WO2017194814A1 - Microarns como biomarcadores para el diagnóstico del cáncer de pulmón - Google Patents

Microarns como biomarcadores para el diagnóstico del cáncer de pulmón Download PDF

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WO2017194814A1
WO2017194814A1 PCT/ES2017/070307 ES2017070307W WO2017194814A1 WO 2017194814 A1 WO2017194814 A1 WO 2017194814A1 ES 2017070307 W ES2017070307 W ES 2017070307W WO 2017194814 A1 WO2017194814 A1 WO 2017194814A1
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lung cancer
diagnosis
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classification
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PCT/ES2017/070307
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French (fr)
Inventor
Antonio RODRÍGUEZ ARIZA
Rosario LÓPEZ PEDRERA
Nuria BARBARROJA PUERTO
Carlos PÉREZ SÁNCHEZ
Original Assignee
Servicio Andaluz De Salud
Universidad de Córdoba
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention is within the field of Molecular Biology and Clinical Medicine, and specifically refers to a method of obtaining useful data for the diagnosis, classification and / or monitoring of lung cancer.
  • Lung cancer is one of the leading causes of death in industrialized countries, ranking second only to cardiovascular diseases. Tobacco is the main risk factor, being the cause of 85-90% of all cases. Despite its high incidence and mortality, it has a low prevalence because most cases are detected in late stages, so it would be very important to have diagnostic tests capable of detecting the disease as soon as possible, as well as the type of tumor and its invasiveness to guide treatment.
  • the condensation analysis of exhaled breath air is a non-invasive test in which exhaled air enters a refrigeration system to condense.
  • This condensed air contains proteins and microRNAs, which may constitute markers of respiratory pathologies, including lung cancer (Conrad et al., 2008. Gen. Intern. Med. 23 Suppl. 1, 78-84. Doi: 10.1007 / s1 1606 -007-041 1 -1).
  • MicroRNAs are small RNA molecules, 20-25 nucleotides, non-coding for proteins that regulate posttranscriptional processing of RNA, by pairing bases with their complementary messenger RNA (mRNA), leading to repression of transcription or degradation of mRNA (Filipowicz et al., 2008. Nature Reviews Genetics, 9 (2), 102-1 14). Approximately 2500 microRNAs have been identified in the human species, their key participation in the regulation of many cellular processes has been demonstrated and their alteration is associated with the development of different pathologies, especially cancer.
  • microRNAs have been detected and has been related to the type of cancer, highlighting its role in the diagnosis of the disease (Xie et al., 2010. Lung Cancer, 67 (2), 170-176; Yu et al., 2010. International Journal of Cancer, 127 (12), 2870-2878).
  • MicroRNAs have also been isolated in exhaled air condensate (Puneet and Faoud, 2013. Journal of Analytical Sciences, Methods and Instrumentation, 3, 17-29).
  • high levels of microRNA-21 and microRNA-486 have been found differentially expressed in exhaled air condensate of patients with microcytic lung cancer (Mozonni et al., 2013. Biomarkers., 18 (8), 679-686).
  • a first aspect of the invention relates to the use of microRNA biomarkers: m ⁇ R-146a, m ⁇ R-122, m ⁇ R-148a, m ⁇ R-214, m ⁇ R-372 , m ⁇ R-let7c, m ⁇ R-30c, m ⁇ R-19a, m ⁇ R-193b, m ⁇ R-29b and m ⁇ R-17 for the diagnosis, classification and / or monitoring of lung cancer.
  • microRNA biomarkers m ⁇ R-146a, m ⁇ R-122, m ⁇ R-148a, m ⁇ R-214, m ⁇ R-372 , m ⁇ R-let7c, m ⁇ R-30c, m ⁇ R-19a, m ⁇ R-193b, m ⁇ R-29b and m ⁇ R-17 for the diagnosis, classification and / or monitoring of lung cancer.
  • a second aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data for the diagnosis, classification and / or monitoring of an individual or subject potentially suffering from lung cancer, hereafter referred to as the first method of the invention, comprising: a) quantify the expression product of the biomarkers m ⁇ R-146a, m ⁇ R-122, m ⁇ R-148a, m ⁇ R-214, m ⁇ R-372, miR-let7c, m ⁇ R-30c, m ⁇ R-19a, m ⁇ R-193b, m ⁇ R-29b and / om ⁇ R-17 in a biological sample isolated from said individual.
  • the biological sample is condensate of exhaled air.
  • the first method of the invention further comprises: b) calculating the A index according to the equation:
  • A -0.083 + 0.177 * (m ⁇ R-122 / m ⁇ R-29b) + 0.009 * (m ⁇ R-29b / m ⁇ R-146) - 0.038 * (m ⁇ R- 214 / m ⁇ R-146) -0.041 * (m ⁇ R-193 / m ⁇ R-146) + 0.004 * (m ⁇ R-30 / m ⁇ R-146) + 0.056 * (m ⁇ R- 146 / m ⁇ R- 372), c) calculate the index B according to the equation:
  • a third aspect of the invention relates to a method for the classification, diagnosis and monitoring of lung cancer, hereafter referred to as the second method of the invention, comprising steps (a) and (b) according to the first method of the invention, and also comprises: g) classify the individual of step (a) in the group of individuals with lung cancer when the value of the index A of step (b) is preferably less than 0.88, more preferably less than 0.75, and even more preferably less than 0.579.
  • a fourth aspect of the invention relates to a method for the classification, diagnosis and monitoring of lung cancer, hereafter referred to as the third method of the invention, comprising steps (a) and (c) according to the first method of the invention.
  • the invention also includes: h) classifying the individual from step (a) into the group of individuals with non-small cell lung cancer of the adenocarcinoma and non-epidermoid type when the B index value of step (c) is preferably less than 0.91, more preferably less than 0.72, and even more preferably less than 0.50.
  • a fifth aspect of the invention relates to a method for the classification, diagnosis and monitoring of lung cancer, hereafter referred to as the fourth method of the invention, comprising steps (a) and (d) according to the first method of the invention, and further comprises: i) classifying the individual from step (a) in the group of individuals with invasive tumor lung cancer when the value of the C index of step (d) is preferably greater than 0.30, more preferably greater than 0.39, and even more preferably greater than 0.65.
  • a sixth aspect of the invention relates to a method for the classification, diagnosis and monitoring of lung cancer, hereafter referred to as the fifth method of the invention, which comprises steps (a) and (e) according to the first method of the invention, and further comprises: j) classifying the individual from step (a) into the group of individuals with lung cancer with metastasis when the value of the D index of step (e) is preferably greater than 0.28, more preferably greater than 0.34, and even more preferably greater than 0.45.
  • a seventh aspect of the invention relates to a method for the classification, diagnosis and monitoring of lung cancer, hereafter sixth method of the invention, which comprises steps (a) and (f) according to the first method of the invention, and further comprises: k) classifying the individual from step (a) in the group of individuals with stage 4 lung cancer when the value of the E index of step (f) is preferably greater than 0.18, more preferably greater than 0.39, and even more preferably greater than 0.64.
  • the biological sample isolated from step (a) is a sample of exhaled air condensate.
  • kits or devices comprising the elements necessary to detect the expression levels of the microRNAs: m ⁇ R-146a, m ⁇ R- 122, m ⁇ R- 148a, m ⁇ R-214, m ⁇ R-372, m ⁇ R-let7c, m ⁇ R-30c, m ⁇ R-19a, m ⁇ R-193b, m ⁇ R-29b and m R-17, as defined in the first aspect of the invention.
  • the kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of quantifying the expression product of the microRNAs: m ⁇ R-146a, m ⁇ R-122, m ⁇ R-148a, m ⁇ R-214, m ⁇ R- 372, m ⁇ R-let7c, m ⁇ R-30c, m ⁇ R-19a, m ⁇ R-193b, m ⁇ R-29b and m ⁇ R-17 , and where:
  • - primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100 %, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID N °: 1, SEQ ID N °: 2, SEQ ID N °: 3, SEQ ID N °: 4, SEQ ID N °: 5, SEQ ID N ° : 6, SEQ ID N °: 7, SEQ ID N °: 8, SEQ ID N °: 9, SEQ ID N °: 1, SEQ ID N °: 12, SEQ ID N °: 12, SEQ ID N °: 13, SEQ ID N °: 14, SEQ ID N °: 15, SEQ ID N °: 16, SEQ ID N °: 17, SEQ ID N °:
  • the probes are sequences of polynucleotides of between 80 and 1,100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80 %, more preferably of at least 90%, even more preferably of at least one 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID N °: 1, SEQ ID N °: 2, SEQ ID N °: 3 , SEQ ID N °: 4, SEQ ID N °: 5, SEQ ID N °: 7, SEQ ID N °: 8, SEQ ID N °: 9, SEQ ID N °: 10, SEQ ID N °: 1 1, SEQ ID N °: 12, SEQ ID N °: 13, SEQ ID N °: 14, SEQ ID N °: 16, SEQ ID N °: 16, SEQ ID N °: 17, SEQ ID N °: 18, SEQ ID N °: 19, SEQ ID N °: 20,
  • the antibodies are capable of binding to a region formed by any of the nucleotide sequences SEQ ID N °: 1, SEQ ID N °: 2, SEQ ID N °: 3, SEQ ID N °: 4, SEQ ID N °: 5, SEQ ID N °: 6, SEQ ID N °: 7, SEQ ID N °: 8, SEQ ID N °: 10, SEQ ID N °: 1 1, SEQ ID N °: 12, SEQ ID N °: 13, SEQ ID N °: 14, SEQ ID N °: 15, SEQ ID N °: 17, SEQ ID N °: 18, SEQ ID N °: 18, SEQ ID N °: 19 , SEQ ID N °: 20, SEQ ID N °: 21, SEQ ID N °: 22 and / or SEQ ID N °: 23.
  • a ninth aspect of the invention relates to a microarray, hereafter referred to as a microarray of the invention, comprising oligonucleotides or single channel microarrays designed from nucleotide sequences SEQ ID N °: 1, SEQ ID N °: 2, SEQ ID N °: 3, SEQ ID N °: 4, SEQ ID N °: 5, SEQ ID N °: 7, SEQ ID N °: 8, SEQ ID N °: 9, SEQ ID N °: 10, SEQ ID N °: 1 1, SEQ ID N °: 12, SEQ ID N °: 13, SEQ ID N °: 14, SEQ ID N °: 15, SEQ ID N °: 16, SEQ ID N °: 17, SEQ ID N °: 18, SEQ ID N °: 19, SEQ ID N °: 20, SEQ ID N °: 21, SEQ ID N °: 22 and / or SEQ ID N °: 23.
  • oligonucleotide sequences can be constructed on the surface of a chip by sequential elongation of a growing chain with a single nucleotide using photolithography.
  • the oligonucleotides are anchored at the 3 'end by a method of selective activation of nucleotides, protected by a photolabile reagent, by the selective incidence of light through a photomask.
  • the photomask can be physical or virtual.
  • oligonucleotide probes can be between 10 and 100 nucleotides, more preferably, between 20 and 70 nucleotides, and even more preferably, between 24 and 30 nucleotides.
  • Synthesis in situ on a solid support could be done using ink-jet technology, which requires longer probes.
  • the supports could be, but not limited to, filters or membranes of NC or nylon (charged), silicon, or glass slides for microscopes covered with aminosilanes, polylysine, aldehydes or epoxy.
  • the probe is each of the chip samples.
  • the target It is the sample to be analyzed: miRNA, messenger RNA, total RNA, a PCR fragment, etc.
  • the microarray of the invention has modified oligonucleotides, as described in the previous aspect of the invention.
  • a tenth aspect of the invention relates to the use of the kit or device of the invention or the microarray of the invention, for obtaining useful data for the diagnosis, classification and / or monitoring of an individual or subject potentially suffering from lung cancer. .
  • Figure 1 Box diagram (Tukey) of the mean expression (Ln2 "ct ) of each differentially expressed miRNA between control and cancer.
  • Figure 2 Cash diagram (Tukey) of the differentially expressed miRNA ratios between control and cancer.
  • the authors of the present invention have analyzed the levels of microRNAs in exhaled air samples of patients with lung cancer compared to other healthy patients and with different risk factors. The results indicate that the microRNAs present in exhaled air can be used as markers of a diagnostic, classification and / or follow-up system of lung cancer.
  • a first aspect of the invention relates to the use of microRNA biomarkers: m ⁇ R-146a, m ⁇ R-122, m ⁇ R-148a, m ⁇ R-214, m ⁇ R -372, m ⁇ R-let7c, m ⁇ R-30c, m ⁇ R-19a, m ⁇ R-193b, m ⁇ R-29b and m ⁇ R-17, or any combination thereof, for diagnosis, classification and / or follow-up of lung cancer, hereinafter biomarkers of the invention.
  • the use of microRNAs is simultaneous.
  • biomarkers of the invention can be used simultaneously, separately or in any combination thereof for the diagnosis, classification and / or monitoring of lung cancer.
  • sets of ratios are used between the biomarkers of the invention for the diagnosis, classification and / or monitoring of lung cancer.
  • the sets of ratios formed between biomarkers of the invention for the diagnosis, classification and / or monitoring of lung cancer used are: m ⁇ R-122 / m ⁇ R-29b, m ⁇ R-29b / m ⁇ R- 146, m ⁇ R-193 / m ⁇ R-146, m ⁇ R-146 / m ⁇ R-372, m ⁇ R-214 / m ⁇ R-146 and / om ⁇ R-30 / m ⁇ R-146 , • m ⁇ R-17 / m ⁇ R-148, m ⁇ R-29b / m ⁇ R-let7c, m ⁇ R-214 / m ⁇ R-let7c and / om ⁇ R-148 / m ⁇ R-let7c,
  • microRNA refers to single stranded RNA approximately 22 nucleotides in length, non-coding for proteins and generated from transcripts Endogenous that can form hairpin structures (Lee et al., 2004. Embo. Journal, 23 (20), 4051-4060).
  • the microRNAs make up a large family of post-transcriptional regulatory genes that control many cellular and eukaryotic development processes, fulfilling a large number of functions. It is estimated that 30% of all human genes are regulated by mechanisms dependent on microRNAs (Rajewsky N. 2006.
  • microRNA can regulate about 200 different transcripts that can work in different pathways in the cell (Krek et al., 2005, Nature Genetics, 37 (5), 495-500), as well as that the same mRNA can be regulated by multiple microRNAs (Cai et al., 2009. Genomics Proteomics Bioinformatics , 7 (4), 147-154).
  • cancer is intended to include any member of a class of diseases characterized by uncontrolled growth of aberrant cells.
  • the term includes all known cancers and neoplastic conditions, characterized as malignant, benign, soft or solid tissue, and cancers of all stages and grades, including premetastatic and postmetastatic cancers. Examples of different types of cancer include lung cancer.
  • a “tumor” comprises one or more cancer cells.
  • Non-small cell lung cancer (“85% of all lung cancers) and small cell lung cancer (from English Small cell lung cancer (SCLC)) («15%).
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • SCLC English Small cell lung cancer
  • BAC Bronchioalveolar Carcinoma
  • - Large Cell Carcinoma conforms from 10% to 15% of NSCLC. It is fast growing and can appear anywhere in the lung., Lung cancer.
  • the treatment for lung cancer is based on the type and stage of the cancer. Treatments, although not limited to us, may include: surgery to remove the tumor, chemotherapy (medications that kill or reduce the size of the tumor) or radiation (x-rays that destroy or damage cancer cells).
  • a second aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data for the diagnosis, classification and / or monitoring of an individual or subject potentially suffering from lung cancer, hereafter referred to as the first method of the invention, comprising: a) obtain an isolated biological sample from an individual, a ') quantify the expression product of m ⁇ R-146a, m ⁇ R-122, m ⁇ R-148a, m ⁇ R-214, m ⁇ R-372, m ⁇ R-let7c, m ⁇ R-30c, m ⁇ R-19a, m ⁇ R-193b, m ⁇ R-29b and / om ⁇ R-17, or alternatively, a) quantify the biomarker expression product m ⁇ R-146a, m ⁇ R-122, m ⁇ R-148a, m ⁇ R-214, m ⁇ R-372, m ⁇ R-let7c, m ⁇ R-30c, m ⁇ R-19a, m ⁇ R-193b, m ⁇ R-29b and /
  • the biological sample is condensate of exhaled air.
  • the expression product of the 1 1 microRNAs is preferably quantified simultaneously, to obtain useful data for diagnosis, classification and / or monitoring of an individual or subject that potentially suffers from lung cancer, the detection of any of them and, preferably, the ratios: m ⁇ R-122 / m ⁇ R-29b, m ⁇ R-29b / m ⁇ R-146, m ⁇ R-193 / m ⁇ R-146, m ⁇ R-146 / m ⁇ R-372, m ⁇ R-214 / m ⁇ R-146, m ⁇ R- 30 / m ⁇ R-146, m ⁇ R-17 / m ⁇ R-148, m ⁇ R-29b / m ⁇ R-let7c, m ⁇ R-214 / m ⁇ R-let7c, m ⁇ R-148 / m ⁇ R- Iet7c, m ⁇ R- 17 / m ⁇ R-214, m ⁇ R
  • expression product also called “gene product” refers to the biochemical material, either RNA (for example microRNA) or protein, resulting from the expression of a gene. Sometimes a measure of the amount of gene product is used to infer how active a gene is.
  • the quantification of the expression product of the microRNAs, or the detection of the expression of their corresponding genes can be carried out by any of the methods known in the state of the art.
  • the quantification is performed by real-time PCR (Q-RT-PCR).
  • the measurement of the expression levels of a gene is based on a signal that is obtained directly from the transcripts of said genes (mRNA, microRNA, etc.), and that is directly correlated with the number of RNA molecules produced by genes.
  • Said signal - which we can also refer to as an intensity signal - can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of said products.
  • the technique preferably used is the so-called real-time polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • an original DNA fragment is exponentially amplified.
  • This technique is carried out in an apparatus called thermocycler that maintains the necessary temperature in each of the stages that make up a cycle.
  • Real-time detection is based on the use of fluorescent markers (probes) that bind to all double stranded DNA sequences formed in the cycles of the PCR reaction. Once the marker binds to the nucleic acid of double string, it emits a fluorescent signal that is processed in real time (Walter et al., 2002, Science, 296, 557-559).
  • the first method of the invention further comprises: b) calculating the A index according to the equation:
  • a third aspect of the invention relates to a method for the classification, diagnosis and monitoring of lung cancer, hereafter referred to as the second method of the invention, comprising steps (a) and (b) according to the first method of the invention, and further comprises: g) classifying the individual from step (a) in the group of individuals with lung cancer when the value of the A index of step (b) is preferably less than 0.88, more preferably less than 0, 75, and even more preferably less than 0.579.
  • a fourth aspect of the invention relates to a method for the classification, diagnosis and monitoring of lung cancer, hereafter referred to as the third method of the invention, comprising steps (a) and (c) according to the first method of the invention.
  • the invention also includes: h) classifying the individual from step (a) into the group of individuals with non-small cell lung cancer of the adenocarcinoma and non-epidermoid type when the B index value of step (c) is preferably less than 0.91, more preferably less than 0.72, and even more preferably less than 0.50.
  • a fifth aspect of the invention relates to a method for the classification, diagnosis and monitoring of lung cancer, hereafter referred to as the fourth method of the invention, comprising steps (a) and (d) according to the first method of the invention, and further comprises: i) classifying the individual from step (a) in the group of individuals with invasive tumor lung cancer when the value of the C index of step (d) is preferably greater than 0.30, more preferably greater than 0.39, and even more preferably greater than 0.65.
  • invasive cancer or tumor or “infiltrant” is understood as cancer that spreads beyond the layer of tissue in which it started and grows or progresses in healthy tissues that surround it. It could also be defined as the migration and direct penetration of cancer cells in neighboring tissues.
  • a sixth aspect of the invention relates to a method for the classification, diagnosis and monitoring of lung cancer, hereafter referred to as the fifth method of the invention, which comprises steps (a) and (e) according to the first method of the invention, and also comprises: j) classify the individual from step (a) in the group of individuals with lung cancer with metastasis when the D index value of step (e) is preferably greater than 0.28, more preferably greater than 0.34, and still more preferably greater than 0.45.
  • the term "metastasis” refers to the ability of cancer cells to penetrate the blood and lymph vessels, circulate through them, and establish or grow in normal tissues of another part of the body.
  • a seventh aspect of the invention relates to a method for the classification, diagnosis and monitoring of lung cancer, hereafter referred to as the sixth method of the invention, comprising steps (a) and (f) according to the first method of the invention, and further comprises: k) classifying the individual from step (a) in the group of individuals with stage 4 lung cancer when the value of the E index of step (f) is preferably greater than 0.18, more preferably greater than 0.39, and even more preferably greater than 0.64.
  • stage or stage of a cancer describes the degree of spread of the disease.
  • the tumor does not measure more than 3 centimeters (cm)
  • the tumor has one or more of the following characteristics: a) It measures more than 3 cm, but does not measure more than 7 cm, b) It involves a main bronchus, but it is more than 2 cm from the carina (the point where the trachea divides into the left and right main bronchi), c) has grown into the membranes surrounding the lungs (visceral pleura), d) the tumor partially obstructs the airways, but This has not caused the entire lung to collapse or the appearance of pneumonia.
  • the tumor has one or more of the following characteristics: a) its size is larger than 7 cm, b) it has grown to the thickness of the chest wall, the muscle that separates the chest from the abdomen (diaphragm ), the membranes that surround the space between the two lungs (mediastinal pleura), or the membranes of the sac that surrounds the heart (parietal pericardium), c) the cancer grows in a main bronchus and is less than 2 cm from the carina , but does not affect the carina itself, d) has grown into the airways enough to cause the total collapse of a lung or pneumonia in the entire lung or e) two or more separate tumor nodules are found present in the same lobe of a lung.
  • a stage 4 or T4 lung tumor has one or more of the following characteristics: a) it has grown into the space between the lungs (mediastinum), the heart, large blood vessels near the heart (such as the aorta) , the trachea, the tube that connects the throat to the stomach (esophagus), the spine or the carina and / or) two or more separate tumor nodules are found in different lobes of the same lung
  • the biological sample isolated from step (a) is a sample of exhaled air condensate.
  • an "isolated biological sample” includes, but is not limited to, cells, tissues and / or biological fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art.
  • the biological sample isolated from step (a) is condensed from exhaled air.
  • Steps (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j) and / or (k) of the methods described above can be fully or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for the quantification of step (a) or the computerized calculation of any of the indices of steps (b), (c), (d) , (e) and / or (f) or the computerized classification in steps (g), (h), (i), (j) and / or (k).
  • kits or devices comprising the elements necessary to detect the expression levels of the microRNAs: m ⁇ R-146a, m ⁇ R- 122, m ⁇ R- 148a, m ⁇ R-214, m ⁇ R-372, m ⁇ R-let7c, m ⁇ R-30c, m ⁇ R-19a, m ⁇ R-193b, m ⁇ R-29b and m R-17, as defined in the first aspect of the invention.
  • the kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of quantifying the expression product of the microRNAs: m ⁇ R-146a, m ⁇ R-122, m ⁇ R-148a, m ⁇ R-214, m ⁇ R- 372, m ⁇ R-let7c, m ⁇ R-30c, m ⁇ R-19a, m ⁇ R-193b, m ⁇ R-29b and m ⁇ R-17 , and where: - primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably of between 18 and 22 base pairs, and even more preferably about 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably of at least 90%, even more preferably of at least 95 %, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID N °: 1, SEQ ID N °: 2, S
  • the probes are sequences of polynucleotides of between 80 and 1,100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80 %, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID N °: 1, SEQ ID N °: 2, SEQ ID N °: 3, SEQ ID N °: 4, SEQ ID N °: 5, SEQ ID N °: 6, SEQ ID N °: 7, SEQ ID N °: 8, SEQ ID N °: 9, SEQ ID N °: 10, SEQ ID N °: 1 1, SEQ ID N °: 12, SEQ ID N °: 13, SEQ ID N °: 14, SEQ ID N °: 15, SEQ ID N °: 16, SEQ ID N °: 17, SEQ ID N °: 18, SEQ ID N °: 19, SEQ ID N °
  • the antibodies are capable of binding to a region formed by any of the nucleotide sequences SEQ ID N °: 1, SEQ ID N °: 2, SEQ ID N °: 3, SEQ ID N °: 4, SEQ ID N °: 5, SEQ ID N °: 6, SEQ ID N °: 7, SEQ ID N °: 8, SEQ ID N °: 10, SEQ ID N °: 1 1, SEQ ID N °: 12, SEQ ID N °: 13, SEQ ID N °: 14, SEQ ID N °: 15, SEQ ID N °: 17, SEQ ID N °: 18, SEQ ID N °: 18, SEQ ID N °: 19 , SEQ ID N °: 20, SEQ ID N °: 21, SEQ ID N °: 22 and / or SEQ ID N °: 23.
  • the antibodies are modified.
  • the antibody is human, humanized or synthetic.
  • the antibody is monoclonal and / or is labeled with a fluorochrome.
  • the fluorochrome is selected from the list comprising Fluorescein (FITC), Tetramethylrodamine and derivatives, Phycoerythrin (PE), PerCP, Cy5, Texas, allophycocyanin, or any combination thereof.
  • microRNAs of the invention Gene ID Name Sequence Sequence Name of miRNA gene miRNA microRNA 146 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 13
  • microRNA 30c 407031 SEQ ID NO: 19 hsa-m ⁇ R30c-5p SEQ ID NO: 8
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 22 microRNA 407024 hsa-m ⁇ R29b-3p 29b-1
  • the genes MIR146A, MIR122, MIR148A, MIR214, MIR372, MIRLET7C, MIR30C, MIR19A, MIR193B, MIR29B1 and MIR17 are also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the microRNAs collected respectively in the SEQ IDs listed in table 1, and which would comprise various vanants from: a) nucleic acid molecules encoding a microRNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID collected in table 1, b) molecules of nucleic acid whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a microRNA comprising the nucleotide sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99%
  • SEQ ID NO: 5 GTGGGCCTCAAATGTGGAGCACTATTCTGATGTCCAAGTGGAAAGTGCTGCGACA TTTGAGCGTCAC
  • SEQ ID NO: 8 AG ATACTGTAAAC ATC CTAC ACTCTC AG CTGTG G AAAGTAAG AAAG CTG G G AG AAG GCTGTTTACTCTTTCT
  • SEQ ID NO: 12 GTCAGAATAATGTCAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGTGATATGCATCTACTGCA GTGAAGGCACTTGTAGCATTATGGTGAC
  • the kit can also contain, without any limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit or device of the invention can include all the supports and containers necessary for its implementation and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out any of the methods of the invention.
  • the kit of the invention may include positive and / or negative controls.
  • the kit may also contain, without any limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit or device of the invention is a kit of parts, comprising a component A, formed by a device for collecting the sample from step a), and a component B, formed by the elements necessary to carry out the quantitative analysis in the sample from step a) or any of the methods of the invention.
  • the kit or device of the invention comprises oligonucleotides.
  • the oligonucleotides have modifications in some of their nucleotides, such as, but not limited to, nucleotides having any of their atoms with a radioactive isotope, usually 32 P or tritium, immunologically labeled nucleotides, such as with a molecule of digoxigenin, and / or immobilized in a membrane. Many possibilities are known in the state of the art.
  • a ninth aspect of the invention relates to a microarray, hereafter referred to as a microarray of the invention, comprising oligonucleotides or channel microarrays uniquely designed from the nucleotide sequences SEQ ID N °: 1, SEQ ID N °: 2, SEQ ID N °: 3, SEQ ID N °: 4, SEQ ID N °: 5, SEQ ID N °: 6, SEQ ID N °: 7, SEQ ID N °: 8, SEQ ID N °: 9, SEQ ID N °: 1, SEQ ID N °: 12, SEQ ID N °: 13, SEQ ID N °: 14, SEQ ID N °: 15, SEQ ID N °: 16, SEQ ID N °: 18, SEQ ID N °: 18, SEQ ID N °: 19, SEQ ID N °: 20, SEQ ID N °: 21, SEQ ID N °: 22 and / or SEQ ID N °: 23.
  • oligonucleotide sequences can be constructed on the surface of a chip by sequential elongation of a growing chain with a single nucleotide using photolithography.
  • the oligonucleotides are anchored at the 3 'end by a method of selective activation of nucleotides, protected by a photolabile reagent, by the selective incidence of light through a photomask.
  • the photomask can be physical or virtual.
  • oligonucleotide probes can be between 10 and 100 nucleotides, more preferably, between 20 and 70 nucleotides, and even more preferably, between 24 and 30 nucleotides.
  • Synthesis in situ on a solid support could be done using ink-jet technology, which requires longer probes.
  • the supports could be, but not limited to, filters or membranes of NC or nylon (charged), silicon, or glass slides for microscopes covered with aminosilanes, polylysine, aldehydes or epoxy.
  • the probe is each of the chip samples.
  • the target is the sample to be analyzed: miRNA, messenger RNA, total RNA, a PCR fragment, etc.
  • the microarray of the invention has modified oligonucleotides, as described in the previous aspect of the invention.
  • a tenth aspect of the invention relates to the use of the kit or device of the invention or the microarray of the invention, for obtaining useful data for the diagnosis, classification and / or monitoring of an individual or subject potentially suffering from lung cancer. .
  • the invention also extends to computer programs adapted so that any processing means can implement the methods of the invention.
  • Such programs may have the form of source code, object code, an intermediate source of code and object code, for example, as partially compiled, or in any other form suitable for use in the implementation of the processes according to the invention.
  • Computer programs also cover cloud applications based on that procedure.
  • a eleventh aspect of the invention relates to a computer program comprising program instructions to make a computer carry out the process according to any of the methods of the invention.
  • the invention encompasses computer programs arranged on or within a carrier.
  • the carrier can be any entity or device capable of supporting the program.
  • the carrier may be constituted by said cable or other device or means.
  • the carrier could be an integrated circuit in which the program is included, the integrated circuit being adapted to execute, or to be used in the execution of, the corresponding processes.
  • the programs could be incorporated into a storage medium, such as a ROM, a CD ROM or a semiconductor ROM, a USB memory, or a magnetic recording medium, for example, a floppy disk or a disk Lasted.
  • the programs could be supported on a transmissible carrier signal.
  • it could be an electrical or optical signal that could be transported through an electrical or optical cable, by radio or by any other means.
  • a twelfth aspect of the invention relates to a computer-readable storage medium comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • a thirteenth aspect of the invention relates to a transmissible signal comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of any of the methods of the invention.
  • a "nucleic acid or polynucleotide sequence” may comprise the five bases that appear biologically (adenine, guanine, thymine, cytosine and uracil) and / or bases other than the five that appear biologically. These bases can serve different purposes, for example, to stabilize or destabilize hybridization; for stimulate or inhibit probe degradation; or as junction points for detectable debris or screening debris.
  • a polynucleotide of the invention may contain one or more modified, non-standard, derivatized base moieties, including, but not limited to, N 6 -methyl-adenine, N 6 -terc-butyl-benzyl-adenine, imidazole, substituted imidazoles, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxyl) uracil, 5- carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethyl dihydrouracil, beta-D-galactosylkeosine, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3- methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-methylladenine, 7
  • nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise one or more modified sugar moieties including, but not limited to, arabinose, 2-fluoroarabinous, xylulose, and a hexose.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence referring to polymeric forms of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, Chemically or biochemically modified.
  • the present invention is understood as a biologically active vanant or fragment, those vanants or fragments of the indicated peptides that have the same physiological, metabolic or immunological effect, or have the same utility as those described. That is, they are functionally equivalent. Such effects can be determined by conventional methods.
  • identity refers to the proportion of identical nucleotides or amino acids between two nucleotide or amino acid sequences that are compared.
  • Sequence comparison methods are known in the state of the art, and include, but are not limited to, the GAG program, including GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP or BLASTN, and FASTA (Altschul et ai, 1999. J. Mol. Biol. 215: 403-410.
  • GAG program including GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP or BLASTN, and FASTA (Altschul et ai, 1999. J. Mol. Biol. 215: 403-410.
  • the term “individual” in this report is synonymous with "patient”, and is not intended to be limiting in any way, and may be of any age, sex and physical condition.
  • the individual can be anyone, an individual predisposed to a disease (for example, lung cancer) or an individual suffering from said disease.
  • Group II 31 Patients diagnosed with COPD from the Pulmonology Service of the Reina Sof ⁇ a Hospital, Córdoba.
  • Group III 32 Healthy Controls with Risk Factor, being smokers or former smokers from the Internal Medicine service of the Reina Sof ⁇ a Hospital, Córdoba.
  • the total RNA of the samples including the fraction of the microRNAs was isolated from 200 ⁇ of condensed exhaled air using the QIAzol miRNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). The 200 ⁇ of exhaled air was incubated with 1 ml of QIAzol Lysis Reagent (Qiagen) to inhibit the function of RNAse enzymes. The protocol was carried out thoroughly following the manufacturer's recommendations. Finally, the isolated RNA was diluted in 14 ⁇ of RNAse-free water and stored at -80 ° C.
  • a PCR array of microRNAs (miScript miRNA PCR array cancer, Quiagen; following the manufacturer's instructions) described in different types of tumors was performed: brain, colon, gastric, head, neck, liver, kidney, lymphoma, pancreatic, prostate, skin , ovary, chest and uterus.
  • the expression of 84 microRNAs in exhaled air from the lower airways of a pool of 17 healthy controls and 17 cancer patients (Group I and group IV) was evaluated.
  • Relative expression levels were calculated according to the 2 "ct method. Using a 2-Fold change cut-off point, we observed that 40 microRNAs were increased and 9 reduced in cancer samples compared to subjects. The results showed that 1 1 microRNAs were expressed only in patients with tumor or were increased in cancer, in all of them the times of change of expression with respect to the control were greater than 10. Some of these microRNAs have been described in urine and plasma of patients with lung cancer, others have been described in other types of tumors, but none in exhaled air.
  • the expression of these 1 1 microRNAs was validated by RT-PCR independently in each subject of the four groups: cases, controls without factor of risk, controls with risk factor and COPD.
  • the 1 1 microRNAs analyzed were: m ⁇ R-146a, m ⁇ R-122, m ⁇ R-148a, m ⁇ R-214, m ⁇ R-372, m ⁇ R-let7c, m ⁇ R-30c, m R-19a, m ⁇ R-193b, m ⁇ R-29b and m ⁇ R-17.
  • the protocol consists of a first retrotranscription (RT) of 1 1 ng of RNA (quantified in the nanodrop) with specific stem-loop primers of microRNAs, followed by a real-time PCR with specific TaqMan probes for each microRNA that is intended to be amplified.
  • Each retrotranscription reaction was performed in 15 ⁇ containing 1.5 ⁇ of 10 X RT buffer 1, 0.2 ⁇ of RNAse inhibitor (20 U / ml), 0.15 ⁇ of 100 mmol / L of "deoxynucleoside triphosphates" , 1 ⁇ of 50 U / ⁇ MultiScribe reverse transcriptase, 1.5 ⁇ of each RT primers (4 miRNA RT primers / RT reaction), 1 1 ng of RNA and water free of RNAse.
  • the reaction was carried out in a GeneAmp PCR System 9700 thermocycler (Applied BioSystems) at 16 ° C for 30 minutes, 42 ° C for 30 ° C and 85 ° C for 5 minutes.
  • Each preamplification was done with a mixture of 4 probes of 4 microRNAs. Thus we made 3 pre-amplifications to subsequently perform the PCRs of the 1 1 selected microRNAs. Then the preamp reaction was proceeded. To do this, 2.5 ⁇ of diluted RT product (2.5 ⁇ in 10 ⁇ of RNase-free water) was combined with 5 ⁇ of Taqman 2x Master Mix PCR, No AmpErase UNG and 2.5 ⁇ from a pool of 4 primers Taqman miRNA assay (0.2x). The reaction was performed in a GeneAmp PCR System 9700 thermocycler (Applied BioSystems) at 95 ° C for 10 minutes, plus 20 cycles at 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 4 minutes.
  • the preamplification product was diluted in 60 ⁇ of water free of RNases to proceed to the PCR reaction. 4 ⁇ of this preamplification product and was combined with 5 ⁇ of Taqman 2x Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG, with 0.5 ⁇ of the first specific 20X Taqman miRNA Assay and 0.5 ⁇ of distilled water.
  • the PCR was performed in the Roche LightCycler 480 thermal cycler at 95 ° C for 10 min, followed by 40 cycles at 95 ° C for 15 s and 60 ° C for 1 min. Expression levels of miRNAs were calculated using method 2 "ct Thus, the PCRs of these 1 1 microRNAs were carried out in the samples of exhaled air from the lower pathways of 127 subjects, these results were analyzed.

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Abstract

Uso de los microARNs: miR-146a, miR-122, miR-148a, miR-214, miR-372, miR-let7c, miR-30c, miR-19a, miR-193b, miR-29b y mi ARN-17 para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento del cáncer de pulmón, método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento de un individuo o sujeto que potencialmente sufra cáncer de pulmón, kit o dispositivo, microarray y usos.

Description

MicroARNs como biomarcadores para el diagnóstico del cáncer de pulmón
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra dentro del campo de la Biología Molecular y la Medicina Clínica, y específicamente se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento del cáncer de pulmón.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El cáncer de pulmón es una de las principales causas de muerte en los países industrializados, ocupando el segundo lugar solamente por detrás de las enfermedades cardiovasculares. El tabaco es el principal factor de riesgo, siendo el causante del 85- 90% de todos los casos. A pesar de su alta incidencia y mortalidad, presenta una baja prevalencia debido a que la mayoría de los casos son detectados en estadios tardíos, por lo que sería muy importante disponer de pruebas de diagnóstico capaces de detectar la enfermedad lo antes posible, así como el tipo de tumor y la invasividad del mismo para orientar el tratamiento.
El análisis de condensación del aire exhalado en la respiración es una prueba no invasiva en la que el aire exhalado entra en un sistema de refrigeración para condensarse. Este aire condensado contiene proteínas y microARNs, que pueden constituir marcadores de patologías respiratorias, incluyendo el cáncer de pulmón (Conrad et al., 2008. Gen. Intern. Med. 23 Suppl. 1 , 78-84. doi: 10.1007/s1 1606-007- 041 1 -1 ).
Hay muy pocos estudios proteómicos en el condensado del aire exhalado, y en los existentes se han conseguido identificar un número relativamente bajo de proteínas (Gianazza et al., 2004. Am. J. Med. 1 17(1 ), 51 -54; Fumagalli et al., 2008. Int. J. Mol. Sel. 13(1 1 ), 13894-13910; Kurova et al., 2009. Clin. Chem. Lab. Med. 47(6), 706-712; Bloemen et al., 2009. Proteomics Clin. Appl. 3(4), 498-504; Chang et al., 2010. Eur. Respir. J. 35(5), 1 182-1215; Bloemen et al., 2010. Biomarkers 15(7), 583-93). Solamente en dos estudios más recientes (Fumagalli et al., 2012. Int. J. Mol. Sci. 13(1 1 ), 13894-13910.; Bredberg et al., 2012. Clin. Chem. 58(2), 431 -440) se han conseguido identificar 44 y 124 proteínas diferentes, respectivamente. Sin embargo, ambos estudios analizaron "pools" de muestras, y no pacientes individuales. La gran mayoría de los estudios realizados hasta la fecha están relacionados con asma o con otras enfermedades pulmonares, como la enfermedad pulmonar crónica obstructiva (EPOC), y únicamente el estudio de Chang y cois., analizó muestras de pacientes de cáncer de pulmón consiguiendo identificar 20 proteínas alteradas en todas las muestras analizadas (Chang et al., 2010. Eur. Respir. J. 35(5), 1 182-1215). Los microARNs (miARN ó m¡R) son moléculas pequeñas de ARN, 20-25 nucleótidos, no codificantes para proteínas que regulan el procesamiento postranscripcional del ARN, mediante el apareamiento de bases con su ARN mensajero (ARNm) complementario, conduciendo a la represión de la transcripción o a la degradación del ARNm (Filipowicz et al., 2008. Nature Reviews Genetics, 9(2), 102-1 14). En la especie humana se han identificado aproximadamente 2500 microARNs, habiéndose demostrado su participación clave en la regulación de muchos procesos celulares y, su alteración está asociada con el desarrollo de diferentes patologías, especialmente cáncer.
Recientemente, se ha detectado la presencia de determinados microARNs en el esputo de pacientes con cáncer de pulmón y ha sido relacionada con el tipo de cáncer, destacando su papel en la diagnóstico de la enfermedad (Xie et al., 2010. Lung Cáncer, 67 (2), 170-176; Yu et al., 2010. International Journal of Cáncer, 127 (12), 2870-2878). Los microARNs también se han aislado en condensado de aire exhalado (Puneet y Faoud, 2013. Journal of Analytical Sciences, Methods and Instrumentation, 3, 17-29). En concreto elevados niveles de microARN-21 y microARN-486 se han encontrado diferencialmente expresados en condensado de aire exhalado de pacientes con cáncer de pulmón microcitico (Mozonni et al., 2013. Biomarkers., 18 (8), 679-686).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un primer aspecto de la invención se refiere al uso de los biomarcadores de microARNs: m¡R-146a, m¡R-122, m¡R-148a, m¡R-214, m¡R-372, m¡R-let7c, m¡R-30c, m¡R-19a, m¡R-193b, m¡R-29b y m¡R-17 para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento del cáncer de pulmón. En
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento de un individuo o sujeto que potencialmente sufra cáncer de pulmón, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: a) cuantificar el producto de expresión de los biomarcadores m¡R-146a, m¡R-122, m¡R-148a, m¡R-214, m¡R-372, miR-let7c, m¡R-30c, m¡R-19a, m¡R-193b, m¡R-29b y/o m¡R-17 en una muestra biológica aislada de dicho individuo. Prefenblemente la muestra biológica es condensado de aire exhalado. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el primer método de la invención además comprende: b) calcular el índice A según la ecuación:
A = -0,083 + 0, 172*(m¡R-122/m¡R-29b) + 0,009*(m¡R-29b/m¡R-146) - 0,038*(m¡R- 214/m¡R-146) -0,041 *(m¡R-193/m¡R-146) + 0,004*(m¡R-30/m¡R-146) + 0,056*(m¡R- 146/m¡R-372), c) calcular el índice B según la ecuación:
B = 3,793 - 0,501 *(m¡R-17/m¡R-148) + 0, 167*(miR-29b/miR-Letc7c) + 0,278*(m¡R- 214/m¡R-Let7c) - 0,045*(m¡R-148/m¡R-let7c), d) calcular el índice C según la ecuación: C = 1 ,417 - 0, 139*(m¡R-17/m¡R-214) + 0,05*(m¡R-122/m¡R-148) + 0, 106*(m¡R-214/m¡R- 148), e) calcular el índice D según la ecuación:
D = 4,372 - 0,026*(m¡R-17/m¡R-214) - 0,049*(m¡R-122/m¡R-214) - 0,129*(m¡R-29b/m¡R- 214) + 0,022*(m¡R-214/m¡R-30) y/o f) calcular el índice E según la ecuación:
E = 16, 12 - 0,630*(m¡R-29b/m¡R-214) + 0, 157*(m¡R-214/m¡R-30), asignando en cada ecuación los valores de los biomarcadores correspondientes obtenidos en el paso (a). Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el primer método de la invención, y además comprende: g) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón cuando el valor del índice A del paso (b) sea preferiblemente menor que 0,88, más preferiblemente menor que 0,75, y aún más preferiblemente menor que 0,579.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende los pasos (a) y (c) según el primer método de la invención, y además comprende: h) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón de células no pequeñas de tipo adenocarcinoma y no epidermoide cuando el valor del índice B del paso (c) sea preferiblemente menor que 0,91 , más preferiblemente menor que 0,72, y aún más preferiblemente menor que 0,50.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón, de ahora en adelante cuarto método de la invención, que comprende los pasos (a) y (d) según el primer método de la invención, y además comprende: i) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón de tumor invasivo cuando el valor del índice C del paso (d) sea preferiblemente mayor que 0,30, más preferiblemente mayor que 0,39, y aún más preferiblemente mayor que 0,65.
Un sexto aspecto de la invención se refiere a un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón, de ahora en adelante quinto método de la invención, que comprende los pasos (a) y (e) según el primer método de la invención, y además comprende: j) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón con metástasis cuando el valor del índice D del paso (e) sea preferiblemente mayor que 0,28, más preferiblemente mayor que 0,34, y aún más preferiblemente mayor que 0,45.
Un séptimo aspecto de la invención se refiere a un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón, de ahora en adelante sexto método de la invención, que comprende los pasos (a) y (f) según el primer método de la invención, y además comprende: k) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón en estadio 4 cuando el valor del índice E del paso (f) sea preferiblemente mayor que 0, 18, más preferiblemente mayor que 0,39, y aún más preferiblemente mayor que 0,64.
En una realización preferida de cualquiera de los aspectos de la invención, la muestra biológica aislada del paso (a) es una muestra de condensado de aire exhalado.
Un octavo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesanos para detectar los niveles de expresión de los microARNs: m¡R-146a, m¡R-122, m¡R- 148a, m¡R-214, m¡R-372, m¡R-let7c, m¡R-30c, m¡R-19a, m¡R-193b, m¡R-29b y m¡R-17, tal y como se han definido estos en el primer aspecto de la invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de cuantificar el producto de expresión los microARNs: m¡R-146a, m¡R-122, m¡R-148a, m¡R-214, m¡R- 372, m¡R-let7c, m¡R-30c, m¡R-19a, m¡R-193b, m¡R-29b y m¡R-17, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID N°: 1 , SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 1 1 , SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 , SEQ ID N°: 22 y/o SEQ ID N°: 23.
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1 100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID N°: 1 , SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 1 1 , SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 , SEQ ID N°: 22 y/o SEQ ID N°: 23.
- los anticuerpos son capaces de unirse a una región formada por cualquiera de las secuencias nucleotídicas SEQ ID N°: 1 , SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 1 1 , SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 , SEQ ID N°: 22 y/o SEQ ID N°: 23.
Un noveno aspecto de la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante microarray de la invención, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de las secuencias nucleotídicas SEQ ID N°: 1 , SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 1 1 , SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 , SEQ ID N°: 22 y/o SEQ ID N°: 23. Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos pueden ser construidas en la superficie de un chip mediante la elongación secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.
Así, las sondas de oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleótidos.
La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse a, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: miARN, ARN mensajero, ARN total, un fragmento de PCR, etc.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el microarray de la invención presenta oligonucleótidos modificados, como se han descrito en el anterior aspecto de la invención.
Un décimo aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención o del microarray de la invención, para la obtención de datos útiles para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento de un individuo o sujeto que potencialmente sufra cáncer de pulmón.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Diagrama de caja (Tukey) de la media de expresión (Ln2"ct) de cada miARN diferencialmente expresados entre control y cáncer.
Figura 2. Diagrama de caja (Tukey) de los ratios de miARNs diferencialmente expresados entre control y cáncer.
Figura 3. Modelo de combinación de los ratios de microARNs que discrimina cáncer de control y curva ROC.
Ecuación resultante= -0,083+0, 172*(miR-122/miR-29b)+0,009*(m¡R-29b/m¡R-146)- 0,038*(miR-214/m¡R-146)-0,041 *(m¡R-193/miR-146)+0,004*(m¡R-30/m¡R- 146)+0,056*(m¡R-146/m¡R-372)
Figura 4. Modelo de combinación de los ratios de microARNs que discriminan entre los tipos de tumor de células no pequeñas, Adenocarcinoma y Epidermoide. Ecuación resultante= 3,793-0,501 *(m¡R-17/m¡R-148)+0, 167*(miR-29b/miR-Let7c)+0,278*(m¡R- 214/miR-Let7c)-0,045*(miR-148/m¡R-Let7c) Figura 5. Modelo de combinación de los ratios de microARNs que discriminan entre invasividad o no del tumor.
Ecuación resultante= 1 ,417-0, 139*(miR-17/miR-214)+0,05*(m¡R-122/m¡R- 148)+0, 106*(m ¡R-214/m ¡R-148) Figura 6. Modelo de combinación de los ratios de microARNs que discriminan entre la presencia o ausencia de metástasis.
Ecuación resultante= 4,372-0,026*(m¡R-17/m¡R-214)-0,049*(m¡R-122/m¡R-214)- 0, 129*(m i R-29b/m i R-214)+0, 022*(m i R-214/m i R-30) Figura 7. Modelo de combinación de los ratios de microARNs que discriminan entre el estadio 3 y 4 del tumor.
Ecuación resultante= 16, 12-0,630*(m¡R-29b/m¡R-214)+0, 157*(m¡R-214/m¡R-372) DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han analizado los niveles de microARNs en muestras de aire exhalado de pacientes con cáncer de pulmón en comparación con otros pacientes sanos y con diferentes factores de riesgo. Los resultados indican que los microARNs presentes en el aire exhalado pueden ser usados como marcadores de un sistema diagnóstico, clasificación y/o seguimiento del cáncer de pulmón.
BIOMARCADORES DE LA INVENCIÓN Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de los biomarcadores de microARNs: m¡R-146a, m¡R-122, m¡R-148a, m¡R-214, m¡R-372, m¡R-let7c, m¡R-30c, m¡R-19a, m¡R-193b, m¡R-29b y m¡R-17, o cualquiera de sus combinaciones, para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento del cáncer de pulmón, de ahora en adelante biomarcadores de la invención. En una realización preferida, el uso de los microARNs es simultáneo.
Los biomarcadores de la invención pueden usarse simultáneamente, por separado o en cualquier combinación de los mismos para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento del cáncer de pulmón.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, se utilizan conjuntos de ratios entre los biomarcadores de la invención para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento del cáncer de pulmón. Preferiblemente, los conjuntos de ratios formados entre biomarcadores de la invención para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento del cáncer de pulmón usados son: m¡R-122/m¡R-29b, m¡R-29b/m¡R-146, m¡R-193/m¡R-146, m¡R-146/m¡R-372, m¡R- 214/m¡R-146 y/o m¡R-30/m¡R-146, • m¡R-17/m¡R-148, m¡R-29b/m¡R-let7c, m¡R-214/m¡R-let7c y/o m¡R-148/ m¡R-let7c,
• m¡R-17/m¡R-214, m¡R-122/m¡R-148 y/o m¡R-214/m¡R-148,
• m¡R-17/m¡R-214, m¡R-122/m¡R-214, m¡R-29b/m¡R-214 y/o m¡R-214/m¡R-30,
• m¡R-29b/m¡R-214 y/o m¡R-214/m¡R-372 El término "microARN" se refiere a ARN monocatenario de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud, no codificantes para proteínas y generados de transcriptos endógenos que pueden formar estructuras en forma de horquilla (Lee et al., 2004. Embo. Journal, 23 (20), 4051 -4060). Los microARNs conforman una gran familia de genes reguladores postranscripcionales que controlan muchos procesos celulares y del desarrollo en eucariotas, cumpliendo una gran cantidad de funciones. Se estima que el 30% de todos los genes humanos son regulados por mecanismos dependientes de microARNs (Rajewsky N. 2006. Nature Genetics, 38, Suppl: S8-13) y que un solo microARN puede regular alrededor de 200 diferentes transcriptos que pueden funcionar en diferentes vías en la célula (Krek et al., 2005, Nature Genetics, 37 (5), 495-500), así como que un mismo ARNm puede ser regulado por múltiples microARNs (Cai et al., 2009. Genomics Proteomics Bioinformatics, 7 (4), 147-154).
El término "cáncer" pretende incluir cualquier miembro de una clase de enfermedades caracterizada por el crecimiento descontrolado de células aberrantes. El término incluye todos los cánceres y condiciones neoplásicas conocidos, caracterizados como malignos, benignos, tejido blandos o sólidos, y cánceres de todos los estadios y grados, incluyendo cánceres premetastásicos y postmetastásicos. Entre los ejemplos de diferentes tipos de cáncer se incluye, el cáncer de pulmón. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "tumor" comprende una o más células cancerosas.
Los principales tipos de cáncer de pulmón son el cáncer de pulmón de células no pequeñas (de inglés Non-small cell lung cáncer (NSCLC)) (« 85% de todos los cánceres de pulmón) y el cáncer de pulmón de células pequeñas (del inglés Small cell lung cáncer (SCLC)) (« 15%). El cáncer de pulmón de células no pequeñas se puede dividir en tres grandes subtipos histológicos:
- Carcinoma de células escamosas, que supone del 25 al 30% de NSCLC.
Este tipo es generalmente encontrado cerca de los bronquios, hacia el centro de la cavidad torácica (del pecho). Es también conocido como carcinoma epidermoide y está usualmente asociado a la exposición al humo de tabaco. Adenocarcinoma: conforma el 40% de todos los NSCLC. Este tipo de cáncer se encuentra generalmente en las regiones más externas del pulmón. También existe una forma rara de adenocarcinoma, llamado carcinoma broncoalveolar (Bronchioalveolar Carcinoma (BAC)) que se está viendo con mayor frecuencia a nivel mundial. BAC se disemina a lo largo de todo el pulmón a diferencia de otros tipos de cáncer de pulmón más comunes que forman tumores únicos. Se desconoce la causa del BAC. A pesar de presentarse en persona que fuman, generalmente se da en aquellas que nunca han fumado.
- Carcinoma de Células Grandes: conforma del 10% al 15% de NSCLC. Es de crecimiento rápido y puede aparecer en cualquier parte del pulmón., el cáncer de pulmón.
El tratamiento para cáncer de pulmón se basa en el tipo y estadio del cáncer. Los tratamientos, aunque sin limitarnos, pueden incluir: cirugía para remover el tumor, quimioterapia (medicamentos que matan o reducen el tamaño del tumor) o radiación (rayos X que destruyen o dañan las células cancerosas).
MÉTODOS DE LA INVENCIÓN
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento de un individuo o sujeto que potencialmente sufra cáncer de pulmón, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, a') cuantificar el producto de expresión del m¡R-146a, m¡R-122, m¡R-148a, m¡R- 214, m¡R-372, m¡R-let7c, m¡R-30c, m¡R-19a, m¡R-193b, m¡R-29b y/o m¡R-17, o alternativamente, a) cuantificar el producto de expresión de los biomarcadores m¡R-146a, m¡R-122, m¡R-148a, m¡R-214, m¡R-372, m¡R-let7c, m¡R-30c, m¡R-19a, m¡R-193b, m¡R-29b y/o m¡R-17 en una muestra biológica aislada de dicho individuo. Preferiblemente la muestra biológica es condensado de aire exhalado. Aunque preferiblemente se cuantifica el producto de expresión de los 1 1 microARNs simultáneamente, para la obtención de datos útiles para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento de un individuo o sujeto que potencialmente sufra cáncer de pulmón, la detección de cualquiera de ellos y, preferiblemente de las ratios: m¡R-122/m¡R-29b, m¡R-29b/m¡R-146, m¡R-193/m¡R-146, m¡R-146/m¡R-372, m¡R-214/m¡R-146, m¡R- 30/m¡R-146, m¡R-17/m¡R-148, m¡R-29b/m¡R-let7c, m¡R-214/m¡R-let7c, m¡R-148/ m¡R- Iet7c, m¡R-17/m¡R-214, m¡R-122/m¡R-148, m¡R-214/m¡R-148, m¡R-17/m¡R-214, m¡R- 122/m¡R-214, m¡R-29b/m¡R-214, m¡R-214/m¡R-30, m¡R-29b/m¡R-214 y/o m¡R-214/m¡R- 372 resulta informativo.
El término "producto de expresión", también denominado "producto génico" se refiere al material bioquímico, ya sea ARN (por ejemplo microARN) o proteína, resultante de la expresión de un gen. Algunas veces se usa una medida de la cantidad de producto génico para inferir qué tan activo es un gen.
La cuantificación del producto de expresión de los microARNs, o la detección de la expresión de sus correspondientes genes, puede realizarse por cualquiera de los métodos conocidos en el estado de la técnica. Preferiblemente, la cuantificación se realiza mediante PCR a tiempo real (Q-RT-PCR).
La medida de los niveles de expresión de un gen, preferiblemente de manera cuantitativa,, está basada en una señal que se obtiene directamente de los transcritos de dichos genes (ARNm, microRNA, etc.), y que está correlacionada directamente con el número de moléculas de ARN producidas por los genes. Dicha señal - a la que también podemos referirnos como señal de intensidad - puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. Por otro lado, se podría realizar mediante medida indirecta que se refiere a la medida obtenida de un componente secundano o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática).
La técnica preferiblemente utilizada es la llamada reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. Según esta técnica, utilizando oligonucleótidos, enzimas, cebadores y solución tampón, se amplifica de forma exponencial un fragmento de ADN original. Esta técnica es llevada a cabo en un aparato llamado termociclador que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo. La detección en tiempo real se basa en la utilización de marcadores fluorescentes (sondas) que se unen a todas las secuencias de doble cadena de ADN formadas en los ciclos de la reacción de PCR. Una vez que el marcador se une al ácido nucleico de doble cadena, éste emite una señal fluorescente que se procesa en tiempo real (Walter et al., 2002, Science, 296, 557-559). El ciclo al cual la emisión de la intensidad del marcador fluorescente supera un umbral determinado es llamado Ct. Los niveles de expresión de un microARN son calculados como 2"ct. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el primer método de la invención además comprende: b) calcular el índice A según la ecuación:
A = -0,083 + 0, 172*(m¡R-122/m¡R-29b) + 0,009*(m¡R-29b/m¡R-146) - 0,038*(m¡R- 214/m¡R-146) -0,041 *(m¡R-193/m¡R-146) + 0,004*(m¡R-30/m¡R-146) + 0,056*(m¡R- 146/m¡R-372) c) calcular el índice B según la ecuación:
B = 3,793 - 0,501 *(m¡R-17/m¡R-148) + 0, 167*(miR-29b/miR-Letc7c) + 0,278*(m¡R- 214/m¡R-Let7c) - 0,045*(m¡R-148/m¡R-let7c) d) calcular el índice C según la ecuación: C = 1 ,417 - 0, 139*(m¡R-17/m¡R-214) + 0,05*(m¡R-122/m¡R-148) + 0, 106*(m¡R-214/m¡R- 148) e) calcular el índice D según la ecuación:
D = 4,372 - 0,026*(m¡R-17/m¡R-214) - 0,049*(m¡R-122/m¡R-214) - 0,129*(m¡R-29b/m¡R- 214) + 0,022*(m¡R-214/m¡R-30) y/o f) calcular el índice E según la ecuación:
E = 16, 12 - 0,630*(m¡R-29b/m¡R-214) + 0, 157*(m¡R-214/m¡R-30) asignando en cada ecuación los valores de los biomarcadores correspondientes obtenidos en el paso (a). De esta manera, para el cálculo de los índices de la invención A-E hay que considerar que el valor de los cocientes entre los biomarcadores de microARNs (m¡RX/m¡RY) se obtiene mediante el log2(2"ctx/2"ctY), donde miRX o X se refiere al microARN indicado en el numerador y miRY o Y indicado microARN en el denominador. Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) según el primer método de la invención, y además comprende: g) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón cuando el valor del índice A del paso (b) sea preferiblemente menor que 0,88, más preferiblemente menor que 0,75, y aún más preferiblemente menor que 0,579.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón, de ahora en adelante tercer método de la invención, que comprende los pasos (a) y (c) según el primer método de la invención, y además comprende: h) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón de células no pequeñas de tipo adenocarcinoma y no epidermoide cuando el valor del índice B del paso (c) sea preferiblemente menor que 0,91 , más preferiblemente menor que 0,72, y aún más preferiblemente menor que 0,50.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón, de ahora en adelante cuarto método de la invención, que comprende los pasos (a) y (d) según el primer método de la invención, y además comprende: i) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón de tumor invasivo cuando el valor del índice C del paso (d) sea preferiblemente mayor que 0,30, más preferiblemente mayor que 0,39, y aún más preferiblemente mayor que 0,65.
En esta memoria se entiende por "cáncer o tumor invasivo" o "infiltrante" al cáncer que se disemina más allá de la capa de tejido en la que se inició y crece o progresa en tejidos sanos que la rodean. También se podría definir como la migración y la penetración directa de las células del cáncer en los tejidos vecinos.
Un sexto aspecto de la invención se refiere a un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón, de ahora en adelante quinto método de la invención, que comprende los pasos (a) y (e) según el primer método de la invención, y además comprende: j) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón con metástasis cuando el valor del índice D del paso (e) sea preferiblemente mayor que 0,28, más preferiblemente mayor que 0,34, y aún más preferiblemente mayor que 0,45. El término "metástasis" se refiere a la capacidad de las células del cáncer de penetrar en los vasos sanguíneos y linfáticos, circular a través de de los mismos, y establecerse o crecer en tejidos normales de otra parte del cuerpo.
Un séptimo aspecto de la invención se refiere a un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón, de ahora en adelante sexto método de la invención, que comprende los pasos (a) y (f) según el primer método de la invención, y además comprende: k) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón en estadio 4 cuando el valor del índice E del paso (f) sea preferiblemente mayor que 0, 18, más preferiblemente mayor que 0,39, y aún más preferiblemente mayor que 0,64.
La "etapa o estadio" de un cáncer describe el grado de propagación de la enfermedad. Así, en el estadio 1 o T1 : el tumor no mide más de 3 centímetros (cm), no ha alcanzado las membranas que rodean los pulmones (pleura visceral), y no afecta las ramas principales de los bronquios. En el estadio 2 o T2, el tumor presenta una o más de las siguientes características: a) Mide más de 3 cm, pero no mide más de 7 cm, b) Involucra a un bronquio principal, pero está a más de 2 cm de la carina (el punto donde la tráquea se divide en los bronquios principales izquierdo y derecho), c) ha crecido hacia el interior de las membranas que rodean a los pulmones (pleura visceral), d) el tumor obstruye parcialmente las vías respiratorias, pero esto no ha causado el colapso de todo el pulmón ni la aparición de neumonía. En el estadio 3 o T3 el tumor presenta una o más de las siguientes características: a) su tamaño es mayor de 7 cm, b) ha crecido hacia el espesor de la pared del tórax, el músculo que separa el tórax del abdomen (diafragma), las membranas que rodean el espacio entre los dos pulmones (pleura mediastinal), o a las membranas del saco que rodea el corazón (pericardio parietal), c) el cáncer crece en un bronquio principal y está a menos de 2 cm de la carina, pero no afecta la carina en sí, d) ha crecido hacia el interior de las vías respiratorias lo suficiente como para causar el colapso total de un pulmón o neumonía en la totalidad del pulmón o e) dos o más nodulos tumorales separados se encuentran presentes en el mismo lóbulo de un pulmón. Un tumor de pulmón en estadio 4 o T4 presenta una o mas de las siguientes características: a) ha crecido hacia el espacio que existe entre los pulmones (mediastino), el corazón, los vasos sanguíneos grandes cercanos al corazón (tal como la aorta), la tráquea, el tubo que conecta la garganta con el estómago (esófago), la columna vertebral o la carina y/o b) dos o más nodulos tumorales separados se encuentran en lóbulos diferentes del mismo pulmón
En una realización preferida de cualquiera de los aspectos de la invención, la muestra biológica aislada del paso (a) es una muestra de condensado de aire exhalado.
Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada del paso (a) es condensado de aire exhalado.
Los métodos de la invención pueden desarrollarse independientemente o conjuntamente, en cualquier combinación de los mismos. Los pasos (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j) y/o (k) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la cuantificación del paso (a) o el cálculo computarizado de cualquiera de los índices de los pasos (b), (c), (d), (e) y/o (f) o la clasificación computarizada en los pasos (g), (h), (i), (j) y/o (k). KIT O DISPOSITIVO DE LA INVENCIÓN, MICROARRAY DE LA INVENCIÓN Y USOS
Un octavo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar los niveles de expresión de los microARNs: m¡R-146a, m¡R-122, m¡R- 148a, m¡R-214, m¡R-372, m¡R-let7c, m¡R-30c, m¡R-19a, m¡R-193b, m¡R-29b y m¡R-17, tal y como se han definido estos en el primer aspecto de la invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de cuantificar el producto de expresión los microARNs: m¡R-146a, m¡R-122, m¡R-148a, m¡R-214, m¡R- 372, m¡R-let7c, m¡R-30c, m¡R-19a, m¡R-193b, m¡R-29b y m¡R-17, y donde: - los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID N°: 1 , SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 1 1 , SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 , SEQ ID N°: 22 y/o SEQ ID N°: 23.
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1 100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID N°: 1 , SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 1 1 , SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 , SEQ ID N°: 22 y/o SEQ ID N°: 23.
- los anticuerpos son capaces de unirse a una región formada por cualquiera de las secuencias nucleotídicas SEQ ID N°: 1 , SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 1 1 , SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 , SEQ ID N°: 22 y/o SEQ ID N°: 23.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los anticuerpos están modificados. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el fluorocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.
Tabla 1. microARNs de la invención. Nombre del Gen ID Nombre del Secuencia del Secuencia del gen miARN gen miARN microARN 146 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 13
406938 hsa-m¡R-146a-5p
(MIR146A) microARN 122 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 14
406906 hsa-m¡R122-5p
(MIR122) microARN
SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 15
148a 406940 hsa-m¡R148a-3p
(MIR148A) microARN 214 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 16
406996 hsa-m¡R214-3p
(MIR214) microRNA372 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 17
442917 hsa-m¡R372
(MIR372) microRNA let-
SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 18 7c 406885 hsa-m¡Rlet7c
(MIRLET7C)
SEQ ID NO: 7
microRNA 30c 407031 SEQ ID NO: 19 hsa-m¡R30c-5p SEQ ID NO: 8
(MIR30C) 407032 microRNA 19A SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 20
406979 hsa-m¡R19a-3p
(MIR19A) microRNA
SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 21
193b 574455 hsa-m¡R193b-3p
(MIR193B)
SEQ ID NO: 1 1 SEQ ID NO: 22 microRNA 407024 hsa-m¡R29b-3p 29b-1
(MIR29B1) microRNA17 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 23
406952 hsa-miR17-5p
(MIR17)
En el contexto de la presente invención, los genes MIR146A, MIR122, MIR148A, MIR214, MIR372, MIRLET7C, MIR30C, MIR19A, MIR193B, MIR29B1 y MIR17 se definen también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de los microARNs recogidas respectivamente en las SEQ ID recogidas en la tabla 1 , y que comprendería a diversas vanantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un microARN que comprende la secuencia nucleotídica de la SEQ ID recogidas en la tabla 1 , b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un microARN que comprende la secuencia nucleotídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con las SEQ ID recogidas en la tabla 1 , respectivamente, y en las que el microARN codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de los microARNs MIR146A, MIR122, MIR148A, MIR214, MIR372, MIRLET7C, MIR30C, MIR19A, MIR193B, MIR29B1 y MIR17. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra las recogidas en las SEQ ID indicadas en la tabla!
Secuencias de la invención: SEQ ID NO: 1 :
CCGATGTGTATCCTCAGCTTTGAGAACTGAATTCCATGGGTTGTGTCAGTGTCAGA CCTCTGAAATTCAGTTCTTCAGCTGGGATATCTCTGTCATCGT SEQ ID NO: 2: CCTTAGCAGAGCTGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTGTCTAAACTATCAAACGCC ATTATC AC ACTAAATAG CTACTG CTAG G C
SEQ ID NO: 3:
G AG G C AAAGTTCTG AG AC ACTC C GACTCTG AGTATGATAG AAGTC AGTGC ACTAC A GAACTTTGTCTC
SEQ ID NO: 4:
GGCCTGGCTGGACAGAGTTGTCATGTGTCTGCCTGTCTACACTTGCTGTGCAGAA C ATC C G CTC AC CTGTAC AGC AG G C AC AG AC AG G C AGTC AC ATG AC AAC C C AG C CT
SEQ ID NO: 5: GTGGGCCTCAAATGTGGAGCACTATTCTGATGTCCAAGTGGAAAGTGCTGCGACA TTTGAGCGTCAC
SEQ ID NO: 6:
GCATCCGGGTTGAGGTAGTAGGTTGTATGGTTTAGAGTTACACCCTGGGAGTTAAC TGTACAACCTTCTAGCTTTCCTTGGAGC
SEQ ID NO: 7:
ACCATGCTGTAGTGTGTGTAAACATCCTACACTCTCAGCTGTGAGCTCAAGGTGGC TGGGAGAGGGTTGT TTACTCCTTCTGCCATGGA
SEQ ID NO: 8: AG ATACTGTAAAC ATC CTAC ACTCTC AG CTGTG G AAAGTAAG AAAG CTG G G AG AAG GCTGTTTACTCTTTCT
SEQ ID NO: 9:
GCAGTCCTCTGTTAGTTTTGCATAGTTGCACTACAAGAAGAATGTAGTTGTGCAAAT CTATGCAAAACTGATGGTGGCCTGC SEQ ID NO: 10:
GTG GTCTC AG AATC G G G GTTTTG AGG G C G AG ATG AGTTTATGTTTTATC C AACTG G CCCTCAAAGTCCCG CTTTTGGGGTCAT SEQ ID NO: 1 1 :
CTTCAGGAAGCTGGTTTCATATGGTGGTTTAGATTTAAATAGTGATTGTCTAGCACC ATT TGAAATCAGTGTTCTTGGGGG
SEQ ID NO: 12: GTCAGAATAATGTCAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGTGATATGTGCATCTACTGCA GTGAAGGCACTTGTAGCATTATGGTGAC
SEQ ID NO: 13:
UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU SEQ ID NO: 14: UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG SEQ ID NO: 15:
U C AG U G C AC U AC AG AAC U U U G U SEQ ID NO: 16:
AC AG C AG G C AC AG AC AG G C AG U SEQ ID NO: 17:
CCUCAAAUGUGGAGCACUAUUCU SEQ ID NO: 18:
UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU SEQ ID NO: 19: UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC SEQ ID NO: 20:
AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA SEQ ID NO: 21 :
CGGGGUUUUGAGGGCGAGAUGA SEQ ID NO: 22:
U AG C AC C AU U U G AAAU C AG U G U U
SEQ ID NO: 23:
CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.
Por otro lado, el kit o dispositivo de la invención puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.
El kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo de la invención es un kit de partes, que comprende un componente A, formado por un dispositivo para la recogida de la muestra del paso a), y un componente B, formado por los elementos necesarios para llevar a cabo el análisis cuantitativo en la muestra del paso a) o cualquiera de los métodos de la invención.
En una realización preferida el kit o dispositivo de la invención comprende oligonucleótidos. En otra realización preferida, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Vahas posibilidades son conocidas en el estado de la técnica.
Un noveno aspecto de la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante microarray de la invención, que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de las secuencias nucleotídicas SEQ ID N°: 1 , SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 1 1 , SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 , SEQ ID N°: 22 y/o SEQ ID N°: 23.
Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos pueden ser construidas en la superficie un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.
Así, las sondas de oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleótidos. La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse a, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: miARN, ARN mensajero, ARN total, un fragmento de PCR, etc.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el microarray de la invención presenta oligonucleótidos modificados, como se han descrito en el anterior aspecto de la invención. Un décimo aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención o del microarray de la invención, para la obtención de datos útiles para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento de un individuo o sujeto que potencialmente sufra cáncer de pulmón.
La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Tales programas pueden tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en práctica de los procesos según la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento.
Un décimo primer aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.
En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, la portadora puede estar constituida por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa, estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de, los procesos correspondientes. Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible. Por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios.
Un décimo segundo aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Un décimo tercer aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Una "secuencia de ácido nucleico o polinucleótido" puede comprender las cinco bases que aparecen biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir para distintos propósitos, por ejemplo, para estabilizar o desestabilizar la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más restos de base modificados, no estándar, derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a, N6-metil-adenina, N6-terc-butil-bencil-adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidrox¡met¡l) uracilo, 5- carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1 - metilguanina, 1 -metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3- metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5- metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'- metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wybutoxosina, pesudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2- tiouracilo, 2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo (es decir, timina), éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxiprop¡l) uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina, y 5-propinil pirimidina. Otros ejemplos de restos de bases modificados, no estándar, o derivatizados pueden encontrarse en las Patentes de EEUU Nos. 6.001 .61 1 ; 5.955.589; 5.844.106; 5.789.562; 5.750.343; 5.728.525; y 5.679.785. Además, una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender uno o más restos de azúcares modificados incluyendo, pero sin limitarse a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxirribonucleótidos (ADN ó DNA). Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
En la presente invención se entiende por vanante o fragmento biológicamente activo, aquellas vanantes o fragmentos de los péptidos indicados que tienen un efecto fisiológico, metabólico o inmunológico igual, o presentan la misma utilidad que los descritos. Esto es, son funcionalmente equivalentes. Dichos efectos se pueden determinar mediante métodos convencionales. El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul et ai, 1999. J. Mol. Biol. 215: 403-410.
El término "individuo" o "sujeto", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a un animal, preferiblemente a un mamífero, y más preferiblemente a un ser humano. El término "individuo" en esta memoria, es sinónimo de "paciente", y no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física. El individuo puede ser cualquiera, un individuo predispuesto a una enfermedad (por ejemplo, cáncer de pulmón) o un individuo que padece dicha enfermedad.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. EJEMPLO DE LA INVENCIÓN
El objeto de esta patente es la utilización de los niveles de microARNs circulantes en condensado de aire exhalado como biomarcadores para la detección de cáncer de pulmón.
Para ello se aisló ARN mediante miRNAeasy serum/plasma kit (qiagen) de 200 μΙ de aire exhalado de vías inferiores de 127 sujetos, divididos en 4 grupos:
- Grupo I: 32 Pacientes diagnosticados de cáncer de pulmón con distintos estadios de la enfermedad, procedentes del servicio de Oncología del Hospital Reina Sofía, Córdoba
- Grupo II: 31 Pacientes diagnosticados con EPOC procedentes del Servicio de Neumología del Hospital Reina Sofía, Córdoba. - Grupo III: 32 Controles sanos con Factor de riesgo, siendo fumadores o ex fumadores procedentes del servicio de Medicina Interna del Hospital Reina Sofía, Córdoba.
- Grupo IV: 32 Sujetos sanos, procedentes del Servicio de Medicina Interna del Hospital Reina Sofía, Córdoba.
El ARN total de las muestras incluyendo la fracción de los microARNs se aisló a partir de 200 μΙ de aire exhalado condensado utilizando el kit QIAzol miRNeasy (Qiagen, Valencia, CA, USA). Los 200 μΙ de aire exhalado se incubaron con 1 mi de QIAzol Lysis Reagent (Qiagen) para inhibir la función de las enzimas ARNasas. El protocolo se realizó siguiendo exhaustivamente las recomendaciones del fabricante. Finalmente, el ARN aislado se diluyó en 14 μΙ de agua libre de ARNasas y se guardó a -80°C.
Se realizó un PCR array de microARNs (miScript miRNA PCR array cáncer, Quiagen; siguiendo las instrucciones del fabricante) descritos en distintos tipos de tumores: cerebral, colon, gástrico, cabeza, cuello, hígado, riñon, linfoma, pancreático, próstata, piel, ovario, pecho y útero. Con esta técnica se evaluó la expresión de 84 microARNs en aire exhalado de vías inferiores de un pool de 17 controles sanos y 17 pacientes con cáncer (Grupo I y grupo IV).
Una vez realizado el array y obtenidas las Cts, los resultados de la PCR fueron normalizados con dos housekeepings diferentes: - Tomando como referencia el valor del microARN sintético Cel-miRNA-39.
- Tomando de referencia el valor del gen SNORD68 que se expresaba de manera constitutiva en nuestras muestras.
Los niveles de expresión relativa se calcularon según el método de 2"ct. Utilizando un punto de corte de 2 veces de cambio (2-Fold change), observamos que 40 microARNs estaban incrementados y 9 reducidos en las muestras de cáncer comparadas con los sujetos sanos. Los resultados mostraron que 1 1 microARNs se expresaban solamente en los pacientes con tumor o se hallaban incrementados en cáncer; en todos ellos las veces de cambio de expresión respecto al control eran mayores de 10. Algunos de estos microARN se han descrito en orina y plasma de pacientes con cáncer de pulmón, otros se han descrito en otros tipos de tumores, pero ninguno en aire exhalado.
La expresión de estos 1 1 microARNs se validó mediante RT-PCR de forma independiente en cada sujeto de los cuatro grupos: casos, controles sin factor de riesgo, controles con factor de riesgo y EPOC. Los 1 1 microARNs analizados fueron: m¡R-146a, m¡R-122, m¡R-148a, m¡R-214, m¡R-372, m¡R-let7c, m¡R-30c, m¡R-19a, m¡R- 193b, m¡R-29b y m¡R-17.
Para realizar las PCRs, la metodología seguida es la que comprende TaqMan MicroRNA Assay kit (Applied Biosystem), estandarizada en nuestro grupo y la que se encuentra en la mayoría de las publicaciones relacionadas con microARNs. El protocolo consiste en una primera retrotranscripcion (RT) del 1 1 ng de ARN (cuantificado en el nanodrop) con stem-loop primers específicos de microARNs, seguida de una real-time PCR con sondas TaqMan específicas para cada microARN que se pretenda amplificar.
Cada reacción de retrotranscripcion se realizó en 15 μΙ conteniendo 1 ,5 μΙ de 10 X RT buffer 1 , 0,2 μΙ de inhibidor de ARNasas (20 U/ml), 0, 15 μΙ de 100 mmol/L de "deoxynucleoside triphosphates", 1 μΙ de 50 U/μΙ MultiScribe transcriptasa inversa, 1 ,5 μΙ de cada RT primers (4 miARN RT primers/reacción de RT), 1 1 ng de ARN y agua libre de ARNasas. La reacción se llevó a cabo en un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied BioSystems) a 16°C durante 30 minutos, 42°C durante 30°C y 85°C 5 minutos. Cada preamplificacion se hizo con una mezcla de 4 sondas de 4 microARNs. Así realizamos 3 preamplificaciones para realizar posteriormente las PCRs de los 1 1 microARNs seleccionados. Después se procedió con la reacción de preamplificacion. Para ello, 2,5 μΙ de producto de RT diluido (2.5 μΙ en 10 μΙ de agua libre de ARNasas) se combinó con 5 μΙ de PCR Master Mix Taqman 2x, No AmpErase UNG y 2,5 μΙ de un pool de 4 primers Taqman miRNA assay (0.2x). La reacción se realizó en un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied BioSystems) a 95°C durante 10 minutos, más 20 ciclos a 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 4 minutos.
Posteriormente el producto de preamplificacion se diluyó en 60 μΙ de agua libre de ARNasas para proceder a la reacción de PCR. 4 μΙ de este producto de preamplificacion y se combinó con 5 μΙ de Taqman 2x Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG, con 0,5 μΙ del primer especifico 20X Taqman miRNA Assay y 0,5 μΙ de agua destilada. La PCR se realizó en el termociclador de Roche LightCycler 480 a 95°C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 95°C durante 15 s y 60°C durante 1 min. Los niveles de expresión de los miARNs se calcularon utilizando el método 2"ct Así se realizó las PCRs de estos 1 1 microARNs en las muestras de aire exhalado de vías inferiores de 127 sujetos, se procedió al análisis de estos resultados.
Teniendo en cuenta la ausencia de un método establecido de normalización de datos de expresión de microARNs circulantes, el análisis se llevó a cabo teniendo en cuenta los distintos modelos publicados hasta el momento (Mestdagh et al., 2009. Genome Biology, Vol.10, N° 6, PP R6; Boeri et al., 201 1 . Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 108, N° 9, PP 3713-3718).
Utilizando el método de normalización de la expresión utilizando como housekeeping la media de los miARNs expresados en todas las muestras (Mestdagh et al., 2009. Genome Biology, Vol.10, N° 6, PP R6) hallamos que los niveles del m¡R-29b y m¡R- 146a estaban diferencialmente expresados de forma significativa en los pacientes con cáncer respecto al grupo control (Figura 1 ).
Utilizando un segundo análisis (Boeri et al., 201 1 . Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 108, N° 9, PP 3713-3718), el nivel de expresión de cada miARN se calculó mediante el método de 2"ct. Después se calcularon los distintos ratios recíprocos, considerando un solo ratio para cada par de miARNs y expresado como log2. De esta forma, hallamos que una firma de 7 microARNs compuesta por los microARNS 122, 29b, 146, 193, 372, 214, 30 generaban una serie de ratios que estaban diferencialmente expresados entre Control y Cáncer (Tabla 2; Figura 2). Tabla 2. Medias y SEM de los ratios de miARNs diferencialmente expresados entre Control y Cáncer
Figure imgf000029_0001
Asimismo, generamos un modelo que integraba la combinación de los ratios diferencialmente expresados (regresión logística binaria), el cual era capaz de discriminar pacientes con cáncer respecto a controles con un 80% de Especificidad, un 70% de Sensibilidad y un área bajo la curva de 0.76. Este modelo se ajusta a los datos de microARNs en nuestra cohorte de individuos. Sería necesaria su validación en otra cohorte de pacientes independiente (Figura 3). Por otro lado encontramos que dentro del grupo de cáncer, existían distintas firmas de microARNs cuyos ratios se asociaron a determinadas características de la clínica de los pacientes con cáncer de pulmón como tipo de tumor, invasión, metástasis y estadio.
Tipos de Tumor
Una firma de 5 microARNs compuesta por el m¡R-17, -29b, -214, -148 y -Iet7c generaban ratios que estaban significativamente diferencialmente expresados entre los subtipos de cáncer adenocarcinoma y epidermoide (Tabla 3):
Tabla 3. Media y SEM de los ratios de miARNs diferencialmente expresados entre el subtipo de tumor Adenocarcinoma y Epidermoide
Figure imgf000030_0001
El modelo de combinación de estos ratios permitía discriminar el tipo de tumor Adenocarcioma del Epidermoide con una Especificidad del 91 %, una Sensibilidad del 87% y un Área bajo la curva de 0.92. Este modelo se ajustó exclusivamente a los datos de miARNs y tipo de tumor de nuestra cohorte de 32 pacientes con cáncer (Figura 4).
Invasividad Una firma de 4 microARNs compuesta por el m¡R-17, -214, -122 y -148 generaban ratios que estaban diferencialmente expresados de forma significativa entre la invasividad o no del tumor (Tabla 4):
Tabla 4. Media y SEM de los ratios microARN diferencialmente expresados entre la invasividad o no del tumor miR Ratios No Invasión Invasión (Media ± P (Log2) (Media ± SEM) SEM)
m¡R-17/m¡R-214 17, 1 ± 2 12, 1 ± 1 , 1 0,04
m¡R-122/m¡R-148 14,5 ± 2,8 19,4 ± 1 ,7 0,05
m¡R-214/m¡R-148 -3, 1 ± 0,9 2,5 ± 2, 1 0,02
El modelo de combinación de estos ratios permitía discriminar la invasividad o no del tumor con una Especificidad del 91 %, una Sensibilidad del 64 % y un Área bajo la curva de 0.85. Este modelo se ajustó exclusivamente a los datos de microARN e invasividad del tumor de nuestra cohorte de 32 pacientes con cáncer (Figura 5).
Metástasis
Una firma de 5 microARNs compuesta por el m¡R-17, -214, -122, -29b y -30 generaban ratios que estaban diferencialmente expresados de forma significativa entre la presencia o no de metástasis (Tabla 5):
Tabla 5. Medias y SEM de los ratios de microARNs diferencialmente expresados entre la presencia o ausencia de metástasis
Figure imgf000031_0001
El modelo de combinación de estos ratios permitía discriminar la presencia o no de metástasis con una Especificidad del 75 %, una Sensibilidad del 71 % y un Área bajo la curva de 0.78. Este modelo se ajustó exclusivamente a los datos de microARN y metástasis de nuestra cohorte de 32 pacientes con cáncer.
Estadio Una firma de 3 microARNs compuesta por el m¡R-29b, -214, y -372 generaban ratios que estaban diferencialmente expresados de forma significativa entre la presencia o no de metástasis (Tabla 6):
Tabla 6. Medias y SEM de los ratios de microARNs diferencialmente expresados entre el estadio 3 y 4 del tumor
Figure imgf000032_0001
El modelo de combinación de estos ratios permitía discriminar entre el estadio 3 y 4 del tumor con una Especificidad del 72 %, una Sensibilidad del 78 % y un Área bajo la curva de 0.84. Este modelo se ajustó exclusivamente a los datos de microARN y estadio del tumor de nuestra cohorte de 32 pacientes con cáncer.

Claims

REIVINDICACIONES
1 .- Uso simultáneo de los biomarcadores de microARNs: m¡R-146a, m¡R-122, m¡R- 148a, m¡R-214, m¡R-372, m¡R-let7c, m¡R-30c, m¡R-19a, m¡R-193b, m¡R-29b y m¡R-17 para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento del cáncer de pulmón.
2.- Un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento de un individuo o sujeto que potencialmente sufra cáncer de pulmón, que comprende: a) cuantificar el producto de expresión de los biomarcadores m¡R-146a, m¡R-122, m¡R-148a, m¡R-214, m¡R-372, m¡R-let7c, m¡R-30c, m¡R-19a, m¡R-193b, m¡R-29b y/o m¡R-17 en una muestra biológica aislada de dicho individuo.
3.- El método según la reivindicación anterior, que además comprende: b) calcular el índice A según la ecuación:
A = -0,083 + 0,172*(m¡R-122/m¡R-29b) + 0,009*(m¡R-29b/m¡R-146) - 0,038*(m¡R- 214/m¡R-146) -0,041 *(m¡R-193/m¡R-146) + 0,004*(m¡R-30/m¡R-146) + 0,056*(m¡R- 146/m¡R-372), c) calcular el índice B según la ecuación:
B = 3,793 - 0,501 *(m¡R-17/m¡R-148) + 0, 167*(miR-29b/miR-Letc7c) + 0,278*(m¡R- 214/m¡R-Let7c) - 0,045*(m¡R-148/m¡R-let7c), d) calcular el índice C según la ecuación: C = 1 ,417 - 0, 139*(m¡R-17/m¡R-214) + 0,05*(m¡R-122/m¡R-148) + 0, 106*(m¡R-214/m¡R- 148), e) calcular el índice D según la ecuación:
D = 4,372 - 0,026*(m¡R-17/m¡R-214) - 0,049*(m¡R-122/m¡R-214) - 0,129*(m¡R-29b/m¡R- 214) + 0,022*(m¡R-214/m¡R-30) y/o f) calcular el índice E según la ecuación:
E = 16, 12 - 0,630*(m¡R-29b/m¡R-214) + 0, 157*(m¡R-214/m¡R-30), asignando en cada ecuación los valores de los biomarcadores correspondientes obtenidos en el paso (a).
4. - Un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón que comprende los pasos (a) y (b) según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, y además comprende: g) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón cuando el valor del índice A del paso (b) sea preferiblemente menor que 0,88, más preferiblemente menor que 0,75, y aún más preferiblemente menor que 0,579.
5. - Un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón que comprende los pasos (a) y (c) según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, y además comprende: h) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón de células no pequeñas de tipo adenocarcinoma y no epidermoide cuando el valor del índice B del paso (c) sea preferiblemente menor que 0,91 , más preferiblemente menor que 0,72, y aún más preferiblemente menor que 0,50.
6. - Un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón que comprende los pasos (a) y (d) según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, y además comprende: i) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón de tumor invasivo cuando el valor del índice C del paso (d) sea preferiblemente mayor que 0,30, más preferiblemente mayor que 0,39, y aún más preferiblemente mayor que 0,65.
7. - Un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón que comprende los pasos (a) y (e) según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, y además comprende: j) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón con metástasis cuando el valor del índice D del paso (e) sea preferiblemente mayor que 0,28, más preferiblemente mayor que 0,34, y aún más preferiblemente mayor que 0,45.
8. - Un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento del cáncer de pulmón que comprende los pasos (a) y (f) según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, y además comprende: k) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con cáncer de pulmón en estadio 4 cuando el valor del índice E del paso (f) sea prefenblemente mayor que 0, 18, más prefenblemente mayor que 0,39, y aún más preferiblemente mayor que 0,64.
9. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-8, donde la muestra biológica aislada del paso (a) es una muestra de condensado de aire exhalado.
10.- Un kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de cuantificar el producto de expresión los microARN: m¡R-146a, m¡R-122, m¡R-148a, m¡R-214, m¡R-372, m¡R-let7c, m¡R-30c, m¡R-19a, m¡R- 193b, m¡R-29b y m¡R-17, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más prefenblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más prefenblemente de al menos un 90%, aún más prefenblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID N°: 1 , SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 1 1 , SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 , SEQ ID N°: 22 y/o SEQ ID N°: 23. - las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1 100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más prefenblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID N°: 1 , SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 1 1 , SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 , SEQ ID N°: 22 y/o SEQ ID N°: 23.
- los anticuerpos son capaces de unirse a una región formada por cualquiera de las secuencias nucleotídicas SEQ ID N°: 1 , SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 1 1 , SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 , SEQ ID N°: 22 y/o SEQ ID N°: 23.
1 1 .- Un microarray que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de las secuencias nucleotídicas SEQ ID N°: 1 , SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 1 1 , SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 13, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 21 , SEQ ID N°: 22 y/o SEQ ID N°: 23.
12.- Uso del kit o dispositivo tal y como se define en la reivindicación 10 o de un microarray tal y como se define en la reivindicación 1 1 , para la obtención de datos útiles para el diagnóstico, clasificación y/o seguimiento de un individuo o sujeto que potencialmente sufra cáncer de pulmón.
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