WO2017138619A1 - 照射装置、レーザ顕微鏡システム、照射方法及びレーザ顕微鏡の検出方法 - Google Patents

照射装置、レーザ顕微鏡システム、照射方法及びレーザ顕微鏡の検出方法 Download PDF

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lights
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interference
diffracted
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秀治 三上
圭介 合田
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国立研究開発法人科学技術振興機構
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    • G02F2203/00—Function characteristic
    • G02F2203/22—Function characteristic diffractive

Definitions

  • the present invention relates to an irradiation apparatus, a laser microscope system, an irradiation method, and a laser microscope detection method.
  • a laser microscope system using a confocal optical system is known.
  • This laser microscope system collects laser light with an objective lens and irradiates the sample, and emits fluorescence and reflected light emitted from the sample through a condensing lens and a pinhole arranged at the focal position of the condensing lens. Light is received by a photodetector. Then, the sample surface is scanned by moving the irradiation position of the laser light in two orthogonal directions.
  • Patent Document 1 proposes a laser microscope system using a technique called frequency-multiplexed excitation (FIRE: Fluorescence-Imaging-using Radio-tagged Emission) method.
  • This frequency-multiplexed excitation laser microscope system includes a beam splitter that divides laser light into first and second laser light, and a plurality of diffracted lights having different deflection angles and frequency shifts from the first laser light.
  • AOD Acoustic-Optic Deflector
  • the frequency of the second laser beam is set.
  • a shift acousto-optic frequency shifter (hereinafter referred to as AOFS (Acousto-Optic Frequency Shifter)) and a plurality of diffracted lights from the AOD are superposed on the second laser light from the AOFS, and the diffracted light and second laser light And a beam splitter that generates excitation light whose intensity is modulated with a difference from the frequency (beat frequency), and an irradiation unit that irradiates the sample with the excitation light.
  • AOFS Acoustic-Optic Frequency Shifter
  • the irradiation unit forms a plurality of excitation light irradiation spots in a line and moves the plurality of irradiation spots in one direction.
  • the sample surface can be scanned by one movement of the plurality of irradiation spots in one direction.
  • Fluorescence from the fluorescent material in the sample is emitted from each part of the sample corresponding to the irradiation spot.
  • the emitted fluorescence changes in light intensity according to the beat frequency of the radiated interference light, and is modulated according to the distribution of the fluorescent substance in the sub-scanning line by moving the irradiation spot in the sub-scanning direction. It becomes a thing.
  • the fluorescence is an optical signal obtained by intensity-modulating a signal having the beat frequency of the irradiated interference light as the carrier frequency according to the distribution of the fluorescent substance.
  • detection light which is a multiplexed signal obtained by superimposing and multiplexing a plurality of optical signals from each irradiation spot, is detected by a photodetector such as an electron multiplier, and from the frequency spectrum, a moving region of each irradiation spot is detected.
  • the observation image is obtained by calculating the distribution of the fluorescent substance in
  • the frequency multiplex excitation method detects detection light (multiplexed signal) obtained by multiplexing a plurality of optical signals corresponding to each irradiation spot, a bandwidth that can be occupied by one optical signal. Is equal to the interval between adjacent carrier frequencies, that is, the interval between beat frequencies.
  • the frequency interval of the plurality of diffracted lights output from the AOD is equal to the frequency interval of each drive signal (comb component) included in the comb signal
  • the beat frequency interval of the excitation light is equal to the frequency interval of the drive signal. Be the same. Therefore, the bandwidth of the detection light is limited to the frequency width of the drive signal that can operate the AOD (hereinafter referred to as the operation band).
  • the practical AOD operating band is about 100 MHz to 200 MHz, for example, and may not be sufficient.
  • the bandwidth of each optical signal is widened, so the number of irradiation spots must be reduced, or the high-frequency component of each optical signal is cut to reduce the light It is necessary to limit the bandwidth of the signal, resulting in a decrease in spatial resolution and contrast, resulting in deterioration of the observation image.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides an irradiation apparatus, a laser microscope system, an irradiation method, and a detection method for a laser microscope, which can broaden the bandwidth of detection light as a multiplexed signal. For the purpose.
  • the irradiation apparatus includes a combination of a plurality of first lights having different frequencies and a plurality of second lights having different frequencies, each having a different frequency difference between the first light and the second light.
  • the interference light generation unit that generates a plurality of interference lights having different beat frequencies and the interference light irradiation unit that irradiates the plurality of interference lights are provided.
  • a laser microscope system of the present invention includes the above-described irradiation device and a photodetector that detects detection light generated by irradiating the sample with the interference light.
  • the irradiation method of the present invention includes a diffracted light generation step of generating a plurality of first lights having different frequencies and a plurality of second lights having different frequencies, a plurality of the first lights and a plurality of the second light.
  • Interference light generation step for generating a plurality of interference light beams having different beat frequencies and an irradiation step for irradiating the plurality of interference light beams.
  • the detection method of the laser microscope of the present invention includes a diffracted light generation step for generating a plurality of first lights having different frequencies and a plurality of second lights having different frequencies, a plurality of the first lights and a plurality of the plurality of first lights. Interfering with the second light to generate a plurality of interference light having different beat frequencies, an irradiation step for irradiating the plurality of interference light, and irradiating the sample with the interference light And a light detection step for detecting the detection light generated in step (b).
  • a plurality of first light beams having different frequencies and a plurality of second light beams having different frequencies are caused to interfere with each other in a combination having different frequency differences to generate and emit a plurality of interference lights. Therefore, the bandwidth of the detection light as the multiplexed signal can be made wider. Then, by widening the bandwidth, for example, it is possible to increase the observation image acquisition speed while maintaining the image quality of the observation image, or to increase the image quality of the observation image while maintaining the observation image acquisition speed.
  • a laser microscope system 10 that implements the present invention includes an interference light generation unit 11, an interference light irradiation unit 12, a light detection unit 13, and a signal processing unit 14.
  • the laser microscope system 10 irradiates the sample T from the interference light irradiation unit 12 with the plurality of interference light generated by the interference light generation unit 11 arranged in a line in the main scanning direction (M direction). Get an image.
  • interference light is irradiated onto the sample T as excitation light, fluorescence emitted from the sample T is detected by the light detection unit 13, and the obtained detection signal is processed by the signal processing unit 14.
  • the distribution of the fluorescent substance in each sub-scanning line is acquired, and an observation image for one frame showing the distribution of the fluorescent substance is generated.
  • the interference light generation unit 11 and the interference light irradiation unit 12 constitute an irradiation device.
  • the interference light generator 11 includes a laser device 15, a polarizing beam splitter 16, first and second arms 17, 18, a beam splitter 19, and the like.
  • the first arm 17 as the first light generation unit is a unit that generates a plurality of first diffracted lights as a plurality of first lights having different frequencies, and includes a half-wave plate 21 and an anamorphic prism pair. 22, a mirror 23, and a first acousto-optic deflector (hereinafter referred to as AOD (Acousto-Optic Deflector)) 24.
  • AOD Acoustic-Optic Deflector
  • the second arm 18 as the second light generation unit is a unit that generates a plurality of second diffracted lights as a plurality of second lights having different frequencies from each other, and includes a mirror 31, an acousto-optic frequency shifter (hereinafter, AOFS ( Acousto- Optic Frequency Shift)) 32, an anamorphic prism pair 33, and a second AOD 34.
  • AOFS Acousto- Optic Frequency Shift
  • Laser light from the laser device 15 as a laser light source enters the polarization beam splitter 16 via the half-wave plate 41.
  • the laser device 15 is a continuous oscillation type, and continuously outputs linearly polarized laser light.
  • a DPSS15 (Diode Pumped Solid State) laser that outputs laser light having a wavelength of 491 nm is used as the laser device 15.
  • the polarization beam splitter 16 is provided as a light splitting unit that splits the laser light from the laser device 15.
  • the polarization beam splitter 16 transmits a part of the incident laser light, emits the first laser light to the half-wave plate 21 of the first arm 17, reflects the remaining laser light, and transmits the second laser light.
  • the polarization beam splitter 16 transmits and reflects the laser light with an intensity ratio corresponding to the polarization direction of the laser light.
  • the polarization direction of the laser light incident on the polarization beam splitter 16 can be adjusted by the azimuth of the optical axis of the half-wave plate 41.
  • the intensity ratio between the first laser beam and the second laser beam is adjusted in consideration of the loss of each laser beam in the first arm 17 and the second arm 18.
  • the first laser light and the second laser light incident on the first and second AODs 24 and 34 are adjusted to have the same light intensity.
  • a half mirror or a non-polarization type beam splitter is used as the light splitting unit instead of the polarizing beam splitter 16. In this case, the half-wave plates 21 and 41 are not necessary.
  • the first diffracted light generated from the first laser light and the second diffracted light generated from the second laser light can interfere with each other, a laser device that outputs the first laser light; You may provide separately the laser apparatus which outputs a 2nd laser beam.
  • the first laser light from the polarization beam splitter 16 is incident on the first AOD 24 via the half-wave plate 21, the anamorphic prism pair 22, and the mirror 23.
  • the half-wave plate 21 rotates so that the polarization direction of the first laser light coincides with the polarization direction of the second laser light.
  • the anamorphic prism pair 22 changes the beam shape (cross-sectional shape) of the first laser light from a circular shape to an elliptical shape. This modification is performed by extending the beam shape along the diffraction direction of the first laser light by the first AOD 24 (the direction in which the traveling wave travels in the AOD). In this way, by deforming the beam shape of the first laser light, the spread of each first diffracted light emitted from the first AOD 24 is suppressed, and a reduction in resolution is prevented.
  • the first AOD 24 is driven by the first comb signal from the comb signal generator 42, and generates a plurality (N) of first diffracted light from the first laser light by diffraction. Each first diffracted light from the first AOD 24 enters the beam splitter 19.
  • the comb signal generator 42 is constituted by an arbitrary waveform generator, for example.
  • the first comb signal is obtained by superimposing drive signals having a plurality of different frequencies, and the first AOD 24 emits N first diffracted lights having different deflection angles simultaneously in response to the input of the first comb signal.
  • the first AOD 24 increases the deflection angle of the first diffracted light in proportion to the frequency of the drive signal, and shifts the frequency of the first diffracted light with respect to the first laser light. This frequency shift increases or decreases the frequency of the first diffracted light by the frequency of the drive signal with respect to the first laser light.
  • the first diffracted light whose frequency is increased by the frequency of the drive signal with respect to the first laser light is emitted from the first AOD 24.
  • the first diffracted light having a larger deflection angle has a higher frequency.
  • the deflection angle is an angle formed between the 0th-order diffracted light and the first diffracted light. Further, the frequency of the first diffracted light may be lowered by the frequency of the drive signal with respect to the first laser light.
  • the first comb signal is obtained by superimposing the N drive signal from the frequency f 11 to frequency f 1N at a constant frequency interval Delta] f.
  • N first diffracted lights from the frequency f a1 to the frequency f aN are output from the first AOD 24 at the frequency interval ⁇ f.
  • the frequency of the first laser beam that is, the laser beam output from the laser device 15
  • i 1, 2,... N
  • f ai f 0 + f 1i ”.
  • the difference in deflection angle between the adjacent first diffracted lights is made equal.
  • an AOD having an operable drive signal range (hereinafter referred to as an operation band) of 100 MHz to 200 MHz is used as the first AOD 24.
  • the frequency interval ⁇ f in the first comb signal is 1 MHz
  • the second laser light from the polarization beam splitter 16 is incident on the second AOD 34 via the mirror 31, the AOFS 32, and the anamorphic prism pair 33.
  • AOFS32 as frequency conversion unit is driven by a shift signal from the shift signal generator 43, to lower the frequency of the second laser beam by the shift frequency f s.
  • the AOFS 32 has the same operating band as the first AOD 24 as the second AOD 34, and uses a plurality of first diffracted light frequency ranges (first frequency ranges) and a plurality of second AODs 34 emitted from the second AOD 34.
  • the frequency range of the second diffracted light (second frequency range) is not overlapped.
  • the shift frequency f s is determined so that the frequency ranges of the plurality of first diffracted lights and the frequency ranges of the plurality of second diffracted lights do not overlap.
  • the shift frequency f s is 100 MHz.
  • the frequency of the second laser light may be increased by the shift frequency f s by the AOFS 32.
  • the AOFS 32 is provided so that the frequency ranges of the plurality of first diffracted lights and the frequency ranges of the plurality of second diffracted lights do not overlap. 1.
  • the AOFS 32 is not necessary when a plurality of first diffracted lights and a plurality of second diffracted lights whose frequency ranges do not overlap directly from the second laser light can be generated. Further, as will be described later, since the interference light is generated by combining the first diffracted light from the first AOD 24 and the second diffracted light from the second AOD 34, the beat frequency of the interference light can be lowered. Therefore, the AOFS for lowering the beat frequency can be made unnecessary in accordance with the response characteristics of the fluorescent material and the response speed of the fluorescent material of the sample T.
  • the anamorphic prism pair 33 deforms the beam shape of the second laser light from the AOFS 32 from a circle to an ellipse. This deformation is performed by extending the beam shape along the diffraction direction of the second laser light by the second AOD 34. Similar to the anamorphic prism pair 22, the anamorphic prism pair 33 suppresses the spread of each second diffracted light emitted from the second AOD 34 and prevents a reduction in resolution.
  • the second AOD 34 is driven by the second comb signal from the comb signal generator 42, and generates N second diffracted lights from the second laser light by diffraction.
  • Each second diffracted light from the second AOD 34 enters the beam splitter 19.
  • the second comb signal is obtained by superimposing drive signals having a plurality of different frequencies, and the second AOD 34 receives N second signals having different deflection angles by the input of the second comb signal.
  • the diffracted light is simultaneously emitted, and the frequency of each second diffracted light is made higher than that of the second laser light by the frequency of the drive signal due to the frequency shift.
  • N second diffracted lights from the frequency f b1 to the frequency f bN are output at the frequency interval ⁇ f.
  • the same AOD as the first AOD 24 and the second AOD 34 it is possible to easily superimpose a plurality of first diffracted lights and a plurality of second diffracted lights for generating a plurality of interference lights. That is, by using the first AOD 24 and the second AOD 34 in which the change amounts of the deflection angles of the first diffracted light and the second diffracted light are the same with respect to the change amount of the frequency of the drive signal in the comb signal, a plurality of first diffracted lights are used. And the angle intervals of the deflection angles of the plurality of second diffracted lights can be made equal to each other, thereby facilitating their superposition. For example, as will be described later, a plurality of first diffracted lights and a plurality of second diffracted lights can be overlapped with a simple configuration like a beam splitter 19 to obtain a desired plurality of interference lights.
  • the beam splitter 19 serving as an overlapping portion interferes between the first diffracted light and the second diffracted light by superimposing a plurality of first diffracted lights and a plurality of second diffracted lights in combination with different frequencies. N interference lights are generated.
  • the first AOD 24 and the second AOD 34 are arranged to emit the first diffracted light and the second diffracted light on the same horizontal plane, and the frequency of the first diffracted light L ai is f ai .
  • the beam splitter 19 superimposes the first diffracted light L ai and the second diffracted light L b (N ⁇ i + 1) to generate interference light L abi .
  • the orientation is adjusted so that. That is, N interference lights are generated by combining the first diffracted light and the second diffracted light in the order of increasing frequency for the first diffracted light and in the order of decreasing frequency of the second diffracted light.
  • the first diffracted light as the first light is selected in order from the one having the low frequency
  • the second diffracted light as the second light is selected in order from the one having the high frequency.
  • the second diffracted light are combined to generate N interference lights.
  • the frequencies f ai and f bi of the first diffracted light L ai and the second diffracted light L bi have higher frequencies as “i” increases (f a (i + 1) ⁇ f ai , f b (i + 1) ⁇ f bi ).
  • the second diffracted light corresponding to the first diffracted light may not completely overlap when generating the interference light.
  • the optical path lengths of the laser beams of the first arm 17 and the second arm 18 are set to coincide with each other in a range where the first diffracted light and the second diffracted light interfere (coherent length range).
  • the frequency interval between adjacent beat frequencies according to the method described in Patent Document 1 is the same as the frequency interval of the AOD drive signal that generates the diffracted light, and corresponds to the frequency interval ⁇ f in this example.
  • each beat frequency f abi becomes fluorescence of the sample T, that is, the carrier frequency (center frequency) of the optical signal that changes in accordance with the change in the light intensity of the fluorescence, and the side wave SB for each carrier frequency.
  • the frequency interval ⁇ f is 1 MHz
  • the bandwidth for each carrier frequency is 1 MHz and the total bandwidth is 100 MHz
  • the bandwidth for each carrier frequency is Is 2 MHz and the total bandwidth is 200 MHz.
  • the interference light is generated by superimposing the corresponding second diffracted light on each of the plurality of first diffracted lights as described above, laser light that is not used for interference distributed around each first diffracted light. Less. For this reason, the generation efficiency of interference light is increased and the light intensity of each interference light can be increased, so that shot noise can be reduced.
  • the combination of the first diffracted light and the second diffracted light when generating a plurality of interference lights having different beat frequencies as described above is an example, and the present invention is not limited to this.
  • the plurality of first diffracted lights and the plurality of second diffracted lights can be combined so that the difference in frequency between the first diffracted light and the second diffracted light is different. That's fine.
  • N interference lights from the beam splitter 19 are emitted side by side on the horizontal plane at equal angular intervals, and the anamorphic prism pair 44 and the relay optical system 45 that are part of the interference light generation unit 11 are transmitted.
  • the dichroic mirror 46 Through the dichroic mirror 46.
  • the direction in which N interference lights are arranged is a direction corresponding to the main scanning direction, and the direction orthogonal to the main scanning direction is the sub-scanning direction.
  • the main scanning direction is the vertical direction indicated by the arrow M
  • the sub-scanning direction is the horizontal direction indicated by the arrow S.
  • the anamorphic prism pair 44 is formed into a circular shape by extending the beam shape of each interference light that is elliptical by the anamorphic prism pairs 22 and 33 in the minor axis direction.
  • a cylindrical lens or the like may be used instead of the anamorphic prism pair 22, 33, 44.
  • the relay optical system 45 includes a lens 45a disposed on the beam splitter 19 side and a lens 45b disposed on the dichroic mirror 46 side.
  • the rear focal position of the lens 45b is arranged on the surface so as to coincide with a reflection surface of a scanning mirror 47a described later.
  • each interference light is made incident on the scanning mirror 47a while maintaining a predetermined beam diameter.
  • the dichroic mirror 46 reflects each interference light passing through the relay optical system 45 toward the interference light irradiation unit 12, transmits the detection light from the interference light irradiation unit 12, and sends it to the light detection unit 13.
  • the interference light irradiation unit 12 includes a resonant scanner 47 having a scanning mirror 47a, a mirror 48, a relay optical system 51, an objective lens 52, a stage (not shown) on which the sample T is placed, and the like.
  • N interference lights from the dichroic mirror 46 enter the objective lens 52 through the scanning mirror 47a, the mirror 48, and the relay optical system 51, and are irradiated onto the sample T.
  • Each interference light reflected by the dichroic mirror 46 is bent 90 degrees upward by the scanning mirror 47 a and then enters the mirror 48.
  • the resonant scanner 47 oscillates the scanning mirror 47a around a rotation axis 47b parallel to the horizontal direction orthogonal to the incident direction of the interference light, thereby periodically deflecting each interference light in the sub-scanning direction to make an equal angle. Scan.
  • the relay optical system 51 includes a lens 51a disposed on the mirror 48 side and a lens 51b disposed on the objective lens 52 side.
  • the front focal position of the lens 51a is on the reflection surface of the scanning mirror 47a, and the lens 51b.
  • the rear focal position is arranged to coincide with the entrance pupil of the objective lens 52.
  • the objective lens 52 collects incident N interference lights and irradiates the sample T toward the sample T. As shown in FIG. 5, the objective lens 52 forms N irradiation spots SP 1 to SP N obtained by condensing each interference light on the focal plane.
  • the irradiation spots SP 1 to SP N are arranged in a line in the main scanning direction at substantially the same pitch as their diameter.
  • the diameter (full width at half maximum) of the irradiation spots SP 1 to SP N is about 330 nm in this example.
  • the irradiation spots SP 1 to SP N are simultaneously moved in the sub-scanning direction while maintaining the state of being arranged in a line by the swing of the scanning mirror 47a.
  • the sample T is two-dimensionally scanned by one movement of the irradiation spots SP 1 to SP N in the sub-scanning direction.
  • the equiangular scanning in the sub-scanning direction of the interference light by the scanning mirror 47a is changed to constant velocity linear scanning.
  • the irradiation spots SP 1 to SP N move once in one direction, thereby completing the scanning for one frame.
  • the irradiation spots SP 1 to SP N will be referred to as irradiation spots SP when it is not necessary to distinguish them.
  • the resonant scanner 47 is a scanning unit that moves the irradiation lines of the irradiation spots SP 1 to SP N arranged on the line with respect to the sample T in the sub-scanning direction.
  • other light deflection means such as a galvanometer mirror or a polygon mirror may be used.
  • the irradiation lines of the irradiation spots SP 1 to SP N arranged on the line are moved in the sub-scanning direction with respect to the fixed sample T, but the two-dimensional sample T is scanned by the scanning unit.
  • the sample T and the irradiation line may be relatively moved. Therefore, the sample T may be moved in the sub-scanning direction with respect to the fixed irradiation line as in a fourth embodiment described later.
  • the relative movement direction of the sample T and the irradiation line is made to coincide with the sub-scanning direction orthogonal to the main scanning direction in which the irradiation spots SP 1 to SP N are arranged.
  • the relative movement direction of the sample T and the irradiation line need not be parallel to the main scanning direction, and when the angle between the irradiation line and the relative movement direction of the sample T is ⁇ , It is sufficient to satisfy “0 ° ⁇ ⁇ 90 °”. Therefore, the sample T and the irradiation line may be relatively moved in the direction intersecting with the main scanning direction. In this example, the irradiation line may be moved in the direction intersecting with the main scanning direction.
  • the relative movement direction of the sample T and the irradiation line is not the direction orthogonal to the main scanning direction, that is, when “0 ° ⁇ ⁇ 90 °”, the irradiation spot in the direction orthogonal to the movement direction Is substantially reduced (cos ⁇ times), the pixel size in this direction is reduced (the pixel resolution is improved), and the effect of improving the resolution is obtained.
  • the objective lens 52 is movable in the optical axis direction, and can be moved by, for example, a motor (not shown). Thereby, scanning can be performed by changing the position of the focal plane of the objective lens 52 with respect to the sample T.
  • the stage on which the sample T is placed may be moved in the optical axis direction of the objective lens 52.
  • the fluorescent material of the sample T in the irradiation spot SP is excited to generate fluorescence.
  • the irradiation spots SP 1 to SP N move in the sub-scanning direction
  • the N irradiation spots SP 1 to SP N arranged in the main scanning direction respectively correspond to the N sub-scanning lines arranged in the main scanning direction.
  • Interference light is irradiated. Thereby, fluorescence is emitted from each sub-scan line.
  • the light intensity of the fluorescence emitted from each sub-scanning line changes according to the beat frequency of the interference light to be irradiated, and the distribution of the fluorescent material in the sub-scanning line is caused by the movement of the irradiation spot SP in the sub-scanning direction. Will change accordingly. That is, the fluorescence is an optical signal obtained by intensity-modulating a signal having the beat frequency of the irradiated interference light as the carrier frequency according to the distribution of the fluorescent substance.
  • the first diffracted light and the second diffracted light both have a Gaussian intensity distribution, and the interference light is a superposition of the first diffracted light and the second diffracted light.
  • the half width of the distribution is narrow and the kurtosis is large. For this reason, the method of irradiating the sample T with the interference light obtained by superimposing the first diffracted light and the second diffracted light has an advantage that the spatial resolution is higher than that of the conventional method.
  • each fluorescence emitted from the irradiation spots SP 1 to SP N is collected by the objective lens 52, and detection light comprising each fluorescence is transmitted from the objective lens 52 to the relay optical system 51.
  • the detection light incident on the relay optical system 51 enters the dichroic mirror 46 through a path opposite to the interference light.
  • the detection light incident on the dichroic mirror 46 passes through the dichroic mirror 46 and is sent to the light detection unit 13.
  • the light detection unit 13 includes a mirror 54, a condensing lens 55, a slit plate 56, a photomultiplier tube (hereinafter referred to as “PMT”) 57, an amplifier 58, and a digitizer 59.
  • the detection light enters the PMT 57 via the mirror 54 and the condenser lens 55.
  • a slit plate 56 is disposed at the focal position of the condenser lens 55, and only the detection light transmitted through the slit 56 a formed in the slit plate 56 enters the PMT 57.
  • the laser microscope system 10 is confocal, and only the fluorescent component from the focal plane of the objective lens 52 is incident on the PMT 57 to improve contrast and spatial resolution.
  • the longitudinal direction of the slit 56 a is the direction in which the main scanning direction on the focal plane of the objective lens 52 is projected through an optical system between the focal plane and the slit plate 56.
  • an avalanche photodiode or the like may be used instead of the PMT 57.
  • the slit plate 56 may be omitted.
  • the PMT 57 outputs a detection signal corresponding to the intensity of incident detection light. That is, from each of the irradiation spots SP 1 to SP N , fluorescence modulated according to the distribution of the fluorescent substance is emitted as an optical signal, and detection light as a multiplexed signal obtained by superimposing these optical signals is multiplexed. A detection signal detected by the PMT 57 and corresponding to the multiplexed signal is output. At this time, in each optical signal, the beat frequency of the interference light irradiated as described above is the carrier frequency.
  • the detection signal from the PMT 57 is amplified by the amplifier 58 and then the signal level is sampled at a predetermined sampling frequency by the digitizer 59 and converted into detection data.
  • the digitizer 59 detects the start and end of scanning of one frame based on the synchronization signal output from the resonant scanner 47 in synchronization with the swing of the scanning mirror 47a, thereby converting the detection signal of one frame into detection data.
  • the detection data converted from the detection signal is sent to the signal processing unit 14.
  • the signal processing unit 14 is configured by, for example, a PC, and acquires information on the sample T, in this example, the distribution of the fluorescent material, from the detection signal.
  • the signal processing unit 14 includes a Fourier transform unit 14a, an inverse Fourier transform unit 14b, an image processing unit 14c, and a monitor 14d.
  • the Fourier transform unit 14a performs fast Fourier transform on the detection data for one frame obtained by one sub-scan to obtain a frequency spectrum.
  • the distribution of the fluorescent substance for the N sub-scanning lines obtained by the inverse Fourier transform unit 14b is converted into an observation image in which the distribution is two-dimensionally mapped by the image processing unit 14c and displayed on the monitor 14d.
  • STFT short-time Fourier transform
  • the STFT spectrum in the time range corresponding to the pixels in the main scanning direction corresponds to the luminance distribution in the sub-scanning direction, and the time change of the STFT spectrum becomes the observation image.
  • the bandwidth for each carrier frequency is wider than the conventional one, it is possible to obtain the distribution of the fluorescent material along the sub-scanning line by using the modulation component having a higher frequency than the conventional one. . Therefore, a good observation image can be obtained even if the moving speed of each irradiation spot SP in the sub-scanning direction is increased.
  • crosstalk may occur between the pair of irradiation spots SP, and unnecessary crosstalk components (beat frequencies) may be generated.
  • unnecessary crosstalk components beat frequencies
  • FIG. 6 between the adjacent irradiation spots SP i and SP i + 1 , the first diffracted light L ai of the interference light that forms the irradiation spot SP i and the interference that forms the irradiation spot SP i + 1.
  • the above crosstalk can be suppressed by satisfying the following two conditions.
  • the first condition is that each of the pair of irradiation spots is such that the crosstalk components generated by the two interferences of the first diffracted light and the second diffracted light cancel each other with respect to the crosstalk between the pair of adjacent irradiation spots.
  • the phase of the first diffracted light and the second diffracted light is set.
  • the second condition is that the crosstalk between a pair of irradiation spots sandwiching one irradiation spot should have a constant phase with respect to the interference light having a beat frequency that affects any crosstalk component. It is.
  • phase of each first diffracted light is set to “0”, and the phase of the second diffracted light is set to 1 such as 0, ⁇ , 0, ⁇ , 0... In order of frequency (wave number). Every other half period ( ⁇ ) may be shifted.
  • the phases of the first and second diffracted lights coincide with the phases of the drive signals (comb components) of the first and second comb signals
  • the phases of the first and second diffracted lights are set as described above.
  • the phase of each drive signal of the second comb signal may be shifted every other half cycle ( ⁇ ) in the order of frequency, such as 0, ⁇ , 0, ⁇ , 0.
  • the phase of each second diffracted light is set to “0”, and the phase of the first diffracted light is alternated every other half period ( ⁇ in the order of frequency, 0, ⁇ , 0, ⁇ , 0... ) You may shift.
  • both the first comb signal and the second comb signal may instantaneously show a very high peak value due to interference of their respective drive signals.
  • the overall amplitude of the first comb signal and the second comb signal is reduced under the influence of a very high peak value.
  • the overall amplitude of the interference light is also reduced. turn into.
  • the first diffracted light has phases of 0, ⁇ , 3 ⁇ , 6 ⁇ , 10 ⁇ ,.
  • the phase of the second diffracted light is preferably set to 0, ⁇ , ⁇ 3 ⁇ , ⁇ 6 ⁇ , ⁇ 10 ⁇ ,.
  • the interference light when i is 1, 2,..., N, when the interference light is generated by combining the first diffracted light L ai and the second diffracted light L b (N ⁇ i + 1) , the first diffracted light L ai Is set to “ ⁇ a + i (i ⁇ 1) ⁇ / 2 + (i ⁇ 1) ⁇ ”, and the phase of the second diffracted light L b (N ⁇ i + 1) is set to “ ⁇ b ⁇ i (i ⁇ 1) ⁇ ”. / 2 + (i ⁇ 1) ⁇ ”.
  • Both ⁇ a and ⁇ b are arbitrary constants, and the value ⁇ is a constant set to prevent the occurrence of a very high peak value and may be set to about 3 °.
  • the value ⁇ may be set to about 183 °.
  • the crosstalk component is added with substantially the same phase to the desired beat frequency component, there is a signal enhancement effect.
  • the order of the phases applied to the first diffracted light and the second diffracted light may be reversed, and the applied phases may be interchanged with the first diffracted light and the second diffracted light.
  • the phase of the first and second diffracted light may be set as the phase of the drive signal of the first and second comb signals.
  • the pp values (difference between the maximum value and the minimum value) of the first and second comb signals substantially coincide with the theoretical minimum value. Further, the pp value of the signal indicating the intensity change obtained by combining the intensity of each interference light is close to the theoretical minimum value. Therefore, the diffraction efficiency of the first AOD 24 and the second AOD 34 and the dynamic range of the light detection unit 13 are increased, which is advantageous.
  • the crosstalk component canceled as described above can be used as a signal.
  • the phase of the first diffracted light L ai is set to “ ⁇ a + i (i ⁇ 1) ⁇ / 2” in the same manner as described above.
  • the phase of the second diffracted light L b (N ⁇ i + 1) is set to “ ⁇ b ⁇ i (i ⁇ 1) ⁇ / 2”.
  • the center interval between the adjacent irradiation spots SP is set so that the adjacent irradiation spots SP partially overlap each other.
  • the crosstalk component is also caused by the overlap of diffracted light as in the case of the signal component described so far. Therefore, when the crosstalk component is used as a signal, it is desirable to increase the overlap and increase the amplitude as much as possible. It is. In this case, the crosstalk component between the two sets of the first diffracted light and the second diffracted light between the adjacent interference lights seems to have the same amplitude as the beat frequency component due to the interference between the original first and second diffracted lights. Thus, the number of pixels in the main scanning direction (number of sub-scanning lines) can be doubled. As a result, the frequency band per pixel is halved. However, as the frequency band is doubled compared to the conventional method, it is possible to obtain information of twice the number of pixels at the same speed. In addition, the effect of increasing the amount of information due to the increase in frequency band can be obtained.
  • the configuration of the laser microscope system 10 is an example, and is not limited to the above configuration.
  • the configuration for generating the plurality of first diffracted beams and the plurality of second diffracted beams is not limited to the above configuration.
  • the first and second AODs 24 and 34 may be driven by comb signals in a frequency range that do not overlap each other to generate the first and second diffracted lights.
  • the first and second AODs 24 and 34 the same AOD having an operating band of, for example, 100 to 300 MHz is used, the first AOD 24 is operated with the first comb signal in the frequency range of 101 to 200 MHz, and the second AOD 34 is set. You may operate with a second comb signal in the frequency range of 201-300 MHz.
  • the same AOD is used as the first and second AODs 24 and 34, and the first and second laser beams are incident on the corresponding AODs with positive and negative incident angles, thereby causing frequency shifts by the first and second AODs 24 and 34.
  • the first and second diffracted lights may be generated by reversing the positive and negative.
  • the positive and negative frequency shifts of the first and second diffracted beams with respect to the first and second laser beams are opposite to each other.
  • the frequency ranges of the second diffracted light do not overlap. It is preferable that the incident angles of the first and second laser beams with respect to the first and second AODs 24 and 34 are the same in order to increase the generation efficiency of interference light.
  • any of the above two configurations it is easy to superimpose a plurality of first diffracted lights and a plurality of second diffracted lights, and the frequency ranges of the first and second diffracted lights do not overlap, so AOFS 32 is not required. This is advantageous in reducing the number of parts.
  • the first and second AODs 24 and 34 may use different AODs. Even in this case, in order to generate a plurality of interference lights in the same manner as described above by using the second AOD 34 in which the change amount of the deflection angle with respect to the change amount of the frequency of the drive signal in the comb signal is the same as the first AOD 24. The plurality of first diffracted lights and the plurality of second diffracted lights can be easily superimposed. At this time, if the second AOD 34 that can operate with the second comb signal in the frequency range that does not overlap with the frequency range of the first comb signal is used, the frequency range of the first and second diffracted lights does not overlap, so the AOFS 32 is provided. There is no need.
  • interference light having the same beat frequency may be generated by overlapping a part of the frequency range of the first and second diffracted lights.
  • one interference light of the same beat frequency is left and the other interference light is blocked, for example, at a position where the interference light is condensed between the lenses 45a and 45b of the relay optical system 45. It may be removed by doing so.
  • the AOFS 32 can be omitted.
  • a laser microscope system is configured to detect fluorescence from a sample emitted to the side opposite to the objective lens.
  • symbol is attached
  • the configuration of the interference light generation unit is the same as that of the first embodiment, and therefore, the interference light generation unit is omitted in FIG. Note that FIGS. 9, 10, and 13 of the third and fourth embodiments described later are the same as those in FIG. 8.
  • N interference lights generated by the interference light generation unit are reflected by the mirror 71 and sent to the interference light irradiation unit 12.
  • N pieces of interference light are irradiated onto the sample T via the scanning mirror 47a, the mirror 48, the relay optical system 51, and the objective lens 52, and in the main scanning direction.
  • the N irradiation spots arranged are moved in the sub-scanning direction by the swing of the scanning mirror 47a, and scanning for one frame is performed.
  • a light detection unit 73 is arranged on the opposite side of the objective lens 52 with the sample T interposed therebetween.
  • a band pass filter 74 In the light detection unit 73, a band pass filter 74, a condensing lens 55, and a PMT 57 are arranged in order from the sample T side.
  • the band pass filter 74 cuts interference light and transmits fluorescence emitted from the sample T.
  • the fluorescence emitted to the back side that is, the side opposite to the objective lens 52 is received by the PMT 57 via the bandpass filter 74 and the condenser lens 55.
  • the bandwidth of the detection light is widened, for example, a good observation image can be obtained even if the moving speed of each irradiation spot SP in the sub-scanning direction is increased.
  • FIG. 9 shows a laser microscope system according to a third embodiment that detects and decomposes detection light into a plurality of wavelengths.
  • the laser microscope system of the third embodiment is the same as that of the first embodiment except that the light detection unit described in detail below is different, and substantially the same constituent members are denoted by the same reference numerals. Detailed description thereof is omitted.
  • a sample T containing one or more of three types of fluorescent substances that emit fluorescence of first to third wavelength components having different wavelengths by irradiation of interference light is provided. Used.
  • the light detection unit 81 includes first and second dichroic mirrors 82a and 82b as wavelength separation units, and first to third detection units 83a to 83c.
  • the first dichroic mirror 82a reflects the fluorescence of the first wavelength component included in the detection light toward the first detection unit 83a and transmits the other wavelength components.
  • the second dichroic mirror 82b reflects the fluorescence of the second wavelength component of the detection light transmitted through the first dichroic mirror 82a toward the second detection unit 83b, and the fluorescence of the other wavelength components is reflected by the second dichroic mirror 82a. 3 is transmitted toward the detection unit 83c.
  • Each of the first to third detection units 83a to 83c includes a condenser lens 55, a slit plate 56, and a PMT 57.
  • the first detection unit 83a receives the fluorescence of the first wavelength component reflected by the first dichroic mirror 82a by the PMT 57 via the condenser lens 55 and the slit plate 56, and changes the light intensity of the fluorescence of the first wavelength component.
  • a corresponding detection signal is output.
  • the second detection unit 83b receives the fluorescence of the second wavelength component reflected by the second dichroic mirror 82b by the PMT 57 via the condenser lens 55 and the slit plate 56, and changes the light intensity of the fluorescence of the second wavelength component.
  • the third detection unit 83c receives the fluorescence of the third wavelength component transmitted through the second dichroic mirror 82b by the PMT 57 via the condenser lens 55 and the slit plate 56, and responds to the light intensity of the fluorescence of the third wavelength component.
  • the detected signal is output.
  • the detection light is separated into three wavelength components, but the wavelength components to be separated may be two or more. Further, as in the second embodiment, detection light composed of fluorescence emitted from the sample T on the opposite side of the objective lens 52, detection light composed of reflected light reflected by the sample T as described later, and sample T Detection light consisting of interference light that has passed through can also be detected by being separated into wavelength components.
  • FIG. 10 shows a laser microscope system according to a fourth embodiment in which the irradiation spot and the sample are relatively moved in the sub-scanning direction by moving the sample in the sub-scanning direction.
  • the laser microscope system of the fourth embodiment is the same as that of the first embodiment except that the details will be described below.
  • the same reference numerals are given to substantially the same constituent members, and the detailed description thereof will be made. Omitted.
  • the example shown in FIG. 10 has a configuration in which the laser microscope system of the present invention is applied to a flow cytometer.
  • the interference light irradiation unit 86 irradiates the micro flow path 87 a formed in the flow cell (flow cytometry cell) 87 with interference light from the objective lens 52.
  • the focal plane of the objective lens 52 is located inside the micro flow path 87a, and the main scanning direction is adjusted to be a direction orthogonal to the flow direction in the micro flow path 87a. That is, the irradiation spots SP are formed in a line in a direction perpendicular to the flow direction in the micro flow path 87a.
  • N interference lights reflected by the dichroic mirror 46 are incident on the objective lens 52 via the relay optical system 51. ing. Even if the sample T flows at high speed in the minute flow path 87a, the bandwidth for each carrier frequency is widened, so that a good observation image can be obtained.
  • a component in the sub-scanning direction is included in the relative movement direction of the sample T and the irradiation line where the irradiation spots SP 1 to SP N are arranged. Therefore, in this example, it is only necessary that the main scanning direction in which the plurality of irradiation spots SP are arranged intersects the flow direction in the micro flow path 87a which is the sub-scanning direction.
  • FIG. 11 shows a fifth embodiment in which the first diffracted light and the second diffracted light are shifted.
  • the laser microscope system of the fifth embodiment is the same as that of the first embodiment except that the details will be described below, and the same reference numerals are given to substantially the same constituent members and the detailed description thereof will be made. Omitted.
  • 21 to SP 2N are formed side by side on the same line parallel to the main scanning direction at an arrangement pitch P substantially the same as the diameter thereof.
  • the irradiation spots SP 21 to SP 2N of the second diffracted light are shifted in the main scanning direction by 1 ⁇ 2 of the arrangement pitch P, and the irradiation spots SP 11 to SP Superimpose on 1N .
  • the phase is set, for example, by changing the phase of the first diffracted light L ai in order to prevent the crosstalk component from being suppressed, as in the case where the crosstalk component described in the first embodiment is used as a signal.
  • the phase of the second diffracted light L b (N ⁇ i + 1) is set to “ ⁇ b ⁇ i (i ⁇ 1) ⁇ / 2”.
  • the beam diameters of the first and second diffracted lights are increased so that the center distance between the adjacent first and second diffracted lights is the same as the spot diameter of the irradiation spot of the diffracted lights, or the former is the latter. What is necessary is just to set so that it may become smaller. At this time, the spot diameter may be adjusted to be larger than the center distance between the first and second diffracted lights. It is preferable to increase the overlap of the irradiation spots of the first and second diffracted lights. Since the intensity of the interference light increases as the overlap of the irradiation spots of the first and second diffracted lights increases, and the signal level of the detection signal can be increased accordingly, it is desirable to perform such setting.
  • the interference light irradiation spots are changed to the first diffracted light irradiation spots SP 11 to SP 1N and the second diffracted light. It is formed as a portion where the light irradiation spots SP 21 to SP 2N overlap.
  • the irradiation spot of the interference light lined up in the main scanning direction is about twice that in the first embodiment. That is, the number of pixels arranged in the main scanning direction (the number of sub-scanning lines) can be doubled, and the spatial resolution in the main scanning direction is improved.
  • the frequency band per pixel is halved, but since the frequency band is doubled compared to the conventional method, it is possible to obtain information of twice the number of pixels at the same speed as the conventional method. As a result, the effect of increasing the amount of information due to the increase of the frequency band can be obtained.
  • This embodiment is the limit in which the center distance between adjacent first and second diffracted beams becomes small, and is consistent with the case where the crosstalk component described in the first embodiment is used. This is because, when the center interval between the adjacent first and second diffracted lights becomes small, the spatial overlap between the adjacent first and second diffracted lights arranged in the main scanning direction approaches 100%. In FIG. 11, this is synonymous with the situation in which the beam diameter is increased while the center distance between the first and second diffracted beams is kept constant.
  • FIG. 12 shows a sixth embodiment in which the first diffracted light and the second diffracted light are generated by using one AOD as the first AOD and the second AOD.
  • the configuration of the laser microscope system in the sixth embodiment is different from the first embodiment only in that the interference light generation unit generates the first diffracted light and the second diffracted light using one AOD.
  • FIG. 12 only the principal part of the interference light generation part is drawn.
  • symbol is attached
  • the interference light irradiation unit, the light detection unit, and the signal processing unit of the laser microscope system of the sixth embodiment can have the same configuration as that of the other embodiments.
  • the interference light generation unit 11 of the laser microscope system includes a laser device 15, an AOFS 91, an anamorphic prism pair 92, a ⁇ / 2 plate 93, a relay optical system 94, an AOD 95, a relay optical system 96, and a wallace. Ton prism 97, polarizer 98, and the like.
  • the linearly polarized laser beam from the laser device 15 enters the AOFS 91.
  • the AOFS 91 divides laser light into first laser light Ba and second laser light Bb.
  • the AOFS 91 emits the transmitted component that has passed through the incident laser beam as it is, as the first laser beam Ba (transmitted light), and the diffracted component as the second laser beam Bb (converted light).
  • the AOFS 91 in the present embodiment is provided in order to make the frequency range of two types of diffracted light generated by the AOD 95 closer and lower the beat frequency of the interference light.
  • the frequency range of the drive signal to the AOD 95 is between 100 MHz and 200 MHz
  • the frequency shift range of the first diffracted light generated from the first laser light Ba is 100 MHz to 200 MHz, and is generated from the second laser light Bb.
  • the frequency shift range of the second diffracted light is “ ⁇ 100 MHz” to “ ⁇ 200 MHz”.
  • the frequency shift amount of the AOFS 91 may be set to “+200 MHz”.
  • the frequency range of the beat frequency of the interference light is between 200 MHz and 400 MHz.
  • Such a high-frequency component may not be able to obtain a sufficient signal level depending on the type of fluorescent substance to be excited or the operating band of the PMT 57, or may not detect a change in signal level with sufficient accuracy. Therefore, by shifting the frequency range of the beat frequency of the interference light to the low frequency region as a whole by the AOFS 91 as described above, it is possible to avoid a decrease in the signal level and to detect a change in the signal level with sufficient accuracy. Yes.
  • the first and second laser beams Ba and Bb pass through the anamorphic prism pair 92 and have their beam shapes expanded in the lateral direction (diffracting direction by the AOD 95), respectively, and then a relay optical system 94 including lenses 94a and 94b. Are incident on the incident surface of the AOD 95 at different incident angles.
  • a ⁇ / 2 plate 93 is disposed on the optical path of the first laser beam Ba between the anamorphic prism pair 92 and the relay optical system 94, and the first laser beam Ba is a ⁇ / 2 plate.
  • the direction of polarization is rotated 90 degrees by passing through 93. Note that the polarization direction of the second laser beam Bb may be rotated by 90 degrees instead of the first laser beam Ba.
  • the relay optical system 94 is adjusted so that its front focal position coincides with the output surface of the AOFS 91 and its rear focal position coincides with the incident surface of the AOD 95.
  • the AOD 95 functions as a first AOD that generates a plurality of first diffracted lights from laser light and a second AOD that generates a plurality of second diffracted lights from the laser light.
  • the AOD 95 receives a comb signal in which N drive signals having a constant frequency interval ⁇ f are superimposed. With the AOD 95, a plurality of first diffracted lights are generated from the incident first laser light Ba, and a plurality of second diffracted lights are generated from the second laser light Bb.
  • the first and second laser beams Ba and Bb are incident on the AOD at angles of incidence opposite to each other, the positive and negative frequency shifts of the first diffracted light and the second diffracted light emitted from the AOD 95 are opposite to each other. .
  • the second diffracted light is frequency-shifted by the AOFS 91 and the AOD 95 with respect to the original laser light frequency, and therefore the frequency shift by the AOFS 91 is the lowest frequency component of the comb signal that drives the AOD 95. It is better to double. Further, it is preferable that the incident angles of the first and second laser beams with respect to the AOD 95 are the same in order to increase the generation efficiency of the interference light.
  • the plurality of first diffracted lights and the plurality of second diffracted lights generated by the AOD 95 are different from each other to the Wollaston prism 97 as an overlapping portion via the relay optical system 96 including the lenses 96a and 96b. Incident from the direction.
  • the relay optical system 96 is adjusted so that its front focal position coincides with the output surface of the AOD 95 and its rear focal position coincides with the Wollaston prism 97.
  • the first and second diffracted lights emitted from the AOD 95 are orthogonal to each other in order to maintain the polarization states of the original first laser light Ba and second laser light Bb, respectively.
  • the first and second diffracted lights are incident on the Wollaston prism 97 via the relay optical system 96, so that the first diffracted light and the second diffracted light are combined between diffracted lights having different frequencies. That is, the combined light that is superimposed is emitted from the Wollaston prism 97.
  • a polarizer 98 that transmits only 45-degree linearly polarized light is disposed on the optical path of the combined light from the Wollaston prism 97.
  • the polarizer 98 When the combined light from the Wollaston prism 97 enters the polarizer 98, only the interference light that becomes 45-degree linearly polarized light from the combined light passes through the polarizer 98.
  • a plurality of interference lights equivalent to the interference lights emitted from the beam splitter 19 in the first embodiment are generated.
  • the plurality of interference lights are sent to the interference light irradiation unit via an anamorphic prism pair (not shown) that is circular by extending its beam shape in the minor axis direction.
  • the 0th-order component that is transmitted from the AOD 95 without being diffracted by the first laser beam Ba is coaxially overlapped with a part of the second diffracted light, but the 0th-order component of the first laser beam Ba is Since the polarizations are orthogonal, the Wollaston prism 97 is emitted in a direction different from the combined light and can be ignored.
  • the 0th-order component that is transmitted through the second laser beam Bb without being diffracted from the AOD 95 is coaxially overlapped with a part of the first diffracted beam, but since their polarizations are orthogonal to each other, the second laser beam Bb Can be ignored because the 0th-order component is emitted from the Wollaston prism 97 in a direction different from the combined light.
  • a single AOD 95 can be used to generate a plurality of first and second diffracted lights to generate a plurality of interference lights, and a component that generates the first and second diffracted lights. It is possible to reduce the score.
  • first diffracted lights and a plurality of second diffracted lights using one AOD by another method.
  • the first laser beam is incident from one surface of the AOD and a plurality of first diffracted beams are emitted from the other surface
  • the second laser beam is incident from the other surface of the AOD and A plurality of second diffracted lights are emitted.
  • the number of parts can be reduced because the number of AODs for generating the first and second diffracted beams is one.
  • the fluorescence from the sample T is detected, but is not limited thereto.
  • interference light transmitted through the sample T or interference light reflected (or backscattered) by the sample T may be detected.
  • a polarization beam splitter 99a and a quarter-wave plate 99b may be used instead of the dichroic mirror that separates the interference light and the detection light, for example, as shown in FIG.
  • the quarter wavelength plate 99b is disposed on the side of the interference light irradiation unit 12 of the polarization beam splitter 99a.
  • the reflected light incident on the polarization beam splitter 99 a has a polarization direction rotated by 90 degrees with respect to the interference light from the interference light generation unit, and passes through the polarization beam splitter 99 a toward the light detection unit 13.
  • the interference light basically has a wavelength different from that of the fluorescence, the transmitted light, the reflected light, and the fluorescence may be detected simultaneously by different detectors as in the third embodiment.
  • a plurality of first and second diffracted lights having different frequencies are generated using AOD, and a plurality of interference lights are generated therefrom. It is not limited.
  • FIG. 14 shows an example in which a plurality of diffracted lights L 1 , L 2 ... L N having different frequencies are generated using a modulation disk 101 having a predetermined transmittance or phase pattern formed on the surface.
  • the modulation disc 101 has a central shaft 102 attached to a motor 103 and is rotated at high speed by the motor 103.
  • the diffracted light L 1 , L 2 ... L N is emitted from the other surface of the modulation disk 101. Inject.
  • the modulation disc 101 is irradiated with the laser beam L in a line shape along the radial direction. Further, the modulation disk 101 has a deformed stripe pattern, and the period of the stripe is slightly longer than the wavelength of the laser beam to be irradiated. As a result, first-order diffracted light L 1 , L 2 ... L N is emitted from each position in the irradiation region of the laser light L on the modulation disk 101 without overlapping with other diffracted light.
  • the frequency shift amount of the diffracted light L 1 , L 2 ... L N varies along the radial direction of the modulation disk 101.
  • a plurality of diffracted lights as the first light or the second light having substantially the same properties as the diffracted light generated from the AOD can be obtained. Details of such a modulation disk 101 are described in the following document 1, document 2, and the like.
  • Reference 1 JEFFREY J. FIELD, DAVID G. WINTERS, AND RANDY A. BARTELS, J. Opt. Soc. A 32 (11) 2156 (2015).
  • Reference 2 Jeffrey S. Sanders, Ronald G. Driggers, Carl E. Halford, and Steven T. Griffin, Opt. Eng. 30 (11), 1720-1724 (1991).
  • the interference light for example, a configuration using the modulation disk 101 of FIG. 14 instead of the first AOD 24 and the second AOD 34 of the first embodiment shown in FIG.
  • a diffracted light portion having a large amount is used as the first diffracted light
  • a diffracted light portion having a small frequency shift amount generated from the other modulation disk 101 is used as the second diffracted light, and these may be superimposed.
  • the patterns of the two modulation disks 101 may be different from each other so that the frequency of the diffracted light obtained from each modulation disk 101 is different.
  • the sample T was observed using the same configuration as the laser microscope system 10 of FIG.
  • the laser microscope system 10 uses the same AOD that can operate with a driving signal of 102 MHz to 201 MHz as the first AOD 24 and the second AOD 34.
  • the first AOD 24 was driven by a first comb signal obtained by superimposing driving signals from 102 MHz to 201 MHz with a frequency interval ⁇ f of 1 MHz.
  • the second AOD 34 was also driven by a second comb signal obtained by superimposing driving signals from 102 MHz to 201 MHz with a frequency interval ⁇ f of 1 MHz.
  • the frequency ranges of the plurality of first diffracted beams and the frequency ranges of the plurality of second diffracted beams can be obtained.
  • the second laser light whose frequency was increased by the AOFS 32 in order to lower the beat frequency of the interference light to the low frequency region was made incident on the second AOD 34.
  • the AOFS 32 is driven by a shift signal having a frequency of 200 MHz, so that the frequency shift amount of the second laser light is set to “+200 MHz”.
  • the second diffracted light is combined in order from the highest frequency to generate 100 interference lights having different beat frequencies.
  • the first and second AODs 24 and 34 have an operating band of 100 to 200 MHz, but the AOD operating band is slightly deviated from the operating band because the operating efficiency of the AOD is defined by a frequency at which the diffraction efficiency is -3 dB. Works well even when excited at a frequency.
  • Frequency spectrum obtained by measuring a plurality of interference lights generated from the first and second diffracted lights from the first and second AODs 24 and 34 driven as described above and output from the objective lens 52 Is shown in FIG. From the frequency spectrum, it was confirmed that 100 interference lights having beat frequencies of 4 MHz to 202 MHz were formed at intervals of 2 MHz, and a bandwidth of 200 MHz was obtained.
  • a signal waveform as shown in FIG. 17 was obtained. This signal waveform has an amplitude of about 70% of an ideal signal waveform when the first diffracted light and the second diffracted light to be overlapped completely, and the generation efficiency of interference light is about 70%. I understood.
  • the frame rate that is, the scanning mirror 47a was swung at 16 KHz, and fluorescent beads with an average diameter of 6 ⁇ m were detected as the sample T.
  • An observation image obtained from this detection is shown in FIG.
  • the horizontal direction is the main scanning direction (M) in which the irradiation spots SP are arranged
  • the vertical direction is the sub-scanning direction (S) in which the irradiation spots SP move.

Abstract

多重化信号としての検出光の帯域幅をより広くすることができる照射装置、レーザ顕微鏡システム、照射方法及びレーザ顕微鏡の検出方法を提供する。レーザ光を分離して第１ＡＯＤ（２４）、第２ＡＯＤ（３４）にそれぞれ入射することによって偏向角と周波数シフトの大きさが互いに異なる複数の第１回折光及び第２回折光を生成する。ビームスプリッタ（１９）で第１回折光と第２回折光とを重ね合わせて、互いにビート周波数が異なる複数の干渉光を生成する。対物レンズ（５２）は、主走査方向に複数の干渉光の照射スポットをライン状に並べて形成し、試料（Ｔ）に干渉光を照射する。走査ミラー（４７ａ）の揺動で照射スポットを主走査方向と直交する副走査方向に移動する。各干渉光の照射で試料（Ｔ）から放出される蛍光を光検出部（１３）で検出する。

Description

照射装置、レーザ顕微鏡システム、照射方法及びレーザ顕微鏡の検出方法
　本発明は、照射装置、レーザ顕微鏡システム、照射方法及びレーザ顕微鏡の検出方法に関する。
　共焦点光学系を用いたレーザ顕微鏡システムが知られている。このレーザ顕微鏡システムは、レーザ光を対物レンズで集光して試料に照射し、試料から放出される蛍光や反射光を集光レンズ及び集光レンズの焦点位置に配されたピンホールを介して光検出器で受光する。そして、レーザ光の照射位置を直交する２方向にそれぞれ移動することにより、試料表面を走査している。
　一方、周波数多重励起（ＦＩＲＥ：Fluorescence Imaging using Radiofrequency-tagged Emission）法と称される手法を用いたレーザ顕微鏡システムが特許文献１によって提案されている。この周波数多重励起法のレーザ顕微鏡システムは、レーザ光を第１、第２のレーザ光に分けるビームスプリッタと、第１のレーザ光から偏向角と周波数シフトの大きさが互いに異なる複数の回折光を出力する音響光学ディフレクタ（以下、ＡＯＤ（Acousto-Optic Deflector）と称する）と、光検出器の応答性や蛍光の応答速度を考慮してビート周波数を低くするために第２のレーザ光の周波数をシフトする音響光学周波数シフタ（以下、ＡＯＦＳ（Acousto-Optic Frequency Shifter）と称する）と、ＡＯＤからの複数の回折光にＡＯＦＳからの第２のレーザ光を重ね合わせ、回折光と第２のレーザ光との周波数との差（ビート周波数）で強度変調された励起光を生成するビームスプリッタと、励起光を試料に照射する照射部とを備えている。
　上記周波数多重励起法のレーザ顕微鏡システムでは、照射部が複数の励起光の照射スポットをライン状に並べて形成し、これら複数の照射スポットを一方向に移動している。これにより、複数の照射スポットの一方向への１回の移動で、試料表面を走査することができる。照射スポットに対応した試料の各部分からは、試料内の蛍光物質からの蛍光が放出される。そして、放出される蛍光は、照射される干渉光のビート周波数に応じて光強度が変化するとともに、照射スポットの副走査方向への移動によって、副走査ラインにおける蛍光物質の分布に応じて変調されたものになる。すなわち、蛍光は、照射された干渉光のビート周波数を搬送周波数とした信号を蛍光物質の分布に応じて強度変調した光信号である。そして、各照射スポットからの複数の光信号を重ね合わせて多重化した多重化信号である検出光が電子増倍管等の光検出器で検出され、その周波数スペクトルから、各照射スポットの移動領域における蛍光物質の分布を算出して観察画像を得ている。
国際公開第２０１４／１１０２９０号
　上記のように周波数多重励起法は、各照射スポットに対応した複数の光信号を多重化した検出光（多重化信号）を検出しているため、１つの光信号が占有することができる帯域幅の上限は隣接した搬送周波数の間隔、すなわちビート周波数の間隔と等しくなる。一方、ＡＯＤが出力する複数の回折光の周波数の間隔は、コム信号に含まれる各駆動信号（コム成分）の周波数間隔と等しいから、励起光のビート周波数の間隔は、駆動信号の周波数間隔と同じになる。したがって、検出光の帯域幅は、ＡＯＤが動作可能な駆動信号の周波数の幅（以下、動作帯域という）に制限される。
　また、実用上のＡＯＤの動作帯域は、例えば１００ＭＨｚ～２００ＭＨｚ程度であり十分とはいえない場合がある。このため、例えば照射スポットの移動速度を高くした場合には、各光信号の帯域幅が広がるから、照射スポットの個数を少なくしなければならず、あるいは各光信号の高周波成分をカットして光信号の帯域幅を制限する必要があり空間分解能やコントラストの低下を招き観察画像を劣化させてしまう。逆に、画質の高い観察画像を得るためには、複数の照射スポットの移動速度を低くする必要があった。
　本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、多重化信号としての検出光の帯域幅をより広くすることができる照射装置、レーザ顕微鏡システム、照射方法及びレーザ顕微鏡の検出方法を提供することを目的とする。
　本発明の照射装置は、互いに異なる周波数の複数の第１の光と互いに異なる周波数の複数の第２の光とを、前記第１の光と前記第２の光との周波数の差が異なる組み合わせで干渉させることよって、ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する干渉光生成部と、複数の前記干渉光を照射する干渉光照射部とを備えるものである。
　本発明のレーザ顕微鏡システムは、上記の照射装置と、前記干渉光を試料に照射することで生じた検出光を検出する光検出器とを備えるものである。
　本発明の照射方法は、互いに異なる周波数の複数の第１の光と互いに異なる周波数の複数の第２の光を生成する回折光生成ステップと、複数の前記第１の光と複数の前記第２の光とを干渉させることよって、ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する干渉光生成ステップと、複数の前記干渉光を照射する照射ステップとを有するものである。
　本発明のレーザ顕微鏡の検出方法は、互いに異なる周波数の複数の第１の光と互いに異なる周波数の複数の第２の光を生成する回折光生成ステップと、複数の前記第１の光と複数の前記第２の光とを干渉させることよって、ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する干渉光生成ステップと、複数の前記干渉光を照射する照射ステップと、前記干渉光を試料に照射することで生じた検出光を検出する光検出ステップとを有するものである。
　本発明によれば、互いに異なる周波数の複数の第１の光と互いに異なる周波数の複数の第２の光とを、周波数の差が異なる組み合わせで干渉させて複数の干渉光を生成して照射するので、多重化信号としての検出光の帯域幅をより広くすることができる。そして、帯域幅が広がることで、例えば観察画像の画質を維持しながら観察画像の取得速度を高くしたり、観察画像の取得速度を維持しながら観察画像の画質を高くすることが可能になる。
第１実施形態に係るレーザ顕微鏡システムの構成を示す概略図である。 コム信号と第１、第２回折光の周波数スペクトルを示す説明図である。 干渉光を生成する際の第１回折光と第２回折光との組み合わせを示す説明図である。 干渉光の周波数スペクトルを示す説明図である。 検出光の周波数スペクトルを示す説明図である。 照射スポットの副走査方向への移動状態を示す説明図である。 隣接した照射スポット間で生じるクロストークを示す説明図である。 １つの照射スポットを挟んだ一対の照射スポット間で生じるクロストークを示す説明図である。 対物レンズと反対側に光検出部を配した第２実施形態のレーザ顕微鏡システムの要部構成を示す概略図である。 試料から放出される蛍光を波長ごとに分離して検出する第３実施形態のレーザ顕微鏡システムの要部構成を示す概略図である。 フローサイトメータにレーザ顕微鏡システムを適用した第４実施形態の要部構成を示す概略図である。 第１回折光の照射スポットに対して第２回折光の照射スポットをずらした第５実施形態を示す説明図である。 １つのＡＯＤを用いた第６実施形態の要部構成を示す説明図である。 干渉光が試料で反射した反射光を検出する例を示す説明図である。 変調ディスクを用いて周波数が異なる回折光を生成する例を示す説明図である。 変調ディスクのパターンを模式的に示す説明図である。 実施例における干渉光の周波数スペクトルを示すグラフである。 図１６の周波数スペクトルをフーリエ変換して得られた信号波形を示すグラフである。 実施例で得られた観察画像である。
［第１実施形態］
　図１に示すように、本発明を実施したレーザ顕微鏡システム１０は、干渉光生成部１１と、干渉光照射部１２と、光検出部１３と、信号処理部１４とを備えている。このレーザ顕微鏡システム１０は、干渉光生成部１１で生成した複数の干渉光を主走査方向（Ｍ方向）にライン状に並べた状態で干渉光照射部１２から試料Ｔに照射して試料Ｔの画像を取得する。この例のレーザ顕微鏡システム１０は、干渉光が励起光として試料Ｔに照射され、試料Ｔから放出される蛍光を光検出部１３で検出し、得られる検出信号を信号処理部１４で処理することにより、各副走査ラインにおける蛍光物質の分布を取得して、蛍光物質の分布を示す１フレーム分の観察画像を生成する。
　干渉光生成部１１は、干渉光照射部１２とともに照射装置を構成する。干渉光生成部１１は、レーザ装置１５、偏光ビームスプリッタ１６、第１及び第２アーム１７、１８、ビームスプリッタ１９等で構成される。第１光生成部としての第１アーム１７は、互いに周波数が異なる複数の第１の光としての複数の第１回折光を生成するユニットであり、１／２波長板２１、アナモルフィックプリズムペア２２、ミラー２３、第１音響光学ディフレクタ（以下、ＡＯＤ（Acousto-Optic Deflector）と称する）２４を備える。第２光生成部としての第２アーム１８は、互いに周波数が異なる複数の第２の光としての複数の第２回折光を生成するユニットであり、ミラー３１、音響光学周波数シフタ（以下、ＡＯＦＳ（Acousto- Optic Frequency Shifter）と称する）３２、アナモルフィックプリズムペア３３、第２ＡＯＤ３４を備える。
　レーザ光源としてのレーザ装置１５からのレーザ光は、１／２波長板４１を介して偏光ビームスプリッタ１６に入射する。レーザ装置１５は、連続発振タイプであり、直線偏光のレーザ光を連続的に出力する。この例では、レーザ装置１５としては、波長４９１ｎｍのレーザ光を出力するＤＰＳＳ (Diode Pumped Solid State)レーザを用いている。
　偏光ビームスプリッタ１６は、レーザ装置１５からのレーザ光を分割する光分割部として設けられている。この偏光ビームスプリッタ１６は、入射するレーザ光の一部を透過して第１レーザ光として第１アーム１７の１／２波長板２１に射出し、残りのレーザ光を反射して第２レーザ光として第２アーム１８のミラー３１に射出する。この偏光ビームスプリッタ１６は、レーザ光の偏光方向に応じた強度比でレーザ光を透過及び反射する。偏光ビームスプリッタ１６に入射するレーザ光の偏光方向は、１／２波長板４１の光学軸の方位によって調整することができる。これにより、第１アーム１７、第２アーム１８における各レーザ光の損失を考慮して、第１レーザ光と第２レーザ光との強度比を調整している。例えば、第１、第２ＡＯＤ２４、３４に入射する第１レーザ光と第２レーザ光との光強度が同じになるように調整している。なお、第１レーザ光と第２レーザ光との強度比を調整する必要がない場合には、光分割部として、偏光ビームスプリッタ１６に代えて、ハーフミラーや無偏光タイプのビームスプリッタを用いることができ、この場合には１／２波長板２１、４１は不要である。
　また、後述するように第１レーザ光から生成される第１回折光と、第２レーザ光から生成される第２回折光とを干渉させることができれば、第１レーザ光を出力するレーザ装置と第２レーザ光を出力するレーザ装置とを別々に設けてもよい。
　第１アーム１７では、偏光ビームスプリッタ１６からの第１レーザ光が１／２波長板２１、アナモルフィックプリズムペア２２、ミラー２３を介して第１ＡＯＤ２４に入射する。１／２波長板２１は、第１レーザ光の偏光方向を、第２レーザ光の偏光方向に一致するように回転する。
　アナモルフィックプリズムペア２２は、第１レーザ光のビーム形状（断面形状）を円形から楕円形に変形させる。この変形では第１ＡＯＤ２４による第１レーザ光の回折方向（ＡＯＤ内で進行波が進む方向）に沿ってビーム形状を引き延ばすことにより行う。このように、第１レーザ光のビーム形状を変形することで、第１ＡＯＤ２４から射出される各第１回折光の広がりを抑え、分解能の低下を防止している。
　第１ＡＯＤ２４は、コム信号発生部４２からの第１コム信号によって駆動され、回折によって第１レーザ光から複数（Ｎ本）の第１回折光を生成する。この第１ＡＯＤ２４からの各第１回折光は、ビームスプリッタ１９に入射する。コム信号発生部４２は、例えば任意波形発生器で構成されている。
　第１コム信号は、互いに異なる複数の周波数の駆動信号を重ねたものであり、この第１コム信号の入力によって第１ＡＯＤ２４は、偏向角が異なるＮ本の第１回折光を同時に射出する。また、第１ＡＯＤ２４は、駆動信号の周波数に比例して、第１回折光の偏向角を大きくするとともに、第１回折光を、第１レーザ光に対して周波数シフトする。この周波数シフトは、第１レーザ光に対して駆動信号の周波数だけ第１回折光の周波数が高くまたは低くなる。この例では、第１レーザ光に対して駆動信号の周波数分だけ周波数が高くなった第１回折光が第１ＡＯＤ２４から射出する。したがって、偏向角が大きい第１回折光ほど周波数が高くなる。なお、偏向角は、０次の回折光と第１回折光とのなす角度である。また、第１レーザ光に対して駆動信号の周波数分だけ第１回折光の周波数を低くしてもよい。
　図２に示すように、第１コム信号は、一定な周波数間隔Δｆで周波数ｆ１１から周波数ｆ１ＮまでのＮ個の駆動信号を重ねたものである。これにより、第１ＡＯＤ２４からは、周波数間隔Δｆで周波数ｆａ１から周波数ｆａＮまでのＮ本の第１回折光が出力される。ここで、第１レーザ光、すなわちレーザ装置１５から出力されるレーザ光の周波数をｆ０、ｉを１、２・・・Ｎとすると「ｆａｉ＝ｆ０＋ｆ１ｉ」となる。また、周波数間隔Δｆを一定にすることで、隣接した第１回折光同士の偏向角の差をいずれも等しくしている。
　この例では、第１ＡＯＤ２４として、動作可能な駆動信号の範囲（以下、動作帯域という）が１００ＭＨｚ～２００ＭＨｚのＡＯＤを用いている。また、第１コム信号における周波数間隔Δｆを１ＭＨｚとして、１０１ＭＨｚ（＝ｆ１１）から２００ＭＨｚ（＝ｆ１(１００)）までの駆動信号を重ね合わせており、これにより周波数が１ＭＨｚ間隔（＝Δｆ）で変化する１００（＝Ｎ）本の第１回折光を生成する。
　図１において、第２アーム１８では、偏光ビームスプリッタ１６からの第２レーザ光は、ミラー３１、ＡＯＦＳ３２、アナモルフィックプリズムペア３３を介して第２ＡＯＤ３４に入射する。周波数変換部としてのＡＯＦＳ３２は、シフト信号発生部４３からのシフト信号によって駆動され、第２レーザ光の周波数をシフト周波数ｆｓだけ低くする。このＡＯＦＳ３２は、第２ＡＯＤ３４として、第１ＡＯＤ２４と同じ動作帯域であり、同じ特性を持つＡＯＤを用いながら、複数の第１回折光の周波数範囲（第１の周波数範囲）と第２ＡＯＤ３４から射出される複数の第２回折光の周波数範囲（第２の周波数範囲）とが重ならないようにしている。このため、シフト周波数ｆｓは、複数の第１回折光の周波数範囲と複数の第２回折光の周波数範囲とが重ならないように決められている。この例では、シフト周波数ｆｓは、１００ＭＨｚとしてある。また、ＡＯＦＳ３２によって、第２レーザ光の周波数をシフト周波数ｆｓだけ高くしてもよい。
　上記のように、ＡＯＦＳ３２は、複数の第１回折光の周波数範囲と複数の第２回折光の周波数範囲とが重ならないようにするために設けているので、第１、第２ＡＯＤ２４、３４によって第１、第２レーザ光から直接に周波数範囲が重ならない複数の第１回折光と複数の第２回折光とを生成することができる場合には、ＡＯＦＳ３２は、不要である。また、後述するように、第１ＡＯＤ２４からの第１回折光と第２ＡＯＤ３４からの第２回折光とを組み合わせて干渉光を生成することで、干渉光のビート周波数を低くできるので、光検出部１３の応答性や試料Ｔの蛍光物質の応答速度に対応させてビート周波数を低くするためのＡＯＦＳを不要とすることができる。
　アナモルフィックプリズムペア３３は、ＡＯＦＳ３２からの第２レーザ光のビーム形状を円形から楕円形に変形させる。この変形では第２ＡＯＤ３４による第２レーザ光の回折方向に沿ってビーム形状を引き延ばすことにより行う。アナモルフィックプリズムペア３３は、アナモルフィックプリズムペア２２と同様に、第２ＡＯＤ３４から射出される各第２回折光の広がりを抑え、分解能の低下を防止している。
　第２ＡＯＤ３４は、コム信号発生部４２からの第２コム信号によって駆動され、回折によって第２レーザ光からＮ本の第２回折光を生成する。第２ＡＯＤ３４からの各第２回折光は、ビームスプリッタ１９に入射する。第２コム信号は、第１コム信号と同様に、互いに異なる複数の周波数の駆動信号を重ねたものであり、この第２コム信号の入力によって第２ＡＯＤ３４は、偏向角が異なるＮ本の第２回折光を同時に射出し、各第２回折光は、その周波数が周波数シフトによって駆動信号の周波数分だけ第２レーザ光よりも高くされている。
　この例では、第２ＡＯＤ３４としては、上述のように第１ＡＯＤ２４と同じＡＯＤを用いている。すなわち、同一の周波数の駆動信号に対する回折光の偏向角が同じになり、駆動信号の周波数の変化量に対する第１回折光と第２回折光の偏向角の変化量が同じになる第１ＡＯＤ２４と第２ＡＯＤ３４とを用いている。また、図２に示すように、第２コム信号の各駆動信号の周波数と第１コム信号の各駆動信号の周波数とを同じにしている（ｆ１ｉ＝ｆ２ｉ）。したがって、第２コム信号は、周波数間隔Δｆで周波数ｆ２１（＝ｆ１１）から周波数ｆ２Ｎ（＝ｆ１Ｎ）までのＮ個の駆動信号を重ねたものになっている。第２ＡＯＤ３４からは、周波数間隔Δｆで周波数ｆｂ１から周波数ｆｂＮまでのＮ本の第２回折光が出力される。第２回折光の周波数ｆｂｉは、対応する駆動信号の周波数ｆ２ｉを用いて「ｆｂｉ＝ｆ０－ｆｓ＋ｆ２ｉ」となる。
　第１ＡＯＤ２４と第２ＡＯＤ３４として、同じＡＯＤを用いることによって、複数の干渉光を生成するための複数の第１回折光と複数の第２回折光との重ね合わせを容易にしている。すなわち、コム信号中の駆動信号の周波数の変化量に対する第１回折光と第２回折光の偏向角の変化量が同じになる第１ＡＯＤ２４と第２ＡＯＤ３４とを用いることによって、複数の第１回折光と複数の第２回折光の偏向角の角度間隔を互いに同じすることができ、それらの重ね合わせを容易にしている。例えば、後述するようにビームスプリッタ１９のように簡単な構成で複数の第１回折光と複数の第２回折光とを重ね合わせて、所望の複数の干渉光を得ることができる。
　上記第２ＡＯＤ３４は、第１ＡＯＤ２４と同じく周波数が１ＭＨｚ間隔（＝Δｆ）で変化する１００（＝Ｎ）本の第２回折光を生成する。また、同じ周波数の駆動信号に対する第２回折光と第１回折光との各偏向角は同じであるが、各周波数はＡＯＦＳ３２のシフト周波数ｆｓだけ第１回折光の周波数が高くなる（ｆａｉ＝ｆｂｉ＋ｆｓ）。
　重ね合わせ部としてのビームスプリッタ１９は、複数の第１回折光と複数の第２回折光とを互いに周波数が異なる同士で組み合わせて重ねることで、第１回折光と第２回折光とが干渉したＮ本の干渉光を生成する。図３に示すように、第１ＡＯＤ２４と第２ＡＯＤ３４とは、同一の水平面に各第１回折光、各第２回折光を射出するように配置され、第１回折光Ｌａｉの周波数をｆａｉ、第２回折光Ｌｂｉの周波数をｆｂｉとしたときに、ビームスプリッタ１９によって、第１回折光Ｌａｉと第２回折光Ｌｂ（Ｎ―ｉ＋１）とを重ね合わせて干渉光Ｌａｂｉを生成するように、その向きが調整されている。すなわち、第１回折光については周波数が高くなる順番で、また第２回折光は周波数が低くなる順番で、第１回折光と第２回折光とを組み合わせてＮ本の干渉光を生成する。このようにして、第１の光としての第１回折光については周波数が低いものから、また第２の光としての第２回折光は周波数が高いものからそれぞれ順番に選択される第１回折光と第２回折光とを組み合わせてＮ本の干渉光を生成している。なお、第１回折光Ｌａｉ及び第２回折光Ｌｂｉの周波数ｆａｉ、ｆｂｉは、「ｉ」が大きいほど周波数が高い（ｆａ（ｉ＋１）≧ｆａｉ、ｆｂ（ｉ＋１）≧ｆｂｉ）。
　なお、干渉光を生成する際に、第１回折光に対応する第２回折光が完全に重ならなくてもよい。また、第１アーム１７と第２アーム１８の各レーザ光の光路長は、第１回折光と第２回折光とが干渉する範囲（コヒーレント長の範囲）で一致させておく。
　上記のように、第１回折光と第２回折光とを重ね合わせることにより、図４Ａに示すように、各干渉光の隣接したビート周波数ｆａｂｉ（＝ｆａｉ－ｆｂ（Ｎ―ｉ＋１））を一定な周波数間隔Δｆａｂ（＝ｆａｂ（ｉ＋１）－ｆａｂｉ）にするとともに、その周波数間隔Δｆａｂを従来よりも広くしている。具体的には、特許文献１に記載される手法による隣接したビート周波数の周波数間隔は、回折光を生成するＡＯＤの駆動信号の周波数間隔と同じであって、この例の周波数間隔Δｆに相当する。しかし、この例では隣接したビート周波数ｆａｂの周波数間隔Δｆａｂは、ＡＯＤの駆動信号の周波数間隔Δｆの２倍（Δｆａｂ＝２・Δｆ）になる。
　図４Ｂに示すように、各ビート周波数ｆａｂｉは、それぞれ試料Ｔを蛍光、すなわち蛍光の光強度の変化に応じて変化する光信号の搬送周波数（中心周波数）となり、搬送周波数ごとに側波ＳＢとして利用可能な幅、すなわち帯域幅が周波数間隔Δｆａｂとなる。したがって、搬送周波数ごとの帯域幅と、Ｎ本の干渉光による検出で利用可能な全帯域幅が従来手法の２倍になる。具体的には、この例では周波数間隔Δｆが１ＭＨｚであるから、従来手法では搬送周波数ごとの帯域幅が１ＭＨｚ、全帯域幅が１００ＭＨｚであるのに対して、この例では搬送周波数ごとの帯域幅が２ＭＨｚ、全帯域幅が２００ＭＨｚである。
　また、上記のように複数の第１回折光のそれぞれに、対応する第２回折光を重ねて干渉光を生成しているので、各第１回折光の周囲に分布する干渉に利用されないレーザ光が少なくなる。このため干渉光の生成効率が高くなるとともに、各干渉光の光強度を高めることができるので、ショットノイズの低減を図ることができる。
　上記のようにビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する際の第１回折光と第２回折光の組み合わせは一例であり、これに限定されるものではない。ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成するには、第１の回折光と第２の回折光との周波数の差が異なるように複数の第１回折光と複数の第２回折光を組み合わせればよい。
　図１において、ビームスプリッタ１９からのＮ本の干渉光は、等角度間隔で水平面上に並んで射出され、干渉光生成部１１の一部であるアナモルフィックプリズムペア４４、リレー光学系４５を介してダイクロイックミラー４６に入射する。このときに、Ｎ本の干渉光が並ぶ方向が主走査方向に相当する方向であり、この主走査方向に直交する方向が副走査方向である。なお、この例では、干渉光照射部１２では、主走査方向は矢印Ｍで示す上下方向になり、副走査方向は矢印Ｓで示す水平方向になる。
　アナモルフィックプリズムペア４４は、アナモルフィックプリズムペア２２、３３によって楕円形となっている各干渉光のビーム形状を、その短軸方向に引き延ばすことによって円形とする。アナモルフィックプリズムペア２２、３３、４４に代えてシリンドリカルレンズ等を用いてもよい。
　リレー光学系４５は、ビームスプリッタ１９側に配されたレンズ４５ａとダイクロイックミラー４６側に配されたレンズ４５ｂとから構成されており、レンズ４５ａの前側焦点位置が第１、第２ＡＯＤ２４、３４の出力面に、レンズ４５ｂの後側焦点位置が後述する走査ミラー４７ａの反射面に一致するように配されている。これにより、各干渉光を所定のビーム径を保持した状態で走査ミラー４７ａに入射させる。ダイクロイックミラー４６は、リレー光学系４５を通った各干渉光を干渉光照射部１２に向けて反射し、干渉光照射部１２からの検出光を透過して光検出部１３に送る。
　干渉光照射部１２は、走査ミラー４７ａを備えたレゾナントスキャナ４７、ミラー４８、リレー光学系５１、対物レンズ５２、試料Ｔを載置するステージ（図示省略）等で構成されている。ダイクロイックミラー４６からのＮ本の干渉光は、走査ミラー４７ａ、ミラー４８、リレー光学系５１を介して対物レンズ５２に入射し、試料Ｔに照射される。ダイクロイックミラー４６で反射された各干渉光は、走査ミラー４７ａによって上方に９０度折り曲げられてから、ミラー４８に入射する。
　レゾナントスキャナ４７は、干渉光の入射方向と直交する水平方向に平行な回転軸４７ｂを中心に走査ミラー４７ａを揺動させることによって、各干渉光を副走査方向に周期的に偏向して等角度走査する。
　リレー光学系５１は、ミラー４８側に配されたレンズ５１ａと対物レンズ５２側に配されたレンズ５１ｂとから構成されており、レンズ５１ａの前側焦点位置が走査ミラー４７ａの反射面に、レンズ５１ｂの後側焦点位置が対物レンズ５２の入射瞳に一致するように配されている。このリレー光学系５１によって、各干渉光は、対物レンズ５２の入射瞳にほぼいっぱいに広がって入射する。
　対物レンズ５２は、入射するＮ本の干渉光をそれぞれ集光して試料Ｔに向けて照射する。図５に示すように、対物レンズ５２によって、その焦点面に各干渉光をそれぞれ集光したＮ個の照射スポットＳＰ１～ＳＰＮが形成される。照射スポットＳＰ１～ＳＰＮは、それらの直径とほぼ同じピッチで主走査方向にライン状に並ぶ。照射スポットＳＰ１～ＳＰＮの直径（半値全幅）は、この例では、約３３０ｎｍである。
　照射スポットＳＰ１～ＳＰＮは、上記走査ミラー４７ａの揺動によって、ライン状に並んだ状態を維持して副走査方向に同時に移動する。これにより、照射スポットＳＰ１～ＳＰＮの１回の副走査方向の移動で試料Ｔを２次元的に走査する。このときに、光の入射角度の変化に比例して像高が変化する対物レンズ５２の領域を使用することで、走査ミラー４７ａによる干渉光の副走査方向の等角度走査は等速直線走査になる。そして、照射スポットＳＰ１～ＳＰＮが１方向に１回移動することで、１フレーム分の走査が完了する。なお、以下では照射スポットＳＰ１～ＳＰＮを特に区別する必要がない場合には照射スポットＳＰと記す。
　この例においては、レゾナントスキャナ４７が、試料Ｔに対してライン上に並んだ照射スポットＳＰ１～ＳＰＮの照射ラインを副走査方向に移動させる走査部であるが、走査部としては、レゾナントスキャナ４７に代えて、ガルバノミラーやポリゴンミラーなどの他の光偏向手段を用いてもよい。
　また、この例では、固定された試料Ｔに対して、ライン上に並んだ照射スポットＳＰ１～ＳＰＮの照射ラインを副走査方向に移動させているが、走査部による試料Ｔの２次元的な走査は、試料Ｔと照射ラインとを相対的に移動すればよい。したがって、後述する第４実施形態のように、固定された照射ラインに対して試料Ｔを副走査方向に移動してもよい。また、この例では、試料Ｔと照射ラインとの相対的な移動方向を、照射スポットＳＰ１～ＳＰＮが並ぶ主走査方向と直交する副走査方向に一致させているが、その移動方向は、副走査方向の成分が含まれていればよい。すなわち、試料Ｔと照射ラインとの相対的な移動方向が主走査方向と平行にならなければよく、照射ラインと試料Ｔとの相対的な移動方向とのなす角度をθとしたときに、「０°＜θ≦９０°」を満たせばよい。したがって、主走査方向と交差する方向に、試料Ｔと照射ラインとを相対的に移動させればよく、この例では、照射ラインを主走査方向と交差する方向に移動すればよい。
　試料Ｔと照射ラインとの相対的な移動方向が、主走査方向に対して直交する方向ではない場合、すなわち「０°＜θ＜９０°」となる場合、移動方向と直交する方向における照射スポットの間隔が実質的に狭くなる（cosθ倍になる）ため、この方向のピクセルサイズを小さくする（ピクセル分解能を向上する）ことになり、解像度向上の効果が得られる。
　なお、対物レンズ５２は、その光軸方向に移動自在にされており、例えばモータ（図示省略）によって移動できる。これにより、試料Ｔに対する対物レンズ５２の焦点面の位置を変えて走査を行うことができる。試料Ｔを載せたステージを対物レンズ５２の光軸方向に移動させてもよい。
　照射スポットＳＰ内の試料Ｔに干渉光が照射されることで、照射スポットＳＰ内の試料Ｔの蛍光物質が励起して蛍光を発生する。そして、照射スポットＳＰ１～ＳＰＮが副走査方向に移動することによって、主走査方向に並んだＮ個の照射スポットＳＰ１～ＳＰＮによって主走査方向に並んだＮ本の副走査ラインにそれぞれ干渉光が照射される。これにより、各副走査ラインから蛍光が放出される。各副走査ラインから放出される蛍光の光強度は、照射される干渉光のビート周波数に応じて変化するとともに、照射スポットＳＰの副走査方向への移動によって、副走査ラインにおける蛍光物質の分布に応じて変化する。すなわち、蛍光は、照射された干渉光のビート周波数を搬送周波数とした信号を蛍光物質の分布に応じて強度変調した光信号である。
　第１回折光と第２回折光とは、いずれも強度分布がガウシアン分布となったものであり、干渉光は、第１回折光と第２回折光とを重ね合わせたものになるので、強度分布の半値幅が狭く尖度が大きくなる。このため、第１回折光と第２回折光とを重ね合わせた干渉光を試料Ｔに照射する手法は、従来の手法に比べて空間分解能が高くなるという利点がある。
　図１において、上記のようにして、照射スポットＳＰ１～ＳＰＮから放出される各蛍光は、対物レンズ５２によって集光され、それら各蛍光からなる検出光が対物レンズ５２からリレー光学系５１に入射し、リレー光学系５１に入射した検出光は、干渉光と逆の経路を通ってダイクロイックミラー４６に入射する。
　ダイクロイックミラー４６に入射した検出光は、ダイクロイックミラー４６を透過して、光検出部１３に送られる。光検出部１３は、ミラー５４、集光レンズ５５、スリット板５６、光検出器としての光電子増倍管（以下、ＰＭＴ（Photomultiplier tube）という）５７、増幅器５８、デジタイザ５９を備える。検出光は、ミラー５４、集光レンズ５５を介してＰＭＴ５７に入射する。集光レンズ５５の焦点位置には、スリット板５６が配されており、スリット板５６に形成されたスリット５６ａを透過した検出光だけがＰＭＴ５７に入射する。これにより、レーザ顕微鏡システム１０を共焦点式として、対物レンズ５２の焦点面からの蛍光成分だけをＰＭＴ５７に入射させ、コントラストや空間分解能を向上させている。スリット５６ａの長手方向は、対物レンズ５２の焦点面における主走査方向を焦点面とスリット板５６との間にある光学系を通して投影した向きである。光検出器としては、ＰＭＴ５７に代えてアバランシェフォトダイオード等を用いてもよい。なお、スリット板５６を省略してもよい。
　ＰＭＴ５７は、入射する検出光の強度に応じた検出信号を出力する。すなわち、各照射スポットＳＰ１～ＳＰＮから、それぞれ蛍光物質の分布に応じて変調された蛍光が光信号として放出され、それら光信号を重ね合わせて多重化された多重化信号としての検出光がＰＭＴ５７で検出され、その多重化信号に相当する検出信号が出力される。このとき、各光信号は、上記のように照射される干渉光のビート周波数が搬送周波数となっている。
　ＰＭＴ５７からの検出信号は、増幅器５８で増幅されてからデジタイザ５９によって、その信号レベルが所定のサンプリング周波数でサンプリングされて検出データにデジタル変換される。走査ミラー４７ａの揺動に同期してレゾナントスキャナ４７が出力する同期信号によって、デジタイザ５９が１フレームの走査開始と終了を検知することで、１フレームの検出信号を検出データに変換する。デジタイザ５９のサンプリング周波数は、検出光の帯域の上限周波数の２倍よりも高くされている。検出光の帯域の上限周波数は、最も高いビート周波数より周波数間隔Δｆ（＝Δｆａｂ）だけ高いから、この例では上限周波数が２００ＭＨｚであり、サンプリング周波数を例えば１ＧＨｚに設定している。
　検出信号から変換された検出データは、信号処理部１４に送られる。この信号処理部１４は、例えばＰＣで構成されており、検出信号から試料Ｔの情報、この例では蛍光物質の分布を取得するものである。信号処理部１４は、フーリエ変換部１４ａ、逆フーリエ変換部１４ｂ、画像処理部１４ｃ、モニタ１４ｄを有する。まず、フーリエ変換部１４ａによって、１回の副走査で得られる１フレーム分の検出データに対して高速フーリエ変換を行い、周波数スペクトルが求められる。
　なお、照射スポットＳＰ１～ＳＰＮのビート周波数を、デジタイザ５９による１フレームに対するサンプリング数（Ｎｄ）とサンプリング周波数（ｆｄ）との比（＝ｆｄ／Ｎｄ）の整数倍になるように設定するのがよい。これにより、フーリエ変換後の周波数データ点に、各照射スポットＳＰ１～ＳＰＮのビート周波数が正確に一致するため、後段のデータ処理の精度を向上させることができる。
　次に、逆フーリエ変換部１４ｂによって、フーリエ変換部１４ａで求められた周波数スペクトルから、干渉光のビート周波数ごとに、ビート周波数を搬送周波数とした所定の帯域幅Δｆｗ（≦２Δｆ）で周波数スペクトルを分離し、それら分離した各周波数スペクトルに逆フーリエ変換をそれぞれ行う。周波数スペクトルを分離することは、周波数スペクトルを副走査ラインごとに分離することに相当し、副走査ラインに干渉光が照射することで得られる変調された蛍光（光信号）の周波数スペクトルである。この逆フーリエ変換により、周波数スペクトルから時間軸方向、すなわち各副走査ラインに沿った蛍光物質の分布が求められる。逆フーリエ変換部１４ｂで求められたＮ本分の副走査ラインについての蛍光物質の分布は、画像処理部１４ｃにより、その分布を２次元にマッピングした観察画像に変換されてモニタ１４ｄに表示される。なお、上記高速フーリエ変換と逆フーリエ変換の代わりに短時間フーリエ変換（ＳＴＦＴ）を行った画像取得も可能である。この場合、主走査方向のピクセルに相当する時間範囲でのＳＴＦＴのスペクトルが副走査方向の輝度分布に相当し、ＳＴＦＴのスペクトルの時間変化が観察画像となる。
　上記のように、搬送周波数ごとの帯域幅が従来よりも広くなっているので、従来よりも高い周波数の変調成分まで利用して副走査ラインに沿った蛍光物質の分布を求めることが可能になる。したがって、各照射スポットＳＰの副走査方向への移動速度を高くしても良好な観察画像を得ることができる。
　ところで、一対の照射スポットＳＰの間でクロストークが生じ、不要なクロストーク成分（ビート周波数）が発生することがある。例えば、図６に模式的に示すように、隣接した照射スポットＳＰｉ、ＳＰｉ＋１の間では、照射スポットＳＰｉを形成する干渉光の第１回折光Ｌａｉと照射スポットＳＰｉ＋１を形成する干渉光の第２回折光Ｌｂ（Ｎ－ｉ）との干渉、及び照射スポットＳＰｉを形成する干渉光の第２回折光Ｌｂ（Ｎ－ｉ＋１）と他方の照射スポットＳＰｉ＋１を形成する干渉光の第１回折光Ｌａ（ｉ＋１）との干渉のそれぞれにより、隣接したビート周波数ｆａｂｉとビート周波数ｆａｂ（ｉ＋１）の中間に不要なクロストーク成分が発生する。
　また、図７に示すように。１つの照射スポットＳＰｉを挟んだ一対の照射スポットＳＰｉ－１，ＳＰｉ＋１の間では、照射スポットＳＰｉ－１を形成する干渉光の第１回折光Ｌａ（ｉ－１）と照射スポットＳＰｉ＋１を形成する干渉光の第２回折光Ｌｂ（Ｎ－ｉ）との干渉、及び照射スポットＳＰｉ－１を形成する干渉光の第２回折光Ｌｂ（Ｎ－ｉ＋２）と照射スポットＳＰｉ＋１を形成する干渉光の第１回折光Ｌａ（ｉ＋１）との干渉のそれぞれにより、それら中間の照射スポットＳＰｉを形成する干渉光のビート周波数ｆａｂｉと同じ周波数のクロストーク成分が発生するため、ビート周波数ｆａｂｉの成分の振幅を大きくしたり小さくしたりする。
　上記のようなクロストークは、次の２つの条件を満たすことで抑制することができる。１つ目の条件は、隣接する一対の照射スポット間のクロストークについて、第１回折光と第２回折光の２つの干渉によって発生するクロストーク成分が互いに打ち消すように、一対の照射スポットの各第１回折光と第２回折光の位相を設定することである。２つ目の条件は、１つの照射スポットを挟んだ一対の照射スポット間のクロストークについて、いずれのクロストーク成分も影響を与えるビート周波数の干渉光に対して一定の位相を有するようにすることである。具体的には、各第１回折光については位相を「０」とし、第２回折光の位相を周波数（波数）の順番で０、π、０、π、０・・・・のように１つおきに半周期（π）ずらせばよい。
　第１、第２回折光の位相は、第１、第２コム信号の駆動信号（コム成分）の位相に一致するので、上記のように各第１、第２回折光の位相を設定するには、第２コム信号の各駆動信号の位相を周波数の順番で０、π、０、π、０・・・・のように１つおきに半周期（π）ずつずらせばよい。なお、各第２回折光の位相を「０」とし、第１回折光の位相を周波数の順番で０、π、０、π、０・・・・のように１つおきに半周期（π）ずらしてもよい。
　なお、第１コム信号、第２コム信号は、いずれもその各駆動信号が干渉することで、瞬間的に非常に高いピーク値を示すことがある。このような現象が生じる場合では、非常に高いピーク値の影響を受けて、第１コム信号、第２コム信号の全体的な振幅が小さくなり、この結果、干渉光の全体的な振幅も小さくなってしまう。このような非常に高いピーク値の発生の防止と、クロストーク成分の抑制のため、第１回折光については、例えば周波数が低いものから順に位相を０、φ、３φ、６φ、１０φ・・・・とし、第２回折光については、周波数が高いものから順に位相を０、π－φ、－３φ、π－６φ、－１０φ・・・・とするのがよい。すなわち、ｉを１、２・・・Ｎとしたときに、第１回折光Ｌａｉと第２回折光Ｌｂ（Ｎ－ｉ＋１）を組み合わせて干渉光を生成する場合、第１回折光Ｌａｉの位相を「φａ+i（i－１）φ／２＋（i－１）π」に設定し、第２回折光Ｌｂ（Ｎ－ｉ＋１）の位相を「φｂ－i（i－１）φ／２＋（i－１）π」に設定することである。φａ，φｂは、いずれも任意の定数であり、値φは、非常に高いピーク値の発生の防止するために設定される定数であって３°程度に設定すればよい。また、値φを１８３°程度に設定してもよい。この場合は、所望のビート周波数成分に対してクロストーク成分がほぼ同位相で加算されるので、信号増強効果がある。第１回折光と第２回折光とに与える位相の順番は逆でもよく、与える位相を第１回折光と第２回折光と入れ替えてもよい。この場合にも、第１、第２回折光の位相を第１、第２コム信号の駆動信号の位相として設定すればよい。
　値φを３°程度に設定した場合、第１，第２コム信号のｐ―ｐ値（最大値と最小値との差）が理論上の最小値とほぼ一致する。また、各干渉光の強度を合成した強度変化を示す信号のｐ－ｐ値も理論的最小値に近くなる。したがって、第１ＡＯＤ２４、第２ＡＯＤ３４の回折効率、光検出部１３のダイナミックレンジが大きくなって有利になる。
　なお、上記でキャンセルするクロストーク成分を逆に信号として利用することも可能である。この場合には、クロストーク成分の抑制がなされないように設定するため、例えば、上記と同様にして第１回折光Ｌａｉの位相を「φａ+i（i－１）φ／２」に設定し、第２回折光Ｌｂ（Ｎ－ｉ＋１）の位相を「φｂ－i（i－１）φ／２」に設定する。さらに、クロストーク成分に十分な振幅を持たせるために、主走査方向に並ぶ複数の照射スポットＳＰについて、隣接した照射スポットＳＰの一部が互いに重なり合うように、隣接した照射スポットＳＰの中心間隔を照射スポットＳＰのスポット径よりも小さくする。これは、クロストーク成分もこれまでに述べた信号成分と同様に、回折光の重なりによって生じるため、クロストーク成分を信号として用いる場合には重なりを大きくして振幅をなるべく大きくするのが望ましいからである。この場合、隣接した干渉光間の２組の第１回折光と第２回折光とのクロストーク成分が本来の第１、第２回折光の干渉によるビート周波数成分と同程度の振幅を持つようになり、主走査方向のピクセル数（副走査ラインのライン数）を倍増させることができる。その分１ピクセルあたりの周波数帯域が半減することになるが、従来の方法に比べて周波数帯域が倍増したことにより、同一の速度で２倍のピクセル数の情報取得が可能になるため、結果的に周波数帯域の増大による情報量の増大という効果が得られる。
　上記レーザ顕微鏡システム１０の構成は、一例であり、上記構成に限定されるものではない。複数の第１回折光と複数の第２回折光を生成する構成についても、上記構成に限定されない。例えば、第１、第２ＡＯＤ２４、３４として同じＡＯＤを用いながら、第１、第２ＡＯＤ２４、３４を互いに重ならない周波数範囲のコム信号でそれぞれ駆動して第１、第２回折光を生成してもよい。具体的には、第１、第２ＡＯＤ２４、３４として、いずれも動作帯域が例えば１００～３００ＭＨｚの同じＡＯＤを用い、第１ＡＯＤ２４を１０１～２００ＭＨｚの周波数範囲の第１コム信号で動作させ、第２ＡＯＤ３４を２０１～３００ＭＨｚの周波数範囲の第２コム信号で動作させてもよい。
　また、第１、第２ＡＯＤ２４、３４として同じＡＯＤを用い、第１、第２レーザ光を互いに正負逆の入射角で対応するＡＯＤに入射することによって、第１、第２ＡＯＤ２４、３４による周波数シフトの正負を互いに逆にして第１、第２回折光を生成してもよい。この場合には、同じ周波数範囲の第１、第２コム信号を用いても、第１、第２レーザ光に対する第１、第２回折光の周波数シフトの正負が互いに逆になるため、第１、第２回折光の各周波数範囲が重ならない。なお、第１、第２ＡＯＤ２４、３４に対する第１、第２レーザ光の入射角の大きさは、干渉光の生成効率を高くするために同じにすることが好ましい。
　上記２つのいずれの構成においても、複数の第１回折光と複数の第２回折光との重ね合わせが容易になるとともに、第１、第２回折光の各周波数範囲が重ならないのでＡＯＦＳ３２が不要になり、部品点数を削減する上で有利である。
　第１、第２ＡＯＤ２４、３４は、異なるＡＯＤを用いてもよい。この場合であっても、コム信号中の駆動信号の周波数の変化量に対する偏向角の変化量が第１ＡＯＤ２４と同じになる第２ＡＯＤ３４を用いることによって、上記同様に、複数の干渉光を生成するための複数の第１回折光と複数の第２回折光との重ね合わせが容易になる。また、このときに、第１コム信号の周波数範囲と重ならない周波数範囲の第２コム信号で動作可能な第２ＡＯＤ３４を用いれば、第１、第２回折光の周波数範囲が重ならないのでＡＯＦＳ３２を設ける必要がなくなる。
　また、第１、第２回折光の周波数範囲の一部範囲が重なることによって、同じビート周波数の干渉光が生成されてもよい。この場合には、同じビート周波数の干渉光のうちの１の干渉光を残して他の干渉光を、例えばリレー光学系４５のレンズ４５ａ、４５ｂの間で干渉光が集光される位置で遮光する等して除去すればよい。このような場合にも、実際に利用する干渉光が、周波数範囲の重ならない第１、第２回折光を用いて生成されているので、ＡＯＦＳ３２を省略することができる。
［第２実施形態］
　第２実施形態は、対物レンズとは反対側に放出される試料からの蛍光を検出するようにレーザ顕微鏡システムを構成したものである。なお、以下に説明する他は、第１実施形態と同じであり、実質的に同じ構成部材には同一の符号を付してその詳細な説明を省略する。また、この第２実施形態のレーザ顕微鏡システムは、干渉光生成部の構成は第１実施形態と同じであるから、図８では干渉光生成部を省略して描いてある。なお、後述する第３、第４実施形態の図９、図１０や、図１３についても、図８と同様である。
　図８に示すように、干渉光生成部で生成されたＮ本の干渉光は、ミラー７１で反射されて干渉光照射部１２に送られる。干渉光照射部１２では、第１実施形態と同様に、Ｎ本の干渉光は、走査ミラー４７ａ、ミラー４８、リレー光学系５１、対物レンズ５２を介して試料Ｔに照射され、主走査方向に並んだＮ個の照射スポットが走査ミラー４７ａの揺動で副走査方向に移動されて１フレーム分の走査が行われる。試料Ｔを挟んで対物レンズ５２の反対側に、光検出部７３が配されている。光検出部７３は、試料Ｔ側から順に、バンドパスフィルタ７４、集光レンズ５５、ＰＭＴ５７が配されている。バンドパスフィルタ７４は、干渉光をカットするとともに、試料Ｔから放出される蛍光を透過する。これにより、干渉光が照射されて試料Ｔから放出される蛍光のうち、背後側すなわち対物レンズ５２と反対側に放出される蛍光がバンドパスフィルタ７４、集光レンズ５５を介してＰＭＴ５７によって受光される。
　第１実施形態と同様に、検出光の帯域幅を広くしているので、例えば、各照射スポットＳＰの副走査方向への移動速度を高くしても良好な観察画像を得ることができる。
［第３実施形態］
　図９は、検出光を複数の波長に分解して検出する第３実施形態のレーザ顕微鏡システムを示している。なお、第３実施形態のレーザ顕微鏡システムは、以下に詳細を説明する光検出部が異なる他は、第１実施形態と同じであり、実質的に同じ構成部材には同一の符号を付してその詳細な説明を省略する。この例では、例えば、干渉光の照射によって、互いに波長の異なる第１～第３波長成分の蛍光を放出する３種類の蛍光物質のいずれか１つ、あるいは２以上を含有するような試料Ｔが用いられる。
　図９に示すように、光検出部８１は、波長分離部としての第１、第２ダイクロイックミラー８２ａ、８２ｂと、第１～３検出ユニット８３ａ～８３ｃを備えている。第１ダイクロイックミラー８２ａは、検出光に含まれる第１波長成分の蛍光を第１検出ユニット８３ａに向けて反射して、それ以外の波長成分を透過する。また、第２ダイクロイックミラー８２ｂは、第１ダイクロイックミラー８２ａを透過した検出光のうちの第２波長成分の蛍光を第２検出ユニット８３ｂに向けて反射して、それ以外の波長成分の蛍光を第３検出ユニット８３ｃに向けて透過する。
　第１～第３検出ユニット８３ａ～８３ｃは、いずれも集光レンズ５５、スリット板５６、ＰＭＴ５７を備えている。第１検出ユニット８３ａは、第１ダイクロイックミラー８２ａで反射された第１波長成分の蛍光を集光レンズ５５、スリット板５６を介してＰＭＴ５７で受光して、第１波長成分の蛍光の光強度に応じた検出信号を出力する。第２検出ユニット８３ｂは、第２ダイクロイックミラー８２ｂで反射された第２波長成分の蛍光を集光レンズ５５、スリット板５６を介してＰＭＴ５７で受光して、第２波長成分の蛍光の光強度に応じた検出信号を出力する。第３検出ユニット８３ｃは、第２ダイクロイックミラー８２ｂを透過した第３波長成分の蛍光を集光レンズ５５、スリット板５６を介してＰＭＴ５７で受光して、第３波長成分の蛍光の光強度に応じた検出信号を出力する。
　上記のように構成することにより、３種類の蛍光物質のいずれが試料Ｔに含まれているか、また試料Ｔの内部に各蛍光物質がどのように分布しているか等を観察することが可能になる。もちろん、第１実施形態と同様に、検出光の帯域幅を広くしているので、例えば各照射スポットＳＰの副走査方向への移動速度を高くしても良好な観察画像を得ることができる。
　上記では、検出光を３つの波長成分に分離しているが、分離する波長成分は２以上であれば良い。また、第２実施形態のように対物レンズ５２の反対側に試料Ｔから放出される蛍光からなる検出光や、後述するように干渉光が試料Ｔで反射した反射光からなる検出光、試料Ｔを透過した干渉光からなる検出光についても波長成分に分離して検出することができる。
［第４実施形態］
　図１０は、試料を副走査方向に移動することにより、照射スポットと試料とを副走査方向に相対的に移動する第４実施形態のレーザ顕微鏡システムを示している。なお、第４実施形態のレーザ顕微鏡システムは、以下に詳細を説明する他は、第１実施形態と同じであり、実質的に同じ構成部材には同一の符号を付してその詳細な説明を省略する。
　図１０に示す例は、フローサイトメータに、本発明のレーザ顕微鏡システムを適用した構成になっている。干渉光照射部８６は、フローセル（フローサイトメトリー用セル）８７に形成された微小流路８７ａに対して、対物レンズ５２から干渉光を照射する。微小流路８７ａの内部に対物レンズ５２の焦点面が位置し、主走査方向が微小流路８７ａ内の流れ方向と直交する方向になるように調整されている。すなわち、微小流路８７ａ内の流れ方向と直交する方向に照射スポットＳＰをライン状に並べて形成する。微小流路８７ａ内に試料Ｔを水等の流体とともに流すことにより、ライン状に並んだ照射スポットＳＰに対して試料Ｔが副走査方向に移動する。
　この例では、走査用ミラー等で照射スポットＳＰを副走査方向に移動する必要がないため、ダイクロイックミラー４６で反射させたＮ本の干渉光をリレー光学系５１を介して対物レンズ５２に入射させている。微小流路８７ａ内を試料Ｔが高速に流れても、搬送周波数ごとの帯域幅を広くしてあるので、良好な観察画像を得ることができる。
　なお、上述のように試料Ｔの２次元的な走査を行う場合、試料Ｔと照射スポットＳＰ１～ＳＰＮが並ぶ照射ラインとの相対的な移動方向に副走査方向の成分が含まれていればよいので、この例では副走査方向となる微小流路８７ａ内の流れ方向に対して複数の照射スポットＳＰの並ぶ主走査方向が交差していればよい。
［第５実施形態］
　図１１は、第１回折光と第２回折光とをずらした第５実施形態を示している。なお、第５実施形態のレーザ顕微鏡システムは、以下に詳細を説明する他は、第１実施形態と同じであり、実質的に同じ構成部材には同一の符号を付してその詳細な説明を省略する。
　この第５実施形態では、図１１に示すように、対物レンズ５２の焦点面、すなわち干渉光の照射位置で、第１回折光の照射スポットＳＰ１１～ＳＰ１Ｎと第２回折光の照射スポットＳＰ２１～ＳＰ２Ｎとを、それぞれその直径とほぼ同じ配列ピッチＰで主走査方向に平行な同一のライン上に並べて形成する。例えば第２アーム１８内のミラー３１の傾きを調整することによって、第２回折光の照射スポットＳＰ２１～ＳＰ２Ｎを配列ピッチＰの１／２だけ主走査方向にずらして照射スポットＳＰ１１～ＳＰ１Ｎに重ね合わせる。
　なお、ミラー２３の傾きの調整に代えて、第１コム信号または第２コム信号のいずれか一方の各駆動信号の周波数を他方に対してずらすことでも実現できる。また、位相の設定は、第１実施形態において説明したクロストーク成分を信号として利用する場合と同様に、クロストーク成分の抑制がなされないようにするため、例えば第１回折光Ｌａｉの位相を「φａ+i（i－１）φ／２」に設定する。さらに第２回折光Ｌｂ（Ｎ－ｉ＋１）の位相を「φｂ－i（i－１）φ／２」に設定する。さらに、第１、第２回折光のビーム径を大きくして、隣接する第１回折光と第２回折光の中心間隔と、回折光の照射スポットのスポット径とが同程度、あるいは前者が後者よりも小さくなるように設定すればよい。このときに第１、第２回折光の中心間隔に対してスポット径を大きくする調整を行ってもよい。第１、第２回折光の照射スポットの重なりを大きくするのがよい。第１、第２回折光の照射スポットの重なりが大きいほど干渉光の強度が大きくなり、それに応じて検出信号の信号レベルを大きくできることから、このような設定を行うことが望ましい。
　上記のように第１回折光と第２回折光を重ね合わせることで、図中ハッチングで示すように、干渉光の照射スポットを、第１回折光の照射スポットＳＰ１１～ＳＰ１Ｎと第２回折光の照射スポットＳＰ２１～ＳＰ２Ｎとが重なった部分として形成する。これにより、主走査方向に並ぶ干渉光の照射スポットが上記第１実施形態に比べて約２倍になる。すなわち、主走査方向に並ぶピクセル数（副走査ラインのライン数）を倍増させることができ、主走査方向の空間解像度が向上する。この場合、１ピクセルあたりの周波数帯域が半減することになるが、従来の方法に比べて周波数帯域が倍増したことにより、従来と同一の速度で２倍のピクセル数の情報取得が可能になるため、結果的に周波数帯域の増大による情報量の増大という効果が得られる。
　本実施形態は、隣接する第１、第２回折ビームの中心間隔が小さくなる極限で、第１実施形態で説明したクロストーク成分を利用する場合と一致する。これは、隣接する第１、第２回折光の中心間隔が小さくなると、主走査方向にずれて配置された隣接する第１、第２回折光の空間的重なりが１００％に近づくためである。図１１において第１、第２回折光の中心間隔を一定に保ったままビーム径を大きくしていく状況と同義である。
［第６実施形態］
　図１２は、第１ＡＯＤと第２ＡＯＤとして１つのＡＯＤを用いて、第１回折光と第２回折光を生成する第６実施形態を示している。なお、この第６実施形態におけるレーザ顕微鏡システムの構成は、干渉光生成部において１つのＡＯＤを用いて第１回折光と第２回折光を生成する点が第１実施形態と異なるだけである。このため、図１２には、干渉光生成部の要部のみ描いてある。また、第１実施形態と実質的に同じ構成部材については、同じ符号を付して、その詳細な説明を省略する。また、第６実施形態のレーザ顕微鏡システムの干渉光照射部、光検出部、信号処理部については他の実施形態と同様な構成とすることができる。
　図１２に示すように、レーザ顕微鏡システムの干渉光生成部１１は、レーザ装置１５、ＡＯＦＳ９１、アナモルフィックプリズムペア９２、λ／２板９３、リレー光学系９４、ＡＯＤ９５、リレー光学系９６、ウォラストンプリズム９７、ポラライザ９８等で構成されている。レーザ装置１５からの直線偏光のレーザ光は、ＡＯＦＳ９１に入射する。ＡＯＦＳ９１は、レーザ光を第１レーザ光Ｂａと第２レーザ光Ｂｂとに分けている。ＡＯＦＳ９１は、入射するレーザ光をそのまま透過した透過成分を第１レーザ光Ｂａ（透過光）として、また回折した成分を第２レーザ光Ｂｂ（変換光）として射出する。
　本実施形態でのＡＯＦＳ９１は、第１実施形態と異なり、ＡＯＤ９５で発生する２種類の回折光の周波数範囲を近づけ、干渉光のビート周波数を低くするために設けてある。例えば、ＡＯＤ９５への駆動信号の周波数範囲が１００ＭＨｚから２００ＭＨｚの間である場合、第１レーザ光Ｂａから生成される第１回折光の周波数シフトの範囲は１００ＭＨｚから２００ＭＨｚ、第２レーザ光Ｂｂから生成される第２回折光の周波数シフトの範囲は「－１００ＭＨｚ」から「－２００ＭＨｚ」となる。これらによる干渉光のビート周波数の周波数範囲を０Ｈｚから２００ＭＨｚの間に設定するためには、ＡＯＦＳ９１の周波数シフト量を「＋２００ＭＨｚ」にすればよい。仮にＡＯＦＳ９１による周波数シフトがない場合、干渉光のビート周波数の周波数範囲は２００ＭＨｚから４００ＭＨｚの間となる。このような高周波成分は励起する蛍光物質の種類やＰＭＴ５７等の動作帯域によっては十分な信号レベルが得られない恐れや、信号レベルの変化を十分な精度で検出できない恐れがある。そこで上記のようにＡＯＦＳ９１により干渉光のビート周波数の周波数範囲を全体的に低周波領域にシフトさせることで、信号レベルの低下を避け、また十分な精度で信号レベルの変化を検出できるようにしている。
　第１、第２レーザ光Ｂａ、Ｂｂは、それぞれアナモルフィックプリズムペア９２を通過して横方向（ＡＯＤ９５による回折方向）にビーム形状が拡大された後、レンズ９４ａ、９４ｂからなるリレー光学系９４を介してＡＯＤ９５の入射面にそれぞれ正負が異なる入射角で入射する。なお、アナモルフィックプリズムペア９２とリレー光学系９４との間の第１レーザ光Ｂａの光路上には、λ／２板９３が配されており、第１レーザ光Ｂａは、λ／２板９３を透過することで偏光方向が９０度回転する。なお、第１レーザ光Ｂａに代えて第２レーザ光Ｂｂの偏光方向を９０度回転してもよい。また、リレー光学系９４は、その前側焦点位置がＡＯＦＳ９１の出力面に、また後側焦点位置がＡＯＤ９５の入射面に一致するように調整されている。
　ＡＯＤ９５は、レーザ光から複数の第１回折光を生成する第１ＡＯＤと、レーザ光から複数の第２回折光を生成する第２ＡＯＤとして機能するものである。ＡＯＤ９５は、一定な周波数間隔ΔｆのＮ個の駆動信号を重ねたコム信号が入力されている。このＡＯＤ９５により、入射する第１レーザ光Ｂａから複数の第１回折光が生成され、第２レーザ光Ｂｂから複数の第２回折光が生成される。第１、第２レーザ光Ｂａ、Ｂｂが互いに正負逆の入射角でＡＯＤに入射することによって、ＡＯＤ９５から射出される第１回折光と第２回折光との周波数シフトの正負が互いに逆になる。ここで、第２回折光は、結果的に元のレーザ光の周波数に対して、ＡＯＦＳ９１とＡＯＤ９５とによって周波数シフトされるから、ＡＯＦＳ９１による周波数シフトを、ＡＯＤ９５に駆動するコム信号の最低周波数成分の２倍とするのがよい。また、ＡＯＤ９５に対する第１、第２レーザ光の入射角の大きさは、干渉光の生成効率を高くするために同じにすることが好ましい。
　上記のようにＡＯＤ９５で生成される複数の第１回折光および複数の第２回折光は、レンズ９６ａ、９６ｂからなるリレー光学系９６を介して、重ね合わせ部としてのウォラストンプリズム９７に互いに異なる方向から入射する。なお、リレー光学系９６は、その前側焦点位置がＡＯＤ９５の出力面に、また後側焦点位置がウォラストンプリズム９７に一致するように調整されている。
　ここで、ＡＯＤ９５から射出される第１、第２回折光は、それぞれ元の第１レーザ光Ｂａ、第２レーザ光Ｂｂの偏光状態を保つため、互いに偏光が直交している。そして、これら第１、第２回折光がリレー光学系９６を介してウォラストンプリズム９７に入射することによって、周波数が異なる回折光同士で第１回折光と第２回折光が合波された、すなわち重ね合わせられた合波光がウォラストンプリズム９７から射出される。
　ウォラストンプリズム９７からの合波光の光路上に、４５度直線偏光のみを透過するポラライザ９８が配されている。ウォラストンプリズム９７からの合波光がポラライザ９８に入射することにより、合波光から４５度直線偏光となる干渉光だけがポラライザ９８を透過する。これにより、上記第１実施形態におけるビームスプリッタ１９から射出される干渉光と同等の複数の干渉光が生成される。複数の干渉光は、そのビーム形状を短軸方向に引き延ばすことによって円形とするアナモルフィックプリズムペア等（図示省略）を介して干渉光照射部に送られる。
　なお、ＡＯＤ９５から第１レーザ光Ｂａが回折されないで透過する０次成分が第２回折光の一部に同軸に重なるが、その第１レーザ光Ｂａの０次成分は、重なる第２回折光と偏光が直交しているので、ウォラストンプリズム９７から合波光とは異なる方向に射出されるため、無視することができる。同様に、ＡＯＤ９５から第２レーザ光Ｂｂが回折されないで透過する０次成分は、第１回折光の一部に同軸に重なるが、それらの偏光が互いに直交しているので、第２レーザ光Ｂｂの０次成分がウォラストンプリズム９７から合波光とは異なる方向に射出されるため、無視することができる。
　上記のように、この例では１つのＡＯＤ９５を用いてそれぞれ複数の第１、第２回折光を生成して複数の干渉光を生成することができ、第１、第２回折光を生成する部品点数を減らすことが可能である。
　別の手法により、１つのＡＯＤを用いて複数の第１回折光と複数の第２回折光とを生成することも可能である。例えば、ＡＯＤの一方の面から第１レーザ光を入射して、他方の面から複数の第１回折光を射出させるとともに、ＡＯＤの他方の面から第２レーザ光を入射して一方の面から複数の第２回折光を射出させるようにする。このようにしても第１、第２回折光を生成するＡＯＤが１つになり部品点数を減らすことが可能である。
　上記の各実施形態では、試料Ｔからの蛍光を検出するが、これに限られない。例えば試料Ｔを透過した干渉光や、試料Ｔで反射（もしくは後方散乱）した干渉光を検出してもよい。反射光を検出する場合には、干渉光と検出光を分離するダイクロイックミラーに代えて、例えば図１３に示すように、偏光ビームスプリッタ９９ａと１／４波長板９９ｂとを用いればよい。１／４波長板９９ｂは、偏光ビームスプリッタ９９ａの干渉光照射部１２側に配置する。これにより、偏光ビームスプリッタ９９ａに入射する反射光は、干渉光生成部からの干渉光に対して偏光方向が９０度回転したものとなり、光検出部１３に向けて偏光ビームスプリッタ９９ａを透過する。また、干渉光は基本的に蛍光と波長が異なるため、上記透過光や反射光と蛍光を第3実施形態と同様に別々の検出器で同時に検出してもかまわない。
　上記各実施形態では、ＡＯＤを用いて、それぞれ周波数の異なる複数の第１及び第２の回折光を生成し、これらから複数の干渉光を生成したが、複数の干渉光の生成は、これに限られるものではない。
　図１４は、所定の透過率あるいは位相のパターンが表面に形成された変調ディスク１０１を用いて、周波数の異なる複数の回折光Ｌ１、Ｌ２・・・ＬＮを生成する例を示している。変調ディスク１０１は、その中心軸１０２がモータ１０３に取り付けられており、モータ１０３によって高速に回転される。この回転している変調ディスク１０１に、その一方の面からレーザ光Ｌをシリンドリカルレンズ１０４を介して照射することによって、変調ディスク１０１の他方の面から回折光Ｌ１、Ｌ２・・・ＬＮを射出する。
　図１５に示すように、シリンドリカルレンズ１０４を介してレーザ光Ｌを照射することによって、変調ディスク１０１には、その径方向に沿ったライン状にレーザ光Ｌが照射される。また、変調ディスク１０１には、パターンは変形した縞状のパターンとなっており、縞の周期が照射されるレーザ光の波長よりわずかに長い程度にしてある。これにより、変調ディスク１０１上のレーザ光Ｌの照射領域内の各位置から、他の回折光と重なることなく１次回折の回折光Ｌ１、Ｌ２・・・ＬＮが射出される。また、変調ディスク１０１の縞の周期は、変調ディスク１０１の径方向で異なるため、回折光Ｌ１、Ｌ２・・・ＬＮの周波数シフト量が変調ディスク１０１の径方向に沿って異なる。この結果、上記実施形態と同様に、ＡＯＤから生成される回折光と実質的に同様の性質を持つ第１の光または第２の光としての複数の回折光が得られる。なお、このような変調ディスク１０１の詳細は次の文献１、文献２等に記載されている。
文献１：JEFFREY J. FIELD,DAVID G. WINTERS,AND RANDY A. BARTELS, J. Opt. Soc. A 32(11) 2156 (2015).
文献２：Jeffrey S. Sanders, Ronald G. Driggers, Carl E. Halford, and Steven T. Griffin, Opt. Eng. 30(11), 1720-1724 (1991).
　干渉光の生成は、例えば図１に示される第１実施形態の第１ＡＯＤ２４、第２ＡＯＤ３４の代わりにそれぞれ図１４の変調ディスク１０１を用いた構成を用い、一方の変調ディスク１０１から生成される周波数シフト量が大きい回折光部分を第１回折光として、またもう一方の変調ディスク１０１から生成される周波数シフト量が小さい回折光部分を第２回折光として用い、それらを重ねればよい。もちろん、各変調ディスク１０１から得られる回折光の周波数が異なるように２枚の変調ディスク１０１のパターンが互いに異なっていてもよい。
［実施例］
　図１のレーザ顕微鏡システム１０と同様な構成を用いて試料Ｔを観察した。この観察では、レーザ顕微鏡システム１０は、第１ＡＯＤ２４、第２ＡＯＤ３４として１０２ＭＨｚ～２０１ＭＨｚの駆動信号で動作可能な同じＡＯＤを用いた。また、第１ＡＯＤ２４は、周波数間隔Δｆを１ＭＨｚとして１０２ＭＨから２０１ＭＨｚまでの各駆動信号を重ね合わせた第１コム信号で駆動した。また、第２ＡＯＤ３４についても、周波数間隔Δｆを１ＭＨｚとして１０２ＭＨから２０１ＭＨｚまでの各駆動信号を重ね合わせた第２コム信号で駆動した。第１コム信号と第２コム信号は周波数成分間の位相の設定値として上に述べた数式に従ってクロストークがキャンセルされるように設定し、φａ＝φｂ＝０、φ＝３．３°とした。
　また、第１、第２ＡＯＤ２４、３４に対する第１、第２レーザ光の入射角の正負を互いに逆にすることによって、複数の第１回折光の周波数範囲と複数の第２回折光の周波数範囲が重ならないが、干渉光のビート周波数を低周波領域に下げるためにＡＯＦＳ３２で周波数を上げた第２レーザ光を第２ＡＯＤ３４に入射させた。このＡＯＦＳ３２は、周波数２００ＭＨｚのシフト信号で駆動することで、第２レーザ光の周波数シフト量を「＋２００ＭＨｚ」とした。第１回折光はその周波数が低いものから、第２回折光はその周波数が高いものから順番に組み合わせられるようにしてビート周波数が異なる１００本の干渉光を生成した。なお、第１、第２ＡＯＤ２４、３４は、動作帯域が１００～２００ＭＨｚであるが、ＡＯＤの動作帯域は回折効率が最大値の－３ｄＢとなる周波数で規定されるため、動作帯域からわずかに外れた周波数で励起しても十分に動作する。
　上記のように駆動される第１、第２ＡＯＤ２４、３４からの第１回折光、第２回折光から生成されて、対物レンズ５２から出力された複数の干渉光を測定して得られた周波数スペクトルを図１６に示す。周波数スペクトルから、ビート周波数が２ＭＨｚ間隔で４ＭＨｚから２０２ＭＨｚまでの１００本の干渉光が形成されていることが確認でき、２００ＭＨｚの帯域幅が得られることが分かった。また、上記周波数スペクトルをフーリエ変換したところ、図１７に示すような信号波形が得られた。この信号波形は、重ね合わせる第１回折光と第２回折光とが完全に重なったときの理想的な信号波形の約７０％の振幅であり、干渉光の生成効率が約７０％であることが分かった。
　フレームレート、すなわち走査ミラー４７ａを１６ＫＨｚで揺動して、試料Ｔとして平均直径６μｍの蛍光ビーズを検出した。この検出から得られた観察画像を図１８に示す。図１８の観察画像は、横方向が照射スポットＳＰが並ぶ主走査方向（Ｍ）であり、縦方向が照射スポットＳＰが移動する副走査方向（Ｓ）である。
　１０　レーザ顕微鏡システム
　１１　干渉光生成部
　１２　干渉光照射部
　１３　光検出部
　１４　信号処理部
　１９　ビームスプリッタ
　２４，３４、９５　ＡＯＤ
　３２、９１　ＡＯＦＳ
　９７　ウォラストンプリズム
　ＳＰ　照射スポット
　Ｔ　試料

 

Claims (20)

  1. 　互いに異なる周波数の複数の第１の光と互いに異なる周波数の複数の第２の光とを、前記第１の光と前記第２の光との周波数の差が異なる組み合わせで干渉させることよって、ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する干渉光生成部と、
    　複数の前記干渉光を照射する干渉光照射部と
    　を備えることを特徴とする照射装置。
  2. 　前記干渉光生成部は、レーザ光源から出力された光を回折させ、入力されるコム信号の周波数に応じた複数の回折光を複数の前記第１の光として射出する第１音響光学ディフレクタと、
    　前記レーザ光源から出力された前記光を回折させ、入力されるコム信号の周波数に応じた複数の回折光を複数の前記第２の光として射出する第２音響光学ディフレクタと
    　を備えることを特徴とする請求項１に記載の照射装置。
  3. 　前記レーザ光源からの前記光が入射され、前記光の周波数を変換した光を射出する音響光学周波数シフタをさらに備え、
    　前記第２音響光学ディフレクタは、前記音響光学周波数シフタで周波数が変換された前記光が入射されることを特徴とする請求項２に記載の照射装置。
  4. 　前記第１音響光学ディフレクタ及び前記第２音響光学ディフレクタは、隣接または離れた位置の第１の光と第２の光との干渉によるクロストーク成分を抑制する位相に各コム成分が設定された前記コム信号が入力されることを特徴とする請求項２または３に記載の照射装置。
  5. 　前記干渉光生成部は、レーザ光源から出力された光が正負の異なる入射角度でそれぞれ入射され、コム信号の周波数に応じた２組の複数の回折光を複数の前記第１の光及び複数の前記第２の光として射出する音響光学ディフレクタを有することを特徴とする請求項１に記載の照射装置。
  6. 　前記レーザ光源からの前記光が入射され、入射する前記光の透過成分の透過光と、回折し周波数が変換された成分の変換光を射出する音響光学周波数シフタをさらに備え、
    　前記音響光学ディフレクタは、前記透過光と前記変換光とが正負の異なる入射角度で入射される
    　ことを特徴とする請求項５に記載の照射装置。
  7. 　複数の前記第１の光の第１の周波数範囲と複数の前記第２の光の第２の周波数範囲とが異なり、
    　前記干渉光生成部は、複数の前記第１の光については周波数が低いものから、複数の前記第２の光については周波数の高いものからそれぞれ順番に選択される前記第１の光と前記第２の光とを組み合わせて複数の前記干渉光を生成することを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の照射装置。
  8. 　複数の前記第１の光の第１の周波数範囲と複数の前記第２の光の第２の周波数範囲とは、周波数範囲が重ならないことを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の照射装置。
  9. 　前記干渉光照射部は、複数の前記干渉光のスポットをライン状に並べて照射することを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の照射装置。
  10. 　前記干渉光照射部は、同じピッチで並ぶ複数の前記第１の光と複数の前記第２の光との入射により、前記干渉光の照射位置に複数の前記第１の光及び複数の前記第２の光のそれぞれのスポットを同じ配列ピッチでライン状に並べ、
    　前記干渉光生成部は、前記干渉光の照射位置で前記第１の光のスポットに対する前記第２の光のスポットの位置を前記配列ピッチの半分だけスポットの並ぶ方向にずらし、前記第１の光のスポットと前記第２の光のスポットとが重なった前記干渉光のスポットを形成するずらし量及び方向に複数の前記第１の光と複数の前記第２の光との相対的な位置をずらすことを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の照射装置。
  11. 　請求項９または１０に記載の照射装置と、
    　前記干渉光を試料に照射することで生じた検出光を検出する光検出器とを備えることを特徴とするレーザ顕微鏡システム。
  12. 　複数の前記干渉光のスポットが並んだ方向と交差する方向に、複数の前記干渉光のスポットと前記試料とを相対的に移動させる走査部を備えることを特徴とする請求項１１に記載のレーザ顕微鏡システム。
  13. 　前記走査部は、前記試料が流体と共に流れ得る流路を有するフローセルであり、
    　前記干渉光照射部は、前記流路内で前記スポットを前記試料の流れる方向と交差する方向に並べることを特徴とする請求項１２に記載のレーザ顕微鏡システム。
  14. 　前記試料からの検出光を波長に応じて２以上の波長成分に分離する波長分離部を備え、
    　前記光検出器は、前記波長分離部により分離される波長成分ごとに設けられていることを特徴とする請求項１１ないし１３のいずれか１項に記載のレーザ顕微鏡システム。
  15. 　互いに異なる周波数の複数の第１の光と互いに異なる周波数の複数の第２の光を生成する回折光生成ステップと、
    　複数の前記第１の光と複数の前記第２の光とを干渉させることよって、ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する干渉光生成ステップと、
    　複数の前記干渉光を照射する照射ステップと
    　を有することを特徴とする照射方法。
  16. 　複数の前記第１の光の第１の周波数範囲と複数の前記第２の光の第２の周波数範囲とが異なり、
    　前記干渉光生成ステップは、複数の前記第１の光については周波数が低いものから、複数の前記第２の光については周波数の高いものからそれぞれ順番に選択される前記第１の光と前記第２の光とを組み合わせて複数の前記干渉光を生成することを特徴とする請求項１５に記載の照射方法。
  17. 　前記回折光生成ステップは、レーザ光源から出力された光を、第１音響光学ディフレクタと第２音響光学ディフレクタとにそれぞれに入射して回折させ、複数の前記第１の光として、入力されたコム信号の周波数に応じた複数の第１回折光を前記第１音響光学ディフレクタで生成し、複数の前記第２の光として、入力されたコム信号の周波数に応じた複数の第２回折光を前記第２音響光学ディフレクタで生成することを特徴とする請求項１５または１６に記載の照射方法。
  18. 　前記回折光生成ステップは、隣接または離れた位置の第１の光と第２の光との干渉によるクロストーク成分を抑制する位相に各コム成分が設定された前記コム信号を、前記第１音響光学ディフレクタ及び前記第２音響光学ディフレクタに入力することを特徴とする請求項１７に記載の照射方法。
  19. 　前記回折光生成ステップは、レーザ光源から出力された光を正負の異なる入射角度で音響光学ディフレクタに入射し、コム信号の周波数に応じた２組の複数の回折光を複数の前記第１の光及び複数の前記第２の光として射出することを特徴とする請求項１５または１６に記載の照射方法。
  20. 　互いに異なる周波数の複数の第１の光と互いに異なる周波数の複数の第２の光を生成する回折光生成ステップと、
    　複数の前記第１の光と複数の前記第２の光とを干渉させることよって、ビート周波数の異なる複数の干渉光を生成する干渉光生成ステップと、
    　複数の前記干渉光を照射する照射ステップと、
    　前記干渉光を試料に照射することで生じた検出光を検出する光検出ステップとを有することを特徴とするレーザ顕微鏡の検出方法。
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