JP2010535830A - デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療用化合物の製造 - Google Patents

Abstract

デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に有用な5-(エチルスルホニル)-2-(ナフタレン-2-イル)ベンゾ[d]オキサゾールの製造方法を提供する。
【選択図】なし

Description

（関連出願）
優先権は、本願明細書において、「デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療」と題され2007年8月15日に出願された英国出願GB0715937.9に対して主張する。上記に参照した出願は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。
（分野）
本明細書中に提供されるものは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための化合物の製造方法である。

(背景)
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、筋肉機能の漸進性悪化と関連した共通の遺伝的神経筋疾患であり、150年以上前にフランスの神経科医デュシェンヌ・ド・ブーローニュによってはじめて記載され、この人物により後に該疾患が名づけられた。DMDはX連鎖劣性障害として特徴づけられ、3,500人に1人の男性が発症し、ジストロフィン遺伝子の突然変異によって生じる。該遺伝子はヒトゲノムにおいて最も大きく、2,600,000のDNA塩基対を含んで、79のエキソンを含む。ジストロフィン突然変異のほぼ60%は下流にフレームシフトエラーをもたらす大規模な挿入又は削除であるが、ほぼ40%は点突然変異又は小規模なフレームシフト再編成である。大多数のDMD患者は、ジストロフィンタンパク質を欠いている。ジストロフィンタンパク質のうち、ベッカー筋ジストロフィーは、量の減少又はサイズの変更によって生じるDMDの非常により軽度の形態である。DMDの高発生率（10,000の精子又は卵子の1）は、遺伝的スクリーニングが該疾患を決して除外しないことを意味するので、有効な治療法はたいへん望ましい。

DMDの多くの天然の及び遺伝子操作された動物モデルが存在し、メインステイを前臨床試験に提供する（Allamand, V. & Campbell, K. P.の文献「筋ジストロフィーの動物モデル：治療法の開発のための有益なツール」Hum. Mol. Genet. 9, 2459-2467 (2000)。マウス、ネコ及びイヌモデルにはすべてDMD遺伝子の突然変異があり、かつヒトにおいて見出されるものと類似の生化学ジストロフィン異常症を呈するにもかかわらず、該モデルは該表現型に関して驚くべき及び相当な変動を示す。ヒトの様に、イヌ（ゴールデンレトリバー筋ジストロフィー及びジャーマンショートヘアドポインタ）のモデルは重篤な表現型を有し；これらのイヌは、典型的には心不全で死ぬ。イヌは、最良の表現型模写をヒト疾患に提供し、前臨床試験の高いベンチマークと考えられる。残念なことに、これらの動物を育てることは高価及び困難であり、臨床時間経過は同腹仔の間で可変的であり得る。
mdxマウスは、有効性、短い妊娠時間、成熟時間及び比較的低コストのため最も広く使われているモデルである（Bulfield, G., Siller, W. G., Wight, P. A. & Moore, K. J.の文献「マウスにおいてＸ染色体にリンクされた筋ジストロフィー（mdx）」Proc. Natl Acad. Sci. USA 81, 1189-1192 (1984))。

約20年前のDMD遺伝子の発見以来、DMDの処理における様々な程度の成功が前臨床医学動物試験において成し遂げられ、そのいくつかはヒトにおいて追跡されている。現在の治療的な戦略は、概して3つの群に分けることが可能である：第1、遺伝子治療アプローチ；第2、細胞療法；及び、最後、薬理学的治療法。遺伝子及び細胞ベースの治療法は、特に疾患経過の初期に開始される場合、個別的に二次的な欠陥/病理学（例えば、拘縮）を修正する必要性を未然に防ぐことの基本的効果を提供する。残念なことに、これらの方法は、多くの技術的な困難に直面する。毒性、安定的発現の欠如及び送達の困難性に加えて、ウイルスベクター、筋芽細胞及び新規合成ジストロフィンに対する免疫応答が報告されている。

筋ジストロフィーの治療のための薬理学的方法は、遺伝子及び細胞ベースの方法とは、失った遺伝子及び／又はタンパク質を送達するように設計されていないことにおいて、異なる。一般に薬理学的戦略は、炎症を減少させること、カルシウムホメオスタシスを改良すること、及び筋肉前駆細胞の増殖又は関与を増加させることなどの手段による表現型を改良する試みにおいて薬/分子を使用する。これらの戦略は、全身的に送達するのが容易で、かつベクター及び細胞ベースの治療法に関連する免疫学的及び／又は毒性問題の多くを回避できる効果を提供する。炎症を低減させるコルチコステロイド及びクロモグリケートナトリウム、カルシウムホメオスタシスを維持するダントロレン、及び筋力を増加させるクレンブテロールを用いた調査は有望な結果をもたらしたにもかかわらず、これらの潜在的治療法のいずれもDMDを治療する際に有効なことを未だ示していない。

代替的な薬理学的アプローチは、アップレギュレーション療法である。アップレギュレーション療法は、欠陥遺伝子を置き換えるために他の遺伝子の発現を増加させることに基づいており、免疫応答が以前に不在のタンパク質に対して開始される場合に特に有益である。ユートロフィン、すなわちジストロフィンの常染色体パラログのアップレギュレーションは、DMDの潜在的治療法として提案されている（Perkins & Daviesの文献、Neuromuscul Disord, S1: S78- S89 (2002), Khurana & Daviesの文献, Nat Rev Drug Discov 2:379-390 (2003))。 ユートロフィンがトランスジェニックmdxマウスにおいて過剰発現するときに、それは筋細胞のサルコレンマに局在して、ジストロフィン関連タンパク質複合体（DAPC）の構成要素を復元し、それはジストロフィー性の発生を防止して、次々に骨格筋の機能的な改良を導く。イヌにおけるユートロフィンのアデノウイルス送達は、病理学を防止することが示されている。マウスモデルにおける出生直後の増加したユートロフィン発現の開始は有効であり得、かつユートロフィンが遍在的に発現されるときに毒性は観察されず、これはこの治療法をヒトに転換するために有望である。病理学を減少させるのに十分なレベルへの内因性ユートロフィンのアップレギュレーションは、小さな拡散性化合物の送達により達成され得る。

（説明）
式1の化合物がデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための優れた特性を有するということを発見した。

したがって、式(I)の化合物の効率的な合成の必要性がある：5-(エチルスルホニル)-2-(ナフタレン-2-イル)ベンゾ[d]オキサゾール。
本明細書中に提供されるものは式(I)の化合物の製造方法であって、

酸触媒の存在下での式(II)の化合物の環化を含む

。

ここでの開示は、添付図面に関して詳細に本明細書で記載する：
ルシフェラーゼレポーターアッセイ（マウスH2K細胞）を示す。 用量依存的ルシフェラーゼ誘導を示す。 マウスユートロフィンに特異的な抗体で染色されるTA筋肉断面の実施例を示す。 CPD-A（V2及びV3）に曝露されたマウスが、対照と比較して増加したユートロフィン発現レベルを示したことを示す。

正確な反応条件の操作について幅広い範囲がある。すべてのこの種の操作は、本発明の範囲内である。本発明を実施する場合、当業者の助けとなり得る情報資源は、一般的な実務手順を論じている「Vogelの実用有機化学のテキストブック第5版、（Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry）B. S. Furnissら, Pearson Education Limited, 1988」を含む。加えて、合成方法は、「総合複素環化学、1巻（Comprehensive Heterocyclic Chemistry, Vol. 1）（AR Katritzky, CW Rees編）Pergamon Press, Oxford, 1984」及び、「総合複素環化学II：文献の再検討（Comprehensive Heterocyclic Chemistry II:A Review of the Literature）1982-1995 複素環化合物の構造、反応、合成及び使用 Alan R. Katritzky (編集者), Charles W. Rees (編集者), E.F.V.Scriven (編集者), Pergamon Pr, June 1996」に論じられている。当業者の助けとなり得る他の一般的情報資源は、「Marchの応用有機化学：反応、機構及び構造（March's Advanced Organic Chemistry:Reactions, Mechanisms, and Structure）Wiley- Interscience；第5版 (January 15, 2001)」を含む。

反応は、-10℃〜+170℃の温度で実施できる。通常、反応は、常圧で溶媒の還流温度で実施できる。試薬を、溶媒の添加前に加熱することなしに冷却しながら混合できることを見出した。この様式での製造は、該反応に悪影響を与えなかった。これは、物理的な処理をより容易かつ安全にする。
前記反応は、該反応を妨げない任意の適切な溶媒において実施できる。使用可能である溶媒は、酢酸、ギ酸、1-プロパノール及び2-プロパノール、1-ブタノール及び2-ブタノール、3-Me-1-ブタノール、イソブタノール、1-ペンタノールなどのプロトン性溶媒並びにトルエン、キシレン（混合）、ジオキサン、4-Me-2-ペンタノン、酢酸イソブチル、酢酸n-プロピル及び酢酸ブチルなどの非プロトン性溶媒を含む。一実施態様において、溶媒は、キシレン（混合）である。

一実施態様において、環化の副産物として生成される水は除去される。
反応から水を除去する方法は、当業者にとって周知である。一実施態様において、水は、ディーン-スターク装置を用いて除去される。ディーン-スターク装置を使用する場合の方法の実施態様において、溶媒が100℃を超える沸点を有することが好ましい。この様式での水の除去が反応速度及び収率に有益であることが分かっている。
環化を触媒する任意の適切な酸触媒を使用でき、多くが当業者に知られている。適切な触媒は、p-トルエンスルホン酸及びメタンスルホン酸を含むが、これに限定されるものではない。
ある種の実施態様において、急速な撹拌は必須でない。媒体について大規模な間接撹拌（overhead stirring）は十分であるが、それは渦動を引き起こすのに必要でない。

式(II)の化合物は、任意の方法で合成できる。一実施態様において、式(II)の化合物は、式(III)のアミノアルコール

の式（IV）のアシル誘導体（式中、Xは脱離基を表す。）

との反応により製造される。

Xは、任意の適切な脱離基を表す。当業者は、利用可能な適切なアシル誘導体の範囲をよく知っている。しかしながら、一実施態様においてXはハロゲンを表し、ここではハロゲンによってF、Cl、Br又はIが意味される。別の実施態様において、XはClを表す。
式(II)の化合物の製造のための合成は、反応を妨げない任意の適切な溶媒において実施できる。使用可能である溶媒は、酢酸、ギ酸、1-プロパノール及び2-プロパノール、1-ブタノール及び2-ブタノール、3-Me-1-ブタノール、イソブタノール及び1-ペンタノールなどのプロトン性溶媒並びにトルエン、キシレン（混合）、ジオキサン、4-Me-2-ペンタノン、酢酸イソブチル、酢酸n-プロピル及び酢酸ブチルなどの非プロトン性溶媒を含む。一実施態様において、溶媒は、キシレン（混合）である。

本発明の一実施態様において、式(II)の化合物は、環化ステップに対し別々のステップで合成及び精製される。
別の実施態様においてワンポット手順を使用し、該手順において、式(II)の化合物は、式(II)の化合物の中間精製又は溶媒の除去なしに合成され、その後環化される。
一実施態様において、式(III)のアミノアルコール、及び式（IV）のアシル誘導体（式中、XはClを表す。）は溶媒中で反応して式(II)の化合物を与え、

これは本明細書で提供する方法において、中間精製又は溶媒の除去なしに使用される。

アミノアルコールと酸塩化物との反応の間、HClガスは遊離され、これは塩基によって中性化できる。一実施態様において、塩基は、外部トラップにある。外部トラップによって、塩基は反応混合物中に存在しないが、HCl-塩基付加生成物が該反応混合物中に生産されていないことも意味される。外部トラップの使用は、精製を単純化し、かつ塩基により触媒されるか又は塩基が関与する副反応のリスクを最小化する。一実施態様において、遊離HClガスは、反応混合物から拝ガスをアルカリ洗浄、例えばNaOH水溶液を通して通過させることにより中和できる。当業者は、反応から酸性拝ガスを中和するために用いることができる他の洗浄剤をよく知っている。

ある種の実施態様において、アミンと酸塩化物との反応は非常に速くあり得、かつこの段階での長時間加熱は必要でない。大規模において（例えば1キログラム超）、気体発生は非常に急速であり、注意深い温度調節が必要である。例えば、使用はジャケット付き反応器からできていることがあり得る−温度をゆっくり適切なレベルに上げ、その後いったんHCl発生が始まったらこの温度で維持することができる。いったんHCl発生が完了したら、慎重な制御を続ける必要はない−反応は、例えばGCMS又はTLCなどの任意の適切な方法によってモニタし、完了を観察できる。

別の実施態様において、XはClを表し、反応は還流下でキシレン（混合）中で起こり、式(II)の化合物は、本明細書に提供する方法において、中間精製又は溶媒の除去なしに使用され、かつ環化段階においてメタンスルホン酸は酸触媒として使用される。
生成物は、従来技術を使用して分離される。例えば、一般的な精製技術を論じている「Vogelの実用有機化学のテキストブック第5版、（Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry）B. S. Furnissら, Pearson Education Limited, 1988」を参照されたい。
一実施態様において、溶媒がキシレン（混合）である場合、生成物を含む溶液は、約90℃に冷却し、それから濾過することができる。ある種の実施態様において、濾過段階における溶液の温度は、収率及び純度に影響を及ぼす：濾過の間におけるより高い溶液の温度は、生成物の収率がより大きく、かつ生成物の純度がより低い。

濾過の後、キシレン（混合）溶液を冷却し、生成物を結晶化することができる。生成物が結晶化するために要する時間は、いくつかの要因、例えば溶液の濃度及び使用する溶媒に依存している。しかしながら、一実施態様において、反応混合物は、数時間そのままにされる。
濾過による生成物の分離後、任意に、生成物は、適切な溶媒での洗浄により更に精製できる。適切な溶媒は、MTBE、アセトン及びエタノールを含むが、これに限定されるものではない。一実施態様において、溶媒は、メチルtert-ブチルエーテルである。この様式で洗浄することは、生成物の純度を増加させるが、収率を低下させ得る。

更に、生成物は、必要に応じて再結晶化できる。使用することができる再結晶溶媒は、アルコール（例えばエタノール）に加えて、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン及びヘプタンのうちの1つを含む、混合溶媒を含む。再結晶は、単独でアセトンにおいて実施することもできる。
DMDの処理での使用のための式Ｉの化合物の潜在的活性は、以下の予測的アッセイ及び選別において明示できる。

1. ルシフェラーゼレポーターアッセイ（マウスH2K細胞）
選別のために使用した細胞株は、不死化mdxマウスH2K細胞株であり、これは〜5kbのユートロフィンAプロモータ断片を含有し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子にリンクされた第1の翻訳されていないエキソンを含むプラスミドで安定的にトランスフェクションされている（図1を参照）。
低温及びインターフェロンを含んでいる培地の条件下で、細胞は筋芽細胞として維持される。これらを96ウエルプレートにまき、3日間の化合物の存在下で培養する。ルシフェラーゼのレベルはそれから、細胞溶解、及びプレート照度計を利用する発現されたルシフェラーゼ遺伝子からの光出力の読み取りにより測定する。
アッセイにおける化合物の薬理学的用量応答の実施例は、図2に示される。

2. mdxマウス
ADMETデータから得られたデータを優先し、かつ、最善のインビトロルシフェラーゼ活性及び合理的なADMETデータを有する化合物を概念研究のmdx証明における試験のために優先し、ここで該結果は、いずれかの化合物が、対照動物に投与されたビヒクルのみと比較して、ジストロフィン欠損筋においてユートロフィンタンパク質のレベルを上昇させる能力を有したかどうかを特定した。
10mg/kgの化合物を注射され、28日間毎日ip投与されかつ齢が一致した対照の2匹の動物が存在した。筋肉サンプルを取得し、切片化（ユートロフィンの筋線維染色における増加を確認するため）及びウエスタンブロッティング（ユートロフィンレベルの全体的増加を確認するため）のために処理した。

図3は、マウスユートロフィンに特異的な抗体で染色したTA筋肉断面の実施例を示す。ビヒクルを注射されただけのmdxの筋肉に対する比較は、筋線維に結合したユートロフィンの量の増加を示す。
また、上記処置されたマウスからの筋肉を切除して、特異抗体を用いたウェスタンブロッティング及び染色のために処理した（図4を参照）。また、CPD-Aを投与した筋肉を使用することは、TA脚筋肉及び横隔膜の両方に存在するユートロフィンの全体レベルにおいて顕著な増加を示す。CPD-A（V2及びV3）に曝露された両方のマウスは、対照と比較してユートロフィン発現の増加したレベルを示した。

第一の28日の研究からの陽性アップレギュレーションデータは、それから、更なる2匹のマウスでの28日の研究において繰り返した。3つの異なる化合物の合計は、28日間ipにより毎日送達した場合、2回反復においてmdxマウスのユートロフィン発現のレベルを上昇させる能力を示した。このデータは、ip送達された場合、化合物の能力がmdxの筋肉で見出されたユートロフィンのレベルにおける顕著な増加を引き起こすことを実証し、それゆえこのアプローチは、現在までのすべての公表データが、3倍を超えるユートロフィンレベルのいかなる増加もジストロフィン欠損筋に重大な機能効果を有することを実証するように、該疾患を改善するという確信を我々に与える。

H2K/mdx/Utro Aレポーター細胞株の維持
H2K/mdx/Utro Aレポーター細胞株を30％以下の集密度まで2週間継代した。細胞を10%CO₂存在下、33℃で培養した。
播種物（platting）について筋芽細胞を除去するために、該細胞を単層が分離し始めるまでトリプシン/EDTAでインキュベートした。
生育培地
DMEMギブコ41966
20%FCS
1%Pen/Strep
1%グルタミン
10mls ニワトリ胚抽出物
インターフェロン（1276 905ロシュ）添加新鮮10μl/50mls培地

96ウエルプレートについてのルシフェラーゼアッセイ
H2K/mdx/Utro Aレポーター細胞株を、190μl通常生育培地中ほぼ5000細胞/ウエルの密度で96ウエルプレート（Falcon 353296、白色不透明体）にまいた。プレートはそれから、10%CO₂存在下で24時間、33℃でインキュベートした。
化合物は、10μlの希釈された化合物を各ウエルに加えることによって終濃度10μMとなるよう投与した。プレートをそれからさらに48時間インキュベートした。
それから細胞を製造者による説明書に従って溶解した後（Promega Steady-Glo Luciferase Assay System(E2520)）、それからプレート照度計を使用して10秒間計数した。

化合物の貯蔵
スクリーニング用化合物は、必要とされるまで、100%DMSO中10mMとして-20℃で保存した。
化合物を用いたmdxマウスの注射
繁殖コロニーからのMdxをテストのために選択した。マウスは、腹膜内経路（ip）を使用して、ビヒクル又は10mg/kgの化合物のいずれかで毎日注射された。マウスを秤量し、化合物をPBS 中5%DMSO、0.1% tweenで希釈した。
マウスは所望の時点に頚椎脱臼により屠殺し、筋肉を分析用に切除した。

筋肉の分析
免疫組織化学
切片化するための組織を解剖し、OCT（Bright Cryo-M-Bed）に浸漬し、液体窒素冷却イソペンタンで凍結させた。固定されてない8μM凍結切片をBright Cryostat上で切り、-80℃で保存した。
染色の準備において、切片を5%ウシ胎仔血清/PBS中で30分間ブロッキングした。一次抗体をブロッキング試薬で希釈し、切片上で1.5時間加湿チャンバ内でインキュベートし、それからPBSで5分間3回洗浄した。二次抗体もブロッキング試薬で希釈し、暗条件の加湿チャンバにおいて1時間インキュベートした。最後に、断面をPBSで5分間3回洗浄し、カバーグラスをハイドロマウントでマウントした。スライドは、ライカの蛍光顕微鏡を使用して分析した。

結果
マウスH2K細胞においてルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して生物学的活性を評価し、以下の通りに分類する：
＋ 対照に比較して200％以下
＋＋ 対照に比較して201％〜300％
＋＋＋ 対照に比較して301％〜400％
＋＋＋＋ 対照に比較して401％以上

ここでは本発明を以下の実施例に関連して記載し、これは本発明の例示を意図しており、限定として解釈されるべきではない。

以下の物質を使用した：

手順：
血管に、後退刃攪拌機及び下方ポンピングタービン、5首のフランジ蓋、シール及びクランプ、撹拌グランド及び間接撹拌機、温度計鞘、ディーン-スタークトラップ、滴下漏斗及びコンデンサを備え付けた。コンデンサに対する水は、それからスイッチを入れられた。
水酸化ナトリウム及び0.80Lの水をそれから混合した（すべての水酸化ナトリウムが溶解するまでの氷浴にて冷却しながら−発熱性に注意）。結果として生じた溶液を、それから、適切に血管に取り付けられた洗浄器に移した。
それから2-アミノ-4-(エチルスルホニル)フェノール及び2.00Lのキシレン（混合）を血管へ移し、試薬及び溶媒を100rpmで撹拌した。

それから、塩化2-ナフトイル（naphtholyl）を2.00Lのキシレン（混合）に溶解し、血管に移した。撹拌速度を150rpmに増加した。
溶液の温度は、少なくとも30分間にわたって段階的に100℃に上げ、その後10分間そのレベルに維持した。（注意：HClガスは、このプロセスの間にガス洗浄器を通って放出される）。撹拌機速度をそれから315rpmに増加し、温度を30分にわたって還流（155℃）まで段階的に上げ、それを90分間維持した。（注意：HClガスは、このプロセスの間にガス洗浄器を通って放出される）。
それからメタンスルホン酸を30分間にわたって滴加し、更なる水がディーン-スターク装置に回収されなくなるまで（約15分）還流（relux）を維持した。

それから熱を取り除き、ディーン-スターク装置からのパイプアダプタを接続解除した。結果として生じた溶液を90℃まで冷却させ、ワットマン1濾紙を使用して濾過した。
結果として生じた溶液をそれから18時間外界温度のままにし、その時間後、生成物を結晶化させ、該生成物をワットマン1濾紙を使用する濾過により分離した。生成物をそれから、1×1.0L のtert-ブチルメチルエーテル（TBME）で洗浄した。
その後、恒量が成し遂げられるまで（少なくとも1時間間隔でなければならない質量の連続的な測定間で0.5g未満の差）、生成物を10mbarの圧力で65℃の真空オーブンで乾燥させた。
生成物は、サンドベージュ粉末として80%の収率で得られた。
生成物は、アセトンを還流することで溶解させ、-10℃〜-15℃に冷却し、冷却しながら濾過することにより再結晶化できる。

特徴描写：
5-(エチルスルホニル)-2-(ナフタレン-2-イル)ベンゾ[d]オキサゾール

Claims (10)

1. 式(I)の化合物の製造方法であって
   

   

   、酸触媒の存在下における式(II)の化合物の環化を含む
   

   

   、前記製造方法。
2. 前記酸触媒がメタンスルホン酸又はp-トルエンスルホン酸である、請求項1記載の製造方法。
3. 還流下で加熱される溶媒において起こる、請求項1又は2記載の製造方法。
4. 前記溶媒がキシレン（混合）である、請求項3記載の製造方法。
5. 前記環化の副産物として生成する水を除去する、請求項1〜4のいずれか1項記載の製造方法。
6. 前記水が、ディーン-スターク装置の使用により除去される、請求項5記載の製造方法。
7. 前記式(II)の化合物が溶媒中で合成され、その後、該式(II)の化合物の中間精製又は該溶媒の除去なく環化される、請求項1〜6のいずれか1項記載の製造方法。
8. 前記式(II)の化合物が、式(III)のアミノアルコール
   

   

   の式（IV）のアシル誘導体（式中、Xは脱離基を表す。）
   

   

   との反応により製造される、請求項1〜7のいずれか1項記載の製造方法。
9. Xがハロゲンを表す、請求項8記載の製造方法。
10. XがClを表す、請求項8記載の製造方法。

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