WO2017131496A1 - 치료학적 효소류의 결합체 - Google Patents

치료학적 효소류의 결합체 Download PDF

Info

Publication number
WO2017131496A1
WO2017131496A1 PCT/KR2017/001016 KR2017001016W WO2017131496A1 WO 2017131496 A1 WO2017131496 A1 WO 2017131496A1 KR 2017001016 W KR2017001016 W KR 2017001016W WO 2017131496 A1 WO2017131496 A1 WO 2017131496A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
enzyme
conjugate
enzyme conjugate
immunoglobulin
peptidyl polymer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2017/001016
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김대진
김정국
정성엽
권세창
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
Original Assignee
Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to JP2018539850A priority Critical patent/JP7356222B2/ja
Priority to TNP/2018/000270A priority patent/TN2018000270A1/en
Priority to EA201891573A priority patent/EA201891573A1/ru
Priority to CR20180393A priority patent/CR20180393A/es
Priority to SG11201806502UA priority patent/SG11201806502UA/en
Priority to BR112018015603-5A priority patent/BR112018015603A2/ko
Priority to MX2018009266A priority patent/MX2018009266A/es
Priority to MA43082A priority patent/MA43082A1/fr
Priority to CA3012982A priority patent/CA3012982A1/en
Priority to AU2017210871A priority patent/AU2017210871A1/en
Priority to US16/073,598 priority patent/US10918736B2/en
Application filed by Hanmi Pharmaceutical Co Ltd, Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd filed Critical Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Priority to EP17744617.6A priority patent/EP3409771A4/en
Priority to HK18116519.8A priority patent/HK1257558A1/en
Priority to CN201780020861.8A priority patent/CN108884455A/zh
Publication of WO2017131496A1 publication Critical patent/WO2017131496A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to PH12018501612A priority patent/PH12018501612A1/en
Priority to ZA2018/05634A priority patent/ZA201805634B/en
Priority to CONC2018/0008427A priority patent/CO2018008427A2/es
Priority to JP2021200694A priority patent/JP2022046524A/ja
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6815—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/321—Polymers modified by chemical after-treatment with inorganic compounds
    • C08G65/328—Polymers modified by chemical after-treatment with inorganic compounds containing other elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33396—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen having oxygen in addition to nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/34—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from hydroxy compounds or their metallic derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01022—Alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic enzyme conjugate in which an immunoglobulin Fc region is bound to a therapeutic enzyme through a non-peptidyl polymer linkage, a method for preparing the conjugate, and a composition comprising the same.
  • Proteins such as therapeutic enzymes generally have low stability and are easily denatured and frequently administered to patients in order to be degraded by proteolytic enzymes in the blood to maintain blood levels and titers.
  • proteolytic enzymes in the blood to maintain blood levels and titers.
  • protein drugs which are mostly administered to patients in the form of injections
  • frequent injections to maintain blood levels of active polypeptides can cause tremendous pain in the patient.
  • efforts have been made to increase the stability of the therapeutic enzymes in the blood and to maximize the drug efficacy by maintaining high blood drug concentration for a long time.
  • Such long-acting preparations of therapeutic enzymes should increase the stability of the therapeutic enzymes while keeping the titer of the drug itself sufficiently high and should not elicit an immune response in the patient.
  • lysosomal storage disease is a fatal disease caused by genetic defects of specific enzymes and it is fatal to death, and supplementation treatment of defective enzymes is essential (Frances M. Platt et al., J Cell Biol. 2012 Nov 26; 199 (5): 723-34).
  • Enzyme supplement therapy is a standard treatment for lysosomal accumulation disease, and supplementing insufficient enzymes may alleviate existing symptoms or slow down disease progression.
  • the daily lives of patients and their families may be limited in that the drug must be administered intravenously for 2-6 hours every 1-2 weeks.
  • the half-life in humans of recombinant enzymes used in the treatment of lysosomal accumulation diseases is very short, ranging from 10 minutes to less than 3 hours, leading to discomfort for patients who need to use enzymes for a lifetime. Very necessary.
  • One object of the present invention is to provide an enzyme conjugate wherein a therapeutic enzyme and an immunoglobulin Fc region are linked through a non-peptidyl polymer.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of lysosomal accumulation disease comprising the enzyme conjugate.
  • Yet another object of the present invention is to provide a method for preparing the enzyme conjugate.
  • the present invention relates to a sustained therapeutic enzyme conjugate, specifically, a therapeutic enzyme, a non-peptidyl polymer linkage, and an immunoglobulin Fc are linked to each other by covalent bonds, thereby improving the in vivo persistence of the enzyme as well as cells. It relates to an enzyme conjugate with improved transcytosis, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting. Enzyme conjugates prepared by the present invention can be usefully used for the treatment of lysosomal storage disease (LSD).
  • LSD lysosomal storage disease
  • 1 is a diagram showing the results of the PK experiment of the agalsidase beta sustained conjugate.
  • Figure 2 is a diagram showing the in vitro enzyme activity of the agalsidase beta continuous conjugate.
  • Figure 3 is a diagram showing the in vitro cellular uptake activity of the agalsidase beta long-acting conjugate.
  • Figure 4 shows the in vitro enzyme activity of the imiglucerase sustained conjugate.
  • 5 is a diagram showing the in vitro enzyme activity of the gallspase long-acting conjugate.
  • FIG. 6 is a diagram showing the in vitro enzyme activity of the iduronidase continuous conjugate.
  • One aspect of the invention provides an enzyme conjugate wherein a therapeutic enzyme and an immunoglobulin Fc region are linked through a non-peptidyl polymer linkage for the treatment of lysosomal storage disease (LSD).
  • LSD lysosomal storage disease
  • the enzyme is beta-glucosidase, beta-galactosidase, galactose-6-sulfatase, acidic ceramidase (acid ceramidase), acid sphingomyelinase, galactocerebrosidsase, arylsulfatase A, beta-hexosaminidase A, beta-hexosaminidase A Beta-hexosaminidase B, heparin N-sulfatase, alpha-D-mannosidase, beta-glucuronidase , N-acetylgalactosamine-6-sulfatase, lysosomal acid lipase, alpha-N-acetyl-glucosaminidase, NAGLU ), Glucocerebrosidase, butyrylcholinesterase, chitinase, glutame Glutamate decarboxylase,
  • Another aspect of the invention provides an enzyme conjugate wherein alpha-galactosidase A and an immunoglobulin Fc region are linked through a non-peptidyl polymer linkage for the treatment of lysosomal storage disease (LSD). to provide.
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another aspect of the invention provides an enzyme conjugate wherein an arylsulfatase B (ARSB) and an immunoglobulin Fc region are linked through a non-peptidyl polymer linkage for the treatment of lysosomal storage disease (LSD). do.
  • ARSB arylsulfatase B
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another aspect of the invention provides an enzyme conjugate wherein an iduronidase and an immunoglobulin Fc region for the treatment of lysosomal storage disease (LSD) are linked through non-peptidyl polymer linkages.
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another aspect of the invention provides an enzyme conjugate wherein alpha-glucosidase and immunoglobulin Fc regions are linked through non-peptidyl polymer linkages for the treatment of lysosomal storage disease (LSD). do.
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another aspect of the invention provides an enzyme conjugate wherein an imiglucerase and an immunoglobulin Fc region for the treatment of lysosomal storage disease (LSD) are linked through non-peptidyl polymer linkages.
  • LSD lysosomal storage disease
  • the lysosomal accumulation disease provides an enzyme conjugate that is selected from the group consisting of mucopolysaccharidosis (MPS), glycogen storage disease, and sphingolipidosis. .
  • MPS mucopolysaccharidosis
  • glycogen storage disease glycogen storage disease
  • sphingolipidosis sphingolipidosis
  • the mucopolysaccharide deposition provides an enzyme conjugate selected from the group consisting of mucopolysaccharidosis (MPS) I, and mucopolysaccharidosis (VI).
  • MPS mucopolysaccharidosis
  • VI mucopolysaccharidosis
  • the glycogen accumulation disease provides an enzyme conjugate that is Pompe disease.
  • the sphingolipidosis provides an enzyme conjugate that is selected from the group consisting of Fabry disease, and Gaucher's disease.
  • the enzyme conjugate provides an enzyme conjugate in which extracytosis, and bioavailability (BA) are increased than an enzyme to which the immunoglobulin Fc region does not bind.
  • BA bioavailability
  • the extracellular excretion provides an enzyme conjugate wherein the immunoglobulin Fc region is by binding of a neonatal Fc receptor (FcRn).
  • FcRn neonatal Fc receptor
  • the enzyme conjugate provides an enzyme conjugate having an increased tissue distribution than an enzyme to which the immunoglobulin Fc region does not bind.
  • the enzyme conjugate provides an enzyme conjugate in which bone marrow targeting is increased over an enzyme to which the immunoglobulin Fc region does not bind.
  • the immunoglobulin Fc region provides an enzyme conjugate that is unglycosylated.
  • the immunoglobulin Fc region provides an enzyme conjugate comprising 1 to 4 domains selected from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 domains.
  • the immunoglobulin Fc region provides an enzyme conjugate further comprising a hinge region.
  • an enzyme conjugate wherein said immunoglobulin Fc region is an immunoglobulin Fc fragment derived from IgG, IgA, IgD, IgE or IgM.
  • each domain of the immunoglobulin Fc region is a hybrid of domains with different origins derived from immunoglobulins selected from the group consisting of IgG, IgA, IgD, IgE, IgM To provide.
  • the immunoglobulin Fc region provides an enzyme conjugate, wherein the immunoglobulin Fc region is a dimer or multimer consisting of short chain immunoglobulins consisting of domains of the same origin.
  • the immunoglobulin Fc region provides an enzyme conjugate wherein the IgG4 Fc fragment is an IgG4 Fc fragment.
  • the immunoglobulin Fc region is a human unglycosylated IgG4 Fc fragment.
  • the enzyme conjugate provides an enzyme conjugate wherein the non-peptidyl polymer linkage is linked to the N-terminus of the enzyme or derivative thereof.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating lysosomal storage disease (LSD), including an enzyme conjugate for treating lysosomes.
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating lysosomal storage disease (LSD), including an alpha-galactosidase A enzyme conjugate for treating lysosomes. .
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating lysosomal storage disease (LSD), including an arylsulfatase B (ARSB) enzyme conjugate for treating lysosomal.
  • LSD lysosomal storage disease
  • ARSB arylsulfatase B
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating lysosomal storage disease (LSD), including an iduronidase enzyme conjugate for treating lysosomes.
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating lysosomal storage disease (LSD), including an alpha-glucosidase enzyme conjugate for treating lysosomes.
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating lysosomal storage disease (LSD), including an imiglucerase enzyme conjugate for treating lysosomes.
  • LSD lysosomal storage disease
  • the pharmaceutical composition provides a pharmaceutical composition that increases extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting.
  • Another embodiment of the present invention comprises the steps of (a) linking a therapeutic enzyme and a non-peptidyl polymer for the treatment of lysosomal storage disease (LSD); And (b) linking the linker to which the enzyme is linked to the non-peptidyl polymer with a biocompatible material capable of increasing half-life in vivo.
  • LSD lysosomal storage disease
  • the enzyme is beta-glucosidase, beta-galactosidase, galactose-6-sulfatase, acidic ceramidase (acid ceramidase), acid sphingomyelinase, galactocerebrosidsase, arylsulfatase A, beta-hexosaminidase A, beta-hexosaminidase A Beta-hexosaminidase B, heparin N-sulfatase, alpha-D-mannosidase, beta-glucuronidase , N-acetylgalactosamine-6-sulfatase, lysosomal acid lipase, alpha-N-acetyl-glucosaminidase, NAGLU ), Glucocerebrosidase, butyrylcholinesterase, chitinase, glutame Glutamate decarboxylase,
  • Another embodiment of the present invention comprises the steps of (a) linking an alpha-galactosidase A enzyme and a non-peptidyl polymer for the treatment of lysosomal storage disease (LSD); And (b) linking the linker to which the alpha-galactosidase A is connected to the non-peptidyl polymer with a biocompatible material capable of increasing the half-life in vivo.
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another embodiment of the present invention comprises the steps of: (a) linking an arylsulfatase B (ARSB) enzyme and a non-peptidyl polymer for the treatment of lysosomal storage disease (LSD); And (b) linking the linker to which the arylsulfatase B and the non-peptidyl polymer are linked with a biocompatible material capable of increasing the half-life in vivo.
  • ARSB arylsulfatase B
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another embodiment of the present invention comprises the steps of: (a) linking an iduronidase enzyme and a non-peptidyl polymer for the treatment of lysosomal storage disease (LSD); And (b) linking the linkage between the iduronidase and the non-peptidyl polymer with a biocompatible material capable of increasing half-life in vivo.
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another embodiment of the present invention comprises the steps of (a) linking an alpha-glucosidase enzyme and a non-peptidyl polymer for the treatment of lysosomal storage disease (LSD); And (b) linking the linker in which the alpha-glucosidase and the non-peptidyl polymer is linked with a biocompatible material capable of increasing the half-life in vivo.
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another embodiment of the present invention comprises the steps of: (a) linking an imiglucerase enzyme and a non-peptidyl polymer for the treatment of lysosomal storage disease (LSD); And (b) linking the linker to which the imiglucerase and the non-peptidyl polymer are linked with a biocompatible material that can increase the half-life in vivo.
  • LSD lysosomal storage disease
  • the non-peptidyl polymer is polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene Selected from the group consisting of glycol-propylene glycol copolymers, polyoxyethylated polyols, polyvinyl alcohols, polysaccharides, dextran, polyvinylethyl ethers, biodegradable polymers, lipid polymers, chitin, hyaluronic acid and combinations thereof Provided are methods for preparing phosphorus enzyme conjugates.
  • the non-peptidyl polymer is polyethylene glycol, which provides a method for preparing an enzyme conjugate.
  • the reactor of the non-peptidyl polymer of step (a) provides a method for producing an enzyme conjugate is selected from the group consisting of aldehyde group, maleimide group and succinimide derivative.
  • the aldehyde group provides a method for preparing an enzyme conjugate, wherein the aldehyde group is a propion aldehyde group or a butyl aldehyde group.
  • the succinimide derivative is succinimidyl carboxymethyl, succinimidyl valerate, succinimidyl methylbutanoate, succinimidyl methylpropionate, succinimidyl butanoate, succinimide Provided are dill propionate, N-hydroxysuccinimide or succinimidyl carbonate.
  • the non-peptidyl polymer provides an enzyme conjugate, which has an aldehyde group reactor at the end.
  • the non-peptidyl polymer provides an enzyme conjugate having at each end an aldehyde group and a maleimide reactor.
  • the non-peptidyl polymer provides an enzyme conjugate having at each end an aldehyde group and a succinimide reactor.
  • a method for producing an enzyme conjugate further comprising the step of separating the conjugate in which the non-peptidyl polymer linkage is bound to the N-terminus of the enzyme.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object provides an enzyme conjugate, wherein the therapeutic enzyme and immunoglobulin Fc region for the treatment of lysosomal storage disease (LSD) are linked through a non-peptidyl polymer linkage.
  • LSD lysosomal storage disease
  • the enzyme conjugate may be an enzyme conjugate in which the non-peptidyl polymer linkage binds to the immunoglobulin Fc region and the enzyme.
  • the enzyme conjugate is obtained by reacting a non-peptidyl polymer with a free Fc region and a free enzyme, wherein the non-peptidyl polymer is selected from the type of non-peptidyl polymer linkage and repeating units. It is the same substance in number and location.
  • the non-peptidyl polymer used for the free Fc region and the free enzyme reaction may be a material having a terminal reactor that differs in chemical structure from the repeating units at both ends of the repeating units.
  • Enzyme conjugates are obtained in which repeating units are linked to an enzyme and an Fc region. That is, in the above embodiment of the present invention, the non-peptidyl polymer is converted into the non-peptidyl polymer linkage in the enzyme conjugate through the manufacturing process.
  • the enzyme that can be included in the enzyme conjugate of the present invention is not particularly limited, and if the enzyme conjugate can be obtained by increasing the in vivo duration by producing the enzyme conjugate of the present invention rather than the enzyme in the non-conjugated form, May be included. In one embodiment of the invention this enzyme conjugate is a combination of therapeutic enzymes.
  • the enzyme is beta-glucosidase, beta-galactosidase, galactose-6-sulfatase, acid ceramidase ), Acid sphingomyelinase, galactocerebrosidase, arylsulfatase A, beta-hexosaminidase A, beta-hexosaminidase (beta-hexosaminidase) B, heparin N-sulfatase, alpha-D-mannosidase, beta-glucuronidase, N- N-acetylgalactosamine-6 sulfatase, lysosomal acid lipase, alpha-N-acetyl-glucosaminidase (NAGLU), glucose Glucocerebrosidase, butyrylcholinesterase, chitinase, glutamate dicarboxyl Glutamate decarboxylase, Lipase
  • Another aspect of the invention provides an enzyme conjugate wherein alpha-galactosidase A and an immunoglobulin Fc region are linked through a non-peptidyl polymer linkage for the treatment of lysosomal storage disease (LSD).
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another aspect of the invention provides an enzyme conjugate wherein an arylsulfatase B (ARSB) and an immunoglobulin Fc region for the treatment of lysosomal storage disease (LSD) are linked via non-peptidyl polymer linkages. do.
  • ARSB arylsulfatase B
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another aspect of the invention provides an enzyme conjugate wherein an iduronidase and an immunoglobulin Fc region for the treatment of lysosomal storage disease (LSD) are linked through non-peptidyl polymer linkages.
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another aspect of the invention provides an enzyme conjugate wherein alpha-glucosidase and an immunoglobulin Fc region for the treatment of lysosomal storage disease (LSD) are linked through non-peptidyl polymer linkages. do.
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another aspect of the invention provides an enzyme conjugate wherein an imiglucerase and an immunoglobulin Fc region for the treatment of lysosomal storage disease (LSD) are linked through non-peptidyl polymer linkages.
  • LSD lysosomal storage disease
  • the term “therapeutic enzyme” or “enzyme” is an enzyme for treating a disease caused by a lack of enzyme, deficiency, dysfunction, etc., and may be performed by enzyme replacement therapy, administration, or the like. It means an enzyme that can treat an individual with a disease. Specifically, it may be an enzyme for the treatment of lysosomal accumulation disease caused by the lack or lack of a lysosomal enzyme, but is not limited thereto.
  • lysosome is one of the organelles present in the cytoplasm, and contains a large number of hydrolytic enzymes. Thus, the body decomposes foreign substances such as macromolecules, bacteria, and the like. It is a small organ that helps to recycle the part.
  • the function of the lysosomal is performed by a number of enzymes, if a specific enzyme loses its function due to stool or deficiency, the degradation function of the lysosome is lost, the macromolecules to be degraded in the cell It accumulates and causes damage to cells, which causes disease.
  • lysosomal storage disease means a rare genetic disease caused by such loss of lysosomal function, and enzymatic replacement therapy using a defective enzyme is essential. to be. In the present invention, it is used interchangeably with "lysosomal accumulator".
  • the lysosomal accumulation disease is classified based on the deficient enzymes: (i) sphingolipidosis, (ii) mucopolysaccharidosis, (iii) glycogen storage disease, (iv) ) Mucolipidosis, (v) oligosaccharidosis, (vi) lipoidosis, and (vii) lysosomal transport disease.
  • sphingolipidosis is a hereditary deficiency of lysosomal enzymes that hydrolyze sugar chains or choline chains of sphingolipids.
  • Krabbe's disease due to galactocerebrosidsase deficiency Fabry's disease due to alpha-galactosidase A deficiency, sphingomyelinase Niemann-pick disease due to deficiency, Gaucher's disease due to Glucocerebrosidase deficiency, Tay-Sachs disease due to Hexosaminidase A deficiency ) And diseases according to the distribution of accumulated lipids, such as Farber disease. It is an autosomal recessive hereditary disease with the exception of Fabry, an X chromosome.
  • Fabry disease refers to a congenital metabolic disorder of glycolipids due to lack of activity of hydrolase (alpha-galactosidase A) in lysosomes. It is a hereditary disease inherited by chromosomal recession. Asymptomatic in infancy, limb pain and skin rash appear after childhood, and cardiovascular lesions and renal failure after puberty. As a treatment method, enzyme replacement therapy and gene therapy are being studied.
  • Gaucher's disease is a congenital lipid metabolism caused by a lack of a glucocerebrosidase enzyme, which is an autosomal (chromosome 1) recessive hereditary disease. Old cells accumulate in the liver, spleen, and bone marrow, causing problems. Severe metastasis to the lungs, eyes, kidneys, heart and nervous system is known to cause serious complications. As a treatment method, enzyme replacement therapy and gene therapy are being studied.
  • MPS manucopolysaccharidosis
  • oligosaccharide sulfatase or acetyl transferase.
  • Fatty cartilage is also called gargoylis.
  • the main symptom is the excessive excretion of mucopolysaccharides in the urine.
  • Type I being Hurler syndrome and Scheie syndrome
  • type II being Hunter syndrome and type III being Sanfilippo syndrome.
  • Types A, B, C, and D Type IV is Morquio syndrome.
  • Types A, B, and VI are Maroteaux-Lamy syndrome.
  • Type V is Sly syndrome. .
  • Heter syndrome is a mucopolysaccharidosis (MPS) type I disease caused by a deficiency of ⁇ -L-iduronidase, an autosomal recessive inherited disease, and a rare hereditary disease. to be. It is similar to Hunter's syndrome, but the symptoms are more severe and most people die before age 10. Symptoms such as Hunter's syndrome, such as intellectual disability, deafness, hypertrophy of the liver and spleen, external features such as low nose, thick lips, and large tongue, and severe skeletal malformations, accompany corneal clouding symptoms.
  • MPS mucopolysaccharidosis
  • Maroteaux-Lamy syndrome is a type of mucopolysaccharidosis (MPS) VI disease, which is required for the degradation of glycosaminoglycan (Arylsulfatase B, N- Autosomal recessive hereditary disease caused by lack of acetylgalactosamine-4-sulfatase). It is a disease caused by deposition of dermatan sulfate, which cannot be degraded due to the lack of the enzyme in bone, heart valve, spleen, liver, and cornea.
  • MPS mucopolysaccharidosis
  • glycososomal accumulation diseases are type II (Pompe disease), and type IIIb (Danon disease).
  • Glycogen accumulation disease type II is also known as acid maltase deficiency, or Pompe disease (Pompe's disease), and one of the lysosomal enzymes, ⁇ -glucosidase ( ⁇ -1,4-glucosidase, acid). It is a disease caused by deficiency of alpha-glucosidase, and is known to die within several months due to hypertrophy of liver, kidney, muscle weakness, equipment band, heart equipment band, dyspnea, etc. have.
  • the term “therapeutic enzyme conjugate (conjugate) for treating lysosomal accumulator disease”, or “enzyme conjugate” refers to an immunoglobulin Fc region in which an enzyme having a therapeutic effect of the lysosomal accumulating disease is through a non-peptidyl polymer linkage. By being linked to, the prophylactic or therapeutic effect of the lysosomal accumulation disease by the enzyme can be obtained.
  • the enzyme conjugate of the present invention may have an effect of increasing the sustainability by connecting a substance capable of increasing the half-life of a therapeutic enzyme with the enzyme.
  • the "enzyme conjugate” of the present invention may be mixed with the "persistent conjugate”.
  • the enzyme conjugates of the present invention can be used as drugs of enzymatic replacement therapy (ERT).
  • ERT enzymatic replacement therapy
  • the enzyme replacement therapy can prevent or treat a disease through recovery of degraded enzyme function by supplementing a deficiency or lack enzyme that causes the disease.
  • the enzyme conjugate linked to the Fc region of the present invention has the effect that the Fc region binds to FcRn, so that extracellular excretion is increased compared to an enzyme to which the Fc region is not linked.
  • Increased FcRn-mediated extracellular excretion not only helps maintain cellular uptake even though the enzyme is linked to the Fc region to form large molecules, but also the therapeutic enzyme is absorbed into the body while maintaining long-lasting enzyme activity. By allowing the enzyme to function itself, it is possible to treat lysosomal accumulation diseases.
  • ERT enzymes used for lysosomal storage disease have a low bioavailability (BA), which has to be administered intravenously (iv).
  • Intravenous injection causes discomfort that requires the patient to visit the hospital each time.
  • intravenous injections cause allergic types of hypersensitivity reactions, leading to infusion reactions related to drug infusion at high frequency.
  • Enzyme conjugate of the present invention increases the bioavailability due to the extracellular discharge (transcytosis) by the FcRn binding site enables subcutaneous injection rather than intravenous injection, and the change of the administration method enables self-injection to increase the convenience of the patient In addition, side effects can be minimized by reducing the infusion reaction.
  • ERT enzyme replacement therapy
  • Enzyme conjugates of the present invention have a high distribution in vivo in various tissues other than the liver, especially bone marrow, spleen, kidney, etc. due to increased blood half-life and transcytosis by the FcRn binding site, Efficiency can be maximized.
  • the enzyme conjugates of the present invention exhibit high bone marrow targeting.
  • Bone marrow tissue is a flexible structure that exists inside the bone, and by increasing the targeting to bone marrow tissue, additional effects can be expected through pharmacological action in the bone marrow by enzyme replacement therapy, thereby effectively treating the lysosomal accumulation disease. have.
  • the lysosomal accumulation disease occurs in a variety of organs, especially in the bone marrow is a variety of anemia and the like through the suppression of bone abnormalities or bone production, the production of erythropoietin and platelet production hormone that must be made in the bone marrow
  • the enzyme conjugates of the present invention have high bone marrow targeting, making them a good therapeutic agent for enzyme replacement therapy.
  • the enzyme conjugate of the present invention may be an increase in extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting than the enzyme that the immunoglobulin Fc region does not bind by binding the immunoglobulin Fc region to FcRn. .
  • the therapeutic enzyme included in the enzyme conjugate of the present invention may be included without limitation as long as it can have a therapeutic effect on lysosomal accumulation disease, but may specifically include the following enzyme.
  • alpha-galactosidase A is an enzyme related to Fabry disease, also called agalasidase, which is the terminal alpha- of glycolipid or glycoprotein.
  • Galactosyl moieties are enzymes that hydrolyze into galactose and glucose.
  • the alpha-galactosidase A may be used in combination with alpha-galactosidase or agalsidase.
  • the alpha-galactosidase or agalsidase may be agalsidase alpha or agalsidase beta.
  • imiglucerase is an enzyme having activity of glucose ceramide hydrolase and is a beta-glucosidic linkage of glucocerebroside, an intermediate of glycolipid metabolism. ) Is a recombinant form of human beta-glucocerebrosidase. It is known to be related to Gaucher's disease.
  • iduronidase refers to L-iduronidase, L-iduronidase, alpha-L-iduronidase (IDUA), laronidase ( laronidase) and is involved in the hydrolysis of glycosaminoglycans, such as dermatan sulfate and heparan sulfate.
  • the idoronidase may be used in combination with laronidase.
  • arylsulfatase B is an arylsulfatase enzyme present in the lysosomes of the liver, pancreas, and kidneys.
  • arylsulfatase B is used to hydrolyze sulfate by degrading glycosaminoglycans. Do it.
  • the arylsulfatase B is known to be associated with mucopolysaccharidosis VI (Maroteaux-Lamy syndrome).
  • the arylsulfatase B may be used in combination with galsulfase.
  • alpha-glucosidase of the present invention is a type of glucosidase that breaks down starch or disaccharides into glucose, and Pompe disease develops due to a deficiency of the enzyme.
  • the alpha-glucosidase may be used in combination with alglucosidase or acid alpha-glucosidase (GAA).
  • a combination of an enzyme for treating lysosomal accumulation disease, bisulfase, agalsidase, imiglucerase, galsulfase, and laronidase, respectively, with an immunoglobulin Fc region and a non-peptidyl polymer (Example 3), and confirmed the in vitro and in vivo activity of each enzyme conjugate (Examples 4 to 8).
  • the therapeutic enzymes that may be included in the enzyme conjugates of the present invention may be naturally occurring, and may comprise a fragment consisting of a part, or a substitution, addition, removal, modification, and combination of some amino acids.
  • Derivatives of enzymes in which modifications selected from the group consisting of, are also included without limitation in the present invention, as long as they have the same activity as a natural enzyme.
  • the enzyme derivative includes a biosimilar and a biobetter form of the enzyme.
  • biosimilars include a difference between a known enzyme and an expression host, a difference in the degree and extent of glycosylation, and a residue at a specific position. In the light of sequence, if it is not 100% substitution, the difference in degree of substitution corresponds to the biosimilar enzyme that can be used in the enzyme conjugate of the present invention.
  • the enzyme may be produced in animal cells, E. coli, yeast, insect cells, plant cells, living animals, etc. through genetic recombination, and the production method is not limited thereto, and may be a commercially available enzyme.
  • Amino acid sequences having the same identity may be included, and the enzyme may be obtained from a microorganism by recombinant technology, or may be commercially available, but is not limited thereto.
  • the term "homology" of the present invention is intended to indicate the degree of similarity between the amino acid sequence of a wild type protein or the base sequence encoding the same, and the amino acid sequence or base sequence of the present invention and Includes sequences having the same sequence by at least the same percentage. Such homology may be determined by visually comparing two sequences, but may be determined using a bioinformatic algorithm that analyzes the degree of homology by arranging the sequences to be compared side by side. Homology between the two amino acid sequences can be expressed as a percentage. Useful automated algorithms are available in the GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA computer software modules of the Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, W, USA).
  • Automated alignment algorithms in this module include Needleman & Wunsch and Pearson & Lipman and Smith & Waterman sequence alignment algorithms. Algorithms and homology determinations for other useful arrays are automated in software including FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST and CLUSTAL W.
  • Information of the sequence of the enzyme or derivatives thereof and the base sequence encoding the same can be obtained from a known database such as NCBI.
  • immunoglobulin Fc region refers to the remainder of the immunoglobulin except for the heavy and light variable regions, heavy chain constant region 1 (C H 1) and light chain constant region 1 (C L 1), and immunoglobulin.
  • the Fc region may further include a hinge region in the heavy chain constant region, and in particular, the Fc region may be a fragment including the entire immunoglobulin Fc region and a portion thereof, so that the immunoglobulin Fc region may be mixed with an immunoglobulin fragment. Can be.
  • Fc gamma receptors 1,2,3 and complement (c1q) While native Fc has a sugar chain at the Asn297 site in heavy chain constant region 1, E. coli-derived recombinant Fc is expressed in a sugar-free form.
  • the sugar chain is removed from Fc, the binding capacity of Fc gamma receptors 1,2,3 and complement (c1q) that binds to heavy chain constant region 1 is reduced, thereby reducing or eliminating antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity.
  • the "immunoglobulin constant region” refers to the heavy chain constant region 2 (CH2) and the heavy chain constant region 3 (except for the heavy and light chain variable regions, heavy chain constant region 1 (CH1) and light chain constant region (CL) of the immunoglobulin)
  • the Fc fragment may include a CH3) (or heavy chain constant region 4 (CH4)) portion, and may include a hinge portion in the heavy chain constant region.
  • the immunoglobulin constant region of the present invention has substantially the same or improved effect as the natural type, except for the heavy and light chain variable regions of the immunoglobulin, some or all heavy chain constant region 1 (CH1) and / or light chain constant region It may be an extended immunoglobulin constant region comprising (CL).
  • the immunoglobulin constant regions of the present invention are (1) CH1 domain, CH2 domain, CH3 domain and CH4 domain, (2) CH1 domain and CH2 domain, (3) CH1 domain and CH3 domain, (4) CH2 domain and CH3 Domain, (5) a combination of one or two or more constant region domains with an immunoglobulin hinge region (or a portion of the hinge region), (6) heavy chain constant regions and dimers of each domain and light chain constant region. Since constant regions, including immunoglobulin Fc fragments, are biodegradable polypeptides that are metabolized in vivo, they are safe for use as carriers of drugs.
  • immunoglobulin Fc fragments have a relatively low molecular weight compared to the whole immunoglobulin molecule, which is advantageous in terms of preparation, purification and yield of the conjugates, and because Fab portions exhibiting high heterogeneity are removed because the amino acid sequence varies from antibody to antibody. It is also expected that the homogeneity will be greatly increased and the likelihood of inducing blood antigens will be lowered.
  • the immunoglobulin constant region may be a human or animal origin, such as cattle, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, guinea pigs, preferably human origin.
  • the immunoglobulin constant region may be selected from the group consisting of constant regions by IgG, IgA, IgD, IgE, IgM derived or combinations thereof or hybrids thereof.
  • IgG or IgM which is most abundant in human blood, and most preferably from IgG known to enhance the half-life of ligand binding proteins.
  • the immunoglobulin Fc region may be a dimer or multimer consisting of short-chain immunoglobulins consisting of domains of the same origin.
  • “combination” means that when forming a dimer or multimer, a polypeptide encoding a single-chain immunoglobulin constant region (preferably an Fc region) forms a bond with a single-chain polypeptide of different origin.
  • a polypeptide encoding a single-chain immunoglobulin constant region preferably an Fc region
  • hybrid is a term used to mean that a sequence corresponding to two or more immunoglobulin constant regions of different origin exists in an immunoglobulin constant region (preferably an Fc region) of a short chain.
  • various types of hybrids are possible. That is, hybridization of a domain consisting of one to four domains selected from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 of IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc and IgD Fc is possible, and further includes a hinge region. can do.
  • IgG can also be divided into subclasses of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 and combinations or hybridized forms thereof are also possible in the present invention. Specifically, it may be an IgG2 and IgG4 subclass, and more specifically, may be an Fc region of IgG4 having little effector function such as Complementdependent cytotoxicity (CDC).
  • CDC Complementdependent cytotoxicity
  • the immunoglobulin constant region may be a natural sugar chain, an increased sugar chain compared to the natural form, a reduced sugar chain or a sugar chain removed from the natural form.
  • Conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods and genetic engineering methods using microorganisms can be used to increase or decrease such immunoglobulin constant region sugar chains.
  • the immunoglobulin constant region in which the sugar chain is removed from the immunoglobulin constant region is markedly lowered in the binding force of the complement (c1q), and the antibody-dependent cytotoxicity or the complement-dependent cytotoxicity is reduced or eliminated. Does not cause.
  • a form more consistent with its original purpose as a carrier of the drug would be an immunoglobulin constant region wherein the sugar chains have been removed or unglycosylated.
  • non-glycosylated Fc regions derived from human IgG4, ie human nonglycosylated IgG4 Fc regions can be used.
  • Human-derived Fc regions may be preferred over non-human-derived Fc regions that can cause undesirable immune responses, such as acting as antigens in human living organisms to produce new antibodies against them.
  • immunoglobulin constant regions of the present invention include not only native amino acid sequences but also sequence derivatives thereof.
  • Amino acid sequence derivatives mean that one or more amino acid residues in a natural amino acid sequence have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • IgG Fc amino acid residues 214 to 238, 297 to 299, 318 to 322 or 327 to 331 which are known to be important for binding can be used as suitable sites for modification.
  • various kinds of derivatives are possible, such as a site capable of forming disulfide bonds, a few amino acids at the N-terminus in the native Fc, or a methionine residue added at the N-terminus of the native Fc.
  • complement binding sites such as C1q binding sites, may be removed, or ADCC sites may be removed to eliminate effector function.
  • Techniques for preparing sequence derivatives of such immunoglobulin constant regions have been disclosed in WO 97/34631, WO 96/32478, and the like.
  • Amino acid exchange in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole is known in the art (H. Neuroath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thr / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly.
  • it may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation, amylation, etc. may be modified.
  • immunoglobulin constant region derivatives described above exhibit the same biological activity as the immunoglobulin constant region of the present invention, but may be derivatives that have enhanced structural stability against heat, pH, and the like of the immunoglobulin constant region.
  • immunoglobulin constant regions may be obtained from natural forms isolated from humans and animals, such as cattle, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, and guinea pigs, or may be transformed animal cells or microorganisms. It may be a recombinant or derivative thereof obtained from.
  • the method obtained from the natural form can be obtained by separating the whole immunoglobulin from the human or animal living body, and then treating the protease. Papain is cleaved into Fab and Fc, and pepsin is cleaved into pF'c and F (ab) 2. This may be separated by Fc or pF'c using size-exclusion chromatography.
  • the human-derived immunoglobulin constant region may be a recombinant immunoglobulin constant region obtained from a microorganism.
  • non-peptidyl polymer includes a biocompatible polymer having two or more repeating units bonded thereto, and is interchangeable with “non-peptidyl linker".
  • the repeating units are linked to each other through any covalent bond, not a peptide bond.
  • the non-peptidyl polymer may include a reactor at its end to form a conjugate through reaction with other components constituting the conjugate.
  • non-peptidyl polymer linkage refers to a component in a conjugate formed by binding a non-peptidyl polymer having reactors at both ends with an immunoglobulin Fc region and a therapeutic enzyme through each reactor. Means.
  • the enzyme conjugate is covalently linked to the immunoglobulin Fc region and the therapeutic enzyme via a non-peptidyl polymer comprising a reactor capable of binding an immunoglobulin Fc region and a therapeutic enzyme at both ends. It may be connected.
  • the non-peptidyl polymer is polyethylene glycol, polypropylene glycol, copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, polyoxy ethylenated polyols, polyvinyl alcohols, polysaccharides, dextran, polyvinyl It may be selected from the group consisting of biodegradable polymers such as ethyl ether, polylactic acid (PLA) and polylactic-glycolic acid (PLGA), lipid polymers, chitins, hyaluronic acid, oligonucleotides, and combinations thereof.
  • the non-peptidyl polymer may be polyethylene glycol, but is not limited thereto.
  • derivatives thereof known in the art and derivatives which can be easily prepared at the technical level in the art are included in the scope of the present invention.
  • the molecular weight of non-peptidyl polymers that can be used in the present invention is in the range of more than 0 to 200 kDa, in particular in the range of 1 to 100 kDa, more specifically in the range of 1 to 50 kDa, even more specifically in the range of 1 to 20 kDa, even more.
  • the range of 3.4kDa to 10 kDa, and more specifically about 3.4kDa is not limited thereto.
  • both ends of the non-peptidyl polymer may bind to the amine group or thiol group of the immunoglobulin Fc region and the amine group or thiol group of the therapeutic enzyme, respectively.
  • the non-peptidyl polymer has a reactor capable of binding to immunoglobulin Fc and a therapeutic enzyme, respectively, at both ends, specifically an amine group located at the N-terminus or lysine of a therapeutic enzyme or immunoglobulin Fc region, or It may include a reactor that can be combined with the thiol group of the cysteine, but is not limited thereto.
  • the reactor of the non-peptidyl polymer may be selected from the group consisting of aldehyde groups, maleimide groups and succinimide derivatives, but is not limited thereto.
  • an aldehyde group may be exemplified as a propion aldehyde group or a butyl aldehyde group, but is not limited thereto.
  • the succinimide derivative may be succinimidyl carboxymethyl, succinimidyl valerate, succinimidyl methylbutanoate, succinimidyl methylpropionate, succinimidyl butanoate, or succinate.
  • Imidyl propionate, N-hydroxysuccinimide or succinimidyl carbonate may be used, but is not limited thereto.
  • the non-peptidyl polymer may be linked to an immunoglobulin Fc and a therapeutic enzyme through such a reactor and converted to a non-peptidyl polymer linkage.
  • the final product produced by reductive alkylation by aldehyde bonds is much more stable than that linked by amide bonds.
  • the aldehyde reactor selectively reacts to the N-terminus at low pH and can form covalent bonds with lysine residues at high pH, for example pH 9.0 conditions.
  • the terminal reactors of the non-peptidyl polymers of the present invention may be the same or different from one another.
  • the non-peptidyl polymer may be one having an aldehyde group reactor at the end, and the non-peptidyl polymer may have an aldehyde group and maleimide reactor at the end, or may have an aldehyde group and succinimide reactor at the end, respectively. May be, but is not limited thereto.
  • one end may have a maleimide group and the other end may have an aldehyde group, a propion aldehyde group, or a butyl aldehyde group.
  • one end may have a succinimidyl group, and the other end may have a propionaldehyde group or a butyl aldehyde group.
  • poly (ethylene glycol) having a hydroxy reactor at the propion side activates the hydroxy group to the various reactors, or has a commercially available modified reactor.
  • Poly (ethylene glycol) may be used to prepare the enzyme conjugates of the present invention.
  • the reactor of the non-peptidyl polymer may be linked to the cysteine residue of the therapeutic enzyme, more specifically to the -SH group of cysteine, but is not limited thereto.
  • maleimide-PEG-aldehyde is used, the maleimide group is linked to the -SH group of the therapeutic enzyme with a thioether bond, and the aldehyde group is linked to the -NH 2 group of the immunoglobulin Fc through a reductive alkylation reaction.
  • the present invention may be, but is not limited to, one example.
  • the N-terminal amino groups of the immunoglobulin Fc region at an oxygen atom located at one end of PEG are connected to each other through a linker functional group having a structure of -CH 2 CH 2 CH 2- , -PEG-O -CH 2 CH 2 CH 2 NH-immunoglobulin Fc can form a structure, and through a thioether bond can form a structure in which one end of the PEG is connected to a sulfur atom located in the cysteine of the therapeutic enzyme.
  • the thioether bond described above It may include the structure of.
  • the reactor of the non-peptidyl polymer may be linked to -NH 2 located at the N-terminus of the immunoglobulin Fc region, which is one example.
  • the therapeutic enzyme of the present invention may be linked to the non-peptidyl polymer having a reactor through the N-terminus.
  • N-terminus refers to the amino terminus of a peptide and refers to a position capable of binding to a non-peptidyl polymer for the purposes of the present invention.
  • it may include not only the N-terminal terminal amino acid residues but also all of the amino acid residues around the N-terminus, specifically, the first to 20th amino acid residues from the last terminal. Can be.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating lysosomal storage disease (LSD), including a therapeutic enzyme conjugate for treating lysosomal accumulation disease.
  • LSD lysosomal storage disease
  • the enzyme is as described above.
  • Another aspect of the invention includes an enzyme conjugate wherein alpha-galactosidase A and an immunoglobulin Fc region are linked through a non-peptidyl polymer linkage for the treatment of lysosomal storage disease (LSD).
  • Another aspect of the invention is an lysosomal accumulation comprising an enzyme conjugate wherein an arylsulfatase B (ARSB) and an immunoglobulin Fc region for the treatment of lysosomal storage disease (LSD) are linked via a non-peptidyl polymer junction.
  • ARSB arylsulfatase B
  • LSD immunoglobulin Fc region for the treatment of lysosomal storage disease
  • Another aspect of the invention is an lysosomal disease comprising an enzyme conjugate wherein an iduronidase and an immunoglobulin Fc region for the treatment of lysosomal storage disease (LSD) comprise a non-peptide polymer junction. storage disease (LSD).
  • LSD lysosomal storage disease
  • Another aspect of the invention is an lysosomal accumulation comprising an enzyme conjugate wherein an alpha-glucosidase and an immunoglobulin Fc region for the treatment of lysosomal storage disease (LSD) is linked via a non-peptidyl polymer junction.
  • Another embodiment of the invention is an lysosomal disease comprising an enzyme conjugate wherein an imiglucerase and an immunoglobulin Fc region for the treatment of lysosomal storage disease (LSD) are linked via a non-peptide polymer junction. storage disease (LSD).
  • LSD lysosomal storage disease
  • lysosomal "lysosomal accumulation disease”, “alpha-galactosidase A”, “arylsulfatase B (ARSB)”, “iduronidase ), “Alpha-glucosidase”, “imiglucerase”, “immunoglobulin Fc region”, “non-peptidyl polymer linkage”, and “enzyme conjugate” are as described above. .
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of lysosomal accumulation disease by administration of a therapeutic enzyme or a composition comprising the same for treating the lysosomal accumulation disease
  • treatment means By any composition containing the same means any action that improves or benefits the symptoms of lysosomal accumulation disease.
  • administration means introducing a certain substance into a patient in any suitable way, and the route of administration of the composition is not particularly limited, but any general route by which the composition can reach a target in vivo.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating lysosomal storage disease (LSD) of the present invention is to recover the function of the lysosomal enzyme by administering a deficient or deficient enzyme that causes the lysosomal storage disease to a subject having a lysosomal accumulation disease, It may have the effect of treating lysosomal accumulation disease.
  • compositions that increase transcytosis, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting.
  • the pharmaceutical composition of the present invention allows the enzyme conjugate to which the therapeutic enzyme is linked to the Fc region to allow the enzyme conjugate to easily cross the cell membrane through intrinsic binding to the FcRn receptor, while at the same time effectively reaching blood vessels and tissues.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier excipient or diluent.
  • Such pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or diluents may be unnaturally occurring.
  • the carrier is not particularly limited, but oral administration may include binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, flavoring agents, and the like.
  • buffers, Preservatives, analgesic agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers and the like can be mixed and used.
  • bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used for topical administration.
  • the term "pharmaceutically acceptable” means a sufficient amount and side effects that do not cause a therapeutic effect, the type of disease, the age, weight, health, sex, sensitivity of the patient to the drug It can be easily determined by those skilled in the art according to well-known factors in the medical field, such as the route of administration, the method of administration, the frequency of administration, the duration of treatment, the combination or the drug used simultaneously.
  • Formulations of the compositions of the present invention can be prepared in a variety of mixtures with the pharmaceutically acceptable carriers described above.
  • oral administration may be in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, may be prepared in unit dosage ampoules or multiple dosage forms.
  • other solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, sustained release preparations and the like are examples of sustained release preparations and the like.
  • suitable carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, preservatives and the like may be further included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, lyophilized preparations and suppositories It may have a formulation of.
  • composition may be formulated in a unit dosage form suitable for intrabody administration of a patient according to a conventional method in the pharmaceutical field, specifically, in the form of a formulation useful for the administration of protein medicines, and administration commonly used in the art.
  • the conjugate may be used in admixture with various carriers (pharmaceutically acceptable carriers) such as saline or organic solvent, carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, ascorbic acid (ascorbic) to increase the stability or absorption acids) or antioxidants such as glutathione, chelating agents, low molecular weight proteins or other stabilizers can be used as medicaments.
  • carriers such as saline or organic solvent, carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, ascorbic acid (ascorbic) to increase the stability or absorption acids) or antioxidants such as glutathione, chelating agents, low molecular weight proteins or other stabilizers can be used as medicaments.
  • the dosage and frequency of the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug which is the active ingredient, along with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient and the severity of the disease.
  • the total effective amount of the composition of the present invention may be administered to a patient in a single dose and may be administered by a fractionated treatment protocol that is administered in multiple doses for long periods of time.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient depending on the extent of the disease.
  • the preferred total dose of the conjugates of the present invention may be from about 0.0001 mg to 500 mg per kg body weight of the patient per day.
  • the dose of the conjugate is determined by taking into consideration various factors such as the age, weight, health condition, sex, severity of the disease, diet and excretion rate, as well as the route and frequency of treatment of the pharmaceutical composition.
  • compositions of the present invention are not particularly limited to its formulation, route of administration and method of administration as long as the effect of the present invention is shown.
  • Another aspect of the invention provides a method of preventing or treating lysosomal accumulation disease, comprising administering to a subject in need thereof a pharmaceutical composition comprising said enzyme conjugate.
  • a method for preventing or treating lysosomal accumulation disease comprising administering to a subject in need thereof a pharmaceutical composition comprising an alpha-galactosidase A enzyme conjugate.
  • the present invention also provides a method of preventing or treating lysosomal accumulation disease, comprising administering to a subject in need thereof a pharmaceutical composition comprising an arylsulfatase B (ARSB) enzyme conjugate.
  • a pharmaceutical composition comprising an arylsulfatase B (ARSB) enzyme conjugate.
  • ARSB arylsulfatase B
  • the present invention also provides a method for preventing or treating a lysosomal accumulation disease, comprising administering to a subject in need thereof a pharmaceutical composition comprising an iduronidase enzyme conjugate.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating a lysosomal accumulation disease, comprising administering to a subject in need thereof a pharmaceutical composition comprising an alpha-glucosidase enzyme conjugate.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating lysosomal accumulation disease, comprising administering to a subject in need thereof a pharmaceutical composition comprising an imiglucerase enzyme conjugate.
  • the enzyme conjugate a composition comprising the same, lysosomal accumulation disease, prevention and treatment are as described above.
  • the term "individual” refers to an individual suspected of lysosomal accumulation disease, and the individual suspected of lysosomal accumulation disease means a mammal including a mouse, a livestock, and the like, including a human who may or may develop the disease. Individuals treatable with the conjugate of the present invention or the composition comprising the same are included without limitation.
  • the method of the present invention may comprise administering a pharmaceutical composition comprising the conjugate in a pharmaceutically effective amount.
  • Suitable total daily doses may be determined by the treating physician within the scope of good medical judgment and may be administered once or in divided doses.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient is determined by the specific composition, including the type and extent of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health of the patient, It is desirable to apply differently depending on various factors and similar factors well known in the medical field, including sex and diet, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, drugs used with or co-specific with the specific composition.
  • Another aspect of the invention provides a composition for extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting of the enzyme comprising the enzyme conjugate.
  • compositions for increasing extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting including an alpha-galactosidase A enzyme conjugate.
  • the present invention also provides an arylsulfatase B (ARSB) enzyme conjugate, comprising a composition for extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting of the enzyme.
  • ARSB arylsulfatase B
  • the present invention also provides a composition for extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting of an enzyme, including an iduronidase enzyme conjugate.
  • the present invention also provides a composition for extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting of an enzyme, including an alpha-glucosidase enzyme conjugate.
  • the present invention also provides a composition for extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting of an enzyme, including an imiglucerase enzyme conjugate.
  • Another aspect of the invention provides a method for increasing extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting of an enzyme, comprising administering the enzyme conjugate or composition comprising the same to an individual in need thereof. To provide.
  • the method comprises administering an alpha-galactosidase A enzyme conjugate or a composition comprising the same to an individual in need thereof, wherein the enzyme is subjected to extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, And methods for increasing bone marrow targeting.
  • extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting comprising administering an arylsulfatase B (ARSB) enzyme conjugate or a composition comprising the same to an individual in need thereof.
  • ARSB arylsulfatase B
  • extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting comprising administering an alpha-glucosidase enzyme conjugate or a composition comprising the same to an individual in need thereof Provide a way to increase.
  • a method for increasing extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting of an enzyme comprising administering an imiglucerase enzyme conjugate or a composition comprising the same to an individual in need thereof. to provide.
  • the enzyme conjugate a composition comprising the same, extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting are as described above.
  • Another aspect of the invention provides the use of the enzyme conjugate for preventing or treating lysosomal accumulation disease.
  • an alpha-galactosidase A enzyme conjugate provides a use for preventing or treating lysosomal accumulation disease.
  • arylsulfatase B (ARSB) enzyme conjugates for lysosomal accumulation disease prevention or treatment.
  • the present invention also provides a lysosomal accumulation disease prevention or treatment of alpha-glucosidase enzyme conjugate.
  • the present invention also provides a lysosomal accumulation disease prevention or treatment of an imiglucerase enzyme conjugate.
  • the enzyme conjugate, lysosomal accumulation disease, prevention, and treatment are as described above.
  • Yet another aspect of the present invention provides the use of the enzyme conjugate or composition comprising the same for extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting.
  • the present invention provides for the use of an alpha-galactosidase A enzyme conjugate or a composition comprising the same for extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and increased bone marrow targeting.
  • the invention also provides for the use of arylsulfatase B (ARSB) enzyme conjugates or compositions comprising the same for extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and increased bone marrow targeting.
  • ARSB arylsulfatase B
  • alpha-glucosidase enzyme conjugate or composition comprising the same for extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and increased bone marrow targeting.
  • the present invention provides for the use of an extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting of an imiglucerase enzyme conjugate or a composition comprising the same.
  • the enzyme conjugate a composition comprising the same, extracellular excretion, bioavailability, tissue distribution, and bone marrow targeting are as described above.
  • Another embodiment of the present invention comprises the steps of (a) linking a therapeutic enzyme and a non-peptidyl polymer for the treatment of lysosomal storage disease (LSD); And
  • X is an enzyme for treating lysosomal storage disease (LSD);
  • L is a non-peptidyl polymer
  • a is 0 or a natural number, provided that when a is 2 or more, each L is independent of each other,
  • F is a substance that can increase the in vivo half-life of X.
  • the enzyme is as described above.
  • Another aspect of the present invention provides a method for treating lysosomal storage disease (LSD), comprising: linking an alpha-galactosidase A enzyme with a non-peptidyl polymer; And (b) provides a method for producing an enzyme conjugate represented by the formula (1) comprising the step of linking the linking enzyme and the non-peptidyl polymer with a biocompatible material that can increase the half-life in vivo .
  • LSD lysosomal storage disease
  • X is an alpha-galactosidase A enzyme for the treatment of lysosomal storage disease (LSD);
  • L is a non-peptidyl polymer
  • a is 0 or a natural number, provided that when a is 2 or more, each L is independent of each other,
  • F is a substance that can increase the in vivo half-life of X.
  • Another embodiment of the present invention comprises the steps of: (a) linking an arylsulfatase B (ARSB) enzyme and a non-peptidyl polymer for the treatment of lysosomal storage disease (LSD); And (b) provides a method for producing an enzyme conjugate represented by the formula (1) comprising the step of linking the linking enzyme and the non-peptidyl polymer with a biocompatible material that can increase the half-life in vivo .
  • ARSB arylsulfatase B
  • LSD lysosomal storage disease
  • X is an arylsulfatase B (ARSB) enzyme for the treatment of lysosomal storage disease (LSD);
  • ARSB arylsulfatase B
  • L is a non-peptidyl polymer
  • a is 0 or a natural number, provided that when a is 2 or more, each L is independent of each other,
  • F is a substance that can increase the in vivo half-life of X.
  • Another aspect of the present invention provides a method for treating lysosomal storage disease (LSD), comprising: linking an iduronidase enzyme and a non-peptidyl polymer for the treatment of lysosomal storage disease (LSD); And
  • X is an iduronidase enzyme for the treatment of lysosomal storage disease (LSD);
  • L is a non-peptidyl polymer
  • a is 0 or a natural number, provided that when a is 2 or more, each L is independent of each other,
  • F is a substance that can increase the in vivo half-life of X.
  • Another embodiment of the present invention comprises the steps of (a) linking an alpha-glucosidase enzyme and a non-peptidyl polymer for the treatment of lysosomal storage disease (LSD); And
  • X is an alpha-glucosidase enzyme for the treatment of lysosomal storage disease (LSD);
  • L is a non-peptidyl polymer
  • a is 0 or a natural number, provided that when a is 2 or more, each L is independent of each other,
  • F is a substance that can increase the in vivo half-life of X.
  • Another aspect of the present invention provides a method for treating lysosomal storage disease (LSD), comprising: linking an imiglucerase enzyme and a non-peptidyl polymer for the treatment of lysosomal storage disease (LSD); And (b) provides a method for producing an enzyme conjugate represented by the formula (1) comprising the step of linking the linking enzyme and the non-peptidyl polymer with a biocompatible material that can increase the half-life in vivo .
  • LSD lysosomal storage disease
  • X is an imiglucerase enzyme for the treatment of lysosomal storage disease (LSD);
  • L is a non-peptidyl polymer
  • a is 0 or a natural number, provided that when a is 2 or more, each L is independent of each other,
  • F is a substance that can increase the in vivo half-life of X.
  • F is a polymer, fatty acid, cholesterol, albumin and fragments thereof, albumin binding material, polymer of repeating unit of specific amino acid sequence, antibody, antibody fragment, FcRn binding material, in vivo connective tissue, nucleotide, fibronectin It may be selected from the group consisting of Transferrin, saccharide, saccharide, heparin, and elastin. More specifically, the FcRn binding agent may be an immunoglobulin Fc region, but is not limited thereto.
  • the F may be bonded to each other by X and a covalent chemical bond or a non-covalent chemical bond, F and X may be bonded to each other through L through a covalent chemical bond, a non-covalent chemical bond, or a combination thereof.
  • the L may be a peptidic polymer or a non-peptidyl polymer.
  • L When L is a peptide polymer, it may include one or more amino acids, for example, may include 1 to 1000 amino acids, but is not particularly limited thereto.
  • Various known peptide linkers may be used in the present invention to link F and X in the present invention, and examples thereof include [GS] x linkers, [GGGS] x linkers, [GGGGS] x linkers, and the like, where x is It may be one or more natural numbers. However, it is not limited to the above example.
  • the non-peptidyl polymer is polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene Glycol-propylene glycol copolymers, polyoxyethylated polyols, polyvinyl alcohols, polysaccharides, dextran, polyvinylethyl ethers, biodegradable polymers, lipid polymers, chitin, hyaluronic acid and combinations thereof And, more specifically, may be polyethylene glycol, but is not limited thereto.
  • the reactor of the non-peptidyl polymer in the step (a) may be selected from the group consisting of aldehyde group, maleimide group and succinimide derivative, more specifically, the aldehyde group is propionaldehyde group or butyl Or an aldehyde group, or the succinimide derivative is succinimidyl carboxymethyl, succinimidyl valerate, succinimidyl methylbutanoate, succinimidyl methylpropionate, succinimidyl butanoate, succinimidyl propionate N-hydroxysuccinimide phosphorus or succinimidyl carbonate, but is not limited thereto.
  • non-peptidyl polymer may have an aldehyde group reactor at one end, an aldehyde group and a maleimide reactor at both ends, or an aldehyde group and succinimide reactor at both ends, This is not restrictive.
  • a specific aspect of the present invention provides a method for producing an enzyme conjugate further comprising the step of separating the conjugate to which the non-peptidyl polymer linkage is bound to the N-terminus of the enzyme.
  • the enzyme conjugate produced by the preparation method of the present invention connects the therapeutic enzyme with the Fc region, thereby allowing the enzyme conjugate to easily cross the cell membrane through intrinsic binding to the FcRn receptor, while in the blood vessel Make it more effective to reach your organization.
  • the enzyme conjugate of the present invention may be to increase the half-life of the enzyme or its derivative (analog).
  • animal cells in which an animal cell expression vector is inserted are cultured and purified.
  • Enzymes used for the preparation of the conjugates in the present invention are Agalsidase beta, Imiglucerase, Galsufase, and Laronidase.
  • the non-peptidyl polymer is bound to the immunoglobulin Fc region and purified.
  • the non-peptidyl polymer is covalently linked to the N terminus of the enzyme purified in Example 1.
  • the non-peptidyl polymer is a linear polymer having an aldehyde (aldehyde, -CHO) group on both sides, and has a polyethylene glycol (CH 2 CH 2 O) n backbone.
  • the size of the non-peptidyl polymer is determined by the number of backbones.
  • Aldehyde (aldehyde, -CHO) a reactor of the non-peptidyl polymer, is -NH2 or -NH2 at the N-terminus of the lysine group. Covalently binds.
  • aldehyde (aldehyde, -CHO) group of the non-peptidyl polymer reacts specifically with the N-terminal -NH2 under specific reaction conditions, and after the reaction, a non-peptidyl polymer enzyme specifically covalently bonded to the N-terminal is obtained through purification.
  • the immunoglobulin Fc region bound to the non-peptidyl polymer purified in Example 2 is combined with the enzyme purified in Example 1.
  • the enzyme may show a difference in activity depending on the binding position of the non-peptidyl polymer. That is, half-life or activity in the body may be improved depending on the site-specific binding of the non-peptidyl polymer and the enzyme. Accordingly, according to the structure of the enzyme of the present invention, the conjugate is prepared by specifying the position at which the non-peptidyl polymer is bound.
  • a conjugate comprising agalsidase beta was prepared as follows.
  • an agalsidase At a molar ratio of beta and ALD-PEG-ALD of 1:50, the concentration of agalsidase beta was reacted at 10 mg / mL at 4 ° C. for about 2 hours. The reaction was at 100 mM sodium phosphate pH 5.6 and 20 mM sodium cyanoborohydride was added as reducing agent. The reaction solution was purified from unreacted agalsidase and monobonded agalsidase beta using a Source 15Q (GE, USA) column using 10 mM sodium phosphate (pH 6.0) buffer and sodium chloride concentration gradient.
  • ALD-PEG-ALD aldehydehyde
  • the molar ratio of the agalsidase beta and the immunoglobulin Fc fragment bound to the purified polyethylene glycol linker is 1:10, and the total protein concentration is 10 mg / mL for 12-16 hours at 4-8.
  • the reaction solution was potassium phosphate pH 6.0, 20 mM sodium cyanoborohydride was added as a reducing agent.
  • the reaction solution was washed with a Source 15Q (GE, USA) column using 10 mM sodium phosphate (pH 6.0) buffer and a sodium chloride gradient, 20 mM Tris (pH 7.5), and 5% (v / v) glycerol.
  • the non-peptidyl polymer enzyme purified from Example 2 and the immunoglobulin Fc region of the non-reacted non-reacted aldehyde (aldehyde, -CHO) group of the non-peptide polymer and -NH 2 of the N terminal of the immunoglobulin Fc region was completed to prepare the enzyme conjugate through purification after the covalent bond reaction.
  • the finally prepared agalsidase-polyethyleneglycol linker-immunoglobulin Fc conjugate is a form in which an agalsidase monomer is linked to one chain of an immunoglobulin Fc consisting of two chains by a polyethyleneglycol linker.
  • Example 3-2 Preparation of a conjugate in which imiglucerase and immunoglobulin Fc are linked with polyethylene glycol
  • a binder comprising imiglucerase was prepared as follows.
  • Aldehyde-polyethylene glycol (Mw 10000 Da) -aldehyde (ALD-PEG-ALD) (SUNBRIGHT DE-100AL2, NOF CORPORATION, Japan)
  • ALD-PEG-ALD aldehyde-polyethylene glycol
  • concentration of imiglucerase was reacted at 1 ° C / mL at 25 ° C for about 1 hour.
  • the reaction was performed at 100 mM potassium phosphate pH 6.0, and 20 mM sodium cyanoborohydride was added as a reducing agent.
  • reaction solution was unreacted using a Source 15S (GE, USA) column using a buffer containing 20 mM sodium phosphate (pH 6.0), 2.5% (v / v) glycerol and a sodium chloride gradient. Iglucerase mono linked with serase was purified.
  • the molar ratio of imiglucerase and immunoglobulin Fc fragments bound to the purified polyethylene glycol linker is 1:50, and the total protein concentration is 40 mg / mL, and the reaction is performed for 4 to 8 at 12 to 16 hours.
  • the reaction solution was 100 mM potassium phosphate pH 6.0, and 20 mM sodium cyanoborohydride was added as a reducing agent.
  • the reaction solution was added to a Source 15S (GE, USA) column and 20 mM Tris (pH 7.5) using a 10 mM sodium citrate (pH 5.0) buffer and a sodium chloride concentration gradient.
  • the purified non-peptidyl polymer enzyme and the immunoglobulin Fc region are covalently bonded to an unreacted aldehyde (aldehyde, -CHO) group of the non-peptidyl polymer and the -NH 2 group at the N-terminus of the immunoglobulin Fc region.
  • aldehyde aldehyde, -CHO
  • the final imiglucerase-polyethyleneglycol linker-immunoglobulin Fc conjugate is a form in which the imiglucerase monomer is linked to one chain of an immunoglobulin Fc consisting of two chains by a polyethyleneglycol linker.
  • a conjugate comprising a gallsulfase was prepared as follows.
  • Aldehyde-Polyethyleneglycol-Aldehdye (10 kDa) (SUNBRIGHT DE-100AL2, NOF CORPORATION, Japan)
  • a gallsulfase and ALD-PEG-ALD At a ratio of 1:20, the concentration of gallsulfase was reacted at 25 ° C. at 1 mg / mL for about 2 hours. At this time, the reaction was performed at 12 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, pH 5.8, and 20 mM sodium cyanoborohydride was added as a reducing agent.
  • the reaction was not reacted using a Source 15Q (GE, USA) column with 20 mM Tris, pH 7.0 buffer and sodium chloride gradient and a Source ISO (GE, USA) column balanced with 1.8 M ammonium sulfite. Non-galsulfase and mono PEG galsulfase were purified.
  • the molar ratio of the galsulfase and the immunoglobulin Fc fragment combined with the purified polyethylene glycol linker was 1:20, and the total protein concentration was 50 mg / mL, and the reaction was carried out at 4 to 8 for 12 to 16 hours.
  • the reaction solution was potassium phosphate (Potassium phosphate, pH 6.0), and 20 mM sodium cyanoborohydride was added as a reducing agent.
  • reaction solution was quenched with a Source 15Q (GE, USA) column using Tris buffer and sodium chloride concentration gradient, 20 mM Tris, pH 7.0, 5% (v / v) Glycerol, Citrate (Sodium citrate, pH 3.0), 10% Glycerol buffer was applied to Protein A (GE, USA) using a concentration gradient, and finally 1.8 M ammonium sulfite (Ammonium) Equilibrium conjugates were purified using a source ISO (GE, USA) column to covalently link the immunoglobulin Fc to galsulfase by a polyethylene glycol linker.
  • Source 15Q GE, USA
  • the purified non-peptidyl polymer enzyme and the immunoglobulin Fc region are covalently bonded to an unreacted aldehyde (aldehyde, -CHO) group of the non-peptidyl polymer and the -NH 2 group at the N-terminus of the immunoglobulin Fc region.
  • aldehyde aldehyde, -CHO
  • the finally prepared gallspase-polyethyleneglycol linker-immunoglobulin Fc conjugate is a form in which a sulfolase monomer is linked to one chain of an immunoglobulin Fc consisting of two chains by a polyethyleneglycol linker.
  • a binder comprising laronidase was prepared as follows.
  • the reaction solution was obtained from a Source 15S (GE, USA) column using a gradient of potassium phosphate (pH 6.0) and sodium chloride, and a Source 15ISO (GE, using a gradient of potassium phosphate (pH 6.0) and ammonium sulfate. USA) was used to purify laronidase mono-linked with polyethylene glycol linker.
  • the molar ratio of laronidase and immunoglobulin Fc fragments bound to the purified polyethylene glycol linker was 1:10, and the total protein concentration was 20 mg / mL, and the reaction was carried out at 4 to 8 for about 14 hours.
  • the reaction solution was 100 mM potassium phosphate (Ptassium phosphate) pH 6.0, 10 mM sodium cyanoborohydride was added as a reducing agent.
  • reaction solution was applied to a Source 15S (GE, USA) column using potassium phosphate (pH 6.0) buffer and sodium chloride concentration gradient, and finally 20 mM Tris (pH 7.5), 5% (v / v) Protein A (GE, USA) using a concentration gradient of glycerol and 100 mM citric acid monohydrate (pH 3.7), 10% glycerol and 100 mM citrate (pH 4.0), 10% glycerol buffer was applied to purify conjugates in which immunoglobulin Fc was covalently linked to the polyethylene glycol linker by laronidase.
  • the purified non-peptidyl polymer enzyme and the immunoglobulin Fc region are covalently bonded to an unreacted aldehyde (aldehyde, -CHO) group of the non-peptidyl polymer and the -NH 2 group at the N-terminus of the immunoglobulin Fc region.
  • aldehyde aldehyde, -CHO
  • the finally produced laronidase-polyethyleneglycol linker-immunoglobulin Fc conjugate is a form in which a laronidase monomer is linked to one chain of an immunoglobulin Fc consisting of two chains by a polyethyleneglycol linker.
  • the present inventors attempted to confirm the effect of the conjugate by examining the pharmacokinetics of the enzyme conjugate prepared in the above example.
  • Example 4-1 PK Identification of Imiglucerase Persistent Binders
  • the inventors confirmed the PK activity of the imiglucerase persistent binder prepared in the above example.
  • control group and the test group were injected intravenously at 1.5 mg / kg each based on imiglucerase, and then the intravenous injection group was bled 0, 2, 5, 10, 20, and 60 minutes after the injection.
  • the amount of protein in the serum was measured by ELISA method using an antibody against imiglucerase.
  • the imiglucerase-continuous conjugate increased both blood half-life and AUC (area under curve), and in particular, blood half-life increased more than four-fold.
  • the AUC indicates the degree of exposure in the body to the drug molecule.
  • the blood stability and pharmacokinetic coefficients of the agalsidase beta (control) and the agalsidase beta sustained conjugate prepared above were compared in one or three ICR mice at each time point of blood collection. .
  • control group and the test group were injected intravenously and subcutaneously at 1.0 mg / kg each on the basis of agalsidase.
  • Control intravenous and subcutaneous injection groups were bled 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 3, 4, 8, 24 and 48 hours after injection.
  • Intravenous injection group was taken at 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 hours after injection.
  • Subcutaneous injection group was 0, 1 after injection. Blood was collected after 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144 and 168 hours.
  • the amount of protein in serum was measured by ELISA method using an antibody against agalsidase.
  • C max is the highest drug concentration
  • AUC area under curve
  • BA bioavailability
  • the inventors intended to confirm the in vitro activity of each enzyme conjugate prepared as follows.
  • 4-Nitrophenyl-aD-galactopyranoside which is known as an enzyme substrate, is reacted with an agalsidase beta and an agalsidase beta sustained conjugate at 37 ° C. for 20 minutes, and then the absorbance of 4-Nitrophenol is finally measured. Enzyme activity on the material was measured.
  • betas are mannose-6-phosphate receptor (M6PR, mannose-6-phosphate receptor) , because the action after absorption in the cell, and the affect Agar let the first long-acting beta conjugate produced in cells resorbing activity, and then through It was confirmed as well.
  • M6PR mannose-6-phosphate receptor
  • agalsidase beta and the agalsidase beta-type conjugate were identified by enzyme activity assay.
  • This M6PR binding and reduced intracellular uptake activity ( vs. agalsidase beta) can be compensated for by improved PK due to the conjugation of the sustained conjugate preparation due to the steric hindrance effect of the sustained conjugate (FIG. 3). ).
  • M6PR mannose phosphate 6 receptor
  • M6PR was immobilized by amine coupling to the CM5 chip.
  • the agalsidase was then diluted to 200 nM-12.5 nM with HBS-EP buffer and bound to the M6PR immobilized chip for 10 minutes, and the binding force was calculated by BIAevaluation software for 6 minutes.
  • the relative binding capacity of the agalsidase beta sustained conjugate was quantified compared to the agalsidase.
  • the agalsidase beta long-acting conjugate compared to the agalsidase beta was confirmed that the receptor binding capacity of about 68% (Table 1).
  • the relatively low binding force of the agalsidase beta-continuous conjugate to M6PR seems to be due to the fact that the physiologically active polypeptide forms a fusion protein with the Fc region and typically exhibits a tendency to decrease its binding to its own receptor.
  • the immunoglobulin Fc and the agalsidase beta are covalently bound, so that the agalsidase site is a steric hindrance ( This may be due to a decrease in the association rate constant (k a ) for the receptor in response to steric hindrance.
  • association rate constant (k a ) for the receptor in response to steric hindrance.
  • dissociation rate constant (k d ) at the receptor it was confirmed that there is no difference with free agalidase that did not form a conjugate.
  • Example 6-1 In vitro Enzyme Activity of Imiglucerase Sustained Conjugates
  • p -Nitrophenyl ⁇ -D-glucopyranoside was used as a substrate for measuring enzyme activity, and the amount of product produced per unit time was calculated by quantifying pNP ( p -Nitrophenol) produced according to the enzymatic action. (Specific activity) is shown. Control and test groups were treated at concentrations of 0.1 ⁇ g / mL on an imiglucerase basis. Substrates were treated with 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1 and 0 mM and reacted at 37 ° C. for 45 minutes. The amount of pNP finally produced was quantified by measuring the absorbance at 405 nm.
  • the binding force between imiglucerase (control) and the above-mentioned imimglucerase sustained conjugate (test group) was confirmed using SPR (surface plasma resonance) (BIACORE T200). It was. M6PR was purchased from Rnd systems, and immobilized on the CM5 chip using the amine binding method, the control group was flowed at a concentration between 100 nM and 6.24 nM, and the test group was flowed at a concentration between 200 nM and 12.5 nM to confirm the binding force.
  • Hepes buffer (HBS-EP) of pH 7.5 was used as the running buffer, and all test materials were diluted with the base buffer to induce defects and dissociation also proceeded to the base buffer.
  • the test material was infused for 10 minutes in M6PR immobilized on the chip to induce binding, and then dissociated for 6 minutes.
  • the dissociation constant was not significantly different depending on the immunoglobulin Fc binding, but the binding constant was confirmed to be different.
  • the binding force of the test group was reduced to about 22% compared to the control group (Table 3).
  • the relatively low binding strength of the imiglucerase sustained conjugate to M6PR seems to be due to the fact that the physiologically active polypeptide forms a fusion protein with the Fc region and typically exhibits a tendency to decrease its binding ability to its own receptor. It is not intended to be bound by any particular theory of the working principle of the present invention, but to explain the present invention only for the purpose of understanding, the immunoglobulin Fc and the imiglucerase are covalently linked to the exeglucerase site.
  • Example 7-1 In vitro Enzyme Activity of Brown Sulfurase Long-acting Binders
  • control group control group
  • test group gallsulfase long-acting conjugates
  • 4-Methylumbelliferyl sulfate (4-MUS) was used as a substrate for measuring enzyme activity, and glycolysis was measured by measuring fluorescence of 4-Methylumbelliferone (4-MU) produced by enzymatic reaction at 37 ° C. for 20 minutes. Enzyme activity for was measured.
  • the enzyme activity of the gallspase and the gallspase long-acting conjugates was 72.3 and 81.3 ⁇ mole / min / mg, respectively.
  • the enzyme activity of the gallspase long-acting conjugate was 112%, and it was confirmed that there was no decrease in the enzyme activity according to immunoglobulin Fc binding (FIG. 5).
  • M6PR was purchased from Rnd systems, and immobilized on the CM5 chip using an amine binding method, and then the test material was flowed at a concentration between 100 nM and 6.24 nM to confirm its binding force.
  • Hepes buffer (HBS-EP) of pH 7.5 was used as the running buffer, and all test materials were diluted with the base buffer to induce defects and dissociation also proceeded to the base buffer.
  • the test material was infused for 10 minutes in M6PR immobilized on the chip to induce binding, and then dissociated for 6 minutes. Thereafter, 5 mM NaoH / 50 mM NaCl was flowed for about 30 seconds to the conjugate bound to M6PR in order to bind different concentrations of the control group or the test group.
  • the binding force between M6PR and gallspase or gallspase long-acting conjugates was analyzed using the BIAevaluation program.
  • Association rate constant (K a ), dissociation rate constant (K d ) and affinity constant (K D ) were calculated using a 1: 1 Langmuir binding model.
  • the dissociation constant was not significantly different depending on the immunoglobulin Fc binding, but the binding constant was confirmed to be different.
  • the binding force of the test group was reduced to about 25% compared to the control group (Table 5).
  • the relatively low binding capacity of the gallspase long-acting conjugates to M6PR seems to be due to the fact that the bioactive polypeptides tend to form a fusion protein with the Fc region and typically have a lower tendency for binding to their own receptors.
  • the gallbladder site becomes steric hindrance as the covalent bond between immunoglobulin Fc and gallsulfase. It appears to be due to a decrease in the association rate constant (k a ) for the receptor. Of the long-lived conjugate In the case of dissociation rate constant (k d ) at the receptor was confirmed that there is no difference with free gallsulfase did not form a conjugate (Table 5).
  • Example 8-1 In vitro Enzyme Activity of Iduronidase Sustained Conjugates
  • 4-methylumbelliferyl alpha-L-iduronide 4-MUI
  • Iduronidase 4-MUI
  • Iduronidase sustained conjugate 37 ° C. for 30 minutes.
  • Enzyme activity of the corresponding substance was measured by measuring the fluorescence of the finally produced 4-Methylumbelliferone (4MU).
  • the binding force between the iduronidase (control group) and the iduronidase long-acting conjugate (test group) prepared above was confirmed by using SPR (surface plasma resonance, BIACORE T200). .
  • M6PR was purchased from Rnd systems, and immobilized on the CM5 chip using the amine binding method, the control group was flowed at a concentration between 50nM and 3.125nM, and the test group was flowed at a concentration between 100nM and 6.25nM. Confirmed.
  • Hepes buffer (HBS-EP) of pH 7.5 was used as the running buffer, and all test materials were diluted with the base buffer to induce defects and dissociation also proceeded to the base buffer.
  • the test material was infused for 10 minutes in M6PR immobilized on the chip to induce binding, and then dissociated for 6 minutes. Thereafter, 5 mM NaoH / 50 mM NaCl was flowed for about 30 seconds to the conjugate bound to M6PR in order to bind different concentrations of the control group or the test group.
  • the binding force between M6PR and the iduronidase or iduronidase sustained conjugate was analyzed using the BIAevaluation program.
  • Association rate constant (K a ), dissociation rate constant (K d ) and affinity constant (K D ) were calculated using a 1: 1 Langmuir binding model.
  • the relatively low binding force of the iduronidase continuous conjugate to M6PR seems to be due to the fact that the physiologically active polypeptide forms a fusion protein with the Fc region and typically exhibits a tendency to be inferior to its own receptor. It is not intended to be bound by any particular theory of the working principle of the present invention, but to explain the present invention only for the purpose of understanding, the immunoglobulin Fc and the iduronidase are covalently bonded to the iduronidase site. receives steric hindrance) is shown to be due to reduced hayeotgi the association rate constant for the receptor (association rate constant, k a) . (Table 7).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 치료학적 효소류에 결합한 결합체에 관한것이다. 비펩타이드성 중합체 연결부가 면역글로불린 Fc와 특이적으로 연결된 결합체, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

치료학적 효소류의 결합체
본 발명은 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 치료학적 효소류에 결합한 치료학적 효소류 결합체, 상기 결합체의 제조 방법, 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
치료학적 효소류와 같은 단백질은 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 치료학적 효소류의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 치료학적 효소류의 지속성 제제는 치료학적 효소류의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
특히 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD)은 특정 효소의 유전적 결함으로 인해 생기는 병으로 사망에 까지 이르는 치명적인 병이며, 결함이 있는 효소의 보충치료가 필수적이다 (Frances M. Platt et al., J Cell Biol. 2012 Nov 26;199(5):723-34). 효소 보충 치료는 리소좀 축적 질환에서 표준이 되는 치료로 부족한 효소를 보충하는 것을 통해 기존의 증상이 완화되거나 질환의 진행을 늦추는 효과를 볼 수 있다. 그러나 지속적으로 1-2주마다 2-6시간 동안 약물을 정맥으로 투여해야 된다는 점에서 환자 및 가족의 일상 생활이 제한 받을 수 있다. 리소좀 축적 질환의 치료에 사용되는 재조합 효소의 사람에서의 반감기는 짧게는 10분에서 3시간 미만으로 그 지속시간이 매우 짧아 평생 효소를 투여해야 하는 환자의 불편함을 야기 하고 있어 그 반감기의 연장이 매우 필요하다.
또한, 리소좀 축적 질환 치료에 사용되는 효소의 생체 내 축적 위치가 상이한 문제점, 및 치료 효소가 골수에 도달하지 않는 등의 문제점이 있어, 리소좀 축적 질환 치료제의 개발 필요성은 더욱 더 커지고 있는 상황이다.
본 발명의 하나의 목적은 치료학적 효소와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 통하여 연결된, 효소 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 지속형 치료학적 효소 결합체에 관한 것으로, 구체적으로 치료학적 효소, 비펩타이드성 중합체 연결부 및 면역글로불린 Fc가 상호 공유결합에 의해 연결되어 있어 상기 효소의 생체 내 지속성이 향상될 뿐만 아니라, 세포외배출(transcytosis), 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성이 향상된 효소 결합체에 관한 것이다. 본 발명에 의하여 제조된 효소 결합체는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD)의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 아갈시다제 베타 지속형 결합체의 PK 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 아갈시다제 베타 지속형 결합체의 in vitro 효소 활성을 나타낸 도이다.
도 3은 아갈시다제 베타 지속형 결합체의 in vitro 세포내 흡수 활성을 나타낸 도이다.
도 4는 이미글루세라제 지속형 결합체의 in vitro 효소 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 갈설파제 지속형 결합체의 in vitro 효소 활성을 나타낸 도이다.
도 6은 이두로니다제 지속형 결합체의 in vitro 효소 활성을 나타낸 도이다.
본 발명의 하나의 양태는 리소좀 축적병 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 치료학적 효소와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된 효소 결합체를 제공한다.
하나의 구체적인 양태로서, 상기 효소는 베타-글루코시다제(beta-glucosidase) , 베타-갈락토시다제 (beta-galactosidase), 갈락토스-6-설파타제(Galactose-6-sulfatase), 산성 세라미다제(acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제(acid sphingomyelinase), 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidsase), 아릴설파타제 A(arylsulfatase A), 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) A, 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) B, 헤파린-N-설파타제(heparin N-sulfatase), 알파-D-만노시다제(alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제(lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제(alpha-N-acetyl-glucosaminidase, NAGLU), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 리파아제(lipase), 우리카제(Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제(Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase), 아세틸-CoA-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라제 (Acetyl-CoA-glucosaminide N-acetyltransferse), N-아세틸글루코사민-6-설파타제 (N-acetylglucosamine-6-sulfatase), 갈락토사민 6-설파타제 (galactosamine 6-sulfatase, GALN), 히알루로니다제 (hyaluronidase), 알파-푸코시다제 (α-fucosidase), 베타-만노시다제 (β-mannosidase), 알파-뉴라미니다제 (α-neuraminidase, sialidase), N-아세틸-글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제 (N-acetyl-glucosamine-1-phosphotransferase), 뮤코리핀-1 (mucolipin-1), 알파-N-아세틸-갈락토사미니다제 (α-N-acetyl-galactosaminidase), N-아스파르틸-베타-글루코사미니다제 (N-aspartyl-β-glucosaminidase), LAMP-2, 시스티노신 (Cystinosin), 시알린 (Sialin), 세라미다제 (ceramidase), 산성-베타-글루코시다제 (acid-β-glucosidase), 갈락토실세라미다제 (galactosylceramidase), NPC1, 카텝신 A (cathepsin A, protective protein), SUMF-1, 리소좀 산성 리파제 (lysosomal acid lipase, LIPA), 및 트리펩티딜 펩티다제 1 (Tripeptidyl peptidase) 1로 이루어진 군에서 선택되는 것인 효소 결합체를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase) A와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된 효소 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 아릴설파타제 B(arylsulfatase B, ARSB)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된 효소 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이두로니다제(iduronidase)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된 효소 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된 효소 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이미글루세라제(imiglucerase)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된 효소 결합체를 제공한다.
하나의 구체적인 양태로서, 상기 리소좀 축적 질환은 뮤코다당체침작증 (mucopolysaccharidosis, MPS), 글리코겐 축적병(Glycogen storage disease), 및 스핑고지질증 (sphingolipidosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 효소 결합체를 제공한다.
다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 뮤코다당체침작증은 MPS(mucopolysaccharidosis) Ⅰ, 및 MPS(mucopolysaccharidosis) Ⅵ으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 글리코겐 축적병은 폼페병 (Pompe disease)인 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 스핑고지질증은 파브리병(Fabry disease), 및 고셰병(Gaucher's disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 효소 결합체는 면역글로불린 Fc 영역이 결합하지 않은 효소 보다 세포외배출 (transcytosis), 및 생체 이용율 (bioavailability, BA)이 증가된 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 세포외배출은 면역글로불린 Fc 영역과 FcRn (neonatal Fc receptor)와의 결합에 의한 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 효소 결합체는 면역글로불린 Fc 영역이 결합하지 않은 효소 보다 조직 분포성 (tissue distribution)이 증가된 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 효소 결합체는 면역글로불린 Fc 영역이 결합하지 않은 효소 보다 골수 표적성이 증가된 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지영역을 추가로 포함하는 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 면역글로불린 Fc 단편인 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 단편인 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 단편인 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 효소 결합체는 효소 또는 이의 유도체의 N-말단에 비펩타이드성 중합체 연결부가 결합된 것인 효소 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 리소좀 치료를 위한 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 리소좀 치료를 위한 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 리소좀 치료를 위한 아릴설파타제 B (arylsulfatase B, ARSB) 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 리소좀 치료를 위한 이두로니다제 (iduronidase) 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 리소좀 치료를 위한 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase) 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 리소좀 치료를 위한 이미글루세라제(imiglucerase) 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
하나의 구체적인 양태로서, 상기 약학적 조성물은 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성을 증가시키는 것인 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 치료학적 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및 (b) 상기 효소와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
하나의 구체적인 양태로서, 상기 효소는 베타-글루코시다제(beta-glucosidase) , 베타-갈락토시다제 (beta-galactosidase), 갈락토스-6-설파타제(Galactose-6-sulfatase), 산성 세라미다제(acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제(acid sphingomyelinase), 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidsase), 아릴설파타제 A(arylsulfatase A), 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) A, 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) B, 헤파린-N-설파타제(heparin N-sulfatase), 알파-D-만노시다제(alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제(lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제(alpha-N-acetyl-glucosaminidase, NAGLU), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 리파아제(lipase), 우리카제(Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제(Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase), 아세틸-CoA-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라제 (Acetyl-CoA-glucosaminide N-acetyltransferse), N-아세틸글루코사민-6-설파타제 (N-acetylglucosamine-6-sulfatase), 갈락토사민 6-설파타제 (galactosamine 6-sulfatase, GALN), 히알루로니다제 (hyaluronidase), 알파-푸코시다제 (α-fucosidase), 베타-만노시다제 (β-mannosidase), 알파-뉴라미니다제 (α-neuraminidase, sialidase), N-아세틸-글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제 (N-acetyl-glucosamine-1-phosphotransferase), 뮤코리핀-1 (mucolipin-1), 알파-N-아세틸-갈락토사미니다제 (α-N-acetyl-galactosaminidase), N-아스파르틸-베타-글루코사미니다제 (N-aspartyl-β-glucosaminidase), LAMP-2, 시스티노신 (Cystinosin), 시알린 (Sialin), 세라미다제 (ceramidase), 산성-베타-글루코시다제 (acid-β-glucosidase), 갈락토실세라미다제 (galactosylceramidase), NPC1 (Cholesterol trafficking), 카텝신 A (cathepsin A, protective protein), SUMF-1, 리소좀 산성 리파제 (lysosomal acid lipase, LIPA), 및 트리펩티딜 펩티다제 1(Tripeptidyl peptidase 1)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및 (b) 상기 알파-갈락토시다제 A와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 아릴설파타제 B(arylsulfatase B, ARSB) 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및 (b) 상기 아릴설파타제 B와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이두로니다제(iduronidase) 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및 (b) 상기 이두로니다제와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase) 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및 (b) 상기 알파-글루코시다제와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이미글루세라제(imiglucerase) 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및 (b) 상기 이미글루세라제와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
하나의 구체적인 양태로서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜인 것인, 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 (a) 단계의 비펩타이드성 중합체의 반응기는 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석신이미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 알데히드 그룹은 프로피온 알데히드 그룹 또는 부틸 알데히드 그룹인 것인 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 석신이미드 유도체는 석신이미딜 카르복시메틸, 석신이미딜 발레르에이트, 석신이미딜 메틸부타노에이트, 석신이미딜 메틸프로피온에이트, 석신이미딜 부타노에이트, 석신이미딜 프로피온에이트, N-하이드록시석신이미드인 또는 석신이미딜 카보네이트인 것인, 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 비펩타이드성 중합체는 말단에 알데히드 그룹 반응기를 갖는 것인, 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데히드 그룹 및 말레이미드 반응기를 갖는 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데히드 그룹 및 석시니미드 반응기를 갖는 것인 효소 결합체를 제공한다.
또 다른 하나의 구체적인 양태로서, 상기 효소의 N-말단에 비펩타이드성 중합체 연결부가 결합된 결합체를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 치료학적 효소 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된, 효소 결합체를 제공한다.
구체적으로, 상기 효소 결합체는 상기 비펩타이드성 중합체 연결부가 면역글로불린 Fc 영역 및 상기 효소에 결합하고 있는 효소 결합체일 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서는, 상기 효소 결합체가 비펩타이드성 중합체를 유리 Fc 영역과 유리 효소에 반응시켜 얻은 것으로서, 이 때 상기 비펩타이드성 중합체는 상기 비펩타이드성 중합체 연결부와 반복 단위들의 종류와 수, 위치 면에서 동일한 물질이다. 상기 유리 Fc 영역 및 유리 효소 반응에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 이 반복 단위들의 양 끝에 상기 반복 단위와 화학적 구조를 달리하는 말단 반응기를 지니고 있는 물질일 수 있다. 이러한 효소 결합체의 제조 과정에서는 이 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기를 통해 유리 효소 및 유리 면역글로불린 Fc 영역과 각각 화학 반응을 일으키고 이 화학 반응으로 말단 반응기가 전환되면서 생기는 공유결합으로 비펩타이드성 중합체의 반복 단위들이 효소와 Fc 영역에 연결되어 있는 효소 결합체를 얻는다. 즉 본 발명의 상기 구체예에서는 비펩타이드성 중합체가 제조 과정을 거쳐 효소 결합체내 비펩타이드성 중합체 연결부로 전환된다.
본 발명의 효소 결합체에 포함될 수 있는 효소는 특별히 제한되지 않으며, 비결합체 형태의 효소보다 본 발명의 효소 결합체로 제조함으로써, 생체내 지속 시간을 늘려 이점을 얻을 수 있는 효소이면 본 발명의 효소 결합체에 포함될 수 있다. 본 발명의 한 실시 형태에서 이 효소 결합체는 치료학적 효소의 결합체이다.
구체적으로, 상기 효소는 베타-글루코시다제(beta-glucosidase) , 베타-갈락토시다제 (beta-galactosidase), 갈락토스-6-설파타제(Galactose-6-sulfatase), 산성 세라미다제(acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제(acid sphingomyelinase), 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidsase), 아릴설파타제 A(arylsulfatase A), 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) A, 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) B, 헤파린-N-설파타제(heparin N-sulfatase), 알파-D-만노시다제(alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제(lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제(alpha-N-acetyl-glucosaminidase, NAGLU), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 리파아제(lipase), 우리카제(Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제(Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase), 아세틸-CoA-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라제 (Acetyl-CoA-glucosaminide N-acetyltransferse), N-아세틸글루코사민-6-설파타제 (N-acetylglucosamine-6-sulfatase), 갈락토사민 6-설파타제 (galactosamine 6-sulfatase, GALN), 히알루로니다제 (hyaluronidase), 알파-푸코시다제 (α-fucosidase), 베타-만노시다제 (β-mannosidase), 알파-뉴라미니다제 (α-neuraminidase, sialidase), N-아세틸-글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제 (N-acetyl-glucosamine-1-phosphotransferase), 뮤코리핀-1 (mucolipin-1), 알파-N-아세틸-갈락토사미니다제 (α-N-acetyl-galactosaminidase), N-아스파르틸-베타-글루코사미니다제 (N-aspartyl-β-glucosaminidase), LAMP-2, 시스티노신 (Cystinosin), 시알린 (Sialin), 세라미다제 (ceramidase), 산성-베타-글루코시다제 (acid-β-glucosidase), 갈락토실세라미다제 (galactosylceramidase), NPC1, 카텝신 A (cathepsin A, protective protein), SUMF-1, 리소좀 산성 리파제 (lysosomal acid lipase, LIPA), 및 트리펩티딜 펩티다제 1 (Tripeptidyl peptidase 1)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 효소 결합체일 수 있으나, 리소좀 축적 질환을 치료할 수 있는 효소라면, 효소의 유래나 종류의 제한 없이 본 발명에 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase) A와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된, 효소 결합체를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 아릴설파타제 B (arylsulfatase B, ARSB)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된, 효소 결합체를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이두로니다제 (iduronidase)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된, 효소 결합체를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된, 효소 결합체를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이미글루세라제(imiglucerase)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된, 효소 결합체를 제공한다.
본 발명의 용어, “치료학적 효소” 또는 “효소”는, 효소의 부족, 결핍, 기능 이상 등에 의해 발병되는 질병을 치료하기 위한 효소로서, 효소 대체 요법 (enzyme replacement therapy), 투여 등을 통해 상기 질병을 가진 개체를 치료할 수 있는 효소를 의미한다. 구체적으로, 리소좀 효소의 부족 또는 결핍 등으로 인해 발병하는 리소좀 축적 질환의 치료를 위한 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, “리소좀 (lysosome)은 세포질에 존재하는 소기관 중 하나로서, 가수 분해 효소를 많이 포함하고 있어서, 체내에서 거대 분자, 세균 등의 이물질을 분해하여, 상기 분해된 산물이 세포의 다른 부분에서 재활용되도록 돕는 소기관이다. 상기 리소좀의 기능은 다수의 효소에 의해 수행되는데, 변이나 부족 등으로 인하여 특정 효소가 기능을 상실하게 되면, 리소좀의 분해 기능이 상실되는 결과를 낳게 되어, 결국 분해되어야 할 거대 분자 등이 세포 내에 축적되어 세포의 손상 등을 유발하며, 이로 인하여 질병이 발병하게 된다.
본 발명의 용어, “리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD)”은, 상기와 같은 리소좀 기능의 상실로 인한 희귀 유전병을 의미하며, 결함이 있는 효소를 이용한 효소 대체 요법 (enzymatic replacement therapy)가 필수적이다. 본 발명에서 “리소좀 축적병”과 혼용되어 사용된다. 상기 리소좀 축적 질환은 결핍된 효소를 기준으로 분류하게 되는데, (i) 스핑고지질증 (sphingolipidosis), (ii) 뮤코다당체침작증 (mucopolysaccharidosis), (iii) 글리코겐 축적병 (glycogen storage disease), (iv) 뮤코리피드증 (mucolipidosis), (v) 올리고침작증 (oligosaccharidosis), (vi) 지방증 (lipidosis), 및 (vii) 리소좀 수송 질환 (lysosomal transport disease) 등으로 분류될 수 있다.
하기에서는 리소좀 축적 질환을 그 분류에 따라 상세히 설명한다.
본 발명의 용어, “스핑고지질증”은, 스핑고지질의 당곁사슬 혹은 콜린곁사슬을 가수분해하는 리소솜효소의 유전성 결핍증이다. 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidsase)의 결핍에 의한 크라베(Krabbe)병, 알파-갈락토시다제 A (alpha-galactosidase A) 결핍에 의한 파브리병 (Fabry disease), 스핑고미엘린나제 (Sphingomyelinase) 결핍에 의한 니만-픽(Niemann-pick)병, 글루코세레브로시다제 (Glucocerebrosidase) 결핍에 의한 고셰 (Gaucher's disease)병, 헥소사미니다제 (Hexosaminidase A) 결핍에 의한 테이-삭병 (Tay-Sachs disease), 파아버(Farber)병 등 각각의 축적지질 분포에 따른 질병을 포함한다. X 염색체 유전병인 파브리병을 제외하고는 상염색체 열성 유전병에 해당한다.
본 발명의 용어, “파브리병(Fabry disease, (Fabry's disease))”은 리소좀에 있는 가수분해 효소 (알파-갈락토시다제 A)의 활성 부족으로 인한 당지질의 선천성대사이상을 나타내는 질병으로서, X염색체 열성으로 유전되는 유전병이다. 유아기에는 무증상이지만 아동기 이후에는 사지동통, 피부발진 등이 나타나며, 사춘기 이후 심혈관병변, 신장장애가 나타난다. 치료 방법으로는 효소 대체 요법이나 유전자 치료 등이 연구되고 있다.
본 발명의 용어, “고셰병 (Gaucher's disease)”은 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase) 효소가 유전자 이상으로 결핍되어 생기는 선천성 지질대사이상증으로서, 상염색체성(1번 염색체) 열성 유전성 질환이다. 낡은 세포들이 간과 비장, 골수에 축적되어 문제를 일으키게 된다. 심하면 폐나 눈·신장·심장 및 신경계까지 전이되어 심각한 합병증을 일으키기도 하는 것으로 알려져 있다. 치료 방법으로는 효소 대체 요법이나 유전자 치료 등이 연구되고 있다.
본 발명의 용어, “뮤코다당체침작증 (mucopolysaccharidosis, MPS)”은 점액성 다당의 유전성분해효소결핍증으로서, 당사슬분해효소, 설파타아제나 아세틸기 전이 효소의 결핍 등이 원인으로 알려져 있다. 지방연골이영양증 (gargoylis) 이라고도 한다. 주증상은 요(尿)에 점액성 다당이 과잉 배설되는 것이다. 현재는 6가지 병형으로 분류하는데, Ⅰ형은 후를러 증후군(Hurler syndrome), 샤이증후군(Scheie syndrome)이고, Ⅱ형은 헌터 증후군(Hunter syndrome), Ⅲ형은 산필립포증후근(Sanfilippo syndrome) A, B, C, D형이고, Ⅳ형은 모르키오증후군(Morquio syndrome) A, B형, Ⅵ형은 마로트-라미증후군(Maroteaux-Lamy syndrome), Ⅶ형은 슬라이증후군(Sly syndrome)이다.
본 발명의 용어, “후를러 증후군(Hurler syndrome)”은 뮤코다당 분해 효소 (α-L-iduronidase) 결핍으로 발생하는 MPS(mucopolysaccharidosis) Ⅰ형 질병으로서, 상염색체 열성 유전병이며, 희귀 유전성 질환이다. 헌터증후군과 비슷한 증상을 보이나 증상이 더 심각하게 나타나 대부분 10세 이전에 사망한다. 지능 장애, 난청, 간장ㆍ비장 비대, 낮은 코ㆍ두꺼운 입술ㆍ큰 혀 등의 외형적 특징, 심한 골격 기형 등과 같은 헌터증후군과 같은 증상에 각막혼탁 증상을 수반한다.
본 발명의 용어, “마로트-라미증후군(Maroteaux-Lamy syndrome)”은 MPS(mucopolysaccharidosis) Ⅵ형 질병으로서, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)의 분해에 필요한 아릴설파타제 B(Arylsulfatase B, N-acetylgalactosamine -4-sulfatase)의 부족으로 발생하는 상염색체 열성 유전병이다. 뼈, 심장판막, 비장, 간, 및 각막 등에 상기 효소의 부족으로 분해되지 못한 dermatan sulfate가 침착되어 나타나는 질병이다.
본 발명의 용어, “글리코겐 축적병 (당원병, glycogen storage disease)”은 글리코겐이 축적되는 탄수화물의 선천성 대사이상 질환으로서, I-VII형이 있는 것으로 알려져 있다. 리소좀 축적 질환과 관계 있는 글리코겐 축적병은 제Ⅱ형 (폼페병, Pompe disease), 및 Ⅲb형 (다논병, Danon disease)이다.
글리코겐 축적병 제Ⅱ형은 산성 말타제 결핍증 (acid maltase deficiency), 또는 폼페병 (Pompe disease, Pompe's disease) 이라고도 하며, 리소좀 효소 중 하나인 α-글루코시다제 (α-1,4-glucosidase, acid alpha-glucosidase) 의 결핍에 의해 생기는 질환으로, 간 ·신장의 비대, 근력저하(筋力低下) ·설비대(舌肥大) ·심장비대(心臟肥大) ·호흡곤란 등을 일으켜 수개월 내로 사망하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어, “리소좀 축적병 질환 치료를 위한 치료학적 효소 결합체(conjugate)”, 또는 “효소 결합체”는 상기 리소좀 축적 질환의 치료 효과를 가지는 효소가 비펩타이드성 중합체 연결부를 통해 면역글로불린 Fc 영역에 연결된 것으로, 상기 효소에 의한 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 효소 결합체는 치료학적 효소의 반감기를 증가시킬 수 있는 물질을 상기 효소와 연결하여, 지속성이 증가되는 효과를 가질 수 있다. 이에, 본 발명의 “효소 결합체”는 “지속형 결합체”와 혼용될 수 있다.
또한, 본 발명의 효소 결합체는 효소 대체 요법 (enzymatic replacement therapy, ERT)의 약물로서 사용될 수 있다. 상기 효소 대체 요법은 질환의 원인이 되는 결핍 또는 부족 효소를 보충함으로써, 저하된 효소 기능의 회복을 통해 질병을 예방 또는 치료할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 Fc 영역과 연결된 효소 결합체는 상기 Fc 영역이 FcRn과 결합하여, 세포외배출(transcytosis)이 Fc 영역이 연결되지 않은 효소에 비하여 증가되는 효과를 가진다.
FcRn을 매개로 하는 증가된 세포외배출은 효소가 Fc 영역과 연결되어 큰 분자를 형성함에도 불구하고, 세포 내 흡수율을 유지하게 도와줄 뿐만 아니라, 치료 효소가 효소 활성을 오래 유지하면서 체내에 흡수되어 효소 자체의 기능을 수행할 수 있게 함으로써, 리소좀 축적 질환의 치료를 가능케 한다.
한편, 치료학적 효소류 특히 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD)에 사용되는 ERT 효소류들은 생체내 이용율 (BA, bioavailability)이 낮아 정맥주사 (iv, intravenous)로 투여 해야 하는 단점이 있으며, 이러한 정맥주사는 매번 환자가 병원을 방문해야 하는 불편함을 야기한다. 또한, 이러한 정맥주사는 알레르기 타입의 과민성 반응을 유발하여 많은 빈도수로 약물 주입 관련 부작용 (infusion reaction)을 초래한다.
본 발명의 효소 결합체는 FcRn 결합 부위에 의한 세포외배출(transcytosis)로 인하여 생체내 이용율을 높여 정맥주사가 아닌 피하주사를 가능케 하고, 이러한 투여 방법의 변화는 자가주사를 가능케 하여 환자의 편의성을 높이며, infusion reaction을 감소시켜 부작용을 최소화 할 수 있다.
또한, 치료학적 효소류 특히 리소좀 축적 질환에 사용되는 효소 대체 요법(ERT)을 위한 효소들은 특정 조직에 쌓인 노폐물을 제거해야 하므로, 각 조직으로의 고른 분포가 매우 중요하다. 그러나 현재 사용되고 있는 ERT 효소류들은 주로 간으로 많은 분포를 나타내고 있어, 다양한 장기로의 분포를 나타낼 수 있는 약물의 개발이 필수적이다.
본 발명의 효소 결합체는 증가된 혈중 반감기와 FcRn 결합 부위에 의한 세포외배출(transcytosis)로 인하여 간 외의 다양한 조직, 특히 골수, 비장, 신장 등에서도 생체내 농도가 높은 우수한 분포를 지니므로, 치료학적 효율을 극대화시킬 수 있다. 특히, 본 발명의 효소 결합체는 높은 골수 표적성을 나타낸다. 골수 조직은 골 내부에 존재하는 유연한 구조의 조직으로, 골수 조직으로의 표적성을 증대시킴으로써, 효소 대체 요법에 의한 골수에서의 약리 작용을 통해 추가 효과를 기대할 수 있어, 리소좀 축적 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.
특히, 상기 리소좀 축적 질환은 다양한 장기에서 발생하며 특히 골수에서의 질환은 뼈의 이상증상 혹은 뼈의 생성 억제, 골수에서 필수적으로 만들어져야되는 적혈구 생성 호르몬과 혈소판 생성 호르몬의 생성 억제를 통해 빈혈등 다양한 부작용을 야기하나 현재 상용화된 효소 치료제는 골수의 분포가 매우 낮아 상기와 같은 부작용이 빈번히 발생한다. 이러한 측면에서, 본 발명의 효소 결합체는 높은 골수 표적성을 가짐으로써, 우수한 효소 대체 요법의 치료제가 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 효소 결합체는 면역글로불린 Fc 영역과 FcRn과의 결합에 의해, 면역글로불린 Fc 영역이 결합하지 않은 효소 보다 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성이 증가한 것일 수 있다.
본 발명의 효소 결합체에 포함되는 치료학적 효소는 리소좀 축적 질환에 대한 치료 효과를 가질 수 있는 것이면 제한 없이 포함될 수 있으나, 구체적으로 하기의 효소를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, “알파-갈락토시다제 A(alpha-galactosidase A)”는, 아갈시다제 (aglasidase)라고도 부르는, 파브리병(Fabry disease)에 관계된 효소로서, 당지질 또는 당단백질의 말단 알파-갈락토실 모이어티 (terminal alpha-galactosyl moieties)를 갈락토스 및 글루코스로 가수 분해하는 효소이다. 본 발명에서 상기 알파-갈락토시다제 A는 알파-갈락토시다제 또는 아갈시다제 (agalsidase)와 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 알파-갈락토시다제 또는 아갈시다제는 아갈시다제 알파 또는 아갈시다제 베타일 수 있다.
본 발명의 용어, “이미글루세라제(imiglucerase)”는, 포도당 세라미드 가수 분해 효소의 활성을 가지는 효소로써 당지질의 대사과정의 중간체인 글루코세레브로시드의 베타-글루코시딕 연결(β-glucosidic linkage)을 가수 분해하는 효소로서, 인간 베타-글루코세레브로시다제 (beta-glucocerebrosidase)의 재조합 형태이다. 고셰병(Gaucher's disease)에 관계된 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어, “이두로니다제(iduronidase)”는, L-이두로니다제 (L-iduronidase), 알파-L-이두로니다제 (alpha-L-iduronidase, IDUA), 라로니다제 (laronidase)라고도 하며, 데르마탄 설페이트 및 헤파란 설페이트와 같은 글리코사미노글리칸의 가수 분해에 관여한다. 본 발명에서 상기 이두로니다제는 라로니다제(laronidase)와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, “아릴설파타제 B (arylsulfatase B, ARSB)”는, 간, 췌장, 신장의 리소좀에 존재하는 아릴설파타제 효소로서, 글리코사미노글리칸을 분해 함으로써, 설페이트를 가수 분해하는 역할을 한다. 상기 아릴설파타제 B는 mucopolysaccharidosis VI (Maroteaux-Lamy syndrome)에 연관된 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 상기 아릴설파타제 B는 갈설파제(galsulfase)와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, “알파-글루코시다제(alpha-glucosidase)”는, 녹말 또는 이당류를 글루코스로 분해하는 글루코시다제의 일종으로, 상기 효소의 결핍으로 폼페병이 발병한다. 본 발명에서 상기 알파-글루코시다제는 알글루코시다제(alglucosidase), 또는 산성 알파-글루코시다제(Acid alpha-glucosidase, GAA)와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 리소좀 축적 질환 치료를 위한 효소인, 이두설파제, 아갈시다제, 이미글루세라제, 갈설파제, 및 라로니다제를 각각 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 중합체와 연결한 결합체를 제조하였으며 (실시예 3), 각 효소 결합체의 in vitro 및 in vivo 활성을 확인하였다(실시예 4 내지 8).
그 결과, 각 효소 결합체의 효소는 Fc 영역과의 결합에도 불구하고, 효소 활성을 유지하면서도, 반감기, 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성이 모두 증가되는 것을 확인하였다.
본 발명의 효소 결합체에 포함될 수 있는 상기 치료학적 효소는 천연형일 수 있으며, 일부로 구성된 단편, 혹은 일부 아미노산의 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난, 효소의 유도체 (analog) 역시 천연형 효소와 동등한 활성을 갖는 한, 본 발명에 제한없이 포함된다.
상기 효소 유도체는 해당 효소의 바이오시밀러와 바이오베터 형태를 포함하는데, 바이오시밀러의 예를 들자면 공지 효소와 발현 숙주의 차이, 당화의 양상과 정도의 차이, 특정 위치의 잔기가 해당 효소의 기준 서열에 비추어 볼 때 100% 치환이 아닌 경우, 그 치환 정도의 차이도 본 발명의 효소 결합체에서 사용할 수 있는 바이오시밀러 효소에 해당한다. 상기 효소는 유전자 재조합을 통해 동물세포, 대장균, 효모, 곤충세포, 식물세포, 살아있는 동물 등에서 생산할 수 있으며 생산 방법은 이에 한정되지 않으며, 상업적으로 이용 가능한 효소일 수도 있다.
또한, 상기 효소 또는 이의 유도체와 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 효소는 재조합 기술에 의해 미생물로부터 수득하거나, 상업적으로 이용가능 한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다..
본 발명의 용어, "상동성(homology)"은, 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성은 두 서열을 육안으로 비교하여 결정할 수도 있으나, 비교대상이 되는 서열을 나란히 배열하여 상동성 정도를 분석해 주는 생물정보 알고리즘(bioinformatic algorithm)을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 두 개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 백분율로 표시할 수 있다. 유용한 자동화된 알고리즘은 Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, W, USA)의 GAP, BESTFIT, FASTA와 TFASTA 컴퓨터 소프트웨어 모듈에서 이용가능하다. 상기 모듈에서 자동화된 배열 알고리즘은 Needleman & Wunsch와 Pearson & Lipman과 Smith & Waterman 서열 배열 알고리즘을 포함한다. 다른 유용한 배열에 대한 알고리즘과 상동성 결정은 FASTP, BLAST, BLAST2,PSIBLAST와 CLUSTAL W를 포함하는 소프트웨어에서 자동화되어 있다.
상기 효소 또는 이의 유도체의 서열 및 이를 코딩하는 염기서열의 정보는 NCBI 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다.
본 발명의 용어, “면역글로불린 Fc 영역"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1 (CH1)과 경쇄 불변영역 1 (CL1)을 제외한 나머지 부분을 의미하며, 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지 (hinge) 영역을 추가로 포함하기도 한다. 특히 면역글로불린 Fc 영역 전체 및 이의 일부를 포함하는 단편일 수 있어, 본 발명에서는 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 단편과 혼용될 수 있다.
천연형 Fc는 중쇄 불변영역 1에서 Asn297 부위에 당쇄가 존재하지만, 대장균 유래 재조합 Fc는 당쇄가 없는 형태로 발현된다. Fc에서 당쇄가 제거되면 중쇄 불변영역 1 에 결합하는 Fc 감마 수용체 1,2,3 과 보체(c1q)의 결합력이 저하되어 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거된다.
본 발명에서, "면역글로불린 불변영역"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3) (또는 중쇄 불변영역 4(CH4) 포함)부분을 포함하는 Fc 단편을 의미할 수 있으며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 불변영역은 천연형과 실질적으로 동등 하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역(CL)을 포함하는 확장된 면역글로불린 불변영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 불변영역은 (1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, (2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, (3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, (4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, (5) 1개 또는 2개의 이상의 불변영역 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)과의 조합, (6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 면역글로불린 Fc 단편을 비롯한 불변영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 단편은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
한편, 면역글로불린 불변영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다. 또한, 면역글로불린 불변영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 불변영역으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래일 수 있다. 본 발명에서 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체일 수 있다.
본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 불변영역(바람직하게는 Fc 영역)을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 불변영역(바람직하게는 Fc 영역)내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 불변영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지영역을 추가로 포함할 수 있다.
IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화된 형태도 가능하다. 구체적으로는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 더욱 구체적으로는 보체 의존적 독성(CDC, Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역일 수 있다.
또한, 면역글로불린 불변영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 불변영역 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, 면역글로불린 불변영역에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 불변영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 불변영역이라 할 것이다. 따라서, 더욱더 구체적으로는, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역, 즉 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역을 사용할 수 있다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직할 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 불변영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가되는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예를 들어 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 불변영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 면역글로불린 불변영역 유도체는 본 발명의 면역글로불린 불변영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나, 면역글로불린 불변영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체일 수 있다. 또한, 이러한 면역글로불린 불변영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.
바람직하게는 인간 유래의 면역글로불린 불변영역을 미생물로부터 수득한 재 조합형 면역글로불린 불변영역일 수 있다.
본 발명의 용어, “비펩타이드성 중합체”는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 포함하고, “비펩타이드성 링커”와 혼용 된다. 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 본 발명에서 비펩타이드성 중합체는 말단에 반응기를 포함하여, 결합체를 구성하는 다른 구성 요소와 반응을 통해 결합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 용어, “비펩타이드성 중합체 연결부 (linkage moiety)”는 양 말단에 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체가 각 반응기를 통해 면역글로불린 Fc 영역 및 치료학적 효소와 결합하여 형성한 결합체 내의 일 구성 요소를 의미한다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 효소 결합체는 양쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 및 치료학적 효소와 결합될 수 있는 반응기를 포함하는 비펩타이드성 중합체를 통하여 면역글로불린 Fc 영역 및 치료학적 효소가 서로 공유결합적으로 연결된 것일 수 있다.
구체적으로, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸에테르, PLA(polylactic acid) 및 PLGA(polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산, 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 보다 구체적인 실시형태에서 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체의 분자량은 0 초과 200 kDa 범위, 구체적으로, 1 내지 100 kDa 범위, 보다 구체적으로, 1 내지 50 kDa 범위, 보다 더 구체적으로, 1 내지 20kDa 범위, 보다 더 구체적으로 3.4kDa 내지 10 kDa, 범위, 보다 더 구체적으로 약 3.4kDa일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단은 각각 면역글로불린 Fc 영역의 아민기 또는 티올기 및 치료학적 효소의 아민기 또는 티올기에 결합할 수 있다.
구체적으로, 상기 비펩타이드성 중합체는 양쪽 말단에 각각 면역글로불린 Fc 및 치료학적 효소와 결합될 수 있는 반응기, 구체적으로는 치료학적 효소 혹은 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 또는 리신에 위치한 아민기, 또는 시스테인의 티올기와 결합될 수 있는 반응기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 비펩타이드성 중합체의 반응기는 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석신이미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있느나 이에, 제한되지 않는다.
상기에서, 알데히드기로 프로피온 알데히드기 또는 부틸 알데히드기를 예로서 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서, 석시니미드 유도체로는 상기 석신이미드 유도체는 석신이미딜 카르복시메틸, 석신이미딜 발레르에이트, 석신이미딜 메틸부타노에이트, 석신이미딜 메틸프로피온에이트, 석신이미딜 부타노에이트, 석신이미딜 프로피온에이트, N-하이드록시석신이미드인 또는 석신이미딜 카보네이트가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 반응기를 통해 면역글로불린 Fc 및 치료학적 효소에 연결되어, 비펩타이드성 중합체 연결부로 전환될 수 있다.
또한, 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 리신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
본 발명의 비펩타이드성 중합체의 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 상기 비펩타이드성 중합체는 말단에 알데히드 그룹 반응기를 갖는 것일 수 있고, 또한 상기 비펩타이드성 중합체는 말단에 각각 알데히드 그룹 및 말레이미드 반응기를 가질 수 있거나, 말단에 각각 알데히드 그룹 및 석시니미드 반응기를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 또 한 가지 예로, 한쪽 말단에는 석시니미딜 그룹을, 다른 쪽 말단에는 프로피온 알데히드 그룹 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다.
프로피온쪽 말단에 하이드록시 반응기를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는, 공지의 화학반응에 의해 상기 하이드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)을 이용하여 본 발명의 효소 결합체를 제조할 수 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 비펩타이드성 중합체의 반응기가 치료학적 효소의 시스테인 잔기, 보다 구체적으로 시스테인의 -SH 기에 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
만약, 말레이미드-PEG-알데히드를 사용하는 경우, 말레이미드 기는 치료학적 효소의 -SH 기와 티오에테르(thioether) 결합으로 연결하고, 알데히드기는 면역글로불린 Fc의 -NH2 기와 환원적 알킬화 반응을 통해 연결할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 이는 하나의 일례에 해당한다.
이와 같은 환원적 알킬화를 통하여 PEG의 한쪽 말단에 위치한 산소 원자에 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 아미노기가 -CH2CH2CH2-의 구조를 가지는 링커 작용기를 통해 서로 연결되어, -PEG-O-CH2CH2CH2NH-면역글로불린 Fc와 같은 구조를 형성할 수 있고, 티오에테르 결합을 통하여 PEG의 한쪽 말단이 치료학적 효소의 시스테인에 위치한 황 원자에 연결된 구조를 형성할 수 있다. 상술한 티오에테르 결합은
Figure PCTKR2017001016-appb-I000001
의 구조를 포함할 수 있다.
그러나, 상술한 예에 특별히 제한되는 것은 아니며, 이는 하나의 일례에 해당한다.
또한, 상기 결합체에서, 비펩타이드성 중합체의 반응기가 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 위치한 -NH2와 연결된 것일 수 있으나, 이는 하나의 일례에 해당한다. 구체적으로, 본 발명의 치료학적 효소는 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체와 N-말단을 통해 연결될 수 있다.
본 발명의 용어, “N-말단”은, 펩타이드의 아미노 말단을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 비펩타이드성 중합체와 결합할 수 있는 위치를 말한다. 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, N-말단의 최말단 아미노산 잔기뿐만 아니라 N-말단 주위의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20 번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 리소좀 축적 질환 치료를 위한 치료학적 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 효소는 상술한 바와 같다.
본 발명의 다른 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase) A와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 아릴설파타제 B (arylsulfatase B, ARSB)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이두로니다제 (iduronidase)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이미글루세라제(imiglucerase)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, “리소좀”, “리소좀 축적 질환”, “알파-갈락토시다제 (alpha-galactosidase) A”, “아릴설파타제 B (arylsulfatase B, ARSB)”, “이두로니다제 (iduronidase)”, “알파-글루코시다제(alpha-glucosidase)”, “이미글루세라제 (imiglucerase)”, “면역글로불린 Fc 영역”, “비펩타이드성 중합체 연결부”, “효소 결합체”는 상술한 바와 같다.
본 발명의 용어, “예방"은 상기 리소좀 축적 질환 치료를 위한 치료학적 효소 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 리소좀 축적 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 효소 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 리소좀 축적 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 조성물이 생체 내 표적에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 또는 직장 내 투여 등이 될 수 있다.
본 발명의 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 리소좀 축적 질환의 원인이 되는 결핍 또는 부족 효소를 리소좀 축적 질환을 가진 개체에 투여함으로써, 리소좀 효소의 기능을 회복시켜 리소좀 축적 질환을 치료하는 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 양태는 세포외배출 (transcytosis), 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성을 증가시키는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료학적 효소가 Fc 영역과 연결된 효소 결합체가 FcRn 수용체와의 고유 결합을 통해 상기 효소 결합체가 세포막을 용이하게 통과할 수 있도록 하는 한편, 혈관에서 조직으로 보다 효과적으로 도달할 수 있도록 한다.
이에, 세포외배출 (transcytosis), 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성이 증가된 효과를 가져, 우수한 리소좀 축적 질환 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제는 비자연적으로 발생된 것일 수 있다. 상기 담체는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 경구 투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제, 구체적으로는 단백질 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여 방법을 이용하여 경구, 또는 피부, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 수막강 내, 심실 내, 폐, 경피, 피하, 복 내, 비강 내, 소화관 내, 국소, 설하, 질 내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구 투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 결합체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타티온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트제, 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers) 등이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량과 횟수는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 결합체의 바람직한 전체 용량은 하루에 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 mg 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 결합체의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 조성물의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 효소 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
구체적인 양태로서, 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 효소 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 아릴설파타제 B (arylsulfatase B, ARSB) 효소 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 이두로니다제 (iduronidase) 효소 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase) 효소 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 이미글루세라제(imiglucerase) 효소 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 효소 결합체, 이를 포함하는 조성물, 리소좀 축적 질환, 예방 및 치료에 대해서는 상술한 바와 같다.
본 발명의 용어, “개체”는 리소좀 축적 질환이 의심되는 개체로서, 상기 리소좀 축적 질환 의심 개체는 해당 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물을 의미하나, 본 발명의 결합체 혹은 이를 포함하는 상기 조성물로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.
본 발명의 방법은 상기 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 효소 결합체를 포함하는, 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가용 조성물을 제공한다.
구체적인 양태로서, 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 효소 결합체를 포함하는, 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가용 조성물을 제공한다.
또한, 아릴설파타제 B (arylsulfatase B, ARSB) 효소 결합체를 포함하는, 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가용 조성물을 제공한다.
또한, 이두로니다제 (iduronidase) 효소 결합체를 포함하는, 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가용 조성물을 제공한다.
또한, 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase) 효소 결합체를 포함하는, 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가용 조성물을 제공한다.
또한, 이미글루세라제(imiglucerase) 효소 결합체를 포함하는, 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 효소 결합체 또는 이를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가 방법을 제공한다.
구체적인 양태로서, 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 효소 결합체 또는 이를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가 방법을 제공한다.
또한, 아릴설파타제 B (arylsulfatase B, ARSB) 효소 결합체 또는 이를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가 방법을 제공한다.
또한, 이두로니다제 (iduronidase) 효소 결합체 또는 이를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가 방법을 제공한다.
또한, 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase) 효소 결합체 또는 이를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가 방법을 제공한다.
또한, 이미글루세라제(imiglucerase) 효소 결합체 또는 이를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가 방법을 제공한다.
상기 효소 결합체, 이를 포함하는 조성물, 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성은 상술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 효소 결합체의 리소좀 축적 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
구체적인 양태로서, 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 효소 결합체의 리소좀 축적 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 아릴설파타제 B (arylsulfatase B, ARSB) 효소 결합체의 리소좀 축적 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 이두로니다제 (iduronidase) 효소 결합체의 리소좀 축적 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase) 효소 결합체의 리소좀 축적 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 이미글루세라제(imiglucerase) 효소 결합체의 리소좀 축적 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
상기 효소 결합체, 리소좀 축적 질환, 예방, 및 치료는 상술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 효소 결합체 또는 이를 포함하는 조성물의 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가 용도를 제공한다.
구체적인 양태로서, 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 효소 결합체 또는 이를 포함하는 조성물의 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가 용도를 제공한다.
또한, 아릴설파타제 B (arylsulfatase B, ARSB) 효소 결합체 또는 이를 포함하는 조성물의 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가 용도를 제공한다.
또한, 이두로니다제 (iduronidase) 효소 결합체 또는 이를 포함하는 조성물의 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가 용도를 제공한다.
또한, 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase) 효소 결합체 또는 이를 포함하는 조성물의 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가 용도를 제공한다.
또한, 이미글루세라제(imiglucerase) 효소 결합체 또는 이를 포함하는 조성물의 효소의 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성 증가 용도를 제공한다.
상기 효소 결합체, 이를 포함하는 조성물, 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성은 상술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 치료학적 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및
(b) 상기 효소와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식1]
X-La-F
여기서, X는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 효소이고;
L은 비펩타이드성 중합체이며;
a는 0 또는 자연수이고, 다만 a가 2이상 일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고,
F는 X의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
구체적으로, 상기 효소는 상술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및 (b) 상기 효소와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식1]
X-La-F
여기서, X는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 효소이고;
L은 비펩타이드성 중합체이며;
a는 0 또는 자연수이고, 다만 a가 2이상 일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고,
F는 X의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 아릴설파타제 B(arylsulfatase B, ARSB) 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및 (b) 상기 효소와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식1]
X-La-F
여기서, X는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 아릴설파타제 B(arylsulfatase B, ARSB) 효소이고;
L은 비펩타이드성 중합체이며;
a는 0 또는 자연수이고, 다만 a가 2이상 일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고,
F는 X의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이두로니다제(iduronidase) 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및
(b) 상기 효소와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식1]
X-La-F
여기서, X는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이두로니다제(iduronidase) 효소이고;
L은 비펩타이드성 중합체이며;
a는 0 또는 자연수이고, 다만 a가 2이상 일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고,
F는 X의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase) 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및
(b) 상기 효소와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다..
[화학식1]
X-La-F
여기서, X는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase) 효소이고;
L은 비펩타이드성 중합체이며;
a는 0 또는 자연수이고, 다만 a가 2이상 일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고,
F는 X의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이미글루세라제(imiglucerase) 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및 (b) 상기 효소와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식1]
X-La-F
여기서, X는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이미글루세라제(imiglucerase) 효소이고;
L은 비펩타이드성 중합체이며;
a는 0 또는 자연수이고, 다만 a가 2이상 일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고,
F는 X의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
본 발명에서 상기 F는 고분자 중합체, 지방산, 콜레스테롤, 알부민 및 이의 단편, 알부민 결합물질, 특정 아미노산 서열의 반복단위의 중합체, 항체, 항체 단편, FcRn 결합물질, 생체 내 결합조직, 뉴클레오타이드, 파이브로넥틴, 트랜스페린(Transferrin), 사카라이드(saccharide), 헤파린, 및 엘라스틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 상기 FcRn 결합 물질은 면역글로불린 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 F는 X와 공유 화학결합 또는 비공유 화학결합으로 서로 결합되는 것일 수 있으며, 공유 화학결합, 비공유 화학결합 또는 이들의 조합으로 L을 통하여 F와 X가 서로 결합되는 것일 수 있다.
또한, 상기 L은 펩타이드성 중합체 또는 비펩타이드성 중합체일 수 있다.
상기 L이 펩타이드성 중합체일 때, 1개 이상의 아미노산을 포함할 수 있으며, 예컨대 1개부터 1000개의 아미노산을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 F와 X를 연결하기 위하여 공지의 다양한 펩타이드 링커가 본 발명에 사용될 수 있으며, 그 예로 [GS]x 링커, [GGGS]x 링커 및 [GGGGS]x 링커 등을 포함하며, 여기서 x는 1 이상의 자연수일 수 있다. 그러나, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.
상기 L이 펩타이드성 중합체일 때, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 폴리에틸렌글리콜일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 (a) 단계에서의 비펩타이드성 중합체의 반응기는 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석신이미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 알데히드 그룹은 프로피온 알데히드 그룹 또는 부틸 알데히드 그룹이거나, 상기 석신이미드 유도체는 석신이미딜 카르복시메틸, 석신이미딜 발레르에이트, 석신이미딜 메틸부타노에이트, 석신이미딜 메틸프로피온에이트, 석신이미딜 부타노에이트, 석신이미딜 프로피온에이트, N-하이드록시석신이미드인 또는 석신이미딜 카보네이트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 비펩타이드성 중합체는 말단에 알데히드 그룹 반응기를 갖는 것이거나, 양 말단에 각각 알데히드 그룹 및 말레이미드 반응기를 갖는 것이거나, 양 말단에 각각 알데히드 그룹 및 석시니미드 반응기를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 구체적인 양태는 상기 효소의 N-말단에 비펩타이드성 중합체 연결부가 결합된 결합체를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 효소 결합체는 치료학적 효소를 Fc 영역과 연결시킴으로써, 상기 Fc 영역이 FcRn 수용체와의 고유 결합을 통해 효소 결합체가 세포막을 용이하게 통과할 수 있도록 하는 한편, 혈관에서 조직으로 보다 효과적으로 도달할 수 있도록 한다.
상기와 같은 효소의 증가된 세포외배출, 생체 이용율, 및 조직 분포성은 모두 효소 결합체에 포함된, 리소좀 축적 질환의 치료를 위한 효소가 체내에서 효소 활성을 유지하면서도 효과적인 타겟 질환의 치료 효과를 나타낼 수 있도록 한다.
또한, 본 발명의 효소 결합체는 효소 또는 이의 유도체 (analog)의 반감기를 증가시키는 것일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 효소 생산
지속형 효소를 생산하기 위해 동물세포 발현 벡터를 삽입한 동물세포를 배양하여 정제한다.
본 발명에서 결합체 제조를 위해 사용된 효소는 아갈시다제 베타 (Agalsidase beta), 이미글루세라제(Imiglucerase), 갈설파제(Galsufase), 및 라로니다제 (Laronidase)이다.
실시예 2: 효소 결합체 제조-1
면역글로불린 Fc 영역에 비펩타이드성 중합체를 결합하여 정제한다.
실시예 1에서 정제한 효소의 N 말단에 비펩타이드성 중합체를 공유 결합시킨다. 이때 비펩타이드성 중합체는 양쪽에 알데하이드(aldehyde, -CHO)기를 갖는 선형(linear) 중합체로써 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, (CH2CH2O)n) 백본(backbone)을 갖는다. 백본의 갯수에 따라 비펩타이드성 중합체의 크기가 결정되며, 비펩타이드성 중합체의 반응기인 알데하이드(aldehyde, -CHO)는 단백질의 구성요소인 라이신(lysine)기의 -NH2 혹은 N 말단의 -NH2와 공유결합한다. 비펩타이드성 중합체의 알데하이드(aldehyde, -CHO)기는 특정 반응 조건하에서 N 말단의 -NH2와 특이적으로 반응하며 반응 후 정제 과정을 통해 N 말단에 특이적으로 공유 결합한 비펩타이드성 중합체 효소를 얻는다.
실시예 3: 효소 결합체 제조-2
실시예 2에서 정제한 비펩타이드성 중합체와 결합한 면역글로불린 Fc 영역과 실시예 1에서 정제한 효소를 결합시킨다.
상기 효소는 비펩타이드성 중합체의 결합 위치에 따라 활성에 차이를 나타낼 수 있다. 즉, 비펩타이드성 중합체와 효소의 위치 특이적 결합에 따라 체내 반감기 또는 활성이 향상될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 효소의 구조에 따라, 비펩타이드성 중합체를 결합시키는 위치를 특정하여 결합체를 제조한다.
실시예 3-1: 아갈시다제 (Agalsidase)와 면역글로불린 Fc를 폴리에틸렌 글리콜로 연결한 결합체의 제조
아갈시다제 베타를 포함하는 결합체를 하기와 같이 제조하였다.
상기 제조된 알데하이드-폴리에틸렌 글리콜(Mw = 10000 Da)-알데하이드(ALD-PEG-ALD) (SUNBRIGHT DE-100AL2, NOF CORPORATION, Japan) 링커를 아갈시다제의 N-말단에 결합시키기 위하여, 아갈시다제 베타와 ALD-PEG-ALD의 몰 비율 1:50으로, 아갈시다제 베타의 농도를 10 mg/mL로 4 ℃에서 약 2시간 반응시켰다. 이때 반응은 100 mM 인산나트륨 pH 5.6에서 이루어졌고, 환원제로서 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다. 반응액은 10 mM 인산나트륨 (pH 6.0) 버퍼와 염화나트륨 농도 구배를 이용한 Source 15Q (GE, 미국) 컬럼을 사용하여 반응하지 않은 아갈시다제와 모노결합된 아갈시다제 베타를 정제하였다.
다음으로, 상기 정제된 폴리에틸렌글리콜 링커와 결합된 아갈시다제 베타와 면역글로불린 Fc 단편의 몰 비가 1:10이 되도록 하고, 전체 단백질 농도를 10 mg/mL로 하여 4 내지 8 에서 12 내지 16시간 반응시켰다. 이때 반응액은 인산칼륨 pH 6.0이며, 환원제로서 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 10 mM 인산나트륨 (pH 6.0) 버퍼와 염화나트륨 농도 구배를 이용한 Source 15Q (GE, 미국) 컬럼과 20mM 트리스 (pH 7.5), 5%(v/v) 글리세롤과 구연산염 (pH 4.0), 염화나트륨, 10% 글리세롤 버퍼의 농도 구배를 이용한 Protein A (GE, 미국)에 적용하였으며, 마지막으로 염화나트륨이 포함된 인산나트륨 버퍼를 이용한 SuperdexTM 200 (GE, 미국)에 적용하여 아갈시다제 베타에 면역글로불린 Fc가 폴리에틸렌글리콜 링커에 의해 공유결합으로 연결된 결합체를 정제하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2에서 정제한 비펩타이드성 중합체 효소와 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체의 미반응한 다른 한쪽의 알데하이드(aldehyde, -CHO)기와 면역글로불린 Fc 영역 N 말단의 -NH2기와 공유결합을 시켜, 공유 결합 반응 후 정제를 통해 효소 결합체 제조를 완성하였다.
최종적으로 제조된 아갈시다제-폴리에틸렌글리콜 링커-면역글로불린 Fc 결합체는 아갈시다제 단량체가 두 개의 사슬로 이루어진 면역글로불린 Fc의 한 쪽 사슬에 폴리에틸렌글리콜 링커로 연결된 형태이다.
실시예 3-2: 이미글루세라제(Imiglucerase)와 면역글로불린 Fc를 폴리에틸렌 글리콜로 연결한 결합체의 제조
이미글루세라제를 포함하는 결합체를 하기와 같이 제조하였다.
알데하이드-폴리에틸렌 글리콜 (Mw = 10000 Da)-알데하이드(ALD-PEG-ALD) (SUNBRIGHT DE-100AL2, NOF CORPORATION, Japan) 링커를 이미글루세라제의 N-말단에 결합시키기 위하여, 이미글루세라제와 ALD-PEG-ALD 의 몰 비율 1:50으로, 이미글루세라제의 농도를 1 mg/mL로 25 ℃에서 약 1시간 반응시켰다. 이때 반응은 100 mM 인산칼륨(Potassium phosphate) pH 6.0에서 이루어졌고, 환원제로서 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다. 반응액은 20 mM 인산나트륨 (Sodium phosphate) (pH 6.0), 2.5%(v/v) 글리세롤이 포함된 버퍼와 염화나트륨 농도 구배를 이용한 Source 15S (GE, 미국) 컬럼을 사용하여 반응하지 않은 이미글루세라제와 모노 결합된 이미글루세라제를 정제하였다.
다음으로, 상기 정제된 폴리에틸렌 글리콜 링커와 결합된 이미글루세라제와 면역글로불린 Fc 단편의 몰비가 1:50이 되도록 하고, 전체 단백질 농도를 40 mg/mL로 하여 4 내지 8 에서 12 내지 16시간 반응시켰다. 이때 반응액은 100 mM 인산칼륨 (Potassium phosphate) pH 6.0이며, 환원제로서 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 10 mM 구연산염 (Sodium citrate) (pH 5.0) 버퍼와 염화나트륨 (Sodium chloride) 농도 구배를 이용한 Source 15S (GE, 미국) 컬럼과 20 mM 트리스 (Tris) (pH 7.5), 5%(v/v) 글리세롤과 100 mM 구연산나트륨(Sodium citrate) (pH 3.7), 염화나트륨, 10% 글리세롤 버퍼의 농도 구배를 이용한 Protein A (GE, 미국)에 적용하였으며, 마지막으로 염화나트륨이 포함된 50 mM 구연산나트륨 버퍼(pH 6.1)를 이용한 SuperdexTM 200 (GE, 미국)에 적용하여 이미글루세라제에 면역글로불린 Fc가 폴리에틸렌 글리콜 링커에 의해 공유결합으로 연결된 결합체를 정제하였다.
구체적으로, 상기 정제한 비펩타이드성 중합체 효소와 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체의 미반응한 다른 한쪽의 알데하이드(aldehyde, -CHO)기와 면역글로불린 Fc 영역 N 말단의 -NH2기와 공유결합을 시켜, 공유 결합 반응 후 정제를 통해 효소 결합체 제조를 완성하였다.
최종적으로 제조된 이미글루세라제-폴리에틸렌글리콜 링커-면역글로불린 Fc 결합체는 이미글루세라제 단량체가 두 개의 사슬로 이루어진 면역글로불린 Fc의 한 쪽 사슬에 폴리에틸렌글리콜 링커로 연결된 형태이다.
실시예 3-3: 갈설파제(Galsulfase)와 면역글로불린 Fc를 폴리에틸렌 글리콜로 연결한 결합체의 제조
갈설파제를 포함하는 결합체를 하기와 같이 제조하였다.
알데하이드-폴리에틸렌 글리콜-알데하이드(Aldehyde-Polyethyleneglycol-Aldehdye, 10 kDa) (SUNBRIGHT DE-100AL2, NOF CORPORATION, Japan) 링커를 갈설파제의 N-말단에 결합시키기 위하여, 갈설파제와 ALD-PEG-ALD 의 몰 비율 1:20으로, 갈설파제의 농도를 1 mg/mL로 25℃에서 약 2시간 반응시켰다. 이 때 반응은 12 mM 인산나트륨(Sodium phosphate), 150 mM 염화나트륨, pH 5.8에서 이루어졌고, 환원제로서 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다. 반응액은 20 mM 트리스 (Tris, pH 7.0) 버퍼와 염화나트륨 농도 구배를 이용한 Source 15Q (GE, 미국) 컬럼과 1.8 M 암모니움설파이트로 평형이 잡힌 Source ISO (GE, 미국) 컬럼을 사용하여 반응하지 않은 갈설파제와 모노 PEG 갈설파제를 정제하였다.
다음으로, 상기 정제된 폴리에틸렌글리콜 링커와 결합된 갈설파제와 면역글로불린 Fc 단편의 몰 비가 1:20이 되도록 하고, 전체 단백질 농도를 50 mg/mL로 하여 4 내지 8 에서 12 내지 16시간 반응시켰다. 이때 반응액은 인산칼륨 (Potassium phosphate, pH 6.0)이며, 환원제로서 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 트리스 (Tris, pH 7.0) 버퍼와 염화나트륨 (Sodium chloride) 농도 구배를 이용한 Source 15Q (GE, 미국) 컬럼과 20mM 트리스 (Tris, pH 7.0), 5%(v/v) 글리세롤 (Glycerol) 과 구연산염 (Sodium citrate, pH 3.0), 10% 글리세롤 (Glycerol) 버퍼의 농도 구배를 이용한 Protein A (GE, 미국)에 적용하였으며, 마지막으로 1.8 M 암모이움설파이트 (Ammonium sulfate)로 평형이 잡힘 Source ISO (GE, 미국) 컬럼을 사용하여 갈설파제에 면역글로불린 Fc가 폴리에틸렌 글리콜 링커에 의해 공유결합으로 연결된 결합체를 정제하였다.
구체적으로, 상기 정제한 비펩타이드성 중합체 효소와 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체의 미반응한 다른 한쪽의 알데하이드(aldehyde, -CHO)기와 면역글로불린 Fc 영역 N 말단의 -NH2기와 공유결합을 시켜, 공유 결합 반응 후 정제를 통해 효소 결합체 제조를 완성하였다.
최종적으로 제조된 갈설파제-폴리에틸렌글리콜 링커-면역글로불린 Fc 결합체는 갈설파제 단량체가 두 개의 사슬로 이루어진 면역글로불린 Fc의 한 쪽 사슬에 폴리에틸렌글리콜 링커로 연결된 형태이다.
실시예 3-4: 라로니다제(Laronidase)와 면역글로불린 Fc를 폴리에틸렌 글리콜로 연결한 결합체의 제조
라로니다제를 포함하는 결합체를 하기와 같이 제조하였다.
10kDa 알데하이드-폴리에틸렌 글리콜-알데하이드(10kDa, ALD-PEG-ALD) 링커 (SUNBRIGHT DE-100AL2, NOF CORPORATION, Japan)를 라로니다제의 N-말단에 결합시키기 위하여, 라로니다제와 10kDa ALD-PEG-ALD의 몰 비율 1:100으로, 라로니다제의 농도를 0.58 mg/mL로 4 내지 8℃에서 약 16시간 반응시켰다. 이때 반응은 100 mM 인산칼륨 (Potassium phosphate) pH 6.0에서 이루어졌고, 환원제로서 10 mM 소디움 시아노보로하이드라이드 (Sodium cyanoborohydride, SCB)를 첨가하였다. 반응액은 인산칼륨 (pH 6.0)과 염화나트륨 (Sodium chloride) 농도 구배를 이용한 Source 15S (GE, 미국) 컬럼과 인산칼륨 (pH 6.0)과 암모늄설페이트 (Ammomium sulfate) 농도 구배를 이용한 Source 15ISO (GE, 미국)를 사용하여 폴리에틸렌 글리콜 링커와 모노 결합된 라로니다제를 정제하였다.
다음으로, 상기 정제된 폴리에틸렌글리콜 링커와 결합된 라로니다제와 면역글로불린 Fc 단편의 몰 비가 1:10이 되도록 하고, 전체 단백질 농도를 20 mg/mL로 하여 4 내지 8에서 약 14시간 반응시켰다. 이때 반응액은 100mM 인산칼륨 (Potassium phosphate) pH 6.0이며, 환원제로서 10 mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 인산칼륨 (pH 6.0) 버퍼와 염화나트륨 (Sodium chloride) 농도 구배를 이용한 Source 15S (GE, 미국) 컬럼에 적용하고, 마지막으로 20mM 트리스 (pH 7.5), 5%(v/v) 글리세롤 (Glycerol)과 100mM 구연산염 (Citric acid monohydrate) (pH 3.7), 10% 글리세롤 및 100mM 구연산염 (pH 4.0), 10% 글리세롤 버퍼의 농도 구배를 이용한 Protein A (GE, 미국)에 적용하여 라로니다제에 면역글로불린 Fc가 폴리에틸렌 글리콜 링커에 의해 공유결합으로 연결된 결합체를 정제하였다
구체적으로, 상기 정제한 비펩타이드성 중합체 효소와 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체의 미반응한 다른 한쪽의 알데하이드(aldehyde, -CHO)기와 면역글로불린 Fc 영역 N 말단의 -NH2기와 공유결합을 시켜, 공유 결합 반응 후 정제를 통해 효소 결합체 제조를 완성하였다.
최종적으로 제조된 라로니다제-폴리에틸렌글리콜 링커-면역글로불린 Fc 결합체는 라로니다제 단량체가 두 개의 사슬로 이루어진 면역글로불린 Fc의 한 쪽 사슬에 폴리에틸렌글리콜 링커로 연결된 형태이다.
실시예 4: 효소 결합체의 약물 동력학 실험
본 발명자들은 상기 실시예에서 제조한 효소 결합체의 약물 동력학을 조사하여 결합체의 효과를 확인하고자 하였다.
실시예 4-1: 이미글루세라제 (imiglucerase) 지속성 결합체의 PK 확인
본 발명자들은 상기 실시예에서 제조한 이미글루세라제 지속성 결합체의 PK 활성을 확인하였다.
각 군 별 채혈시점당 3 마리의 ICR 마우스 (mouse)에 이두설파제 (Idursulfase, 대조군) 와 상기 실시예에서 제조한 이두설파제 지속형 결합체의 혈액 내 안정성 및 약물 동력학 계수를 비교하였다.
구체적으로, 대조군과 시험군을 이미글루세라제 기준으로 각 1.5 mg/kg 씩 정맥 내 주사한 후 정맥 내 주사 투여군은 주사 후 0, 2, 5, 10, 20, 및 60분후에 채혈하였고. 혈청 내 단백질 양은 이미글루세라제 에 대한 항체를 이용하여 ELISA 방법으로 측정하였다.
약물동력학 분석 결과 이미글루세라제 지속형 결합체는 대조군에 대비하여 혈중 반감기, AUC(area under curve) 모두 증가하였으며 특히 혈중반감기는 4배 이상 증가되었다. 상기 AUC는 약물 분자에 대한 체내 노출 정도를 나타낸다.
실시예 4-2: 아갈시다제 지속성 결합체의 PK 확인
각 군 별 채혈시점당 1 또는 3 마리의 ICR 마우스 (mouse)에 아갈시다제 베타 (Agalsidase beta, 대조군)와 상기에서 제조한 아갈시다제 베타 지속형 결합체의 혈액 내 안정성 및 약물 동력학 계수를 비교하였다.
구체적으로, 대조군과 시험군을 아갈시다제 기준으로 각 1.0 mg/kg 씩 정맥 내 및 피하 주사하였다. 대조군 정맥 내 및 피하 주사 투여군은 주사 후 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 3, 4, 8, 24 및 48 시간 후에 채혈하였다. 시험군 정맥 내 주사 군은 주사 후 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 시간 후에 채혈 하였고, 피하 주사 투여군은 주사 후 0, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144 및 168시간 후에 채혈하였다. 혈청 내 단백질 양은 아갈시다제에 대한 항체를 이용하여 ELISA 방법으로 측정하였다.
아갈시다제 베타 지속성 결합체의 경우 대조군에 대비하여 혈중 반감기, Cmax, AUC 모두 증가하였다. 또한, 아갈시다제 베타의 BA가 3.3 %인데 비해 아갈시다제 베타 지속성 결합체는 58.2 %으로 약 18 배 이상 월등히 우수한 생체이용률을 나타냄을 확인하였다 (도 2).
Cmax는 최고 약물 농도를, AUC(area under curve)는 약물분자에 대한 체내 노출 정도를, BA(Bioavailability)는 생체 내 이용률 의미한다.
본 발명자들은 제조된 각 효소 결합체의 In vitro 활성을 하기와 같이 확인하고자 하였다.
실시예 5: 아갈시다제 효소 결합체의 활성 확인
실시예 5-1: 아갈시다제 지속형 결합체의 In vitro 효소 활성
아갈시다제 베타의 지속형 결합체 제조에 따른 효소 활성 변화를 측정하고자 in vitro 시험관 효소 활성 측정을 진행하였다.
구체적으로, 효소 기질로 알려진 4-Nitrophenyl-a-D-galactopyranoside 를 아갈시다제 베타 및 아갈시다제 베타 지속형 결합체와 37 ℃에서 20분 반응 후, 최종적으로 생성되는 4-Nitrophenol 에 대한 흡광도를 측정함으로써 해당물질에 대한 효소활성을 측정하였다.
그 결과, 아갈시다제 베타와 아갈시다제 베타 지속형 결합체의 효소 비활성(specific activity)이 각각 63.6, 56.3 μmol/min/μg임을 확인하였다. 결론적으로 유리 아갈시다제 베타 대비, 아갈시다제 베타 지속형 결합체의 효소 활성이 88.6%로 아갈시다제 베타 지속형 결합체의 제조에 따른 효소 활성 감소가 미비한 것을 확인하였다 (도 2).
실시예 5-2: 아갈시다제 지속형 결합체의 세포내 흡수 활성
아갈시다제 베타는 만노스-6-인산 수용체(M6PR, mannose-6-phosphate receptor)를 통해 세포에 흡수된 후 작용하므로, 아갈시다제 베타 지속형 결합체 제조가 세포 흡수 활성에 영향을 미치는지를 다음과 같이 확인하였다.
구체적으로, 먼저 M6PR 가 발현한다고 알려진 CCD986SK cell (human skin fibroblast) 에 아갈시다제 베타 및 아갈시다제 베타 지속형 결합체를 각각 처리한 후, 37 ℃에서 세포 내 흡수를 유도하였다. 24시간 후, 세포 내 존재하는 아갈시다제 베타 및 아갈시다제 베타 지속형 결합체를 효소활성 측정법을 통해 확인하였다.
그 결과, 아갈시다제 베타 지속형 결합체의 세포내 흡수활성 (Kuptake = 29.3 nM) 이 아갈시다제 베타의 세포내 흡수활성 대비 (Kuptake = 13.7 nM) 약 47 % 임을 확인하였다. 이러한 M6PR 결합 및 세포내 흡수활성 감소 (vs. 아갈시다제 베타) 는 지속형 결합체의 steric hindrance 영향으로, 지속형 결합체 제조에 따른 결합 (conjugation) 으로 개선된 PK 에 의해 보상될 수 있다 (도 3).
실시예 5-3: 아갈시다제 지속형 결합체의 M6P 수용체 결합력 확인
아갈시다제 베타 및 아갈시다제 베타 지속형 결합체의 mannose phosphate 6 수용체(M6PR) 결합력 확인을 위해, surface plasmon resonance (BIACORE T200, GE healthcare)를 이용하여 분석하였다.
구체적으로, M6PR는 CM5 chip에 아민커플링으로 고정화였다. 그 후 아갈시다제를 HBS-EP 버퍼로 200 nM - 12.5 nM이 되도록 희석하여 M6PR가 고정화된 칩에 10분간 결합시키고, 6분간 해리시키면서 그 결합력을 BIAevaluation software로 계산하였다. 아갈시다제 베타 지속형 결합체의 상대적인 결합력을 아갈시다제와 비교하여 수치화하였다.
그 결과, 아갈시다제 베타와 대비하여 아갈시다제 베타 지속형 결합체는 약 68%의 수용체 결합력이 확인되었다 (표 1). 아갈시다제 베타 지속형 결합체의 M6PR에 대한 결합력이 상대적으로 낮은 것은 생리 활성 폴리펩타이드가 Fc 영역과 융합 단백질을 형성하면서 통상적으로 자체 수용체에 대한 결합력이 떨어지는 경향을 나타내는 것과 같은 원인으로 보인다. 본 발명의 작용 원리에 관한 어떠한 특정 이론에 얽매이고자 하는 의도가 아니라, 단지 발명의 이해를 돕기 위하여 설명을 해 보자면 면역글로불린 Fc와 아갈시다제 베타가 공유 결합됨에 따라 아갈시다제 부위가 입체장애(steric hindrance)를 받아 수용체에 대한 결합 속도 상수(association rate constant, ka)가 감소하였기 때문인 것으로 보여진다. 한 번 결합된 지속형 결합체의 경우 수용체에서 해리 속도 상수(dissociation rate constant, kd)는 결합체를 형성하지 않은 유리 아갈시다제와 차이가 없음을 확인하였다.
물질명 ka (1/Ms, X105) ka (1/s, X10-3) KD (nM)
아갈시다제 베타 1.35 ± 0.25 (100%) 2.73 ± 0.86 (100%) 20.0 ± 3.58 (100%)
아갈시다제 베타 지속형 결합체 0.80 ± 0.02 (70.4%) 2.77 ± 0.86 (101%) 29.6 ± 3.66 (67.6%)
본 발명의 아갈시다제 베타 지속형 결합체의 활성을 확인한 결과를 정리하면 하기와 같다.
In vitro activity (vs. 1st ERT) In vivo activity (vs. 1st ERT)
효소 활성 M6PR 결합력 세포 흡수 PK
t1/2 AUC
87 % 68 % 47 % 125 fold 18 fold
실시예 6: 이미글루세라제 효소 결합체의 활성 확인
실시예 6-1: 이미글루세라제 지속형 결합체의 In vitro 효소 활성
이미글루세라제 (Imiglucerase, 대조군)와 상기에서 제조한 이미글루세라제 지속형 결합체 (시험군)의 시험관 효소 활성을 비교하였다.
구체적으로, 효소 활성 측정을 위하여 p-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside 이 기질로서 사용되었고, 효소작용에 따라 생성된 pNP (p-Nitrophenol) 을 정량하여 단위시간당 생성된 산물의 양을 계산하여 절대적 효소 활성 (Specific activity) 을 나타내었다. 대조군과 시험군을 이미글루세라제 기준으로 각 0.1 μg/mL 의 농도로 처리하였다. 기질은 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1 및 0 mM 으로 처리하였고, 37℃ 에서 45 분간 반응시켰다. 최종적으로 생성된 pNP의 양은 405nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량 하였다. 정량된 pNP의 농도, 반응 부피 및 반응 시간을 이용하여 μmole/min/mg 을 계산해내고 Michaelis-Menten식에 x값은 처리한 기질의 농도, y값은 상기의 계산된 값을 대입하여 최종적으로 효소활성인 Vmax (μmole/min/mg = U/mg) 값을 산출하였다.
그 결과, 이미글루세라제와 이미글루세라제 지속형 결합체의 효소활성이 각각 48.5, 45.2 U/mg 임을 확인하였다. 결론적으로 대조군 대비, 이미글루세라제 ㅈ지지속형 결합체의 효소 활성이 93% 로 면역글로불린 Fc 결합에 따른 효소활성 감소가 없음을 확인하였다 (도 4).
실시예 6-2: 이미글루세라제 지속형 결합체의 M6P 수용체 결합력 확인
M6PR에 대한 결합력을 확인하기 위해 SPR(surface Plasmon resonance, BIACORE T200)을 이용하여 이미글루세라제 (대조군)와 상기에서 제조한 ㅇ이임이미글루세라제 지속형 결합체 (시험군)의 결합력을 확인하였다. M6PR은 Rnd systems에서 구매하였고, CM5칩에 아민 결합법을 이용하여 고정화시킨 후, 대조군은 100nM내지 6.24nM 사이의 농도로, 시험군은 200nM 내지 12.5nM 사이의 농도로 흘려 그 결합력을 확인하였다.
pH7.5 의 헤페스버퍼(HBS-EP)를 기본버퍼(running buffer)로 사용하였고, 모든 시험물질은 기본 버퍼로 희석하여 결함을 유도하고 해리 또한 기본버퍼로 진행하였다. 칩에 고정화된 M6PR에 시험물질을 10분간 흘려 결합을 유도하였고, 그 후 6분간 해리 과정을 거쳤다.
그 후 다른 농도의 대조군 또는 시험군을 결합시키기 위하여 M6PR에 결합되어있는 결합체에 5mM NaoH/50mM NaCl 을 약 30초간 흘려주었다. M6PR와 이미글루세라제 또는 이미글루세라제 지속형 결합체 간의 결합력은 BIAevaluation 프로그램을 이용하여 분석하였다. Ka(association rate constant), Kd (dissociation rate constant) 및 KD (affinity constant)는 1:1 Langmuir binding model을 이용하여 산출하였다.
그 결과, 면역글로불린 Fc 결합에 따라 해리 상수는 큰 차이가 없으나 결합상수에 차이가 생기는 것을 확인하였다. 이에 대조군 대비하여 시험군의 결합력이 22% 가량으로 감소되는 결과를 나타내었다 (표 3). 이미글루세라제 지속형 결합체의 M6PR에 대한 결합력이 상대적으로 낮은 것은 생리 활성 폴리펩타이드가 Fc 영역과 융합 단백질을 형성하면서 통상적으로 자체 수용체에 대한 결합력이 떨어지는 경향을 나타내는 것과 같은 원인으로 보인다. 본 발명의 작용 원리에 관한 어떠한 특정 이론에 얽매이고자 하는 의도가 아니라, 단지 발명의 이해를 돕기 위하여 설명을 해 보자면 면역글로불린 Fc와 이미글루세라제가 공유 결합됨에 따라 이미글루세라제 부위가 입체장애(steric hindrance)를 받아 수용체에 대한 결합 속도 상수(association rate constant, ka)가 감소하였기 때문인 것으로 보여진다. 한 번 결합된 지속형 결합체의 경우 수용체에서 해리 속도 상수(dissociation rate constant, kd)는 결합체를 형성하지 않은 유리 이미글루세라제와 차이가 없음을 확인하였다 (표 3).
시험물질 ka (1/Ms, X105) kd(1/s, X10-3) KD(nM)
이미글루세라제 2.32 ± 0.68 3.87 ± 0.46 17.3 ± 0.35
이미글루세라제 지속형 결합체 0.49 ± 0.00 3.90 ± 0.16 79.6 ± 0.33
본 발명의 이미글루세라제 지속형 결합체의 활성을 확인한 결과를 정리하면 하기와 같다.
In vitro activity (vs. 1st ERT)
효소 활성 M6PR 결합력
93% 22%
실시예 7: 갈설파제 효소 결합체의 활성 확인
실시예 7-1: 갈설파제 지속형 결합체의 In vitro 효소 활성
갈설파제 (Galsulfase, 대조군)와 상기에서 제조한 갈설파제 지속형 결합체 (시험군)의 시험관 효소 활성을 비교하였다.
구체적으로, 효소 활성 측정을 위하여 4-Methylumbelliferyl sulfate (4-MUS) 가 기질로서 사용되었고, 37℃ 에서 20분간 효소작용에 따라 생성된 4-Methylumbelliferone (4-MU) 에 대해 형광을 측정함으로써 해당물징에 대한 효소 활성을 측정하였다.
그 결과, 갈설파제와 갈설파제 지속형 결합체의 효소 활성은 각각 72.3, 81.3 μmole/min/mg 임을 확인하였다. 결론적으로 대조군 대비, 갈설파제 지속형 결합체의 효소 활성이 112% 로 면역글로불린 Fc 결합에 따른 효소활성 감소가 없는 것을 확인하였다 (도5).
실시예 7-2: 갈설파제 지속형 결합체의 M6P 수용체 결합력 확인
M6PR에 대한 결합력을 확인하기 위해 SPR(surface Plasmon resonance, BIACORE T200)을 이용하여 갈설파제 (Galsulfase, 대조군)와 상기에서 제조한 갈설파제 지속형 결합체 (시험군) 의 결합력을 확인하였다.
구체적으로, M6PR은 Rnd systems에서 구매하였고, CM5칩에 아민 결합법을 이용하여 고정화시킨 후, 시험물질을 100nM 내지 6.24nM 사이의 농도로 흘려 그 결합력을 확인하였다.
pH7.5 의 헤페스버퍼(HBS-EP)를 기본버퍼(running buffer)로 사용하였고, 모든 시험물질은 기본 버퍼로 희석하여 결함을 유도하고 해리 또한 기본버퍼로 진행하였다. 칩에 고정화된 M6PR에 시험물질을 10분간 흘려 결합을 유도하였고, 그 후 6분간 해리 과정을 거쳤다. 그 후 다른 농도의 대조군 또는 시험군을 결합시키기 위하여 M6PR에 결합되어있는 결합체에 5mM NaoH/50mM NaCl 을 약 30초간 흘려주었다. M6PR와 갈설파제 또는 갈설파제 지속형 결합체 간의 결합력은 BIAevaluation 프로그램을 이용하여 분석하였다. Ka(association rate constant), Kd (dissociation rate constant) 및 KD (affinity constant)는 1:1 Langmuir binding model을 이용하여 산출하였다.
그 결과, 면역글로불린 Fc 결합에 따라 해리 상수는 큰 차이가 없으나 결합상수에 차이가 생기는 것을 확인하였다. 이에 대조군 대비하여 시험군의 결합력이 25% 가량으로 감소되는 결과를 나타내었다 (표 5). 갈설파제 지속형 결합체의 M6PR에 대한 결합력이 상대적으로 낮은 것은 생리 활성 폴리펩타이드가 Fc 영역과 융합 단백질을 형성하면서 통상적으로 자체 수용체에 대한 결합력이 떨어지는 경향을 나타내는 것과 같은 원인으로 보인다. 본 발명의 작용 원리에 관한 어떠한 특정 이론에 얽매이고자 하는 의도가 아니라, 단지 발명의 이해를 돕기 위하여 설명을 해 보자면 면역글로불린 Fc와 갈설파제가 공유 결합됨에 따라 갈설파제 부위가 입체장애(steric hindrance)를 받아 수용체에 대한 결합 속도 상수(association rate constant, ka)가 감소하였기 때문인 것으로 보여진다. 한 번 결합된 지속형 결합체의 경우 수용체에서 해리 속도 상수(dissociation rate constant, kd)는 결합체를 형성하지 않은 유리 갈설파제와 차이가 없음을 확인하였다 (표 5).
시험물질 ka (1/Ms, X105) kd(1/s, X10-3) KD(nM)
갈설파제 34.9 ± 3.7 1.30 ± 0.00 0.38 ± 0.04
갈설파제 지속형 결합체 8.32 ± 0.80 1.22± 0.01 1.48 ± 0.15
본 발명의 갈설파제 지속형 결합체의 활성을 확인한 결과는 하기와 같다.
In vitro activity (vs. 1st ERT)
효소 활성 M6PR 결합력
112% 25%
실시예 8: 이두로니다제 효소 결합체의 활성 확인
실시예 8-1: 이두로니다제 지속형 결합체의 In vitro 효소 활성
이두로니다제 지속형 결합체 제조에 따른 효소활성 변화를 측정하고자 in vitro 시험관 효소활성 측정을 진행하였다.
구체적으로, 효소기질로 알려진 4-methylumbelliferyl alpha-L-iduronide (4-MUI)를 이두로니다제 (Iduronidase) 및 이두로니다제 지속형 결합체와 37 ℃에서 30분간 반응하였다. 최종적으로 생성되는 4-Methylumbelliferone (4MU) 에 대한 형광을 측정함으로써 해당물질에 대한 효소활성을 측정하였다.
그 결과, 이두로니다제와 이두로니다제 지속형 결합체의 효소 활성 (specific activity)이 각각 127.5±15.8, 132.2±24.3 μmol/min/mg 임을 확인하였다. 결론적으로 이두로니다제 대비, 이두로니다제 지속형 결합체의 효소 활성이 105.7±32.2%로 지속형 결합체 제조에 의한 결합 (conjugation) 에 따른 효소활성 감소가 없는 것을 확인하였다 (도6).
실시예 8-2: 이두로니다제 지속형 결합체의 M6P 수용체 결합력 확인
M6PR에 대한 결합력을 확인하기 위해 SPR(surface Plasmon resonance, BIACORE T200)을 이용하여 이두로니다제 (Iduronidase, 대조군) 와 상기에서 제조한 이두로니다제 지속형 결합체 (시험군)의 결합력을 확인하였다.
구체적으로, M6PR은 Rnd systems에서 구매하였고, CM5칩에 아민 결합법을 이용하여 고정화시킨 후, 대조군은 50nM내지 3.125nM 사이의 농도로, 시험군은 100nM내지 6.25nM 사이의 농도로 흘려 그 결합력을 확인하였다.
pH7.5 의 헤페스버퍼(HBS-EP)를 기본버퍼(running buffer)로 사용하였고, 모든 시험물질은 기본 버퍼로 희석하여 결함을 유도하고 해리 또한 기본버퍼로 진행하였다. 칩에 고정화된 M6PR에 시험물질을 10분간 흘려 결합을 유도하였고, 그 후 6분간 해리 과정을 거쳤다. 그 후 다른 농도의 대조군 또는 시험군을 결합시키기 위하여 M6PR에 결합되어있는 결합체에 5mM NaoH/50mM NaCl 을 약 30초간 흘려주었다. M6PR와 이두로니다제 또는 이두로니다제 지속형 결합체 간의 결합력은 BIAevaluation 프로그램을 이용하여 분석하였다. Ka(association rate constant), Kd (dissociation rate constant) 및 KD (affinity constant)는 1:1 Langmuir binding model을 이용하여 산출하였다.
그 결과, 면역글로불린 Fc 결합에 따라 해리상수와 결합상수 모두에 차이가 생기는 것을 확인하였다. 이에 대조군 대비하여 시험군의 결합력이 13% 가량으로 감소되는 결과를 나타내었다.
이두로니다제 지속형 결합체의 M6PR에 대한 결합력이 상대적으로 낮은 것은 생리 활성 폴리펩타이드가 Fc 영역과 융합 단백질을 형성하면서 통상적으로 자체 수용체에 대한 결합력이 떨어지는 경향을 나타내는 것과 같은 원인으로 보인다. 본 발명의 작용 원리에 관한 어떠한 특정 이론에 얽매이고자 하는 의도가 아니라, 단지 발명의 이해를 돕기 위하여 설명을 해 보자면 면역글로불린 Fc와 이두로니다제가 공유 결합됨에 따라 이두로니다제 부위가 입체장애(steric hindrance)를 받아 수용체에 대한 결합 속도 상수(association rate constant, ka)가 감소하였기 때문인 것으로 보여진다. (표 7).
시험물질 ka (1/Ms, X105) kd(1/s, X10-3) KD(nM)
이두로니다제 169.3 ± 22.1 5.65 ± 4.50 0.59 ± 0.34
이두로니다제 지속형 결합체 4.74 ± 0.37 2.23 ± 0.14 4.72 ± 0.40
본 발명의 실시예에서 제조한 이두로니나제 지속형 결합체의 활성을 확인한 결과는 하기와 같다.
In vitro activity (vs. 1st ERT)
효소 활성 M6PR 결합력
114% 13%
상기와 같은 결과들은 본 발명의 효소 결합체들이 기존의 다른 치료적 효소에 비하여 세포외배출, 체내 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성이 우수하여, 리소좀 축적 질환의 획기적인 치료제로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (73)

  1. 리소좀 축적병 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 치료학적 효소와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된, 효소 결합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 효소는 베타-글루코시다제(beta-glucosidase) , 베타-갈락토시다제 (beta-galactosidase), 갈락토스-6-설파타제(Galactose-6-sulfatase), 산성 세라미다제(acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제(acid sphingomyelinase), 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidsase), 아릴설파타제 A(arylsulfatase A), 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) A, 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) B, 헤파린-N-설파타제(heparin N-sulfatase), 알파-D-만노시다제(alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제(lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제(alpha-N-acetyl-glucosaminidase, NAGLU), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 리파아제(lipase), 우리카제(Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제(Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase), 아세틸-CoA-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라제 (Acetyl-CoA-glucosaminide N-acetyltransferse), N-아세틸글루코사민-6-설파타제 (N-acetylglucosamine-6-sulfatase), 갈락토사민 6-설파타제 (galactosamine 6-sulfatase, GALN), 아릴설파타제 B (arylsulfatase B, ARSB), 히알루로니다제 (hyaluronidase), 알파-푸코시다제 (α-fucosidase), 베타-만노시다제 (β-mannosidase), 알파-뉴라미니다제 (α-neuraminidase, sialidase), N-아세틸-글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제 (N-acetyl-glucosamine-1-phosphotransferase), 뮤코리핀-1 (mucolipin-1), 알파-N-아세틸-갈락토사미니다제 (α-N-acetyl-galactosaminidase), N-아스파르틸-베타-글루코사미니다제 (N-aspartyl-β-glucosaminidase), LAMP-2, 시스티노신 (Cystinosin), 시알린 (Sialin), 세라미다제 (ceramidase), 산성-베타-글루코시다제 (acid-β-glucosidase), 갈락토실세라미다제 (galactosylceramidase), NPC1, 카텝신 A (cathepsin A, protective protein), SUMF-1, 리소좀 산성 리파제 (lysosomal acid lipase, LIPA), 및 트리펩티딜 펩티다제 1 (Tripeptidyl peptidase 1)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 효소 결합체.
  3. 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase) A와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된, 효소 결합체.
  4. 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 아릴설파타제 B (arylsulfatase B, ARSB)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된, 효소 결합체.
  5. 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이두로니다제 (iduronidase)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된, 효소 결합체.
  6. 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된, 효소 결합체.
  7. 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이미글루세라제(imiglucerase)와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체 연결부를 통하여 연결된, 효소 결합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리소좀 축적 질환은 뮤코다당체침작증 (mucopolysaccharidosis, MPS), 글리코겐 축적병(Glycogen storage disease), 및 스핑고지질증 (sphingolipidosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 효소 결합체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 뮤코다당체침작증은 MPS Ⅰ(mucopolysaccharidosis Ⅰ), 및 MPS Ⅵ(mucopolysaccharidosis Ⅵ)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 효소 결합체.
  10. 제8항에 있어서, 상기 글리코겐 축적병은 폼페병 (Pompe disease)인 것인, 효소 결합체.
  11. 제8항에 있어서, 상기 스핑고지질증은 파브리병(Fabry disease), 및 고셰병(Gaucher's disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 효소 결합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효소 결합체는 면역글로불린 Fc 영역이 결합하지 않은 효소 보다 세포외배출 (transcytosis), 및 생체 이용율 (bioavailability, BA)이 증가된 것인, 효소 결합체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 세포외배출은 면역글로불린 Fc 영역과 FcRn (neonatal Fc receptor)와의 결합에 의한 것인, 효소 결합체.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효소 결합체는 면역글로불린 Fc 영역이 결합하지 않은 효소 보다 조직 분포성 (tissue distribution)이 증가된 것인, 효소 결합체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 효소 결합체는 면역글로불린 Fc 영역이 결합하지 않은 효소 보다 골수 표적성이 증가된 것인, 효소 결합체.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것인, 효소 결합체.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 효소 결합체.
  18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지영역을 추가로 포함하는 것인, 효소 결합체.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 면역글로불린 Fc 단편인 효소 결합체.
  20. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 것인, 효소 결합체.
  21. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 것인, 효소 결합체.
  22. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 단편인 것인, 효소 결합체.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 단편인 것인, 효소 결합체.
  24. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효소 결합체는 효소의 N-말단에 비펩타이드성 중합체 연결부가 결합된 것인, 효소 결합체.
  25. 제1항 또는 제2항의 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  26. 제3항의 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  27. 제4항의 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  28. 제5항의 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  29. 제6항의 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  30. 제7항의 효소 결합체를 포함하는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성을 증가시키는 것인, 약학적 조성물.
  32. (a) 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 치료학적 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및
    (b) 상기 효소와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 이의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 효소 결합체를 제조하는 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 효소는 베타-글루코시다제(beta-glucosidase) , 베타-갈락토시다제 (beta-galactosidase), 갈락토스-6-설파타제(Galactose-6-sulfatase), 산성 세라미다제(acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제(acid sphingomyelinase), 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidsase), 아릴설파타제 A(arylsulfatase A), 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) A, 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) B, 헤파린-N-설파타제(heparin N-sulfatase), 알파-D-만노시다제(alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제(lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제(alpha-N-acetyl-glucosaminidase, NAGLU), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 리파아제(lipase), 우리카제(Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제(Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase), 아세틸-CoA-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라제 (Acetyl-CoA-glucosaminide N-acetyltransferse), N-아세틸글루코사민-6-설파타제 (N-acetylglucosamine-6-sulfatase), 갈락토사민 6-설파타제 (galactosamine 6-sulfatase, GALN), 아릴설파타제 B (arylsulfatase B, ARSB), 히알루로니다제 (hyaluronidase), 알파-푸코시다제 (α-fucosidase), 베타-만노시다제 (β-mannosidase), 알파-뉴라미니다제 (α-neuraminidase, sialidase), N-아세틸-글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제 (N-acetyl-glucosamine-1-phosphotransferase), 뮤코리핀-1 (mucolipin-1), 알파-N-아세틸-갈락토사미니다제 (α-N-acetyl-galactosaminidase), N-아스파르틸-베타-글루코사미니다제 (N-aspartyl-β-glucosaminidase), LAMP-2, 시스티노신 (Cystinosin), 시알린 (Sialin), 세라미다제 (ceramidase), 산성-베타-글루코시다제 (acid-β-glucosidase), 갈락토실세라미다제 (galactosylceramidase), NPC1, 카텝신 A (cathepsin A, protective protein), SUMF-1, 리소좀 산성 리파제 (lysosomal acid lipase, LIPA), 및 트리펩티딜 펩티다제 1 (Tripeptidyl peptidase 1)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 효소 결합체를 제조하는 방법.
  34. (a) 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및
    (b) 상기 효소와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 효소 결합체를 제조하는 방법.
    [화학식1]
    X-La-F
    여기서, X는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase) A 효소이고;
    L은 비펩타이드성 중합체이며;
    a는 0 또는 자연수이고, 다만 a가 2이상 일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고,
    F는 X의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
  35. (a) 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 아릴설파타제 B(arylsulfatase B, ARSB) 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및
    (b) 상기 효소와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 효소 결합체를 제조하는 방법.
    [화학식1]
    X-La-F
    여기서, X는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 아릴설파타제 B(arylsulfatase B, ARSB) 효소이고;
    L은 비펩타이드성 중합체이며;
    a는 0 또는 자연수이고, 다만 a가 2이상 일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고,
    F는 X의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
  36. (a) 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이두로니다제(iduronidase) 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및
    (b) 상기 효소와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 효소 결합체를 제조하는 방법.
    [화학식1]
    X-La-F
    여기서, X는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이두로니다제(iduronidase) 효소이고;
    L은 비펩타이드성 중합체이며;
    a는 0 또는 자연수이고, 다만 a가 2이상 일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고,
    F는 X의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
  37. (a) 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase) 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및
    (b) 상기 효소와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 효소 결합체를 제조하는 방법.
    [화학식1]
    X-La-F
    여기서, X는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase) 효소이고;
    L은 비펩타이드성 중합체이며;
    a는 0 또는 자연수이고, 다만 a가 2이상 일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고,
    F는 X의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
  38. (a) 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이미글루세라제(imiglucerase) 효소와 비펩타이드성 중합체를 연결하는 단계; 및
    (b) 상기 효소와 비펩타이드성 중합체가 연결된 연결체를 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 생체적합성 물질과 연결하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 효소 결합체를 제조하는 방법.
    [화학식1]
    X-La-F
    여기서, X는 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD) 치료를 위한 이미글루세라제(imiglucerase) 효소이고;
    L은 비펩타이드성 중합체이며;
    a는 0 또는 자연수이고, 다만 a가 2이상 일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고,
    F는 X의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
  39. 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 F는 고분자 중합체, 지방산, 콜레스테롤, 알부민 및 이의 단편, 알부민 결합물질, 특정 아미노산 서열의 반복단위의 중합체, 항체, 항체 단편, FcRn 결합물질, 생체 내 결합조직, 뉴클레오타이드, 파이브로넥틴, 트랜스페린(Transferrin), 사카라이드(saccharide), 헤파린, 및 엘라스틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 효소 결합체를 제조하는 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 FcRn 결합 물질은 면역글로불린 Fc 영역인 것인, 효소 결합체를 제조하는 방법
  41. 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 효소 결합체를 제조하는 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜인 것인, 효소 결합체를 제조하는 방법.
  43. 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 비펩타이드성 중합체의 반응기는 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석신이미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 효소 결합체를 제조하는 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    상기 알데히드 그룹은 프로피온 알데히드 그룹 또는 부틸 알데히드 그룹인 것인, 효소 결합체를 제조하는 방법.
  45. 제43항에 있어서,
    상기 석신이미드 유도체는 석신이미딜 카르복시메틸, 석신이미딜 발레르에이트, 석신이미딜 메틸부타노에이트, 석신이미딜 메틸프로피온에이트, 석신이미딜 부타노에이트, 석신이미딜 프로피온에이트, N-하이드록시석신이미드인 또는 석신이미딜 카보네이트인 것인, 효소 결합체를 제조하는 방법.
  46. 제43항에 있어서,
    상기 비펩타이드성 중합체는 말단에 알데히드 그룹 반응기를 갖는 것인, 효소 결합체를 제조하는 방법.
  47. 제43항에 있어서,
    상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데히드 그룹 및 말레이미드 반응기를 갖는 것인, 효소 결합체를 제조하는 방법.
  48. 제43항에 있어서,
    상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데히드 그룹 및 석시니미드 반응기를 갖는 것인, 효소 결합체를 제조하는 방법.
  49. 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효소의 N-말단에 비펩타이드성 중합체 연결부가 결합된 결합체를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 효소 결합체를 제조하는 방법.
  50. 제1항 또는 제2항의 효소 결합체를 포함하는, 효소의 세포외배출(transcytosis) 증가용 조성물.
  51. 제1항 또는 제2항의 효소 결합체를 포함하는, 효소의 조직 분포성(tissue distribution) 증가용 조성물.
  52. 제3항의 효소 결합체를 포함하는, 효소의 세포외배출(transcytosis) 증가용 조성물.
  53. 제3항의 효소 결합체를 포함하는, 효소의 조직 분포성(tissue distribution) 증가용 조성물.
  54. 제4항의 효소 결합체를 포함하는, 효소의 세포외배출(transcytosis) 증가용 조성물.
  55. 제4항의 효소 결합체를 포함하는, 효소의 조직 분포성(tissue distribution) 증가용 조성물.
  56. 제5항의 효소 결합체를 포함하는, 효소의 세포외배출(transcytosis) 증가용 조성물.
  57. 제5항의 효소 결합체를 포함하는, 효소의 조직 분포성(tissue distribution) 증가용 조성물.
  58. 제6항의 효소 결합체를 포함하는, 효소의 세포외배출(transcytosis) 증가용 조성물.
  59. 제6항의 효소 결합체를 포함하는, 효소의 조직 분포성(tissue distribution) 증가용 조성물.
  60. 제7항의 효소 결합체를 포함하는, 효소의 세포외배출(transcytosis) 증가용 조성물.
  61. 제7항의 효소 결합체를 포함하는, 효소의 조직 분포성(tissue distribution) 증가용 조성물.
  62. 제1항 또는 제2항의 효소 결합체를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 세포외배출(transcytosis)을 증가시키는 방법.
  63. 제1항 또는 제2항의 효소 결합체를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 조직 분포성(tissue distribution)을 증가시키는 방법.
  64. 제3항의 효소 결합체를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 세포외배출(transcytosis)을 증가시키는 방법.
  65. 제3항의 효소 결합체를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 조직 분포성(tissue distribution)을 증가시키는 방법.
  66. 제4항의 효소 결합체를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 세포외배출(transcytosis)을 증가시키는 방법.
  67. 제4항의 효소 결합체를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 조직 분포성(tissue distribution)을 증가시키는 방법.
  68. 제5항의 효소 결합체를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 세포외배출(transcytosis)을 증가시키는 방법.
  69. 제5항의 효소 결합체를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 조직 분포성(tissue distribution)을 증가시키는 방법.
  70. 제6항의 효소 결합체를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 세포외배출(transcytosis)을 증가시키는 방법.
  71. 제6항의 효소 결합체를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 조직 분포성(tissue distribution)을 증가시키는 방법.
  72. 제7항의 효소 결합체를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 세포외배출(transcytosis)을 증가시키는 방법.
  73. 제7항의 효소 결합체를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 효소의 조직 분포성(tissue distribution)을 증가시키는 방법.
PCT/KR2017/001016 2016-01-29 2017-01-31 치료학적 효소류의 결합체 Ceased WO2017131496A1 (ko)

Priority Applications (18)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/073,598 US10918736B2 (en) 2016-01-29 2017-01-31 Conjugate of therapeutic enzymes
EA201891573A EA201891573A1 (ru) 2016-01-29 2017-01-31 Конъюгат терапевтических ферментов
CR20180393A CR20180393A (es) 2016-01-29 2017-01-31 Conjugados de enzimas terapéuticas
SG11201806502UA SG11201806502UA (en) 2016-01-29 2017-01-31 Conjugate of therapeutic enzymes
BR112018015603-5A BR112018015603A2 (ko) 2016-01-29 2017-01-31 Conjugate of therapeutic enzymes
MX2018009266A MX2018009266A (es) 2016-01-29 2017-01-31 Conjugado de enzimas terapeuticas.
MA43082A MA43082A1 (fr) 2016-01-29 2017-01-31 Conjugue d'enzymes thérapeutiques
CA3012982A CA3012982A1 (en) 2016-01-29 2017-01-31 Conjugate of therapeutic enzymes
EP17744617.6A EP3409771A4 (en) 2016-01-29 2017-01-31 COUPLING ASSEMBLY FOR THERAPEUTIC ENZYMES
JP2018539850A JP7356222B2 (ja) 2016-01-29 2017-01-31 治療学的酵素類の結合体
TNP/2018/000270A TN2018000270A1 (en) 2016-01-29 2017-01-31 Conjugate of therapeutic enzymes.
AU2017210871A AU2017210871A1 (en) 2016-01-29 2017-01-31 Coupling assembly for therapeutic enzymes
HK18116519.8A HK1257558A1 (en) 2016-01-29 2017-01-31 Coupling assembly for therapeutic enzymes
CN201780020861.8A CN108884455A (zh) 2016-01-29 2017-01-31 治疗酶的偶联装配体
PH12018501612A PH12018501612A1 (en) 2016-01-29 2018-07-30 Conjugate of therapeutic enzymes
ZA2018/05634A ZA201805634B (en) 2016-01-29 2018-08-23 Conjugate of therapeutic enzymes
CONC2018/0008427A CO2018008427A2 (es) 2016-01-29 2018-08-29 Conjugado de enzimas terapéuticas
JP2021200694A JP2022046524A (ja) 2016-01-29 2021-12-10 治療学的酵素類の結合体

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20160011886 2016-01-29
KR10-2016-0011886 2016-01-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017131496A1 true WO2017131496A1 (ko) 2017-08-03

Family

ID=59398822

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2017/001016 Ceased WO2017131496A1 (ko) 2016-01-29 2017-01-31 치료학적 효소류의 결합체

Country Status (23)

Country Link
US (1) US10918736B2 (ko)
EP (1) EP3409771A4 (ko)
JP (2) JP7356222B2 (ko)
KR (1) KR102946363B1 (ko)
CN (1) CN108884455A (ko)
AR (2) AR107483A1 (ko)
AU (1) AU2017210871A1 (ko)
BR (1) BR112018015603A2 (ko)
CA (1) CA3012982A1 (ko)
CL (2) CL2018002045A1 (ko)
CO (1) CO2018008427A2 (ko)
CR (1) CR20180393A (ko)
EA (1) EA201891573A1 (ko)
EC (1) ECSP18062538A (ko)
HK (1) HK1257558A1 (ko)
MA (1) MA43082A1 (ko)
MX (1) MX2018009266A (ko)
PH (1) PH12018501612A1 (ko)
SG (1) SG11201806502UA (ko)
TN (1) TN2018000270A1 (ko)
TW (1) TW201729846A (ko)
WO (1) WO2017131496A1 (ko)
ZA (1) ZA201805634B (ko)

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018105988A1 (ko) 2016-12-05 2018-06-14 한미약품 주식회사 면역반응이 약화된 결합체
US10870837B2 (en) 2017-10-02 2020-12-22 Denali Therapeutics Inc. Fusion proteins comprising enzyme replacement therapy enzymes
US11103596B2 (en) 2015-05-11 2021-08-31 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
US12215138B2 (en) 2017-06-07 2025-02-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
US12221638B2 (en) 2020-08-07 2025-02-11 Alteogen Inc. Method for producing recombinant hyaluronidase
US12252544B2 (en) 2018-05-17 2025-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-CD63 antibodies, conjugates, and uses thereof
US12258597B2 (en) 2018-02-07 2025-03-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for therapeutic protein delivery
US12297257B2 (en) 2015-07-06 2025-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
US12371683B2 (en) 2018-07-25 2025-07-29 Alteogen Inc. Hyaluronidase variants and pharmaceutical composition comprising the same
RU2857183C2 (ru) * 2020-09-16 2026-02-27 Ханми Файн Кемикал Ко., Лтд. Производное полиэтиленгликоля, композиция, содержащая такое производное, и способ получения конъюгата биоактивного полипептида с использованием такого производного
US12565526B2 (en) 2018-10-18 2026-03-03 Merck Sharpe & Dohme LLC Formulations of anti-RSV antibodies and methods of use thereof
US12570766B2 (en) 2019-03-25 2026-03-10 Alteogen Inc. Pharmaceutical composition for subcutaneous administration containing human hyaluronidase PH20 variant and drug
US12576159B2 (en) 2018-10-31 2026-03-17 Merck Sharp & Dohme Llc Anti-human PD-1 antibody crystals and methods of use thereof
EP4493163A4 (en) * 2022-03-15 2026-04-29 Green Cross Corp LYOPHILIZED FORMULATION COMPRISING A FUSION PROTEIN INCLUDING A-GALACTOSIDASE A

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR107483A1 (es) * 2016-01-29 2018-05-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de enzimas terapéuticas
CN109641038A (zh) 2016-07-01 2019-04-16 小利兰·斯坦福大学理事会 靶向细胞表面编辑的共轭物
AU2018295994B2 (en) * 2017-07-07 2025-02-06 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Novel therapeutic enzyme fusion protein and use thereof
WO2019124973A1 (ko) * 2017-12-19 2019-06-27 재단법인 목암생명과학연구소 알부민 및 리소좀 효소를 포함하는 단백질 접합체 및 융합단백질
CN111511910B (zh) * 2017-12-22 2024-11-08 韩美药品株式会社 具有新颖结构的治疗酶融合蛋白及其用途
EP3735458A4 (en) 2018-01-03 2022-04-27 Palleon Pharmaceuticals Inc. RECOMBINANT HUMAN SIALIDASES, SIALIDASE FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE THEREOF
EP3876990A4 (en) 2018-11-07 2023-09-06 Merck Sharp & Dohme LLC CO-FORMULATIONS OF ANTI-LAG3 ANTIBODIES AND ANTI-PD-1 ANTIBODIES
KR20210100794A (ko) 2020-02-06 2021-08-18 삼성디스플레이 주식회사 표시 모듈 가공 장치 및 표시 모듈 가공 방법
EP4229192A1 (en) 2020-10-14 2023-08-23 Denali Therapeutics Inc. Fusion proteins comprising sulfoglucosamine sulfohydrolase enzymes and methods thereof
US20230416714A1 (en) * 2020-11-13 2023-12-28 Hanmi Pharm. Co., Ltd Use of therapeutic enzyme fusion protein in prevention and treatment of neuropathy caused by or accompanied by fabry disease
AU2021378707A1 (en) * 2020-11-13 2023-06-01 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Use of therapeutic enzyme fusion protein in prevention and treatment of renal diseases caused by or accompanied by Fabry disease
CA3250114A1 (en) * 2022-01-28 2023-08-03 Sigilon Therapeutics, Inc. THERAPIES FOR MUCOPOLYSACCHARIDOSE TYPE 6
TW202542190A (zh) 2023-12-20 2025-11-01 美商戴納立製藥公司 包含酸性α—葡萄糖苷酶之融合蛋白及其方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020010363A (ko) * 2000-07-29 2002-02-04 박명옥 고반응성의 가지 달린 고분자 유도체 및 고분자와 단백질또는 펩타이드의 접합체
KR100754667B1 (ko) * 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
KR20140037961A (ko) * 2007-05-30 2014-03-27 주식회사 제넥신 면역글로불린 융합 단백질
KR20150008011A (ko) * 2013-07-12 2015-01-21 한미약품 주식회사 FcRn 결합력이 유지되는 면역글로불린 Fc 결합체

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
JP4046354B2 (ja) 1996-03-18 2008-02-13 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン
ES2383300T3 (es) * 2003-11-13 2012-06-20 Hanmi Holdings Co., Ltd Fragmento Fc de IgG para un vehículo de fármacos y procedimiento para su preparación
SI2995306T1 (sl) 2009-10-19 2019-04-30 Amicus Therapeutics, Inc. Novi sestavki za preprečevanje in/ali zdravljenje motenj lizosomskega shranjevanja
KR101987736B1 (ko) 2011-03-18 2019-06-11 젠자임 코포레이션 글루코실세라마이드 합성효소 억제제
KR102041412B1 (ko) 2011-12-30 2019-11-11 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 Ｆｃ 단편 유도체
KR101895634B1 (ko) * 2013-05-31 2018-09-05 한미약품 주식회사 변이된 힌지 영역을 포함하는 IgG4 Fc 단편
WO2015009052A1 (ko) 2013-07-16 2015-01-22 일동제약 주식회사 하이브리드 면역글로불린 fc와 효소의 융합단백질
CN105745326A (zh) * 2013-10-24 2016-07-06 优尼科Ip有限公司 用于基因治疗神经疾病的aav-5假型载体
AR107483A1 (es) * 2016-01-29 2018-05-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de enzimas terapéuticas

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020010363A (ko) * 2000-07-29 2002-02-04 박명옥 고반응성의 가지 달린 고분자 유도체 및 고분자와 단백질또는 펩타이드의 접합체
KR100754667B1 (ko) * 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
KR20140037961A (ko) * 2007-05-30 2014-03-27 주식회사 제넥신 면역글로불린 융합 단백질
KR20150008011A (ko) * 2013-07-12 2015-01-21 한미약품 주식회사 FcRn 결합력이 유지되는 면역글로불린 Fc 결합체

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BECK, MICHAEL: "New Therapeutic Options for Lysosomal Storage Disorders: Enzyme Replacement, Small Molecules and Gene Therapy", HUMAN GENETICS, vol. 121, no. 1, 2007, pages 1 - 22, XP002575043 *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12370268B2 (en) 2015-05-11 2025-07-29 Ucl Business Ltd Fabry disease gene therapy
US11103596B2 (en) 2015-05-11 2021-08-31 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
US12297257B2 (en) 2015-07-06 2025-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
WO2018105988A1 (ko) 2016-12-05 2018-06-14 한미약품 주식회사 면역반응이 약화된 결합체
US12215138B2 (en) 2017-06-07 2025-02-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
US11866742B2 (en) 2017-10-02 2024-01-09 Denali Therapeutics Inc. Fusion proteins comprising enzyme replacement therapy enzymes
US10870837B2 (en) 2017-10-02 2020-12-22 Denali Therapeutics Inc. Fusion proteins comprising enzyme replacement therapy enzymes
US12258597B2 (en) 2018-02-07 2025-03-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for therapeutic protein delivery
US12252544B2 (en) 2018-05-17 2025-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-CD63 antibodies, conjugates, and uses thereof
US12371683B2 (en) 2018-07-25 2025-07-29 Alteogen Inc. Hyaluronidase variants and pharmaceutical composition comprising the same
US12565526B2 (en) 2018-10-18 2026-03-03 Merck Sharpe & Dohme LLC Formulations of anti-RSV antibodies and methods of use thereof
US12576159B2 (en) 2018-10-31 2026-03-17 Merck Sharp & Dohme Llc Anti-human PD-1 antibody crystals and methods of use thereof
US12570766B2 (en) 2019-03-25 2026-03-10 Alteogen Inc. Pharmaceutical composition for subcutaneous administration containing human hyaluronidase PH20 variant and drug
US12618055B2 (en) 2020-01-23 2026-05-05 Alteogen Inc. Hyaluronidase variants with improved stability and pharmaceutical composition comprising the same
US12221638B2 (en) 2020-08-07 2025-02-11 Alteogen Inc. Method for producing recombinant hyaluronidase
RU2857183C2 (ru) * 2020-09-16 2026-02-27 Ханми Файн Кемикал Ко., Лтд. Производное полиэтиленгликоля, композиция, содержащая такое производное, и способ получения конъюгата биоактивного полипептида с использованием такого производного
EP4493163A4 (en) * 2022-03-15 2026-04-29 Green Cross Corp LYOPHILIZED FORMULATION COMPRISING A FUSION PROTEIN INCLUDING A-GALACTOSIDASE A

Also Published As

Publication number Publication date
MA43082A1 (fr) 2018-10-31
TW201729846A (zh) 2017-09-01
JP7356222B2 (ja) 2023-10-04
US10918736B2 (en) 2021-02-16
AR120515A2 (es) 2022-02-23
SG11201806502UA (en) 2018-08-30
KR20170091056A (ko) 2017-08-08
ECSP18062538A (es) 2018-09-30
CO2018008427A2 (es) 2018-10-31
TN2018000270A1 (en) 2020-01-16
US20190046657A1 (en) 2019-02-14
CA3012982A1 (en) 2017-08-03
EP3409771A4 (en) 2019-10-23
CR20180393A (es) 2019-02-12
EA201891573A1 (ru) 2019-02-28
ZA201805634B (en) 2019-06-26
HK1257558A1 (en) 2019-10-25
JP2022046524A (ja) 2022-03-23
JP2019506164A (ja) 2019-03-07
PH12018501612A1 (en) 2019-04-08
KR102946363B1 (ko) 2026-04-01
MX2018009266A (es) 2019-01-10
CN108884455A (zh) 2018-11-23
AR107483A1 (es) 2018-05-02
EP3409771A1 (en) 2018-12-05
BR112018015603A2 (ko) 2018-12-26
CL2020001857A1 (es) 2020-10-02
CL2018002045A1 (es) 2018-08-31
AU2017210871A1 (en) 2018-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017131496A1 (ko) 치료학적 효소류의 결합체
WO2017116205A1 (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체의 지속형 결합체
WO2018117613A1 (ko) 뇌 표적 지속성 단백질 결합체
WO2010123290A2 (ko) 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 단백질 또는 펩티드 융합체, 및 이를 이용하여 체내 반감기를 증가시키는 방법
WO2017052329A1 (en) Protein complex by use of a specific site of an immunoglobulin fragment for linkage
WO2017003191A1 (en) Glucagon derivative and a composition comprising a long acting conjugate of the same
WO2018004283A2 (ko) 글루카곤 유도체, 이의 결합체, 및 이를 포함하는 조성물, 및 이의 치료적 용도
WO2020130749A1 (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체 및 인슐린을 포함하는 약학 조성물
WO2019190293A1 (ko) 뇌 표적 지속성 단백질 결합체, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 조성물
WO2018143729A1 (ko) 지속성이 증가된 생리활성 물질의 결합체 및 이의 용도
WO2013051900A2 (en) Blood coagulation factor ⅶ and ⅶa derivatives, conjugates and complexes comprising the same, and use thereof
WO2017116207A1 (ko) Fgf21 아날로그, fgf21 결합체, 및 이의 용도
WO2021066600A1 (ko) 글루카곤, 및 glp-1 수용체 및 gip 수용체 이중 작용제를 포함하는 조성물 및 이의 치료학적 용도
WO2019066586A1 (ko) 글루카곤 유사 펩타이드-2(glp-2) 유도체의 지속형 결합체
WO2020071865A1 (ko) 글루카곤 및 이를 포함하는 조합물의 치료학적 용도
WO2019066570A1 (ko) 지속형 단쇄 인슐린 아날로그 및 이의 결합체
WO2022211537A1 (ko) 신규한 면역 활성 인터루킨 2 아날로그 결합체 및 이의 제조 방법
WO2022139538A1 (ko) 신규한 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중활성체 및 이의 용도
WO2021235913A1 (ko) Glp-2의 지속형 결합체의 액상 제제
WO2022035302A1 (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체를 포함하는 혈압 강하용 약학 조성물
WO2018174668A2 (ko) 인슐린 수용체와의 결합력이 감소된 인슐린 아날로그의 결합체 및 이의 용도
WO2019022563A2 (ko) 이두로네이트 2-설파타제 결합체
WO2021010532A1 (ko) 신규 중간체 제조를 통한 지속형 약물 결합체의 제조 방법
WO2016195394A1 (ko) 효모 세포벽 만노단백질 유래의 당사슬을 이용한 만노스-6-인산 당사슬이 부가된 당단백질의 제조방법
WO2022015082A1 (ko) 글루카곤 유도체 또는 이의 결합체의 간질환에 대한 치료적 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17744617

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 3012982

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 260839

Country of ref document: IL

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018539850

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12018501612

Country of ref document: PH

Ref document number: 001361-2018

Country of ref document: PE

Ref document number: MX/A/2018/009266

Country of ref document: MX

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11201806502U

Country of ref document: SG

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: DZP2018000409

Country of ref document: DZ

Ref document number: 201891573

Country of ref document: EA

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112018015603

Country of ref document: BR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: CR2018-000393

Country of ref document: CR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: A201808420

Country of ref document: UA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2017744617

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017210871

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20170131

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017744617

Country of ref document: EP

Effective date: 20180829

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112018015603

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20180730