JP6335411B2 - 標本の観察方法 - Google Patents

Description

本発明は標本の観察方法に関する。特に本発明はイオン液体、及び荷電粒子線装置を使用した観察方法に関する。例えば、本発明はイオン液体を使用して液体を観察する方法に関する。

近年、気泡、特に微小な径を有する気泡（以降、微小気泡と称する）がその産業応用範囲の広さから注目されている。その応用範囲は非常に広く、例えば、殺菌、洗浄、植物の成長促進といった用途が挙げられる。気泡の作成手法は様々な手法が提唱されており、その一例としては特許文献１が挙げられる。

特開２０１１−１５７５８０

標本を観察する装置としては走査型電子顕微鏡や透過型電子顕微鏡に例示されるいわゆる荷電粒子線装置が考えられる。本願の発明者らが鋭意検討したところ、気泡を発生させる処理を施した液体の荷電粒子線像には作業者が気泡、例えば微小気泡を特定できる程度のコントラストが現れないという課題を見出した。

本願の発明者らが鋭意検討した結果、気泡を発生させる処理を施した液体とイオン液体とを含む標本の荷電粒子線像には作業者が気泡、例えば微小気泡を特定できる程度のコントラストが現れる現象を見出した。本発明はこの現象を利用することを１つの特徴とする。

例えば、本発明は気泡を発生させる処理を施した液体とイオン液体とを含む標本を荷電粒子線装置、例えば電子顕微鏡で観察することを１つの特徴とする。

本発明によれば、液中の気泡、例えば微小気泡を確認することが可能となる。例えば、本発明によれば液体標本を凍結させることなく微小気泡を確認することが可能となる。例えば、本発明を利用し動画を撮影するなら、微小気泡の時間に対する変化を分かりやすく観察することが可能となる。

実施例１のフローチャート。 イオン液体と微小気泡との相互作用を説明する図。 微小気泡発生装置を説明する図。 サンプルホルダ３０１を説明する図。 液中観察ツールの概略図。 液中観察ツールの詳細を説明する図。 液中観察ツールに標本を封入するフロー。 透過型電子顕微鏡を説明する図。 試料４０５として液中観察ツール４５を搭載したマイクログリッド５１１を観察する場合を説明する図。 表示画面を説明する図。

以降、本発明の実施例を図面を用いて説明する。以降の説明は例示である。以降の説明から任意の特徴を選択すること、削除すること、他の特徴と置換すること、他の特徴と組み合わせることも本明細書の開示の範囲内である。

図１は本実施例のフローチャートを説明する図である。まず、溶媒（例えば超純水）と電解質とを混合し、攪拌する（ステップ１０１）。攪拌は作業者が手動で行っても良いし、攪拌機を使用してもよい。

次に、ステップ１０１の結果物に対して、所定の処理を行う。この所定の処理は、微小気泡発生処理と称呼することができる。微小気泡発生処理は後述する微小気泡発生装置にステップ１０１の結果物を投入し、電圧を印加することで行う（ステップ１０２）。ステップ１０２により超純水と電解質との混合液中には気泡、例えば微小気泡が含まれることになる。以降、ステップ１０２の結果物を微小気泡水と称する。

微小気泡は例えばファインバブル、ウルトラファインバブル、マイクロバブル、ナノバブル、マイクロナノバブルと称呼される場合もある。ファインバブルとは、例えば気泡径が数１０ミクロン以下の気泡と表現することができ、より具体的には例えば気泡径が1ミクロン以下の気泡と表現することもできる。特に気泡径が１ミクロン以下のファインバブルはウルトラファインバブルと表現することもできる。

次に、イオン液体を溶媒（例えば超純水）で希釈する（ステップ１０３）。ここでイオン液体について説明する。イオン液体とは例えば、常温で液状であり、イオンを含む液体と表現することができる。イオン液体は真空中で全く蒸発しないか、ほとんど蒸発しない。イオン液体は例えばカチオン、及びアニオンを含む場合もある。イオン液体は親水性である場合もあれば、疎水性である場合もある。なお、ステップ１０３はステップ１０１、１０２と並行して行っても良い。

次に、微小気泡水とステップ１０３によって希釈されたイオン液体とを混合し、標本を作成する（ステップ１０４）。

次に、ステップ１０４で作成した標本を液中観察ツール（詳細は後述）に封入する（ステップ１０５）。

次に、標本を封入した液中観察ツールをサンプルホルダに搭載し、荷電粒子線装置のチャンバーに投入し、画像を得る（ステップ１０６）。荷電粒子線装置としては、例えば、透過型電子顕微鏡（以降、ＴＥＭと称する）が考えられる。また、走査透過型電子顕微鏡（以降、ＳＴＥＭと称する）、走査型電子顕微鏡（以降、ＳＥＭと称する）といったその他の荷電粒子線装置も使用し得る。ステップ１０６は例えば、気泡を発生させる処理を施した液体とイオン液体とを含む標本の荷電粒子線像を得る撮像工程と表現することができる。

イオン液体を使用しない標本のＴＥＭ像では微小気泡を示す領域は現れない。一方、イオン液体を使用した標本のＴＥＭ像中には微小気泡を示す領域が現れる。この現象は再現性を有する。この領域はその周囲よりも暗い領域であり、その形状は実質的な点や円である。このようにイオン液体を使用した標本のＴＥＭ像で微小気泡を示す領域が確認できる理由は、イオン液体と微小気泡との相互作用の結果、イオン液体と他の物質との分子量の大小がコントラストの差として現れるからである。イオン液体と微小気泡との相互作用とは、例えば図２に示すように標本２１の内部で微小気泡２２の表面にイオン液体２３が吸着する場合（図２(a)）、及びイオン液体２３が微小気泡２２を置換する場合（図２(b)）の少なくとも１つが考えられる。

ここで、ステップ１０１の詳細について説明する。電解質は炭酸イオン、重炭酸イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、塩化物イオン、過塩素酸イオン、水酸イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンの少なくとも１つを含みえるが、その他の公知の電解質も採用し得る。その濃度範囲は任意の範囲を採用し得る。一例として、濃度範囲は０．１〜１０００mＭである場合もある。

次に、ステップ１０２の詳細について説明する。図３はファインバブル発生装置を説明する図である。ファインバブル発生装置はステップ１０１の結果物である電解液を投入するための容器２０８、陽極２０２、陰極２０４、イオン交換膜２０５、ガス放出口２０６、取出口２０７、電源２０９を含む。

イオン交換膜２０５によって容器２０８は２室構造となり、電解液は電解液２０１、電解液２０３へ分割される。陽極２０２を含む側を陽極室と、陰極２０４を含む側を陰極室と表現することができる。陽極室、陰極室は電解液を供給するための供給口を含む。イオン交換膜２０５は任意の材料を採用し得る。その一例としては、パーフルオロスルホン酸系材料を採用し得る。

陽極２０２は任意の材料を採用し得る。その一例としては、ホウ素をドープした導電性ダイヤモンド触媒を採用し得る。

陰極２０４は任意の材料を採用し得る。その一例としては、白金を採用し得る。

このような２室構造に対して通電を行うことによって、所定粒径の微小気泡、例えばオゾン微細気泡が陽極室に発生する。陰極室側では、水素ガスが発生する。微小気泡を含む電解液、つまり前述した微小気泡水は取出口２０７から取出される。

微小気泡の生成方法は上記の通電方式(方式1)に限定されず、超音波を利用した方式(方式２)、旋回流を利用した方式(方式３)、加圧溶解方式(方式４)、微細孔を利用した方式(方式５)を任意に採用し得る。微小気泡は上述したように称呼や気泡径によって表現することが可能であるが、上述した方式１乃至５の少なくとも１つによって生成された気泡を微小気泡と表現することもできる。 次に標本を封入するための液中観察ツールについて説明する。図４は後述する透過型電子顕微鏡用のサンプルホルダを説明する図である。サンプルホルダ３０１の先端に液中観察ツール４５は存在する。

図５は液中観察ツール４５の概要を説明する図である。図４(a)に示すように液中観察ツール４５は基板４１、基板４１を貫通するよう形成された空間４４、空間４４の開口を塞ぐよう配置される第１の観察窓４２、及び第２の観察窓４３を含む。第１の観察窓４２、及び第２の観察窓４３の少なくとも一つは取り外し可能ある。また、第１の観察窓４２、及び第２の観察窓４３は荷電粒子に対して透明な材料で形成される。例えば、その材料としては窒化珪素が挙げられる。図４(b)に示すように標本は空間４４に供給され、その後、第１の観察窓４２で開口を塞ぐことで封止される。これにより、標本は液中観察ツール４５内に封入されることになる。

図６は液中観察ツール４５を図５のZ方向から詳細に説明する図である。液中観察ツール４５はベース５０１、第１のカバー５０６、第２のカバー５０８、及び第３のカバー５１０を含む。ベース５０１はネジ穴５０２、第１のＯリング５０３、電子線通過部５０４、及び第２のＯリング５０５を含む。第１のカバー５０５には観察窓５０７が形成される。第２のカバー５０８には観察窓５０９が形成される。観察窓５０７、及び観察窓５０９は荷電粒子線に対して透明な材料であり、例えば窒化珪素である。第３のカバー５１０は、開口５１１、及びネジ穴５１２を含む。電子線通過部５０４は開口、又は荷電粒子線に対して透明な材料である。

第１のＯリング５０３の内側に電子線通過部５０４はある。第１のＯリング５０３は第２のＯリング５０５の内側にある。第１のカバー５０６は第２のカバー５０８より小さく、第２のカバー５０８は第３のカバーより小さい。

図７は図６の液中観察ツールに標本を封入するフロー(図１のステップ１０５)を説明する図である。まず、ベース５０１に第１のカバー５０６を搭載し、第１のカバー５０６の上に標本を供給する（ステップ６０１）。より具体的には、第１のカバー５０６は第１のＯリング５０３は覆うが、第２のＯリング５０５の内側にあるよう配置される。さらに、観察窓５０７は電子線通過部５０４の内側にある。この状態で標本は第１のカバー５０６上に供給される。

次に、第１のカバー５０６上に第２のカバー５０８を配置する（ステップ６０２）。より具体的には、第２のカバー５０８はネジ穴５０２の内側にあるよう配置される。さらに少なくとも観察窓５０９の一部の投影は観察窓５０７の一部と重なる関係にある。

次に、第２のカバー５０８上に第３のカバー５１０を配置し、ネジ６０１で固定する（ステップ６０３）。この時、観察窓５０９は開口５１１の内側にある。ネジ穴５０２とネジ穴５１２は一致する位置関係にあり、ネジ６０１によってベース５０１に第３のカバー５０８を固定することが可能となる。

観察窓５０９が図５の第１の観察窓４２、観察窓５０７が図５の第２の観察窓４３の機能を有することになる。よって、観察窓５０９へ供給された荷電粒子は封入された標本に到達し、標本を透過した荷電粒子は観察窓５０７を経由して液中観察ツール４５の外に射出される。この標本を透過した電子を後述する検出器やカメラで検出することで荷電粒子線画像を得ることができる。

このような液中観察ツールは例えば、荷電粒子線装置の真空チャンバー内にあっても標本を液体のまま保持し、荷電粒子線が透過可能であり、前記標本からの電子が透過可能な容器であると表現することができる。液中観察ツールは本実施例に限定されず、任意の構造を採用し得る。

液中観察ツールはいわゆるその場観察(in-situ観察)に利用される場合もある。in-situ観察は標本にエネルギを印加しながら行う観察や標本の時間に対する変化を捕捉する観察と表現することができる。in-situ観察を行う場合、液中観察ツールはその場観察機構を含む。その場観察機構の例としては、例えば標本に電圧を印加する２つ以上の電極（電圧印加工程）、標本の温度を変更する温調機構（温度制御工程）、標本に液体やガスに例示される媒体を供給する供給源、及び配管（媒体供給工程）、及び標本を循環させるための流路を含む循環機構 (循環工程)の少なくとも１つが使用され得る。電圧印加工程、温度制御工程、媒体供給工程の少なくとも１つであれば微小気泡の化学的な変化を観察することが可能となる。循環工程によれば微小気泡の移動を観察することが可能となる。in-situ観察を行う場合、微小気泡像を動画として取得するなら、微小気泡の変化は作業者により理解しやすくなる。

次に、標本を観察するための観察装置について説明する。観察装置の一例としては、荷電粒子線装置、例えば、透過型電子顕微鏡が挙げられる。図８は本実施例の透過型電子顕微鏡を説明する図である。

電子銃４０１から照射される電子ビームは、高電圧制御部４０２によりＯＮ／ＯＦＦや強度などの制御が行われる。電子銃４０１から照射された電子ビームは、レンズ４０３によって集束され、偏向コイル４０４によって電子ビームの試料面上での位置を調整される。その結果、試料４０５表面の任意の位置に電子ビームが照射されることになる。

レンズ４０３および偏向コイル４０４はそれぞれレンズ制御部４０７および偏向コイル制御部４０８によって制御される。

ＴＥＭ像は蛍光板４１０上に結像される。この蛍光板４１０を電子ビームが完全にあたらない位置に移動させることにより、その下のカメラ４１２内のフィルム４１３上にＴＥＭ像が結像され、ＴＥＭ像を取得することができる。このカメラ４１２はカメラ制御部４１４によって制御されている。カメラ４１２はフィルムを使用したカメラに限定されず、カメラ４１２はフィルムの代わりにＣＣＤやＣＭＯＳに例示される撮像素子を利用したデジタルタイプのカメラも含む。

次に、走査像観察機能(ＳＴＥＭ機能)を使用する場合について説明する。この場合、電子ビームは、レンズ４０３によって細く集束され、更に偏向コイル４０４によって偏向される。その結果、試料４０５上の所望の二次元領域が電子ビームによって走査される。試料４０５へ電子ビームを照射すると透過電子、二次電子や散乱電子等が発生する。試料を透過した透過電子、試料４０５から発生した二次電子や散乱電子等を検出器で検出することで、透過電子像、二次電子像、散乱電子像を取得することができる。このとき、発生した散乱電子は、試料下部にあるレンズ４０３によって散乱角を制御され常に円環状の暗視野走査像検出器４０９に散乱電子が入るように調整される。取得された像はそれぞれの制御部に供給される。電子ビームの走査に同期した走査像(暗視野ＳＴＥＭ像)はパーソナルコンピュータ４１５に表示される。

なお、制御部は制御アルゴリズムを保存したメモリ、アルゴリズムを実行するためのＣＰＵ、信号を送受信するＩ/Ｏインターフェースを含む。パーソナルコンピュータ４１５は画像を保存するメモリ、メモリからのデータの読み出しやメモリへのデータの書き込みといった所定の処理を行うＣＰＵ、マウス、キーボードに例示される入力部、ディスプレイに例示される出力部を含む。

その他、本実施例の透過型電子顕微鏡は、明視野ＳＴＥＭ像を取得するための明視野走査像検出器４１１、電子線量測定器４２１、インターフェース部４１７、on/offスイッチ４２２、鏡体冷却用水流４１８、鏡体冷却装置制御部４１９、外部記憶装置４２０を含む。電子線量測定器４２１は蛍光板４１０に照射された電子線量を計測するためのものである。フィルム４１３で撮影する画像は場合、電子線量測定器４２１を使用し、電子線量と露光時間を制御することで、所望の画像を得ることが可能となる。カメラ制御部４１４はカメラ４１２のシャッターを制御するものである。インターフェース部４１７は、全ての制御部とパーソナルコンピュータ４１５とを繋ぐものであり、バスやＩ／Ｏインターフェースを含む。on/offスイッチ４２２はメイン電源である。on/offスイッチ４２２をoffにすることで、装置を停止させることができる。鏡体冷却用水流４１８は鏡体を冷やすための冷却水の流路である。鏡体冷却装置制御部４１９は冷却水の流量(l/min)を制御するものである。

外部記憶装置４２０は各制御部の情報、得られた画像を保存するための記憶媒体あり、パーソナルコンピュータ４１５内部のメモリよりも大容量の記憶媒体である場合もある。得られた画像、動画はパーソナルコンピュータ内４１５内部のメモリ、及び外部記憶装置４２０の少なくとも１つに保存することができる。パーソナルコンピュータ４１５内のＣＰＵは得られた画像、動画に所定の画像処理を行うことができる。

液中観察ツール４５はサンプルホルダ３０１の先端に直接接続、又は形成することができるが、図９に示すように微小な開口の集合であるマイクログリッド５１１を介してサンプルホルダ３０１の先端に搭載することもできる。電子線８０１は観察窓４２を通過し、標本へ到達する。標本を透過した透過電子８０２はマイクログリッド５１１中の開口、及び観察窓４２の反対側の観察窓４３を通過する。この透過電子８０２を検出することで標本のＴＥＭ像を取得することが可能となる。

次に、微小気泡の寸法の評価について説明する。図１０（a）はパーソナルコンピュータ４１５の出力部によって表示されるＧＵＩを説明する図である。ＧＵＩ９０１にはＴＥＭ像９０２が表示される。本実施例では、例えばＴＥＭ像９０２には微小気泡領域９０３、及び９０４が含まれるものとして説明する。作業者はポインタ９０７によって微小気泡領域９０３の任意の始点９０５から任意の終点９０６までの線分９０８を描画することができる。パーソナルコンピュータ４１５内のＣＰＵは図１０(b)のモデルに基づき線分９０８の標本上での長さを得る。得られた長さはウィンドウ９１０に表示される。同様の手順はファインバブル領域９０４に適用することができる。始点９０５、終点９０６の座標はポインタ９０７による選択から得ることができる。よって、Ｌ、Ｍを既知としておけば線分９０８の標本上での長さを得ることができる。このように、始点９０５の座標、終点９０６の座標、画素寸法に関する情報、倍率に関する情報から線分９０８の標本上での長さを得ることができる。もちろん図１０(b)以外のモデルを利用することも本明細書の開示の範囲内である。

また、この手順を行わなくてもＴＥＭ像に付属するスケール９１２と微小気泡領域９０３、及び９０４とを作業者が目視で比較することでもファインバブルの寸法を得ることが可能である。

なお、動画を取得した場合は、タイムスケール９１１を表示することができる。タイムスケール９１１は動画撮像時間を意味している。ポインタ９０７でバー９１３を矢印９１２の方向へ移動することで、任意の撮像時刻を指定することができる。任意の撮像時刻が指定されるとＣＰＵはメモリから指定された時刻のＴＥＭ像を読み出し、ＧＵＩ９０１上に表示する。この動作により作業者は任意の時刻の微小気泡の寸法を評価することができる。もちろん、微小気泡の評価手法は上記の手法に限定されない。このように微小気泡の寸法を得る工程は例えば、荷電粒子像中の所定の領域の寸法を得る計測工程と表現することができる。

このように、本実施例ではイオン液体を利用することによって、液中の気泡、例えば微小気泡を確認することが可能となる。より具体的には、標本を凍結させることなく、液中の微小気泡を確認可能な状態とすることができる。そして、この画像を利用することによって液中の微小気泡の寸法を評価することが可能となる。

ここで、イオン液体のバリエーションについて説明する。親水性のイオン液体の具体例として、テトラフルオロホウ酸 １−エチル−３−メチルイミダゾリウム、トリフルオロメタンスルホン酸 １−エチル−３−メチルイミダゾリウム、テトラフルオロホウ酸 １−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、トリフルオロメタンスルホン酸 １−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、臭化 １−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム、塩化 １−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム若しくは塩化 １−デシル−３−メチルイミダゾリウム等が挙げられる。

疎水性のイオン液体としては、１-ブチル-３-メチルイミダゾリウム ビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミド（ＢＭＩ−ＴＦＳＩ）が挙げられる。

以上、本発明の実施例について説明したが、本発明は実施例に限定されない。図１、図６の各ステップは全ステップが必須の関係にあるわけではない。荷電粒子線装置の構成は図８に限定されない。ＴＥＭ像に例示される画像を連続的に取得することで動画を取得することも本明細書の開示の範囲内である。本発明は標本の作製や気泡の評価に幅広く適用可能である。気泡を含むであろう液体にイオン液体を適用する形態は本明細書の開示の範囲内である。気泡を含むであろう液体の画像中の所定の領域とその周囲の領域との境界を観察者が判別可能とする思想も本明細書の開示の範囲内である。

２０１・・・電解液
２０２・・・陽極
２０３・・・電解液
２０４・・・陰極
２０５・・・イオン交換膜
２０６・・・ガス放出口、
２０７・・・取出口

Claims (13)

1. 気泡を発生させる処理を施した液体とイオン液体とを含む標本の荷電粒子線像を得る撮像工程を含むことを特徴とする標本の観察方法。
2. 請求項１に記載の観察方法において、
   前記標本を荷電粒子に対して透明な部分を含む容器に封入する封入工程を含み、
   前記封入工程は前記撮像工程の前に行われることを特徴とする標本の観察方法。
3. 請求項１に記載の観察方法において、
   前記イオン液体はカチオン、及びアニオンを含むことを特徴とする標本の観察方法。
4. 請求項１に記載の観察方法において、
   前記気泡はファインバブルであることを特徴とする標本の観察方法。
5. 請求項１に記載の観察方法において、
   前記荷電粒子線像中の所定の領域の寸法を得る計測工程を含み、
   前記所定の領域はその周囲に比べて暗いことを特徴とする標本の観察方法。
6. 請求項１に記載の観察方法において、
   前記撮像工程は前記標本の動画を得る動画取得工程を含むことを特徴とする標本の観察方法。
7. 請求項６に記載の観察方法において、
   前記撮像工程は前記標本のその場観察工程を含むことを特徴とする標本の観察方法。
8. 請求項７に記載の観察方法において、
   前記その場観察は前記標本に電圧を印加する電圧印加工程を含む標本の観察方法。
9. 請求項７に記載の観察方法において、
   前記その場観察は前記標本の温度を変更する温度制御工程を含む標本の観察方法。
10. 請求項７に記載の観察方法において、
    前記その場観察は前記標本へ媒体を供給する媒体供給工程を含む標本の観察方法。
11. 請求項７に記載の観察方法において、
    前記その場観察は前記標本を循環させる循環工程を含む標本の観察方法。
12. 請求項１に記載の観察方法において、
    前記荷電粒子線像は透過電子像であることを特徴とする標本の観察方法。
13. 請求項１に記載の観察方法において、
    前記荷電粒子線像は走査電子顕微鏡像であることを特徴とする標本の観察方法。

Images