記β－アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲに用いる前記プローブの量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、最終濃度が５０ｎＭ程度が好ましい。
　前記β－アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲの反応時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、（１）９５℃、３０秒間の後、（２）９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間を複数サイクル行うことが好ましい。
　前記（２）９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間のサイクル数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０サイクル程度が好ましい。
　前記β－アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲによる定量方法は、上記した＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞の－定量ＰＣＲ－の項目において記載したものと同様である。
　前記β－アクチン遺伝子のリアルタイムＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲの装置の中で逆転写反応を行うものであってもよいし、予め作製したｃＤＮＡを用いるものであってもよい。
　前記β－アクチン遺伝子の定量ＰＣＲに用いる装置としては、特に制限はなく、公知の装置を目的に応じて適宜選択することができる。
（プライマー対）
　本発明のプライマー対は、定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対である。
＜プライマー対＞
　前記プライマー対は、上記した（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法）の＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞の－ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対－の項目に記載のものと同様である。
（プライマー対とプローブとの組合せ）
　本発明のプライマー対とプローブとの組合せは、定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対とプローブとの組合せである。
＜プライマー対＞
　前記プライマー対は、上記した（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法）の＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞の－ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対－の項目に記載のものと同様である。
＜プローブ＞
　前記プローブは、上記した（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法）の＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞の－ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ－の項目に記載のものと同様である。
（キット）
　本発明のキットは、定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるキットであって、本発明のプライマー対を少なくとも含み、必要に応じて更にプローブなどのその他の構成を含む。
＜本発明のプライマー対＞
　前記プライマー対は、上記した本発明のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対である。
＜その他の構成＞
　前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ、コントロール遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対（以下、「コントロール遺伝子用プライマー対」と称することがある）、コントロール遺伝子の検出用プローブ、ＰＣＲに用いる試薬などが挙げられる。
＜＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ＞＞
　前記プローブは、上記した（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法）の＜ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子量測定工程＞の－ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ－の項目に記載のものと同様である。
＜＜コントロール遺伝子用プライマー対、コントロール遺伝子の検出用プローブ＞＞
　前記コントロール遺伝子は、上記した（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法）の＜その他の工程＞の＜＜コントロール遺伝子量測定工程＞＞の－コントロール遺伝子－の項目に記載のものと同様であり、好ましい遺伝子も同様である。
　前記キットは、前記その他の構成として、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブを含むことが好ましく、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ、及び前記β－アクチン遺伝子用プライマー対を含むことがより好ましく、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブ、前記β－アクチン遺伝子用プライマー対、及び前記β－アクチン遺伝子の検出用プローブを含むことが好ましい。
　前記前記β－アクチン遺伝子用プライマー対、及び前記β－アクチン遺伝子の検出用プローブは、上記した（ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法）の＜その他の工程＞の＜＜コントロール遺伝子量測定工程＞＞の－－－β－アクチン遺伝子用プライマー対－－－及び－－－β－アクチン遺伝子の検出用プローブ－－－の項目に記載のものと同様である。
　以下、調製例、試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの試験例等に限定されるものではない。
（調製例１：ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子のｃＤＮＡの調製）
　ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子のｃＤＮＡとして、配列番号：１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプラスミドに挿入後、制限酵素処理をすることにより調製した。前記配列番号：１で表される塩基配列は、ＡＤＡＭＴＳ５（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：　ＮＭ＿００７０３８．３）の１，９１４番目～２，３４３番目（４３０ｂｐ）の塩基に相当する。
（調製例２：ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対及びプローブの調製）
　ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対及びＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブとして、以下のものを化学合成により調製した。
　・　フォワードプライマー
　　　５’－ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ－３’　（配列番号：２）
　・　リバースプライマー
　　　５’－ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ－３’　（配列番号：３）
　・　プローブ
　　　５’－ＦＡＭ－ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ－ＴＡＭＲＡ－３’　（配列番号：４）
　　　前記配列番号：４で表されるプローブは、５’末端がＦＡＭ（レポーター色素）で修飾されており、３’末端がＴＡＭＲＡ（クエンチャー色素）で修飾されている。
（調製例３：β－アクチン遺伝子のｃＤＮＡの調製）
　β－アクチン遺伝子のｃＤＮＡとして、配列番号：５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプラスミドに挿入後、制限酵素処理をすることにより調製した。前記配列番号：５で表される塩基配列は、β－アクチン（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：　ＮＭ＿００１１０１．２）の３番目～４６９番目（４６７ｂｐ）の塩基に相当する。
（調製例４：β－アクチン遺伝子用プライマー対及びプローブの調製）
　β－アクチン遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対及びβ－アクチン遺伝子の検出用プローブとして、以下のものを化学合成により調製した。
　・　フォワードプライマー
　　　５’－ＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ－３’　（配列番号：６）
　・　リバースプライマー
　　　５’－ＣＣＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧ－３’　（配列番号：７）
　・　プローブ
　　　５’－ＦＡＭ－ＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣ－ＴＡＭＲＡ－３’　（配列番号：８）
　　　前記配列番号：８で表されるプローブは、５’末端がＦＡＭ（レポーター色素）で修飾されており、３’末端がＴＡＭＲＡ（クエンチャー色素）で修飾されている。
（試験例１：リアルタイムＰＣＲによる定量）
　本発明のプライマー対及びプローブを用いて、下記試験例１－１～１－４のリアルタイムＰＣＲを行った。
＜試験例１－１＞
　コントロールＤＮＡとして、前記調製例１で調製したＡＤＡＭＴＳ５遺伝子のｃＤＮＡを、１．０μｇ／ｍＬ、１．０×１０－３μｇ／ｍＬ、又は１．０×１０－６μｇ／ｍＬとなるように希釈したものを使用した。
　プライマー対及びプローブとして、前記調製例２で調製したＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対（配列番号：２、３）及びプローブ（配列番号：４）を用いた。
　リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、表１－１に記載の反応試薬、及び以下に記載の反応時間の反応条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
－反応時間－
　以下の順に行った。
　（１）　９５℃、３０秒間
　（２）　サイクル数：５０
　　　　　条件：９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間
　前記リアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を図１Ａ（横軸：サイクル数、縦軸：増幅されたＰＣＲ産物に相当する蛍光シグナル（ΔＲｎ））に示す。図１Ａ中、実線は１．０μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、点線は１．０×１０－３μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、一点鎖線は１．０×１０－６μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、両端が矢印の線は、ベースライン（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　Ｌｉｎｅ）を示す。
　前記増幅曲線の結果から、コントロールＤＮＡの濃度を縦軸に、Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄに相当するサイクル数）を横軸にとり、検量線を作成した。
＜試験例１－２＞
　健常人のｃＤＮＡを２種（以下、「サンプル１」、「サンプル２」と称することがある）用意し、これを２倍希釈し、サンプルとした。
　プライマー対及びプローブとして、前記調製例２で調製したＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対（配列番号：２、３）及びプローブ（配列番号：４）を用いた。
　リアルタイムＰＣＲの反応条件は、前記試験例１－１におけるコントロールＤＮＡを前記サンプル１又は２に代えた以外は、前記試験例１－１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。
　前記試験例１－１で得られた検量線を用い、前記サンプル１及び２のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の絶対量を算出した結果、サンプル１では、１．０７×１０－３μｇ／ｍＬであり、サンプル２では、２．１８×１０－３μｇ／ｍＬであった。
＜試験例１－３＞
　コントロールＤＮＡとして、前記調製例３で調製したβ－アクチン遺伝子のｃＤＮＡを、１．０μｇ／ｍＬ、１．０×１０－３μｇ／ｍＬ、又は１．０×１０－６μｇ／ｍＬとなるように希釈したものを使用した。
　プライマー対及びプローブとして、前記調製例４で調製したβ－アクチン遺伝子用プライマー対（配列番号：６、７）及びプローブ（配列番号：８）を用いた。
　リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、表１－２に記載の反応試薬、及び以下に記載の反応時間の反応条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
－反応時間－
　以下の順に行った。
　（１）　９５℃、３０秒間
　（２）　サイクル数：５０
　　　　　条件：９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間
　前記リアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を図１Ｂ（横軸：サイクル数、縦軸：増幅されたＰＣＲ産物に相当する蛍光シグナル（ΔＲｎ））に示す。図１Ｂ中、実線は１．０μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、点線は１．０×１０－３μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、一点鎖線は１．０×１０－６μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、両端が矢印の線は、ベースライン（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　Ｌｉｎｅ）を示す。
　前記増幅曲線の結果から、コントロールＤＮＡの濃度を縦軸に、Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄに相当するサイクル数）を横軸にとり、検量線を作成した。
＜試験例１－４＞
　健常人のｃＤＮＡを２種（サンプル１、サンプル２）用意し、これを５０倍希釈し、サンプルとした。
　プライマー対及びプローブとして、前記調製例４で調製したβ－アクチン遺伝子用プライマー対（配列番号：６、７）及びプローブ（配列番号：８）を用いた。
　リアルタイムＰＣＲの反応条件は、前記試験例１－３におけるコントロールＤＮＡを前記サンプル１又は２に代えた以外は、前記試験例１－３と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。
　前記試験例１－３で得られた検量線を用い、前記サンプル１及び２のβ－アクチン遺伝子の絶対量を算出した結果、サンプル１では、５．００μｇ／ｍＬであり、サンプル２では、６．４０μｇ／ｍＬであった。
　試験例１－１～１－４の結果から、健常人のｃＤＮＡ２種（サンプル１、サンプル２）におけるβ－アクチン　ｍＲＮＡ量に対するＡＤＡＭＴＳ５　ｍＲＮＡ量の相対比（Ｉｎｄｅｘ）は、サンプル１では、２．１４Ｉｎｄｅｘ、サンプル２では、３．４１Ｉｎｄｅｘとなった。
（試験例２：リアルタイムＰＣＲによる定量）
　市販のプライマー対及びプローブ（ＭＧＢプローブ）を用いて、下記試験例２－１～２－４のリアルタイムＰＣＲを行った。
＜試験例２－１＞
　コントロールＤＮＡとして、前記調製例１で調製したＡＤＡＭＴＳ５遺伝子のｃＤＮＡを、１．０μｇ／ｍＬ、１．０×１０－３μｇ／ｍＬ、又は１．０×１０－６μｇ／ｍＬとなるように希釈したものを使用した。
　プライマー対及びプローブとして、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対及びプローブセット（カタログ番号　Ｈｓ００１９９８４１＿ｍ１；プローブは、ＭＧＢプローブ；プライマー及びプローブの配列は未公開）を用いた。
　リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、表２－１に記載の反応試薬、及び以下に記載の反応時間の反応条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
－反応時間－
　以下の順に行った。
　（１）　５０℃、３０秒間
　（２）　９５℃、１０分間
　（３）　サイクル数：５０
　　　　　条件：９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間
　前記リアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を図２Ａ（横軸：サイクル数、縦軸：増幅されたＰＣＲ産物に相当する蛍光シグナル（ΔＲｎ））に示す。図２Ａ中、実線は１．０μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、点線は１．０×１０－３μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、一点鎖線は１．０×１０－６μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、両端が矢印の線は、ベースライン（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　Ｌｉｎｅ）を示す。
　前記増幅曲線の結果から、コントロールＤＮＡの濃度を縦軸に、Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄに相当するサイクル数）を横軸にとり、検量線を作成した。
＜試験例２－２＞
　健常人のｃＤＮＡを２種（サンプル１、サンプル２）用意し、これを２倍希釈し、サンプルとした。
　プライマー対及びプローブとして、前記試験例２－１と同様に、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対及びプローブセット（カタログ番号　Ｈｓ００１９９８４１＿ｍ１；プローブは、ＭＧＢプローブ；プライマー及びプローブの配列は未公開）を用いた。
　リアルタイムＰＣＲの反応条件は、前記試験例２－１におけるコントロールＤＮＡを前記サンプル１又は２に代えた以外は、前記試験例２－１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。
　前記試験例２－１で得られた検量線を用い、前記サンプル１及び２のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の絶対量を算出した結果、サンプル１では、５．８６×１０－４μｇ／ｍＬであり、サンプル２では、９．８０×１０－４μｇ／ｍＬであった。
＜試験例２－３＞
　コントロールＤＮＡとして、前記調製例３で調製したβ－アクチン遺伝子のｃＤＮＡを、１．０μｇ／ｍＬ、１．０×１０－３μｇ／ｍＬ、又は１．０×１０－６μｇ／ｍＬとなるように希釈したものを使用した。
　プライマー対及びプローブとして、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のβ－アクチン遺伝子用プライマー対及びプローブセット（カタログ番号　４３３３７６２Ｆ；プローブは、ＭＧＢプローブ；プライマー及びプローブの配列は未公開）を用いた。
　リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、表２－２に記載の反応試薬、及び以下に記載の反応時間の反応条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
－反応時間－
　以下の順に行った。
　（１）　５０℃、３０秒間
　（２）　９５℃、１０分間
　（３）　サイクル数：５０
　　　　　条件：９５℃、１５秒間、次いで、６０℃、６０秒間
　前記リアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線を図２Ｂ（横軸：サイクル数、縦軸：増幅されたＰＣＲ産物に相当する蛍光シグナル（ΔＲｎ））に示す。図２Ｂ中、実線は１．０μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、点線は１．０×１０－３μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、一点鎖線は１．０×１０－６μｇ／ｍＬのコントロールＤＮＡを用いた場合の結果を示し、両端が矢印の線は、ベースライン（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　Ｌｉｎｅ）を示す。
　前記増幅曲線の結果から、コントロールＤＮＡの濃度を縦軸に、Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄに相当するサイクル数）を横軸にとり、検量線を作成した。
＜試験例２－４＞
　健常人のｃＤＮＡを２種（サンプル１、サンプル２）用意し、これを５０倍希釈し、サンプルとした。
　プライマー対及びプローブとして、前記試験例２－３と同様に、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のβ－アクチン遺伝子用プライマー対及びプローブセット（カタログ番号　４３３３７６２Ｆ；プローブは、ＭＧＢプローブ；プライマー及びプローブの配列は未公開）を用いた。
　リアルタイムＰＣＲの反応条件は、前記試験例２－３におけるコントロールＤＮＡを前記サンプル１又は２に代えた以外は、前記試験例２－３と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。
　前記試験例２－３で得られた検量線を用い、前記サンプル１及び２のβ－アクチン遺伝子の絶対量を算出した結果、サンプル１では、２．１２μｇ／ｍＬであり、サンプル２では、２．７４μｇ／ｍＬであった。
　試験例２－１～２－４の結果から、健常人のｃＤＮＡ２種（サンプル１、サンプル２）におけるβ－アクチン　ｍＲＮＡ量に対するＡＤＡＭＴＳ５　ｍＲＮＡ量の相対比（Ｉｎｄｅｘ）は、サンプル１では、２．７７Ｉｎｄｅｘ、サンプル２では、３．５８Ｉｎｄｅｘとなった。
　試験例１及び２の結果をまとめたものを表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　試験例１及び２の結果から、本発明のプライマー対及びプローブの組合せを用いてリアルタイムＰＣＲで定量した健常人のｃＤＮＡにおけるＡＤＡＭＴＳ遺伝子の発現量（Ｉｎｄｅｘ値）（試験例１）は、市販のＭＧＢプローブを用いてリアルタイムＰＣＲで定量した健常人のｃＤＮＡにおけるＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の発現量（Ｉｎｄｅｘ値）（試験例２）とほぼ同じ値であった。
　したがって、本発明のプライマー対及びプローブの組合せを用いることにより、β－アクチン　ｍＲＮＡ量に対するＡＤＡＭＴＳ５　ｍＲＮＡ量の相対比を、従来の高コストであるＭＧＢプローブを用いる場合よりも低コストで、かつ同一の性能で定量できることが示された。
（試験例３：リアルタイムＰＣＲの性能の比較）
　前記調製例２で調製したＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対（配列番号：２、３）及びプローブ（配列番号：４）と、前記市販のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子用プライマー対及びプローブセット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号　Ｈｓ００１９９８４１＿ｍ１；プローブは、ＭＧＢプローブ；プライマー及びプローブの配列は未公開）とについて、リアルタイムＰＣＲの性能の比較を以下のようにして行った。
＜試験例３－１：本発明のプライマー対及びプローブ＞
　前記試験例１－１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。なお、各濃度のコントロールＤＮＡについて、リアルタイムＰＣＲを５回行い、それぞれについてＣｔ値を求めた。結果を表４に示す。
＜試験例３－２：市販のプライマー対及びプローブ＞
　前記試験例２－１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。なお、各濃度のコントロールＤＮＡについて、リアルタイムＰＣＲを５回行い、それぞれについてＣｔ値を求めた。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　試験例３の結果から、低濃度（１．０×１０－６μｇ／ｍＬ）のコントロールＤＮＡをサンプルＤＮＡとした場合のＣｔ値は、本発明のプライマー対及びプローブの組合せを用いた場合（試験例３－１：３２．３２）のほうが、市販のプライマー対及びプローブの組合せを用いた場合（試験例３－２：３４．８４）よりも有意（ｐ＜０．０１）に低かった。
　したがって、本発明のプライマー対及びプローブの組合せを用いることにより、ＡＤＡＭＴＳ５　ｍＲＮＡ量の絶対量を、従来のＭＧＢプローブを用いる場合よりも高い感度で検出できることが示された。
　本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
　＜１＞　定量ＰＣＲにより、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を測定する工程を含み、
　前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプライマーとを用いることを特徴とするＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法である。
　５’－ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ－３’　（配列番号：２）
　５’－ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ－３’　（配列番号：３）
　＜２＞　前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブを用いる前記＜１＞に記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法である。
　５’－ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ－３’　（配列番号：４）
　＜３＞　更に、定量ＰＣＲにより、試料中のβ－アクチン遺伝子の量を測定する工程を含み、
　前記β－アクチン遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプライマーとを用いる前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法である。
　５’－ＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ－３’　（配列番号：６）
　５’－ＣＣＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧ－３’　（配列番号：７）
　＜４＞　前記β－アクチン遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブを用いる前記＜３＞に記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法である。
　５’－ＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣ－３’　（配列番号：８）
　＜５＞　定量されるＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量が、絶対量、及びβ－アクチン遺伝子の量に対する相対量の少なくともいずれかである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法である。
　＜６＞　定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対であって、
　前記プライマー対が、下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とするプライマー対である。
　５’－ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ－３’　（配列番号：２）
　５’－ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ－３’　（配列番号：３）
　＜７＞　定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対とプローブとの組合せであって、
　前記プライマー対が、前記＜６＞に記載のプライマー対であり、
　前記プローブが、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブであることを特徴とするプライマー対とプローブとの組合せである。
　５’－ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ－３’　（配列番号：４）
　＜８＞　定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるキットであって、
　前記＜６＞に記載のプライマー対を含むことを特徴とするキットである。
　＜９＞　更に、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブを含む前記＜８＞に記載のキットである。
　５’－ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ－３’　（配列番号：４）
　＜１０＞　更に、β－アクチン遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプライマーを含む前記＜８＞から＜９＞のいずれかに記載のキットである。
　５’－ＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ－３’　（配列番号：６）
　５’－ＣＣＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧ－３’　（配列番号：７）
　＜１１＞　更に、前記β－アクチン遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブを含む前記＜８＞から＜１０＞のいずれかに記載のキットである。
　５’－ＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣ－３’　（配列番号：８）
　本発明のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法によれば、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量を低コストで、かつ高感度に実施することができるので、試料中の前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を指標とする薬剤の薬効予測などに好適に利用可能である。
　本発明のプライマー対、プライマー対とプローブとの組合せ、及びキットは、本発明のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法などに好適に利用可能である。
　前記試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を指標とする薬剤の薬効予測としては、例えば、関節リウマチに対して抗ＴＮＦα抗体薬が有効か否かを評価する方法が挙げられる。
　具体例としては、内在性コントロールとしてβ－アクチンを用いた場合における、ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量／β－アクチンのｍＲＮＡの発現量）が、０．６×１／２５より小さい場合には、関節リウマチに対してインフリキシマブが有効であると評価することができる。また、内在性コントロールとしてβ－アクチンを用いた場合における、ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量／β－アクチンのｍＲＮＡの発現量）が、４．０×１０－４以上の場合には、関節リウマチに対してアダリムマブが有効であると評価することができる。

Claims (11)

  1. 　定量ＰＣＲにより、試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量を測定する工程を含み、
    　前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプライマーとを用いることを特徴とするＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法。
    　５’－ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ－３’　（配列番号：２）
    　５’－ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ－３’　（配列番号：３）
  2. 　前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブを用いる請求項１に記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法。
    　５’－ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ－３’　（配列番号：４）
  3. 　更に、定量ＰＣＲにより、試料中のβ－アクチン遺伝子の量を測定する工程を含み、
    　前記β－アクチン遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプライマーとを用いる請求項１から２のいずれかに記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法。
    　５’－ＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ－３’　（配列番号：６）
    　５’－ＣＣＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧ－３’　（配列番号：７）
  4. 　前記β－アクチン遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブを用いる請求項３に記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法。
    　５’－ＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣ－３’　（配列番号：８）
  5. 　定量されるＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の量が、絶対量、及びβ－アクチン遺伝子の量に対する相対量の少なくともいずれかである請求項１から４のいずれかに記載のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量方法。
  6. 　定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対であって、
    　前記プライマー対が、下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：３で表される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とするプライマー対。
    　５’－ＣＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣ－３’　（配列番号：２）
    　５’－ＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣ－３’　（配列番号：３）
  7. 　定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるプライマー対とプローブとの組合せであって、
    　前記プライマー対が、請求項６に記載のプライマー対であり、
    　前記プローブが、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブであることを特徴とするプライマー対とプローブとの組合せ。
    　５’－ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ－３’　（配列番号：４）
  8. 　定量ＰＣＲによる試料中のＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の定量に用いるキットであって、
    　請求項６に記載のプライマー対を含むことを特徴とするキット。
  9. 　更に、前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：４で表される塩基配列からなるプローブを含む請求項８に記載のキット。
    　５’－ＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡ－３’　（配列番号：４）
  10. 　更に、β－アクチン遺伝子が含まれる領域を増幅する増幅用プライマー対として、下記配列番号：６で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号：７で表される塩基配列からなるプライマーを含む請求項８から９のいずれかに記載のキット。
    　５’－ＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ－３’　（配列番号：６）
    　５’－ＣＣＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧ－３’　（配列番号：７）
  11. 　更に、前記β－アクチン遺伝子の検出用プローブとして、下記配列番号：８で表される塩基配列からなるプローブを含む請求項８から１０のいずれかに記載のキット。
    　５’－ＣＣＧＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣ－３’　（配列番号：８）
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