WO2017194876A1 - Méthode de calibration universelle pour le dosage d'inhibiteurs enzymatiques - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une méthode de calibration universelle utile pour le dosage des inhibiteurs d'une même enzyme, par exemple pour le dosage des inhibiteurs d'une enzyme de la coagulation sanguine. L'invention concerne également l'utilisation de cette calibration universelle dans une méthode de dosage d'un inhibiteur réversible ou irréversible de l'enzyme, dans un échantillon biologique. L'invention concerne aussi l'utilisation de la calibration universelle dans une méthode de criblages d'inhibiteurs de l'enzyme.

Description

Méthode de Calibration Universelle pour le Dosage d'Inhibiteurs Enzymatiques

Demande Parente

La présente demande internationale revendique la priorité de la demande française numéro FR 16 54148 déposée le 10 mai 2016, dont le contenu est incorporé ici par référence dans son intégralité.

Domaine de l'Invention

La présente invention concerne une méthode de calibration universelle utile pour le dosage des inhibiteurs d'une même enzyme, par exemple d'une enzyme de la coagulation sanguine. L'invention concerne également l'utilisation de cette calibration universelle dans une méthode de dosage d'un inhibiteur de l'enzyme dans un échantillon biologique. La calibration universelle permettant également la comparaison d'inhibiteurs entre eux, l'invention concerne aussi l'utilisation de la calibration universelle dans une méthode de criblage de composés susceptibles d'inhiber l'enzyme.

Contexte de l'Invention

La coagulation sanguine est un phénomène physiologique complexe qui fait intervenir plusieurs facteurs, dont notamment:

- le facteur tissulaire, activateur physiologique de la génération de thrombine, et

- le fibrinogène, transformé en fibrine sous l'activation de la thrombine.

La fibrine conduit, par son accumulation, à la formation d'un caillot, qui arrête l'hémorragie. La formation de ce caillot est régulée par un équilibre entre activations et inhibitions, où interviennent notamment de nombreuses enzymes et leurs inhibiteurs. Une rupture de cet équilibre entre activations et inhibitions peut induire deux types de pathologies: les maladies thrombotiques d'une part, et les maladies hémorragiques d'autre part. Dans le but de diagnostiquer l'une ou l'autre de ces maladies, ou de mesurer l'activité de thérapies mises en place pour traiter ces maladies, il peut être intéressant de doser l'une des enzymes impliquées ou l'un des inhibiteurs de cette enzyme.

Classiquement, le dosage d'un inhibiteur d'une enzyme de la coagulation du sang s'effectue en mettant en compétition pour l'enzyme: l'inhibiteur présent dans l'échantillon sanguin et un substrat spécifique de l'enzyme. Un tel dosage s'accomplit, en général, en utilisant un kit dédié et spécifique de l'inhibiteur qui est basé sur: - une méthodologie optimisée et généralement propre au dosage de l'inhibiteur, ce qui implique notamment une dilution de l'échantillon à tester, des concentrations spécifiques en réactifs et des points de mesure précis; et

- un modèle mathématique de régression de la courbe de calibration, qui peut être linéaire, polynomiale ou logarithmique.

Ce kit dédié et spécifique de l'inhibiteur comprend généralement:

- un calibrant (typiquement des plasmas contenant des niveaux croissants en concentration en inhibiteur à doser); et

- des contrôles qualités contenant généralement un niveau bas et un niveau haut de concentrations en inhibiteur.

En outre, dans les cas où il est nécessaire de pouvoir doser en parallèle, dans différents échantillons, plusieurs inhibiteurs d'une même enzyme, l'utilisateur doit disposer d'un kit de dosage par inhibiteur. De plus, pour chaque inhibiteur, il est nécessaire de calibrer le système de mesure. II existe donc un besoin pour une méthode qui s'affranchit de l'ensemble de ces contraintes. Notamment, il existe un besoin pour une méthode de dosage d'un inhibiteur d'une enzyme de la coagulation sanguine, qui soit facile à mettre en œuvre, et qui ne soit pas spécifique de l'inhibiteur concerné, c'est-à-dire, en d'autres termes, d'une méthode de dosage qui soit universelle. Résumé de l'Invention

L'invention fournit une méthode de calibration, simple à mettre en œuvre et peu coûteuse, permettant le dosage en parallèle de multiples inhibiteurs d'une même enzyme, et ce, que les inhibiteurs enzymatiques soient réversibles ou irréversibles. Alors que dans une méthode de calibration classique, la courbe de calibration est établie à partir de concentrations croissantes en inhibiteur que l'on veut doser, dans une méthode de calibration selon l'invention, la courbe de calibration est établie à partir de concentrations décroissantes de l'enzyme ciblée. La méthode de calibration selon l'invention permet d'obtenir des résultats exprimés en pourcentage d'activité anti-enzyme, une unité universelle commune à tous les inhibiteurs de l'enzyme, ce qui permet de comparer l'efficacité inhibitrice de ces inhibiteurs sur l'enzyme. La calibration permettant donc la comparaison des inhibiteurs entre eux, l'invention concerne aussi l'utilisation de la calibration universelle dans une méthode de criblage pour identifier des inhibiteurs de l'enzyme. La méthode de calibration selon l'invention permet également la mesure de la quantité ou de la concentration d'inhibiteur présent dans un échantillon testé en réalisant un abaque de conversion selon un raisonnement mathématique spécifique. Une méthode de calibration selon l'invention trouve donc application dans le dosage d'un inhibiteur de l'enzyme présent dans un échantillon biologique, par exemple dans le dosage d'un anticoagulant oral direct présent dans un échantillon biologique provenant d'un patient traité par l'anticoagulant oral direct.

Plus spécifiquement, la présente invention concerne une méthode pour obtenir une calibration universelle pour le dosage d'un inhibiteur d'une enzyme, la méthode comprenant les étapes suivantes:

a) déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour chacun d'une pluralité de mélanges contenant l'enzyme E et un substrat S marqué et spécifique de l'enzyme, où:

- le substrat spécifique de l'enzyme est marqué par un marqueur ayant une propriété physique détectable,

- dans chacun des mélanges, le substrat est présent en excès par rapport à l'enzyme,

- les mélanges contiennent une même concentration initiale de substrat, [S]o,

- les mélanges ont le même volume total V et le même milieu réactionnel M_R,

- les mélanges ont des concentrations initiales en enzyme connues et décroissantes, la concentration initiale en enzyme la plus élevée étant [E]₀, ou ont des activités initiales d'enzyme connues et décroissantes, l'activité initiale d'enzyme la plus élevée étant A₀, et

- l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire d'un mélange est déterminée par les étapes suivantes:

al) mélanger une solution de l'enzyme E et une solution du substrat S pour obtenir un mélange de concentration initiale d'enzyme connue, ou d'activité initiale d'enzyme connue, et de concentration initiale de substrat [S]o,

a2) mesurer la valeur de la propriété physique détectable du marqueur et reporter, sur un graphe, la valeur de cette propriété physique en fonction du temps pour obtenir une courbe, la courbe présentant une partie rectiligne correspondant à l'état stationnaire, et

a3) calculer la pente de la partie rectiligne de la courbe obtenue en a2), où la pente obtenue en a3) est l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du mélange;

b) pour chacun des mélanges de l'étape a), convertir la concentration initiale en enzyme du mélange, en activité anti-enzyme exprimée en pourcentage en normalisant ladite concentration initiale en enzyme du mélange par rapport à la concentration initiale en enzyme la plus élevée [E]o, ou convertir l'activité initiale d'enzyme du mélange, en activité anti-enzyme exprimée en pourcentage en normalisant ladite activité initiale d'enzyme du mélange par rapport à l'activité initiale d'enzyme la plus élevée A₀,

c) construire une courbe de calibration universelle en reportant, sur un graphe, pour chaque mélange, l'activité anti-enzyme déterminée à l'étape b) en fonction de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue à l'étape a).

Dans certains modes de réalisation, l'enzyme utilisée dans la méthode de calibration universelle appartient à la classe des hydrolases, à la classe des lyases, ou à la classe des isomérases. Dans certains modes de réalisation, l'inhibiteur que l'on souhaite doser en utilisant la méthode de calibration est un inhibiteur réversible direct ou indirect, ou est un inhibiteur irréversible direct ou indirect.

Dans certains modes de réalisation, dans l'étape b) de la méthode de calibration universelle, pour un mélange de concentration initiale en enzyme, [E], l'activité anti-enzyme exprimée en pourcentage est calculée par l'équation:

AntiEnzyme % = 1 - ([E]/[E]₀),

et pour un mélange d'activité initiale d'enzyme, A, l'activité anti-enzyme exprimée en pourcentage est calculée par l'équation:

AntiEnzyme _% = 1 - (A/A₀). Dans certains modes de réalisation, dans l'étape c) de la méthode de calibration universelle, la courbe de calibration est une droite d'équation:

AntiEnzyme^ = 1 — {— x v ) où:

AntiEnzyme_(%) est l'activité anti-enzyme exprimée en pourcentage,

v est l'activité résiduelle enzymatique à l'état stationnaire, et 1/vo est la pente de la courbe de calibration, et v₀ est l'activité résiduelle enzymatique à l'état stationnaire observée en absence d'un inhibiteur.

Dans certains modes de réalisation, la méthode de calibration universelle comprend en outre une étape d) consistant à construire un abaque de conversion spécifique à un inhibiteur de l'enzyme E et permettant de convertir l'activité anti-enzyme, déterminée pour un échantillon à tester, en quantité ou concentration en inhibiteur. Préférablement, l'étape d) comprend les sous-étapes suivantes:

dl) déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour au moins deux mélanges d'étalonnage contenant chacun l'inhibiteur à une concentration initiale connue, l'enzyme E à la concentration initiale [E]o ou à l'activité initiale A₀, et le substrat S marqué et spécifique de l'enzyme à la concentration [S]o, où:

- dans chacun des mélanges d'étalonnage, l'enzyme est présente en excès par rapport à l'inhibiteur,

- les mélanges d'étalonnage ont le même volume V et le même milieu réactionnel M_R, et

- l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire d'un mélange est déterminée par les étapes suivantes:

dl') mélanger l'inhibiteur avec une solution de l'enzyme E et une solution du substrat S pour obtenir un mélange d'étalonnage de concentration initiale en inhibiteur connue,

dl") mesurer la valeur de la propriété physique détectable du marqueur et reporter, sur un graphe, la valeur de cette propriété physique en fonction du temps pour obtenir une courbe, la courbe présentant une partie rectiligne correspondant à l'état stationnaire, et

dl'") calculer la pente de la partie rectiligne de la courbe obtenue en dl"),

où la pente obtenue à l'étape dl'") est l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du mélange d'étalonnage;

d2) par chacun des mélanges d'étalonnage, utiliser la courbe de calibration universelle obtenue à l'étape c) de la méthode de calibration universelle, pour déterminer l'activité anti- enzyme du mélange à partir de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire mesurée à l'étape dl '") pour le mélange d'étalonnage; et d3) construire un abaque ou courbe d'étalonnage, en reportant sur un graphe, pour chaque mélange d'étalonnage, la concentration initiale en inhibiteur du mélange d'étalonnage en fonction de l'activité anti-enzyme déterminée à l'étape d2).

Dans certains modes de réalisation, le volume V est identique au volume V. Dans certains modes de réalisation, l'étape d) comprend en outre la sous-étape d4) consistant à déterminer l'équation de la courbe d'étalonnage par une régression des couples (activité anti-enzyme, concentration en inhibiteur) portés sur le graphe à l'étape d3).

Dans certains modes de réalisation,

- si l'inhibiteur est un inhibiteur réversible direct, l'équation de la courbe d'étalonnage est l'équation suivante:

où :

AntiEnzyme_(%) est l'activité anti-enzyme,

[I]₀ est la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon à tester, et

i et e sont deux constantes fixes et propres à l'inhibiteur; et

- si l'inhibiteur est un inhibiteur irréversible indirect, l'équation de la courbe d'étalonnage est l'équation suivante:

[I]o = e x AntiEnzyme_(%)

où:

AntiEnzyme_(%) est l'activité anti-enzyme dans l'échantillon à tester,

[I]₀ est la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon, et

e est une constante fixe et propre à l'inhibiteur.

L'invention concerne également une méthode de dosage d'un inhibiteur d'une enzyme dans un échantillon biologique, la méthode comprenant les étapes suivantes:

1) déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour un mélange à tester de milieu réactionnel M_R, de volume V", et contenant une aliquote de l'échantillon biologique contenant l'inhibiteur, l'enzyme E à une concentration initiale [E]₀ ou à une activité initiale Ao, et un substrat S marqué et spécifique de l'enzyme à une concentration initiale [S]o, où: - le substrat spécifique de l'enzyme est marqué par un marqueur ayant une propriété physique détectable, et

- l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du mélange à tester est déterminée par les étapes suivantes:

i) mélanger l'aliquote de l'échantillon biologique avec une solution de l'enzyme E et une solution du substrat S pour obtenir un mélange de concentration initiale d'enzyme [E]o, ou d'activité initiale d'enzyme A₀, et une concentration initiale en substrat [S]o,

ii) mesurer la valeur de la propriété physique détectable du marqueur et reporter, sur un graphe, la valeur de cette propriété physique en fonction du temps pour obtenir une courbe, la courbe présentant une partie rectiligne correspondant à l'état stationnaire, et

iii) calculer la pente de la partie rectiligne de la courbe obtenue à l'étape ii),

où la pente obtenue à l'étape iii) est l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du mélange à tester; et

2) utiliser la courbe de calibration universelle obtenue à l'étape c) de la méthode de calibration selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour déterminer l'activité antienzyme de l'échantillon biologique à partir de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire mesurée pour le mélange à tester.

Dans certains modes de réalisation, l'échantillon biologique utilisé dans une méthode de dosage selon l'invention est un échantillon de sang, de plasma, de plasma riche en plaquettes ou de plasma pauvre en plaquettes, de plasma contenant des microparticules plaquettaires, érythrocytaires ou toute autre cellule. Dans certains modes de réalisation préférés, l'échantillon biologique est un échantillon de plasma pauvre en plaquettes.

Dans certains modes de réalisation, l'enzyme utilisée dans une méthode de dosage selon l'invention est une enzyme de la coagulation sanguine choisie parmi les facteurs de coagulation, la kallikréine et la plasmine, de préférence choisie parmi le facteur lia, le facteur Xa, et la plasmine.

Dans les modes de réalisation où l'enzyme est une enzyme de la coagulation sanguine, l'inhibiteur à doser par une méthode de dosage selon l'invention peut être choisi parmi antithrombine, le cofacteur II de l'héparine, l'alpha-2-macroglobuline, l'hirudine, la lépirudine, la désirudine, le rivaroxaban, l'apixaban, l'edoxaban, le betrixaban, le dabigatran, la bivalirudine, l'argatroban, les héparines non fractionnées, les héparines de bas poids moléculaires, les pentasaccharides, et le danaparoïde sodique.

Dans certains modes de réalisation, le volume V" est identique au volume V.

Dans certains modes de réalisation, la méthode de dosage selon l'invention comprend en outre l'étape suivante:

3) convertir l'activité anti-enzyme exprimée en pourcentage et obtenue à l'étape 2), en concentration en inhibiteur en utilisant l'abaque spécifique de l'inhibiteur obtenu à l'étape d) de la méthode calibration selon l'une quelconque des revendications 6 à 10.

La présente invention concerne également l'utilisation d'une méthode de dosage selon l'invention pour estimer le risque hémorragique chez un patient traité par un anticoagulant oral direct.

La présente invention concerne aussi une méthode pour estimer le risque hémorragique chez un patient traité par un anticoagulant oral direct, la méthode comprenant les étapes suivantes:

- déterminer la quantité ou la concentration en anticoagulant oral direct dans un échantillon biologique du patient en utilisant une méthode de dosage de l'invention;

comparer cette quantité ou concentration avec un seuil prédéterminé; et

conclure qu'il y a risque hémorragique si la quantité ou concentration en anticoagulant oral direct est supérieure au seuil prédéterminé. Dans certains modes de réalisation, la méthode pour estimer le risque hémorragique chez un patient traité par un anticoagulant oral direct selon la revendication 20, comprenant en outre l'étape suivante:

déterminer la quantité de composé anti-inhibiteur à administrer au patient en fonction de la quantité ou concentration en anticoagulant oral direct mesurée dans l'échantillon biologique du patient.

Dans certains modes de réalisation, le patient traité par l'anticoagulant oral direct est un patient soupçonné d'être en surdosage d'anticoagulant oral direct, ou est un patient ayant subi un récent changement de traitement d'un médicament antivitamine K vers l'anticoagulant oral direct, ou est un patient sur le point de subir une intervention chirurgicale. La présente invention concerne également une méthode de criblage pour identifier un inhibiteur d'une enzyme comprenant les étapes suivantes:

1) déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour un mélange de milieu réactionnel M_R, de volume V" et contenant un composé test à une concentration initiale [C], l'enzyme E à une concentration initiale [E]o ou à une activité initiale Ao et un substrat S marqué spécifique de l'enzyme à une concentration initiale [S]o, où:

- le substrat spécifique de l'enzyme est marqué par un marqueur ayant une propriété physique détectable,

- dans le mélange, l'enzyme est présente en excès par rapport au composé test, et - l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du mélange est déterminée par les étapes suivantes:

i) mélanger le composé test avec une solution de l'enzyme E et une solution du substrat S pour obtenir un mélange de concentration initiale d'enzyme [E]₀, ou d'activité d'enzyme Ao, une concentration initiale en substrat [S]o, et une concentration [C] en composé test,

ii) mesurer la valeur de la propriété physique détectable du marqueur et reporter, sur un graphe, la valeur de cette propriété physique en fonction du temps pour obtenir une courbe, la courbe présentant une partie rectiligne correspondant à l'état stationnaire, et

iii) calculer la pente de la partie rectiligne de la courbe obtenue à l'étape ii), où la pente obtenue à l'étape iii) est l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du composé à tester;

2) utiliser la courbe de calibration universelle obtenue à l'étape c) de la méthode de calibration universelle, pour déterminer l'activité anti-enzyme du composé test à partir de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire mesurée pour le mélange; et

3) comparer l'activité anti-enzyme du composé test déterminée à l'étape 2) avec l'activité anti-enzyme déterminée, dans les mêmes conditions, pour un inhibiteur standard de l'enzyme à une concentration [C] ou comparer l'activité anti-enzyme du composé test déterminée à l'étape 2) avec un seuil prédéterminé, où le composé test est identifié comme un inhibiteur de l'enzyme si l'activité anti-enzyme du composé test est supérieure à l'activité anti-enzyme de l'inhibiteur standard de l'enzyme ou si l'activité anti-enzyme du composé test est supérieure au seuil prédéterminé. Dans certains modes de réalisation, le volume V" est identique au volume V.

Dans certains modes de réalisation, l'enzyme utilisée dans une méthode de criblage selon l'invention appartient à la classe des hydrolases ou à la classe des lyases.

La présente invention concerne enfin un premier kit pour identifier un inhibiteur d'une enzyme E comprenant

l'enzyme E,

un substrat S marqué et spécifique de l'enzyme, et

des instructions pour mettre en œuvre une méthode de criblage selon l'invention; et un deuxième kit pour doser au moins un des inhibiteurs d'une enzyme E dans un échantillon biologique, le kit comprenant

l'enzyme E,

un substrat S marqué et spécifique de l'enzyme,

au moins un inhibiteur de l'enzyme, et

des instructions pour mettre en œuvre une méthode de dosage selon l'invention. Dans certains modes de réalisation, le deuxième kit comprend en outre au moins un antre inhibiteur.

Une description plus détaillée de certains modes de réalisation préférés de l'invention est donnée ci-dessous.

Description Détaillée de l'Invention

Comme mentionné ci-dessus, la présente invention concerne une méthode de calibration d'inhibiteurs d'une enzyme et l'utilisation de cette calibration universelle dans des méthodes de dosage d'inhibiteurs de l'enzyme et dans des méthodes de criblage d'inhibiteurs de l'enzyme.

I - Méthode de Calibration Universelle

A. Principe de base d'une méthode classique de dosage d'inhibiteur enzymatique

Une méthode classique de dosage d'un inhibiteur d'une enzyme fait intervenir au minimum trois éléments et met en compétition deux réactions biochimiques. Les trois éléments sont l'enzyme (E), l'inhibiteur (I) dont on souhaite mesurer la quantité ou la concentration dans l'échantillon testé, et un substrat (S), spécifique de l'enzyme, ce substrat étant marqué (généralement le marquage est choisi de telle sorte que la réaction enzymatique résulte en une libération du marqueur, ce qui permet sa détection). Les deux réactions biochimiques en compétition sont: la réaction d'inhibition de l'enzyme par l'inhibiteur, et la réaction enzymatique entre l'enzyme et son substrat.

Lorsque l'inhibiteur est un inhibiteur réversible, la réaction d'inhibition de l'enzyme par l'inhibiteur réversible est la suivante:

k_i+

E + I

où:

E et I désignent l'enzyme et l'inhibiteur, comme définis ci-dessus,

E · I désigne le complexe inactif formé entre l'enzyme et l'inhibiteur,

kj₊ est la constante d'association entre l'enzyme et l'inhibiteur réversible, et

k;_ est la constante de dissociation entre l'enzyme et l'inhibiteur réversible.

Lorsque l'inhibiteur est un inhibiteur irréversible, la réaction d'inhibition de l'enzyme par l'inhibiteur irréversible est la suivante:

E + I ^ka _> E - I

où:

E, I et E · I sont comme définis ci-dessus, et

k_a est la constante d'association entre l'enzyme et l'inhibiteur irréversible.

La réaction enzymatique entre l'enzyme et son substrat est la suivante:

E + S ^Km > E - S ^kcat _{> E + p}

où:

E et S désignent l'enzyme et son substrat marqué, comme définis ci-dessus,

E · S désigne le complexe instable formé par l'enzyme et le substrat,

P désigne le produit issu de la catalyse du substrat par l'enzyme,

K_M est la constante de Henri-Michaelis-Menten, et

k_cat est la constante catalytique de l'enzyme.

Dans les cas où l'inhibiteur est indirect, le dosage fait intervenir un quatrième élément: un composé A qui forme avec l'inhibiteur un complexe (A · I), qui lui est un inhibiteur irréversible de l'enzyme. Ainsi, par exemple, dans le cas d'un inhibiteur irréversible indirect, les réactions mises en compétition sont alors représentées dans le schéma suivant: .4■ /

où:

E, I, S, K_M, et k_cat sont comme définis précédemment;

A est le composé qui forme le complexe A · I avec l'inhibiteur;

k_on est la constante d'association du complexe A · I;

koff est la constante de dissociation du complexe A · I; et

kj est la constante d'association de l'enzyme et de l'inhibiteur.

Dans une méthode de dosage, le substrat est initialement présent en excès par rapport à l'enzyme, qui est elle-même présente en excès par rapport à l'inhibiteur. Au cours de la mesure, l'enzyme, inhibée dans une plus ou moins grande proportion par l'inhibiteur, clive le substrat en produit. Cela résulte en la libération du marqueur, dont l'apparition et l'accumulation induisent des changements observables d'au moins une propriété physique de l'échantillon testé. Suivre les variations de cette propriété physique en fonction du temps, par la construction d'une courbe, permet de suivre l'établissement d'un équilibre entre les deux réactions biochimiques mises en compétition.

En effet, au bout d'un certain temps, les deux réactions biochimiques en compétition vont atteindre un équilibre local appelé état stationnaire: c'est-à-dire un état où l'enzyme et l'inhibiteur (ou l'enzyme et le complexe A · I pour un inhibiteur indirect) sont en équilibre biochimique, et où les concentrations en enzyme, en inhibiteur et en complexe E · I (ou en enzyme, en complexe A · I et en complexe E · A · I, pour un inhibiteur indirect) sont constantes. L'enzyme étant initialement en excès, il persiste à cet instant une activité résiduelle enzymatique qui peut être quantifiée afin d'en déduire la concentration en inhibiteur présente dans l'échantillon testé. En effet, l'activité résiduelle de l'enzyme et la concentration initiale en inhibiteur sont inversement proportionnelles: plus la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon testé est élevée, plus l'enzyme est inhibée au cours de la mesure et moins elle est active vis-à-vis du substrat au cours de l'état stationnaire; à l'inverse plus la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon est faible, moins l'enzyme est inhibée au cours de la mesure et plus elle est active vis-à-vis du substrat au cours de l'état stationnaire. La relation entre ces deux grandeurs, activité résiduelle de l'enzyme à l'état stationnaire et concentration en inhibiteur, est ainsi bijective et il existe donc pour chaque concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon une unique activité résiduelle enzymatique équivalente. L'état stationnaire correspond à la partie rectiligne de la courbe présentant les variations de la propriété physique (liée à la libération du marqueur) en fonction du temps. La pente de cette partie rectiligne est l'activité résiduelle de l'enzyme qui est inversement proportionnelle à la concentration initiale en inhibiteur. Dans une méthode classique de dosage d'un inhibiteur enzymatique, une calibration est effectuée en déterminant l'activité résiduelle enzymatique à l'état stationnaire pour un nombre, n, d'échantillons de calibration ayant des concentrations en inhibiteur connues. La courbe de calibration d'une méthode de dosage classique est établie en reportant, sur un graphe, les n couples (activité résiduelle enzymatique, concentration en inhibiteur) obtenus. L'équation mathématique de la régression de ces n couples permet de déterminer, à partir de l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire pour l'échantillon testé, la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon testé.

B. Calibration Universelle

La présente invention fournit une méthode de calibration qui ne fait pas intervenir l'inhibiteur enzymatique, mais un calibrant unique et commun à tous les inhibiteurs de l'enzyme: l'enzyme elle-même. Le principe de la calibration universelle selon l'invention consiste à mesurer, pour des échantillons de calibration contenant des concentrations initiales décroissantes en enzyme, l'activité résiduelle enzymatique à l'état stationnaire, puis à construire une courbe de calibration en reportant, sur un graphe, les différents couples (activité résiduelle enzymatique, concentration initiale en enzyme) obtenus. L'équation de la régression de ces différents couples permet de convertir l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire pour l'échantillon testé, en équivalent de concentration en enzyme. Plutôt que de fournir le résultat en équivalent de concentration en enzyme, le résultat est ici fourni en équivalent d'activité anti-enzyme exprimée en pourcentage. Plus spécifiquement, la présente invention concerne une méthode pour obtenir une calibration universelle pour le dosage d'un inhibiteur d'une enzyme, la méthode comprenant les étapes suivantes: a) déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour chacun d'une pluralité de mélanges contenant l'enzyme E et un substrat S marqué et spécifique de l'enzyme, où:

- le substrat spécifique de l'enzyme est marqué par un marqueur ayant une propriété physique détectable,

- dans chacun des mélanges, le substrat est présent en excès par rapport à l'enzyme,

- les mélanges contiennent une même concentration initiale de substrat, [S]o,

- les mélanges ont le même volume total V et le même milieu réactionnel M_R,

- les mélanges ont des concentrations initiales en enzyme connues et décroissantes, la concentration initiale en enzyme la plus élevée étant [E]o, ou ont des activités initiales d'enzyme connues et décroissantes, l'activité initiale d'enzyme la plus élevée étant A₀, et

- l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire d'un mélange est déterminée par les étapes suivantes:

al) mélanger une solution de l'enzyme E et une solution du substrat S pour obtenir un mélange de concentration initiale d'enzyme connue, ou d'activité initiale d'enzyme connue, et de concentration initiale de substrat [S]o, a2) mesurer la valeur de la propriété physique détectable du marqueur et reporter, sur un graphe, la valeur de cette propriété physique en fonction du temps pour obtenir une courbe, la courbe présentant une partie rectiligne correspondant à l'état stationnaire, et

a3) calculer la pente de la partie rectiligne de la courbe obtenue en a2), où la pente obtenue en a3) est l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du mélange;

b) pour chacun des mélanges de l'étape a), convertir la concentration initiale en enzyme du mélange, en activité anti-enzyme exprimée en pourcentage en normalisant ladite concentration initiale en enzyme du mélange par rapport à la concentration initiale en enzyme la plus élevée [E]₀, ou convertir l'activité initiale d'enzyme du mélange, en activité anti-enzyme exprimée en pourcentage en normalisant ladite activité initiale d'enzyme du mélange par rapport à l'activité initiale d'enzyme la plus élevée Ao, et c) construire une courbe de calibration universelle en reportant, sur un graphe, pour chaque mélange, l'activité anti-enzyme déterminée à l'étape b) en fonction de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue à l'étape a). Etape a) de là Méthode de Calibration Universelle

L'étape a) de la méthode de calibration universelle selon l'invention consiste à déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour chacun d'une pluralité de mélanges de calibration contenant l'enzyme à calibrer et un substrat spécifique de l'enzyme dans un milieu réactionnel M_R. Par "pluralité de mélanges", on entend au moins 2 mélanges différents, de préférence au moins 4 mélanges différents, par exemple 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 mélanges différents, ou bien encore au moins 10 mélanges différents, par exemple 10, 11, 12, 13, 14, 15 mélanges différents ou plus de 15 mélanges de calibration différents.

Enzymes

Une enzyme est une protéine ou une glycoprotéine dotée de propriétés catalytiques.

Une méthode de calibration universelle décrite ici peut être appliquée à n'importe quelle enzyme qui, avec son substrat spécifique, est impliquée dans une réaction enzymatique du type suivant:

E + S ^ ^Km > ^{E * s K}cat ^x, E + P

où E, S, E · S, P, K_M, et k_cat sont comme définis plus haut.

D'une manière plus générale, les enzymes auxquelles peuvent être appliquée une méthode de calibration selon l'invention sont des enzymes dont la réaction enzymatique avec le substrat ne fait pas intervenir de coenzyme. De telles enzymes sont connues dans l'art et appartiennent aux classes suivantes: les hydrolases, les lyases et les isomérases. Ainsi, l'enzyme utilisée dans une méthode de calibration universelle selon l'invention appartient à la classe des hydrolases, à la classe des lyases ou à la classe des isomérases. Préférablement, l'enzyme utilisée dans une méthode de calibration appartient à la classe des hydrolases ou à la classe des lyases.

Les hydrolases constituent une classe d'enzymes qui catalysent les réactions d'hydrolyse, cette classe contient les estérases, qui hydrolysent les esters; les peptidases, qui hydrolysent les oligo- ou poly-saccharides; et les phosphatases, qui hydrolysent les produits phosphorés. Parmi les peptidases (ou protéases), on distingue, les aminopeptidases (qui libèrent séquentiellement les acides aminés N-terminaux); les carboxypeptidases (qui libèrent séquentiellement les acides aminés C-terminaux); les dipeptidases (qui hydrolysent les dipeptides); et les protéinases (qui hydrolysent des protéines). Dans les Exemples présentés dans le présent document, l'Inventeur a utilisé, comme enzyme, le facteur Xa, qui est une protéase et appartient donc à la classe des hydrolases.

Les lyases constituent une classe d'enzymes qui catalysent la rupture de différentes liaisons chimiques par des moyens autres que l'hydrolyse ou l'oxydation, formant souvent une nouvelle liaison double ou un nouveau cycle. Cette classe d'enzymes contient, sans limitations, les lyases qui coupent les liaisons carbone-carbone comme les décarboxylases, les aldolases, et les oxacide lyases; les lyases qui coupent les liaisons carbone-oxygène comme les déshydratases; les lyases qui coupent les liaisons carbone-azote comme la phénylalanine ammonia-lyase; les lyases qui coupent les liaisons carbone-soufre, etc....

Les isomérases constituent une classe d'enzymes qui catalysent les changements au sein d'une molécule, souvent par réarrangement des groupements fonctionnels et conversion de la molécule en l'un de ses isomères. Cette classe d'enzymes contient, sans limitation, les racémases, les épimérases, les cis-trans-isomérases, les oxydo-réductases intramoléculaires, les transférases intramoléculaires, les lyases intramoléculaires, et les topoisomérases. L'enzyme utilisée dans une méthode de calibration selon l'invention peut être une enzyme d'origine bactérienne, virale, fongique, végétale ou peut être une enzyme de mammifère (humaine ou animale). En particulier, une méthode de calibration universelle selon la présente invention peut être appliquée à n'importe quelle enzyme, dont il est intéressant d'identifier des inhibiteurs, par exemple dans le but de développer des inhibiteurs thérapeutiques humains ou vétérinaires, ou encore n'importe quelle enzyme dont il est souhaitable de quantifier la présence d'un inhibiteur dans un échantillon biologique, par exemple la présence d'un inhibiteur thérapeutique dans un échantillon biologique provenant d'un patient traité par l'inhibiteur thérapeutique.

Substrat Marqué, Spécifique de l'Enzyme

Avant de pouvoir catalyser une réaction chimique, les enzymes doivent tout d'abord se lier à leurs substrats. Les termes "substrat" et "substrat enzymatique", sont utilisés ici de façon interchangeable. Ils ont leur sens connu dans l'art et désignent toute molécule susceptible de subir l'action d'une enzyme. Comme le reconnaîtra l'homme du métier, le substrat utilisé dans une méthode de calibration doit être un substrat spécifique de l'enzyme qui fait l'objet de la calibration. L'homme du métier sait également que, lorsque la spécificité de l'enzyme est large, c'est-à-dire lorsqu'elle tolère plusieurs substrats, le choix du substrat idéal est en fait un compromis entre la spécificité de ce substrat pour l'enzyme (qui est garante de l'exactitude des mesures) et les contraintes analytiques liées à la sensibilité et à la praticabilité des mesures.

Le substrat utilisé dans une méthode de calibration selon l'invention est un substrat marqué ayant une propriété physique détectable. Préférablement, le substrat est marqué de telle sorte que la réaction enzymatique entre l'enzyme et le substrat résulte en la libération du marqueur, rendant donc possible la détection de ce marqueur.

Ainsi, par "substrat marqué", on entend donc désigner un substrat qui contient, ou qui est associé (par exemple de façon non covalente) ou lié (par exemple de façon covalente) à un marqueur détectable. Différent types de marquage et de marqueurs sont bien connus de l'homme du métier et peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention, y compris les marqueurs chromogènes, fluorescents, chemiluminescents, électrochimiques, radioactifs, etc.... Dans les Exemples présentés dans le présent document, l'Inventeur a utilisé, l'enzyme F.Xa (le facteur Xa bovin), et le substrat chromogène, MAPA-Gly-Arg-pNA, dans lequel la séquence peptidique MAPA-Gly-Arg (4-Methyl-2-Amino-[Methoxy-(Ethoxy)-Carbamate]-Pentanoyl- Glycine-Arginine) est liée de façon covalente à la para-nitroaniline (pNA). La réaction enzymatique libère pNA, dont on peut suivre la densité optique (ou absorbance), dans le mélange, à une longueur d'onde comprise entre 400 et 500 nm, typiquement à 405 nm.

Propriétés des Mélanges de Calibration

Les mélanges de calibration utilisés dans une méthode selon l'invention ont des concentrations initiales en enzyme connues et décroissantes, la concentration initiale en enzyme la plus élevée étant [E]₀. Alternativement, les mélanges de calibration ont des activités initiales d'enzyme connues et décroissantes, l'activité initiale d'enzyme la plus élevée étant A₀. Comme le reconnaîtra l'homme du métier, la concentration initiale en enzyme la plus élevée, [E]₀, et la gamme des concentrations initiales en enzymes utilisées pour la calibration sont choisies en fonction de l'utilisation prévue pour la courbe de calibration (par exemple utilisation dans une méthode de criblage dont l'opérateur fixe lui-même la concentration initiale en composé test ou utilisation dans une méthode de dosage d'un inhibiteur thérapeutique dans un échantillon biologique d'un patient dont on sait que la concentration en inhibiteur thérapeutique est très faible ou très élevée par rapport à un seuil prédéterminé). Cependant, [E]o et la gamme de concentrations initiales en enzyme doivent être en choisies de telle sorte que, dans un échantillon biologique (ou dans un échantillon de criblage), l'enzyme est toujours présente en excès par rapport à l'inhibiteur. Cet excès garanti la mesure d'une activité résiduelle enzymatique non nulle. Par "enzyme présente en excès par rapport à l'inhibiteur", on entend une concentration initiale en enzyme au moins 1,25 fois plus élevée que la concentration en inhibiteur que l'on veut doser (ou que la concentration en composé test que l'on veut tester), préférablement au moins 1,33 fois plus élevée, et plus préférablement encore au moins 1,5 fois plus élevée. Ainsi, la concentration initiale en enzyme dans un mélange de calibration peut être n'importe quelle concentration qui remplit cette condition. De la même manière, l'activité enzymatique initiale la plus élevée, A₀, dans un des mélanges de calibration est choisie en fonction de l'utilisation prévue pour la courbe de calibration.

A l'exception de leurs concentrations initiales en enzyme, les mélanges de calibration utilisés dans une méthode de calibration selon l'invention sont identiques. En particulier, ils contiennent la même concentration initiale en substrat [S]o. De plus, dans tous les mélanges de calibration, le substrat est présent en excès par rapport à l'enzyme. Cet excès permet d'avoir une concentration en substrat qui varie peu au cours de l'état stationnaire. Par "substrat présent en excès par rapport au l'enzyme", on entend une concentration initiale en substrat au moins 10 fois plus élevée que la concentration initiale en enzyme, préférablement au moins 100 fois plus élevée que la concentration initiale en substrat, et plus préférablement encore au moins 1000 fois plus élevée ou au moins 10000 fois plus élevée que la concentration initiale en substrat. En d'autres termes, dans un mélange de calibration ayant une concentration initiale en enzyme [E]_n, l'enzyme est présente en excès par rapport au substrat si le rapport, [E]_n/[S]o, est supérieur ou égal à 10, préférablement supérieur ou égal à 100, et plus préférablement supérieure ou égal à 1000 ou 10000.

Tous les mélanges de calibration ont également le même volume total V. Une méthode de calibration peut être effectuée en utilisant des mélanges de calibration ayant n'importe quel volume total V. Il est évident que pour des raisons de coût, on cherche toujours à minimiser les volumes analytiques. Ainsi, par exemple, le volume V peut être compris entre quelques millilitres (par exemple 1 ml ou 2 ml) et quelques centaines de microlitres (par exemple 500 μΐ, 400 μΐ, 300 μΐ ou moins de 300 μΐ). Les mélanges de calibration ont aussi tous le même milieu réactionnel M_R. On entend par "milieu réactionnel", le solvant dans lequel a lieu la mise en compétition la réaction d'inhibition et la réaction enzymatique. Le milieu réactionnel peut être n'importe quel milieu réaction réactionnel approprié pour de telles réactions. Etant donnée l'influence que peut avoir le milieu réactionnel sur les réactions enzymatiques, l'homme du métier comprendra que la calibration et le dosage (ou la calibration et le criblage) doivent être effectués dans le même milieu réactionnel ou sensiblement le même milieu réactionnel. Ainsi par exemple, lorsque le but est de doser un inhibiteur présent dans un échantillon biologique provenant d'un patient traité par un inhibiteur de l'enzyme, le milieu réactionnel d'un mélange de calibration contient une aliquote d'un échantillon biologique de patient sain (c'est-à-dire un échantillon biologique ne contenant pas l'inhibiteur - voir plus bas).

Dans les Exemples décrits à la fin du présent document, la calibration a été effectuée avec des mélanges de calibration contenant 50 μΐ de plasma sain, 150 μΐ de solution de substrat et 150 μΐ de solution d'enzyme pour un volume total V de 350 μΐ. Avec une telle calibration, le dosage peut être effectué avec un mélange à tester contenant 50 μΐ de plasma obtenu d'un patient traité par un inhibiteur de l'enzyme, 150 μΐ de solution de substrat et 150 μΐ de solution d'enzyme pour un volume total V de 350 μΐ ou plus généralement avec un mélange à tester contenant du plasma obtenu d'un patient traité par un inhibiteur de l'enzyme, de la solution de substrat, et de la solution d'enzyme dans le rapport 1:3:3 en volume .

Préparation des Mélanges de Calibration

Chaque mélange de calibration est préparé en mélangeant une solution de substrat et une solution du substrat de manière à obtenir un mélange de concentration initiale en substrat [S]o et de concentration initiale en enzyme connue, ou d'activité initiale d'enzyme connue. Il est, par exemple, possible d'obtenir les mélanges par dilution sérielle d'une même concentration stock d'enzyme de concentration connue. Pour les dilutions sérielles, une solution tampon ou du plasma (voir plus bas) peuvent être utilisés.

Dans les modes de réalisation, où une aliquote d'un échantillon biologique sain est utilisé, un mélange de calibration est préparé en mélangeant aliquote (diluée ou non) de l'échantillon biologique sain avec une solution de l'enzyme E et une solution du substrat S pour obtenir un mélange de concentration initiale en enzyme connue, ou d'activité initiale connue, et une concentration en substrat [S]o. Comme le sait l'homme du métier, l'ordre d'ajout de la solution de l'enzyme et de la solution du substrat à l'échantillon biologique sain est indifférent dans les cas des inhibiteurs directs. En effet, le mélange à tester peut être obtenu:

- soit en mélangeant d'abord l'échantillon biologique sain avec la solution d'enzyme, puis en ajoutant la solution de substrat marqué (une incubation peut être effectuée avant ajout de la solution de substrat),

- soit en mélangeant d'abord l'échantillon biologique sain avec la solution de substrat marqué, puis en ajoutant de la solution d'enzyme (une incubation peut être effectuée avant ajout de la solution d'enzyme).

Cependant, dans les cas des inhibiteurs indirects, l'échantillon biologique sain est d'abord mélangée avec la solution de l'enzyme en excès, et le mélange est mis à incuber pour un temps suffisamment long pour permettre d'atteindre la phase d'équilibre réactionnel (c'est- à-dire la phase où la totalité du complexe A · I est fixée à l'enzyme). L'ajout de la solution de substrat a alors lieu à la fin de la période d'incubation (voir Exemple 2) et initie la réaction enzymatique.

Conditions Expérimentales

La réaction d'inhibition et la réaction enzymatique peuvent être effectuées dans n'importe quelles conditions expérimentales physico-chimiques (pH, température, force ionique, etc ..) appropriées. Cependant, comme le reconnaîtra l'homme du métier, les réactions de tous les mélanges de calibration doivent être effectuées dans les mêmes conditions expérimentales (en plus d'être effectuées dans le même, ou sensiblement le même, milieu réactionnel).

Les conditions expérimentales optimales d'une réaction enzymatique sont connues dans l'art ou peuvent être facilement déterminées par l'homme du métier. Dans les exemples présentés ici, l'Inventeur a utilisé une température comprise entre 35°C et 40°C, et un milieu réactionnel contenant du tampon Owren Koller (pH 7,35) et/ou du plasma. Détermination de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire

Comme indiqué plus haut, suivre les variations de la propriété physique détectable du marqueur en fonction du temps permet de suivre l'établissement de l'équilibre stationnaire. Le suivi est effectué par mesure de la valeur de la propriété physique détectable du marqueur en fonction du temps. La nature du marqueur détermine la technique utilisée pour mesurer la propriété physique. Ainsi, si le marqueur est un marqueur chromogène, la propriété physique est une densité optique (ou absorbance), qui peut être mesurée par spectrophotométrie, si le marqueur est un marqueur fluorescent, la propriété physique est mesurée par spectrofluorimétrie, etc... Le suivi des variations de la propriété physique détectable du marqueur est effectué soit pendant une période de temps suffisamment longue pour atteindre et observer l'équilibre stationnaire, soit seulement pendant la période d'équilibre stationnaire (par exemple lorsque le temps pour atteindre un tel équilibre est connu ou a été préalablement déterminé). Plus spécifiquement, en reportant sur un graphe, la valeur de la propriété physique en fonction du temps, la courbe obtenue présente, après un certain temps, une partie rectiligne, qui correspond à l'état stationnaire. L'homme du métier sait donc déterminer la durée optimale du suivi des variations de la propriété physique du marqueur. Dans l'Exemple présenté ci-dessous et concernant les anticoagulants oraux directs (AOD), l'Inventeur a mélangé l'échantillon contenant l'AOD avec la solution de substrat et incubé le mélange obtenu pendant 240 secondes, puis ajouté la solution de l'enzyme, ce qui initie la réaction enzymatique. La réaction a été suivie par mesure de la densité optique du marqueur pNA, à 405 nm, au cours du temps pendant une durée de 30 secondes en commençant 50 secondes après l'initiation de la réaction enzymatique, soit entre 50 et 80 secondes. Dans l'Exemple présenté ci-dessous et concernant les héparines, l'Inventeur a mélangé l'échantillon contenant l'héparine avec la solution de l'enzyme et incubé le mélange obtenu pendant 11,5 minutes, puis ajouté la solution de substrat, ce qui initie la réaction enzymatique. La réaction a été suivie par mesure de la densité optique du marqueur pNA, à 405 nm, pendant 30 secondes en commençant 20 secondes après initiation de la réaction enzymatique. Pour chaque mélange de calibration, on obtient, une courbe de suivi du marquage en fonction du temps. Une méthode de calibration selon l'invention comprend ensuite une étape consistant à calculer, pour chaque mélange, la pente de la partie rectiligne de la courbe des variations de la propriété physique détectable du marqueur en fonction du temps. Pour un mélange de calibration donné, c'est-à-dire pour une concentration initiale en enzyme donnée, l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire est la pente de la partie rectiligne de la courbe établie pour le mélange.

Etape b) de là Méthode de Calibration Universelle

L'étape b) d'une méthode de calibration universelle selon l'invention consiste à convertir, pour chacun des mélanges de calibration, la concentration initiale en enzyme du mélange, en activité anti-enzyme exprimée en pourcentage en normalisant ladite concentration initiale en enzyme du mélange par rapport à la concentration initiale en enzyme la plus élevée [E]o, ou à convertir l'activité initiale d'enzyme du mélange, en activité anti-enzyme exprimée en pourcentage en normalisant ladite activité initiale d'enzyme du mélange par rapport à l'activité initiale d'enzyme la plus élevée A₀. La normalisation peut être effectuée par n'importe quelle méthode. Cependant, préférablement, pour un mélange ayant une concentration initiale en enzyme [E], ou une activité initiale d'enzyme A, l'activité anti-enzyme exprimée en pourcentage pour ce mélange, AntiEnzyme_(%), est calculée par l'une des équations suivantes:

AntiEnzyme(%) = 1 - ([E]/[E]o), ou AntiEnzyme(%) = 1 - (A/Ao). Ainsi, pour l'échantillon ayant la concentration initiale en enzyme la plus élevée [E]o, ou l'activité initiale la plus élevée A₀, l'activité anti-enzyme, AntiEnzyme_(%), est nulle.

Par exemple, si la concentration en enzyme la plus élevée [E]₀ est de 10 nM, alors, l'activité anti-enzyme associée est de 0%. Dans le cas où 4 mesures sont effectuées, les 3 mesures restantes peuvent être obtenues pour des concentrations de 7,5 nM, 5 nM et 2,5 nM, leurs activités anti-enzyme associées, calculées comme indiqué précédemment, sont de 0,25 (soit 25%), 0.5 (soit 50%) et 0.75 (soit 25%), respectivement.

Etape c) de la Méthode de Calibration Universelle

L'étape c) d'une méthode de calibration universelle selon l'invention consiste à construire la courbe de calibration en reportant sur un graphe, pour chaque mélange de calibration, l'activité anti-enzyme calculée à l'étape b) en fonction de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue à l'étape a). L'équation de la courbe de calibration peut être déduite par régression des couples (activité anti-enzyme, activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire) portés sur le graphe. La régression peut être une régression linaire ou polynomiale. Dans le cas où la régression est linéaire, l'équation de la courbe de calibration est l' « équation 1 », qui est de la forme:

où :

AntiEnzyme_(%) est l'activité anti-enzyme exprimée en pourcentage,

v est l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire, et

1/vo est la pente de la courbe de calibration, et v₀ correspond à l'activité résiduelle enzymatique mesurée à l'état stationnaire observée lorsque la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon est nulle (L e. , l'activité résiduelle enzymatique maximale).

Les résultats sont exprimés en pourcentage: l'unité est ainsi commune à l'ensemble des inhibiteurs de l'enzyme, et permet de comparer entre elles leur action inhibitrice. Abaque

Comme indiqué plus haut, une méthode de calibration peut être destinée à être utilisée dans le dosage d'un inhibiteur de l'enzyme. Par "inhibiteur de l'enzyme" ou "inhibiteur enzymatique", on désigne toute molécule qui se lie à l'enzyme et diminue son activité. L'inhibiteur peut être réversible ou irréversible. Par "inhibiteur réversible", on entend un inhibiteur qui s'associe à l'enzyme de manière non-covalente (par exemple par des liaisons hydrogène, des interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques), ce qui inactive l'enzyme de manière non permanente. On parle ici d'un "inhibiteur réversible direct", si l'inhibiteur I s'associe directement à l'enzyme, et d'un "inhibiteur réversible indirect", si c'est A · I, le complexe de l'inhibiteur avec le composé présent dans l'échantillon biologique, qui s'associe à l'enzyme. Par "inhibiteur irréversible" d'une enzyme, on entend un inhibiteur qui s'associe à l'enzyme par au moins une liaison covalente et forme alors un complexe stable avec l'enzyme, ce qui inactive l'enzyme de façon permanente. On parle d'un "inhibiteur réversible direct", si l'inhibiteur I s'associe directement à l'enzyme, et d'un "inhibiteur réversible indirect", si c'est A · I, un complexe de l'inhibiteur avec un inhibiteur naturel de l'enzyme présent dans l'échantillon biologique, qui s'associe à l'enzyme. Dans le but de fournir le résultat d'un dosage non pas en activité anti-enzyme exprimée en pourcentage mais sous forme d'une quantité ou d'une concentration de l'inhibiteur (par exemple en ng/ml), ce qui correspond à une unité quantitative stricte, une méthode de calibration selon l'invention peut également comprendre une étape supplémentaire de construction d'un abaque. Ainsi, dans certains modes de réalisation, la méthode de calibration selon l'invention comprend en outre une étape d) consistant à construire un abaque de conversion spécifique à un inhibiteur de l'enzyme E, qui permet de convertir l'activité anti-enzyme, déterminée pour un échantillon à tester, en quantité ou concentration en inhibiteur (par exemple en concentration exprimée en ng/ml).

Préférablement, la méthode de calibration selon l'invention comprend en outre une étape d) consistant à construire au moins un abaque spécifique d'un inhibiteur de l'enzyme E, l'étape d) comprenant les étapes suivantes:

dl) déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour au moins deux mélanges d'étalonnage contenant chacun l'inhibiteur à une concentration initiale connue, l'enzyme E à la concentration [E]o et le substrat S marqué et spécifique de l'enzyme à la concentration [S]o, où:

- dans chacun des mélanges d'étalonnage, l'enzyme est présente en excès par rapport à l'inhibiteur,

- les mélanges d'étalonnage ont le même volume V et le même milieu réactionnel M_R, et

- l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire d'un mélange est déterminée par les étapes suivantes:

dl') mélanger l'inhibiteur avec une solution de l'enzyme E et une solution du substrat S pour obtenir un mélange d'étalonnage de concentration initiale en inhibiteur connue,

dl") mesurer la valeur de la propriété physique détectable du marqueur et reporter, sur un graphe, la valeur de cette propriété physique en fonction du temps pour obtenir une courbe, la courbe présentant une partie rectiligne correspondant à l'état stationnaire, et

dl'") calculer la pente de la partie rectiligne de la courbe obtenue en dl"), où la pente obtenue à l'étape dl'") est l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du mélange d'étalonnage; d2) par chacun des mélanges d'étalonnage, utiliser la courbe de calibration universelle obtenue à l'étape c) de la méthode de calibration universelle, pour déterminer l'activité anti-enzyme du mélange à partir de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire mesurée, à l'étape dl'"), pour le mélange d'étalonnage; et

d3) construire un abaque, ou courbe d'étalonnage, en reportant sur un graphe, pour chaque mélange d'étalonnage, la concentration initiale en inhibiteur du mélange d'étalonnage en fonction de l'activité anti-enzyme déterminée à l'étape d2).

Dans certains modes de réalisation, la méthode peut en outre comprendre une étape supplémentaire d4) consistant à déterminer l'équation de la courbe d'étalonnage par une régression des couples (activité anti-enzyme, concentration en inhibiteur) portés sur le graphe. La régression peut être une régression, linéaire, polynomiale ou autre.

Etape dl) de la Méthode de Calibration

L'étape dl) de la méthode de calibration selon l'invention consiste à déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour au moins deux mélanges d'étalonnage contenant chacun une concentration connue en inhibiteur, l'enzyme E à la concentration [E]o (c'est-à-dire identique à la concentration initiale en enzyme la plus élevée utilisé dans les étapes a)-d) de la méthode de calibration), ou à l'activité initiale A₀ (c'est-à- dire identique à l'activité initiale d'enzyme utilisée dans les étapes a)-d) de la méthode de calibration) et le substrat S à la concentration [S]o (c'est-à-dire identique à la concentration initiale en substrat utilisée dans les étapes a)-d) de la méthode de calibration). Dans les mélanges d'étalonnage, l'enzyme est présente en excès par rapport à l'inhibiteur (voir plus haut).

Par exemple, les mélanges d'étalonnage utilisés pour construire l'abaque peuvent présenter des concentrations initiales croissantes en inhibiteur, typiquement comprises entre 0 et 600 ng/ml. Par exemple, les mélanges d'étalonnage utilisés peuvent avoir des concentrations initiales égales à 0, 100, 200, 300, 400 et éventuellement 500 ng/ml. Alternativement, des mélanges d'étalonnage présentant des concentrations comprises entre 0 et 200 ng/ml peuvent être utilisés. Typiquement, lesdites concentrations peuvent être égales à 0, 30, 65 et 100 ng/ml; ou bien égales à 0, 50, 100 et 150 ng/ml. Les mélanges d'étalonnage utilisés dans l'étape d) de la méthode de calibration ont le même volume V, qui peut être, ou non, identique au volume V des mélanges utilisés dans les étapes a)-c) de la méthode de calibration. Préférablement, le volume V est identique au volume V. Le milieu réactionnel M_R des échantillons d'étalonnage est préférablement identique ou sensiblement identique au milieu réactionnel des échantillons utilisés dans les étapes a)-c) de la méthode de calibration. D'une manière générale, pour la construction de l'abaque, la mise en compétition de la réaction d'inhibition et de la réaction enzymatique est effectuée dans n'importe quelles conditions expérimentales physico-chimiques (pH, température, force ionique, etc ..) appropriées, identiques à celles utilisées dans la méthode de calibration universelle.

Les conditions opératoires décrites pour l'étape a) de la calibration universelle sont applicables à l'étape dl), en particulier en ce qui concerne l'ordre des mélanges (voir plus haut). Avant mélange, l'inhibiteur est préférablement sous forme de solution d'inhibiteur de concentration connue (par exemple l'inhibiteur est ajoutée à un échantillon biologique sain). L'étape dl") (mesure de la valeur de la propriété physique détectable du marqueur en fonction du temps et construction d'une courbe présentant une partie rectiligne) et l'étape dl'") (calcul de la pente de la partie rectiligne de cette courbe pour obtenir l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire) sont effectuées comme les étapes a2) et a3) de la méthode de calibration.

Etape d2) de la Méthode de Calibration

L'étape d2) de la méthode de calibration selon l'invention consiste à utiliser la courbe de calibration universelle obtenue à l'étape c) de la méthode de calibration universelle, pour déterminer, pour chacun des mélanges d'étalonnage, l'activité anti-enzyme du mélange à partir de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire mesurée pour le mélange d'étalonnage. La détermination peut se faire manuellement en reportant l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire mesurée pour un mélange d'étalonnage sur le graphe et en déterminant l'activité anti-enzyme associée. Alternativement, l'activité antienzyme d'un mélange d'étalonnage peut être calculée en utilisant l'équation de la courbe de calibration, par exemple l'équation 1, si la courbe de calibration est une droite.

Etapes d3) et d4) de la Méthode de Calibration

L'étape d3) de la méthode de calibration selon l'invention consiste à construire un abaque ou courbe d'étalonnage, en reportant sur un graphe, pour chaque mélange d'étalonnage, la concentration initiale en inhibiteur du mélange d'étalonnage en fonction de l'activité anti-enzyme déterminée à l'étape d2).

La méthode de calibration selon l'invention peut en outre comprendre une étape supplémentaire d4) consistant à déterminer l'équation de la courbe d'étalonnage par une régression des couples (activité anti-enzyme, concentration en inhibiteur) portés sur le graphe à l'étape d3). La régression peut être une régression, linéaire, polynomiale ou autre. L'homme du métier sait déterminer l'équation d'une courbe d'étalonnage.

Dans certains modes de réalisation de l'invention, si l'inhibiteur est un inhibiteur réversible direct, l'abaque est obtenu en effectuant une régression non-linéaire de l'équation suivante (« équation 2 »), sur les échantillons d'étalonnage dont les couples (activité antienzyme, concentration en inhibiteur) ont été déterminés:

où :

AntiEnzyme_(%) est l'activité anti-enzyme,

-[I]o est la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon, et

i et e sont deux constantes fixes et propres à chaque inhibiteur.

Une modélisation alternative, par exemple un polynôme, est également utilisable.

Dans d'autres modes de réalisation de l'invention, si l'inhibiteur est un inhibiteur irréversible indirect formant un complexe A · I avec un composé A présent dans l'échantillon biologique, l'abaque est obtenu en effectuant:

une régression linéaire de l'équation suivante (« équation 3 »), sur les échantillons d'étalonnage dont les couples (activité anti-enzyme, concentration en inhibiteur) ont été déterminés:

[I]o = e x AntiEnzyme_(%)

où:

AntiEnzyme_(%) est l'activité anti-enzyme,

[I]o est la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon, et

e est une constante fixe et propre à chaque inhibiteur,

l'équation 3 n'étant valable que si la concentration initiale en inhibiteur est inférieure ou égale à la concentration initiale en composé A dans chacun des mélanges d'étalonnage. Une modélisation alternative, par exemple un polynôme, est également utilisable.

L'étape d) de la méthode de calibration peut être répétée pour tout inhibiteur de l'enzyme dont on souhaite disposer d'un abaque spécifique.

C. Automatisation

Dans certains modes de réalisation, certaines étapes de la méthode de calibration universelle (ainsi que de la méthode de dosage ou de criblage) selon l'invention sont réalisées sur un automate de diagnostic. Préférablement, toutes les étapes de la méthode de calibration universelle (ainsi que de la méthode de dosage ou de criblage) selon l'invention sont mises en œuvre sur un tel automate. Par exemple, comme décrit dans les Exemples présentés ici, la méthode de calibration universelle et la méthode de dosage ou de criblage selon l'invention sont mises en œuvre sur l'automate STA-R® Evolution Expert Séries du groupe Stago. Un tel automate permet de charger simultanément les échantillons, d'effectuer les mélanges et l'incubation, et de mesurer les densités optiques. Cela en fait une méthode de calibration ou de dosage rapide, fiable et reproductible. Une méthode selon l'invention peut également être utilisée sur un dispositif de biologie délocalisée ou un dispositif portable au lit du patient.

II - Utilisations de la Méthode de Calibration Universelle

Comme indiqué plus haut, une courbe de calibration obtenue par une méthode de calibration universelle selon l'invention est spécifique de l'enzyme et peut être utilisée pour doser un inhibiteur de l'enzyme dans un échantillon biologique et pour identifier un composé capable d'inhiber l'enzyme dans une méthode de criblage.

A. Méthode de Dosage d'inhibiteurs Enzymatiques dans un Echantillon Biologique

Une méthode de dosage d'un inhibiteur d'une enzyme dans un échantillon biologique comprend les étapes suivantes:

1) déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour un mélange à tester de milieu réactionnel M_R, de volume V", et contenant une aliquote de l'échantillon biologique contenant l'inhibiteur, l'enzyme E à une concentration initiale [E]o ou à une activité initiale Ao, et un substrat S marqué et spécifique de l'enzyme à une concentration initiale [S]o, où: - le substrat spécifique de l'enzyme est marqué par un marqueur ayant une propriété physique détectable, et

- l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du mélange à tester est déterminée par les étapes suivantes:

i) mélanger aliquote de l'échantillon biologique avec une solution de l'enzyme E et une solution du substrat S pour obtenir un mélange de concentration initiale d'enzyme [E]o, ou d'activité initiale d'enzyme A₀, et une concentration initiale en substrat [S]o,

ii) mesurer la valeur de la propriété physique détectable du marqueur et reporter, sur un graphe, la valeur de cette propriété physique en fonction du temps pour obtenir une courbe, la courbe présentant une partie rectiligne correspondant à l'état stationnaire, et

iii) calculer la pente de la partie rectiligne de la courbe obtenue à l'étape ii), où la pente obtenue à l'étape iii) est l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du mélange à tester; et

2) utiliser la courbe de calibration universelle obtenue à l'étape c) de la méthode de calibration universelle, pour déterminer l'activité anti-enzyme de l'échantillon biologique à partir de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire mesurée pour le mélange à tester. De préférence, la méthode de dosage selon l'invention comprend en outre une étape 3) consistant à convertir l'activité anti-enzyme, exprimée en pourcentage et obtenue à l'étape 2), en concentration en inhibiteur en utilisant l'abaque (ou courbe d'étalonnage) spécifique de l'inhibiteur, obtenu à l'étape d) de la méthode de calibration universelle. En effet, la méthode de dosage selon l'invention permet le dosage d'un inhibiteur:

- soit sous la forme d'une activité, exprimée en pourcentage: cela correspond à une unité universelle, qui permet de comparer l'action de différents inhibiteurs entre eux vis-à-vis d'une enzyme donnée;

- soit sous la forme d'une quantité ou concentration (par exemple en ng/ml): cela correspond à une unité quantitative stricte. Etape 1) de là Méthode de Dosage

L'étape 1) de la méthode de dosage selon l'invention consiste à déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour un mélange contenant une aliquote de l'échantillon biologique à tester, la même enzyme E que celle utilisée dans la méthode de calibration, et le même substrat spécifique, marqué S que celui utilisé dans la méthode de calibration. Dans le mélange à tester, la concentration initiale en substrat est [S]o, c'est-à- dire la même concentration que celle utilisée dans la méthode de calibration et la concentration initiale en enzyme est [E]o, c'est-à-dire la concentration initiale en enzyme la plus élevée utilisée dans la méthode de calibration, ou l'activité initiale de l'enzyme est A₀, c'est-à-dire l'activité initiale de l'enzyme la plus élevée utilisée dans la méthode de calibration. Dans un mélange à tester, le substrat est présent en excès par rapport à l'enzyme, qui est elle-même présente en excès par rapport à l'inhibiteur à doser (voir plus haut).

Le volume V" de l'échantillon à tester peut être identique, ou non, au volume V des mélanges utilisés dans les étapes a)-c) de la méthode de calibration, et peut être identique, ou non, au volume V des mélanges d'étalonnage utilisés dans l'étape d) de la méthode de calibration. Préférablement, le volume V" est identique au volume V et au volume V . Le milieu réactionnel du mélange à tester est préférablement identique ou sensiblement identique au milieu réactionnel des échantillons de calibration et des échantillons d'étalonnage.

Enzymes et Inhibiteurs

Comme indiqué plus haut, la présente invention peut être appliquée à n'importe quelle enzyme (telle que définie plus haut) dont il est souhaitable de quantifier la présence d'un inhibiteur, par exemple un inhibiteur thérapeutique, dans un échantillon biologique provenant d'un patient traité par l'inhibiteur thérapeutique.

Dans certains modes de réalisation de l'invention, l'enzyme utilisée dans une méthode de dosage est une enzyme de la coagulation sanguine. Par "enzyme de la coagulation sanguine", on entend toute enzyme impliquée dans la coagulation du sang, comme par exemple les facteurs de coagulation, la kallikréine ou la plasmine. L'enzyme de la coagulation sanguine est de préférence une enzyme de mammifère, préférablement une enzyme bovine ou humaine. L'enzyme peut être d'origine recombinante ou plasmatique; elle peut être purifiée ou non. Dans certains modes de réalisation, l'enzyme de la coagulation sanguine est choisie parmi le facteur Ha, le facteur Xa et la plasmine. Un inhibiteur direct irréversible d'une enzyme de la coagulation sanguine pouvant être dosé par une méthode selon l'invention peut être choisi parmi antithrombine, le cofacteur II de l'héparine, l'alpha-2-macroglobuline, l'hirudine, la lépirudine et la désirudine. Un inhibiteur réversible direct d'une enzyme de la coagulation sanguine pouvant être dosé par une méthode selon l'invention peut être choisi parmi le rivaroxaban, l'apixaban, l'edoxaban, le betrixaban, le dabigatran, la bivalirudine et l'argatroban. Un inhibiteur irréversible indirect d'une enzyme de la coagulation sanguine pouvant être dosé par une méthode selon l'invention peut être choisi parmi les héparines non fractionnées, les héparines de bas poids moléculaires, les pentasaccharides comme le fondaparinux, le danaparoïde sodique. Dans d'autres modes de réalisation de l'invention, l'enzyme est une enzyme de la conversion de l'angiotensine (ECA). L'ECA est une métalloenzyme appartenant à la famille des carboxypeptidases. Elle catalyse le clivage de l'angiotensine I en angiotensine II, un puissant vasoconstricteur. L'ECA est également impliquée dans l'inactivation de la bradykinine, un puissant vasodilatateur. Les inhibiteurs de cette enzyme constituent une classe thérapeutique originale. Ils forment un groupe thérapeutique récent, prenant une part importante dans le traitement de l'hypertension artérielle, de l'insuffisance cardiaque et de la néphrologie diabétique. Des exemples d'inhibiteurs de l'ECA utilisés cliniquement et pouvant être dosés par une méthode selon l'invention incluent, sans limitation, le bénazépril, le captopril, l'enalapril, le monopril, le lisinopril, le moexipril, le périndopril, le quinapril, le ramipril et le tradolapril. La calibration de l'ECA s'effectue à l'aide d'un substrat artificiel comme l'hippuryl-histidyl-leucine (HHL) ou le 3-(2-furylacryloyl)-L-phenylalanyl-glycyl- glycine (FAPGG). Avec ce dernier, la diminution de l'absorbance à 340 nm est proportionnelle à la quantité de substrat hydrolysé.

Echantillons Biologiques

La méthode de dosage d'un inhibiteur enzymatique est effectuée sur un échantillon biologique, en particulier un échantillon biologique provenant d'un patient.

Le terme "patient", tel qu'utilisé ici, désigne un être humain. Le terme "patient" ne désigne pas un âge particulier, et englobe donc les enfants, les adolescents et les adultes. Généralement, dans une méthode de dosage selon l'invention, le patient est un sujet qui reçoit un traitement à base de l'inhibiteur enzymatique dont on souhaite déterminer la quantité dans l'échantillon biologique. Dans le contexte de la présente invention, on parle de "patient normal" ou "patient sain", lorsque le patient ne reçoit pas d'administration de l'inhibiteur enzymatique ou de tout autre médicament pouvant avoir un effet (d'activation ou d'inhibition) de l'enzyme inhibée par l'inhibiteur enzymatique. Dans le cas d'une méthode de dosage d'un inhibiteur d'une enzyme de la coagulation sanguine, le patient sain est un patient qui n'est pas sous traitement pro- ou anti-coagulant. Le terme "échantillon biologique", tel qu'utilisé ici, a son sens le plus large. Un échantillon biologique peut être n'importe quel fluide biologique dans lequel l'inhibiteur est présent et peut être dosé. Des exemples de fluides biologiques pouvant être utilisés dans une méthode de dosage selon l'invention incluent, sans limitation, le sang, le sérum, le plasma, l'urine, la salive, les fluides gastriques, la sueur, etc .. Dans certains modes de réalisation préférés, une méthode de dosage selon l'invention utilise un simple échantillon biologique sanguin du patient. L'échantillon biologique sanguin peut être est un échantillon de sang, de plasma, de plasma riche en plaquettes ou de plasma pauvre en plaquettes ou de plasma contenant des microparticules plaquettaires, érythrocytaires ou toute autre cellule.

Dans certains modes de réalisation, la méthode de dosage selon l'invention est réalisée sur un échantillon de sang total (c'est-à-dire de sang avec tous ses constituants). Le sang total peut être citraté. Dans ce cas, le sang total prélevé par prise de sang est récolté dans un tube citraté.

Dans d'autres modes de réalisation, la méthode de dosage selon l'invention est réalisée sur un échantillon plasmatique obtenu à partir de l'échantillon sanguin. Les méthodes d'obtention de plasma à partir de sang humain sont connues dans l'art. De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon de plasma pauvre en plaquettes (PPP). Dans ce cas, il peut notamment être obtenu par centrifugation du tube citraté comprenant l'échantillon de sang de patient, pendant 15 minutes, à une vitesse de 2000 à 2500 g, dans une centrifugeuse thermostatée à une température comprise entre 18 et 22°C. Si l'échantillon de PPP doit être conservé, il est possible d'utiliser le protocole suivant qui consiste à:

- décanter rapidement le plasma, en laissant environ 0.5 cm de plasma au-dessus de la couche cellulaire des globules blancs et plaquettes;

- récupérer le plasma dans un tube à hémolyse ou un tube plastique;

- centrifuger ce tube à nouveau pendant 15 minutes, à une vitesse de 2000 à 2500 g, dans une centrifugeuse thermostatée à une température comprise entre 18 et 22°C; - aliquoter en fractions de 0,5 à 1 mL sans prendre le fond du tube (qui contient les débris cellulaires); puis

- congeler rapidement à une température comprise entre -70°C et -90°C, de préférence à -80°C. Le dosage selon l'invention peut être effectué sur n'importe quel volume approprié d'échantillon biologique. Généralement, l'aliquote de l'échantillon biologique est utilisée dans la présente invention en faible volume. Ainsi, l'échantillon biologique peut avoir un volume compris entre 2 μL· et 500 μί, de préférence compris entre 3 μΐ_^ et 400 μί, ou entre 3 μΐ_^ et 100 μί, ou encore 5 μΐ_^ et 50 μL· Un tel volume d'échantillon biologique suffit en effet pour l'analyse sur instrument de routine, mais peut être réduit sur un dispositif de biologie délocalisée. Cet échantillon biologique peut être diluée s, notamment dilué dans un tampon (comme le tampon Owren Koller) ou dans du plasma, avant l'ajout de la solution du substrat S et de la solution de l'enzyme E.

Dans les Exemples présentés à la fin de ce document, l'échantillon biologique a typiquement été dilué pour représenter 12,5% en volume du volume final (i.e. 6,25 μΐ d'échantillon dans un volume final de 50 μΐ) avant ajout de la solution du substrat S et de la solution de l'enzyme E), ce qui correspond à environ 1.8 % en volume du mélange à tester de volume total V de 350 μΐ, ou bien 50% en volume du volume final (i.e. 25μ 1 d'échantillon dans un volume final de 50 μΐ), ce qui correspond à environ 7.1 % en volume du mélange à tester de volume total V de 350 μΐ.

Préparation de l'Echantillon à Tester et Conditions des Réactions en Compétition

Le mélange à tester est préparé en mélangeant l'aliquote (diluée ou non) de l'échantillon biologique avec une solution de l'enzyme E et une solution du substrat S pour obtenir un mélange de concentration initiale d'enzyme [E]₀, ou d'activité initiale A₀, et une concentration initiale en substrat [S]o dans un ordre qui est déterminé en fonction de la nature de l'inhibiteur (voir plus haut). D'une manière générale, la mise en compétition de la réaction d'inhibition et de la réaction enzymatique est effectuée dans n'importe quelles conditions expérimentales physico-chimiques (pH, température, force ionique, etc ..) appropriées, identiques à celles utilisées dans la méthode de calibration universelle. L'étape ii) (mesure de la valeur de la propriété physique détectable du marqueur en fonction du temps et construction d'une courbe présentant une partie rectiligne) et l'étape iii) (calcul de la pente de la partie rectiligne de cette courbe pour obtenir l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire) sont effectuées comme les étapes a2) et a3) de la méthode de calibration.

Etape 2) de là Méthode de Dosage

L'étape 2) de la méthode de dosage selon l'invention, qui consiste à utiliser la courbe de calibration universelle obtenue à l'étape c) de la méthode de calibration universelle, pour déterminer l'activité anti-enzyme de l'échantillon biologique à partir de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire mesurée pour le mélange à tester, est effectuée comme l'étape d2) de la méthode de construction de l'abaque. Etape 3) de là Méthode de Dosage

Dans les cas où l'on souhaite obtenir le résultat du dosage sous forme d'une quantité ou d'une concentration en inhibiteur, la méthode de dosage comprend l'étape 3) supplémentaire, qui consiste à convertir l'activité anti-enzyme, exprimée en pourcentage et obtenue à l'étape 2), en concentration en inhibiteur en utilisant l'abaque (ou courbe d'étalonnage) spécifique de l'inhibiteur, obtenu à l'étape d) de la méthode de calibration universelle.

La détermination peut se faire manuellement en reportant l'activité anti-enzyme mesurée pour le mélange à tester sur le graphe et en déterminant la quantité ou la concentration en inhibiteur correspondante. Alternativement, la concentration en inhibiteur peut être calculée en utilisant l'équation de la courbe d'étalonnage. Par exemple, si l'inhibiteur est un inhibiteur réversible direct, la concentration en inhibiteur dans le mélange à tester peut être calculée par l'équation 2 (ou tout autre équation appropriée), et si l'inhibiteur est un inhibiteur irréversible indirect, la concentration en inhibiteur dans le mélange à tester peut être calculée par l'équation 3 (ou tout autre équation appropriée), A la fin de l'étape 3) de la méthode de dosage de l'invention, il est ainsi possible de déterminer la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon biologique testé, par exemple l'échantillon biologique d'un patient traité par l'inhibiteur enzymatique.

Utilisations Cliniques

Dans le domaine des anticoagulants oraux directs (AODs), une méthode de calibration/dosage selon l'invention peut être utilisée pour doser un AOD dans un échantillon biologique du patient traité par l'AOD, dans le but de diagnostiquer un surdosage, par exemple en cas de dépassement de prise par le patient, en cas d'interaction médicamenteuse, en cas de changement de traitement d'un médicament anti vitamine K (AVK) vers un anticoagulant oral direct, ou bien encore avant une intervention chirurgicale ou un geste invasif. En effet, par exemple, si, après arrêt d'administration de l'AOD, le taux d'AOD est encore élevé, il y a risque d'hémorragie pour le patient durant la chirurgie, il est alors nécessaire soit d'attendre que le taux d'AOD diminue, soit d'administrer au patient un composé anti-inhibiteur, afin de contrecarrer les inconvénients de l'inhibiteur, dans une approche d'antidotage.

Ainsi, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une méthode de dosage selon l'invention pour estimer le risque hémorragique chez un patient traité par AOD. En particulier, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une méthode de dosage selon l'invention pour diagnostiquer un surdosage chez un patient traité par un AOD. L'invention a également pour objet l'utilisation d'une méthode de dosage selon l'invention pour déterminer le risque hémorragique d'un patient traité par AOD avant une intervention chirurgicale.

La présente invention concerne aussi une méthode pour estimer le risque hémorragique chez un patient traité par un anticoagulant oral direct (par exemple un inhibiteur du facteur Xa ou un inhibiteur du facteur Ha), la méthode comprenant les étapes suivantes:

- déterminer la quantité ou la concentration en anticoagulant oral direct dans un échantillon biologique du patient en utilisant une méthode de dosage de l'invention, comparer cette quantité ou concentration avec un seuil prédéterminé, et

conclure qu'il y a risque hémorragique si la quantité ou concentration en anticoagulant oral direct est supérieure au seuil prédéterminé, et

- éventuellement, déterminer la quantité de composé anti-inhibiteur à administrer au patient en fonction de la quantité ou concentration en anticoagulant oral direct mesurée dans l'échantillon biologique du patient.

Dans certains modes de réalisation, le patient traité par l'AOD est soupçonné d'être en surdosage d'AOD. Dans d'autres modes de réalisation, le patient traité par l'AOD a subi un récent changement de traitement d'un médicament antivitamine K (AVK) vers un anticoagulant oral direct. Dans encore d'autres modes de réalisation, le patient traité par l'AOD est sur le point de subir une intervention chirurgicale. Par "seuil prédéterminé", on entend ici une quantité ou concentration en inhibiteur qui est connue dans l'art ou qui a été déterminée comme correspondant à une quantité ou concentration en inhibiteur au-dessus de laquelle l'inhibiteur est en excès chez le patient dans une situation donnée (par exemple lors d'une intervention chirurgicale imminente). De tels seuils sont fixés par la communauté scientifique et/ou médicale pour chaque AOD utilisé cliniquement et sont constamment affinés au fur et à mesure que l'on acquiert de l'expérience dans l'utilisation clinique de chaque AOD. Ainsi, par exemple, le seuil décisionnel pour autoriser une intervention chirurgicale chez un patient prenant un traitement d'anticoagulant oral direct (AOD) est un taux inférieur ou égal à 30 ng/ml (a minima pour le rivaroxaban, Pernod et al., Annales françaises d'anesthésie et de réanimation, 2013, 32(10): 691-700).

Dans une méthode selon l'invention, les composés anti-inhibiteurs qui peuvent être administrés à des patients sous AOD et présentant un risque hémorragique incluent les agents hémostatiques. B. Méthode de Criblage D'inhibiteurs Enzymatiques

Comme indiqué plus haut, la méthode de calibration selon l'invention permet d'obtenir des résultats exprimés en pourcentage d'activité anti-enzyme, une unité universelle commune à tous les inhibiteurs de l'enzyme calibrée, ce qui permet de comparer l'efficacité inhibitrice de ces inhibiteurs sur l'enzyme. La méthode de calibration selon l'invention peut donc être utilisée dans une méthode de criblage pour identifier des inhibiteurs de l'enzyme.

De manière générale, une méthode de criblage selon l'invention comprend la détermination de l'activité anti-enzyme mesurée pour une concentration donnée d'un composé test et la comparaison de cette activité anti-enzyme avec l'activité anti-enzyme mesurée dans les mêmes conditions pour la même concentration d'un inhibiteur connu de l'enzyme.

La présente invention concerne donc également une méthode de criblage pour identifier un inhibiteur d'une enzyme, qui comprend les étapes suivantes:

1) déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour un mélange de milieu réactionnel M_R, de volume total V" et contenant un composé test à une concentration initiale [C], l'enzyme E à une concentration initiale [E]₀ ou à une activité initiale Ao et un substrat S marqué et spécifique de l'enzyme à une concentration initiale [S]o, où:

- le substrat spécifique de l'enzyme est marqué par un marqueur ayant une propriété physique détectable,

- dans le mélange, l'enzyme est présente en excès par rapport au composé test, et

- l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du mélange est déterminée par les étapes suivantes:

i) mélanger le composé test avec une solution de l'enzyme E et une solution du substrat S pour obtenir un mélange de concentration initiale d'enzyme [E]o, ou d'activité d'enzyme Ao, de concentration initiale en substrat [S]o, et de concentration [C] en composé test,

ii) mesurer la valeur de la propriété physique détectable du marqueur et reporter, sur un graphe, la valeur de cette propriété physique en fonction du temps pour obtenir une courbe, la courbe présentant une partie rectiligne correspondant à l'état stationnaire, et

iii) calculer la pente de la partie rectiligne de la courbe obtenue à l'étape ii), où la pente obtenue à l'étape iii) est l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du composé à tester;

2) utiliser la courbe de calibration universelle obtenue à l'étape c) de la méthode de calibration universelle, pour déterminer l'activité anti-enzyme du composé test à partir de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire mesurée pour le mélange; et

3) comparer l'activité anti-enzyme du composé test déterminée à l'étape 2) avec l'activité anti-enzyme déterminée, dans les mêmes conditions, pour un inhibiteur standard de l'enzyme à une concentration [C] ou comparer l'activité anti-enzyme du composé test déterminée à l'étape 2) avec un seuil prédéterminé, où le composé test est identifié comme un inhibiteur de l'enzyme si l'activité anti-enzyme du composé test est supérieure à l'activité anti-enzyme de l'inhibiteur standard de l'enzyme ou si l'activité anti-enzyme du composé test est supérieure au seuil prédéterminé

Etape 1) de là Méthode de Criblage

L'étape 1) de la méthode de criblage selon l'invention, qui consiste à déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour un mélange contenant le composé test, la même enzyme E et le substrat S marqué et spécifique de l'enzyme est effectuée similairement à l'étape 1) de la méthode de dosage.

Le volume V" du mélange contenant le composé test peut être identique, ou non, au volume V des mélanges utilisés dans les étapes a)-c) de la méthode de calibration, et peut être identique, ou non, au volume V des mélanges d'étalonnage utilisés dans l'étape d) de la méthode de calibration. Préférablement, le volume V" est identique au volume V et au volume V . Le milieu réactionnel M_R du mélange contenant le composé test est préférablement identique ou sensiblement identique au milieu réactionnel des échantillons de calibration et des échantillons d'étalonnage. Enzymes

Comme déjà indiqué, la présente invention peut être appliquée à n'importe quelle enzyme (telle que définie plus haut) dont il est intéressant d'identifier des inhibiteurs, par exemple dans le but de développer des inhibiteurs thérapeutiques humains ou vétérinaires. Ainsi, dans une méthode de calibration/criblage selon l'invention, l'enzyme est une cible thérapeutique identifiée. Plus spécifiquement, dans une méthode de calibration/criblage selon l'invention, l'enzyme peut être toute enzyme appartenant aux classes des hydrolases, des lyases ou des isomérases et identifiée comme une cible thérapeutique.

Des exemples de lyases identifiées comme cibles thérapeutiques incluent, sans limitation, la DOPA décarboxylase (ou acide L-aminé aromatique décarboxylase, une enzyme dont des inhibiteurs cliniques connus incluent la carbidopa et la bensérazide, qui sont utilisées dans le cadre de la maladie de Parkinson, et le méthyldopa, qui est utilisé dans le traitement de l'hypertension gestationnelle); anhydrase carbonique (une enzyme qui est présente à la surface plasmide intracellulaire des globules rouges, et dont les inhibiteurs cliniques sont utilisés comme agents anti-glaucomes, diurétiques, antiépileptiques, ainsi que dans le traitement des ulcères gastro-duodénaux, des troubles neurologiques ou encore de l'ostéoporose); l'histidine décarboxylase (dont les inhibiteurs cliniques connus, comme la catéchine et la tritoqualine, sont utilisés comme antihistaminiques); et l'ornithine décarboxylase (dont un inhibiteur clinique connu, l'eflornithine, est utilisé dans le traitement du cancer). Des exemples d'hydrolases identifiées comme cibles thérapeutiques incluent, sans limitation, les aspartyl protéases (ou protéases asptartiques) virales (dont les inhibiteurs cliniques connus incluent, sans limitation, le saquinavir et l'indinavir qui sont utilisés dans le traitement d'une infection par le VIH, et le télaprévir et le bacéprévir qui sont utilisés dans le traitement de l'hépatite C); les protéases à serine, telles que les protéases à serine humaines qui comprennent des enzymes digestives pancréatiques, comme la trypsine, la chymotrypsine et l'élastase (dont les inhibiteurs peuvent être utiles dans le traitement de maladies sérieuses comme l'emphysème, la fibrose cystique ou la développement et la progression du cancer), des enzymes impliquées dans la coagulation, comme la thrombine, la kallikréine, le facteur Xa (voir plus haut), et des enzymes impliquées dans la fibrinolyse, comme la plasmine; les métalloprotéases qui incluent, sans limitation, l'enzyme de la conversion de l'angiotensine humaine (voir plus haut), la HMG-CoA réductase (dont les inhibiteurs cliniques connues incluent les statines qui sont utilisées comme médicaments pour baisser la cholestérolémie), et l'enképhalinase humaine (dont les inhibiteurs trouvent application comme analgésiques, antidépresseurs, anxiolytiques, et antidiarrhétiques); et d'autres hydrolases comme par exemple les estérases, les glycosidases virales, les glycosidases humaines, les lipases, les phosphatases, et les phosphorylases.

Des exemples d'isomérases identifiées comme cibles thérapeutiques incluent, sans limitation, l'alanine isomérase (qui est surtout présente chez les bactéries, ce qui en fait une cible privilégiée pour le développement d'agents antibactériaux).

Composés Tests

Dans une méthode de criblage selon l'invention, tout type de composé peut être testé.

Ainsi, un composé test peut être un produit naturel ou un produit synthétique; il peut être une molécule unique ou bien un mélange ou un complexe de différentes molécules.

Dans certains modes de réalisation, un composé test appartient à une chimiothèque (c'est-à-dire une banque de molécules). Les chimiothèques peuvent contenir plusieurs dizaines à plusieurs millions de composés chimiques. Des chimiothèques de composés naturels sous la forme d'extraits bactériens ou fongiques, ou sous la forme d'extraits de plantes sont disponibles par exemple chez Pan Laboratories (Bothell, WA) ou MycoSearch (Durham, NC). Des chimiothèques de composés synthétiques sont également commercialement disponibles, par exemple, chez Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH), Microsource (New Milford, CT), et Aldrich (Milwaukee, WI) ou chez des grandes sociétés chimiques comme Merck, Glaxo Welcome, Bristol-Meyers- Squibb, Novartis, Monsanto/Searle, et Pharmacia UpJohn. Les composés test peuvent appartenir à n'importe quelle classe de molécules, comme les protéines, les peptides, les peptidomimétiques, les peptoïdes, les saccharides, les stéroïdes, etc .. Les composés test peuvent également être des "small molécules" ou molécules de petits poids molécules, généralement compris entre environ 50 et environ 2500 Daltons, comme par exemple entre 500 et 700 Daltons, et moins de 350 Daltons.

Conditions Opératoires

Les conditions opératoires décrites pour l'étape a) de la calibration universelle ou pour l'étape 1) de la méthode de dosage sont applicables à l'étape 1) de la méthode de criblage.

Dans certains modes opératoires, un seul composé est testé par une méthode d'identification de la présente invention. Dans d'autres modes opératoires, plusieurs composés sont testés en parallèle. Dans ce cas, les réactions enzymatiques peuvent être réalisées sur une plaque multi-puits, ce qui permet de conduire de nombreux essais simultanément. Parmi les supports typiques, on trouve les plaques de micro titration et plus particulièrement les plaques de 12, 24, 48, 96, 384 puits (ou plus), qui sont faciles à manipuler.

Un composé peut être testé à une seule concentration. Alternativement, un composé peut être testé à plusieurs concentrations, par exemple des concentrations se trouvant dans la gamme de concentrations où l'inhibiteur connu de l'enzyme, qui est utilisé comme contrôle, est actif. Identification de Composés Inhibiteurs de l'Enzyme

Dans une méthode de criblage selon l'invention, un composé test est identifié comme un inhibiteur de l'enzyme si l'activité anti-enzyme du composé test est supérieure à l'activité anti-enzyme mesurée, dans les mêmes conditions, pour un inhibiteur standard de l'enzyme ou si l'activité anti-enzyme du composé test est supérieure au seuil prédéterminé. Par "inhibiteur standard de l'enzyme", on désigne ici un inhibiteur connu de l'enzyme.

L'homme du métier sait sélectionner l'inhibiteur standard pour identifier les composés test susceptibles de présenter un intérêt clinique. Par exemple, l'inhibiteur standard peut être un inhibiteur enzymatique utilisé cliniquement.

Par "seuil prédéterminé", on entend ici une quantité ou concentration en inhibiteur qui, à la concentration testée, a été identifiée comme la valeur d'activité anti-enzyme au-dessus de laquelle le composé test peut être considéré comme un inhibiteur de l'enzyme susceptible de présenter un intérêt clinique.

Développement d'Inhibiteurs Thérapeutiques

Un procédé de criblage selon l'invention a pour but d'identifier des composés inhibiteurs de l'enzyme et susceptibles de présenter un intérêt clinique. Un test de criblage selon l'invention peut être suivi par d'autres essais, par exemple par un ou plusieurs tests de criblage selon l'invention conduits en comparaison avec d'autres inhibiteurs connus de l'enzyme et/ou avec d'autres enzymes appartenant à la même classe. Alternativement ou additionnellement, un test de criblage selon l'invention peut être suivi par des études de toxicité in vivo sur des modèles cellulaires ou sur des modèles animaux. Lorsqu'un composé test a été identifié comme présentant une activité inhibitrice sur l'enzyme, des études de relations structure-activité peuvent être menées dans le but d'identifier de nouveaux squelettes inhibiteur présentant des propriétés améliorées comparées au composé test identifié. III - Kits

La présente invention vise également des kits comprenant du matériel utile pour la réalisation d'une méthode selon l'invention. En particulier, la présente invention concerne des kits pour le dosage d'inhibiteurs d'une enzyme et des kits pour le criblage de composés capables d'inhiber une enzyme. Un kit est généralement conçu pour une enzyme donnée. Cependant, un kit peut également être conçu pour plus d'une enzyme. Par exemple, un kit peut être conçu pour au moins deux enzymes impliquées dans un mécanisme ou biologique commun, notamment pour au moins deux enzymes de la coagulation sanguine. Lorsque le kit est destiné à être utilisé dans une méthode de dosage, il peut être conçu pour être utilisé dans le cas d'un seul inhibiteur de l'enzyme. Alternativement, le kit peut être conçu pour le dosage de plusieurs inhibiteurs différents de l'enzyme (par exemple 2 inhibiteurs différents, ou plus de 2 inhibiteurs différents). De plus, lorsque le kit est destiné à être utilisé dans une méthode de dosage d'un inhibiteur, le kit peut être conçu pour permettre un seul dosage. Alternativement, le kit peut être conçu pour effectuer un nombre fini de dosages, par exemple 2 dosages, ou 5 dosages, ou 10 dosages, ou 20 dosages, ou 50 dosages, etc .. De manière générale, un kit selon l'invention comprend l'enzyme et le substrat spécifique. Dans certains modes de réalisation, le substrat spécifique contenu dans le kit est marqué. Dans d'autres modes de réalisation, le substrat spécifique contenu dans le kit n'est pas marqué mais le kit comprend au moins un réactif nécessaire à son marquage. L'enzyme et le substrat sont fournis dans une quantité appropriée pour effectuer la calibration et le nombre de dosages prévus. Quand le kit est destiné à être utilisé dans une méthode de dosage d'un inhibiteur de l'enzyme, le kit peut comprendre un ou plusieurs échantillons d'étalonnage de l'inhibiteur. Quand le kit est destiné à être utilisé pour le dosage de différents inhibiteurs de l'enzyme, le kit peut comprendre un ou plusieurs échantillons d'étalonnage de chacun des différents inhibiteurs de l'enzyme. Quand le kit est destiné à être utilisé dans une méthode de criblage pour l'identification d'inhibiteurs de l'enzyme, le kit peut comprendre au moins un inhibiteur standard de l'enzyme.

Un kit selon l'invention peut en outre comprendre des réactifs ou solutions pour la mise en œuvre d'une méthode de calibration/dosage ou de calibration/criblage selon l'invention, par exemple des réactifs ou solutions pour diluer l'échantillon biologique, etc.... En particulier, un kit peut comprendre un tampon pour diluer les échantillons biologiques, par exemple un tampon TOK. Des protocoles pour utiliser ces réactifs et/ou solutions peuvent également être inclus dans le kit.

Un kit selon l'invention peut également comprendre des contrôles qualité. Les différents composants du kit peuvent être fournis sous forme solide (par exemple sous forme lyophilisée) ou sous forme liquide. Un kit peut éventuellement comprendre un récipient contenant chacun des réactifs ou solutions, et/ou des récipients pour réaliser certaines étapes d'une méthode de calibration/dosage ou de calibration/criblage de l'invention. Généralement, un kit selon l'invention comprend également des instructions pour mettre en œuvre une méthode de calibration/dosage ou de calibration/criblage selon l'invention.

Un kit selon l'invention peut aussi comprendre une notice sous la forme prescrite par une agence gouvernementale régulant la préparation, la vente et l'utilisation de produits biologiques. A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevet, tous les brevets et toutes autres références mentionnés ici sont incorporés par référence.

Exemples

Les exemples suivants et les figures décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, il est entendu que les exemples ne sont présentés qu'à titre illustratif seulement et ne limitent en aucun cas la portée de l'invention. Légendes des Figures

Figure 1: Calibrations universelles. Les graphiques donnent l'activité anti-Xa (%) en fonction des DO/mn correspondantes observées sur 10 points expérimentaux.

(A) Méthodologie gamme large: la régression linéaire de ces points expérimentaux donne la droite d'équation y = 1,053 - 0,999 x avec un coefficient de détermination R² = 0,994. (B) Méthodologie gamme fine: la régression linéaire de ces points expérimentaux donne la droite d'équation y = 1,034 - 1,081 x avec un coefficient de détermination R² = 0,996.

Figure 2: Abaques de conversion. Ces abaques permettent la conversion de l'activité anti-Xa (%) mesurée en concentration exprimée en ng/ml pour chacun des trois anticoagulants oraux directs (AODs). (A) Méthodologie gamme large: les régressions non- linéaires de l'équation 2 sur plusieurs points expérimentaux donnent respectivement pour le rivaroxaban (·) i = 0,73 et e = 16,43, pour l'apixaban ( A ) i = 1,35 et e = 14,66 et pour l'edoxaban (■) i = 1,14 et e = 15,66. (B) Méthodologie gamme fine: les régressions non- linéaires de l'équation 2 sur plusieurs points expérimentaux donnent respectivement pour le rivaroxaban (·) i = 1,42 et e = 15,36, pour l'apixaban ( A ) i = 2,91 et e = 13,23, et pour l'edoxaban (■) i = 1,98 et e = 14,96.

Figure 3: Rivaroxaban. (A) Méthodologie gamme large: les comparaisons des résultats des dosages des taux en rivaroxaban mesurés sur 20 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle selon l'invention aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = 6,91 + 0,98 x avec un coefficient de détermination R² = 0,998. (B) Méthodologie gamme fine: les comparaisons des résultats des dosages des taux en rivaroxaban mesurés sur 8 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle selon l'invention aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = 1,63 + 0,96 x avec un coefficient de détermination R² = 0,995.

Figure 4: Apixaban. (A) Méthodologie gamme large: les comparaisons des résultats des dosages des taux en apixaban mesurés sur 24 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle selon l'invention aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = 10,41 + 0,97 x avec un coefficient de détermination R² = 0,999. (B) Méthodologie gamme fine: les comparaisons des résultats des dosages des taux en apixaban mesurés sur 10 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle selon l'invention aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = 2,79 + 0,97 x avec un coefficient de détermination R² = 0,999.

Figure 5: Edoxaban. (A) Méthodologie gamme large: les comparaisons des résultats des dosages des taux en edoxaban mesurés sur 24 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle selon l'invention aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = 0,99x + 0,83 avec un coefficient de détermination R² = 0,996. (B) Méthodologie gamme fine: les comparaisons des résultats des dosages des taux en edoxaban mesurés sur 10 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle selon l'invention aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = l,00x - 0,24 avec un coefficient de détermination R² = 0,997.

Figure 6: Amélioration de la régression de la calibration universelle. Les graphes présentent l'activité anti-Xa (%) en fonction des DO/mn correspondantes observées sur 10 points expérimentaux en méthodologie gamme fine. (A) Régression linéaire: la régression linéaire de ces points expérimentaux donne la droite dont l'équation est: y = 1,034 - 1,081 x avec un coefficient de détermination R² = 0,9963. (B) La égression avec un polynôme d'ordre deux: la régression de ces points expérimentaux donne le polynôme d'équation y = 0,978 - 0,789 x - 0,281 x² avec un coefficient de détermination R² = 0,9998.

Figure 7: Dilution en plasma - calibrations universelles. Les graphes présentent l'activité anti-Xa (%) en fonction des DO/mn correspondantes observées sur 10 points expérimentaux en méthodologies gamme large (·) et gamme fine ( A). (A) Dilution dans du tampon: les régressions linéaires donnent en méthodologie gamme large (·) la droite d'équation y = 1,053 - 0,999 x avec un coefficient de détermination R² = 0,994 et en méthodologie gamme fine ( A ), la droite d'équation y = 1,034 - 1,081 x avec un coefficient de détermination R² = 0,996. (B) Dilution dans du plasma: les régressions linéaires donnent respectivement en méthodologie gamme large (·) la droite d'équation: y = 1,022 - 1,173 x avec un coefficient de détermination R² = 0,998 et en méthodologie gamme fine ( A ) la droite d'équation y = 1,020 - 1,198 x avec un coefficient de détermination R² = 0,998.

Figure 8: Dilution en plasma: rivaroxaban. (A) Méthodologie gamme large: les comparaisons des résultats des dosages des taux en rivaroxaban mesurés sur 20 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle selon l'invention avec une dilution dans du plasma aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = 1,03 + 0,96 x avec un coefficient de détermination R² = 0,999. (B) Méthodologie gamme fine: les comparaisons des résultats des dosages des taux en rivaroxaban mesurés sur 8 surcharges en utilisant le principe de calibration universelle selon l'invention avec une dilution dans du plasma aux taux théoriques donnent la droite d'équation y = 1,15 + 0,95 x avec un coefficient de détermination R² = 0, 995.

Figure 9: Calibration universelle. Le graphique donne l'activité anti-Xa( ) en fonction des DO/mn correspondantes observées sur 10 points expérimentaux. La régression linéaire de ces points expérimentaux a donné la droite d'équation y = 0,094 - 0,518 x avec un coefficient de détermination R = 0,996.

Figure 10: Abaques de conversion. Les abaques présentés sur cette figure permettent la conversion de l'activité anti-Xa (%) mesurée en concentration en Ul/ml pour

(A) l'Héparine non-fractionnée : la régression linéaire des points expérimentaux a donné la droit d'équation y = 2,354 x - 0,02569 avec un coefficient de détermination R = 0,992, et

(B) l'Héparine de bas poids moléculaire : la régression linéaire de ces points expérimentaux a donné la droite d'équation y = 1,621 x - 0,02827 avec un coefficient de détermination R² = 0,979.

Figure 11: (A) Héparine Non-Fractionnée. La comparaison des résultats des dosages des taux en héparine non-fractionnée mesurés sur 11 surcharges en utilisant le principe de la calibration universelle aux taux théoriques a donné la droite d'équation y = 1,025 x - 0,01107 avec un coefficient de détermination R² = 0,979. (B) Héparine de Bas Poids Moléculaire. La comparaison des résultats des dosages des taux en héparine de bas poids moléculaire mesurés sur 7 surcharges en utilisant le principe de la calibration universelle aux taux théoriques a donné la droite d'équation y = 0,9764 x + 0,01489 avec un coefficient de détermination R = 0,985. Exemple 1: Inhibiteurs Réversibles Directs

Les antagonistes de la vitamine K (AVK) sont historiquement la première et unique classe d'anticoagulants qui s'administrent par voie orale. La grande variabilité dans la réponse des patients à ce type de traitements, à laquelle s'ajoutent de nombreuses interactions alimentaires et médicamenteuses, imposent une surveillance régulière in vitro du traitement, impliquant pour le patient de nombreux prélèvements sanguins. Ce constat a conduit l'industrie pharmaceutique à développer une nouvelle famille d'anticoagulants, appelés anticoagulants oraux directs (AODs), qui théoriquement ne requièrent pas de suivi régulier et n'ont que peu d'interactions alimentaires et médicamenteuses. Cette famille d'anticoagulants se décline en deux classes:

- les anti-Xa, inhibiteurs directs du facteur Xa; et

- les anti-IIa, inhibiteurs directs de la thrombine.

Comme indiqué plus haut, il existe certaines situations où le dosage des anticoagulants oraux directs (AODs) est utile, comme par exemple: en en amont d'une intervention chirurgicale urgente, dans le cas d'une suspicion de surdosage, ou dans le cas d'une hémorragie d'origine inconnue. L'étude présentée ici se focalise sur la famille des anti-Xa dont les principales molécules sont:

- le rivaroxaban commercialisé par Bayer/Janssen Pharmaceutical sous le nom de Xarelto^®;

- l'apixaban commercialisé par Bristol-Myers Squibb/Pfizer sous le nom de Eliquis^®; et - l'edoxaban commercialisé par Daiichi Sankyo sous le nom de Savaysa^® ou Lixiana^®.

I. Protocoles Expérimentaux

1. Matériels

Les échantillons de plasma (Etablissement Français du Sang, La Plaine Saint-Denis, France) sont issus de patients sains, qui n'étaient pas sous traitements pro- ou anti- coagulants. Différents pools de plasma datés de 01/2011, 03/2012, 04/2014, 11/2014 et 02/2015 ont été utilisés pour les expériences. Avant la réalisation des pools de poches de plasma, des tests ont été réalisés afin de vérifier que les valeurs des taux de prothrombine (TP), des temps de céphaline avec activateur (TCA) ainsi que les concentrations en facteurs de coagulation étaient conformes. Les poches de plasma ont, par la suite, été décongelées pendant 50 minutes à 37°C et laissées à température ambiante pendant 30 minutes pour stabilisation. Un pool a été réalisé et le plasma a été mis sous agitation à 153 tours/min pendant 35 minutes avant répartition. Les fractions ont été conservées à environ -70°C. Avant utilisation, elles ont été décongelées à 37°C pendant 5 minutes.

Les surcharges en anticoagulants ont été réalisées à partir de solutions d'apixaban (Eliquis, Bristol Myers Squibb, New York, Etats Unis) concentrées à 400 μg/mL, de solutions de tosylate d'edoxaban (Lixiana, Daiichi-Sankyo, Tokyo, Japon) concentrées à 500 μg/mL et de solutions de rivaroxaban (Xarelto, Bayer, Leverkusen, Allemagne) concentrées à 393 μg/mL.

Les réactifs du kit commercial STA^® - Liquid Anti-Xa (Diagnostica Stago, Asnières sur Seine, France), F.Xa (facteur Xa d'origine bovine) et substrat (MAPA-Gly-Arg-pNA) ont été utilisés. Ces réactifs commerciaux ainsi que le pool de plasma humain normal Pool Norm (Diagnostica Stago, Asnières sur Seine, France), le tampon Owren Koller (TOK) (pH 7,35, STA^® - Owren-Koller, Diagnostica Stago, Asnières sur Seine, France) et la solution de désorption (DU) STA^® - Desorb U (Diagnostica Stago, Asnières sur Seine, France) ont été régénérés à température ambiante pendant 30 minutes, comme recommandé par le fournisseur.

Du diméthylsulfoxyde (DMSO) (Carlo Erba, Val de Rueil, France) dilué à 5 % dans de l'eau déminéralisée a été utilisé pour les expériences.

Toutes les mesures ont été effectuées sur l'automate STA^® (Diagnostica Stago, Asnières sur Seine, France) AUT00460 (Numéro Hasting). La version de logiciel de l'automate utilisée dans ces expériences est étaient la version v3.04.05.

2. Méthodes

Dosages enzymatiques anti-Xa. Le suivi des cinétiques s'obtient a été effectué par colorimétrie à 405 nm en détectant la libération de paranitroanilide (pNA). La densité optique (DO) a été mesurée toutes les deux secondes. Deux méthodologies ont été optimisées pour le dosage des trois anticoagulants oraux directs anti-Xa: la méthodologie gamme large et la méthodologie gamme fine. En effet, la méthodologie gamme large permet le dosage des anticoagulants sur l'intégralité de la plage souhaitée; toutefois la mesure de faibles concentrations de ces anticoagulants nécessitant une grande précision, une méthodologie gamme fine a donc été développée. En gamme large, 6,25 μΐ_^ d'échantillon biologique (plasma) ont été dilués avec du

TOK dans un volume final de 50 μΐ_^. La micro-cuvette a été incubée pendant 240 secondes à 37°C en présence de 150 μΐ_^ de substrat. La réaction a été déclenchée par l'ajout de 150 μL· de F.Xa préalablement incubé à 37°C. En gamme fine, 25 μΐ_^ d'échantillon ont été dilués avec 25 μΐ_^ de TOK. Les conditions expérimentales d'ajout de substrat et d'enzyme sont les mêmes que pour la méthodologie gamme large. La détermination des pentes a été effectuée entre 50 et 80 secondes.

Calibration universelle. La calibration est a été réalisée à partir d'une gamme en F.Xa composée de 10 points allant de 10% à 100% de F.Xa, correspondant à une activité anti-Xa allant de 90% à 0%. La gamme a été créée à partir des réactifs du kit STA^® Liquid Anti-Xa. Le F.Xa (2 ml, 1,8 ml, 0,2 ml) a été dilué dans du TOK (0 ml, 0,2 ml... 1,8 ml) pour un volume final de 2 ml. Le pool de plasmas sains daté du 04/2014 a été utilisé pour cette expérience. Du DMSO 5% a été dilué au l/20^eme dans le plasma. Les résultats (mesures des DO/mn entre 50 et 80 secondes) ont été déterminés en deux réplicats.

Les pentes des cinétiques mesurées pour les 10 points de calibration permettent le tracé du graphe activité anti-Xa(%) en fonction de la DO/mn. L'équation de la courbe obtenue est utilisée pour convertir les DO/mn des échantillons testés en activité anti-Xa en pourcentage. L'équation de la courbe est donnée par une régression polynomiale d'ordre un ou d'ordre deux.

Construction des abaques de conversion. Les paramètres de l'abaque, propres à chaque anticoagulant oral direct (AOD), ont été déterminés pour chacune des deux méthodologies (méthodologie gamme large et méthodologie gamme fine) par une régression non-linéaire de l'équation 2 sur quelques points expérimentaux. En gamme large, les échantillons surchargés à 0, 100, 200, 300 et 400 ng/ml en AOD ont été utilisés pour construire l'abaque associé au rivaroxaban. Les échantillons surchargés à 0, 100, 200, 300, 400 et 500 ng/ml ont été utilisés pour construire les abaques associés à l'apixaban et à l'edoxaban. En gamme fine, les échantillons surchargés à 0, 30, 65 et 100 ng/ml en AOD ont été utilisés pour construire l'abaque associé au rivaroxaban. Les échantillons surchargés à 0, 50, 100 et 150 ng/ml en AOD ont été utilisées pour construire les abaques associés à l'apixaban et à l'edoxaban. Pour chaque échantillon la DO/mn a été mesurée entre 50 et 80 secondes. Surcharges de plasma. Le pool de plasma daté du 04/2014 a été utilisé pour réaliser les surcharges. Les dilutions des solutions mères en anticoagulants oraux directs (AODs) ont été effectuées dans du DMSO %. Une solution intermédiaire à 10 μg/ml a été utilisée afin de réaliser les gammes de dilution pour les différentes surcharges. La dilution des AOD dans le plasma était au l/20^eme. Les concentrations des surcharges étaient de 0, 10, 20, 30, 40, 50, 65, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400 ng/ml pour le rivaroxaban et de 0, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ng/ml pour l'apixaban et l'edoxaban. Le volume final des surcharges était de 1 ml. Les solutions contenant de l'edoxaban ont été conservées à l'abri de la lumière. Les résultats (mesures des DO/mn entre 50 et 80 secondes) ont été déterminés pour chaque surcharge en trois réplicats.

Configuration des tests pour la calibration universelle. Une configuration de test a été créée par dilution en F.Xa pour les méthodologies gamme large et gamme fine. Les conditions expérimentales sont les mêmes que celles décrites dans la section "Dosages enzymatiques anti-Xa".

Configuration des tests pour la construction des abaques. Comme précédemment, les différentes mesures ont été obtenues suivant les méthodologies gamme large et gamme fine décrites dans la section "Dosages enzymatiques anti-Xa".

Configuration des tests pour les surcharges de plasma. Les mesures sur les plasmas surchargés en AODs ont été effectuées suivant les méthodologies gamme large et gamme fine décrites dans la section "Dosages enzymatiques anti-Xa".

Détermination de la limite de blanc. La limite de blanc (LoB) a été réalisée suivant une procédure standard. Les cinq différents plasmas utilisés ont été ceux datés du 01/2011, du 03/2012, du 04/2014, du 11/2014 et du 02/2015. Quatre réplicats ont été réalisés chaque jour, pendant trois jours sur le même automate. Les tests ont été effectués pour les méthodologies gamme large et gamme fine.

Détermination de la limite de détection. La détermination de la limite de détection (LoD) a été réalisée suivant une procédure standard. Des plasmas bas en analyte ont été préparés. Les surcharges ont été effectuées au l/20^eme. Le plasma daté du 04/2014 a été utilisé. Lorsque la régression de la calibration universelle était un polynôme d'ordre un, les concentrations en analytes en gamme large étaient de 10 ng/ml en rivaroxaban et en apixaban et de 15 ng/ml pour l'edoxaban. En gamme fine, les concentrations des surcharges étaient de 5 ng/ml pour les trois anticoagulants. Cinq surcharges ont été réalisées pour un volume final de 900 μΐ_^. Lorsque la régression de la calibration universelle était un polynôme d'ordre deux, les concentrations en analytes en gamme large et en gamme fine étaient de 2 ng/ml pour les trois anticoagulants oraux directs (AODs). Le volume final des surcharges était de 1000 μL· Chaque surcharge a été fractionnée en trois tubes. Les échantillons ont été congelés à -70°C jusqu'à leur utilisation. Les analyses ont été effectuées sur trois jours sur le même automate avec quatre réplicats d'analyse par jour et par surcharge.

Dosages enzymatiques anti-Xa avec dilution en plasma. Les conditions expérimentales sont identiques à celles décrites dans les sections précédentes mis à part le fait que la dilution n'a pas été effectuée dans du tampon mais dans du plasma. Le diluant utilisé était le Pool Norm. La calibration universelle a toutefois été obtenue en diluant le F.Xa dans du TOK dans les mêmes conditions que celles décrites dans la section "Calibrations universelles".

IL Résultats

1. Calibrations universelles

La Figure 1 présente des exemples de calibrations universelles selon l'invention obtenues respectivement en méthodologies gamme large et gamme fine, qui expriment les résultats en activité anti-Xa (%) en fonction des DO/mn mesurées. Les régressions linéaires des différents points expérimentaux donnent les équations:

y = 1,053 - 0,999 x (R² = 0,994), et y = 1,034 - 1,081 x (R = 0,996). L'équation théorique de ces calibrations universelles est donnée par la droite d'équation 1 comme décrit plus haut dans la description; les résultats obtenus ici sont en parfait accord avec cette expression: c'est-à-dire que l'on obtient une régression linéaire avec un coefficient de détermination très proche de 1 et une ordonnée à l'origine proche de

1. Il est intéressant de noter que les équations de ces deux droites sont différentes. Ceci s'explique par le fait que la dilution de l'échantillon est différente entre les deux méthodologies (1/8 pour la méthodologie gamme large, 1/2 pour la méthodologie gamme fine); un effet matrice est observé.

2. Abaques de conversion

La Figure 2 illustre les abaques qui permettent de convertir l'activité anti-Xa (%) mesurée en concentration exprimée en ng/ml pour chacun des trois anticoagulants oraux directs (AODs). Ces abaques ont été construits en effectuant une régression non-linéaire de l'équation 2 sur des échantillons dont les couples (activité anti-Xa, concentration en anticoagulant) étaient connus. En méthodologie gamme large, ces régressions non-linéaires ont respectivement des coefficients de détermination R² de 0,997 pour le rivaroxaban, de 0,995 pour l'apixaban et de 0,993 pour edoxaban. En méthodologie gamme fine, ces régressions non-linéaires ont respectivement des coefficients de détermination R² de 0,993 pour le rivaroxaban, de 0,997 pour l'apixaban et de 0,992 pour l'edoxaban. L'ensemble des valeurs de ces coefficients de détermination souligne la pertinence du modèle mathématique développé. En outre, à concentrations égales, le rivaroxaban possède l'activité anti-Xa in vitro la plus élevée alors que l'edoxaban a la plus faible activité anti-Xa: ceci confirme que la concentration exprimée en ng/ml n'est pas une unité universelle pour le dosage des AODs anti-Xa.

3. Dosages de plasmas surchargés en Anticoagulants Oraux Directs (AODs)

Dans cette section, les résultats des dosages des taux de plasmas surchargés en AODs (rivaroxaban, apixaban et edoxaban) ont été obtenus en utilisant le principe de calibration universelle selon l'invention et comparés aux taux théoriques. Les résultats sont jugés satisfaisants lorsque la pente de la régression linéaire est comprise entre 0,9 et 1,1 et que le coefficient de détermination R² est supérieur ou égal à 0,95.

Rivaroxaban. La Figure 3 présente les résultats des comparaisons des dosages des taux en rivaroxaban mesurés en utilisant le principe de calibration universelle en méthodologie gamme large (20 surcharges) et en méthodologie gamme fine (8 surcharges) et comparés aux taux théoriques. Ces comparaisons ont donné respectivement une pente de 0,98 et de 0,96 ainsi qu'un coefficient de détermination de 0,998 et de 0,995, validant ainsi les résultats.

Apixaban. La Figure 4 présente les résultats des comparaisons des dosages des taux en apixaban mesurés en utilisant le principe de calibration universelle en méthodologie gamme large (24 surcharges) et en méthodologie gamme fine (10 surcharges) et comparés aux taux théoriques. Ces comparaisons ont donné respectivement une pente de 0,97 et de 0,97 ainsi qu'un coefficient de détermination de 0,999 et de 0,999, validant ainsi les résultats. Edoxaban. La Figure 5 présente les résultats des comparaisons des dosages des taux en edoxaban mesurés en utilisant le principe de calibration universelle en méthodologie gamme large (24 surcharges) et en méthodologie gamme fine (10 surcharges) et comparés aux taux théoriques. Ces comparaisons donnent respectivement une pente de 0,99 et de 1,00 ainsi qu'un coefficient de détermination de 0,996 et de 0,997, validant ainsi les résultats.

4. Limites de blanc et limites de détection

Dans cette section, les limites de blanc (LoB) ainsi que les limites de détection (LoD) mesurées ont été obtenues en utilisant le principe de calibration universelle en méthodologie gamme large et gamme fine. De plus, une méthode d'amélioration de ces valeurs en méthodologie gamme fine est proposée. Pour rappel, le seuil décisionnel pour autoriser une intervention chirurgicale chez un patient prenant un traitement d'anticoagulant oral direct (AOD) est un taux inférieur ou égal à 30 ng/ml (a minima pour le rivaroxaban, Pernod et al., Annales françaises d'anesthésie et de réanimation, 2013, 32(10): 691-700).

Méthodologie gamme large. Le Tableau 1 ci-dessous liste les limites de blanc et les limites de détection obtenues en méthodologie gamme large en utilisant le principe de calibration universelle selon l'invention. Les valeurs des LoD observées étaient respectivement de 21,5 ng/ml pour le rivaroxaban, de 21,8 ng/ml pour apixaban et de 28,8 ng/ml pour l'edoxaban. Ces résultats indiquent que la méthodologie gamme large ne permet pas de mesurer les faibles taux en AODs anti-Xa avec la précision requise dans le contexte d'une intervention chirurgicale urgente.

Tableau 1: Méthodologie gamme large - limites de blanc et limites de détection.

Méthodologie gamme fine. Le Tableau 2 ci-dessous liste les limites de blanc et les limites de détection obtenues en méthodologie gamme fine en utilisant le principe de calibration universelle selon l'invention. Les valeurs des LoD observées étaient respectivement de 6,9 ng/ml pour le rivaroxaban, de 6,9 ng/ml pour apixaban et de 8,7 ng/ml pour l'edoxaban. Ces résultats démontrent que la méthodologie gamme fine est suffisamment performante pour mesurer avec précision de très faibles taux en AODs anti- Xa. Tableau 2: Méthodologie gamme fine - limites de blanc et limites de détection.

Optimisation en méthodologie gamme fine. Il a été démontré et validé expérimentalement que la calibration universelle suit une droite donnée par l'équation 1. Toutefois, de manière empirique, une régression de la calibration universelle par un polynôme d'ordre deux devrait mieux exprimer les points expérimentaux qu'une régression linéaire. Cela est confirmé expérimentalement - voir la Figure 6. La régression de la calibration universelle par un polynôme d'ordre deux permet d'améliorer les LoB et LoD en méthodologie gamme fine (cf. le Tableau 3, ci-dessous) mais n'impacte pas sur la qualité des comparaisons des taux mesurés aux taux théoriques (résultats non montrés). Tableau 3: Optimisation en méthodologie gamme fine - limites de blanc et limites de détection.

5. Dilution en plasma

La différence de la valeur de la dilution de l'échantillon entre les méthodologies gamme large (dilution = 1/8) et gamme fine (dilution = 1/2) induit un effet matrice. Une méthode est proposée ici pour s'en affranchir. Pour cela, dans la calibration universelle, l'échantillon n'est plus dilué dans du tampon (TOK) mais il est dilué dans du plasma (Pool Norm), les facteurs de dilution restant inchangés. La Figure 7 compare l'allure des calibrations universelles lorsque l'échantillon est dilué dans du tampon à l'allure des calibrations universelles lorsque l'échantillon est dilué dans du plasma. Les régressions linéaires des points expérimentaux en méthodologie gamme large et en méthodologie gamme fine donnent, respectivement les droites d'équation:

y = 1,053 - 0,999 x et

y = 1,034 - 1,081 x +,

lorsque l'échantillon est dilué dans du tampon, et donnent les droites d'équation y = 1,022 - 1,173 x et

y = 1,020 - 1,198 x

lorsque l'échantillon est dilué dans du plasma.

Ces résultats indiquent que lorsque l'échantillon est dilué dans du plasma, les équations des deux droites des calibrations universelles se superposent. Dans cette configuration, il n'est plus nécessaire d'effectuer deux calibrations mais simplement une seule, commune aux deux méthodologies (méthodologie gamme large et méthodologie gamme fine). Il faut par ailleurs souligner que la comparaison des taux théoriques en rivaroxaban aux taux mesurés dans des plasmas surchargés en utilisant le principe de calibration universelle avec dilution de l'échantillon dans du plasma donne une pente de

0.96 et un coefficient de détermination de 0,999 en méthodologie gamme large, et une pente de 0,95 et un coefficient de détermination de 0,995 en méthodologie gamme fine, voir la Figure 8: ces résultats démontrent qu'il est possible de mesurer in vitro les taux en anticoagulants oraux directs dans des échantillons dilués dans du plasma. Exemple 2: Inhibiteurs Irréversibles Indirects

1. Protocoles Expérimentaux

1. Matériels

Les échantillons de plasma (Etablissement Français du Sang, La Plaine Saint-Denis, France) et les réactifs dans l'Exemple 2 sont les mêmes que ceux utilisés dans l'Exemple 1. Les surcharges en héparines ont été réalisées à partir de solutions d'héparine calcique

(Cari-parine^®, Sanofi-Aventis, Paris, France), concentrées à 5000 UI/0,2 mL et de tinzaparine sodique (Innohep^®, Léo Pharma, Ballerup, Danemark) à 10000 UI/0,5 mL.

2. Méthodes

Dosages enzymatiques anti-Xa. Le suivi des cinétiques a été effectué comme dans l'Exemple 1. La méthodologie a été optimisée pour le dosage des héparines non fractionnées et des héparines à bas poids moléculaires. Deux (2) \L de plasma ont été dilués dans du TOK dans un volume final de 100 mL. La microcuvette a été mise à incuber pendant 690 secondes à 37°C en présence de 100 mL de F.Xa. La phase de mesure a été déclenchée par l'ajout de 100 mL de substrat préalablement incubé à 37°C. La détermination des pentes a été effectuée entre 20 et 50 secondes. Calibration universelle. La calibration a été réalisée comme dans l'Exemple 1 à l'exception du fait que les mesures ont été effectuées entre 20 et 50 secondes.

Construction des abaques de conversion. Les paramètres de l'abaque, propres à chaque héparine, ont été déterminés par une régression linéaire de l'équation 3 sur quelques points expérimentaux. Les échantillons surchargés à 0, 0,3, 0,6 et 1,0 UI/mL ont été utilisés pour construire l'abaque associé à l'héparine calcique. Les échantillons surchargés à 0, 0,2,

0.4 et 0,6 UI/mL ont été utilisés pour construire l'abaque associé à la tinzaparine sodique. Pour chaque échantillon, la DO/mn est mesurée entre 20 et 50 secondes.

Surcharges de plasma. Un pool de plasma a été utilisé pour réaliser les surcharges. Les dilutions des solutions mère en héparines ont été faites dans du sérum physiologique. Les concentrations des surcharges étaient de 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, et 1,0 UI/mL pour l'héparine calcique et de 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, et 0,6 UI/mL pour la tinzaparine sodique. Le volume final des surcharges était de 0,5 mL. Les résultats (mesures des DO/mn entre 20 et 50 secondes) ont été déterminés pour chaque surcharge en trois réplicats.

Configuration des tests pour la calibration universelle, Configuration des tests pour la construction des abaques, et Configuration des tests pour les surcharges de plasma.

Les conditions expérimentales sont les mêmes que celles décrites dans la section "Dosages enzymatiques anti-Xa". IL Résultats

1. Calibration universelle

La Figure 9 illustre la calibration universelle qui exprime les résultats en activité anti- Xa ( ) en fonction des DO/mn mesurées. La régression linéaire des différents points expérimentaux donnent l'équation y = 0,994 - 0,518 x =(R = 0,996). L'équation théorique de cette calibration est donnée par la droite d'équation 1. Les résultats obtenus sont en parfait accord avec cette expression - c'est-à-dire une régression linéaire avec un coefficient de détermination très proche de 1 et une ordonnée à l'origine proche de 1.

2. Abaques de conversion

La Figure 10 présente les abaques établis pour convertir l'activité anti-Xa( ) mesurée en concentration en UI§/ml pour chacune des deux familles d'héparines. Ces abaques ont été construits en effectuant une régression linéaire sur des échantillons dont les couples (activité anti-Xa, concentration en anticoagulant) étaient connus. Les régressions linéaires des points expérimentaux sont données la droite d'équation y = 2,354 x - 0,01569 pour l'héparine non-fractionnée et la droite d'équation y = 1,621 x - 0,028247 et pour l'héparine de bas poids moléculaire. Ces équations sont en parfaite adéquation (droite avec une ordonnée proche de zéro) avec l'équation 2. De plus, l'équation 3 est théoriquement valide quand la concentration en héparine est inférieure ou égale à la concentration en antithrombine. Dans le cas contraire, l'héparine n'est plus mesurable étant donné qu'elle sature complètement antithrombine plasmatique. Ce comportement s'observe sur les abaques de la Figure 10. En effet, la régression linéaire ne s'applique que pour des activités anti-Xa inférieures ou égales à 52,75% pour l'héparine non-fractionnée et à 52,85% pour l'héparine de bas poids moléculaires. Ces valeurs sont extrêmement concordantes bien que déterminées de manière indépendante. Ainsi, l'ensemble des résultats obtenus confirme la pertinence du modèle mathématique développé ici.

3. Dosages de Plasmas Surchargés en Héparines

Les résultats des dosages des taux de plasmas surchargés en héparine non-fractionnée et en héparine de bas poids moléculaires obtenus en utilisant le principe de la calibration universelle selon la présente invention sont présentés ici par comparaison aux taux théoriques. Les résultats ont été jugés satisfaisants lorsque la pente de la régression linéaire est comprise entre 0,9 et 1,1, et que le coefficient de détermination R est supérieur ou égal à 0,95.

Héparine Non-Fr actionnée. La Figure 11(A) présente les résultats obtenus en utilisant 11 surcharges héparine non-fractionnée. La comparaison des taux mesurés en utilisant le principe de la calibration universelle aux taux théoriques a donné une pente de 1,025 et un coefficient de détermination de 0,987, ce qui valide les résultats. Héparine de Bas Poids Moléculaire. La Figure 11(B) présente les résultats obtenus en utilisant 7 surcharges héparine de bas poids moléculaire. La comparaison des taux mesurés en utilisant le principe de la calibration universelle aux taux théoriques a donné une pente de 0,9764 et un coefficient de détermination de 0,985, ce qui valide les résultats.

Claims

Revendications

1. Une méthode pour obtenir une calibration universelle pour le dosage d'un inhibiteur d'une enzyme, la méthode comprenant les étapes suivantes:

a) déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour chacun d'une pluralité de mélanges contenant l'enzyme E et un substrat S marqué et spécifique de l'enzyme, où:

- le substrat spécifique de l'enzyme est marqué par un marqueur ayant une propriété physique détectable,

- dans chacun des mélanges, le substrat est présent en excès par rapport à l'enzyme,

- les mélanges contiennent une même concentration initiale de substrat, [S]o,

- les mélanges ont le même volume total V et le même milieu réactionnel M_R,

- les mélanges ont des concentrations initiales en enzyme connues et décroissantes, la concentration initiale en enzyme la plus élevée étant [E]_¾ ou ont des activités initiales d'enzyme connues et décroissantes, l'activité initiale d'enzyme la plus élevée étant A₀, et

- l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire d'un mélange est déterminée par les étapes suivantes:

al) mélanger une solution de l'enzyme E et une solution du substrat S pour obtenir un mélange de concentration initiale d'enzyme connue, ou d'activité initiale d'enzyme connue, et de concentration initiale de substrat [S]o,

a2) mesurer la valeur de la propriété physique détectable du marqueur et reporter, sur un graphe, la valeur de cette propriété physique en fonction du temps pour obtenir une courbe, la courbe présentant une partie rectiligne correspondant à l'état stationnaire, et

a3) calculer la pente de la partie rectiligne de la courbe obtenue en a2), où la pente obtenue en a3) est l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du mélange;

b) pour chacun des mélanges de l'étape a), convertir la concentration initiale en enzyme du mélange, en activité anti-enzyme exprimée en pourcentage en normalisant ladite concentration initiale en enzyme du mélange par rapport à la concentration initiale en enzyme la plus élevée [E]o, ou convertir l'activité initiale d'enzyme du mélange, en activité anti-enzyme exprimée en pourcentage en normalisant ladite activité initiale d'enzyme du mélange par rapport à l'activité initiale d'enzyme la plus élevée A₀,

c) construire une courbe de calibration universelle en reportant, sur un graphe, pour chaque mélange, l'activité anti-enzyme déterminée à l'étape b) en fonction de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire obtenue à l'étape a).

La méthode selon la revendication 1, dans laquelle l'enzyme appartient à la classe des hydrolases, à la classe des lyases, ou à la classe des isomérases.

La méthode selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle l'inhibiteur est un inhibiteur réversible direct ou indirect, ou un inhibiteur irréversible direct ou indirect.

La méthode pour obtenir une calibration universelle selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, où dans l'étape b), pour un mélange de concentration initiale en enzyme, [E], l'activité anti-enzyme exprimée en pourcentage est calculée par l'équation:

AntiEnzyme _% = 1 - ([E]/[E]₀), et pour un mélange d'activité initiale d'enzyme, A, l'activité anti-enzyme exprimée en pourcentage est calculée par l'équation:

AntiEnzyme % = 1 - (A/Ao).

5. La méthode pour obtenir une calibration universelle selon l'une quelconque revendications 1 à 4, où dans l'étape c), la courbe de calibration est une droite d'équation:

où:

AntiEnzyme_(%) est l'activité anti-enzyme exprimée en pourcentage,

v est l'activité résiduelle enzymatique à l'état stationnaire, 1/vo est la pente de la courbe de calibration, et v₀ est l'activité résiduelle enzymatique à l'état stationnaire observée en absence d'un inhibiteur.

La méthode pour obtenir une calibration universelle selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant en outre une étape d) consistant à construire un abaque de conversion spécifique à un inhibiteur de l'enzyme E et permettant de convertir l'activité anti-enzyme, déterminée pour un échantillon à tester, en quantité ou concentration en inhibiteur.

La méthode pour obtenir une calibration universelle selon la revendication 6, dans laquelle l'étape d) comprend les sous-étapes suivantes:

dl) déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour au moins deux mélanges d'étalonnage contenant chacun l'inhibiteur à une concentration initiale connue, l'enzyme E à la concentration initiale [E]₀ ou à l'activité initiale A₀, et le substrat S marqué et spécifique de l'enzyme à la concentration [S]o, où:

- dans chacun des mélanges d'étalonnage, l'enzyme est présente en excès par rapport à l'inhibiteur,

- les mélanges d'étalonnage ont le même volume V et le même milieu réactionnel M_R, et

- l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire d'un mélange est déterminée par les étapes suivantes:

dl') mélanger l'inhibiteur avec une solution de l'enzyme E et une solution du substrat S pour obtenir un mélange d'étalonnage de concentration initiale en inhibiteur connue,

dl") mesurer la valeur de la propriété physique détectable du marqueur et reporter, sur un graphe, la valeur de cette propriété physique en fonction du temps pour obtenir une courbe, la courbe présentant une partie rectiligne correspondant à l'état stationnaire, et

dl'") calculer la pente de la partie rectiligne de la courbe obtenue en dl"), où la pente obtenue à l'étape dl'") est l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du mélange d'étalonnage; d2) par chacun des mélanges d'étalonnage, utiliser la courbe de calibration universelle obtenue à l'étape c) de la méthode de calibration universelle, pour déterminer l'activité anti-enzyme du mélange à partir de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire mesurée à l'étape dl'") pour le mélange d'étalonnage; et

d3) construire un abaque ou courbe d'étalonnage, en reportant sur un graphe, pour chaque mélange d'étalonnage, la concentration initiale en inhibiteur du mélange d'étalonnage en fonction de l'activité anti-enzyme déterminée à l'étape d2).

8. La méthode pour obtenir une calibration universelle selon la revendication 7, dans laquelle le volume V est identique au volume V.

9. La méthode pour obtenir une calibration universelle selon la revendication 7 ou la revendication 8, dans laquelle l'étape d) comprend en outre la sous-étape d4) consistant à déterminer l'équation de la courbe d'étalonnage par une régression des couples (activité anti-enzyme, concentration en inhibiteur) portés sur le graphe à l'étape d3).

10. La méthode pour obtenir une calibration universelle selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans laquelle:

si l'inhibiteur est un inhibiteur réversible direct, l'équation de la courbe d'étalonnage est l'équation suivante:

. ,

= i x

h e X AntÀEnz-yme₍-<%.)

^* 1 — ÀntŒnzyme{%)

où :

AntiEnzyme_(%) est l'activité anti-enzyme,

[I]₀ est la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon à tester, et i et e sont deux constantes fixes et propres à l'inhibiteur; et si l'inhibiteur est un inhibiteur irréversible indirect, l'équation de la courbe d'étalonnage est l'équation suivante:

[I]o = e x AntiEnzyme_(%)

où: AntiEnzyme_(%) est l'activité anti-enzyme dans l'échantillon à tester,

[I]o est la concentration en inhibiteur présent dans l'échantillon, et e est une constante fixe et propre à l'inhibiteur.

11. Une méthode de dosage d'un inhibiteur d'une enzyme dans un échantillon biologique comprend les étapes suivantes:

1) déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour un mélange à tester de milieu réactionnel M_R, de volume V", et contenant une aliquote de l'échantillon biologique contenant l'inhibiteur, l'enzyme E à une concentration initiale [E]₀ ou à une activité initiale A₀, et un substrat S marqué et spécifique de l'enzyme à une concentration initiale [S]o, où:

- le substrat spécifique de l'enzyme est marqué par un marqueur ayant une propriété physique détectable, et

- l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du mélange à tester est déterminée par les étapes suivantes:

i) mélanger l'aliquote de l'échantillon biologique avec une solution de l'enzyme E et une solution du substrat S pour obtenir un mélange de concentration initiale d'enzyme [E]₀, ou d'activité initiale d'enzyme A₀, et une concentration initiale en substrat [S]o, ii) mesurer la valeur de la propriété physique détectable du marqueur et reporter, sur un graphe, la valeur de cette propriété physique en fonction du temps pour obtenir une courbe, la courbe présentant une partie rectiligne correspondant à l'état stationnaire, et

iii) calculer la pente de la partie rectiligne de la courbe obtenue à l'étape ii),

où la pente obtenue à l'étape iii) est l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du mélange à tester; et

2) utiliser la courbe de calibration universelle obtenue à l'étape c) de la méthode de calibration selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour déterminer l'activité anti-enzyme de l'échantillon biologique à partir de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire mesurée pour le mélange à tester.

12. La méthode de dosage selon la revendication 11, dans laquelle l'échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma, de plasma riche en plaquettes ou de plasma pauvre en plaquettes, de plasma contenant des microparticules plaquettaires, érythrocytaires ou toute autre cellule.

13. La méthode de dosage selon la revendication 12, dans laquelle l'échantillon biologique est un échantillon de plasma pauvre en plaquettes.

14. La méthode selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, dans laquelle l'enzyme est une enzyme de la coagulation sanguine choisie parmi les facteurs de coagulation, la kallikréine et la plasmine, de préférence choisie parmi le facteur lia, le facteur Xa, et la plasmine.

15. La méthode selon la revendication 14, dans laquelle l'inhibiteur est choisi parmi l'antithrombine, le cofacteur II de l'héparine, l'alpha-2-macroglobuline, l'hirudine, la lépirudine, la désirudine, le rivaroxaban, l'apixaban, l'edoxaban, le betrixaban, le dabigatran, la bivalirudine, l'argatroban, les héparines non fractionnées, les héparines de bas poids moléculaires, les pentasaccharides, et le danaparoïde sodique.

16. La méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, dans laquelle le volume V" est identique au volume V.

17. Une méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 11 à 16 comprenant en outre l'étape suivante:

3) convertir l'activité anti-enzyme exprimée en pourcentage et obtenue à l'étape 2), en concentration en inhibiteur en utilisant l'abaque spécifique de l'inhibiteur obtenu à l'étape d) de la méthode calibration selon l'une quelconque des revendications 6 à 10.

18. La méthode de dosage selon la revendication 17, dans laquelle le volume V" est identique au volume V.

19. Utilisation d'une méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 11 à 18 pour estimer le risque hémorragique chez un patient traité par un anticoagulant oral direct.

20. Une méthode pour estimer le risque hémorragique chez un patient traité par un anticoagulant oral direct, la méthode comprenant les étapes suivantes:

déterminer la quantité ou la concentration en anticoagulant oral direct dans un échantillon biologique du patient en utilisant une méthode de dosage de l'invention;

comparer cette quantité ou concentration avec un seuil prédéterminé; et conclure qu'il y a risque hémorragique si la quantité ou concentration en anticoagulant oral direct est supérieure au seuil prédéterminé.

21. La méthode pour estimer le risque hémorragique chez un patient traité par un anticoagulant oral direct selon la revendication 20, comprenant en outre l'étape suivante:

déterminer la quantité de composé anti-inhibiteur à administrer au patient en fonction de la quantité ou concentration en anticoagulant oral direct mesurée dans l'échantillon biologique du patient.

22. L'utilisation selon la revendication 19, ou la méthode selon la revendication 20 ou la revendication 21, dans laquelle le patient traité par l'anticoagulant oral direct est un patient soupçonné d'être en surdosage d'anticoagulant oral direct, ou est un patient ayant subi un récent changement de traitement d'un médicament antivitamine K vers l'anticoagulant oral direct, ou est un patient sur le point de subir une intervention chirurgicale.

23. Une méthode de criblage pour identifier un inhibiteur d'une enzyme, comprenant les étapes suivantes:

1) déterminer l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire pour un mélange de milieu réactionnel M_R, de volume V" et contenant un composé test à une concentration initiale [C], l'enzyme E à une concentration initiale [E]₀ ou à une activité initiale A₀ et un substrat S marqué spécifique de l'enzyme à une concentration initiale [S]o, où:

- le substrat spécifique de l'enzyme est marqué par un marqueur ayant une propriété physique détectable,

- dans le mélange, l'enzyme est présente en excès par rapport au composé test, et - l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du mélange est déterminée par les étapes suivantes:

i) mélanger le composé test avec une solution de l'enzyme E et une solution du substrat S pour obtenir un mélange de concentration initiale d'enzyme [E]o, ou d'activité d'enzyme A₀, une concentration initiale en substrat [S]o, et une concentration [C] en composé test, ii) mesurer la valeur de la propriété physique détectable du marqueur et reporter, sur un graphe, la valeur de cette propriété physique en fonction du temps pour obtenir une courbe, la courbe présentant une partie rectiligne correspondant à l'état stationnaire, et

iii) calculer la pente de la partie rectiligne de la courbe obtenue à l'étape ii),

où la pente obtenue à l'étape iii) est l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire du composé à tester;

2) utiliser la courbe de calibration universelle obtenue à l'étape c) de la méthode de calibration universelle, pour déterminer l'activité anti-enzyme du composé test à partir de l'activité enzymatique résiduelle à l'état stationnaire mesurée pour le mélange; et

3) comparer l'activité anti-enzyme du composé test déterminée à l'étape 2) avec l'activité anti-enzyme déterminée, dans les mêmes conditions, pour un inhibiteur standard de l'enzyme à une concentration [C] ou comparer l'activité anti-enzyme du composé test déterminée à l'étape 2) avec un seuil prédéterminé, où le composé test est identifié comme un inhibiteur de l'enzyme si l'activité anti-enzyme du composé test est supérieure à l'activité anti-enzyme de l'inhibiteur standard de l'enzyme ou si l'activité anti-enzyme du composé test est supérieure au seuil prédéterminé.

La méthode de criblage selon la revendication 23, dans laquelle le volume V" est identique au volume V.

25. La méthode de criblage selon la revendication 23 ou la revendication 24, dans laquelle l'enzyme appartient à la classe des hydrolases ou à la classe des lyases.

26. Un kit pour identifier un inhibiteur d'une enzyme E comprenant l'enzyme E,

un substrat S marqué et spécifique de l'enzyme, et

des instructions pour mettre en œuvre une méthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 22 à 25.

27. Un kit pour doser au moins un des inhibiteurs d'une enzyme E dans un échantillon biologique, le kit comprenant

l'enzyme E,

un substrat S marqué et spécifique de l'enzyme,

au moins un inhibiteur de l'enzyme, et

des instructions pour mettre en œuvre une méthode de dosage selon l'une quelconque des revendications 11 à 19.

28. Le kit selon la revendication 27, comprenant en outre au moins un autre inhibiteur de l'enzyme.