WO2017158806A1 - 標本の観察方法 - Google Patents

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    • H01J2237/2809—Scanning microscopes characterised by the imaging problems involved

Definitions

  • the present invention relates to a specimen observation method.
  • the present invention relates to an ionic liquid and an observation method using a charged particle beam apparatus.
  • the present invention relates to a method for observing a liquid using an ionic liquid.
  • microbubbles bubbles having a minute diameter
  • the application range is very wide, and examples thereof include uses such as sterilization, washing, and promotion of plant growth.
  • Various methods have been proposed as a method for creating bubbles, and an example thereof is Patent Document 1.
  • a so-called charged particle beam device exemplified by a scanning electron microscope and a transmission electron microscope can be considered.
  • a charged particle beam image of a liquid that has been subjected to a process for generating bubbles does not have a contrast that allows an operator to identify bubbles, for example, microbubbles.
  • the charged particle beam image of a specimen including a liquid that has been subjected to a process for generating bubbles and an ionic liquid has a contrast that allows an operator to identify bubbles, for example, microbubbles.
  • the present invention is characterized by utilizing this phenomenon.
  • the present invention is characterized by observing a specimen containing a liquid subjected to a treatment for generating bubbles and an ionic liquid with a charged particle beam apparatus such as an electron microscope.
  • microbubbles can be confirmed without freezing the liquid specimen.
  • a moving image is photographed using the present invention, it is possible to observe the change of microbubbles with respect to time in an easy-to-understand manner.
  • FIG. 2 is a flowchart of the first embodiment.
  • FIG. Schematic of the observation tool in liquid.
  • the figure explaining the case where the microgrid 511 carrying the in-liquid observation tool 45 is observed as the sample 405.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining a flowchart of this embodiment.
  • a solvent for example, ultrapure water
  • an electrolyte are mixed and stirred (step 101). Stirring may be performed manually by an operator, or a stirrer may be used.
  • a predetermined process is performed on the result of step 101.
  • This predetermined process can be referred to as a microbubble generation process.
  • the microbubble generation process is performed by putting the result of step 101 into a microbubble generator described later and applying a voltage (step 102).
  • step 102 the mixed liquid of ultrapure water and the electrolyte contains bubbles, for example, microbubbles.
  • the result of step 102 is referred to as microbubble water.
  • the microbubbles may be referred to as, for example, fine bubbles, ultra fine bubbles, micro bubbles, nano bubbles, and micro nano bubbles.
  • a fine bubble can be expressed as, for example, a bubble having a bubble diameter of several tens of microns or less, and more specifically, for example, a bubble having a bubble diameter of 1 micron or less.
  • fine bubbles having a bubble diameter of 1 micron or less can be expressed as ultra fine bubbles.
  • the ionic liquid is diluted with a solvent (for example, ultrapure water) (step 103).
  • a solvent for example, ultrapure water
  • the ionic liquid will be described.
  • the ionic liquid is liquid at normal temperature and can be expressed as a liquid containing ions.
  • the ionic liquid does not evaporate at all or hardly evaporates in the vacuum.
  • An ionic liquid may contain a cation and an anion, for example.
  • the ionic liquid may be hydrophilic or hydrophobic. Note that step 103 may be performed in parallel with steps 101 and 102.
  • step 104 the microbubble water and the ionic liquid diluted in step 103 are mixed to prepare a specimen (step 104).
  • step 105 the specimen prepared in step 104 is sealed in a submerged observation tool (details will be described later) (step 105).
  • Step 106 an in-liquid observation tool enclosing the specimen is mounted on the sample holder and placed in the chamber of the charged particle beam apparatus to obtain an image (step 106).
  • TEM transmission electron microscope
  • STEM scanning transmission electron microscope
  • SEM scanning electron microscope
  • Step 106 can be expressed as, for example, an imaging process for obtaining a charged particle beam image of a specimen including a liquid subjected to a process for generating bubbles and an ionic liquid.
  • the region showing microbubbles does not appear in the TEM image of the specimen that does not use ionic liquid.
  • a region showing microbubbles appears in a TEM image of a specimen using an ionic liquid. This phenomenon is reproducible. This area is darker than its surroundings, and its shape is a substantial point or circle.
  • the reason why the region showing the microbubbles can be confirmed in the TEM image of the sample using the ionic liquid is that, as a result of the interaction between the ionic liquid and the microbubble, the magnitude of the molecular weight of the ionic liquid and the other substance has a contrast. This is because it appears as a difference.
  • the interaction between the ionic liquid and the microbubbles is, for example, when the ionic liquid 23 is adsorbed on the surface of the microbubbles 22 inside the specimen 21 as shown in FIG. At least one of the cases where the microbubbles 22 are replaced (FIG. 2B) is conceivable.
  • the electrolyte can include at least one of carbonate ion, bicarbonate ion, nitrate ion, sulfate ion, chloride ion, perchlorate ion, hydroxide ion, sodium ion, potassium ion, but other known electrolytes are also employed. obtain.
  • An arbitrary range can be adopted as the concentration range. As an example, the concentration range may be 0.1 to 1000 mM.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining a fine bubble generator.
  • the fine bubble generator includes a container 208 for charging the electrolyte solution resulting from step 101, an anode 202, a cathode 204, an ion exchange membrane 205, a gas discharge port 206, an outlet 207, and a power source 209.
  • the container 208 has a two-chamber structure by the ion exchange membrane 205, and the electrolytic solution is divided into the electrolytic solution 201 and the electrolytic solution 203.
  • the side including the anode 202 can be expressed as an anode chamber, and the side including the cathode 204 can be expressed as a cathode chamber.
  • the anode chamber and the cathode chamber include a supply port for supplying an electrolytic solution.
  • Any material can be used for the ion exchange membrane 205. For example, a perfluorosulfonic acid material can be used.
  • any material can be used for the anode 202.
  • a conductive diamond catalyst doped with boron may be employed.
  • cathode 204 Any material can be used for the cathode 204.
  • platinum can be adopted.
  • microbubbles having a predetermined particle diameter such as ozone microbubbles
  • Hydrogen gas is generated on the cathode chamber side.
  • the electrolytic solution containing microbubbles, that is, the above-described microbubble water is taken out from the outlet 207.
  • the method of generating microbubbles is not limited to the above-described energization method (method 1), but a method using ultrasonic waves (method 2), a method using swirl flow (method 3), a pressure dissolution method (method 4), A method using a fine hole (method 5) can be arbitrarily adopted.
  • the microbubbles can be expressed by the designation or the bubble diameter, but the bubbles generated by at least one of the above-described methods 1 to 5 can also be expressed as the microbubbles.
  • FIG. 4 is a view for explaining a sample holder for a transmission electron microscope to be described later.
  • An in-liquid observation tool 45 is present at the tip of the sample holder 301.
  • FIG. 5 is a diagram for explaining the outline of the in-liquid observation tool 45.
  • the in-liquid observation tool 45 includes a substrate 41, a space 44 formed so as to penetrate the substrate 41, a first observation window 42 disposed so as to close the opening of the space 44, and a second.
  • the observation window 43 is included. At least one of the first observation window 42 and the second observation window 43 is removable.
  • the first observation window 42 and the second observation window 43 are formed of a material that is transparent to charged particles.
  • the material includes silicon nitride.
  • the specimen is supplied to the space 44 and then sealed by closing the opening with the first observation window 42. As a result, the specimen is sealed in the in-liquid observation tool 45.
  • FIG. 6 is a diagram for explaining the submerged observation tool 45 in detail from the Z direction in FIG.
  • the submerged observation tool 45 includes a base 501, a first cover 506, a second cover 508, and a third cover 510.
  • the base 501 includes a screw hole 502, a first O-ring 503, an electron beam passage portion 504, and a second O-ring 505.
  • An observation window 507 is formed in the first cover 505.
  • An observation window 509 is formed in the second cover 508.
  • the observation window 507 and the observation window 509 are a material that is transparent to the charged particle beam, and is, for example, silicon nitride.
  • the third cover 510 includes an opening 511 and a screw hole 512.
  • the electron beam passage portion 504 is made of a material that is transparent to the opening or the charged particle beam.
  • the electron beam passage 504 is inside the first O-ring 503.
  • the first O-ring 503 is inside the second O-ring 505.
  • the first cover 506 is smaller than the second cover 508, and the second cover 508 is smaller than the third cover.
  • FIG. 7 is a diagram for explaining a flow (step 105 in FIG. 1) for enclosing a sample in the in-liquid observation tool in FIG.
  • the first cover 506 is mounted on the base 501, and a sample is supplied onto the first cover 506 (step 601). More specifically, the first cover 506 covers the first O-ring 503 but is disposed inside the second O-ring 505. Further, the observation window 507 is inside the electron beam passage portion 504. In this state, the sample is supplied onto the first cover 506.
  • the second cover 508 is disposed on the first cover 506 (step 602). More specifically, the second cover 508 is disposed inside the screw hole 502. Further, at least a part of the observation window 509 is in a relationship of overlapping a part of the observation window 507.
  • the third cover 510 is disposed on the second cover 508 and fixed with the screws 601 (step 603).
  • the observation window 509 is inside the opening 511.
  • the screw hole 502 and the screw hole 512 have a matching positional relationship, and the third cover 508 can be fixed to the base 501 by the screw 601.
  • the observation window 509 has the function of the first observation window 42 in FIG. 5, and the observation window 507 has the function of the second observation window 43 in FIG. Therefore, the charged particles supplied to the observation window 509 reach the sealed specimen, and the charged particles that have passed through the specimen are emitted outside the in-liquid observation tool 45 through the observation window 507.
  • a charged particle beam image can be obtained by detecting electrons transmitted through the specimen with a detector or a camera described later.
  • Such a submerged observation tool is, for example, a container that holds a specimen in a liquid state even in a vacuum chamber of a charged particle beam apparatus, is capable of transmitting charged particle beams, and is capable of transmitting electrons from the specimen. It can be expressed that there is.
  • the submerged observation tool is not limited to the present embodiment, and any structure can be adopted.
  • In-liquid observation tools are sometimes used for so-called in-situ observation.
  • In-situ observation can be expressed as observation while applying energy to the specimen or observation that captures the change of the specimen with time.
  • the in-liquid observation tool includes an in-situ observation mechanism.
  • the in-situ observation mechanism include, for example, two or more electrodes that apply voltage to the specimen (voltage application process), a temperature control mechanism that changes the temperature of the specimen (temperature control process), and liquid or gas in the specimen.
  • At least one of a supply mechanism for supplying a medium and a circulation mechanism (circulation process) including a pipe (medium supply process) and a flow path for circulating the sample may be used.
  • FIG. 8 is a diagram for explaining the transmission electron microscope of this embodiment.
  • the electron beam irradiated from the electron gun 401 is controlled by the high voltage control unit 402 such as ON / OFF and intensity.
  • the electron beam emitted from the electron gun 401 is focused by the lens 403 and the position of the electron beam on the sample surface is adjusted by the deflection coil 404. As a result, the electron beam is irradiated to an arbitrary position on the surface of the sample 405.
  • the lens 403 and the deflection coil 404 are controlled by a lens control unit 407 and a deflection coil control unit 408, respectively.
  • the TEM image is formed on the fluorescent screen 410.
  • a TEM image is formed on the film 413 in the camera 412 below, and a TEM image can be acquired.
  • the camera 412 is controlled by a camera control unit 414.
  • the camera 412 is not limited to a camera using a film, and the camera 412 includes a digital type camera using an image pickup device exemplified by a CCD or a CMOS instead of a film.
  • the scanning image observation function (STEM function) is used.
  • the electron beam is finely focused by the lens 403 and further deflected by the deflection coil 404.
  • a desired two-dimensional area on the sample 405 is scanned by the electron beam.
  • transmitted electrons, secondary electrons, scattered electrons, and the like are generated.
  • a transmitted electron image, a secondary electron image, and a scattered electron image can be acquired.
  • the generated scattered electrons are controlled such that the scattered angle always enters the annular dark field scanning image detector 409 by controlling the scattering angle by the lens 403 under the sample.
  • the acquired image is supplied to each control unit.
  • a scan image (dark field STEM image) synchronized with the electron beam scan is displayed on the personal computer 415.
  • the control unit includes a memory storing a control algorithm, a CPU for executing the algorithm, and an I / O interface for transmitting and receiving signals.
  • the personal computer 415 includes a memory that stores images, a CPU that performs predetermined processing such as reading data from the memory and writing data to the memory, a mouse, an input unit exemplified by a keyboard, and an output unit exemplified by a display. .
  • the transmission electron microscope of this embodiment includes a bright-field scanning image detector 411 for acquiring a bright-field STEM image, an electron dose measuring device 421, an interface unit 417, an on / off switch 422, a water flow for cooling the lens body. 418, a mirror body cooling device control unit 419, and an external storage device 420 are included.
  • the electron dose measuring device 421 is for measuring the electron dose irradiated to the fluorescent screen 410. In the case of an image shot with the film 413, a desired image can be obtained by controlling the electron dose and the exposure time using the electron dose measuring device 421.
  • the camera control unit 414 controls the shutter of the camera 412.
  • the interface unit 417 connects all the control units and the personal computer 415, and includes a bus and an I / O interface.
  • the on / off switch 422 is a main power source. The device can be stopped by turning off the on / off switch 422.
  • the mirror body cooling water flow 418 is a flow path of cooling water for cooling the mirror body.
  • the mirror body cooling device control unit 419 controls the flow rate (l / min) of the cooling water.
  • the external storage device 420 is a storage medium for storing information of each control unit and the obtained image, and may be a storage medium having a larger capacity than the memory inside the personal computer 415.
  • the obtained images and moving images can be stored in at least one of the memory inside the personal computer 415 and the external storage device 420.
  • the CPU in the personal computer 415 can perform predetermined image processing on the obtained images and moving images.
  • the in-liquid observation tool 45 can be directly connected to or formed at the tip of the sample holder 301, it is mounted on the tip of the sample holder 301 via a microgrid 511 which is a collection of minute openings as shown in FIG. You can also.
  • the electron beam 801 passes through the observation window 42 and reaches the sample.
  • the transmitted electrons 802 that have passed through the specimen pass through the opening in the microgrid 511 and the observation window 43 opposite to the observation window 42. By detecting the transmitted electrons 802, a TEM image of the specimen can be acquired.
  • FIG. 10A illustrates a GUI displayed by the output unit of the personal computer 415.
  • a TEM image 902 is displayed on the GUI 901.
  • the TEM image 902 includes microbubble regions 903 and 904.
  • the operator can draw a line segment 908 from an arbitrary start point 905 to an arbitrary end point 906 of the microbubble region 903 with the pointer 907.
  • the CPU in the personal computer 415 obtains the length of the line segment 908 on the sample based on the model shown in FIG. The obtained length is displayed in window 910.
  • a similar procedure can be applied to the fine bubble area 904.
  • the coordinates of the start point 905 and the end point 906 can be obtained from selection by the pointer 907. Therefore, if L and M are known, the length of the line segment 908 on the sample can be obtained. In this way, the length of the line segment 908 on the sample can be obtained from the coordinates of the start point 905, the coordinates of the end point 906, information on the pixel size, and information on the magnification.
  • L and M are known, the length of the line segment 908 on the sample can be obtained.
  • the length of the line segment 908 on the sample can be obtained from the coordinates of the start point 905, the coordinates of the end point 906, information on the pixel size, and information on the magnification.
  • the time scale 911 can be displayed.
  • the time scale 911 means moving image capturing time.
  • An arbitrary imaging time can be specified by moving the bar 913 in the direction of the arrow 912 with the pointer 907.
  • the CPU reads a TEM image at the designated time from the memory and displays it on the GUI 901.
  • the operator can evaluate the size of the microbubbles at an arbitrary time.
  • the microbubble evaluation method is not limited to the above method.
  • the process of obtaining the dimension of microbubbles can be expressed as a measurement process of obtaining the dimension of a predetermined region in the charged particle image, for example.
  • the ionic liquid by using the ionic liquid, it is possible to check bubbles in the liquid, for example, microbubbles. More specifically, the microbubbles in the liquid can be confirmed without freezing the specimen. And it becomes possible by using this image to evaluate the dimension of the microbubble in a liquid.
  • hydrophilic ionic liquids include tetrafluoroboric acid 1-ethyl-3-methylimidazolium, trifluoromethanesulfonic acid 1-ethyl-3-methylimidazolium, tetrafluoroboric acid 1-butyl-3-methylimidazole 1-butyl-3-methylimidazolium bromide, trifluoromethanesulfonic acid, 1-hexyl-3-methylimidazolium bromide, 1-hexyl-3-methylimidazolium chloride, 1-decyl-3-methylimidazolium chloride, etc. Is mentioned.
  • hydrophobic ionic liquid examples include 1-butyl-3-methylimidazolium bis (trifluoromethanesulfonyl) imide (BMI-TFSI).
  • the present invention is not limited to the embodiments.
  • the steps in FIGS. 1 and 6 are not necessarily in an essential relationship.
  • the configuration of the charged particle beam apparatus is not limited to FIG. It is also within the scope of the present disclosure to acquire a moving image by continuously acquiring images exemplified by the TEM image.
  • the present invention is widely applicable to specimen preparation and bubble evaluation.
  • the form of applying the ionic liquid to the liquid that will contain bubbles is within the scope of the disclosure herein.
  • the idea that an observer can discriminate the boundary between a predetermined region in a liquid image that will contain bubbles and the surrounding region is also within the scope of the disclosure of this specification.

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Abstract

標本を観察する装置としては走査型電子顕微鏡や透過型電子顕微鏡に例示されるいわゆる荷電粒子線装置が考えられる。本願の発明者らが鋭意検討したところ、気泡を発生させる処理を施した液体の荷電粒子線像には作業者が微小気泡を特定できる程度のコントラストが現れないという課題を見出した。本願の発明者らは、気泡を発生させる処理を施した液体とイオン液体とを含む標本の荷電粒子線像には作業者が微小気泡を特定できる程度のコントラストが現れる現象を見出した。本発明はこの現象を利用することを１つの特徴とする。本発明によれば、液中の気泡、例えば微小気泡を確認することが可能となる。

Description

標本の観察方法
　本発明は標本の観察方法に関する。特に本発明はイオン液体、及び荷電粒子線装置を使用した観察方法に関する。例えば、本発明はイオン液体を使用して液体を観察する方法に関する。
　近年、気泡、特に微小な径を有する気泡（以降、微小気泡と称する）がその産業応用範囲の広さから注目されている。その応用範囲は非常に広く、例えば、殺菌、洗浄、植物の成長促進といった用途が挙げられる。気泡の作成手法は様々な手法が提唱されており、その一例としては特許文献１が挙げられる。
特開２０１１－１５７５８０
　標本を観察する装置としては走査型電子顕微鏡や透過型電子顕微鏡に例示されるいわゆる荷電粒子線装置が考えられる。本願の発明者らが鋭意検討したところ、気泡を発生させる処理を施した液体の荷電粒子線像には作業者が気泡、例えば微小気泡を特定できる程度のコントラストが現れないという課題を見出した。
　本願の発明者らが鋭意検討した結果、気泡を発生させる処理を施した液体とイオン液体とを含む標本の荷電粒子線像には作業者が気泡、例えば微小気泡を特定できる程度のコントラストが現れる現象を見出した。本発明はこの現象を利用することを１つの特徴とする。
　例えば、本発明は気泡を発生させる処理を施した液体とイオン液体とを含む標本を荷電粒子線装置、例えば電子顕微鏡で観察することを１つの特徴とする。
　本発明によれば、液中の気泡、例えば微小気泡を確認することが可能となる。例えば、本発明によれば液体標本を凍結させることなく微小気泡を確認することが可能となる。例えば、本発明を利用し動画を撮影するなら、微小気泡の時間に対する変化を分かりやすく観察することが可能となる。
実施例１のフローチャート。 イオン液体と微小気泡との相互作用を説明する図。 微小気泡発生装置を説明する図。 サンプルホルダ３０１を説明する図。 液中観察ツールの概略図。 液中観察ツールの詳細を説明する図。 液中観察ツールに標本を封入するフロー。 透過型電子顕微鏡を説明する図。 試料４０５として液中観察ツール４５を搭載したマイクログリッド５１１を観察する場合を説明する図。 表示画面を説明する図。
　以降、本発明の実施例を図面を用いて説明する。以降の説明は例示である。以降の説明から任意の特徴を選択すること、削除すること、他の特徴と置換すること、他の特徴と組み合わせることも本明細書の開示の範囲内である。
　図１は本実施例のフローチャートを説明する図である。まず、溶媒（例えば超純水）と電解質とを混合し、攪拌する（ステップ１０１）。攪拌は作業者が手動で行っても良いし、攪拌機を使用してもよい。
　次に、ステップ１０１の結果物に対して、所定の処理を行う。この所定の処理は、微小気泡発生処理と称呼することができる。微小気泡発生処理は後述する微小気泡発生装置にステップ１０１の結果物を投入し、電圧を印加することで行う（ステップ１０２）。ステップ１０２により超純水と電解質との混合液中には気泡、例えば微小気泡が含まれることになる。以降、ステップ１０２の結果物を微小気泡水と称する。
　微小気泡は例えばファインバブル、ウルトラファインバブル、マイクロバブル、ナノバブル、マイクロナノバブルと称呼される場合もある。ファインバブルとは、例えば気泡径が数１０ミクロン以下の気泡と表現することができ、より具体的には例えば気泡径が1ミクロン以下の気泡と表現することもできる。特に気泡径が１ミクロン以下のファインバブルはウルトラファインバブルと表現することもできる。
　次に、イオン液体を溶媒（例えば超純水）で希釈する（ステップ１０３）。ここでイオン液体について説明する。イオン液体とは例えば、常温で液状であり、イオンを含む液体と表現することができる。イオン液体は真空中で全く蒸発しないか、ほとんど蒸発しない。イオン液体は例えばカチオン、及びアニオンを含む場合もある。イオン液体は親水性である場合もあれば、疎水性である場合もある。なお、ステップ１０３はステップ１０１、１０２と並行して行っても良い。
　次に、微小気泡水とステップ１０３によって希釈されたイオン液体とを混合し、標本を作成する（ステップ１０４）。
　次に、ステップ１０４で作成した標本を液中観察ツール（詳細は後述）に封入する（ステップ１０５）。
　次に、標本を封入した液中観察ツールをサンプルホルダに搭載し、荷電粒子線装置のチャンバーに投入し、画像を得る（ステップ１０６）。荷電粒子線装置としては、例えば、透過型電子顕微鏡（以降、ＴＥＭと称する）が考えられる。また、走査透過型電子顕微鏡（以降、ＳＴＥＭと称する）、走査型電子顕微鏡（以降、ＳＥＭと称する）といったその他の荷電粒子線装置も使用し得る。ステップ１０６は例えば、気泡を発生させる処理を施した液体とイオン液体とを含む標本の荷電粒子線像を得る撮像工程と表現することができる。
　イオン液体を使用しない標本のＴＥＭ像では微小気泡を示す領域は現れない。一方、イオン液体を使用した標本のＴＥＭ像中には微小気泡を示す領域が現れる。この現象は再現性を有する。この領域はその周囲よりも暗い領域であり、その形状は実質的な点や円である。このようにイオン液体を使用した標本のＴＥＭ像で微小気泡を示す領域が確認できる理由は、イオン液体と微小気泡との相互作用の結果、イオン液体と他の物質との分子量の大小がコントラストの差として現れるからである。イオン液体と微小気泡との相互作用とは、例えば図２に示すように標本２１の内部で微小気泡２２の表面にイオン液体２３が吸着する場合（図２(a)）、及びイオン液体２３が微小気泡２２を置換する場合（図２(b)）の少なくとも１つが考えられる。
　ここで、ステップ１０１の詳細について説明する。電解質は炭酸イオン、重炭酸イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、塩化物イオン、過塩素酸イオン、水酸イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンの少なくとも１つを含みえるが、その他の公知の電解質も採用し得る。その濃度範囲は任意の範囲を採用し得る。一例として、濃度範囲は０．１～１０００mＭである場合もある。
　次に、ステップ１０２の詳細について説明する。図３はファインバブル発生装置を説明する図である。ファインバブル発生装置はステップ１０１の結果物である電解液を投入するための容器２０８、陽極２０２、陰極２０４、イオン交換膜２０５、ガス放出口２０６、取出口２０７、電源２０９を含む。
　イオン交換膜２０５によって容器２０８は２室構造となり、電解液は電解液２０１、電解液２０３へ分割される。陽極２０２を含む側を陽極室と、陰極２０４を含む側を陰極室と表現することができる。陽極室、陰極室は電解液を供給するための供給口を含む。イオン交換膜２０５は任意の材料を採用し得る。その一例としては、パーフルオロスルホン酸系材料を採用し得る。
　陽極２０２は任意の材料を採用し得る。その一例としては、ホウ素をドープした導電性ダイヤモンド触媒を採用し得る。
　陰極２０４は任意の材料を採用し得る。その一例としては、白金を採用し得る。
　このような２室構造に対して通電を行うことによって、所定粒径の微小気泡、例えばオゾン微細気泡が陽極室に発生する。陰極室側では、水素ガスが発生する。微小気泡を含む電解液、つまり前述した微小気泡水は取出口２０７から取出される。
　微小気泡の生成方法は上記の通電方式(方式1)に限定されず、超音波を利用した方式(方式２)、旋回流を利用した方式(方式３)、加圧溶解方式(方式４)、微細孔を利用した方式(方式５)を任意に採用し得る。微小気泡は上述したように称呼や気泡径によって表現することが可能であるが、上述した方式１乃至５の少なくとも１つによって生成された気泡を微小気泡と表現することもできる。　次に標本を封入するための液中観察ツールについて説明する。図４は後述する透過型電子顕微鏡用のサンプルホルダを説明する図である。サンプルホルダ３０１の先端に液中観察ツール４５は存在する。
　図５は液中観察ツール４５の概要を説明する図である。図４(a)に示すように液中観察ツール４５は基板４１、基板４１を貫通するよう形成された空間４４、空間４４の開口を塞ぐよう配置される第１の観察窓４２、及び第２の観察窓４３を含む。第１の観察窓４２、及び第２の観察窓４３の少なくとも一つは取り外し可能ある。また、第１の観察窓４２、及び第２の観察窓４３は荷電粒子に対して透明な材料で形成される。例えば、その材料としては窒化珪素が挙げられる。図４(b)に示すように標本は空間４４に供給され、その後、第１の観察窓４２で開口を塞ぐことで封止される。これにより、標本は液中観察ツール４５内に封入されることになる。
　図６は液中観察ツール４５を図５のZ方向から詳細に説明する図である。液中観察ツール４５はベース５０１、第１のカバー５０６、第２のカバー５０８、及び第３のカバー５１０を含む。ベース５０１はネジ穴５０２、第１のＯリング５０３、電子線通過部５０４、及び第２のＯリング５０５を含む。第１のカバー５０５には観察窓５０７が形成される。第２のカバー５０８には観察窓５０９が形成される。観察窓５０７、及び観察窓５０９は荷電粒子線に対して透明な材料であり、例えば窒化珪素である。第３のカバー５１０は、開口５１１、及びネジ穴５１２を含む。電子線通過部５０４は開口、又は荷電粒子線に対して透明な材料である。
　第１のＯリング５０３の内側に電子線通過部５０４はある。第１のＯリング５０３は第２のＯリング５０５の内側にある。第１のカバー５０６は第２のカバー５０８より小さく、第２のカバー５０８は第３のカバーより小さい。
　図７は図６の液中観察ツールに標本を封入するフロー(図１のステップ１０５)を説明する図である。まず、ベース５０１に第１のカバー５０６を搭載し、第１のカバー５０６の上に標本を供給する（ステップ６０１）。より具体的には、第１のカバー５０６は第１のＯリング５０３は覆うが、第２のＯリング５０５の内側にあるよう配置される。さらに、観察窓５０７は電子線通過部５０４の内側にある。この状態で標本は第１のカバー５０６上に供給される。
　次に、第１のカバー５０６上に第２のカバー５０８を配置する（ステップ６０２）。より具体的には、第２のカバー５０８はネジ穴５０２の内側にあるよう配置される。さらに少なくとも観察窓５０９の一部の投影は観察窓５０７の一部と重なる関係にある。
　次に、第２のカバー５０８上に第３のカバー５１０を配置し、ネジ６０１で固定する（ステップ６０３）。この時、観察窓５０９は開口５１１の内側にある。ネジ穴５０２とネジ穴５１２は一致する位置関係にあり、ネジ６０１によってベース５０１に第３のカバー５０８を固定することが可能となる。
　観察窓５０９が図５の第１の観察窓４２、観察窓５０７が図５の第２の観察窓４３の機能を有することになる。よって、観察窓５０９へ供給された荷電粒子は封入された標本に到達し、標本を透過した荷電粒子は観察窓５０７を経由して液中観察ツール４５の外に射出される。この標本を透過した電子を後述する検出器やカメラで検出することで荷電粒子線画像を得ることができる。
　このような液中観察ツールは例えば、荷電粒子線装置の真空チャンバー内にあっても標本を液体のまま保持し、荷電粒子線が透過可能であり、前記標本からの電子が透過可能な容器であると表現することができる。液中観察ツールは本実施例に限定されず、任意の構造を採用し得る。
　液中観察ツールはいわゆるその場観察(in-situ観察)に利用される場合もある。in-situ観察は標本にエネルギを印加しながら行う観察や標本の時間に対する変化を捕捉する観察と表現することができる。in-situ観察を行う場合、液中観察ツールはその場観察機構を含む。その場観察機構の例としては、例えば標本に電圧を印加する２つ以上の電極（電圧印加工程）、標本の温度を変更する温調機構（温度制御工程）、標本に液体やガスに例示される媒体を供給する供給源、及び配管（媒体供給工程）、及び標本を循環させるための流路を含む循環機構 (循環工程)の少なくとも１つが使用され得る。電圧印加工程、温度制御工程、媒体供給工程の少なくとも１つであれば微小気泡の化学的な変化を観察することが可能となる。循環工程によれば微小気泡の移動を観察することが可能となる。in-situ観察を行う場合、微小気泡像を動画として取得するなら、微小気泡の変化は作業者により理解しやすくなる。
　次に、標本を観察するための観察装置について説明する。観察装置の一例としては、荷電粒子線装置、例えば、透過型電子顕微鏡が挙げられる。図８は本実施例の透過型電子顕微鏡を説明する図である。
　電子銃４０１から照射される電子ビームは、高電圧制御部４０２によりＯＮ／ＯＦＦや強度などの制御が行われる。電子銃４０１から照射された電子ビームは、レンズ４０３によって集束され、偏向コイル４０４によって電子ビームの試料面上での位置を調整される。その結果、試料４０５表面の任意の位置に電子ビームが照射されることになる。
　レンズ４０３および偏向コイル４０４はそれぞれレンズ制御部４０７および偏向コイル制御部４０８によって制御される。
　ＴＥＭ像は蛍光板４１０上に結像される。この蛍光板４１０を電子ビームが完全にあたらない位置に移動させることにより、その下のカメラ４１２内のフィルム４１３上にＴＥＭ像が結像され、ＴＥＭ像を取得することができる。このカメラ４１２はカメラ制御部４１４によって制御されている。カメラ４１２はフィルムを使用したカメラに限定されず、カメラ４１２はフィルムの代わりにＣＣＤやＣＭＯＳに例示される撮像素子を利用したデジタルタイプのカメラも含む。
　次に、走査像観察機能(ＳＴＥＭ機能)を使用する場合について説明する。この場合、電子ビームは、レンズ４０３によって細く集束され、更に偏向コイル４０４によって偏向される。その結果、試料４０５上の所望の二次元領域が電子ビームによって走査される。試料４０５へ電子ビームを照射すると透過電子、二次電子や散乱電子等が発生する。試料を透過した透過電子、試料４０５から発生した二次電子や散乱電子等を検出器で検出することで、透過電子像、二次電子像、散乱電子像を取得することができる。このとき、発生した散乱電子は、試料下部にあるレンズ４０３によって散乱角を制御され常に円環状の暗視野走査像検出器４０９に散乱電子が入るように調整される。取得された像はそれぞれの制御部に供給される。電子ビームの走査に同期した走査像(暗視野ＳＴＥＭ像)はパーソナルコンピュータ４１５に表示される。
　なお、制御部は制御アルゴリズムを保存したメモリ、アルゴリズムを実行するためのＣＰＵ、信号を送受信するＩ/Ｏインターフェースを含む。パーソナルコンピュータ４１５は画像を保存するメモリ、メモリからのデータの読み出しやメモリへのデータの書き込みといった所定の処理を行うＣＰＵ、マウス、キーボードに例示される入力部、ディスプレイに例示される出力部を含む。
　その他、本実施例の透過型電子顕微鏡は、明視野ＳＴＥＭ像を取得するための明視野走査像検出器４１１、電子線量測定器４２１、インターフェース部４１７、on/offスイッチ４２２、鏡体冷却用水流４１８、鏡体冷却装置制御部４１９、外部記憶装置４２０を含む。電子線量測定器４２１は蛍光板４１０に照射された電子線量を計測するためのものである。フィルム４１３で撮影する画像は場合、電子線量測定器４２１を使用し、電子線量と露光時間を制御することで、所望の画像を得ることが可能となる。カメラ制御部４１４はカメラ４１２のシャッターを制御するものである。インターフェース部４１７は、全ての制御部とパーソナルコンピュータ４１５とを繋ぐものであり、バスやＩ／Ｏインターフェースを含む。on/offスイッチ４２２はメイン電源である。on/offスイッチ４２２をoffにすることで、装置を停止させることができる。鏡体冷却用水流４１８は鏡体を冷やすための冷却水の流路である。鏡体冷却装置制御部４１９は冷却水の流量(l/min)を制御するものである。
　外部記憶装置４２０は各制御部の情報、得られた画像を保存するための記憶媒体あり、パーソナルコンピュータ４１５内部のメモリよりも大容量の記憶媒体である場合もある。得られた画像、動画はパーソナルコンピュータ内４１５内部のメモリ、及び外部記憶装置４２０の少なくとも１つに保存することができる。パーソナルコンピュータ４１５内のＣＰＵは得られた画像、動画に所定の画像処理を行うことができる。
　液中観察ツール４５はサンプルホルダ３０１の先端に直接接続、又は形成することができるが、図９に示すように微小な開口の集合であるマイクログリッド５１１を介してサンプルホルダ３０１の先端に搭載することもできる。電子線８０１は観察窓４２を通過し、標本へ到達する。標本を透過した透過電子８０２はマイクログリッド５１１中の開口、及び観察窓４２の反対側の観察窓４３を通過する。この透過電子８０２を検出することで標本のＴＥＭ像を取得することが可能となる。
　次に、微小気泡の寸法の評価について説明する。図１０（a）はパーソナルコンピュータ４１５の出力部によって表示されるＧＵＩを説明する図である。ＧＵＩ９０１にはＴＥＭ像９０２が表示される。本実施例では、例えばＴＥＭ像９０２には微小気泡領域９０３、及び９０４が含まれるものとして説明する。作業者はポインタ９０７によって微小気泡領域９０３の任意の始点９０５から任意の終点９０６までの線分９０８を描画することができる。パーソナルコンピュータ４１５内のＣＰＵは図１０(b)のモデルに基づき線分９０８の標本上での長さを得る。得られた長さはウィンドウ９１０に表示される。同様の手順はファインバブル領域９０４に適用することができる。始点９０５、終点９０６の座標はポインタ９０７による選択から得ることができる。よって、Ｌ、Ｍを既知としておけば線分９０８の標本上での長さを得ることができる。このように、始点９０５の座標、終点９０６の座標、画素寸法に関する情報、倍率に関する情報から線分９０８の標本上での長さを得ることができる。もちろん図１０(b)以外のモデルを利用することも本明細書の開示の範囲内である。
　また、この手順を行わなくてもＴＥＭ像に付属するスケール９１２と微小気泡領域９０３、及び９０４とを作業者が目視で比較することでもファインバブルの寸法を得ることが可能である。
　なお、動画を取得した場合は、タイムスケール９１１を表示することができる。タイムスケール９１１は動画撮像時間を意味している。ポインタ９０７でバー９１３を矢印９１２の方向へ移動することで、任意の撮像時刻を指定することができる。任意の撮像時刻が指定されるとＣＰＵはメモリから指定された時刻のＴＥＭ像を読み出し、ＧＵＩ９０１上に表示する。この動作により作業者は任意の時刻の微小気泡の寸法を評価することができる。もちろん、微小気泡の評価手法は上記の手法に限定されない。このように微小気泡の寸法を得る工程は例えば、荷電粒子像中の所定の領域の寸法を得る計測工程と表現することができる。
　このように、本実施例ではイオン液体を利用することによって、液中の気泡、例えば微小気泡を確認することが可能となる。より具体的には、標本を凍結させることなく、液中の微小気泡を確認可能な状態とすることができる。そして、この画像を利用することによって液中の微小気泡の寸法を評価することが可能となる。
　ここで、イオン液体のバリエーションについて説明する。親水性のイオン液体の具体例として、テトラフルオロホウ酸　１－エチル－３－メチルイミダゾリウム、トリフルオロメタンスルホン酸　１－エチル－３－メチルイミダゾリウム、テトラフルオロホウ酸　１－ブチル－３－メチルイミダゾリウム、トリフルオロメタンスルホン酸　１－ブチル－３－メチルイミダゾリウム、臭化　１－ヘキシル－３－メチルイミダゾリウム、塩化　１－ヘキシル－３－メチルイミダゾリウム若しくは塩化　１－デシル－３－メチルイミダゾリウム等が挙げられる。
　疎水性のイオン液体としては、１-ブチル-３-メチルイミダゾリウム　ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミド（ＢＭＩ－ＴＦＳＩ）が挙げられる。
　以上、本発明の実施例について説明したが、本発明は実施例に限定されない。図１、図６の各ステップは全ステップが必須の関係にあるわけではない。荷電粒子線装置の構成は図８に限定されない。ＴＥＭ像に例示される画像を連続的に取得することで動画を取得することも本明細書の開示の範囲内である。本発明は標本の作製や気泡の評価に幅広く適用可能である。気泡を含むであろう液体にイオン液体を適用する形態は本明細書の開示の範囲内である。気泡を含むであろう液体の画像中の所定の領域とその周囲の領域との境界を観察者が判別可能とする思想も本明細書の開示の範囲内である。
２０１・・・電解液
２０２・・・陽極
２０３・・・電解液
２０４・・・陰極
２０５・・・イオン交換膜
２０６・・・ガス放出口、
２０７・・・取出口

Claims (13)

  1. 　気泡を発生させる処理を施した液体とイオン液体とを含む標本の荷電粒子線像を得る撮像工程を含むことを特徴とする標本の観察方法。
  2. 　請求項１に記載の観察方法において、
    　前記標本を荷電粒子に対して透明な部分を含む容器に封入する封入工程を含み、
    　前記封入工程は前記撮像工程の前に行われることを特徴とする標本の観察方法。
  3. 　請求項１に記載の観察方法において、
    　前記イオン液体はカチオン、及びアニオンを含むことを特徴とする標本の観察方法。
  4. 　請求項１に記載の観察方法において、
    　前記気泡はファインバブルであることを特徴とする標本の観察方法。
  5. 　請求項１に記載の観察方法において、
    　前記荷電粒子線像中の所定の領域の寸法を得る計測工程を含み、
    　前記所定の領域はその周囲に比べて暗いことを特徴とする標本の観察方法。
  6. 　請求項１に記載の観察方法において、
    　前記撮像工程は前記標本の動画を得る動画取得工程を含むことを特徴とする標本の観察方法。
  7. 　請求項６に記載の観察方法において、
    　前記撮像工程は前記標本のその場観察工程を含むことを特徴とする標本の観察方法。
  8. 　請求項６に記載の観察方法において、
    　前記その場観察は前記標本に電圧を印加する電圧印加工程を含む標本の観察方法。
  9. 　請求項６に記載の観察方法において、
    　前記その場観察は前記標本の温度を変更する温度制御工程を含む標本の観察方法。
  10. 　請求項６に記載の観察方法において、
    　前記その場観察は前記標本へ媒体を供給する媒体供給工程を含む標本の観察方法。
  11. 　請求項６に記載の観察方法において、
    　前記その場観察は前記標本を循環させる循環工程を含む標本の観察方法。
  12. 　請求項１に記載の観察方法において、
    　前記荷電粒子線像は透過電子像であることを特徴とする標本の観察方法。
  13. 　請求項１に記載の観察方法において、
    　前記荷電粒子線像は走査電子顕微鏡像であることを特徴とする標本の観察方法。
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