WO2017175842A1 - スプライシングの改変に関する化合物及び医薬組成物 - Google Patents

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WO2017175842A1
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halogen atom
alkyl group
compound
pharmaceutical composition
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萩原正敏
大江賢治
佐古有季哉
細谷孝充
吉田優
隅田有人
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国立大学法人京都大学
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    • C07D409/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond

Definitions

  • the present disclosure relates to compounds and pharmaceutical compositions relating to splicing modification, their use, and methods for the prevention, amelioration, progression inhibition and / or treatment of genetic diseases using them.
  • Duchenne muscular dystrophy is composed of 79 exons, which are the cause of the dystrophin gene, and has an optional repeat structure, so exon skip induction therapy is possible.
  • frame shifts due to gene mutations and the appearance of stop codons cause dystrophin protein abnormalities, but functionally full-length dystrophin protein that lacks skipped exons by artificially skipping mutant exons to match the frame It is believed that symptoms can be alleviated.
  • Non-patent Document 1 It has been reported that a low molecular weight compound is effective in promoting exon skipping of a dystrophin gene having a certain mutation and that DMD can be treated by exon skipping with the low molecular weight compound.
  • the present disclosure in one aspect, provides compounds and pharmaceutical compositions capable of modifying splicing, their use, and methods for preventing, ameliorating, suppressing progression and / or treating genetic diseases using them.
  • the present disclosure includes a compound represented by the following general formula (I), a prodrug thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, and the compound has an ability to inhibit the phosphorylation activity of a protein kinase.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for modifying splicing.
  • X 1 is R 3 , R 4 and R 5 are each independently hydrogen, a halogen atom, a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, a C 1-4 alkyl group, or a C 1-4 substituted with a halogen atom.
  • An alkyl group, X 2 is — (bond) or —NH—
  • R 1 is R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 each independently represent hydrogen, a halogen atom, a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, a C 1-4 alkyl group, or a C atom substituted with a halogen atom.
  • R 2 is hydrogen, a halogen atom, a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, a C 1-4 alkyl group, or a C 1-4 alkyl group substituted with a halogen atom.
  • the present disclosure relates to a method for preventing, ameliorating, suppressing progression and / or treating a genetic disease, the method comprising administering to a subject a pharmaceutical composition according to the present disclosure.
  • the present disclosure provides a compound represented by the above general formula (I) or a prodrug thereof for producing a pharmaceutical composition for preventing, ameliorating, suppressing progression and / or treating a genetic disease Or the use of a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present disclosure relates to the use of a compound represented by the above general formula (I) or a prodrug thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof for modifying splicing. Moreover, this indication is related with the compound represented by the said general formula (I), its prodrug, or its pharmaceutically acceptable salt in another aspect.
  • FIG. 1 is an example of the results of measuring the blood concentration when compound 3 and TG003 were administered to mice once subcutaneously.
  • FIG. 2 shows an example of the result of confirming the Clk inhibitory activity by in vitro kinase analysis of Compound 3.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a reporter plasmid capable of detecting exon skip.
  • FIG. 4 is an example of the results of detecting the inhibitory effect of Compound 3 on SR protein phosphorylation in HeLa cells into which a DMD patient reporter was introduced.
  • FIG. 5 is an example of the result of detecting the exon skip activity of Compound 3 using a DMD patient reporter introduced into HeLa cells.
  • FIG. 1 is an example of the results of measuring the blood concentration when compound 3 and TG003 were administered to mice once subcutaneously.
  • FIG. 2 shows an example of the result of confirming the Clk inhibitory activity by in vitro kinase analysis of Compound 3.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a reporter
  • FIG. 6 is an example of the result of confirming that the frequency of exon skip is increased in patient-derived muscle cells by the addition of Compound 3.
  • FIG. 7 is an example of the result of confirming that the expression level of dystrophin protein is increased in patient-derived muscle cells by the addition of Compound 3.
  • FIG. 8 is an example of the results of confirming the uptake of compound 3 in muscle tissue after oral administration of compound 3.
  • FIG. 9 is an example of the results of confirming the inhibitory effect on phosphorylation of SR protein in muscle tissue after oral administration of compound 3.
  • FIG. 10 is an example of the results of confirming that splicing changes in muscle tissue after oral administration of Compound 3 to mice.
  • FIG. 11 shows an example of the result of detecting the exon skip activity of a compound using a DMD patient reporter introduced into HeLa cells.
  • FIG. 12 is an example of the results of confirming that the frequency of specific exon skipping is increased in patient-derived muscle cells by the addition of Compound 3.
  • the present disclosure is based on the knowledge that in one aspect, a compound represented by the following general formula (I) can exhibit an effect of altering splicing.
  • the present disclosure is also based on the finding that, in one aspect, alteration of splicing enables prevention, improvement, progression inhibition, and / or treatment of genetic diseases.
  • the present disclosure in one aspect, relates to a compound represented by the following general formula (I), a prodrug thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a compound represented by the following general formula (I) or a prodrug thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof is also referred to as a “compound according to the present disclosure”.
  • X 1 is R 3 , R 4 and R 5 are each independently hydrogen, a halogen atom, a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, a C 1-4 alkyl group, or a C 1-4 substituted with a halogen atom.
  • An alkyl group, X 2 is — (bond) or —NH—
  • R 1 is R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 each independently represent hydrogen, a halogen atom, a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, a C 1-4 alkyl group, or a C atom substituted with a halogen atom.
  • R 2 is hydrogen, a halogen atom, a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, a C 1-4 alkyl group, or a C 1-4 alkyl group substituted with a halogen atom.
  • a bond with a wavy line indicates a bond portion with the formula (I).
  • the compound according to the present disclosure has the ability to inhibit the phosphorylation activity of protein kinase.
  • the protein kinase that the compound according to the present disclosure inhibits is not particularly limited, and examples include kinases such as Haspin, CLK1, DYRK1A, DYRK2, DYRK1B, HGK, DYRK3, CDK9 / CycT1, and MINK2.
  • the compound according to the present disclosure is presumed to induce splicing modification by having the ability to inhibit the phosphorylation activity of protein kinase, but the present disclosure is not limited to this mechanism. Good.
  • splicing modification means that the mode of pre-mRNA splicing changes.
  • alteration of splicing may include exon skipping or suppression thereof, intron insertion or suppression thereof, selective splicing enhancement or suppression thereof. Splicing modifications can be performed in vivo, ex vivo, or in vitro.
  • exon skip means that one or more exons are removed when a gene composed of a plurality of exons and a plurality of introns is removed from the transcribed mRNA precursor to form a mature mRNA. That means.
  • gene disease refers to a disease caused by a genetic abnormality. When splicing alterations occur, it may be possible to prevent, ameliorate, inhibit progression, and / or treat genetic diseases.
  • the present disclosure relates to a pharmaceutical composition containing the compound according to the present disclosure as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition containing the compound according to the present disclosure as an active ingredient is also referred to as a “pharmaceutical composition according to the present disclosure”.
  • the pharmaceutical composition according to the present disclosure is, in one or more embodiments, a pharmaceutical composition for modifying splicing, and in one or more embodiments, is a pharmaceutical composition for inducing exon skip. .
  • the pharmaceutical composition according to the present disclosure is a pharmaceutical composition for modifying splicing by having an ability to inhibit the phosphorylation activity of a protein kinase, and further includes one or more In the embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition for inducing exon skipping by having the ability to inhibit the phosphorylation activity of protein kinase.
  • muscular dystrophy As one or a plurality of embodiments of the genetic disease that can be improved, suppressed or treated by modifying splicing, muscular dystrophy can be mentioned.
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • the dystrophin gene consists of 79 exons and has an optional repeat structure. It is believed that by artificially skipping a mutant exon containing the gene mutation so that the frame matches, a functional full-length dystrophin protein can be induced although the skipped exon is lacking, and the symptoms can be alleviated.
  • the pharmaceutical composition according to the present disclosure is a pharmaceutical composition for preventing, improving, suppressing progression, and / or treating a genetic disease.
  • the genetic disease is a genetic disease in which a mutation causing the disease can be eliminated or suppressed by altering splicing, and in one or a plurality of embodiments, exon skipping is performed. It refers to a genetic disease that can occur to eliminate or suppress a mutation that causes the disease.
  • An example of the genetic disease is muscular dystrophy, but the present invention is not limited thereto.
  • “muscular dystrophy” includes progressive muscular dystrophy in one or a plurality of embodiments, and includes Duchenne muscular dystrophy (DMD) and Becker muscular dystrophy (BMD) in one or more embodiments. .
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 and R 9 are each independently a hydrogen atom or a halogen atom in one or more embodiments. , A C 1-4 alkyl group, or a C 1-4 alkyl group substituted with a halogen atom.
  • examples of the C 1-4 alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, and a tert-butyl group.
  • examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • the compound represented by the general formula (I) is: R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are the same as described above.
  • the compound represented by the general formula (I) is: R 2 , R 3 , R 4 , R 6 and R 7 are the same as described above.
  • the compound represented by the general formula (I) is: R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are the same as described above.
  • the compound represented by the general formula (I) is: R 2 , R 3 , R 6 , R 7 , R 8 and R 9 are the same as described above.
  • the “pharmaceutically acceptable salt” in the present disclosure includes a pharmacologically and / or pharmaceutically acceptable salt, and includes, for example, an inorganic acid salt, an organic acid salt, an inorganic basic salt, an organic basic salt, acidic or basic. Amino acid salts and the like.
  • Preferable examples of the inorganic acid salt include hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, phosphate and the like, and preferable examples of the organic acid salt include, for example, acetate, succinate, Examples thereof include fumarate, maleate, tartrate, citrate, lactate, stearate, benzoate, methanesulfonate, and p-toluenesulfonate.
  • Preferred examples of the inorganic base salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, aluminum salt and ammonium salt.
  • Preferable examples of the organic base salt include diethylamine salt, diethanolamine salt, meglumine salt, N, N′-dibenzylethylenediamine salt and the like.
  • Preferred examples of the acidic amino acid salt include aspartate and glutamate.
  • Preferable examples of the basic amino acid salt include arginine salt, lysine salt, ornithine salt and the like.
  • the “salt of a compound” may include a hydrate that can be formed by absorbing moisture when the compound is left in the air. Further, in the present disclosure, the “salt of a compound” may include a solvate that can be formed by absorbing a certain kind of other solvent.
  • the “prodrug” includes, in one or a plurality of embodiments, those that are easily hydrolyzed in vivo and regenerate the compound represented by the general formula (I). If it is a compound, the compound which the carboxyl group became the alkoxycarbonyl group, the compound which became the alkylthiocarbonyl group, or the compound which became the alkylaminocarbonyl group is mentioned.
  • a compound having an amino group a compound in which the amino group is substituted with an alkanoyl group to become an alkanoylamino group, a compound in which the amino group is substituted with an alkoxycarbonyl group to become an alkoxycarbonylamino group, an acyloxymethylamino group, Or a compound that has become hydroxylamine.
  • a compound having a hydroxyl group a compound in which the hydroxyl group is substituted with the acyl group to become an acyloxy group, a compound that has become a phosphate ester, or a compound that has become an acyloxymethyloxy group can be given.
  • alkyl moiety of the group used for forming a prodrug examples include an alkyl group described later, and the alkyl group may be substituted (for example, by an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms).
  • the alkyl group may be substituted (for example, by an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms).
  • lower (for example, 1-6 carbon atoms) alkoxycarbonyl such as methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, methoxymethoxycarbonyl, ethoxymethoxy, etc.
  • Examples include lower (for example, 1-6 carbon atoms) alkoxycarbonyl substituted by alkoxy groups such as carbonyl, 2-methoxyethoxycarbonyl, 2-methoxyethoxymethoxycarbonyl, pivaloyloxymethoxycarbonyl and the like.
  • the “pharmaceutical composition” may be a dosage form suitable for an administration form by applying a well-known formulation technique in one or a plurality of embodiments.
  • the dosage form include, but are not limited to, oral administration in a dosage form such as a tablet, capsule, granule, powder, pill, troche, syrup, and liquid.
  • parenteral administration in dosage forms such as injections, liquids, aerosols, suppositories, patches, lotions, liniments, ointments, eye drops and the like can be mentioned.
  • These preparations can be produced by known methods using additives such as, but not limited to, excipients, lubricants, binders, disintegrants, stabilizers, flavoring agents, and diluents.
  • excipient examples include, but are not limited to, starch such as starch, potato starch, and corn starch, lactose, crystalline cellulose, calcium hydrogen phosphate, and the like.
  • coating agent examples include, but are not limited to, ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, shellac, talc, carnauba wax, paraffin, and the like.
  • binder include, but are not limited to, polyvinyl pyrrolidone, macrogol and the same compound as the excipient.
  • disintegrant examples include, but are not limited to, compounds similar to the excipients and chemically modified starch and celluloses such as croscarmellose sodium, sodium carboxymethyl starch, and crosslinked polyvinylpyrrolidone.
  • stabilizer examples include, but are not limited to, paraoxybenzoates such as methylparaben and propylparaben; alcohols such as chlorobutanol, benzyl alcohol, and phenylethyl alcohol; benzalkonium chloride; phenol, cresol Mention may be made of such phenols; thimerosal; dehydroacetic acid; and sorbic acid.
  • flavoring agent examples include, but are not limited to, sweeteners, acidulants, and fragrances that are commonly used.
  • the solvent is not limited to these, but ethanol, phenol, chlorocresol, purified water, distilled water and the like can be used, and a surfactant or an emulsifier can also be used as necessary.
  • a surfactant or an emulsifier include, but are not limited to, polysorbate 80, polyoxyl 40 stearate, lauromacrogol, and the like.
  • the method of using the pharmaceutical composition according to the present disclosure may vary depending on symptoms, age, administration method, and the like. Although the method of use is not limited to these, the compound represented by the above general formula (I), which is an active ingredient, is administered orally intermittently or continuously so that the concentration in the body is between 100 nM and 1 mM. , Transdermal, submucosal, subcutaneous, intramuscular, intravascular, intracerebral, or intraperitoneal.
  • the lower limit is 0.01 mg (preferably converted into the compound represented by the above general formula (I) per day for a subject (adult if human)) 0.1 mg), and as an upper limit, 2000 mg (preferably 500 mg, more preferably 100 mg) can be divided into one or several doses and administered according to symptoms.
  • the lower limit is 0.001 mg (preferably 0.01 mg) and the upper limit is 500 mg (preferably 50 mg) per day for a subject (adult if human). Is divided into one or several times and administered according to symptoms.
  • the pharmaceutical composition according to the present disclosure preferably induces splicing modification in a cell or tissue in which a gene causing a genetic disease is expressed or not expressed.
  • a gene causing a genetic disease is expressed or not expressed.
  • Individuals for which the splicing alteration is induced include humans and / or non-human animals.
  • the pharmaceutical composition according to the present disclosure is for prevention, improvement, progression suppression, and / or treatment of genetic diseases.
  • the present disclosure relates to a method for preventing, ameliorating, suppressing progression, and / or treating a genetic disease, which includes administering a pharmaceutical composition according to the present disclosure to a subject. .
  • administration of the pharmaceutical composition according to the present disclosure can be based on the above-described method of using the pharmaceutical composition. Examples of the subject include humans and non-human animals.
  • the present disclosure provides a compound represented by the above general formula (I) or a prodrug thereof or a pharmaceutically acceptable agent for the prevention, amelioration, progression inhibition, and / or treatment of a genetic disease.
  • the present disclosure is represented by the general formula (I) for producing a pharmaceutical composition for preventing, ameliorating, suppressing progression, and / or treating a genetic disease. It relates to the use of a compound or a prodrug thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present disclosure relates to a method for inducing splicing modification, which includes administering a pharmaceutical composition according to the present disclosure to a subject.
  • administration of the pharmaceutical composition according to the present disclosure can be based on the above-described method of using the pharmaceutical composition.
  • Targets include cells, tissues, organs, individuals, humans, and non-human animals.
  • the present disclosure relates to the use of a compound represented by the general formula (I) or a prodrug thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof for inducing splicing modification.
  • the present disclosure relates to a compound represented by the general formula (I) or a prodrug thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof for producing a pharmaceutical composition for inducing splicing alteration.
  • salt a compound represented by the general formula (I) or a prodrug thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof for producing a pharmaceutical composition for inducing splicing alteration.
  • a compound represented by the following general formula (I), a prodrug thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof [Here, in the general formula (I), X 1 is R 3 , R 4 and R 5 are each independently hydrogen, a halogen atom, a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, a C 1-4 alkyl group, or a C 1-4 substituted with a halogen atom.
  • An alkyl group, X 2 is — (bond) or —NH—
  • R 1 is R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 each independently represent hydrogen, a halogen atom, a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, a C 1-4 alkyl group, or a C atom substituted with a halogen atom.
  • R 2 is hydrogen, a halogen atom, a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, a C 1-4 alkyl group, or a C 1-4 alkyl group substituted with a halogen atom.
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 and R 9 are each independently hydrogen, halogen atom, C 1-4
  • a prodrug thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof which is an alkyl group or a C 1-4 alkyl group substituted with a halogen atom.
  • the compound represented by the general formula (I) is: Or a prodrug or pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of [1] to [3].
  • the compound represented by the general formula (I) is: Or a prodrug or pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of [1] to [3].
  • the compound represented by the general formula (I) is: Or a prodrug or pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of [1] to [3].
  • the compound represented by the general formula (I) is: Or a prodrug or pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of [1] to [3].
  • a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient the compound according to any one of [1] to [7], a prodrug thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the pharmaceutical composition according to any one of [8] to [11] which induces exon skipping by having an ability to inhibit the phosphorylation activity of protein kinase.
  • the pharmaceutical composition according to any one of [8] to [12] for prevention, improvement, progression inhibition, and / or treatment of a genetic disease [14] The pharmaceutical composition according to any one of [8] to [13], wherein the genetic disease is a genetic disease in which a mutation causing the disease can be eliminated or suppressed by altering splicing. [15] The pharmaceutical composition according to any one of [8] to [14], wherein the genetic disease is muscular dystrophy. [16] A method for the prevention, amelioration, progression inhibition, and / or treatment of a genetic disease, comprising administering the pharmaceutical composition according to any one of [8] to [15] to a subject .
  • the genetic disease is a genetic disease in which splicing is altered so that a mutation causing the disease can be eliminated or suppressed.
  • the genetic disease is muscular dystrophy.
  • a method for inducing splicing modification comprising administering to a subject the pharmaceutical composition according to any one of [8] to [15].
  • 5-bromoindazole (197 mg, 1.00 mmol, commercial product), 5-quinolineboronic acid (259 mg, 1.50 mmol, commercial product), tris (dibenzylideneacetone) dipalladium (Pd 2 dba 3 ) ( 9.20 mg, 10.0 ⁇ mol, commercial product), 2-dicyclohexylphosphino-2 ', 4', 6'-triisopropylbiphenyl (Xphos) (19.1 mg, 40.1 ⁇ mol, commercial product), tripotassium phosphate, n-hydrated
  • the product (425 mg, 2.00 mmol, commercial product) in 1-butanol (10 mL, commercial product) was heated and stirred at 100 ° C.
  • 5-bromoindazole (197 mg, 1.00 mmol, commercial product), 5-isoquinolineboronic acid (259 mg, 1.50 mmol, commercial product), tris (dibenzylideneacetone) dipalladium (Pd 2 dba 3 ) ( 9.20 mg, 10.0 ⁇ mol, commercial product), 2-dicyclohexylphosphino-2 ', 4', 6'-triisopropylbiphenyl (Xphos) (19.1 mg, 40.1 ⁇ mol, commercial product), tripotassium phosphate, n-hydrated
  • the product (425 mg, 2.00 mmol, commercial product) in 1-butanol (10 mL, commercial product) was heated and stirred at 100 ° C.
  • 5-bromoindazole 118 mg, 0.601 mmol, commercial product
  • 4-pyridylboronic acid 110 mg, 0.898 mmol, commercial product
  • tris (dibenzylideneacetone) dipalladium Pd 2 dba 3 ) ( 27.5 mg, 30.0 ⁇ mol, commercial product)
  • 2-dicyclohexylphosphino-2 ', 4', 6'-triisopropylbiphenyl (Xphos) 57.6 mg, 0.118 mmol, commercial product
  • tripotassium phosphate n-hydrated
  • the product 255 mg, ⁇ 1.20 mmol, commercial product) in 1-butanol (2.4 ml, commercial product) was heated and stirred at 100 ° C.
  • 5-bromoquinoline (84.2 mg, 405 ⁇ mol, commercial product), 4-pyridylboronic acid (73.8 mg, 600 ⁇ mol, commercial product), tetrakis (triphenylphosphine) palladium (Pd (PPh 3 ) 4 ) (23.1 mg, 20.0 ⁇ mol, commercial product), sodium carbonate monohydrate (99.2 mg, 800 ⁇ mol, commercial product) in toluene (1.3 mL, commercial product), ethanol (1.3 mL, commercial product), purified water ( 1.3 mL) of the mixed solution was heated and stirred at 90 ° C. for 25 hours.
  • Compound 3 and TG003 were each dissolved in 5% DMSO, 5% saltol, 9% Tween-80, 81% physiological saline, and then subcutaneously in Jcl: TTC mice (7 weeks old, male male, provided by Charles River Laboratories). 30 mg / kg was injected. After compound injection, whole blood was collected under anesthesia with isoflurane (manufactured by Mylan) at 30 minutes, 90 minutes, 180 minutes, and 360 minutes, and serum was separated by centrifugation. The concentrations of Compound 3 and TG003 in serum were measured by LC / MS using ZORBAX HILIC Plus (compound 3) or ZORBAX Eclipse C18 (TG003) column (manufactured by Agilent Technologies).
  • Compound 3 was present in blood at 10 ⁇ M after 6 hours of single subcutaneous administration (30 mg / kg) to mice, and showed much higher blood stability than TG003.
  • Compound 3 and TG003 were serially diluted to 30 ⁇ M, 10 ⁇ M, 3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 0.03 ⁇ M, 0.01 ⁇ M, 0.003 ⁇ M, 0.001 ⁇ M, respectively, and 10 mM MOPS-KOH (pH 6.5), 10 mM magnesium chloride, 200 ⁇ M EDTA, 1 ⁇ M ATP, 0.167 ⁇ Ci of [ ⁇ - 32 P] ATP, 0.417 ⁇ g RS peptide (NH2-RSPSYGRSRSRSRSRSRSRSRSRSRSNSRSRSY-OH, SEQ ID NO: 1), recombinant GST tag human CLK1 (Carnabio) 25 ⁇ l of the reaction solution was prepared.
  • HeLa cells are seeded at 1x10 5 cells per well in a 12-well plate and cultured for 48 hours. Each compound 3 and TG003 diluted in DMSO solution is 5 ⁇ M, 10 ⁇ M, 20 ⁇ M, and the DMSO concentration is 0.1%. Added by concentration.
  • the protein concentration of the supernatant collected by centrifugation at 15,000 xg for 30 minutes was quantified with a protein assay reagent (Protein Assay Reagent, manufactured by Thermo). Adjust the extract so that the protein concentration is equal, add sample buffer (manufactured by Nacalai Tesque), incubate at 95 ° C for 5 minutes, and then SDS-PAE gel (10% SuperSep TM Ace gel, Wako) SDS-PAGE was performed using In Western blotting, after sample migration was completed, transfer to a PVDF membrane (manufactured by Pall) was performed with a blotting apparatus at 100 V for 3 hours.
  • a protein assay reagent Protein Assay Reagent, manufactured by Thermo
  • exon skip by compound 3 was evaluated by semi-quantitative RT-PCR.
  • the specific protocol is as follows. The result is shown in FIG. The same concentration TG003 was used as a control in the evaluation.
  • H492-dys Ex31m splicing reporter (Fig. 3) is transfected using transfection reagent (Lipofectamin 2000, manufactured by Invitrogen). did.
  • transfection reagent Lipofectamin 2000, manufactured by Invitrogen.
  • Compound 3 TG003 diluted in DMSO solution was added at 5 ⁇ M, 10 ⁇ M, 20 ⁇ M, 30 ⁇ M, 50 ⁇ M, and the DMSO concentration at 0.1%, respectively.
  • RNA extraction reagent (Sepazole RNA I Super G, manufactured by Nacalai Tesque) was added to the wells, and the cells were collected. After recovering RNA according to the attached protocol, incubate with DNase (Promega) at 37 ° C for 30 minutes, add the attached reaction stop solution and incubate at 65 ° C for 10 minutes to inactivate DNase I let you. DNase-treated RNA was prepared from 50 pmol of random hexamer (Takara Bio) using Superscript II (Takara Bio) according to the attached protocol, 10 minutes at 30 ° C, 42 First-strand cDNA was obtained by incubation at 50 ° C. for 50 minutes and at 70 ° C.
  • DNase-treated RNA was prepared from 50 pmol of random hexamer (Takara Bio) using Superscript II (Takara Bio) according to the attached protocol, 10 minutes at 30 ° C, 42 First-strand cDNA was obtained by incubation at 50 ° C.
  • the gel was stained with ethidium bromide and the product was detected with ultraviolet light using a ChemiDoc TM MP imaging system.
  • the amplified PCR product was quantified using Image Lab software (Bio-Rad).
  • the reporter exon 31 exon skipping ratio was derived as the ratio of skipping products to the total of transcripts exon 31 skipped and transcripts containing exon 31.
  • the primers used for each amplification are as follows: Human CLK1 forward, 5'-ATG AGA CAC TCA AAG AGA ACT TAC TG-3 '(SEQ ID NO: 2); human CLK1 reverse, 5'-CTT TAT GAT CGA TGC ACT CCA C-3' (SEQ ID NO: 3); GAPDH Forward, 5'-CCA TCA CCA TCT TCC AGG AGC GAG-3 '(SEQ ID NO: 4); GAPDH Reverse, 5'-GTG ATG GCA TGG ACT GTG GTC ATG-3' (SEQ ID NO: 5); Splicing Reporter Forward, 5 '-ATT ACT CGC TCA GAA GCT GTG TTG C-3' (SEQ ID NO: 6); Splicing Reporter Reverse, 5'-AAG TCT CTC ACT TAG CAA CTG GCA G-3 '(SEQ ID NO: 7).
  • Compound 3 exhibited phosphorylation inhibitory effect on ClSF substrates SRSF4 and SRSF6. In addition, as shown in FIG. 5, Compound 3 exhibited an exon skip activity equivalent to TG003.
  • RNA extraction reagent Trizol, manufactured by Thermo
  • RNA was added to the wells, and the cells were collected. RNA was collected using an RNA extraction kit (Direct-zol RNA purification kit, manufactured by Gimo Research) according to the attached protocol.
  • the reaction solution was mixed with a loading buffer (Takara Bio) and electrophoresed on a 2.5% agarose gel in 1 ⁇ TAE buffer (Nacalai Tesque). The gel was stained with ethidium bromide and the product was detected with ultraviolet light using a ChemiDoc TM MP imaging system. Quantification was performed on the amplified RCR product using an Agilent 2100 Bioanalyzer System (manufactured by Agilent Technologies) using a DNA 1000 laboratory chip kit (manufactured by Agilent Technologies).
  • exon 31 exon skipping ratio was derived as the ratio of the skipping product to the total of the transcripts exon 31 skipped and the transcript containing exon 31.
  • Primers used for amplification are as follows: Dystrophin Forward, 5'-CCT GTA GCA CAA GAG GCC TTA-3 '(SEQ ID NO: 8); Dystrophin Reverse, 5'-TCC ACA CTC TTT GTT TCC AAT G-3' (SEQ ID NO: 9)
  • Compound 3 was dissolved in 0.5% carboxymethylcellulose physiological saline and then injected subcutaneously at 30 mg / kg in Jcl: TCR mice (7-week-old, ⁇ , Charles River Laboratories). After the compound injection, the mice were dislocated from the cervical vertebra after 30 minutes, 90 minutes, 180 minutes, and 360 minutes, respectively, and then the anterior tibial muscle was collected.
  • Compound 3 could be detected by LC / MS in muscle tissue at 30 mg / kg orally administered with Compound 3, and a peak value of 4.5 ⁇ M was obtained at 1.5 hours.
  • Compound 3 was dissolved in 0.5% carboxymethylcellulose physiological saline and injected subcutaneously at 30 mg / kg into Jcl: TCR mice (7 weeks old, male, provided by Charles River Laboratories). After 90 minutes from the compound injection, the mice were dislocated from the cervical spine, and then the anterior tibial muscle was collected. 200 ⁇ l CelLytic MT (Sigma Aldrich) supplemented with protease inhibitor (Nacalai Tesque) and phosphatase inhibitor (Nacalai Tesque) was added to the collected anterior tibial muscle, and a bead crusher (Bead crusher ⁇ T-12 And lysate was recovered.
  • CelLytic MT Sigma Aldrich
  • protease inhibitor Nacalai Tesque
  • phosphatase inhibitor Nacalai Tesque
  • the protein concentration of the collected supernatant was quantified with a protein assay reagent (Protein Assay Reagent, manufactured by Thermo). Adjust the extract so that the protein concentration is equal, add sample buffer (manufactured by Nacalai Tesque), incubate at 95 ° C for 5 minutes, and then SDS-PAE gel (10% SuperSep TM Ace gel, Wako) SDS-PAGE was performed using In Western blotting, after sample migration was completed, transfer to a PVDF membrane (manufactured by Pall) at 100 V for 3 hours was performed using a blotting apparatus.
  • a protein assay reagent Protein Assay Reagent, manufactured by Thermo
  • the detection was performed using Immunostar LD (manufactured by Wako Co., Ltd.) as a chromogenic substrate, using a ChemiDoc TM MP imaging system with a membrane sandwiched between OHP films. After completion of transcription, blocking is performed with Blocking One (Nacalai Tesque) for 30 minutes at room temperature, and anti-dystrophin antibody (Abcam) and anti- ⁇ tubulin antibody (Invitrogen, clone DM1A) are each used as primary antibodies. Dilution was performed 200 times and 2,000 times with Signal (Toyobo Co., Ltd.).
  • Detection was performed after anti-rabbit IgG-HRP labeled antibody (GE Healthcare) was diluted 20,000 times and anti-mouse IgG-HRP labeled antibody (Jackson ImmunoResearch) was diluted 5,000 times as secondary antibodies.
  • the detection was performed using Immunostar LD (manufactured by Wako Co., Ltd.) as a chromogenic substrate, using a ChemiDoc TM MP imaging system with a membrane sandwiched between OHP films. SRSF4 bands were quantified using Image Lab software (Bio-Rad).
  • RNA extraction kit (RNeasy purification kit, Qiagen). First, 300 ⁇ l of the RLT buffer attached to the kit was added and crushed with a bead crusher (bead crusher ⁇ T-12, manufactured by Taitec Co., Ltd.), and the lysate was recovered.
  • the gel was stained with ethidium bromide and the product was detected with ultraviolet light using a ChemiDoc TM MP imaging system.
  • the amplified PCR product was quantified using Image Lab software (Bio-Rad).
  • the primers used for each amplification are as follows: Mouse CLK1 forward, 5'-ATG AGA CAT TCA AAG AGA ACT TAC TG-3 '(SEQ ID NO: 10); Mouse Clk1 reverse, 5'-CAC TTT ATG ATC GAT GCA TTC C-3' (SEQ ID NO: 11); GAPDH Forward, 5'-CCA TCA CCA TCT TCC AGG AGC GAG-3 '(SEQ ID NO: 4); GAPDH reverse, 5'-GTG ATG GCA TGG ACT GTG GTC ATG-3' (SEQ ID NO: 5)
  • Compound 3 exhibited an inhibitory effect on phosphorylation of SRSF4, which is a substrate of Clk, in muscle tissue after oral administration. As shown in FIG. 10, Compound 3 was confirmed to increase Clcl mature splicing product, which is known to be induced by Clk activity inhibition, in muscle tissue after oral administration of mice.
  • Experimental Example 8 Evaluation of exon skip activity
  • the effects of compounds 1-4, 6, 8, 10, 12, 14, and 15 on exon skip were evaluated by semi-quantitative RT-PCR.
  • the specific protocol is as follows. The results are shown in Table 1 below and FIG.
  • H492-dys Ex31m splicing reporter (Fig. 3) is transfected using transfection reagent (Lipofectamin 2000, manufactured by Invitrogen). did. After culturing for 24 hours, each compound diluted in DMSO solution was added at a concentration of 10 ⁇ M and a DMSO concentration of 0.1%. 24 hours after administration, 800 ⁇ l of RNA extraction reagent (Sepazole RNA I Super G, manufactured by Nacalai Tesque) was added to the wells, and the cells were collected.
  • transfection reagent Lipofectamin 2000, manufactured by Invitrogen
  • RNA was prepared from 50 pmol of random hexamer (Takara Bio) using Superscript II (Takara Bio) according to the attached protocol, 10 minutes at 30 ° C, 42 First-strand cDNA was obtained by incubation at 50 ° C. for 50 minutes and at 70 ° C. for 15 minutes to carry out reverse transcription.
  • PCR thermal cycler BioRad PCR was performed by repeating 32 cycles of a denaturation step at 95 ° C for 20 seconds, an annealing step at 58 ° C for 20 seconds, and an extension step at 72 ° C for 1 minute.
  • the reaction solution was mixed with a loading buffer (Takara Bio) and electrophoresed on a 2.5% agarose gel in 1 ⁇ TAE buffer (Nacalai Tesque).
  • the gel was stained with ethidium bromide and the product was detected with ultraviolet light using a ChemiDoc TM MP imaging system.
  • the amplified PCR product was quantified using Image Lab software (Bio-Rad).
  • the reporter exon 31 exon skipping ratio was derived as the ratio of skipping products to the total of transcripts exon 31 skipped and transcripts containing exon 31.
  • Primers used for amplification are as follows: Splicing Reporter Forward, 5'-ATT ACT CGC TCA GAA GCT GTG TTG C-3 '(SEQ ID NO: 6); Splicing Reporter Reverse, 5'-AAG TCT CTC ACT TAG CAA CTG GCA G-3' (SEQ ID NO: 7).
  • each of the compounds used exhibited an effect of improving the exon skip rate.
  • Immortalized muscular dystrophy patient-derived cells (ref. Nishida, A. et al. Brain Dev. 38, 738-745 (2016)) were cultured in a 12-well plate for 24 hours, and then compound 3, TG003 diluted in DMSO solution and 20 ⁇ M and DMSO were added at respective concentrations so that the concentration was 0.1%. 48 hours after administration, 800 ⁇ l of RNA extraction reagent (Trizol, manufactured by Sakai Thermo) was added to the wells, and the cells were collected. RNA was collected using an RNA extraction kit (Direct-zol RNA purification kit, manufactured by Zimo Research) according to the attached protocol.
  • Trizol manufactured by Sakai Thermo
  • the reaction solution was mixed with a loading buffer (Takara Bio) and electrophoresed on a 2.5% agarose gel in 1 ⁇ TAE buffer (Nacalai Tesque). The gel was stained with ethidium bromide and the product was detected with ultraviolet light using a ChemiDoc TM MP imaging system.
  • Primers used for amplification are as follows:
  • Exon 1-8 forward 5'- ATGCTTTGGTGGGAAGAAGTAG -3 '(SEQ ID NO: 12); Exon 1-8 reverse, 5'-CTGTTGAGAATAGTGCATTTGAT-3 '(SEQ ID NO: 13); Exon 7-11 forward, 5'-GTGGTTTGCCAGCAGTCAGCCACA-3 '(SEQ ID NO: 14); Exon 7-11 reverse, 5'-TCCTGTTCCAATCAGCTTACTTC -3 '(SEQ ID NO: 15); Exon 10-14 forward, 5'- TTGCAAGCACAAGGAGAGATT-3 '(SEQ ID NO: 16); Exon 10-14 reverse, 5'-ACGTTGCCATTTGAGAAGGAT-3 '(SEQ ID NO: 17); Exon 13-18 forward, 5'-GCTGCTTTGGAAGAACAACTT -3 '(SEQ ID NO: 18); Exon 13-18 reverse, 5'- CTTCTGAGCGAGTAATCCAGCT -3 '(SEQ ID NO: 19); Exon 17-21
  • Compound 3 induces skipping of patient variant exon 31 (fragment of exons: 27-32) but does not affect skipping of other exons.
  • Sequence number 1 RS peptide Sequence number 2: Human CLK1 forward Sequence number 3: Human CLK1 reverse Sequence number 4: GAPDH forward Sequence number 5: GAPDH reverse Sequence number 6: Splicing reporter forward Sequence number 7: Splicing reporter reverse Sequence number 8: Dystrophin Forward SEQ ID NO: 9: Dystrophin Reverse SEQ ID NO: 10: Mouse CLK1 Forward SEQ ID NO: 11: Mouse CLK1 Reverse SEQ ID NO: 12: Exon 1-8 Forward SEQ ID NO: 13: Exon 1-8 Reverse SEQ ID NO: 14: Exon 7-11 Forward Sequence SEQ ID NO: 16: Exon 10-14 Reverse SEQ ID NO: 17: Exon 10-14 Reverse SEQ ID NO: 18: Exon 13-18 Forward SEQ ID NO: 19: Exon 13-18 Reverse SEQ ID NO: 20: Exon 17 -21 Forward SEQ ID NO: 21: Exon 17-21 River SEQ ID NO: 22: exon 21-25 forward SEQ ID NO: 23: exon 21-25 reverse

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Abstract

スプライシングの改変に関する化合物及び医薬組成物、それらの使用、又は、それらを用いた遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制及び／又は治療方法の提供。 一又は複数の実施形態において、下記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩を有効成分とし、前記化合物はタンパク質リン酸化酵素のリン酸化活性に対する阻害能を有する、スプライシングを改変するための医薬組成物。Ｘ２：－（結合手）又は－ＮＨ－

Description

スプライシングの改変に関する化合物及び医薬組成物
　本開示は、スプライシングの改変に関する化合物及び医薬組成物、それらの使用、それらを用いた遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制及び／又は治療方法に関する。
　Duchenne型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、その原因であるジストロフィン遺伝子が７９ものエキソンからなり、省略可能な繰り返し構造を有するため、エキソンスキップ誘導療法が可能となる。すなわち、遺伝子変異によるフレームシフトや停止コドンの出現がジストロフィン蛋白質の異常をきたすが、変異エキソンをフレームが合うように人為的にスキップさせることで、スキップされたエキソンを欠くものの機能性の全長ジストロフィン蛋白質を誘導でき、症状の緩和が可能と考えられている。
　低分子化合物が、ある変異を有するジストロフィン遺伝子のエキソンスキップ促進に有効であり、該低分子化合物によるエキソンスキップによってDMDを治療できる可能性があることが報告されている（非特許文献１）。
Nishida A, Kataoka N, Takeshima Y, et al.: Chemical treatment enhances skipping of a mutated exon in the dystrophin gene. Nature Commun. 2:308, doi: 10.1038/ncomms1306, 2011.
　本開示は、一態様において、スプライシングを改変できる化合物及び医薬組成物、それらの使用、それらを用いた遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制及び／又は治療方法を提供する。
　本開示は、一態様において、下記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩を有効成分とし、前記化合物はタンパク質リン酸化酵素のリン酸化活性に対する阻害能を有する、スプライシングを改変するための医薬組成物に関する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 ［ここで、上記一般式（Ｉ）において、
　Ｘ1は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 であって、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基であり、
　Ｘ2は、－（結合手）又は－ＮＨ－であり、
　Ｒ1は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 であって、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基であり、
　Ｒ2は、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基である。］
　本開示は、その他の態様において、遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、本開示に係る医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
　本開示は、その他の態様において、遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物を製造するための上記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩の使用に関する。
　本開示は、その他の態様において、スプライシングを改変するための上記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩の使用に関する。また、本開示は、その他の態様において、上記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩に関する。
図１は、化合物３及びＴＧ００３をマウスへ単回皮下投与した場合における血中濃度を測定した結果の一例である。 図２は、化合物３のin vitroキナーゼ解析によりClk阻害活性を確認した結果の一例である。 図３は、エキソンスキップを検出できるレポータープラスミドの概略図である。 図４は、DMD患者レポーターを導入したHeLa細胞におけるSRタンパク質のリン酸化に対する化合物３の阻害効果を検出した結果の一例である。 図５は、HeLa細胞に導入したDMD患者レポーターを用いて化合物３のエキソンスキップ活性を検出した結果の一例である。 図６は、化合物３の添加により患者由来筋肉細胞においてエキソンスキップの頻度が高くなることを確認した結果の一例である。 図７は、化合物３の添加により患者由来筋肉細胞においてジストロフィンタンパク質の発現量が高くなることを確認した結果の一例である。 図８は、化合物３をマウス経口投与後に、筋肉組織で化合物３の取り込みを確認した結果の一例である。 図９は、化合物３をマウス経口投与後の筋肉組織でSRタンパク質のリン酸化に対する阻害効果を確認した結果の一例である。 図１０は、化合物３をマウス経口投与後の筋肉組織でスプライシングが変化することを確認した結果の一例である。 図１１は、HeLa細胞に導入したDMD患者レポーターを用いて化合物のエキソンスキップ活性を検出した結果の一例である。 図１２は、化合物３の添加により患者由来筋肉細胞において特定のエキソンスキップの頻度が高くなることを確認した結果の一例である。
　本開示は、一態様において、下記一般式（Ｉ）で表される化合物がスプライシングを改変する効果を示しうるという知見に基づく。本開示はまた、一態様において、スプライシングを改変することにより、遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療が可能になるという知見に基づく。
　本開示は、一態様において、下記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩に関する。本開示において、下記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩を、「本開示に係る化合物」とも呼ぶ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 ［ここで、上記一般式（Ｉ）において、
　Ｘ1は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 であって、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基であり、
　Ｘ2は、－（結合手）又は－ＮＨ－であり、
　Ｒ1は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 であって、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基であり、
　Ｒ2は、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基である。］
　なお、本開示において波線を付した結合手は、式（Ｉ）との結合部分を示す。
　本開示に係る化合物は、一又は複数の実施形態において、タンパク質リン酸化酵素のリン酸化活性に対する阻害能を有する。本開示に係る化合物が阻害するタンパク質リン酸化酵素は、とくに制限されないが、Ｈａｓｐｉｎ、ＣＬＫ１、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ２、ＤＹＲＫ１Ｂ、ＨＧＫ、ＤＹＲＫ３、ＣＤＫ９／ＣｙｃＴ１、ＭＩＮＫ２などのキナーゼが挙げられる。
　本開示に係る化合物は、タンパク質リン酸化酵素のリン酸化活性に対する阻害能を有することで、スプライシングの改変を誘導するものと推測されるが、本開示はこのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
　本開示において「スプライシングの改変」とは、pre-mRNAスプライシングの態様が変化することをいう。スプライシングの改変は、一又は複数の実施形態において、エキソンのスキップ若しくはその抑制、イントロンの挿入若しくはその抑制、選択的スプライシングの亢進若しくはその抑制を含みうる。スプライシングの改変は、in vivo、ex vivo、又はin vitroで行われうる。
　本開示において「エキソンスキップ」とは、複数のエキソン及び複数のイントロンから構成される遺伝子が転写されたmRNA前駆体からイントロンが取り除かれて成熟mRNAとなる際に、１又は複数のエキソンが取り除かれることをいう。
　本開示において「遺伝子疾患」とは、遺伝子の異常が原因である疾患をいう。スプライシングの改変が起きると、遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療が可能になることがある。
　したがって、本開示は、一態様において、本開示に係る化合物を有効成分とする医薬組成物に関する。本開示において、本開示に係る化合物を有効成分とする医薬組成物を「本開示に係る医薬組成物」とも呼ぶ。
　本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、スプライシングを改変するための医薬組成物であり、さらなる一又は複数の実施形態において、エキソンスキップを誘導するための医薬組成物である。また、本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、タンパク質リン酸化酵素のリン酸化活性に対する阻害能を有することでスプライシングを改変するための医薬組成物であり、さらなる一又は複数の実施形態において、タンパク質リン酸化酵素のリン酸化活性に対する阻害能を有することでエキソンスキップを誘導するための医薬組成物である。
　スプライシングが改変されることで改善、進行抑制又は治療が可能な遺伝子疾患の限定されない一又は複数の実施形態として、筋ジストロフィーが挙げられる。上述したように、Duchenne型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、ジストロフィン遺伝子のフレームシフトや停止コドンなどの遺伝子変異により機能性のジストロフィンタンパク質が発現しなくなることが原因であると考えられている。一方、ジストロフィン遺伝子は、７９ものエキソンからなり、省略可能な繰り返し構造を有する。該遺伝子変異を含む変異エキソンをフレームが合うように人為的にスキップさせることで、スキップされたエキソンを欠くものの機能性の全長ジストロフィン蛋白質を誘導でき、症状の緩和が可能と考えられている。
　したがって、本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物である。前記遺伝子疾患は、一又は複数の実施形態において、スプライシングが改変することで、疾患の原因となる変異が解消又は抑制されうる遺伝子疾患であり、その他の一又は複数の実施形態において、エキソンスキップが起きることで、疾患の原因となる変異が解消又は抑制されうる遺伝子疾患をいう。前記遺伝子疾患の一例が筋ジストロフィーであるが、これに限定されなくてもよい。なお、本開示において「筋ジストロフィー」とは、一又は複数の実施形態において、進行性筋ジストロフィーを含み、その他の一又は複数の実施形態において、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）を含む。
　前記一般式（Ｉ）において、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は、一又は複数の実施形態において、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基である。
　本開示において、Ｃ1-4アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、sec－ブチル基、tert－ブチル基が挙げられる。本開示において、ハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
　本開示の一又は複数の実施形態において、前記一般式（Ｉ）で表される化合物は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 であって、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は上述と同様である。
　本開示の一又は複数の実施形態において、前記一般式（Ｉ）で表される化合物は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 であって、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ6及びＲ7は上述と同様である。
　本開示の一又は複数の実施形態において、前記一般式（Ｉ）で表される化合物は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 であって、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は上述と同様である。
　本開示の一又は複数の実施形態において、前記一般式（Ｉ）で表される化合物は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 であって、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8及びＲ9は上述と同様である。
　本開示における「製薬上許容される塩」とは、薬理上及び／又は医薬上許容される塩を含有し、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性又は塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。
　前記無機酸塩の好ましい例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが挙げられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、p－トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。
　前記無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。前記有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩などが挙げられる。
　前記酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられる。前記塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩などが挙げられる。
　本開示において「化合物の塩」には、化合物が大気中に放置されることにより、水分を吸収して形成されうる水和物が包含され得る。また、本開示において「化合物の塩」には、化合物が他のある種の溶媒を吸収して形成されうる溶媒和物も包含され得る。
　本開示において「プロドラッグ」は、一又は複数の実施形態において、生体内で容易に加水分解され、前記一般式（Ｉ）で表される化合物を再生するものが挙げられ、例えばカルボキシル基を有する化合物であればそのカルボキシル基がアルコキシカルボニル基となった化合物、アルキルチオカルボニル基となった化合物、又はアルキルアミノカルボニル基となった化合物が挙げられる。また、例えばアミノ基を有する化合物であれば、そのアミノ基がアルカノイル基で置換されアルカノイルアミノ基となった化合物、アルコキシカルボニル基により置換されアルコキシカルボニルアミノ基となった化合物、アシロキシメチルアミノ基となった化合物、又はヒドロキシルアミンとなった化合物が挙げられる。また例えば水酸基を有する化合物であれば、その水酸基が前記アシル基により置換されてアシロキシ基となった化合物、リン酸エステルとなった化合物、又はアシロキシメチルオキシ基となった化合物が挙げられる。これらのプロドラッグ化に用いる基のアルキル部分としては後述するアルキル基が挙げられ、そのアルキル基は置換（例えば炭素原子数１－６のアルコキシ基等により）されていてもよい。一又は複数の実施形態において、例えばカルボキシル基がアルコキシカルボニル基となった化合物を例にとれば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニルなどの低級（例えば炭素数１－６）アルコキシカルボニル、メトキシメトキシカルボニル、エトキシメトキシカルボニル、２－メトキシエトキシカルボニル、２－メトキシエトキシメトキシカルボニル、ピバロイロキシメトキシカルボニルなどのアルコキシ基により置換された低級（例えば炭素数１－６）アルコキシカルボニルが挙げられる。
　本開示において「医薬組成物」は、一又は複数の実施形態において、周知の製剤技術を適用し、投与形態に適した剤形とすることができる。その投与形態としては、これらに限定されないが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、シロップ剤、液剤等の剤形による経口投与が挙げられる。或いは、注射剤、液剤、エアゾール剤、座剤、貼布剤、パップ剤、ローション剤、リニメント剤、軟膏剤、点眼剤等の剤形による非経口投与を挙げることができる。これらの製剤は、これらに限定されないが、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造されうる。
　前記賦形剤としては、これらに限定されないがデンプン、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン等のデンプン、乳糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。前記コーティング剤としては、これらに限定されないが、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバロウ、パラフィン等を挙げることができる。前記結合剤としては、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドン、マクロゴール及び前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。前記崩壊剤としては、これらに限定されないが、前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。前記安定化剤としては、これらに限定されないが、メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェエノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及びソルビン酸を挙げることができる。前記矯味矯臭剤としては、これらに限定されないが、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。
　また、液剤の製造には、溶媒として、これらに限定されないが、エタノール、フェノール、クロロクレゾール、精製水、蒸留水等を使用することができ、必要に応じて界面活性剤又は乳化剤等も使用できる。前記界面活性剤又は乳化剤としては、これらに限定されないが、ポリソルベート８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、ラウロマクロゴール等を挙げることができる。
　本開示に係る医薬組成物の使用方法は、症状、年齢、投与方法等により異なりうる。使用方法は、これらに限定されないが、有効成分である前記一般式（Ｉ）で表される化合物の体内濃度が１００ｎＭ－１ｍＭの間のいずれかになるように、間欠的若しくは持続的に、経口、経皮、粘膜下、皮下、筋肉内、血管内、脳内、又は腹腔内に投与することができる。限定されない実施形態として、経口投与の場合、対象（ヒトであれば成人）に対して１日あたり、前記一般式（Ｉ）で表される化合物に換算して、下限として０．０１ｍｇ（好ましくは０．１ｍｇ）、上限として、２０００ｍｇ（好ましくは５００ｍｇ、より好ましくは１００ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが挙げられる。限定されない実施形態として、静脈内投与の場合には、対象（ヒトであれば成人）に対して１日当たり、下限として０．００１ｍｇ（好ましくは０．０１ｍｇ）、上限として、５００ｍｇ（好ましくは５０ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが挙げられる。
　本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、遺伝子疾患の原因となる遺伝子が発現している又は発現していない細胞又は組織においてスプライシングの改変を誘導することが好ましい。例えば、筋ジストロフィーであれば、筋肉組織の細胞、又は、筋細胞でエキソンスキップを誘導することが好ましい。スプライシングの改変を誘導する対象の個体としては、ヒト及び／又はヒト以外の動物が挙げられる。本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のためのものである。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、本開示に係る医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。本開示に係る医薬組成物の投与は、一又は複数の実施形態において、前述の医薬組成物の使用方法に準じることができる。対象としては、ヒト、ヒト以外の動物が挙げられる。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための前記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩の使用に関する。
　本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物を製造するための前記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩の使用に関する。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、スプライシングの改変の誘導方法であって、本開示に係る医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。本開示に係る医薬組成物の投与は、一又は複数の実施形態において、前述の医薬組成物の使用方法に準じることができる。対象としては、細胞、組織、器官、個体、ヒト、ヒト以外の動物が挙げられる。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、スプライシングの改変の誘導のための前記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩の使用に関する。
　本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、スプライシングの改変の誘導のための医薬組成物を製造するための前記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩の使用に関する。
　すなわち、本開示は以下の一又は複数の実施形態に関しうる；
[1]  下記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 ［ここで、上記一般式（Ｉ）において、
　Ｘ1は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 であって、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基であり、
　Ｘ2は、－（結合手）又は－ＮＨ－であり、
　Ｒ1は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 であって、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基であり、
　Ｒ2は、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基である。］
[2]  タンパク質リン酸化酵素のリン酸化活性に対する阻害能を有する、[1]に記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩。
[3]  前記一般式（Ｉ）において、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基である、[1]又は[2]に記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩。
[4]  前記一般式（Ｉ）で表される化合物が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 である、[1]から[3]のいずれかに記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩。
[5]  前記一般式（Ｉ）で表される化合物が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 である、[1]から[3]のいずれかに記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩。
[6]  前記一般式（Ｉ）で表される化合物が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 である、[1]から[3]のいずれかに記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩。
[7]  前記一般式（Ｉ）で表される化合物が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 である、[1]から[3]のいずれかに記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩。
[8]  [1]から[7]のいずれかに記載の化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩を有効成分とする、医薬組成物。
[9]  スプライシングを改変するための、[8]記載の医薬組成物。
[10]　エキソンスキップを誘導するための、[8]又は[9]に記載の医薬組成物。
[11]　タンパク質リン酸化酵素のリン酸化活性に対する阻害能を有することでスプライシングを改変するための、[8]から[10]のいずれかに記載の医薬組成物。
[12]　タンパク質リン酸化酵素のリン酸化活性に対する阻害能を有することでエキソンスキップを誘導するための、[8]から[11]のいずれかに記載の医薬組成物。
[13]　遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための、[8]から[12]のいずれかに記載の医薬組成物。
[14]　前記遺伝子疾患が、スプライシングが改変することで、疾患の原因となる変異が解消又は抑制されうる遺伝子疾患である、[8]から[13]のいずれかに記載の医薬組成物。
[15]　前記遺伝子疾患が、筋ジストロフィーである、[8]から[14]のいずれかに記載の医薬組成物。
[16]　遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、[8]から[15]のいずれかに記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
[17]　前記対象が、ヒト、又はヒト以外の動物である、[16]に記載の方法。
[18]　前記遺伝子疾患が、スプライシングが改変することで、疾患の原因となる変異が解消又は抑制されうる遺伝子疾患である、[16]又は[17]に記載の方法。
[19]　前記遺伝子疾患が、筋ジストロフィーである、[16]から[18]のいずれかに記載の方法。
[20]　遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための前記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩の使用。
[21]　遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物を製造するための前記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩の使用。
[22]　前記遺伝子疾患が、スプライシングが改変することで、疾患の原因となる変異が解消又は抑制されうる遺伝子疾患である、[20]又は[21]に記載の使用。
[23]　前記遺伝子疾患が、筋ジストロフィーである、[20]から[22]のいずれかに記載の使用。
[24]　スプライシングの改変の誘導方法であって、[8]から[15]のいずれかに記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
[25]　前記対象が、細胞、組織、器官、個体、ヒト、又はヒト以外の動物である、[24]に記載の方法。
[26]　前記スプライシングの改変が、エキソンスキップである、[24]又は[25]に記載の方法。
[27]　スプライシングの改変の誘導のための前記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩の使用。
[28]　スプライシングの改変の誘導のための医薬組成物を製造するための前記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩の使用。
[29]　前記スプライシングの改変が、エキソンスキップである、[27]又は[28]に記載の方法。
　以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本開示中に引用された文献は、すべて本開示の一部として組み入れられる。
　本実施例に用いる下記化合物１－１５を準備した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　上記化合物１－６のうち、化合物１、２及び３の合成方法を代表して以下に示す。
　化合物１の合成方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　アルゴン雰囲気下、5-ブロモインダゾール（197 mg, 1.00 mmol, 商用品）、5-キノリンボロン酸（259 mg, 1.50 mmol, 商用品）、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム（Pd2dba3）（9.20 mg, 10.0 μmol, 商用品）、2-ジシクロヘキシルホスフィノ－2',4',6'-トリイソプロピルビフェニル（Xphos）（19.1 mg, 40.1 μmol, 商用品）、リン酸三カリウム・n水和物（425 mg, 2.00 mmol, 商用品）の1-ブタノール（10 mL, 商用品）溶液を18時間、100 ℃で加熱撹拌した。室温まで放冷後、水（5 mL）を加え、酢酸エチル（5 mL × 3）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、濾過後、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧カラムクロマトグラフィー（Yamazen, AI-580 and Parallel Frac FR-360）（Yamazen Universal Columns Premium cartridge [silica] 40 g, クロロホルム/メタノール = 20/1）により精製した後、得られた固体をジクロロメタンで洗浄することにより、5-(5-キノリル)インダゾール（化合物１）（202 mg, 824 μmol, 82.4%）を肌色の固体として得た。
TLC Rf = 0.20 (ジクロロメタン/メタノール = 20/1); Mp 255 ℃ (decomp); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.51-7.56 (m, 2H), 7.67 (dd, J = 0.8, 6.8 Hz, 1H), 7.74 (d, J =8.4 Hz, 1H), 7.86-7.92 (m, 2H), 8.10 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.18 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 8.38 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.90 (dd, J = 1.6, 4.4 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 112.1, 123.4, 123.9, 125.5, 129.3, 129.4, 130.0, 131.1, 131.5, 134.0, 136.2, 137.5, 142.0, 143.4, 150.0, 151.9; IR (cm-1) 746, 772, 802, 887, 918, 937, 1061, 1101, 1238, 1290, 1337, 1395, 1510, 1574, 1738, 2849, 2901, 2928, 3030, 3094.
　化合物２の合成方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　アルゴン雰囲気下、5-ブロモインダゾール（197 mg, 1.00 mmol, 商用品）、5-イソキノリンボロン酸（259 mg, 1.50 mmol, 商用品）、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム（Pd2dba3）（9.20 mg, 10.0 μmol, 商用品）、2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',4',6' -トリイソプロピルビフェニル（Xphos）（19.1 mg, 40.1 μmol, 商用品）、リン酸三カリウム・n水和物（425 mg, 2.00 mmol, 商用品）の1-ブタノール（10 mL, 商用品）溶液を5.5時間、100 ℃で加熱撹拌した。室温まで放冷後、水（5 mL）を加え、酢酸エチル（5 mL × 3）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、濾過後、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧カラムクロマトグラフィー（Yamazen, AI-580 and Parallel Frac FR-360）（Yamazen Universal Columns Premium cartridge [silica] 40 g, クロロホルム/メタノール = 20/1）により精製し、5-(5-イソキノリル)インダゾール（化合物２）（182 mg, 742 μmol, 74.2%）を無色の固体として得た。
TLC Rf = 0.20 (ジクロロメタン/メタノール = 20/1); Mp 250 ℃ (decomp.); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.57 (dd, J = 1.6, 8.8 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.79-7.88 (m, 3H), 7.94 (dd, J = 0.8, 1.6 Hz, 1H), 8.17-8.20 (m, 2H), 8.44 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 9.35 (d, J = 0.8 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 112.2, 121.3, 123.8, 125.5, 129.3, 129.5, 131.0, 131.5, 133.7, 134.1, 136.2, 136.9, 141.8, 142.0, 144.0, 154.5; IR (cm-1) 650, 712, 754, 768, 779, 812, 835, 895, 943, 986, 1034, 1161, 1292, 1342, 1379, 1489, 1585, 1614, 2770, 2851, 2901, 3030, 3117.
　化合物３の合成方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　アルゴン雰囲気下、5-ブロモインダゾール（118 mg, 0.601 mmol，商用品）、4-ピリジルボロン酸（110 mg, 0.898 mmol，商用品）、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム（Pd2dba3）（27.5 mg, 30.0 μmol，商用品）、2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',4',6' -トリイソプロピルビフェニル（Xphos）（57.6 mg, 0.118 mmol，商用品）、リン酸三カリウム・n水和物（255 mg, <1.20 mmol，商用品）の1-ブタノール（2.4 ml, 商用品）溶液を24時間、100℃で加熱撹排した。室温まで放冷後、セライト濾過後、濾液を減圧濃縮した。得られたオレンジ色の残査を薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝ 10/1）により精製した後、5-(4-キノリル)インダゾール（化合物３）（24.4 mg, 0.125 mmol, 20.8%）を黄色の固体として得た。
TLC Rf = 0.26 （ジクロロメタン／メタノール＝ 20/1）； IR (cm-1) 792, 798, 802, 1030, 1349, 1420, 1490, 1603, 3361; 1H NMR( CDCl3, 500 MHz) δ 7.57 (AA' BB' ,2 H), 7.62 (d, J= 8.5 Hz, 1H) , 7.70 (dd, J= 1.3, 8.5 Hz, 1H) , 8.06 (d, J=1.3Hz, 1H), 8.18 (s,1H) , 8.68 (AA' BB' ,2 H) (The signal for NH of indazole was not observed); 13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ 110.5, 119.7, 121.4, 121.8, 123.9, 126.3, 131.5, 135.6, 140.2, 150.1; HRMS (ESI+) m/z 196.0867 ([M+H]+, C12H10N3 requires 196.0869).
　上記化合物７－９のうち、化合物８の合成方法を代表して以下に示す。
　化合物８の合成方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　アルゴン雰囲気下、5-アミノキノリン（144 mg, 999 μmol, 商用品）、3-ブロモピリジン（150 μL, 1.54 mmol, 商用品）、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム（Pd2dba3）（45.8 mg, 50.0 μmol, 商用品）、4,5-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9-ジメチルキサンテン（xantphos）（57.9 mg, 100 μmol, 商用品）、tert-ブトキシナトリウム（192 mg, 2.00 mmol, 商用品）の1,4-ジオキサン（10 mL, 商用品）溶液を14時間、110 ℃で加熱撹拌した。室温まで放冷後、水（5 mL）を加え、酢酸エチル（5 mL × 3）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、濾過後、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧カラムクロマトグラフィー（Yamazen, W-Prep 2XY A-type）（Biotage ZIP（商標）sphere cartridge [silica] 30 g, ジクロロメタン/メタノール = 20/1 → 5/1）により粗精製した後、得られた固体をヘキサン/ジクロロメタン = 30/1で洗浄することにより、5-(3-ピリジルアミノ)キノリン（化合物８）（120 mg, 542 μmol, 54.3%）を薄黄色の固体として得た。
TLC Rf = 0.30 (ジクロロメタン/メタノール = 20/1); Mp 180 ℃ (decomp.); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.08 (br s, 1H), 7.13-7.22 (m, 2H), 7.38-7.42 (m, 2H), 7.66 (dd, J = 8.8, 8.8 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.18 (dd, J = 1.6, 4.4 Hz, 1H), 8.33-8.37 (m, 2H), 8.95 (dd, J = 1.6, 4.4 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 117.5, 120.8, 123.1, 123.3, 123.8, 125.6, 129.6, 130.6, 137.7, 139.6, 141.2, 142.0, 149.3, 150.7; IR (cm-1) 652, 710, 762, 783, 814, 966, 1018, 1063, 1240, 1294, 1317, 1395, 1470, 1485, 1537, 1570, 3005, 3044, 3109, 3175.
　上記化合物１０－１３のうち、化合物１２の合成方法を代表して以下に示す。
　化合物１２の合成方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　アルゴン雰囲気下、5-ブロモキノリン（84.2 mg, 405 μmol, 商用品）、4-ピリジルボロン酸（73.8 mg, 600 μmol, 商用品）、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（Pd(PPh3)4）（23.1 mg, 20.0 μmol, 商用品）、炭酸ナトリウム・一水和物（99.2 mg, 800 μmol, 商用品）のトルエン（1.3 mL, 商用品）、エタノール（1.3 mL, 商用品）、精製水（1.3 mL）の混合溶液を25時間、90 ℃で加熱撹拌した。室温まで放冷後、水（2 mL）を加え、酢酸エチル（2 mL × 3）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、濾過後、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧カラムクロマトグラフィー（Yamazen, W-Prep 2XY A-type）（Biotage ZIP（商標）sphere cartridge [silica] 30 g, 酢酸エチル100% → ジクロロメタン/メタノール = 95/5）により精製し、5-(4-ピリジル)キノリン（化合物１２）（77.7 mg, 377 μmol, 93.0%）を黄色の固体として得た。
TLC Rf = 0.35 (ジクロロメタン/メタノール = 20/1); Mp 113 ℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.39-7.43 (m, 3H), 7.52 (dd, J = 1.2, 7.2 Hz, 1H), 7.80 (dd, J = 7.2, 8.8 Hz, 1H), 8.17-8.22 (m, 2H), 8.75-8.78 (AA'BB', 2H), 8.98 (dd, J = 1.6, 4.0 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 121.6, 124.9 (2C), 125.9, 127.3, 128.9, 130.3, 133.4, 137.5, 147.2, 148.5, 150.0 (2C), 150.7; IR (cm-1) 650, 696, 743, 750, 797, 839, 962, 989, 1111, 1229, 1304, 1391, 1418, 1495, 1543, 1570, 1589, 3026.
　上記化合物１４－１５のうち、化合物１４の合成方法を代表して以下に示す。
　化合物１４の合成方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　アルゴン雰囲気下、5-ブロモベンゾフラン（79.6 mg, 404 μmol, 商用品）、4-ピリジルボロン酸（73.8 mg, 600 μmol, 商用品）、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（Pd(PPh3)4）（23.1 mg, 20.0 μmol, 商用品）、炭酸ナトリウム・一水和物（99.2 mg, 800 μmol, 商用品）のトルエン（1.3 mL, 商用品）、エタノール（1.3 mL, 商用品）、精製水（1.3 mL）の混合溶液を8時間、90 ℃で加熱撹拌した。室温まで放冷後、水（2 mL）を加え、酢酸エチル（2 mL × 3）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、濾過後、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧カラムクロマトグラフィー（Yamazen, W-Prep 2XY A-type）（Biotage ZIP（商標）sphere cartridge [silica] 45 g, ジクロロメタン/メタノール = 10/1）により精製した後、ヘキサン/ジクロロメタンを用いて再結晶することにより、5-(4-ピリジル)ベンゾフラン（化合物１４）（56.8 mg, 289 μmol, 71.6%）を無色の固体として得た。
TLC Rf = 0.50 (ジクロロメタン/メタノール = 10/1); Mp 96 ℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.84 (dd, J = 0.8, 2.0 Hz, 1H), 7.52-7.54 (AA´BB´, 2H), 7.54-7.62 (m, 2H), 7.68 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.86 (dd, J = 0.4, 1.6 Hz, 1H), 8.64-8.66 (AA´BB´, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 106.8, 112.0, 119.9, 121.9 (2C), 123.6, 128.2, 133.3, 146.1, 148.8, 150.2 (2C), 155.4; IR (cm-1) 746, 775, 806, 874, 1018, 1109, 1219, 1265, 1414, 1460, 1537, 1595, 1728, 2853, 2924, 3036, 3094.
　実験例１：化合物３の血中薬物動態評価
　化合物３を0.5% carboxymethylcelluloseに30mg/kgで懸濁し、マウスに皮下注射した。化合物3の単回皮下投与時の血中濃度を、ZOBAX HILIC Plus (agilent)カラムにて検出した。対照化合物として、Cdc2-like kinase (CLK)阻害剤であるTG003（CAS 300801-52-9）を使用した。具体的なプロトコールは以下の通り。その結果を図１に示す。
　化合物３，TG003をそれぞれ5% DMSO, 5 % ソルトール, 9 % Tween-80, 81% 生理食塩水にて溶解後、Jcl: TCRマウス(7週齢, 雄, チャールズリバーラボラトリーズ社提供)の皮下に30 mg/kg注射した。化合物注射後、30分、90分、180分、360分、それぞれの時間経過後にイソフルレン(マイラン社製)麻酔下で全血を採取、遠心にて血清を分離した。血清中の化合物３, TG003濃度はそれぞれ、ZORBAX HILIC Plus (化合物３)又はZORBAX Eclipse Plus C18 (TG003) カラム(アジレントテクノロジー社製)を用いてLC/MSにて測定した。
　図１に示すとおり、化合物３は、マウスへの単回皮下投与(30mg/kg)の６時間後において10μMで血中に存在し、TG003より格段に高い血中安定性を示した。
　実験例２：化合物３のキナーゼ活性評価
　化合物３のin vitroキナーゼ解析によりClk阻害活性を確認した。RSペプチドを基質として、Clk1蛋白質存在下、ATP 1μMの条件下で化合物１の阻害活性を検討した。具体的なプロトコールは以下の通り。その結果を図２に示す。
　化合物３，TG003をそれぞれ30 μM, 10 μM, 3 μM, 1 μM, 0.3 μM, 0.1 μM, 0.03 μM, 0.01 μM, 0.003 μM, 0.001 μMに段階希釈し、10 mM MOPS-KOH (pH 6.5), 10 mM 塩化マグネシウム, 200 μM EDTA, 1 μM ATP, 0.167 μCi of [γ-32P] ATP, 0.417 μg RSペプチド (NH2-RSPSYGRSRSRSRSRSRSRSRSNSRSRSY-OH、配列番号１), 組み替え体GST tagヒトCLK1 (カルナバイオ社製)で25 μlの反応液を調整した。混合液を30℃で30分間反応させた後に、5%リン酸溶液を加え反応を停止させた。反応液中25μlをP81ホスホセルロース紙に滴下し乾燥後、5%リン酸溶液にて3回洗浄した。液体シンチレーションカウンターにてメンブレンのγ-32Pを測定した。測定値からバックグラウンドの値(CLK1を加えずに調整した反応液)を差し引き、得られた値から4パラメーターロジスティック回帰により反応曲線を描いた。そこから化合物のIC50を算出した。
　図２に示すとおり、CLK1に対するin vitroキナーゼ解析において、化合物３のIC50 (93.9 - 122.5nM) は、TG003 (13.13 - 20.29nM) には劣るものの、強いCLK阻害活性を示した。
　実験例３：化合物３のリン酸化阻害及びエキソンスキップ活性の評価
　図３に示すDMD患者(c.4303G>T)レポーター（H492-dys Ex31 プラスミド）（非特許文献1）をHeLa細胞に導入した。
　該HeLa細胞に化合物３を添加し、CLKの基質であるSR蛋白質に対するリン酸化の阻害をウエスタンブロットにて検証した。具体的なプロトコールは以下の通り。その結果を図４に示す。評価における対照として同濃度TG003を使用した。
　HeLa細胞を12ウェルプレートに1ウェルあたり1x105個播いて48時間培養後、DMSO溶液に希釈した化合物３, TG003を5 μM, 10 μM, 20 μM、DMSO濃度が0.1%となるようにそれぞれの濃度で加えた。投与1時間後に4℃のPBSで2回洗浄した後、プロテアーゼインヒビター(ナカライテスク社製)、ホスファターゼインヒビター(ナカライテスク社製)添加した200 μlのCelLytic M (シグマアルドリッチ社製)をウェルに加え、ライセートを回収した。15,000 x gで30分間遠心して回収した上清のタンパク濃度を蛋白測定試薬(Protein Assay Reagent, サーモ社製)にて定量した。タンパク濃度が等量になるように抽出液を調整し、サンプルバッファー(ナカライテスク社製)を加え95℃で5分間インキュベートした上で、SDS-PAEゲル(10% SuperSep（商標） Ace gel, 和光社製)を用いてSDS-PAGEを行なった。ウエスタンブロット法では、先ずサンプルの泳動が終了した後、ブロッティング装置により、100Vで3時間かけてPVDF膜(ポール社製)への転写を行った。転写終了後、Blocking One(ナカライテスク社製)で30分間室温でブロッキングを行い、1次抗体として抗リン酸化SR蛋白質抗体(インビトロジェン社製, クローン 1H4)、抗Lamin B抗体(サンタクルズ社製, クローン M-20)をそれぞれCan Get Signal(東洋紡社製)で500倍希釈、1,000倍希釈を行った。2次抗体として抗マウスIgG-HRP標識抗体(GEヘルスケア社製)を5,000倍希釈、抗ヤギIgG-HRP標識抗体(ジャクソンイムノリサーチ社製)を10,000倍希釈してから検出を行った。検出は、発色基質としてイムノスターLD(和光社製)を用いて、OHPフィルムにメンブレンを挟みChemiDoc（商標）MPイメージングシステムを使用して行なった。
　また、化合物３によるエキソンスキップをsemi-quantitative RT-PCRにて評価した。具体的なプロトコールは以下の通り。その結果を図５に示す。評価における対照として同濃度TG003を使用した。
　HeLa細胞を12ウェルプレートに1ウェルあたり1x105個播くと同時に、1ウェルあたり0.1 μgのH492-dys Ex31mスプライシングレポーター（図３）をトランスフェクション試薬(Lipofectamin 2000, インビトロジェン社製)を用いてトランスフェクションした。24時間培養後、DMSO溶液に希釈した化合物3, TG003を5 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM、DMSO濃度が0.1%となるようにそれぞれの濃度で加えた。投与24時間後に800 μlのRNA抽出試薬(セパゾール RNA I スーパーG, ナカライテスク社製)をウェルに添加し、細胞を回収した。添付のプロトコールに従ってRNAを回収した後、DNase(プロメガ社製)を用いて37℃で30分間インキュベートして、添付の反応停止液を加えた上、65℃で10分間インキュベートしてDNaseを失活させた。DNase処理済みのRNAを、スーパースクリプトII(タカラバイオ社製)を用いて添付のプロトコールに従って、50 pmolのランダムヘキサマー(タカラバイオ社製)を含む反応液を調整、30℃で10分、42℃で50分、70℃で15分間インキュベートして逆転写反応を行い第1鎖cDNAを得た。得られたcDNAをEx Taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いて添付のプロトコールに従って、0.4 μMのプライマー(配列は下記に記載)を含む反応液を調整し、PCRサーマルサイクラー(バイオラッド社製)で、レポーター, Clk1に対しては95℃20秒の変性工程、58℃20秒のアニーリング工程、72℃1分の伸長工程を32サイクル、GAPDHに対しては25サイクル繰り返してPCRを実施した。反応液をローディングバッファー(タカラバイオ社製)と混合し、1xTAEバッファー(ナカライテスク社製)中、2.5%アガロースゲルで電気泳動した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ChemiDoc（商標）MPイメージングシステムを用いて生成物を紫外線で検出した。増幅されたPCR産物はImage Labソフトウェア(バイオラッド社製)を用いて定量化した。レポーターのエキソン31エキソンスキッピング比率はエキソン31をスキッピングした転写産物とエキソン31を含む転写産物の合計に占めるスキッピング産物の割合で導出した。
それぞれの増幅に用いたプライマーは下記の通り:
ヒトCLK1フォワード, 5'-ATG AGA CAC TCA AAG AGA ACT TAC TG-3'（配列番号2）;  ヒトCLK1リバース, 5'-CTT TAT GAT CGA TGC ACT CCA C-3'（配列番号3）;  GAPDH フォワード, 5'-CCA TCA CCA TCT TCC AGG AGC GAG-3'（配列番号4）;  GAPDH リバース, 5'-GTG ATG GCA TGG ACT GTG GTC ATG-3'（配列番号5）; スプライシングレポーター フォワード, 5'-ATT ACT CGC TCA GAA GCT GTG TTG C-3'（配列番号6）; スプライシングレポーター リバース, 5'-AAG TCT CTC ACT TAG CAA CTG GCA G-3'（配列番号7）.
　図４に示すとおり、化合物３は、Clkの基質であるSRSF4及びSRSF6に対してリン酸化阻害効果を発揮した。また、図５に示すとおり、化合物３はTG003と同等のエキソンスキップ活性を示した。
　実験例４：化合物３のエキソンスキップ活性評価2
　DMD患者(c.4303G>T)由来細胞におけるジストロフィン遺伝子エキソン３１のエキソンスキップに対する化合物３の影響をsemi-quantitative RT-PCRにて評価した。具体的なプロトコールは以下の通り。その結果を図６に示す。
　不死化筋ジストロフィー患者由来細胞(ref. Nishida, A. et al. Brain Dev. 38, 738-745 (2016).)を12ウェルプレートに24時間培養後、DMSO溶液に希釈した化合物3, TG003を10 μM, 20 μM, 50 μM、DMSO濃度が0.1%となるようにそれぞれの濃度で加えた。投与48時間後に800 μlのRNA抽出試薬(トライゾール, サーモ社製)をウェルに添加し、細胞を回収した。RNA抽出キット(Direct-zol RNA精製キット, ジーモリサーチ社製)を用いて、添付のプロトコールに従ってRNAを回収した。抽出したRNAを、スーパースクリプトII(タカラバイオ社製)を用いて添付のプロトコールに従って、50 pmolのランダムヘキサマー(タカラバイオ社製)を含む反応液を調整、30℃で10分、42℃で50分、70℃で15分間インキュベートして逆転写反応を行い第1鎖cDNAを得た。得られたcDNAをEx Taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いて添付のプロトコールに従って、0.4 μMのプライマー(配列は下記に記載)を含む反応液を調整し、PCRサーマルサイクラー(バイオラッド社製)で、95℃20秒の変性工程、58℃20秒のアニーリング工程、72℃1分の伸長工程を32サイクル繰り返してPCRを実施した。反応液をローディングバッファー(タカラバイオ社製)と混合し、1xTAEバッファー(ナカライテスク社製)中、2.5%アガロースゲルで電気泳動した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ChemiDoc（商標）MPイメージングシステムを用いて生成物を紫外線で検出した。定量化は増幅したRCR産物をアジレント2100バイオアナライザーシステム(アジレントテクノロジー社製)で、DNA 1000ラボチップキット(アジレントテクノロジー社製)を用いて行った。エキソン31エキソンスキッピング比率はエキソン31をスキッピングした転写産物とエキソン31を含む転写産物の合計に占めるスキッピング産物の割合で導出した。増幅に用いたプライマーは下記の通り:
ジストロフィン フォワード, 5'-CCT GTA GCA CAA GAG GCC TTA-3'（配列番号8）; ジストロフィン リバース, 5'-TCC ACA CTC TTT GTT TCC AAT G-3'（配列番号9）
　図6に示すとおり、患者由来筋肉細胞を用いた解析では、化合物3の添加により、遺伝子変異をもつDMD exon 31のスキップの増強が見られた。
　実験例5：化合物３のエキソンスキップ活性評価３
　化合物３の添加によりDMD患者(c.4303G>T)由来細胞においてジストロフィン蛋白質が増加することを、ジストロフィン抗体(ab15277)を用いたウエスタンブロットにより確認した。その結果を図７に示す。
　図７に示すとおり、化合物３は、患者由来筋肉細胞に添加すると濃度依存性にジストロフィンタンパク質の発現増加が認められた。
　実験例６：化合物３の経口投与
　化合物３のマウス経口投与後に、筋肉組織での化合物３の取り込みの確認した(LC/MS)。化合物３の0.5% carboxy-methylcellulose溶液をマウスに経口投与(30mg/kg)し、筋肉組織内の化合物濃度をLC/MSにより解析した。具体的なプロトコールは以下の通り。その結果を図８に示す。
　化合物３を0.5% カルボキシメチルセルロース生理食塩水に溶解後、Jcl: TCRマウス(7週齢, 雄, チャールズリバーラボラトリーズ社提供)の皮下に30 mg/kg注射した。化合物注射後、30分、90分、180分、360分、それぞれの時間経過後にマウスを頸椎脱臼させた後、前脛骨筋を採取した。採取した前脛骨筋に5倍量の生理食塩水を加えてビーズ破砕機(ビーズクラッシャーμT-12, タイテック社製)にて破砕し、破砕液50 μlに対してメタノールで1%に希釈したギ酸アンモニウムを100 μl加えて攪拌後、遠心した。得られた上清90 μlに水510 μlを加えて遠心、上清300 μlを0.45 μm孔フィルター(コスモスピンフィルター, ナカライテスク社製)で濾過した後、遠心して上清を回収した。回収した溶液中の化合物3濃度をPoroshell 120 PFPカラム(アジレントテクノロジー社製)を用いてLC/MSにて測定した。
　図8に示すとおり、化合物3のマウス経口投与30 mg/kgで、筋肉組織において化合物3をLC/MSで検出でき、1.5 hに4.5 μMの頂値が得られた。
　実験例７：化合物３の経口投与２
　マウス経口投与において頂値が見られた投与後1.5hに単離した筋肉組織を試料として用い、CLKの基質であるSR蛋白質のリン酸化に対する阻害効果をウエスタンブロットにて検証した。具体的なプロトコールは以下の通り。その結果を図９に示す。
　化合物３を0.5% カルボキシメチルセルロース生理食塩水に溶解後、Jcl: TCRマウス(7週齢, 雄, チャールズリバーラボラトリーズ社提供)の皮下に30 mg/kg注射した。化合物注射後、90分経過後にマウスを頸椎脱臼させた後、前脛骨筋を採取した。採取した前脛骨筋にプロテアーゼ阻害剤 (ナカライテスク社製)、ホスファターゼ阻害剤 (ナカライテスク社製)添加した200 μlのCelLytic MT(シグマアルドリッチ社製)を加え、ビーズ破砕機(ビーズクラッシャーμT-12, タイテック社製)にて破砕し、ライセートを回収した。15,000 x gで30分間遠心して、回収した上清のタンパク濃度を蛋白測定試薬(Protein Assay Reagent, サーモ社製)にて定量した。タンパク濃度が等量になるように抽出液を調整し、サンプルバッファー(ナカライテスク社製)を加え95℃で5分間インキュベートした上で、SDS-PAEゲル(10% SuperSep（商標） Ace gel, 和光社製)を用いてSDS-PAGEを行なった。ウエスタンブロット法では、先ずサンプルの泳動が終了した後、ブロッティング装置により、100 Vで3時間かけてPVDF膜(ポール社製)への転写を行った。転写終了後、Blocking One(ナカライテスク社製)で30分間室温でブロッキングを行い、1次抗体として抗リン酸化SR蛋白質抗体(インビトロジェン社製, クローン 1H4)、抗Lamin B抗体(サンタクルズ社製, クローン M-20)をそれぞれCan Get Signal(東洋紡社製)で500倍希釈、1,000倍希釈を行った。2次抗体として抗マウスIgG-HRP標識抗体(GEヘルスケア社製)を5,000倍希釈、抗ヤギIgG-HRP標識抗体(ジャクソンイムノリサーチ社製)を10,000倍希釈してから検出を行った。検出は、発色基質としてイムノスターLD(和光社製)を用いて、OHPフィルムにメンブレンを挟みChemiDoc（商標）MPイメージングシステムを使用して行なった。
　転写終了後、Blocking One(ナカライテスク社製)で30分間室温でブロッキングを行い、1次抗体として抗ジストロフィン抗体(アブカム社製)、抗αチュブリン抗体(インビトロジェン社製, クローン DM1A)をそれぞれCan Get Signal(東洋紡社製)で200倍希釈、2,000倍希釈を行った。2次抗体として抗ラビットIgG-HRP標識抗体(GEヘルスケア社製)を20,000倍希釈、抗マウスIgG-HRP標識抗体(ジャクソンイムノリサーチ社製)を5,000倍希釈してから検出を行った。検出は、発色基質としてイムノスターLD(和光社製)を用いて、OHPフィルムにメンブレンを挟みChemiDoc（商標）MPイメージングシステムを使用して行なった。SRSF4のバンドはImage Labソフトウェア(バイオラッド社製)を用いて定量化した。
　また、該筋肉組織試料におけるスプライシング変化をsemi-quantitative RT-PCRにて検討した。具体的なプロトコールは以下の通り。その結果を図１０に示す。
　化合物３を0.5% カルボキシメチルセルロース生理食塩水に溶解後、Jcl: TCRマウス(7週齢, 雄, チャールズリバーラボラトリーズ社提供)の皮下に30 mg/kg注射した。化合物注射後、180分経過後にマウスを頸椎脱臼させた後、前脛骨筋を採取した。採取した前脛骨筋からはRNA抽出キット(RNeasy精製キット, キアゲン社製)を用いて、RNAを抽出した。まずキット付属のRLTバッファーを300 μl加え、ビーズ破砕機(ビーズクラッシャーμT-12, タイテック社製)にて破砕し、ライセートを回収した。590 μlの超純水、プロテナーゼK溶液(20mg/ml, ナカライテスク社製)を10 μl加えて、55℃で10分間プロテナーゼ処理を行った。その後遠心して上清を回収して、キット添付のプロトコールに従って精製を行った。精製したRNAをスーパースクリプトII(タカラバイオ社製)を用いて添付のプロトコールに従って、50 pmolのランダムヘキサマー(タカラバイオ社製)を含む反応液を調整、30℃で10分、42℃で50分、70℃で15分間インキュベートして逆転写反応を行い第1鎖cDNAを得た。得られたcDNAをEx Taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いて添付のプロトコールに従って、0.4 μMのプライマー(配列は下記に記載)を含む反応液を調整し、PCRサーマルサイクラー(バイオラッド社製)で、レポーター, Clk1に対しては95℃20秒の変性工程、58℃20秒のアニーリング工程、72℃1分の伸長工程を32サイクル、GAPDHに対しては25サイクル繰り返してPCRを実施した。反応液をローディングバッファー(タカラバイオ社製)と混合し、1xTAEバッファー(ナカライテスク社製)中、2.5%アガロースゲルで電気泳動した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ChemiDoc（商標）MPイメージングシステムを用いて生成物を紫外線で検出した。増幅されたPCR産物はImage Labソフトウェア(バイオラッド社製)を用いて定量化した。
　それぞれの増幅に用いたプライマーは下記の通り:
マウスCLK1フォワード, 5'-ATG AGA CAT TCA AAG AGA ACT TAC TG-3'（配列番号10）; マウスClk1 リバース, 5'-CAC TTT ATG ATC GAT GCA TTC C-3'（配列番号11）; GAPDH フォワード, 5'-CCA TCA CCA TCT TCC AGG AGC GAG-3'（配列番号4）; GAPDH リバース, 5'-GTG ATG GCA TGG ACT GTG GTC ATG-3'（配列番号5）
　図９に示すとおり、化合物３は、経口投与後の筋肉組織において、Clkの基質であるSRSF4のリン酸化に対する阻害効果を発揮した。図１０に示すとおり、化合物３は、マウス経口投与後の筋肉組織において、Clk活性阻害によって誘導されることが知られているClk1成熟型スプライシング産物の増加が確認された。
　実験例８：エキソンスキップ活性の評価
　実験例３と同様にして、化合物１－４、６、８、１０、１２、１４、及び１５のエキソンスキップに対する効果をsemi-quantitative RT-PCRにて評価した。具体的なプロトコールは以下の通り。その結果を下記表１及び図１１に示す。
　HeLa細胞を12ウェルプレートに1ウェルあたり1x105個播くと同時に、1ウェルあたり0.1 μgのH492-dys Ex31mスプライシングレポーター（図３）をトランスフェクション試薬(Lipofectamin 2000, インビトロジェン社製)を用いてトランスフェクションした。24時間培養後、DMSO溶液に希釈した化合物をそれぞれ10 μM、DMSO濃度が0.1%となるようにそれぞれの濃度で加えた。投与24時間後に800 μlのRNA抽出試薬(セパゾール RNA I スーパーG, ナカライテスク社製)をウェルに添加し、細胞を回収した。添付のプロトコールに従ってRNAを回収した後、DNase(プロメガ社製)を用いて37℃で30分間インキュベートして、添付の反応停止液を加えた上、65℃で10分間インキュベートしてDNaseを失活させた。DNase処理済みのRNAを、スーパースクリプトII(タカラバイオ社製)を用いて添付のプロトコールに従って、50 pmolのランダムヘキサマー(タカラバイオ社製)を含む反応液を調整、30℃で10分、42℃で50分、70℃で15分間インキュベートして逆転写反応を行い第1鎖cDNAを得た。得られたcDNAをEx Taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いて添付のプロトコールに従って、0.4 μMのプライマー(配列は下記に記載)を含む反応液を調整し、PCRサーマルサイクラー(バイオラッド社製)で95℃20秒の変性工程、58℃20秒のアニーリング工程、72℃1分の伸長工程を32サイクル、繰り返してPCRを実施した。反応液をローディングバッファー(タカラバイオ社製)と混合し、1xTAEバッファー(ナカライテスク社製)中、2.5%アガロースゲルで電気泳動した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ChemiDoc（商標）MPイメージングシステムを用いて生成物を紫外線で検出した。増幅されたPCR産物はImage Labソフトウェア(バイオラッド社製)を用いて定量化した。レポーターのエキソン31エキソンスキッピング比率はエキソン31をスキッピングした転写産物とエキソン31を含む転写産物の合計に占めるスキッピング産物の割合で導出した。
増幅に用いたプライマーは下記の通り:
スプライシングレポーター フォワード, 5'-ATT ACT CGC TCA GAA GCT GTG TTG C-3'（配列番号6）; スプライシングレポーター リバース, 5'-AAG TCT CTC ACT TAG CAA CTG GCA G-3'（配列番号7）.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
　表１及び図１１に示すとおり、用いた化合物は、それぞれ、エキソンスキップ率が向上するという効果を示した。
　実験例９：化合物３のエキソンスキップ活性の評価4
　DMD患者(c.4303G>T)由来細胞におけるジストロフィン遺伝子エキソン31のエキソンスキップに対する化合物３の影響をより詳細に評価した。具体的なプロトコールは以下の通り。その結果を図１２に示す。
　不死化筋ジストロフィー患者由来細胞(ref. Nishida, A. et al. Brain Dev. 38, 738-745 (2016).)を12ウェルプレートに24時間培養後、DMSO溶液に希釈した化合物3, TG003を20 μM、DMSO濃度が0.1%となるようにそれぞれの濃度で加えた。投与48時間後に800 μlのRNA抽出試薬(トライゾール, サーモ社製)をウェルに添加し、細胞を回収した。RNA抽出キット(Direct-zol RNA精製キット, ジーモリサーチ社製)を用いて、添付のプロトコールに従ってRNAを回収した。抽出したRNAを、スーパースクリプトII(タカラバイオ社製)を用いて添付のプロトコールに従って、50 pmolのランダムヘキサマー(タカラバイオ社製)を含む反応液を調整、30℃で10分、42℃で50分、70℃で15分間インキュベートして逆転写反応を行い第1鎖cDNAを得た。得られたcDNAをEx Taqポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用いて添付のプロトコールに従って、0.4 μMのプライマー(配列は下記に記載)を含む反応液を調整し、PCRサーマルサイクラー(バイオラッド社製)で、95℃20秒の変性工程、58℃20秒のアニーリング工程、72℃1分の伸長工程を32サイクル繰り返してPCRを実施した。反応液をローディングバッファー(タカラバイオ社製)と混合し、1xTAEバッファー(ナカライテスク社製)中、2.5%アガロースゲルで電気泳動した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ChemiDoc（商標）MPイメージングシステムを用いて生成物を紫外線で検出した。増幅に用いたプライマーは下記の通り:
　エキソン1-8 フォワード, 5'- ATGCTTTGGTGGGAAGAAGTAG -3'（配列番号12）;
　エキソン1-8 リバース, 5'- CTGTTGAGAATAGTGCATTTGAT -3'（配列番号13）;
　エキソン7-11 フォワード, 5'- GTGGTTTGCCAGCAGTCAGCCACA -3'（配列番号14）;
　エキソン7-11 リバース, 5'- TCCTGTTCCAATCAGCTTACTTC -3'（配列番号15）;
　エキソン10-14 フォワード, 5'- TTGCAAGCACAAGGAGAGATT -3'（配列番号16）; 
　エキソン10-14 リバース, 5'- ACGTTGCCATTTGAGAAGGAT -3'（配列番号17）; 
　エキソン13-18 フォワード, 5'- GCTGCTTTGGAAGAACAACTT -3'（配列番号18）; 
　エキソン13-18 リバース, 5'- CTTCTGAGCGAGTAATCCAGCT -3'（配列番号19）; 
　エキソン17-21 フォワード, 5'- AGGCAGATTACTGTGGATTCTGA -3'（配列番号20）;
　エキソン17-21 リバース, 5'- TTGTCTGTAGCTCTTTCTCTC -3'（配列番号21）;
　エキソン21-25 フォワード, 5'- CAACCTCAAATTGAACGATT -3'（配列番号22）; 
　エキソン21-25 リバース, 5'- CCCACCTTCATTGACACTGTT -3'（配列番号23）; 
　エキソン24-28 フォワード, 5'- GAGCATTGTCAAAAGCTAGAGGA -3'（配列番号24）; 
　エキソン24-28 リバース, 5'- CAATAACTCATGCCAACATGCCCA -3'（配列番号25）; 
　エキソン27-32 フォワード, 5'- CCTGTAGCACAAGAGGCCTTA -3'（配列番号26）;
　エキソン27-32 リバース, 5'- TCCACACTCTTTGTTTCCAATG -3'（配列番号27）;
　エキソン31-35 フォワード, 5'- GCCCAAAGAGTCCTGTCTCA -3'（配列番号28）; 
　エキソン31-35 リバース, 5'- GTGCACCTTCTGTTTCTCAA -3'（配列番号29）; 
　エキソン34-38 フォワード, 5'- GAATGGCTGGCAGCTACAGA -3'（配列番号30）; 
　エキソン34-38 リバース, 5'- TTAAACTGCTCCAATTCCTTCAA -3'（配列番号31）; 
　エキソン36-41 フォワード, 5'- TTTGACCAGAATGTGGACCA -3'（配列番号32）;
　エキソン36-41 リバース, 5'- TGCGGCCCCATCCTCAGACAA -3'（配列番号33）;
　エキソン40-45 フォワード, 5'- AGCCTACCTGAGCCCAGAGATG -3'（配列番号34）; 
　エキソン40-45 リバース, 5'- CTTCCCCAGTTGCATTCAAT -3'（配列番号35）; 
　エキソン44-48 フォワード, 5'- GCTGAACAGTTTCTCAGAAAGACACAA -3'（配列番号36）; 
　エキソン44-48 リバース, 5'- CAACTGATTCCTAATAGGAGA -3'（配列番号37）; 
　エキソン48-52 フォワード, 5'- CAAGGAGAAATTGAAGCTCAA -3'（配列番号38）;
　エキソン48-52 リバース, 5'- CGATCCGTAATGATTGTTCTAGC -3'（配列番号39）;
　エキソン51-59 フォワード, 5'- TGGACAGAACTTACCGACTGG -3'（配列番号40）;
　エキソン51-59 リバース, 5'- GTAACAGGACTGCATCATCG -3'（配列番号41）;
　エキソン55-59 フォワード, 5'- AGAGGCTGCTTTGGAAGAAA -3'（配列番号42）; 
　エキソン55-59 リバース, 5'- CCCACTCAGTATTGACCTCCTC -3'（配列番号43）; 
　エキソン58-68 フォワード, 5'- GACAGAGCAGCCTTTGGAAG -3'（配列番号44）; 
　エキソン58-68 リバース, 5'- GGACACGGATCCTCCCTGTTCG -3'（配列番号45）; 
　エキソン64-68 フォワード, 5'- CTCCGAAGACTGCAGAAGGC -3'（配列番号46）;
　エキソン64-68 リバース, 5'- TTTCTGCAGCAGCCACTCT -3'（配列番号47）;
　エキソン67-72 フォワード, 5'- ATTGAGCCAAGTGTCCGG -3'（配列番号48）; 
　エキソン67-72 リバース, 5'- TATCATCGTGTGAAAGCTGAG -3'（配列番号49）; 
　エキソン70-79 フォワード, 5'- GAATGGGCTACCTGCCAGTG -3'（配列番号50）;
　エキソン70-79 リバース, 5'- ATCGCTCTGCCCAAATCATCTG -3'（配列番号51）;
　図１２に示すとおり、化合物３は、患者変異型エキソン31のスキッピングは誘導する(エキソン数：２７－３２の断片）が、その他のエキソンのスキッピングには影響を与えないことが示された。
　配列番号1：RSペプチド
　配列番号2：ヒトCLK1フォワード
　配列番号3：ヒトCLK1リバース
　配列番号4：GAPDH フォワード
　配列番号5：GAPDH リバース
　配列番号6：スプライシングレポーター フォワード
　配列番号7：スプライシングレポーター リバース
　配列番号8：ジストロフィン フォワード
　配列番号9：ジストロフィン リバース
　配列番号10：マウスCLK1フォワード
　配列番号11：マウスCLK1リバース
　配列番号12：エキソン1-8 フォワード
　配列番号13：エキソン1-8 リバース
　配列番号14：エキソン7-11 フォワード
　配列番号15：エキソン7-11 リバース
　配列番号16：エキソン10-14 フォワード
　配列番号17：エキソン10-14 リバース
　配列番号18：エキソン13-18 フォワード
　配列番号19：エキソン13-18 リバース
　配列番号20：エキソン17-21 フォワード
　配列番号21：エキソン17-21 リバース
　配列番号22：エキソン21-25 フォワード
　配列番号23：エキソン21-25 リバース
　配列番号24：エキソン24-28 フォワード
　配列番号25：エキソン24-28 リバース
　配列番号26：エキソン27-32 フォワード
　配列番号27：エキソン27-32 リバース
　配列番号28：エキソン31-35 フォワード
　配列番号29：エキソン31-35 リバース
　配列番号30：エキソン34-38 フォワード
　配列番号31：エキソン34-38 リバース
　配列番号32：エキソン36-41 フォワード
　配列番号33：エキソン36-41 リバース
　配列番号34：エキソン40-45 フォワード
　配列番号35：エキソン40-45 リバース
　配列番号36：エキソン44-48 フォワード
　配列番号37：エキソン44-48 リバース
　配列番号38：エキソン48-52 フォワード
　配列番号39：エキソン48-52 リバース
　配列番号40：エキソン51-59 フォワード
　配列番号41：エキソン51-59 リバース
　配列番号42：エキソン55-59 フォワード
　配列番号43：エキソン55-59 リバース
　配列番号44：エキソン58-68 フォワード
　配列番号45：エキソン58-68 リバース
　配列番号46：エキソン64-68 フォワード
　配列番号47：エキソン64-68 リバース
　配列番号48：エキソン67-72 フォワード
　配列番号49：エキソン67-72 リバース
　配列番号50：エキソン70-79 フォワード
　配列番号51：エキソン70-79 リバース

Claims (12)

  1. 　スプライシングを改変するための医薬組成物であって、
    　下記一般式(I)で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩を有効成分とし、前記化合物はタンパク質リン酸化酵素のリン酸化活性に対する阻害能を有する、医薬組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［ここで、上記一般式（Ｉ）において、
    　Ｘ1は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     であって、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基であり、
    　Ｘ2は、－（結合手）又は－ＮＨ－であり、
    　Ｒ1は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     であって、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基であり、
    　Ｒ2は、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基である。］
  2. 　エキソンスキップを誘導するための、請求項１記載の医薬組成物。
  3. 　遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための、請求項１又は２記載の医薬組成物。
  4. 　一般式（Ｉ）で表される化合物が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     である、請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物。
  5. 　一般式（Ｉ）で表される化合物が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     である、請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物。
  6. 　一般式（Ｉ）で表される化合物が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     である、請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物。
  7. 　一般式（Ｉ）で表される化合物が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     である、請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物。
  8. 　遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、請求項１から７のいずれかに記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
  9. 　遺伝子疾患の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物を製造するための下記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩の使用。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     ［ここで、上記一般式（Ｉ）において、
    　Ｘ1は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     であって、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基であり、
    　Ｘ2は、－（結合手）又は－ＮＨ－であり、
    　Ｒ1は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     であって、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基であり、
    　Ｒ2は、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基である。］
  10. 　スプライシングを改変するための下記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩の使用。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     ［ここで、上記一般式（Ｉ）において、
    　Ｘ1は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     であって、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基であり、
    　Ｘ2は、－（結合手）又は－ＮＨ－であり、
    　Ｒ1は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     であって、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基であり、
    　Ｒ2は、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基である。］
  11. 　下記一般式（Ｉ）で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩を有効成分とし、前記化合物はタンパク質のリン酸化活性を阻害する活性を有する、医薬組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     ［ここで、上記一般式（Ｉ）において、
    　Ｘ1は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     であって、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基であり、
    　Ｘ2は、－（結合手）又は－ＮＨ－であり、
    　Ｒ1は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     であって、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基であり、
    　Ｒ2は、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基である。］
  12. 　下記一般式で表される化合物若しくはそのプロドラッグ又はその製薬上許容される塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     ［ここで、上記一般式において、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、Ｃ1-4アルキル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ1-4アルキル基である。］
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