WO2017155053A1 - 非アルコール性脂肪性肝疾患／非アルコール性脂肪性肝炎の治療剤 - Google Patents

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lansoprazole
nash
nafld
examples
expression
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悠太 山本
敬司 上山
利男 西
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公立大学法人和歌山県立医科大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole

Definitions

  • the present invention relates to a novel pharmaceutical use of lansoprazole known as a proton pump inhibitor. More specifically, the present invention relates to a preventive and / or therapeutic agent for nonalcoholic fatty liver disease / nonalcoholic steatohepatitis containing lansoprazole.
  • non-alcoholic steatohepatitis (hereinafter referred to as “NASH”), which exhibits liver tissue findings such as fat accumulation, inflammatory necrosis, and fibrosis despite the absence of alcohol consumption due to increased obesity and insulin resistance accompanying lifestyle changes. ” May be abbreviated as“. ”An increase in patients has been reported (Non-patent Document 1). Chronic progressive liver disease of non-drinkers who have fatty liver and whose cause is unknown is collectively called non-alcoholic fatty liver disease (hereinafter sometimes abbreviated as “NAFLD”), of which liver lesions are highly active and cirrhosis.
  • NAFLD non-alcoholic fatty liver disease
  • NASH is defined as one that has a high frequency of transition to liver disease or death related to liver disease (Japanese Society of Gastroenterology NAFLD / NASH Clinical Practice Guidelines 2014; hereinafter, in this specification, general NAFLD typified by NASH is shown. (In some cases, “NAFLD / NASH” may be used as an abbreviation.)
  • the main features of the clinical pathology of NAFLD / NASH include an increase in aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) activities.
  • AST aspartate aminotransferase
  • ALT alanine aminotransferase
  • NASH patients have a high risk of progressing to fatal diseases such as cirrhosis and liver cancer, and NAFLD / NASH prevention, improvement, and development of treatment methods are important medical issues.
  • the onset mechanism of NAFLD / NASH is still unclear, and safe and highly effective drugs and treatment methods for NAFLD / NASH
  • Lansoprazole (trade name: Takepron (registered trademark)) has a proton pump inhibitory action on gastric wall cells (Patent Document 1) and is a highly safe compound that is commercially available as a therapeutic agent for peptic ulcer.
  • the present inventors have induced oxidative stress tolerance of organs by inducing lansoprazole in the first phase drug metabolism system (Ahr-Cyp1a1) and the second phase drug metabolism system (Nrf2-HO-1). It has been reported that it has a therapeutic effect on drug-induced acute hepatitis (Patent Document 2, Non-Patent Document 2).
  • lansoprazole is effective for the prevention and / or treatment of NAFLD / NASH.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • An object of the present invention is to provide a safe and useful preventive and / or therapeutic agent for nonalcoholic fatty liver disease / nonalcoholic steatohepatitis for which no effective drug therapy is currently known.
  • lansoprazole suppresses liver fibrosis and suppresses the progression of NAFLD / NASH by subcutaneous administration to NAFLD / NASH model animals. I found. Interestingly, it was found that this suppressive effect was not due to the action of lansoprazole to induce the expression of antioxidant stress gene. Hepatic fibrosis is deeply involved in the accumulation of extracellular matrix (ECM) such as type I collagen ⁇ 1 chain (Col1a1), which is a downstream factor of TGF- ⁇ .
  • ECM extracellular matrix
  • ECM is lysed by matrix metalloproteinases (MMPs), but when the activity of MMPs is inhibited by a tissue inhibitor of MMPs (Timp1), liver fibrosis occurs. Therefore, the present inventors examined whether lansoprazole suppresses the expression of these liver fibrosis-related genes, and none of the gene expression was significantly suppressed. It was found that protein expression (ie, activation of TGF- ⁇ ) was remarkably suppressed. Although the involvement of reactive oxygen species (ROS), MMP2 and MMP9 has been reported as a mechanism of TGF- ⁇ activation, lansoprazole did not increase HO-1 expression in NAFLD / NASH model animals.
  • ROS reactive oxygen species
  • TGF- ⁇ activation was inhibited by inhibiting.
  • NASH is caused by inflammation following fat accumulation
  • the present inventors examined the influence of lansoprazole administration on the expression of proinflammatory cytokines in NAFLD / NASH model animals. As a result, it was revealed that lansoprazole suppresses IL-6 gene and protein expression. From the above, the present inventors have found that lansoprazole is useful for the treatment of NAFLD / NASH, and that the therapeutic effect involves cytokines, not antioxidant stress proteins, and completed the present invention. I came to let you.
  • the present invention is as follows.
  • a preventive and / or therapeutic agent for NAFLD / NASH comprising lansoprazole.
  • the agent according to [1] which is used so that 5 mg to 150 mg of lansoprazole is administered per day for an adult.
  • a TGF- ⁇ expression inhibitor comprising lansoprazole.
  • An IL-6 expression inhibitor comprising lansoprazole.
  • NAFLD / NASH can be prevented and / or treated by administering lansoprazole at a dose that has been confirmed to be safe as an existing drug.
  • A shows the tissue of the liver of a NAFLD / NASH model rat in which collagen (I and III) fibers are stained with Picrosirus® Red.
  • B shows the result of scoring using the NAFLD / NASH stage criteria (Brunt criteria). The result of having investigated the density
  • the result of having investigated the expression change of Nrf2, HO-1, Ahr, and Cyp1a1 gene in the liver of a NAFLD / NASH model rat by lansoprazole administration by RT-PCR is shown.
  • the black bar shows the results of the CDAA 5w + LAP 4w group administered with lansoprazole, and the white bar shows the results of the control CDAA 5w group.
  • the result of having investigated the expression change of the liver fibrosis related gene (Timp1, Col1a1, Tgfb1) in the liver of a NAFLD / NASH model rat by lansoprazole administration is shown.
  • TGF- (beta) protein in the liver of a NAFLD / NASH model rat by lansoprazole administration is shown.
  • the present invention provides a prophylactic and / or therapeutic agent for NAFLD / NASH (hereinafter sometimes abbreviated as “the prophylactic and / or therapeutic agent of the present invention”) comprising lansoprazole.
  • Lansoprazole which is an active ingredient in the present invention, is a compound represented by the following structural formula (2-[[[3-methyl-4- (2,2,2-trifluoroethoxy) -2-pyridinyl] methyl] sulfinyl] -1H-benzimidazole).
  • Lansoprazole in the present invention may be a racemate or an optically active form such as an R-form or S-form, but (R) -2-[[[3-methyl-4- (2 , 2,2-trifluoroethoxy) -2-pyridinyl] methyl] sulfinyl] -1H-benzimidazole and the like are preferred.
  • lansoprazole in the present invention may be a compound represented by the above structural formula or a pharmaceutically acceptable salt of an optically active substance thereof. Examples of such salts include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with basic amino acids, and the like.
  • the salt with an inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; ammonium salt and the like.
  • Suitable examples of salts with organic bases include, for example, alkylamines (trimethylamine, triethylamine, etc.), heterocyclic amines (pyridine, picoline, etc.), alkanolamines (ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, etc.), dicyclohexylamine.
  • salts with N, N′-dibenzylethylenediamine and the like Preferable examples of the salt with basic amino acid include salts with arginine, lysine, ornithine and the like. Of these salts, alkali metal salts or alkaline earth metal salts are preferable. The sodium salt is particularly preferable.
  • lansoprazole Since lansoprazole is unstable to acids, it can be provided in the form of an acid-stable prodrug to prevent degradation by gastric acid when administered orally. Examples thereof include prodrugs described in US Pat. No. 6,093,734.
  • Lansoprazole can be produced by a method known per se, for example, the method described in JP-A-61-50978, US Pat. No. 4,628,098, JP-A-10-195068, WO98 / 21201, or the like. Manufactured by.
  • the optically active substance can be obtained by an optical resolution method (fractional recrystallization method, chiral column method, diastereomer method, method using a microorganism or enzyme, etc.), asymmetric oxidation, and the like. In this case, it can also be produced according to the methods described in WO00 / 78745, WO01 / 83473, WO01 / 87874 and WO02 / 44167.
  • TGF- ⁇ () TGF- ⁇ involved in promoting fibrosis in the NAFLD / NASH pathology
  • TGF- ⁇ meaning the expression of active TGF- ⁇ protein.
  • IL-6 () pro-inflammatory cytokine IL-6 gene expression and protein expression
  • Lansoprazole has low toxicity and is a pharmaceutical composition mixed with a pharmacologically acceptable carrier as it is or according to a method known per se, such as tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), powders, granules and capsules. (Including soft capsules), orally disintegrating tablets, liquids, injections, suppositories, sustained-release agents, patches, etc., for humans or other mammals, orally or parenterally (eg, Topical, subcutaneous, rectal, intravenous administration, etc.) can be safely administered.
  • a pharmacologically acceptable carrier as it is or according to a method known per se, such as tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), powders, granules and capsules. (Including soft capsules), orally disintegrating tablets, liquids, injections, suppositories, sustained-release agents, patches, etc., for humans or other mammals, orally or parenterally (eg, Topical, subcutaneous, rectal
  • lansoprazole can exert an action of suppressing the pathological condition of NAFLD / NASH at a dose that has already been confirmed in animal experiments as a therapeutic agent for gastric ulcer and duodenal ulcer. Therefore, the preventive and / or therapeutic agent of the present invention can also be effectively administered to NAFLD / NASH patients in an amount of active ingredient equivalent to the dose as an existing therapeutic agent for gastric ulcer and duodenal ulcer.
  • the content of lansoprazole in the preventive and / or therapeutic agent of the present invention is about 0.01% to 100% by weight of the total composition.
  • the dose of the preventive and / or therapeutic agent of the present invention varies depending on the administration subject, administration route, severity of disease, etc., but for example, when administered orally to an adult (60 kg), the amount of active ingredient About 0.5 to 1500 mg / day, preferably about 5 to 150 mg / day, and most preferably 30 mg / day. When administered parenterally (for example, subcutaneously), the amount of the active ingredient is about 0.5 to 1500 mg / day, preferably about 5 to 150 mg / day, and most preferably 30 mg / day.
  • Lansoprazole may be administered once a day or divided into 2-3 times.
  • Examples of the pharmacologically acceptable carrier that may be used for the production of the preventive and / or therapeutic agent of the present invention include various organic or inorganic carrier substances that are commonly used as pharmaceutical materials. Agents, lubricants, binders, disintegrants, water-soluble polymers, basic inorganic salts; solvents, solubilizers, suspending agents, isotonic agents, buffers, soothing agents, etc. in liquid preparations It is done. Further, if necessary, additives such as ordinary preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners, sour agents, foaming agents, and fragrances can be used.
  • excipient examples include lactose, sucrose, D-mannitol, starch, corn starch, crystalline cellulose, light anhydrous silicic acid, titanium oxide and the like.
  • lubricant examples include magnesium stearate, sucrose fatty acid ester, polyethylene glycol, talc, stearic acid and the like.
  • binder examples include hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, crystalline cellulose, starch, polyvinylpyrrolidone, gum arabic powder, gelatin, pullulan, low-substituted hydroxypropylcellulose, and the like.
  • disintegrant examples include (1) crospovidone, (2) disintegrants called super disintegrants such as croscarmellose sodium (FMC-Asahi Kasei), carmellose calcium (Gotoku Pharmaceutical), (3) carboxymethyl Examples include starch sodium (eg, Matsutani Chemical Co., Ltd.), (4) low-substituted hydroxypropylcellulose (eg, Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.), (5) corn starch and the like.
  • the “crospovidone” is crosslinked with a chemical name of 1-ethenyl-2-pyrrolidinone homopolymer, including those called polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) and 1-vinyl-2-pyrrolidinone homopolymer.
  • PVPP polyvinylpolypyrrolidone
  • Specific examples include Kollidon CL (manufactured by BASF), Polyplastidone XL (manufactured by ISP), Polyplaston XL-10 (manufactured by ISP), and Polyplastidone. INF-10 (manufactured by ISP).
  • water-soluble polymer examples include ethanol-soluble water-soluble polymers [for example, cellulose derivatives such as hydroxypropylcellulose (hereinafter sometimes referred to as HPC), polyvinylpyrrolidone, etc.], ethanol-insoluble water-soluble polymers Molecules [for example, hydroxypropylmethylcellulose (hereinafter sometimes referred to as HPMC), cellulose derivatives such as methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, polyvinyl alcohol, sodium alginate, guar gum, etc.] and the like.
  • HPC hydroxypropylcellulose
  • HPMC hydroxypropylmethylcellulose
  • HPMC hydroxypropylmethylcellulose
  • cellulose derivatives such as methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, polyvinyl alcohol, sodium alginate, guar gum, etc.
  • Examples of the “basic inorganic salt” include basic inorganic salts of sodium, potassium, magnesium and / or calcium. Preferred is a basic inorganic salt of magnesium and / or calcium. More preferred is a basic inorganic salt of magnesium.
  • Examples of the basic inorganic salt of sodium include sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, disodium hydrogen phosphate and the like.
  • Examples of the basic inorganic salt of potassium include potassium carbonate and potassium hydrogen carbonate.
  • Examples of the basic inorganic salt of magnesium include heavy magnesium carbonate, magnesium carbonate, magnesium oxide, magnesium hydroxide, magnesium metasilicate aluminate, magnesium silicate, magnesium aluminate, synthetic hydrotalcite [Mg 6 Al 2 ( OH) 16 ⁇ CO 3 ⁇ 4H 2 O] and alumina hydroxide / magnesium, preferably heavy magnesium carbonate, magnesium carbonate, magnesium oxide, magnesium hydroxide and the like.
  • Examples of the basic inorganic salt of calcium include precipitated calcium carbonate and calcium hydroxide.
  • solvent examples include water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil, olive oil and the like.
  • dissolution aid examples include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate and the like.
  • the “suspending agent” examples include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate; And hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and hydroxypropylcellulose.
  • surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate
  • hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and hydroxypropylcellulose.
  • Examples of the “isotonic agent” include glucose, D-sorbitol, sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like.
  • Examples of the “buffering agent” include buffer solutions of phosphate, acetate, carbonate, citrate, and the like.
  • Examples of the “soothing agent” include benzyl alcohol and the like.
  • Examples of the “preservative” include p-hydroxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • antioxidant examples include sulfite, ascorbic acid, ⁇ -tocopherol and the like.
  • colorant include edible pigments such as edible yellow No. 5, edible red No. 2, and edible blue No. 2; edible lake pigments, bengara and the like.
  • sweetening agent examples include saccharin sodium, dipotassium glycyrrhizin, aspartame, stevia, thaumatin and the like.
  • sweetening agent examples include saccharin sodium, dipotassium glycyrrhizin, aspartame, stevia, thaumatin and the like.
  • sweet agent examples include citric acid (anhydrous citric acid), tartaric acid, malic acid and the like.
  • the “foaming agent” examples include sodium bicarbonate.
  • the “fragrance” may be a synthetic product or a natural product, and examples thereof include lemon, lime, orange, menthol, and strawberry.
  • Lansoprazole is compression-molded by adding a carrier such as an excipient, a disintegrant, a binder or a lubricant according to a method known per se such as JP-A-62-277322 and JP-A-63-301816. Then, if necessary, a preparation for oral administration can be prepared by coating by a method known per se for the purpose of taste masking, enteric property or persistence. In the case of an enteric preparation, an intermediate layer may be provided between the enteric layer and the drug-containing layer by a method known per se for the purpose of separating both layers.
  • a carrier such as an excipient, a disintegrant, a binder or a lubricant according to a method known per se such as JP-A-62-277322 and JP-A-63-301816.
  • a preparation for oral administration can be prepared by coating by a method known per se for the purpose of taste masking, enteric property or persistence.
  • an intermediate layer may be provided between
  • lansoprazole when used as an orally disintegrating tablet, for example, a core containing crystalline cellulose and lactose is coated with lansoprazole and, if necessary, a basic inorganic salt in accordance with WO 99/59544, WO 00/00126, etc.
  • a composition is obtained by coating with a coating layer containing a water-soluble polymer, and the resulting composition is coated with an enteric coating layer containing polyethylene glycol, and then coated with an enteric coating layer containing triethyl citrate, It can be produced by a method of coating with a polyethylene glycol-containing enteric coating layer and finally coating with mannitol to obtain fine particles, mixing the obtained fine particles and additives, and molding.
  • enteric coating layer examples include cellulose acetate phthalate (CAP), hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxymethylcellulose acetate succinate, methacrylic acid copolymer [for example, Eudragit® L30D-55 (trade name; Rame Co., Ltd.), Kollicoat MAE30DP (trade name; manufactured by BASF Corp.), Polykid PA30 (trade name; manufactured by Sanyo Kasei Co., Ltd.), etc.], carboxymethyl ethyl cellulose, shellac and other water-based enteric polymer bases; Sustained release bases such as coalescent [eg Eudragit NE30D (trade name), Eudragit RL30D (trade name), Eudragit RS30D (trade name), etc.]; water-soluble polymer; triethyl citrate, polyethylene glycol, acetylated monoglyceride De, triacetin, include one or consists like a mixture of two or more layers such as a plasticizer such as castor
  • additives examples include water-soluble sugar alcohols (eg, sorbitol, mannitol, maltitol, reduced starch saccharified product, xylitol, reduced palatinose, erythritol, etc.), crystalline cellulose (eg, Theolas KG 801, Avicel PH 101) , Avicel PH 102, Avicel PH 301, Avicel PH ⁇ 302, Avicel RC-591 (crystalline cellulose, carmellose sodium), etc., low-substituted hydroxypropylcellulose (eg, LH-22, LH-32, LH-23, LH) -33 (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) and mixtures thereof, etc.), binders, acidulants, foaming agents, sweeteners, fragrances, lubricants, colorants, stabilizers, excipients, Disintegrants are also used.
  • water-soluble sugar alcohols eg, sorbitol, mannitol
  • Lansoprazole can be used in combination with other drugs.
  • concomitant drugs include liver protectants, hypoglycemic agents, antihypertensive agents, antioxidants, anti-inflammatory agents and the like.
  • liver protectant include ursodeoxycholic acid and betaine.
  • hypoglycemic agents include insulin and insulin derivatives, sulfonylureas such as tolbutamide, gliclazide, glibenclamide and glimepiride, fast-acting insulin secretagogues such as nateglinide, repaglinide and mitiglinide, and ⁇ such as acarbose, voglibose and miglitol.
  • -Glucosidase inhibitors biguanides such as metformin and phenformin, and thiazolidines such as pioglitazone, rosiglitazone and troglitazone.
  • the antihypertensive agent include an angiotensin converting enzyme inhibitor, an angiotensin receptor inhibitor, and a calcium antagonist.
  • the antioxidant include vitamins such as vitamin C and vitamin E, N acetylcysteine, probucol, icosapentaenoic acid and esters thereof.
  • the anti-inflammatory agent include cytokine production inhibitors such as pentoxifylline.
  • lansoprazole is mixed according to a method known per se, and in one pharmaceutical composition (for example, tablet, powder, granule, capsule (including soft capsule), liquid, injection, suppository, sustained release etc.)
  • pharmaceutical composition for example, tablet, powder, granule, capsule (including soft capsule), liquid, injection, suppository, sustained release etc.
  • both may be formulated separately, and each may be formulated separately and administered to the same subject simultaneously or with a time difference.
  • liver fibrosis The fixed tissue was embedded in paraffin and sliced, and collagen (I and III) fibers were stained using Picroserius Red Stain Kit (Polyscienes). Hepatic fibrosis scoring was performed using the criteria of Brunt (1) (Brunt, EM. Et al., Seminar Liv. Dis., 21: 3-16 (2001)).
  • RNA samples were extracted from tissues soaked in RNAlator using RNeasy mini kit, concentration was measured using Nano Drop 1000 (Thermo Fischer), and then reverse transcription reaction was performed using AMV reverse transcriptase (Roche).
  • AMV reverse transcriptase As an internal control, the housekeeping gene GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) was used.
  • the reverse-transcribed sample was quantified by real-time PCR using the primers shown in Table 1 and LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche) or KAPA SYBR FAST qPCR Kit (KAPA Biosystems).
  • the amplification protocol was 45 cycles of 95 ° C. 5 seconds-60 ° C. 5 seconds-72 ° C. 12 seconds.
  • a calibration curve was prepared by amplifying a series of 10-fold diluted standard cDNA samples using the same protocol.
  • TGF- ⁇ protein was measured by Western blotting.
  • the cryopreserved sample was homogenized in PRO-PREP TM (INTRON) buffer and incubated on ice for 20 minutes. Centrifuged at 13,000 xg for 5 minutes at 4 ° C to extract soluble protein. Electrophoresis on SDS-polyacrylamide gel (12.5%), transferred to PVDF membrane (Millipore), and reacted with rabbit anti-TGF ⁇ antibody (CST, 3711S) or rabbit anti-IL-6 antibody (Abnova, PAB16165) as the primary antibody It was.
  • Nrf2 and Ahr expression levels of downstream genes of Nrf2 and Ahr
  • lansoprazole administration significantly increased Nrf2 and Ahr mRNA levels (*: P ⁇ 0.05, analyzed by Student's t test), but downstream HO-1 and Ahr mRAN levels No significant change was observed (FIG. 3). Therefore, it was shown that the prevention and / or treatment effect of lansoprazole on NAFLD / NASH is due to an action different from the antioxidant action of lansoprazole.
  • liver fibrosis-related genes In order to investigate the mechanism of liver fibrosis, the expression levels of three genes (Timp1, Col1a1, Tgfb1) associated with liver fibrosis were measured in the liver of NAFLD / NASH model rats. As a result, the expression of any gene was not significantly changed by lansoprazole administration (FIG. 4).
  • TGF- ⁇ protein In NAFLD / NASH model rats, lansoprazole significantly suppressed the expression of mature TGF- ⁇ protein in the liver (*: P ⁇ 0.05, analyzed by Student's t test) (FIG. 5). On the other hand, the expression of TGF- ⁇ precursor protein was not suppressed by lansoprazole administration. Since TGF- ⁇ protein involved in the promotion of fibrosis is suppressed by lansoprazole, the effect of lansoprazole on liver fibrosis on NAFLD / NASH is the expression of mature TGF- ⁇ (ie, activation of TGF- ⁇ ) It was suggested that it was due to a route through inhibition.
  • proinflammatory cytokines In order to investigate the mechanism of the anti-inflammatory effect of lansoprazole administration, the amount of gene expression of proinflammatory cytokines IL-6 and IL-1 ⁇ in the liver of NAFLD / NASH model rats was measured. As a result, IL-1 ⁇ gene expression was not changed by lansoprazole administration, but IL-6 expression was significantly reduced (FIG. 6A). Similarly, lansoprazole administration also reduced IL-6 protein expression (FIGS. 6B and C).
  • the prophylactic and / or therapeutic agent of the present invention is useful as a safe prophylactic and / or therapeutic agent for NAFLD / NASH.

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Abstract

本発明は、ランソプラゾールを含有してなる、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）／非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の予防及び／又は治療剤を提供する。ランソプラゾールは胃潰瘍／十二指腸潰瘍の治療剤として、これまで安全に使用されてきているので、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの治療においても、安全かつ有用な薬剤となり得る。

Description

非アルコール性脂肪性肝疾患／非アルコール性脂肪性肝炎の治療剤
　本発明は、プロトンポンプ阻害薬として知られるランソプラゾールの新規医薬用途に関する。より詳細には、本発明は、ランソプラゾールを含有する、非アルコール性脂肪性肝疾患／非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療剤に関する。
　近年、生活習慣の変化に伴う肥満やインスリン抵抗性の増加により、アルコールを摂取しないにも関わらず脂肪蓄積、炎症性壊死、線維化といった肝組織所見を示す非アルコール性脂肪性肝炎（以下「ＮＡＳＨ」と省略する場合がある。）患者の増加が報告されている（非特許文献１）。非飲酒者で脂肪肝を呈する原因不明の慢性進行性肝疾患は非アルコール性脂肪性肝疾患（以下「ＮＡＦＬＤ」と省略する場合がある。）と総称され、そのうち肝病変の活動性が高く肝硬変への移行や肝疾患関連死を生じる頻度が高いものがＮＡＳＨと定義されている（日本消化器病学会ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ診療ガイドライン２０１４；以下、本明細書において、ＮＡＳＨを典型とするＮＡＦＬＤ全般を示す略称として、「ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ」を用いる場合がある。）。ＮＡＦＬＤ/ＮＡＳＨの臨床病態の主な特徴としては、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)活性の上昇などが挙げられる。ＮＡＳＨ患者は肝硬変や肝癌などの致死性の疾患に進展するリスクが高く、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの予防、改善、治療法の開発は医療上の重要な課題となっている。しかしながら、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの発症機序はいまだ不明な点も多く、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの安全で治療効果の高い薬剤や治療法は未だ確立されていない。
　ランソプラゾール（商品名：タケプロン(登録商標)）は、胃の壁細胞のプロトンポンプ阻害作用を有し（特許文献１）、消化性潰瘍治療薬として市販されている安全性の高い化合物である。また、本発明者らは、ランソプラゾールが、第1相の薬物代謝系（Ahr-Cyp1a1）及び第2相の薬物代謝系（Nrf2-HO-1）を誘導することで、臓器の酸化ストレス耐性を高め、薬剤性急性肝炎等に対する治療効果を有することを報告している（特許文献２、非特許文献２）。しかしながら、ランソプラゾールが、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの予防及び／又は治療に有効であるとの報告はない。
　また、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨは、炎症と線維化の２つのパラメーターの進行により、病態が形成されていくため、線維化を抑制する薬剤の重要性が認識されている。これらの薬剤の開発が世界中で行われているが、未だに開発が成功したとの報告はない。ここで、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)は、線維性疾患における線維芽細胞の活性化の重要な調節因子であるとの報告があるものの（非特許文献３、４）、ランソプラゾールが、線維化を抑制することや、TGF-βの発現に関与することは報告されていない。
特開昭61-50978号公報 特開2015-145343号公報
Arun, J., Gastroenterology, 123(5): 1705-1725 (2002) Yamashita, Y., Ueyama, T., Nishi, T., Yamamoto, Y., Kawakoshi, A., Sunami, S., Iguchi, M., Tamai, H., Ueda, K., Ito, T., Tsuo, Y, Ichinose, M., PLoS ONE, 9(5): e97419 (2014) Robert, M., Borna, M., Chest, 136: 1364-1370 (2009) Verrecchia, F., Mauviel A., World J. Gastroenterol., 13: 3056-3062 (2007)
　本発明の目的は、現在有効な薬物療法が知られていない非アルコール性脂肪性肝疾患／非アルコール性脂肪性肝炎に対し、安全かつ有用な予防及び／又は治療剤を提供することである。
　本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ランソプラゾールが、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデル動物への皮下投与により、肝線維化を抑制し、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの進行を抑制することを見出した。そして興味深いことに、この抑制効果は、ランソプラゾールの抗酸化ストレス遺伝子発現誘導作用によるものでないことを見出した。
　肝線維化には、TGF-βの下流因子であるI型コラーゲンα1鎖（Col1a1）等の細胞外マトリクス（ECM）の蓄積が深く関与している。ECMはマトリクスメタロプロテイナーゼ（MMPs）により溶解するが、MMPsの組織インヒビター（Timp1）によりMMPsの活性が阻害されると、肝線維化を引き起こす。そこで、本発明者らは、ランソプラゾールがこれらの肝線維化関連遺伝子の発現を抑制するか否かを調べたところ、いずれの遺伝子発現も有意に抑制されなかったが、ランソプラゾールは、成熟TGF-βタンパク質の発現（即ち、TGF-βの活性化）を顕著に抑制することを見出した。TGF-βの活性化のメカニズムとして活性酸素種（ROS）やMMP2及びMMP9の関与が報告されているが、ランソプラゾールはＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデル動物におけるHO-1の発現を増加させなかったことから、MMPsを阻害することでTGF-βの活性化を阻害していることが示唆された。
　また、ＮＡＳＨは脂肪蓄積に続く炎症により引き起こされることから、本発明者らは、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデル動物におけるランソプラゾール投与による前炎症性サイトカインの発現への影響を調べた。その結果、ランソプラゾールはIL-6の遺伝子及びタンパク質発現を抑制することが明らかとなった。
　以上のことから、本発明者らは、ランソプラゾールがＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの治療に有用であること、及びその治療効果には抗酸化ストレスタンパク質ではなくサイトカインが関与していることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］ランソプラゾールを含有してなる、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの予防及び／又は治療剤。
［２］成人１日あたり５mg～１５０mgのランソプラゾールが投与されるように用いられる、[１]記載の剤。
［３］成人１日あたり３０mgのランソプラゾールが投与されるように用いられる、[１]記載の剤。
［４］ランソプラゾールを含有してなる、TGF-β発現抑制剤。
［５］ランソプラゾールを含有してなる、IL-6発現抑制剤。
　本発明によれば、既存薬として安全性が確認されている用量でランソプラゾールを投与することにより、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨを予防及び／又は治療することができる。
ランソプラゾールが、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨにおける線維化を抑制することを示す図である。Ａ：コラーゲン（Ｉ及びＩＩＩ）線維をPicrosirus Redで染色したＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデルラットの肝臓の組織を示す。Ｂ：ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨのステージ基準（Ｂｒｕｎｔの基準）を用いてスコアリングを行った結果を示す。 ランソプラゾール投与による、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデルラットの血清中のAST及びALTの濃度を調べた結果を示す。 ランソプラゾール投与による、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデルラットの肝臓におけるNrf2、HO-1、Ahr、Cyp1a1遺伝子の発現変化を、RT-PCRにより調べた結果を示す。黒色のバーは、ランソプラゾールを投与したCDAA 5w + LAP 4w群、白色のバーは、対照のCDAA 5w群の結果を示す。 ランソプラゾール投与による、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデルラットの肝臓における肝線維化関連遺伝子（Timp1、Col1a1、Tgfb1）の発現変化を調べた結果を示す。 ランソプラゾール投与による、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデルラットの肝臓におけるTGF-βタンパク質の発現変化を調べた結果を示す。 ランソプラゾール投与による、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデルラットの肝臓における前炎症性サイトカイン遺伝子（IL-6、IL-1β）の発現変化（Ａ）、及びIL-6タンパク質の発現変化（Ｂ、Ｃ）を調べた結果を示す。
　本発明は、ランソプラゾールを含有してなる、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの予防及び／又は治療剤（以下、「本発明の予防及び／又は治療剤」と略記する場合がある。）を提供する。
　本発明における有効成分であるランソプラゾールは、下記構造式で表される化合物（２－［［［３－メチル－４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－２－ピリジニル］メチル］スルフィニル］－１Ｈ－ベンズイミダゾール）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明におけるランソプラゾールは、ラセミ体であってもよく、Ｒ－体、Ｓ－体などの光学活性体であってもよいが、（Ｒ）－２－［［［３－メチル－４－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）－２－ピリジニル］メチル］スルフィニル］－１Ｈ－ベンズイミダゾールなどの光学活性体が好ましい。
　また、本発明におけるランソプラゾールは、上記構造式で示される化合物又はその光学活性体の薬学的に許容される塩であってもよい。このような塩としては、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、塩基性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えば、アルキルアミン（トリメチルアミン、トリエチルアミンなど）、複素環式アミン（ピリジン、ピコリンなど）、アルカノールアミン（エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなど）、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ,Ｎ'－ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えば、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられる。これらの塩のうち好ましくは、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩である。とりわけナトリウム塩が好ましい。
　ランソプラゾールは酸に不安定なため、経口投与する場合には胃酸による分解を防ぐために、酸に安定なプロドラッグの形態で提供され得る。例えば、米国特許第６０９３７３４号に記載のプロドラッグ等が挙げられる。
　ランソプラゾールは、自体公知の方法により製造でき、例えば、特開昭６１－５０９７８号、米国特許４,６２８,０９８、特開平１０－１９５０６８号、ＷＯ９８／２１２０１等に記載の方法又はこれらに準じた方法により製造される。なお、光学活性体については、光学分割法（分別再結晶法、キラルカラム法、ジアステレオマー法、微生物又は酵素を用いる方法など）、不斉酸化などの方法で得ることができ、例えばＲ－体の場合は、ＷＯ００／７８７４５、ＷＯ０１／８３４７３、ＷＯ０１／８７８７４及びＷＯ０２／４４１６７記載の方法に従って製造することもできる。
　上述のように、ランソプラゾールは、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ病態において、線維化の促進に関与するTGF-βの発現（本明細書において、「TGF-β(の)発現」とは、特にことわらない限り成熟TGF-β、即ち活性TGF-βタンパク質の発現を意味する。）及び前炎症性サイトカインIL-6の遺伝子発現及びタンパク質発現（本明細書において、「IL-6(の)発現」は、特にことわらない限りIL-6の遺伝子発現及びタンパク質発現の両方を包含する意味で用いられる。）を抑制し、肝線維化及び炎症を抑制するとともに、AST／ALTレベルを低下させるなど、肝機能を改善する作用を有するので、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの予防及び／又は治療に有効である。
　ランソプラゾールは、毒性が低く、そのままあるいは自体公知の方法に従って、薬理学的に許容される担体を混合した医薬組成物、例えば、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、口腔内崩壊錠、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤、貼布剤等の製剤として、ヒト又は他の哺乳動物に対して、経口的又は非経口的（例、局所、皮下、直腸、静脈投与等）に安全に投与することができる。後述の実施例に示されるとおり、ランソプラゾールは、胃潰瘍及び十二指腸潰瘍治療薬として動物実験で既に安全性が確認されている用量において、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの病態を抑制する作用を発揮し得る。従って、本発明の予防及び／又は治療剤においても、既存の胃潰瘍及び十二指腸潰瘍治療薬としての投与量と同等の有効成分量にて、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ患者に有効に投与することができる。
　本発明の予防及び／又は治療剤中の、ランソプラゾールの含有量は、組成物全体の約０．０１重量％～１００重量％である。
　本発明の予防及び／又は治療剤の投与量は、投与対象、投与ルート、疾患の重篤度等によっても異なるが、例えば、成人（６０ｋｇ）に対し経口的に投与する場合、有効成分量として約０．５～１５００mg／日、好ましくは約５～１５０mg／日、最も好ましくは３０mg／日である。非経口的に（例えば、皮下投与で）投与する場合も、有効成分量として約０．５～１５００mg／日、好ましくは約５～１５０mg／日、最も好ましくは３０mg／日である。ランソプラゾールは、１日１回又は２～３回に分けて投与してもよい。
　本発明の予防及び／又は治療剤の製造に用いられてもよい薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、水溶性高分子、塩基性無機塩；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じて、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、酸味剤、発泡剤、香料等の添加物を用いることもできる。
　該「賦形剤」としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、でんぷん、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸、酸化チタン等が挙げられる。
　該「滑沢剤」としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、タルク、ステアリン酸等が挙げられる。
　該「結合剤」としては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム末、ゼラチン、プルラン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
　該「崩壊剤」としては、（１）クロスポビドン、（２）クロスカルメロースナトリウム（ＦＭＣ－旭化成）、カルメロースカルシウム（五徳薬品）等スーパー崩壊剤と称される崩壊剤、（３）カルボキシメチルスターチナトリウム（例、松谷化学（株）製）、（４）低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（例、信越化学（株）製）、（５）コーンスターチ等が挙げられる。該「クロスポピドン」としては、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）、１－ビニル－２－ピロリジノンホモポリマーと称されているものも含め、１－エテニル－２－ピロリジノンホモポリマーという化学名を有し架橋されている重合物のいずれであってもよく、具体例としては、コリドンＣＬ（ＢＡＳＦ社製）、ポリプラスドンＸＬ（ＩＳＰ社製）、ポリプラスドンＸＬ－１０（ＩＳＰ社製）、ポリプラスドンＩＮＦ－１０（ＩＳＰ社製）等である。
　該「水溶性高分子」としては、例えば、エタノール可溶性水溶性高分子〔例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（以下、ＨＰＣと記載することがある）等のセルロース誘導体、ポリビニルピロリドン等〕、エタノール不溶性水溶性高分子〔例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（以下、ＨＰＭＣと記載することがある）、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース誘導体、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、アルギン酸ナトリウム、グアーガム等〕等が挙げられる。
　該「塩基性無機塩」としては、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム及び／又はカルシウムの塩基性無機塩が挙げられる。好ましくはマグネシウム及び／又はカルシウムの塩基性無機塩である。さらに好ましくはマグネシウムの塩基性無機塩である。該ナトリウムの塩基性無機塩としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム等が挙げられる。該カリウムの塩基性無機塩としては、例えば、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム等が挙げられる。該マグネシウムの塩基性無機塩としては、例えば、重質炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、珪酸マグネシウム、アルミン酸マグネシウム、合成ヒドロタルサイト〔Ｍｇ６Ａｌ２（ＯＨ）１６・ＣＯ３・４Ｈ２Ｏ〕及び水酸化アルミナ・マグネシウム、好ましくは、重質炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム等が挙げられる。該カルシウムの塩基性無機塩としては、例えば、沈降炭酸カルシウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。
　該「溶剤」としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。
　該「溶解補助剤」としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ－マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
　該「懸濁化剤」としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
　該「等張化剤」としては、例えば、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ－マンニトール等が挙げられる。
　該「緩衝剤」としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。
　該「無痛化剤」としては、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。
　該「防腐剤」としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。
　該「抗酸化剤」としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α－トコフェロール等が挙げられる。
　該「着色剤」としては、例えば、食用黄色５号、食用赤色２号、食用青色２号等の食用色素；食用レーキ色素、ベンガラ等が挙げられる。
　該「甘味剤」としては、例えば、サッカリンナトリウム、グリチルリチン二カリウム、アスパルテーム、ステビア、ソーマチン等が挙げられる。
　該「酸味剤」としては、例えば、クエン酸（無水クエン酸）、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
　該「発泡剤」としては、例えば重曹等が挙げられる。
　該「香料」としては、合成物及び天然物のいずれでもよく、例えば、レモン、ライム、オレンジ、メントール、ストロベリー等が挙げられる。
　ランソプラゾールは、例えば、特開昭62-277322、特開昭63-301816など自体公知の方法に従い、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤又は滑沢剤等の担体を添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより経口投与製剤とすることができる。腸溶性製剤とする場合、腸溶層と薬剤含有層との間に両層の分離を目的として、自体公知の方法により中間層を設けることもできる。
　ランソプラゾールを例えば口腔内崩壊錠とする場合、例えば、WO 99/59544、WO 00/06126などに準じて、例えば、結晶セルロース及び乳糖を含有する核を、ランソプラゾール及び必要により塩基性無機塩で被覆し、さらに水溶性高分子含有被覆層で被覆して組成物を得、得られた組成物をポリエチレングリコール含有腸溶性被覆層で被覆し、次にクエン酸トリエチル含有腸溶性被覆層で被覆し、さらにポリエチレングリコール含有腸溶性被覆層で被覆し、最後にマンニトールで被覆して細粒を得、得られた細粒と添加剤とを混合し、成形する方法によって製造することができる。
　上記「腸溶性被覆層」としては、例えば、セルロースアセテートフタレート(ＣＡＰ)、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、メタアクリル酸共重合体〔例えば、オイドラギット(Eudragit) Ｌ３０Ｄ－５５（商品名;レーム社製）、コリコートＭＡＥ３０ＤＰ（商品名;ＢＡＳＦ社製）、ポリキッドＰＡ３０（商品名;三洋化成社製）等〕、カルボキシメチルエチルセルロース、セラック等の水系腸溶性高分子基剤；メタアクリル酸共重合体〔例えば、オイドラギットＮＥ３０Ｄ（商品名）、オイドラギットＲＬ３０Ｄ（商品名）、オイドラギットＲＳ３０Ｄ（商品名）等〕等の徐放性基剤；水溶性高分子；クエン酸トリエチル、ポリエチレングリコール、アセチル化モノグリセリド、トリアセチン、ヒマシ油等の可塑剤等の一種又は二種以上混合したもの等からなる層が挙げられる。
　上記「添加剤」としては、例えば、水溶性糖アルコール（例、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、還元澱粉糖化物、キシリトール、還元パラチノース、エリスリトール等）、結晶セルロース（例、セオラスＫＧ ８０１、アビセルＰＨ １０１、アビセルＰＨ １０２、アビセルＰＨ ３０１、アビセルＰＨ ３０２、アビセルＲＣ－５９１（結晶セルロース・カルメロースナトリウム）等）、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（例、ＬＨ－２２、ＬＨ－３２、ＬＨ－２３、ＬＨ－３３（信越化学（株））及びこれらの混合物等）等が挙げられ、さらに結合剤、酸味料、発泡剤、甘味剤、香料、滑沢剤、着色剤、安定化剤、賦形剤、崩壊剤等も用いられる。
　ランソプラゾールは、さらに他の薬剤と組み合わせた形態で使用することができる。併用薬剤としては、肝庇護剤、血糖降下剤、降圧剤、抗酸化剤、抗炎症剤などが挙げられる。ここで肝庇護剤としては、例えば、ウルソデオキシコール酸やベタインが挙げられる。血糖降下剤としては、例えば、インスリンやインスリン誘導体、トルブタミド、グリクラジド、グリベンクラミド、グリメピリドのようなスルホニルウレア剤、ナテグリニド、レパグリニド、ミチグリニドのような速効型インスリン分泌促進剤、アカルボース、ボグリボース、ミグリトールのようなα-グルコシダーゼ阻害剤、メトホルミン、フェンホルミンのようなビグアナイド剤、ピオグリタゾン、ロジグリタゾン、トログリタゾンのようなチアゾリジン類が挙げられる。降圧剤としては、例えば、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体阻害剤、カルシウム拮抗剤が挙げられる。抗酸化剤としては、例えば、ビタミンＣ やビタミンＥ等のビタミン類、Ｎアセチルシステイン、プロブコール、イコサペンタエン酸及びそのエステル体などが挙げられる。抗炎症剤としては、例えば、ペントキシフィリン等のサイトカイン産生抑制剤が挙げられる。組合せは、ランソプラゾールを自体公知の方法に従って混合し、ひとつの医薬組成物（例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤等）中に両者を共に含有する形態でもよく、それぞれを別々に製剤化し、同一対象に対して同時に又は時間差を置いて投与してもよい。
　以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明の範囲を何ら限定するものではない。
（方法）
CDAAを用いたＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデル動物の作成
　６週齢のWistar系雄性ラット（紀和実験動物）を高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料（A06083101, EPS益新株式会社）(CDAA)で1週間飼育し、脂肪肝ラットを作製した（CDAA 1w）（n=6）。別の群では、さらに同条件で4週間飼育を行ったが、この期間中は、ランソプラゾール(AG-1749, 武田薬品工業株式会社)を乳鉢で粉砕し、溶媒液（0.5%カルボキシメチルセルロース溶液）を少しずつ加えて、最終的に30 mg/mlになるように調製した0.67mlの懸濁液を、26Gツベルクリン針で毎日１回背部の皮下に投与した。毎日、体重を測定し、投与量が30mg/kgになるように調整した。投与開始後、4週間でsamplingした（CDAA 5w + LAP 4w）。対照動物には、等容積の溶媒を毎日1回経皮投与した（CDAA 5w）（それぞれn=7）。
血液サンプル及び肝組織の採取と解析
　CDAAで1週間又は5週間飼育したラットは、体重測定後にイソフルランで麻酔を行い開胸し心臓より直接血液を採取した。また、肝臓を採取し重量を測定したのちに肝臓の一部を組織解析のために4%ホルマリン水溶液により固定し、又は遺伝子発現解析のためにRNAlator溶液に浸し、あるいはタンパク質発現解析のために液体窒素により急速凍結を行った。採取した血液を遠心分離し、血清を採取し常法にてAST及びALTの濃度を測定した。
肝線維化の評価
　固定された組織はパラフィンにより包埋を行い薄切し、Picroserius Red Stain Kit (Polyscienes)を用いて、コラーゲン（Ｉ及びＩＩＩ）線維を染色した。肝線維化のスコアリングは、Brunt(1)の基準を用いて行った(Brunt, EM. et al., Seminar Liv. Dis., 21:3～16 (2001))。
遺伝子発現の検討
　Real time RT-PCR法で、遺伝子発現量を測定した。RNAサンプルはRNAlatorに浸した組織よりRNeasy mini kitを用いて抽出を行いNano Drop 1000（Thermo Fischer）を用いて濃度測定を行った後に、AMV reverse transcriptase (Roche) により逆転写反応を行った。内部コントロールとして、ハウスキーピング遺伝子GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）を用いた。逆転写したサンプルは表１に示したプライマーと、LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche) 又はKAPA SYBR FAST qPCR Kit (KAPA Biosystems) を用いてリアルタイムPCRを行い定量した。増幅プロトコールは95℃ 5秒-60℃ 5秒-72℃ 12秒を45サイクル行った。検量線は標準cDNAサンプルを10倍希釈した系列を同一プロトコールで増幅し作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
蛋白発現量の検討
　ウェスタンブロット法でTGF-βの蛋白量を測定した。凍結保存したサンプルをPRO-PREPTM(INTRON）バッファーにホモジナイズし、氷上で20分間インキュベートした。13,000 x g、4℃で5分間遠心分離し、可溶性タンパクを抽出した。SDS-ポリアクリルアミドゲル（12.5%）で電気泳動し、PVDF膜(Millipore)に転写し、一次抗体としてウサギ抗TGFβ抗体（CST, 3711S）又はウサギ抗IL-6抗体（Abnova, PAB16165）を反応させた。次いで、HRP標識付の抗ウサギIgG抗体(Thermo, 31458)で反応後、ECL法で検出した。リプロービング後、ウサギ抗アクチン抗体 (Sigma-Aldrich, A5060)を一次抗体として反応させ、次にペルオキダーゼ標識した抗ウサギ抗体（NA934、Amersham）で反応後、ECL法で検出した。TGF-β免疫陽性シグナルの定量は、Lumino analyzer LAS-1000（Fuji Film）で行い、アクチン免疫陽性のシグナルで補正した。
（結果）
１．ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨに対する効果
　CDAAを1週間投与したラットでは、脂肪肝が認められ、さらに４週間CDAAの投与を続けることにより、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの特徴であるブリッジングフィブロシスの所見が認められた（CDAA 5w）（図１Ａ左）。対照的に、CDAA投与開始から２週目より４週間にわたりランソプラゾールを30 mg/kgで皮下投与することで、線維化が抑制された（CDAA 5w + LAP 4w）（図１Ａ右）。肝線維化のスコアリングを行ったところ、ランソプラゾールの投与により、Fibrosis score（ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨのステージ）は有意に抑制された（*: P=0.01、Mann-Whitney検定にて解析）（図１Ｂ）。
　CDAAを投与したラット(CDAA 5w)では、通常食で飼育したコントロールのラット(Normal)と比較して血清のAST及びALTの濃度は増加した。対照的に、ランソプラゾールを投与することで（CDAA 5w + LAP 4w）、血清ASTの濃度は有意に減少し（#: P< 0.05）、血清ALTについても減少傾向を示した（P=0.10）（図２）。統計解析は、Holmの多重検定にて解析した。
　従って、ランソプラゾールは、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの進行を有意に抑制することが示された。
２．Nrf2及びAhrの下流遺伝子の発現解析
　抗酸化ストレス作用を有する、Nrf2で誘導されるHO-1遺伝子及びAhrで誘導されるCyp1a1遺伝子の発現レベルを、RT-PCR法を用いて検討した。ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデルラットにおいて、ランソプラゾール投与により、Nrf2及びAhrのmRNAレベルは有意に上昇したが(*: P<0.05、Student’s t検定にて解析)、その下流にあるHO-1びAhrのmRANレベルの有意な変化は認められなかった(図３)。従って、ランソプラゾールのＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの予防及び／又は治療効果は、ランソプラゾールの抗酸化作用とは異なる作用によることが示された。
３．肝線維化関連遺伝子の発現解析
　肝線維化のメカニズムを調べるため、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデルラットの肝臓における、肝線維化と関連する3つの遺伝子（Timp1、Col1a1、Tgfb1）の発現量を測定した。その結果、ランソプラゾール投与によっては、いずれの遺伝子の発現も有意に変化しなかった（図４）。
４．TGF-βタンパク質の発現解析
　ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデルラットにおいて、ランソプラゾールは、肝臓における成熟TGF-βタンパク質の発現を有意に抑制した(*: P<0.05、Student’s t検定にて解析)（図５）。一方、ランソプラゾール投与によりTGF-β前駆体タンパク質の発現は抑制されなかった。線維化の促進に関与するTGF-βタンパク質が、ランソプラゾールにより抑制されることから、ランソプラゾールのＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨに対する肝線維化抑制効果は、成熟TGF-βの発現（即ち、TGF-βの活性化）抑制を介した経路によることが示唆された。
５．前炎症性サイトカインの発現解析
　ランソプラゾール投与による抗炎症効果のメカニズムを調べるために、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨモデルラットの肝臓における、前炎症性サイトカインIL-6及びIL-1βの遺伝子発現の量を測定した。その結果、ランソプラゾール投与により、IL-1β遺伝子の発現は変化しなかったが、IL-6の発現は有意に低下した（図６Ａ）。同様に、ランソプラゾール投与により、IL-6タンパク質の発現も低下した（図６Ｂ及びＣ）。
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
　ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本出願は、2016年3月9日付で日本国に出願された特願2016-046340を基礎としており、ここで言及することによりその内容は全て本明細書に包含される。
　ランソプラゾールは、消化性潰瘍治療剤として、従来より安全に使用されているので、本発明の予防及び／又は治療剤は、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの安全な予防及び／治療剤として有用である。

Claims (5)

  1. 　ランソプラゾールを含有してなる、非アルコール性脂肪性肝疾患／非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療剤。
  2. 　成人１日あたり５mg～１５０mgのランソプラゾールが投与されるように用いられる、請求項１記載の剤。
  3. 　成人１日あたり３０mgのランソプラゾールが投与されるように用いられる、請求項１記載の剤。
  4. 　ランソプラゾールを含有してなる、TGF-β発現抑制剤。
  5. 　ランソプラゾールを含有してなる、IL-6発現抑制剤。
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