WO2017131066A1 - Ｈｅｒ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬の投与が有効ながん患者を選択するためのキットおよび方法 - Google Patents

Ｈｅｒ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬の投与が有効ながん患者を選択するためのキットおよび方法 Download PDF

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WO2017131066A1
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antibody
her2 protein
her2
sample
protein antibody
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PCT/JP2017/002645
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学 武藤
正博 吉岡
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国立大学法人京都大学
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a kit and a method for selecting a cancer patient who is effective in administering an antibody drug having a HER2 protein as a therapeutic target molecule.
  • the HER2 protein is a gene product of the human oncogene HER2 / neu (c-erbB-2) and is one of a series of epidermal growth factor receptor proteins (HER1 to 4) known as the HER family. It is a transmembrane protein having a tyrosine kinase active region and a molecular weight of about 185000.
  • the HER2 protein forms a homodimer or heterodimer with a HER family protein expressed on the cell surface, and plays a role in transmitting a growth signal of epidermal growth factor to the nucleus.
  • Overexpression of HER2 has been confirmed in certain patients, and the relationship between prognosis and HER2 overexpression has been studied.
  • trastuzumab As a molecular targeting drug targeting HER2 protein, anti-HER2 humanized monoclonal antibody trastuzumab (trade name “Herceptin (registered trademark)”) is listed in the drug price list, breast cancer in which HER2 overexpression has been confirmed, and HER2 Approved for the treatment of unresectable advanced or recurrent gastric cancer with overexpression confirmed.
  • Herceptin registered trademark
  • trastuzumab has also been targeted with its target molecule prior to administration. Tests for confirming overexpression of a certain HER2 protein and tests for confirming HER2 gene amplification are indispensable.
  • IHC immunohistochemistry
  • ISH in situ hybridization
  • Non-Patent Document 2 reports the agreement rate of HER2 overexpression test results of a sample obtained by endoscopic biopsy before surgery and a sample obtained by surgery in 61 cases of gastric cancer. According to this, there were 3 cases (4.9%) in which a positive result was obtained with a sample obtained by surgery after a negative result was obtained with a biopsy sample. This result shows that false negatives occur in biopsy samples, and these patients are essentially treated with trastuzumab, but trastuzumab unless a positive result is subsequently obtained in the surgical sample. It means that the standard treatment by cannot be received. That is, it must be said that the current inspection method is insufficient to make an accurate judgment on a biopsy sample.
  • both IHC and ISH have a large number of steps, complicated procedures, a plurality of factors that affect the test results, and the results may vary depending on the facility or pathologist. Furthermore, it takes several days to several weeks until a test result is obtained from the biopsy sample collection, and there is also a problem that it is not quick. Therefore, establishment of a test method capable of selecting a HER2 overexpressing patient quickly, simply and reliably is desired.
  • An object of the present invention is to provide a kit and a method capable of selecting a HER2 protein overexpressing patient quickly, simply and reliably without generating false negatives even when a biopsy sample is used.
  • Another object of the present invention is to provide a kit and a method for selecting a cancer patient who is effective in administering an antibody drug having a HER2 protein as a therapeutic target molecule. Furthermore, this invention makes it a subject to provide the kit and method which can select the antibody pharmaceutical suitable for a patient.
  • a kit for selecting a cancer patient who is effective in administration of an antibody drug having a HER2 protein as a therapeutic target molecule comprising a test strip for lateral flow immunoassay for detecting HER2 protein in cancer tissue
  • the test strip includes a sample pad to which the sample is added, a conjugate pad holding the first anti-HER2 protein antibody, and a second anti-HER2 protein antibody immobilized in order from the upstream in the direction in which the sample flows.
  • kits comprising the antibody drug as any one of HER2 protein antibodies.
  • the antibody drug is selected from the group consisting of trastuzumab, pertuzumab and trastuzumab-emtansine.
  • the kit according to [1] or [2] wherein the first anti-HER2 protein antibody is labeled with colloidal microparticles.
  • the membrane is a region where the third anti-HER2 protein antibody is immobilized, or a region where the third anti-HER2 protein antibody is immobilized and the fourth anti-HER2 protein antibody is immobilized. Wherein the second anti-HER2 protein antibody, the third anti-HER2 protein antibody, and the fourth anti-HER2 protein antibody are different antibody drugs, respectively.
  • a method for selecting a cancer patient in which administration of an antibody drug using HER2 protein as a therapeutic target molecule is effective comprising the following steps (1) to (3): (1) a step of preparing a sample from cancer tissue collected from a subject; (2) a step of detecting HER2 protein in the sample by a lateral flow immunoassay using an antibody drug having the HER2 protein as a therapeutic target molecule, and (3) a step of selecting a subject who showed a positive result in the lateral flow immunoassay. .
  • step (2) the sample pad to which the sample is added, the conjugate pad holding the first anti-HER2 protein antibody, and the second anti-HER2 protein antibody are fixed in order from the upstream in the direction in which the sample flows.
  • a membrane having a phased region and a region on which an antibody that binds to the first anti-HER2 protein antibody is immobilized, and a test strip for lateral flow immunoassay having a configuration in which an absorption pad is linked The method according to [10] or [11] above, wherein the antibody drug is used for any one of the anti-HER2 protein antibody and the second anti-HER2 protein antibody. [13] The method according to [12], wherein the first anti-HER2 protein antibody is labeled with colloidal microparticles. [14] The method according to [12] or [13], wherein the antibody drug is used for the first anti-HER2 protein antibody.
  • the membrane is a region where the third anti-HER2 protein antibody is immobilized, or a region where the third anti-HER2 protein antibody is immobilized and the fourth anti-HER2 protein antibody is immobilized.
  • the second anti-HER2 protein antibody, the third anti-HER2 protein antibody, and the fourth anti-HER2 protein antibody are respectively different antibody pharmaceuticals [12] or The method according to [13].
  • the cancer tissue is a cancer tissue of the upper gastrointestinal tract.
  • the present invention it is possible to provide a kit and a method capable of selecting a HER2 protein overexpressing patient quickly, simply and reliably without generating false negatives even when a biopsy sample is used. Moreover, since the antibody pharmaceutical which uses HER2 protein as a therapeutic target molecule is used for the antibody for detecting HER2 protein, this invention can evaluate the effectiveness with respect to the patient of the said antibody pharmaceutical. In addition, compared to the HER2 overexpression test using current biopsy samples (IHC and ISH), it is easier to operate and does not require skill, so accuracy control is improved and results vary between facilities and judgment physicians. Can be improved.
  • IHC and ISH current biopsy samples
  • FIG. 1 It is a schematic diagram which shows the structure of an example of the test strip for lateral flow immunoassay used by this invention, (A) is a top view, (B) is a side view. It is a figure which shows the result of having quantified by the densitometry based on the result which confirmed the HER2 protein in the protein extract prepared from various gastric cancer cell lines by the western blotting method, and the HER2 protein density
  • FIG. It is a figure which shows the result of having detected the HER2 protein contained in the protein extract prepared from various gastric cancer cell lines using the lateral flow strip of Example 5.
  • FIG. It is a figure which shows the result of having detected the HER2 protein in the sample which diluted the protein extract prepared from GLM1 cell using the lateral flow strip of Example 5.
  • FIG. The HER2 protein in the protein extract prepared from the GLM1 cell-derived tumor and MKN45 cell-derived tumor formed under the skin of a nude mouse and a biopsy sample collected from a HER2-positive gastric cancer patient was used as the lateral flow strip of Example 5. It is a figure which shows the result detected using this.
  • the present invention provides a kit for selecting a cancer patient who is effective in administering an antibody drug using HER2 protein as a therapeutic target molecule.
  • the present invention also provides a method for selecting a cancer patient that is effective for administration of an antibody drug using the HER2 protein as a therapeutic target molecule.
  • Both of the kit and method of the present invention are characterized by detecting HER2 protein in cancer tissue by a lateral flow immunoassay using an antibody drug having HER2 protein as a therapeutic target molecule.
  • the present invention is preferably practiced using a lateral flow immunoassay test strip configured to detect HER2 protein in a sample.
  • the basic configuration of a lateral flow immunoassay test strip that can be used in the present invention is not particularly limited, and a known test strip configuration used in a normal lateral flow immunoassay can be employed.
  • the membrane 1, the absorbent pad 2, the conjugate pad 3, the sample pad 4, and the back sheet 5 are arranged in order from the upstream of the direction in which the sample flows (in the direction of the arrow of the deployment direction in FIG. ),
  • a test strip in which the sample pad 4, the conjugate pad 3, the membrane 1 and the absorbent pad 2 are connected can be suitably used.
  • the material of the membrane is not limited as long as it has a developing speed that can provide sufficient sensitivity as a chromatographic medium in a short time.
  • a nitrocellulose membrane, a cellulose membrane, an acetylcellulose membrane, a polysulfone membrane, a polyethersulfone membrane, a nylon membrane, a glass fiber, a nonwoven fabric, a filter paper and the like can be preferably used.
  • a region where the antibody is immobilized is formed on the membrane.
  • sample pad examples of the material of the sample pad include, but are not limited to, those having uniform characteristics such as cellulose film, glass fiber, polyurethane, polyacetate, cellulose acetate, nylon, and cotton cloth.
  • the sample pad is a portion to which a sample is added, but also has a function of filtering insoluble particles and the like in the sample.
  • conjugate pad examples of the material of the conjugate pad include, but are not limited to, a cellulose membrane, glass fiber, and non-woven fabric.
  • the conjugate pad is produced by uniformly soaking the labeled anti-HER2 protein antibody into the pad material and drying it. A method for producing the conjugate pad will be described later.
  • the absorption pad absorbs and removes the complex of the HER2 protein and the anti-HER2 protein antibody in the sample that is not physically bound to the immobilized antibody on the membrane while the added sample is physically absorbed by capillary action. It is.
  • a water-absorbing material such as a cellulose film, a nonwoven fabric, a cloth, or a cellulose acetate film can be preferably used.
  • the development speed of the added sample can be set to a desired speed.
  • the present invention relates to a lateral flow immunoassay using at least a first anti-HER2 protein antibody and a second anti-HER2 protein antibody, wherein either one of the first anti-HER2 protein antibody and the second anti-HER2 protein antibody is a HER2 protein. It is characterized by using an antibody drug having as a therapeutic target molecule.
  • antibody drugs that use the HER2 protein as a therapeutic target molecule include trastuzumab (trade name: Herceptin, Chugai Pharmaceutical), pertuzumab (trade name: Pergeta, Chugai Pharmaceutical), trastuzumab-emtansine (trade name: Kadsaila, Chugai Pharmaceutical), etc. It is done. These antibody drugs are listed in drug prices and can be purchased and used.
  • the anti-HER2 protein antibody other than the antibody drug using the HER2 protein as a therapeutic target molecule is not particularly limited as long as it is an antibody that can specifically bind to the human HER2 protein.
  • a commercially available anti-human HER2 protein antibody, an anti-HER2 protein antibody having a cross-reactivity with the human HER2 protein, or the like can be suitably used.
  • an anti-human HER2 protein antibody can be made and used by itself.
  • the anti-HER2 protein antibody may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or an antibody fragment. Preferably, it is an anti-human HER2 protein monoclonal antibody or a fragment thereof capable of binding to HER2 protein.
  • the first anti-HER2 protein antibody and the second anti-HER2 protein antibody are preferably different antibodies.
  • the first anti-HER2 protein antibody is an antibody drug
  • the second anti-HER2 protein antibody is preferably an anti-human HER2 protein antibody other than the antibody drug
  • the first anti-HER2 protein antibody is other than the antibody drug.
  • the second anti-HER2 protein antibody is preferably an antibody drug.
  • the first anti-HER2 protein antibody retained on the conjugate pad is preferably labeled.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it is a known labeling substance used for antibody labeling, but it is preferable to use known colloidal fine particles that can be used for immunoagglutination.
  • Specific examples include gold colloid, silver colloid, platinum colloid, iron colloid, aluminum hydroxide colloid, latex particles, and composite colloids thereof.
  • colloidal metal colloids such as gold colloid, silver colloid and platinum colloid, or composite colloids thereof. More preferably, it is a gold colloid showing red, a silver colloid showing yellow, and more preferably a gold colloid.
  • the average particle diameter of the colloidal fine particles is preferably about 1 nm to about 500 nm, more preferably about 10 nm to about 150 nm, and further preferably about 20 nm to about 100 nm.
  • gold colloid is used as the colloidal fine particles
  • commercially available gold colloid particles and gold colloid labeling kits can be suitably used.
  • colloidal gold particles may be prepared by a known method. Examples of known methods for preparing colloidal gold particles include a method of reducing chloroauric acid with sodium citrate.
  • control antibody an antibody that binds to the first anti-HER2 protein antibody is referred to as a control antibody. Therefore, the first anti-HER2 protein antibody, that is, an antibody that can bind to the labeled anti-HER2 protein antibody is used as the control antibody.
  • the control antibody is not particularly limited as long as it is an antibody that can bind to the labeled anti-HER2 protein antibody to be used, and may be appropriately selected from commercially available antibodies according to the animal species and antibody class of the labeled anti-HER2 protein antibody. Can do.
  • a control antibody can be made and used.
  • the control antibody may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or an antibody fragment capable of binding to the first anti-HER2 protein antibody.
  • the method for retaining the labeled anti-HER2 protein antibody on a pad material is not particularly limited.
  • a method can be used in which a labeled anti-HER2 protein antibody is suspended in an appropriate solvent to form a colloidal solution, and the colloidal solution is uniformly infiltrated into the pad material by coating, spraying, dipping, etc., and then dried.
  • the drying method is not particularly limited, and for example, drying means such as natural drying, reduced pressure drying, freeze drying, and heat drying can be used.
  • the anti-HER2 protein antibody retained on the conjugate pad must be readily eluted by the sample and bind to the HER2 protein in the sample while moving with the sample.
  • sugar alcohols such as saccharides, such as sucrose, maltose, and lactose
  • mannitol such as sucrose, maltose, and lactose
  • these materials may be coated on the pad material in advance.
  • a region where the second anti-HER2 protein antibody is immobilized and a region where the control antibody is immobilized are formed on the membrane.
  • the membrane may further have a region where a third anti-HER2 protein antibody is immobilized.
  • the method for immobilizing the antibody on the membrane is not particularly limited, and the antibody can be immobilized by a known physical means or chemical means. For example, a method in which an antibody solution is physically adsorbed on a membrane by dropping an antibody solution onto the membrane surface and drying it can be used.
  • the shape of the antibody-immobilized region is not particularly limited as long as the antibody is locally immobilized and the color can be visually confirmed. For example, a circular shape, a strip shape, a linear shape, and the like can be given.
  • the amount of antibody to be immobilized can be appropriately set in consideration of detection sensitivity. For example, it is preferable to immobilize the antibody so that the amount of antibody in one region is in the range of about 0.01 ⁇ g to about 5 ⁇ g.
  • Non-specific adsorption prevention treatment of sample pad In order to prevent the analyte in the sample from adsorbing nonspecifically to the material of the sample pad, it is preferable to perform a nonspecific adsorption preventing process on the sample pad.
  • the nonspecific adsorption preventing treatment include a method in which a known blocking agent such as BSA (bovine serum albumin), skim milk, and casein is uniformly soaked into a sample pad and dried.
  • a blocking agent solution is prepared using an appropriate solvent so that the concentration is about 1% by mass to about 5% by mass, and this solution is impregnated with about 60 ⁇ L per test strip, and then dried.
  • non-specific adsorption prevention treatment can be performed.
  • the nonspecific adsorption prevention treatment may be performed on the membrane, or may be performed on both the sample pad and the membrane.
  • the non-specific adsorption preventing process for the membrane can be performed in the same manner as the non-specific adsorption preventing process for the sample pad.
  • test strip for lateral flow immunoassay is prepared by connecting the sample pad 4, the conjugate pad 3, the membrane 1 and the absorption pad 2 from upstream to downstream in the direction of flow of the sample (in the direction of the arrow in FIG. 1). be able to.
  • the backing sheet a commercially available backing sheet for immunochromatography can be suitably used.
  • the sample is prepared from cancer tissue collected from a cancer patient.
  • the subject cancer patient is a cancer patient suspected of suffering from a cancer in which HER2 is overexpressed.
  • Cancers with overexpressed HER2 include breast cancer, stomach cancer, esophageal cancer, colon cancer, bile duct cancer, gallbladder cancer, non-small cell lung cancer, head and neck cancer, bladder cancer, and ovary. Cancer, uterine cancer, salivary gland cancer and the like. Therefore, it is preferable that the target cancer patient is a cancer patient suffering from these cancers. More preferably breast cancer patients, stomach cancer patients, esophageal cancer patients, colon cancer patients, bile duct cancer patients, head and neck cancer patients, more preferably breast cancer patients, stomach cancer patients, particularly preferably stomach cancer patients. is there.
  • the cancer tissue only needs to be collected from a cancer patient to be examined. It may be a biopsy tissue or a cancer tissue removed by surgery. A biopsy tissue collected by endoscopy is preferable, and a biopsy tissue collected by upper gastrointestinal endoscopy is more preferable. It is preferable to prepare a protein extract from the above cancer tissue and use it as a sample for lateral flow immunoassay.
  • the protein extract can be prepared using a known method. Specifically, for example, a commercially available tissue lysate (for example, RIPA (Radio-Immunoprecipitation Assay) buffer etc.) is added to the cancer tissue and homogenized, and the resulting tissue lysate is centrifuged and its supernatant Can be used as a protein extract.
  • a commercially available tissue lysate for example, RIPA (Radio-Immunoprecipitation Assay) buffer etc.
  • the obtained protein extract can be stored frozen at ⁇ 80 ° C. It is preferable that the protein extract is appropriately diluted and used so that the total protein amount in the sample falls within a certain range when subjected to the lateral flow immunoassay.
  • the total protein amount in the sample can be appropriately set in consideration of detection sensitivity.
  • the protein concentration can be measured using a known method (for example, a commercially available protein quantification kit).
  • the amount of sample added to the sample pad can be appropriately set according to the size and shape of the test strip.
  • the determination is usually performed by visually observing the coloration of the anti-HER2 protein antibody immobilization region formed on the membrane. A commercially available immunochromatography reader can also be used. If no coloration is observed in the control antibody-immobilized region, the test is determined to be invalid.
  • the first embodiment of the present invention is implemented using a test strip for lateral flow immunoassay using an antibody drug having HER2 protein as a therapeutic target molecule as the first anti-HER2 protein antibody.
  • an antibody drug having HER2 protein as a therapeutic target molecule as the first anti-HER2 protein antibody.
  • trastuzumab is used as the antibody drug, but the same can be applied when an antibody drug other than trastuzumab is used.
  • Trastuzumab is labeled with colloidal gold and held on the conjugate pad.
  • the second anti-HER2 protein antibody a commercially available anti-HER2 protein antibody that can specifically bind to human HER2 protein is used.
  • the control antibody an antibody (for example, an anti-human IgG antibody) that can bind to colloidal gold-labeled trastuzumab is used.
  • the second anti-HER2 protein antibody and the control antibody are respectively immobilized on different regions on the membrane.
  • a sample protein extract
  • the sample that reaches the conjugate pad develops further downstream while eluting the retained colloidal gold-labeled trastuzumab.
  • colloidal gold-labeled trastuzumab binds to HER2 protein to form a complex. This complex is captured by the second anti-HER2 protein antibody and the control antibody immobilized on the membrane, and each immobilized region is colored red.
  • the control antibody also captures gold colloid-labeled trastuzumab that is not complexed.
  • the colloidal gold-labeled trastuzumab does not form a complex with the HER2 protein, so that the control antibody immobilization region captures the gold colloid-labeled trastuzumab and turns red,
  • the HER2 protein antibody immobilized region is not colored. Therefore, assuming that the control antibody-immobilized region is colored, it is determined as positive when the second anti-HER2 protein antibody-immobilized region is colored, and the second anti-HER2 protein antibody-immobilized region is colored. If not, it is determined as negative. Patients who are determined to be positive can be determined to be effective patients for treatment with trastuzumab.
  • a patient determined to be positive when pertuzumab is used instead of trastuzumab, a patient determined to be positive can be determined to be a patient who is effective for treatment with pertuzumab.
  • trastuzumab-emtansine when trastuzumab-emtansine is used in place of trastuzumab, a patient who is determined to be positive can be determined to be an effective patient for treatment with trastuzumab-emtansine.
  • the second embodiment of the present invention is carried out using a test strip for lateral flow immunoassay using an antibody drug having HER2 protein as a therapeutic target molecule as the second anti-HER2 protein antibody.
  • an antibody drug having HER2 protein as a therapeutic target molecule as the second anti-HER2 protein antibody.
  • trastuzumab is used as the antibody drug, but the same can be applied when an antibody drug other than trastuzumab is used.
  • the first anti-HER2 protein antibody a commercially available anti-HER2 protein antibody that can specifically bind to human HER2 protein is used.
  • the first anti-HER2 protein antibody is labeled with colloidal gold and retained on the conjugate pad.
  • the control antibody an antibody capable of binding to the first anti-HER2 protein antibody labeled with colloidal gold is used. Trastuzumab and control antibody are immobilized on different regions of the membrane.
  • the sample is developed as in the first embodiment.
  • both the trastuzumab immobilization region and the control antibody immobilization region are colored red, and when the HER2 protein is not present in the sample, only the control antibody immobilization region is present. Colored red. Therefore, assuming that the control antibody-immobilized region is colored, it is determined as positive when the trastuzumab-immobilized region is colored, and is determined as negative when the trastuzumab-immobilized region is not colored. Patients who are determined to be positive can be determined to be effective patients for treatment with trastuzumab.
  • a patient determined to be positive when pertuzumab is used instead of trastuzumab, a patient determined to be positive can be determined to be a patient who is effective for treatment with pertuzumab.
  • trastuzumab-emtansine when trastuzumab-emtansine is used in place of trastuzumab, a patient who is determined to be positive can be determined to be an effective patient for treatment with trastuzumab-emtansine.
  • the third embodiment of the present invention is a lateral flow in which an antibody drug having a HER2 protein as a therapeutic target molecule, which is different from the second anti-HER2 protein antibody in the second embodiment, is further solid-phased on a membrane. Performed using an immunoassay test strip. Different from the second anti-HER2 protein antibody, there may be one or more types of antibody drugs using the HER2 protein as a therapeutic target molecule.
  • the second and third anti-HER2 protein antibodies When two kinds of antibody drugs are used as the second and third anti-HER2 protein antibodies, respectively, for example, a combination of trastuzumab and pertuzumab, a combination of pertuzumab and trastuzumab-emtansine, a combination of trastuzumab and trastuzumab-emtansine, etc. it can.
  • a combination of trastuzumab, pertuzumab and trastuzumab-emtansine can be selected.
  • control antibody-immobilized region it is determined to be positive when at least one of the plurality of provided antibody drug-immobilized regions is colored, and a plurality of provided antibody drug-immobilized regions. When all the conversion regions are not colored, it is determined as negative.
  • the cancer tissue of a patient in which all three antibody drug-immobilized regions were colored was immobilized. Since it is considered that HER2 protein having high binding property to any antibody drug is overexpressed, all of the immobilized antibody drugs can be judged as effective patients.
  • Cancer tissues of patients with a mixture of colored antibody drug-immobilized areas and non-colored antibody drug-immobilized areas have high binding properties with the antibody drug immobilized on the colored areas and do not color.
  • HER2 protein which has a low binding property to the antibody drug immobilized in the region, is considered to be overexpressed. Therefore, treatment with the antibody drug immobilized in the colored region is effective, It can be determined that the treatment with the antibody drug immobilized in the area where there was no effect is not effective. The same determination can be made when two types of antibody drugs are used and when four or more types of antibody drugs are used.
  • the third embodiment is very useful in that it can be used for selection of antibody drugs used for treatment of individual cancer patients. Furthermore, when a new antibody drug is developed, an antibody drug suitable for the patient can be selected from a plurality of usable antibody drugs by increasing the number of anti-HER2 protein antibody immobilization regions. it is conceivable that.
  • the kit of the present invention only needs to include a test strip for lateral flow immunoassay for detecting HER2 protein in cancer tissue.
  • the test strip for lateral flow immunoassay is as described above.
  • the specific kit configuration other than these is not particularly limited, and other necessary reagents, instruments, instructions for use, etc. may be appropriately selected to form the kit configuration.
  • Anti-HER2 antibody CST HER2 / ErbB2 Antibody
  • secondary antibody GE healthcare ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab from donkey
  • anti- ⁇ -actin antibody CST ⁇ -Actin (13E5)
  • Rabbit mAb HRP Conjugate was used for immunoblotting. Immobilon Western (Merck Millipore) was used as the color former. Photographing was performed with Chemidoc XRS + (BIO-RAD).
  • Results The results are shown in FIG. The upper row shows the results of detecting HER2 protein by Western blotting, the middle row shows the results of detecting ⁇ -actin by Western blotting, and the lower row shows the results of quantifying HER2 protein by densitometry based on the Western blotting image of HER2 protein. From these results, it was revealed that the HER2 expression level of MKN7, GLM1, GLM2, and GLM4 is high.
  • Example 1 Production of test strip (1)
  • Strip Material A nitrocellulose membrane card (Merck Millipore, HF120MC100, 60 mm ⁇ 301 mm) was used as the membrane.
  • conjugate pad a glass fiber pad (Merck Millipore, GFCP103000) was used.
  • Cellulose pads (Merck Millipore, CFSP173000) were used as sample pads and absorbent pads.
  • the first anti-HER2 protein antibody includes an anti-HER2 mouse monoclonal antibody (HER-2 / ErbB2 Monoclonal Antibody (N24), Thermo Scientific, MA1-12691). )It was used.
  • Trastuzumab Herceptin (registered trademark) 60 for injection, manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.
  • second antibody As a control antibody, an anti-mouse IgG antibody (Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Thermo Scientific, PA1-28555) was used.
  • Antibody Stabilizer Based on PBS CANDOR Bioscience, 131050, hereinafter referred to as “antibody dilution” was used.
  • Sample Pad 5% BSA / PBS was prepared by dissolving BSA (Wako Pure Chemical, 015-21274) in PBS (PBS tablet (Takara Bio) dissolved in ultrapure water). This was uniformly infiltrated into a sample pad (Cellulose Fiber Sample Pad). The area of the sample pad and the amount of liquid to be soaked were appropriately adjusted so that 60 ⁇ L of 5% BSA / PBS was contained in the sample pad (5 mm ⁇ 17 mm) per test strip. Thereafter, the sample pad was kept in a horizontal state and completely dried at room temperature over one night.
  • a half strip is a preliminary strip composed of a membrane and an absorption pad on which trastuzumab and a control antibody (anti-mouse IgG antibody) are immobilized.
  • One end of the membrane (the one where the absorption pad is not connected) is immersed in a solution containing the sample and colloidal gold-labeled first antibody, and the solution is used in the direction of the absorption pad.
  • the half strip was produced by the following procedure.
  • a lateral flow strip was produced by the following procedure. (1) Affixing the absorbent pad to the membrane card (2) Affixing the conjugate pad holding the gold colloid-labeled first antibody to the membrane card (3) Affixing the sample pad holding BSA to the conjugate pad (4 ) Cut to 5mm width (5) Immobilize trastuzumab on membrane (see 1-3 above) (6) Immobilization of anti-mouse IgG antibody on membrane (see 1-3 above) In the following Examples, the region where the second antibody is immobilized is referred to as “test line”, and the region where the control antibody is immobilized is referred to as “control line”.
  • Example 2 Detection of HER2 protein by half strip
  • the protein extract prepared in Reference Example 1 was used.
  • the used cells are MKN1, MKN7, MKN45, MKN74, AGS, KATOIII, HGC27, and MCF7 (negative control).
  • Strip The half strip produced in Example 1 was used.
  • the test line antibody (trastuzumab) amount was 5 ⁇ g.
  • Detection method A 96-well plate was used.
  • the amount of protein from the protein extract is 60 ⁇ g / well, the BSA concentration is 3% / well, the amount of the colloidal gold-labeled primary antibody prepared in 1-4-1 of Example 1 is 1 ⁇ L / well, and the solution per well Samples were prepared so that the volume was 100 ⁇ L. One end of the membrane of the half strip was immersed in the sample solution and developed, and the coloring of the test line and the control line was observed. Those in which the color of the test line could be visually confirmed were judged as positive.
  • Results The results are shown in FIG. 3 indicates the HER2 protein concentration in the protein extract of each cell line quantified by densitometry in Reference Example 1 above. As is clear from FIG. 3, a clear signal was detected with MKN7 having a high HER2 expression level. Weak signals were also detected with MKN74, KATOIII and HGC27. From this result, it was shown that HER2-positive gastric cancer can be detected by a lateral flow assay.
  • Example 3 Examination of test line antibody amount
  • Example 4 Detection of HER2 protein by lateral flow strip.
  • Sample Protein extracts of MKN7 and MCF7 (control) prepared in Reference Example 1 were used.
  • Strip The lateral flow strip produced in Example 1 was used.
  • the test line antibody (trastuzumab) amount was 5 ⁇ g.
  • Detection method A sample was prepared so that the amount of protein from the protein extract was 200 ⁇ g and the amount was 100 ⁇ L, and the entire amount of the sample was added to the sample pad portion and developed. The coloring of the control line and test line was visually observed.
  • the HER2 protein concentration in the protein extract prepared from each cell was quantified using ErbB2 / Her2 ELISA Kit (Novus Biologicals, NBP1-84823). The quantitative value was expressed not by the HER2 protein concentration in the solution but by the HER2 protein amount per unit protein amount in the solution.
  • Results The results are shown in FIG. The upper part shows the result of detecting HER2 protein by Western blotting, the middle part shows the result of detecting ⁇ -actin by Western blotting, and the lower part shows the result of quantifying HER2 protein by ELISA. From these results, it was revealed that HER2 expression levels of GLM1 and GLM4 were very high, and then HER2 expression levels of MKN7 and GLM2 were high.
  • Example 5 Production of test strip (2)
  • Strip Material A nitrocellulose membrane (Merck Millipore, HF13504) was used as the membrane. Glass fiber pads (Merck Millipore, GFDX203000) were used as sample pads and conjugate pads. A cellulose pad (Merck Millipore, CFSP223000) was used as the absorbent pad.
  • a test strip was prepared by inverting the first antibody and the second antibody of the test strip prepared in Example 1. That is, trastuzumab (Herceptin (registered trademark) for injection 60, manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) was used as the first antibody.
  • An anti-HER2 mouse monoclonal antibody (HER-2 / ErbB2 Monoclonal Antibody (N24), Thermo Scientific, MA1-12691) was used as the second antibody.
  • an anti-mouse IgG antibody Goat anti-Mouse IgG's, Japanese flour
  • For antibody dilution the same antibody dilution as in Example 1 was used.
  • Anti-HER2 mouse monoclonal antibody and anti-mouse IgG were each diluted with an antibody diluent to prepare a 0.1 ⁇ g / ⁇ L antibody solution, and 1 ⁇ L of antibody solution per spot was micropipetted. (Antibody 0.1 ⁇ g / spot).
  • Anti-HER2 mouse monoclonal antibody was spotted at one location and anti-mouse IgG was spotted at 2 locations.
  • the membrane was dried at 50 ° C. for 30 minutes. Subsequently, the membrane was immersed in a blocking buffer (0.5% casein, 50 mM boric acid, pH 8.5) and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • the membrane was transferred to a washing / stabilizing buffer (0.5% sucrose, 0.05% sodium cholate, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5), immersed, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes or more.
  • the membrane was pulled up, placed on a paper towel and dried overnight at room temperature.
  • the membrane thus obtained can be stored in an aluminum pouch together with a desiccant.
  • conjugate pad To 500 ⁇ L of the gold colloid-labeled primary antibody solution prepared above, 500 ⁇ L of distilled water and gold colloid coating buffer (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.05% PEG 20,000, 5% 1 mL of sucrose) was mixed and stirred gently. 1.6 mL of the above mixed solution was evenly applied per one glass fiber pad (300 mm). The pad was placed in a desiccator and dried under reduced pressure at room temperature over one night. The dried conjugate pad can be protected from light in a plastic bag containing silica gel.
  • gold colloid coating buffer (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.05% PEG 20,000, 5% 1 mL of sucrose
  • the laminated sheet was cut into a width of 5 mm to produce a lateral flow strip.
  • the produced lateral flow strip can be stored together with silica gel in an aluminum pouch and stored at room temperature.
  • Example 6 Detection of HER2 protein in gastric cancer cell line-derived protein extract.
  • Reference Example 2 Sample Nine types of human gastric cancer cell line-derived protein extracts prepared in Reference Example 2 were used. As a control, the protein extract derived from the breast cancer cell line MCF7 prepared in Reference Example 2 was used. (2) Strip The lateral flow strip produced in Example 5 was used. (3) Detection method Prepare a sample so that the amount of protein from the protein extract is 2 ⁇ g and the amount of the solution is 100 ⁇ L (protein concentration: 0.02 mg / mL). It was. The coloring of the control line and test line was visually observed.
  • FIG. 7 shows the HER2 protein amount per unit protein amount determined by ELISA in Reference Example 2, and the middle value in FIG. 7 shows the HER2 protein amount per strip calculated based on the upper value. Is shown. The possibility that the HER2 protein amount per strip exceeded 10 ng could be detected by the lateral flow strip prepared in Example 5 was considered from FIG.
  • Example 7 Examination of HER2 protein concentration in sample.
  • Experimental Material and Method (1) Sample The protein extract of GLM1 prepared in Reference Example 1 was used. Five types of samples with total protein concentration ( ⁇ g / mL) in the samples of 0.2, 0.02, 0.002, 0.0002, and 0.00002 were prepared. (2) Strip The lateral flow strip produced in Example 5 was used. (3) Detection method 100 ⁇ L of each sample was added to the sample pad portion for development, and the coloring of the control line and the test line was visually observed.
  • Results The results are shown in FIG.
  • the upper value in FIG. 8 indicates the total protein concentration in the sample, and the middle value in FIG. 8 indicates the amount of HER2 protein per strip.
  • Example 8 Examination of HER2 protein concentration in xenograft-derived sample and human biopsy sample.
  • Experimental Materials and Methods (1) Preparation of Xenograft-Derived Sample GLM1 and MKN45 were each inoculated subcutaneously into nude mice to form tumors. Samples were taken from the tumor tissue using biopsy forceps used during upper gastrointestinal endoscopy, weighed, and stored in liquid nitrogen. T-PER Tissue Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific) was added to the collected tissue and homogenized with a homogenizer (Nippi, BioMasher II).
  • tissue lysate was centrifuged (10,000 ⁇ g, 4 ° C., 5 minutes), and the supernatant was stored as a protein extract at ⁇ 80 ° C. It melted at the time of use and used for the test.
  • (2) Preparation of human specimen-derived sample A biopsy specimen collected from a stomach cancer patient was used. A sample of a case confirmed to be HER2 positive by HER2 immunostaining was used. As a control, a gastric biopsy specimen from a healthy part of the same patient was used. In the same manner as in (1) above, T-PER Tissue Protein Extraction Reagent was added, homogenized and centrifuged to prepare a protein extract, which was stored at -80 ° C.
  • FIG. 9 The results are shown in FIG. The upper value in FIG. 9 indicates the amount of HER2 protein per strip. As is clear from FIG. 9, HER2 could be detected in a GLM1-derived xenograft (Xenograft) and a biopsy specimen of a human tumor site. From this result, it was shown that the HER2 protein can be detected even with a protein extract from a tumor tissue using the prepared strip.
  • GLM1-derived xenograft Xenograft

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Abstract

本発明は、ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬の投与が有効ながん患者を選択するためのキットおよび方法を提供する。本発明のキットは、試料が流れる方向の上流から順に、試料を添加するサンプルパッド、第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が保持されたコンジュゲートパッド、第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体および第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体に結合する抗体が固相化された領域を有するメンブレン、吸収パッドが連結された構成を有し、第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体および第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体のいずれか一方に、ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬を用いたラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップを含み、本発明の方法は、当該テストストリップを用いたラテラルフローイムノアッセイにより患者のがん組織中のＨＥＲ２タンパク質を検出する工程を含む。

Description

ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬の投与が有効ながん患者を選択するためのキットおよび方法
　本発明は、ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬の投与が有効ながん患者を選択するためのキットおよび方法に関するものである。
　ＨＥＲ２タンパク質はヒトがん遺伝子ＨＥＲ２／ｎｅｕ（c－ｅｒｂＢ－２）の遺伝子産物で、ＨＥＲファミリーとして知られる一連の上皮系増殖因子受容体タンパク質（ＨＥＲ１～４）の一つであり、細胞質側にチロシンキナーゼ活性領域を有する分子量約１８５０００の膜貫通型タンパク質である。ＨＥＲ２タンパク質は、細胞表面に発現したＨＥＲファミリータンパク質とホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成して、上皮系増殖因子の増殖シグナルを核に伝達する役割を担っている。これまでに、乳がん、胃がん、食道がん、大腸がん、胆管がん、胆嚢がん、非小細胞肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮がん、唾液腺がんなどの一定の患者にＨＥＲ２の過剰発現が確認されており、予後とＨＥＲ２過剰発現の関連が研究されている。
　ＨＥＲ２タンパク質を標的とする分子標的薬として、抗ＨＥＲ２ヒト化モノクローナル抗体であるトラスツズマブ（商品名「ハーセプチン（登録商標）」）が薬価収載されており、ＨＥＲ２過剰発現が確認された乳がん、および、ＨＥＲ２過剰発現が確認された治癒切除不能な進行・再発の胃がんについての適用が承認されている。近年、分子標的薬の開発による治癒率の向上がもたらされる一方で、医療経済性も重視され、より適正な対象への使用が求められることから、トラスツズマブについても投与に先立って、その標的分子であるＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を確認する検査およびＨＥＲ２遺伝子増幅を確認する検査が不可欠となっている。胃がんの場合、ＨＥＲ２タンパク過剰発現には免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＨＥＲ２遺伝子増幅にはｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）法が使用されている（非特許文献１）。
　非特許文献２には、胃がん６１症例で、手術前の内視鏡下生検により得られた試料と手術により得られた試料とのＨＥＲ２過剰発現検査結果の一致率が報告されている。これによれば、生検試料で陰性結果が得られた後に、手術により得られた試料で陽性結果が得られた症例が３例（４．９％）あった。この結果は、生検試料で偽陰性が発生することを示しており、これらの患者は本来トラスツズマブによる治療が有効であるにも関わらず、その後に手術試料で陽性の結果が得られない限りトラスツズマブによる標準治療が受けられないことを意味する。すなわち、現行の検査法は生検試料で正確な判断を行うには不十分であると言わざるを得ない。
　このように、現行の生検試料を用いるＨＥＲ２過剰発現検査（ＩＨＣおよびＩＳＨ）では、数％程度の偽陰性が発生するため、トラスツズマブによる治療の恩恵に与るべき症例が見逃される可能性がある。また、ＩＨＣおよびＩＳＨのどちらも工程数が多く、手技が煩雑で、検査結果に影響を与える因子が複数存在し、施設や病理医師により結果が異なる場合がある。さらに、生検試料採取から検査結果が得られるまで数日から数週間を要し、迅速性に欠けるという問題もある。それゆえ、迅速、簡便かつ確実にＨＥＲ２過剰発現患者を選択できる検査方法の確立が望まれている。
Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, et al: Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer（ToGA）: a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet 2010 Aug 28;376（9742）:687-97. Pirrelli M, Caruso ML, Di Maggio M, Armentano R, Valentini AM. Are biopsy specimens predictive of HER2 status in gastric cancer patients? Digestive diseases and sciences. 2013;58(2):397-404.
　本発明は、生検試料を用いても偽陰性が発生せず、迅速、簡便かつ確実にＨＥＲ２タンパク質過剰発現患者を選択できるキットおよび方法を提供することを課題とする。また本発明は、ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬の投与が有効ながん患者を選択するためのキットおよび方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、患者に適した抗体医薬を選択できるキットおよび方法を提供することを課題とする。
　本発明は、上記の課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬の投与が有効ながん患者を選択するためのキットであって、がん組織中のＨＥＲ２タンパク質を検出するためのラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップを含み、該テストストリップは、試料が流れる方向の上流から順に、試料を添加するサンプルパッド、第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が保持されたコンジュゲートパッド、第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域および第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体に結合する抗体が固相化された領域を有するメンブレン、ならびに吸収パッドが連結された構成を有し、前記第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体および第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体のいずれか一方に、前記抗体医薬を用いることを特徴とするキット。
［２］前記抗体医薬が、トラスツズマブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブ－エムタンシンからなる群より選択されることを特徴とする前記［１］に記載のキット。
［３］前記第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体がコロイド微粒子で標識されていることを特徴とする前記［１］または［２］に記載のキット。
［４］前記第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体に前記抗体医薬を用いることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のキット。
［５］前記第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体に前記抗体医薬を用いることを特徴とする前記［１］～［３］のいずれかに記載のキット。
［６］前記メンブレンが第三の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域、または、第三の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域と第四の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域をさらに含み、前記第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体、前記第三の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体および前記第四の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体はそれぞれ異なる前記抗体医薬であることを特徴とする前記［１］～［３］のいずれかに記載のキット。
［７］被験者から採取されたがん組織から調製したタンパク質抽出液を試料とすることを特徴とする前記［１］～［６］のいずれかに記載のキット。
［８］前記がん組織が生検組織であることを特徴とする前記［７］に記載のキット。
［９］前記がん組織が上部消化管のがん組織であることを特徴とする前記［７］または［８］に記載のキット。
［１０］ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬の投与が有効ながん患者を選択する方法であって、以下の工程（１）～（３）を含むことを特徴とする方法：
（１）被験者から採取されたがん組織から試料を調製する工程、
（２）前記ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬を用いたラテラルフローイムノアッセイにより前記試料中のＨＥＲ２タンパク質を検出する工程、および
（３）前記ラテラルフローイムノアッセイで陽性を示した被験者を選択する工程。
［１１］前記抗体医薬が、トラスツズマブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブ－エムタンシンからなる群より選択されることを特徴とする前記［１０］に記載の方法。
［１２］前記工程（２）において、試料が流れる方向の上流から順に、試料を添加するサンプルパッド、第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が保持されたコンジュゲートパッド、第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域および第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体に結合する抗体が固相化された領域を有するメンブレン、ならびに吸収パッドが連結された構成を有するラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップを用い、前記第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体および第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体のいずれか一方に、前記抗体医薬を用いることを特徴とする前記［１０］または［１１］に記載の方法。
［１３］前記第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体がコロイド微粒子で標識されていることを特徴とする前記［１２］に記載の方法。
［１４］前記第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体に前記抗体医薬を用いることを特徴とする前記［１２］または［１３］に記載の方法。
［１５］前記第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体に前記抗体医薬を用いることを特徴とする前記［１２］または［１３］に記載の方法。
［１６］前記メンブレンが、第三の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域、または、第三の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域と第四の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域をさらに含み、前記第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体、前記第三の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体および前記第四の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体はそれぞれ異なる抗体医薬であることを特徴とする前記［１２］または［１３］に記載の方法。
［１７］前記がん組織が生検組織であることを特徴とする前記［１０］～［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］前記がん組織が上部消化管のがん組織であることを特徴とする前記［１０］～［１７］のいずれかに記載の方法。
　本発明によれば、生検試料を用いても偽陰性が発生せず、迅速、簡便かつ確実にＨＥＲ２タンパク質過剰発現患者を選択できるキットおよび方法を提供することができる。また、本発明は、ＨＥＲ２タンパク質を検出するための抗体にＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬を用いるので、当該抗体医薬の患者に対する有効性を評価することができる。さらに、現行の生検試料を用いるＨＥＲ２過剰発現検査（ＩＨＣおよびＩＳＨ）と比較して操作が簡単で熟練を要しないので、精度管理が向上し、施設間や判定医師間での結果のばらつきを改善することができる。
本発明で用いるラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップの一例の構造を示す模式図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は側面図である。 各種胃がん細胞株から調製したタンパク質抽出液中のＨＥＲ２タンパク質をウエスタンブロッティング法で確認した結果と、試料中のＨＥＲ２タンパク質濃度をウエスタンブロッティング画像に基づくデンシトメトリーで定量した結果を示す図である。 各種胃がん細胞株から調製したタンパク質抽出液中のＨＥＲ２タンパク質を、実施例１のハーフストリップを用いて検出した結果を示す図である。 ＭＫＮ７細胞から調製したタンパク質抽出液中のＨＥＲ２タンパク質を、トラスツズマブの固相化量が異なる５種類のハーフストリップを用いて検出した結果を示す図である。 ＭＫＮ７細胞およびＨＥＲ２の発現レベルが低い乳がん細胞株ＭＣＦ７から調製したタンパク質抽出液中のＨＥＲ２タンパク質を、実施例１のラテラルフローストリップを用いて検出した結果を示す図である。 各種胃がん細胞株から調製したタンパク質抽出液中のＨＥＲ２タンパク質をウエスタンブロッティング法で確認し、試料中の単位タンパク質当たりのＨＥＲ２タンパク質量をＥＬＩＳＡで定量した結果を示す図である。 各種胃がん細胞株から調製したタンパク質抽出液に含まれるＨＥＲ２タンパク質を、実施例５のラテラルフローストリップを用いて検出した結果を示す図である。 ＧＬＭ１細胞から調製したタンパク質抽出液を希釈した試料中のＨＥＲ２タンパク質を、実施例５のラテラルフローストリップを用いて検出した結果を示す図である。 ヌードマウスの皮下に形成させたＧＬＭ１細胞由来の腫瘍およびＭＫＮ４５細胞由来の腫瘍、ならびにＨＥＲ２陽性胃がん患者から採取した生検検体から調製したタンパク質抽出液中のＨＥＲ２タンパク質を、実施例５のラテラルフローストリップを用いて検出した結果を示す図である。
　本発明は、ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬の投与が有効ながん患者を選択するためのキットを提供する。また本発明は、ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬の投与が有効ながん患者を選択する方法を提供する。本発明のキットおよび方法は、どちらもＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬を用いたラテラルフローイムノアッセイにより、がん組織中のＨＥＲ２タンパク質を検出することを特徴としている。本発明は、試料中のＨＥＲ２タンパク質を検出するために構成されたラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップを用いて実施することが好ましい。
　本発明に使用することのできるラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップの基本構成は特に限定されず、通常のラテラルフローイムノアッセイに使用される公知のテストストリップの構成を採用することができる。例えば、図１に示すようにメンブレン１、吸収パッド２、コンジュゲートパッド３、サンプルパッド４およびバックシート５から構成され、試料が流れる方向の上流から順に（図１の展開方向の矢印の方向に）、サンプルパッド４、コンジュゲートパッド３、メンブレン１および吸収パッド２が連結されたテストストリップを好適に用いることができる。
〔メンブレン〕
　メンブレンは、クロマトグラフ媒体として短時間での判定で十分な感度が得られる展開速度を有するものであれば、その素材は限定されない。例えばニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、濾紙などを好ましく用いることができる。メンブレンには、後述するように、抗体が固相化された領域が形成される。
〔サンプルパッド〕
　サンプルパッドの素材としては、例えばセルロース膜、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、セルロースアセテート、ナイロン、綿布等の均一な特性を有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。サンプルパッドは試料を添加する部分であるが、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能も有する。
〔コンジュゲートパッド〕
　コンジュゲートパッドの素材としては、例えばセルロース膜、ガラス繊維、不織布などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。コンジュゲートパッドは、標識された抗ＨＥＲ２タンパク質抗体を上記パッドの素材に均一に染み込ませて乾燥させることにより作製される。コンジュゲートパッドの作製方法については後述する。
〔吸収パッド〕
　吸収パッドは、添加された試料が毛細管現象により物理的に吸収されると共に、メンブレンの固相化抗体に結合しなかった試料中のＨＥＲ２タンパク質と抗ＨＥＲ２タンパク質抗体との複合体を吸収除去する部位である。素材としては、セルロ－ス膜、不織布、布、セルロースアセテート膜などの吸水性材料を好ましく用いることができる。吸収パッドの材質、大きさにより、添加した試料の展開速度を所望の速度に設定することができる。
〔抗ＨＥＲ２タンパク質抗体〕
　本発明は、少なくとも第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体と第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体を使用するラテラルフローイムノアッセイにおいて、第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体および第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体のいずれか一方にＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬を用いることを特徴とする。ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬としては、トラスツズマブ（商品名：ハーセプチン、中外製薬）、ペルツズマブ（商品名：パージェタ、中外製薬）、トラスツズマブ－エムタンシン（商品名：カドサイラ、中外製薬）などが挙げられる。これらの抗体医薬は薬価収載されており、購入して使用することができる。
　ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬以外の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体は、ヒトＨＥＲ２タンパク質と特異的に結合できる抗体であれば特に限定されない。市販の抗ヒトＨＥＲ２タンパク質抗体や、ヒトＨＥＲ２タンパク質と交差性を有する抗ＨＥＲ２タンパク質抗体などを好適に用いることができる。また、抗ヒトＨＥＲ２タンパク質抗体を自作して使用することができる。抗ＨＥＲ２タンパク質抗体はポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体でもよく、抗体フラグメントでもよい。好ましくは、抗ヒトＨＥＲ２タンパク質モノクローナル抗体、またはＨＥＲ２タンパク質との結合能を有するそのフラグメントである。第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体と第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体は異なる抗体であることが好ましい。第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が抗体医薬である場合は、第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体は抗体医薬以外の抗ヒトＨＥＲ２タンパク質抗体であることが好ましく、第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が抗体医薬以外の抗ヒトＨＥＲ２タンパク質抗体である場合は、第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体は抗体医薬であることが好ましい。
〔抗ＨＥＲ２タンパク質抗体の標識〕
　コンジュゲートパッドに保持される第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体は標識されていることが好ましい。標識物質は、抗体の標識に用いられる公知の標識物質であれば特に限定されないが、免疫凝集反応に使用可能な公知のコロイド微粒子を用いることが好ましい。具体的には、例えば金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、ラテックス粒子、これらの複合コロイドなどが挙げられる。好ましくは、金コロイド、銀コロイド、白金コロイドなどの着色金属コロイド、またはこれらの複合コロイドである。より好ましくは、赤色を示す金コロイド、黄色を示す銀コロイドであり、さらに好ましくは金コロイドである。コロイド微粒子の平均粒径は、約１ｎｍ～約５００ｎｍが好ましく、約１０ｎｍ～約１５０ｎｍがより好ましく、約２０ｎｍ～約１００ｎｍがさらに好ましい。コロイド微粒子として金コロイドを用いる場合、市販の金コロイド粒子や金コロイド標識キットを好適に用いることができる。または公知の方法により金コロイド粒子を調製してもよい。公知の金コロイド粒子の調製方法としては、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法などが挙げられる。
〔コントロール抗体〕
　本明細書では、第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体に結合する抗体をコントロール抗体と称する。したがって、コントロール抗体には、第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体、すなわち標識された抗ＨＥＲ２タンパク質抗体と結合できる抗体が使用される。コントロール抗体は、使用する標識抗ＨＥＲ２タンパク質抗体と結合できる抗体であれば特に限定されず、標識抗ＨＥＲ２タンパク質抗体の動物種および抗体のクラスに応じて、市販の抗体から適宜選択して使用することができる。また、コントロール抗体を自作して使用することができる。コントロール抗体はポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体でもよく、第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体に結合能を有する抗体フラグメントでもよい。
〔コンジュゲートパッドの作製〕
　標識された抗ＨＥＲ２タンパク質抗体をパッド素材（セルロース膜、ガラス繊維、不織布など）に保持させる方法は特に限定されない。例えば、標識された抗ＨＥＲ２タンパク質抗体を適当な溶媒に懸濁してコロイド溶液とし、当該コロイド溶液を塗布、スプレー、浸漬等によりパッド素材に均一に染み込ませて、その後乾燥させる方法を用いることができる。乾燥方法は特に限定されず、例えば自然乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥、熱乾燥等の乾燥手段を用いることができる。コンジュゲートパッドに保持された抗ＨＥＲ２タンパク質抗体は、試料により容易に溶出され、試料と共に移動しながら試料中のＨＥＲ２タンパク質に結合する必要がある。そのため、抗ＨＥＲ２タンパク質抗体を懸濁する溶媒に、スクロース、マルトース、ラクトース等の糖類、マンニトール等の糖アルコールを添加することが好ましい。あるいは、これらの物質を予めパッド素材にコーティングしておいてもよい。
〔メンブレンへの抗体の固相化〕
　メンブレンには、第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域およびコントロール抗体が固相化された領域が形成される。メンブレンは、さらに第三の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域を有していてもよい。抗体をメンブレンに固相化する方法は特に限定されず、公知の物理的手段または化学的手段により固相化することができる。例えば、抗体溶液をメンブレン表面に滴下して乾燥させることにより、抗体をメンブレンに物理的に吸着させる方法などが挙げられる。抗体固相化領域の形状は、局所的に抗体が固相化されて、着色が目視で確認できる形状であれば特に限定されない。例えば円状、帯状、線状などが挙げられる。固相化する抗体量は、検出感度を考慮して適宜設定することができる。例えば、１領域の抗体量が約０．０１μｇ～約５μｇの範囲で固相化することが好ましい。
〔サンプルパッドの非特異的吸着防止処理〕
　試料中の分析対象物がサンプルパッドの材質に非特異的に吸着することを防止するために、サンプルパッドに対して非特異的吸着防止処理を行うことが好ましい。非特異的吸着防止処理としては、例えばＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、スキムミルク、カゼイン等の公知のブロッキング剤をサンプルパッドに均一に染み込ませて乾燥させる方法などが挙げられる。具体的には、例えば濃度が約１質量％～約５質量％になるように適当な溶媒を用いてブロッキング剤溶液を調製し、この溶液をテストストリップ１枚当たり約６０μＬ染み込ませて、その後乾燥することにより、非特異的吸着防止処理を行うことができる。非特異的吸着防止処理はメンブレンに行ってもよく、サンプルパッドとメンブレンの両方に行ってもよい。メンブレンの非特異的吸着防止処理は、上記サンプルパッドの非特異的吸着防止処理と同様に行うことができる。
〔ラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップの作製〕
　ラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップは、試料が流れる方向（図１の矢印の方向）の上流から下流に向かって、サンプルパッド４、コンジュゲートパッド３、メンブレン１および吸収パッド２を連結することにより作製することができる。各部材間で毛細管現象を生じさせ易くするために、隣接する部材を１ｍｍ～７ｍｍ程度重ね合わせることが好ましい。また、これらの部材を粘着剤付きのバッキングシート上に貼付することが好ましい。バッキングシートとしては、市販のイムノクロマト用バッキングシートを好適に用いることができる。
〔試料の調製〕
　試料はがん患者から採取されたがん組織から調製される。対象のがん患者は、ＨＥＲ２が過剰発現しているがんを患っていることが疑われるがん患者である。ＨＥＲ２の過剰発現が確認されているがんとしては、乳がん、胃がん、食道がん、大腸がん、胆管がん、胆嚢がん、非小細胞肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮がん、唾液腺がんなどが挙げられる。したがって、対象のがん患者は、これらのがんを患っているがん患者であることが好ましい。より好ましくは、乳がん患者、胃がん患者、食道がん患者、大腸がん患者、胆管がん患者、頭頸部がん患者であり、さらに好ましくは乳がん患者、胃がん患者であり、特に好ましくは胃がん患者である。
　がん組織は、検査対象のがん患者から採取されたものであればよい。生検組織でもよく、手術により摘出されたがん組織でもよい。好ましくは内視鏡検査により採取された生検組織であり、より好ましくは、上部消化管内視鏡検査により採取された生検組織である。
　上記のがん組織からタンパク質抽出液を調製し、これをラテラルフローイムノアッセイの試料に用いることが好ましい。タンパク質抽出液は、公知の方法を用いて調製することができる。具体的には、例えば、がん組織に市販の組織溶解液（例えば、ＲＩＰＡ（Radio-Immunoprecipitation Assay）バッファーなど）を添加してホモジネートし、得られた組織溶解液を遠心分離し、その上清をタンパク質抽出液として使用することができる。得られたタンパク質抽出液は、－８０℃で凍結保存することができる。タンパク質抽出液は、ラテラルフローイムノアッセイに供する際に、試料中の総タンパク質量が一定の範囲に収まるように、適宜希釈して使用することが好ましい。試料中の総タンパク質量は、検出感度を考慮して適宜設定することができる。タンパク質濃度は、公知の方法（例えば、市販のタンパク質定量キット）を用いて測定することができる。サンプルパッドへの試料の添加量は、テストストリップの大きさや形状に応じて適宜設定することができる。
〔判定方法〕
　判定は、通常、メンブレンに形成された抗ＨＥＲ２タンパク質抗体固相化領域の着色を目視で観察することにより行われる。また、市販のイムノクロマトリーダーを使用することもできる。なお、コントロール抗体固相化領域の着色が観察されない場合は、検査は無効と判定する。
〔第１の実施形態〕
　本発明の第１の実施形態は、第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体として、ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬を用いたラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップを使用して実施される。ここでは抗体医薬としてトラスツズマブを用いる場合について説明するが、トラスツズマブ以外の抗体医薬を用いる場合も同様に実施することができる。
　トラスツズマブは金コロイド標識され、コンジュゲートパッドに保持される。第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体には、ヒトＨＥＲ２タンパク質と特異的に結合できる市販の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体を用いる。コントロール抗体には金コロイド標識されたトラスツズマブと結合できる抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体など）を用いる。第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体とコントロール抗体は、メンブレン上の異なる領域にそれぞれ固相化されている。
　試料（タンパク質抽出液）をサンプルパッドに添加すると、コンジュゲートパッドの方向に展開する。コンジュゲートパッドに到達した試料は保持されている金コロイド標識トラスツズマブを溶出しながらさらに下流に展開する。試料中にＨＥＲ２タンパク質が存在する場合は、金コロイド標識トラスツズマブがＨＥＲ２タンパク質と結合し、複合体を形成する。この複合体は、メンブレンに固相化された第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体およびコントロール抗体に捕捉され、各固相化領域は赤色に着色される。コントロール抗体には複合体を形成していない金コロイド標識トラスツズマブも捕捉される。試料中にＨＥＲ２が存在しない場合は、金コロイド標識トラスツズマブはＨＥＲ２タンパク質と複合体を形成しないので、コントロール抗体固相化領域は金コロイド標識トラスツズマブを捕捉して赤色に着色するが、第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体固相化領域は着色しない。したがって、コントロール抗体固相化領域が着色することを前提として、第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体固相化領域が着色した場合に陽性と判定し、第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体固相化領域が着色しなかった場合に陰性と判定する。陽性と判定された患者は、トラスツズマブによる治療が有効な患者と判断することができる。
　本実施形態において、トラスツズマブに代えてペルツズマブを用いた場合、陽性と判定された患者は、ペルツズマブによる治療が有効な患者と判断することができる。また、本実施形態において、トラスツズマブに代えてトラスツズマブ－エムタンシンを用いた場合、陽性と判定された患者は、トラスツズマブ－エムタンシンによる治療が有効な患者と判断することができる。
〔第２の実施形態〕
　本発明の第２の実施形態は、第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体として、ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬を用いたラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップを使用して実施される。ここでは抗体医薬としてトラスツズマブを用いる場合について説明するが、トラスツズマブ以外の抗体医薬を用いる場合も同様に実施することができる。
　第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体には、ヒトＨＥＲ２タンパク質と特異的に結合できる市販の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体を用いる。第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体は金コロイド標識され、コンジュゲートパッドに保持される。コントロール抗体には、金コロイド標識された第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体と結合できる抗体を用いる。トラスツズマブとコントロール抗体は、メンブレン上の異なる領域にそれぞれ固相化されている。
　試料添加後は上記第１の実施形態と同様に試料が展開する。試料中にＨＥＲ２タンパク質が存在する場合は、トラスツズマブ固相化領域とコントロール抗体固相化領域の両方が赤色に着色し、試料中にＨＥＲ２タンパク質が存在しない場合は、コントロール抗体固相化領域のみが赤色に着色する。したがって、コントロール抗体固相化領域が着色することを前提として、トラスツズマブ固相化領域が着色した場合に陽性と判定し、トラスツズマブ固相化領域が着色しなかった場合に陰性と判定する。陽性と判定された患者は、トラスツズマブによる治療が有効な患者と判断することができる。
　本実施形態において、トラスツズマブに代えてペルツズマブを用いた場合、陽性と判定された患者は、ペルツズマブによる治療が有効な患者と判断することができる。また、本実施形態において、トラスツズマブに代えてトラスツズマブ－エムタンシンを用いた場合、陽性と判定された患者は、トラスツズマブ－エムタンシンによる治療が有効な患者と判断することができる。
〔第３の実施形態〕
　本発明の第３の実施形態は、上記第２の実施形態において、第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体とは異なる、ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬を、さらにメンブレンに固相化したラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップを使用して実施される。第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体とは異なる、ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬は１種類でもよく、２種類以上でもよい。２種類の抗体医薬をそれぞれ第二および第三の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体として用いる場合、例えば、トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせ、ペルツズマブとトラスツズマブ－エムタンシンの組み合わせ、トラスツズマブとトラスツズマブ－エムタンシンの組み合わせなどを選択することができる。３種類の抗体医薬をそれぞれ第二、第三および第四の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体として用いる場合、例えば、トラスツズマブとペルツズマブとトラスツズマブ－エムタンシンの組み合わせなどを選択することができる。
　第３の実施形態では、コントロール抗体固相化領域が着色することを前提として、複数設けた抗体医薬固相化領域の少なくとも１つが着色した場合に陽性と判定し、複数設けた抗体医薬固相化領域の全てが着色しなかった場合に陰性と判定する。例えば３種類の抗体医薬固相化領域を有するラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップを使用した場合、三か所の抗体医薬固相化領域の全てが着色した患者のがん組織は、固相化されたいずれの抗体医薬とも結合性の高いＨＥＲ２タンパク質を過剰発現していると考えられるため、固相化された抗体医薬の全てが有効な患者と判断することができる。着色した抗体医薬固相化領域と着色しなかった抗体医薬固相化領域が混在した患者のがん組織は、着色した領域に固相化された抗体医薬との結合性が高く、着色しなかった領域に固相化された抗体医薬との結合性が低いＨＥＲ２タンパク質を過剰発現していると考えられるため、着色した領域に固相化された抗体医薬による治療は有効であるが、着色しなかった領域に固相化された抗体医薬による治療は有効でないと判断することができる。２種類の抗体医薬を用いた場合、および４種類以上の抗体医薬を用いた場合も同様に判断することができる。
　このように、第３の実施形態は、個々のがん患者の治療に使用する抗体医薬の選択に利用することができる点で非常に有用性が高いと考えられる。さらに新たな抗体医薬が開発された場合には、抗ＨＥＲ２タンパク質抗体固相化領域の数を増やすことにより、使用可能な複数の抗体医薬の中から患者に適した抗体医薬を選択することができると考えられる。
　本発明のキットは、がん組織中のＨＥＲ２タンパク質を検出するためのラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップを含むものであればよい。当該ラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップについては、既に説明した通りである。これら以外の具体的なキットの構成については特に限定されるものではなく、他に必要な試薬、器具、使用説明書等を適宜選択してキットの構成とすればよい。本発明のキットを用いることにより、ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬の投与が有効ながん患者を迅速、簡便かつ確実に選択することができる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下において特に断りのない場合、％は質量％を示す。
〔参考例１：ウエスタンブロッティング法による胃がん細胞株のＨＥＲ２発現の検討〕
１．実験材料および方法
（１）使用細胞
　ヒト胃がん細胞株として、ＭＫＮ１（理化学研究所バイオリソースセンター番号：ＲＣＢ１００３）、ＭＫＮ７（理化学研究所バイオリソースセンター番号：ＲＣＢ０９９９）、ＭＫＮ４５（理化学研究所バイオリソースセンター番号：ＲＣＢ１００１）、ＭＫＮ７４（理化学研究所バイオリソースセンター番号：ＲＣＢ１００２）、ＧＬＭ１（Nakanishi, H., K. Yasui, Y. Ikehara, H. Yokoyama, S. Munesue, Y. Kodera and M. Tatematsu. "Establishment and Characterization of Three Novel Human Gastric Cancer Cell Lines with Differentiated Intestinal Phenotype Derived from Liver Metastasis." Clin Exp Metastasis 22, no. 2 (2005): 137-47.）、ＧＬＭ２（同上）、ＧＬＭ４（Yokoyama, H., Y. Ikehara, Y. Kodera, S. Ikehara, Y. Yatabe, Y. Mochizuki, M. Koike, M. Fujiwara, A. Nakao, M. Tatematsu and H. Nakanishi. "Molecular Basis for Sensitivity and Acquired Resistance to Gefitinib in Her2-Overexpressing Human Gastric Cancer Cell Lines Derived from Liver Metastasis." Br J Cancer 95, no. 11 (2006): 1504-13.）、ＡＧＳ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ－１７３９）、ＫＡＴＯＩＩＩ（理化学研究所バイオリソースセンター番号：ＲＣＢ２０８８）、ＨＧＣ２７（理化学研究所バイオリソースセンター番号：ＲＣＢ０５００）を用いた。ＧＬＭ１、ＧＬＭ２およびＧＬＭ４は、愛知県がんセンター研究所から供与を受けた。
　対照として、乳がん細胞株ＭＣＦ７（理化学研究所バイオリソースセンター番号：ＲＣＢ１９０４）を用いた。ＭＣＦ７はＨＥＲ２の発現レベルが低いことが知られている。
　細胞は１００ｍｍ細胞培養用ディッシュで培養した。培地には、各細胞に適した公知の培地を選択して使用した。
（２）タンパク質抽出液の調製
　細胞を培養しているディッシュの培地を廃棄し、ＰＢＳで２回洗浄した。プロテアーゼインヒビター（Roche社、Complete Mini）を加えたＲＩＰＡバッファー（10mM Tris-HCl、pH7.4 150mM NaCl、1% NP40、0.1% SDS、0.1％ sodium deoxycholate (DOC)、1mM EDTA、1mM Na3VO4、2mM PMSF）をディッシュに加え細胞を溶解し、スクレイパーで細胞溶解液を掻き取り、回収した。得られた細胞溶解液を遠心分離し（14,000rpm, 4℃, 30min）、上清をタンパク質抽出液として－８０℃で保存した。使用時に融解して試験に供した。
（３）ウエスタンブロッティング
　上記（２）で調製した各細胞のタンパク質抽出液のタンパク質濃度をＰＩＥＲＣＥ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ThermoFischer Scientific社）を用いて定量した。タンパク質濃度が１５μｇ／レーンになるようにサンプルバッファー（ナカライテスク社、Sample Buffer Solution with Reducing Reagent(6x) for SDS-PAGE）で希釈し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。トランスブロットＴｕｒｂｏ転写システム（BIO-RAD社）を用いて、ＰＶＤＦ膜に転写した。抗ＨＥＲ２抗体（CST社 HER2/ErbB2 Antibody）、２次抗体（GE healthcare社 ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab from donkey）、抗β－Ａｃｔｉｎ抗体（CST社 β-Actin (13E5) Rabbit mAb HRP Conjugate）の各抗体を用いて免疫ブロットを行った。発色剤にはＩｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ（Merck Millipore社）を使用した。撮影は、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＸＲＳ＋（BIO-RAD社）で行った。
（４）デンシトメトリーによる定量
　撮影した画像をＩｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェア（BIO-RAD社）で解析し、各バンドのシグナル強度を得た。リコンビナントＨＥＲ２タンパク（SignalChem社, HER2, Active, E27-11G, 分子量131）を用いて検量線を作成し、この検量線に基づいて各タンパク質抽出液のＨＥＲ２濃度を求めた。
２．結果
　結果を図２に示した。上段がウエスタンブロッティングでＨＥＲ２タンパク質を検出した結果、中段がウエスタンブロッティングでβ－アクチンを検出した結果、下段がＨＥＲ２タンパク質のウエスタンブロッティング画像に基づいて、デンシトメトリーによりＨＥＲ２タンパク質を定量した結果である。これらの結果から、ＭＫＮ７、ＧＬＭ１、ＧＬＭ２およびＧＬＭ４のＨＥＲ２発現レベルが高いことが明らかになった。
〔実施例１：テストストリップの作製（１）〕
１－１　ストリップ材料
　メンブレンには、ニトロセルロースメンブレンカード（Merck Millipore社、HF120MC100、60mm×301mm）を使用した。コンジュゲートパッドには、グラスファイバーパッド（Merck Millipore社、GFCP103000）を使用した。サンプルパッドおよび吸収パッドには、セルロースパッド（Merck Millipore社、CFSP173000）を使用した。
１－２　使用抗体
　第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体（以下、「第一抗体」と記す）には、抗ＨＥＲ２マウスモノクローナル抗体（HER-2/ErbB2 Monoclonal Antibody (N24)、Thermo Scientific社、MA1-12691）を使用した。第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体（以下、「第二抗体」と記す）には、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）注射用６０、中外製薬製）を使用した。コントロール抗体には、抗マウスＩｇＧ抗体（Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody、Thermo Scientific社、PA1-28555）を使用した。抗体の希釈には、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ＰＢＳ（CANDOR Bioscience社、131050、以下「抗体希釈液」と記す）を使用した。
１－３　第二抗体の固相化
　ハーセプチン（登録商標）注射用６０を添付文書のとおりに溶解し、２１ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブ溶液を調製した。これを抗体希釈液で希釈し、所望の濃度のトラスツズマブ溶液を調製した。抗マウスＩｇＧ抗体を抗体希釈液で希釈して０．５ｍｇ／ｍＬのコントロール抗体溶液を調製した。各抗体溶液１μＬをマイクロピペットを用いてメンブレンに添着させ、３７℃で１２０分間乾燥させた。
１－４　コンジュゲートパッドの作製
１－４－１　第一抗体の金コロイド標識
　抗ＨＥＲ２マウスモノクローナル抗体の金コロイド標識には、金コロイド標識キット（BBI GoldLink Kits、BBInternational社、GLK 10.40）を用いた。キットのプロトコールに従って金コロイド標識を行い、溶液５０μＬ中に抗体１μｇを含む金コロイド標識第一抗体の溶液を得た。
１－４－２　コンジュゲートパッドの作製
　得られた金コロイド標識第一抗体の溶液１容に対して、塗布バッファー（5%スクロース, 2mMホウ酸溶液）２５容を添加して希釈し、これをコンジュゲートパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ）に均一に染み込ませた。テストストリップ１枚あたりのコンジュゲートパッド（5mm×10mm）に含まれる、上記手法により得られた金コロイド標識第一抗体の溶液量が１μＬになるように、コンジュゲートパッドの面積と染み込ませる抗体溶液量を適宜調整した。その後、コンジュゲートパッドを水平に保った状態で、室温で一夜乾燥させた。
１－５　サンプルパッドの作製
　ＢＳＡ（和光純薬、015-21274）をＰＢＳ（PBSタブレット（タカラバイオ）を超純水で溶解したもの）で溶解し、５％ＢＳＡ／ＰＢＳを調製した。これをサンプルパッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ）に均一に染み込ませた。テストストリップ１枚あたりのサンプルパッド（5mm×17mm）に、６０μＬの５％ＢＳＡ／ＰＢＳが含まれるように、サンプルパッドの面積と染み込ませる液量を適宜調整した。その後、サンプルパッドを水平に保った状態で、室温で一夜以上かけて完全に乾燥させた。
１－６　ハーフストリップの作製
　ハーフストリップは、トラスツズマブとコントロール抗体（抗マウスＩｇＧ抗体）が固相化されたメンブレンおよび吸収パッドの２つで構成された予備検討用のストリップである。試料と金コロイド標識第一抗体を含む溶液にメンブレンの一端（吸収パッドが連結されていない方）を浸漬し、溶液を吸収パッドの方向に展開させて使用する。
　ハーフストリップは以下の手順で作製した。
（１）メンブレンカードのサンプルパッドおよびコンジュゲートパッド貼付部を切り離す
（２）吸収パッドをメンブレンカードに貼付
（３）５ｍｍ幅に切断
（４）メンブレンにトラスツズマブを固相化（上記１－３参照）
（５）メンブレンに抗マウスＩｇＧ抗体を固相化（上記１－３参照）
１－７　ラテラルフローストリップの作製
　ラテラルフローストリップは以下方法の手順で作製した。
（１）吸収パッドをメンブレンカードに貼付
（２）金コロイド標識第一抗体を保持させたコンジュゲートパッドを、メンブレンカードに貼付
（３）ＢＳＡを保持させたサンプルパッドをコンジュゲートパッドに貼付
（４）５ｍｍ幅に切断
（５）メンブレンにトラスツズマブを固相化（上記１－３参照）
（６）メンブレンに抗マウスＩｇＧ抗体を固相化（上記１－３参照）
　以下の実施例において、第二抗体を固相化した領域を「テストライン」と称し、コントロール抗体を固相化した領域を「コントロールライン」と称する。
〔実施例２：ハーフストリップによるＨＥＲ２タンパク質の検出〕
１．実験材料および方法
（１）試料
　参考例１で調製したタンパク質抽出液を使用した。使用した細胞は、ＭＫＮ１、ＭＫＮ７、ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４、ＡＧＳ、ＫＡＴＯＩＩＩ、ＨＧＣ２７、ＭＣＦ７（ネガティブコントロール）である。
（２）ストリップ
　実施例１で作製したハーフストリップを使用した。テストラインの抗体（トラスツズマブ）量は５μｇとした。
（３）検出方法
　９６ウェルプレートを使用した。タンパク質抽出液からのタンパク質量が６０μｇ／ウェル、ＢＳＡ濃度が３％／ウェル、実施例１の１－４－１で調製した金コロイド標識第一抗体の溶液量が１μＬ／ウェル、ウェルあたりの液量が１００μＬになるように試料を調製した。ハーフストリップのメンブレンの一端を試料溶液中に浸漬して展開させ、テストラインおよびコントロールラインの着色を観察した。テストラインの着色が目視で確認できるものを陽性と判断した。
２．結果
　結果を図３に示した。図３の上段の数値は、上記参考例１においてデンシトメトリーで定量した各細胞株のタンパク質抽出液におけるＨＥＲ２タンパク質濃度を示している。図３から明らかなように、ＨＥＲ２発現レベルが高いＭＫＮ７で明瞭なシグナルを検出した。また、ＭＫＮ７４、ＫＡＴＯＩＩＩおよびＨＧＣ２７でも弱いシグナルを検出した。この結果から、ラテラルフローアッセイにより、ＨＥＲ２陽性胃がんの検出が可能であることが示された。
〔実施例３：テストライン抗体量の検討〕
１．実験材料および方法
（１）試料
　参考例１で調製したＭＫＮ７のタンパク質抽出液を使用した。
（２）ストリップ
　実施例１で作製したハーフストリップを使用した。テストラインの抗体（トラスツズマブ）量が１、３、５、１０または２０μｇである５種類を使用した。
（３）検出方法
　実施例２と同じ方法で行った。
２．結果
　結果を図４に示した。図４から明らかなように、シグナル強度はテストラインの抗体量に依存して増強された。この結果は、テストラインの抗体量を増減させることにより検出感度を調節できることを示すものである。
〔実施例４：ラテラルフローストリップによるＨＥＲ２タンパク質の検出〕
１．実験材料および方法
（１）試料
　参考例１で調製したＭＫＮ７およびＭＣＦ７（コントロール）のタンパク質抽出液を使用した。
（２）ストリップ
　実施例１で作製したラテラルフローストリップを使用した。テストラインの抗体（トラスツズマブ）量は５μｇとした。
（３）検出方法
　タンパク質抽出液からのタンパク質量が２００μｇ、液量が１００μＬとなるように試料を調製し、試料の全量をサンプルパッド部分に添加して展開させた。コントロールラインおよびテストラインの着色を目視で観察した。
２．結果
　結果を図５に示した。図５から明らかなように、ＭＫＮ７ではコントロールラインおよびテストラインのシグナルが認められたが、ＭＣＦ７ではテストラインのシグナルが認められなかった。
〔参考例２：ウエスタンブロッティング法による胃がん細胞株のＨＥＲ２発現の検討〕
１．実験材料および方法
（１）使用細胞（参考例１参照）
　ヒト胃がん細胞株として、ＭＫＮ１、ＭＫＮ７、ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４、ＧＬＭ１、ＧＬＭ２、ＧＬＭ４、ＡＧＳ、ＨＧＣ２７を用いた。対照として、乳がん細胞株ＭＣＦ７を用いた。
（２）タンパク質抽出液の調製
　参考例１と同じ方法で、各細胞からそれぞれタンパク質抽出液を調製した。
（３）ウエスタンブロッティング
　参考例１と同じ方法で、ウエスタンブロッティングを行った。
（４）ＥＬＩＳＡによる定量
　ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Novus Biologicals社、NBP1-84823）を用いて、各細胞から調製したタンパク質抽出液中のＨＥＲ２タンパク質濃度を定量した。定量値は、溶液中のＨＥＲ２タンパク質濃度ではなく、溶液中の単位タンパク質量あたりのＨＥＲ２タンパク質量で表した。
２．結果
　結果を図６に示した。上段がウエスタンブロッティングでＨＥＲ２タンパク質を検出した結果、中段がウエスタンブロッティングでβ－アクチンを検出した結果、下段がＥＬＩＳＡによりＨＥＲ２タンパク質を定量した結果である。これらの結果から、ＧＬＭ１およびＧＬＭ４のＨＥＲ２発現レベルが非常に高く、次いでＭＫＮ７およびＧＬＭ２のＨＥＲ２発現レベルが高いことが明らかになった。
〔実施例５：テストストリップの作製（２）〕
５－１　ストリップ材料
　メンブレンには、ニトロセルロース膜（Merck Millipore社、HF13504）を使用した。サンプルパッドおよびコンジュゲートパッドには、グラスファイバーパッド（Merck Millipore社、GFDX203000）を使用した。吸収パッドには、セルロースパッド（Merck Millipore社、CFSP223000）を使用した。
５－２　使用抗体
　実施例１で作製したテストストリップの第一抗体と第二抗体を逆にして、テストストリップを作製した。すなわち、第一抗体には、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）注射用６０、中外製薬製）を使用した。第二抗体には、抗ＨＥＲ２マウスモノクローナル抗体（HER-2/ErbB2 Monoclonal Antibody (N24)、Thermo Scientific社、MA1-12691）を使用した。コントロール抗体には、抗マウスＩｇＧ抗体（Goat anti-Mouse IgG’s、日本製粉）を使用した。抗体の希釈には、実施例１と同じ抗体希釈液を使用した。
５－３　第二抗体の固相化
　抗ＨＥＲ２マウスモノクローナル抗体および抗マウスＩｇＧをそれぞれ抗体希釈液で希釈して、０．１μｇ／μＬの抗体溶液を調製し、スポット当たり１μＬの抗体溶液をマイクロピペットを用いてメンブレンに添着させた（抗体０．１μｇ／スポット）。抗ＨＥＲ２マウスモノクローナル抗体は１箇所、抗マウスＩｇＧは２箇所にスポットした。メンブレンを５０℃で３０分乾燥させた。続いて、メンブレンを、ブロッキングバッファー（0.5%カゼイン、50mMホウ酸、pH 8.5）に浸漬し、室温で３０分間静置した。メンブレンを洗浄・安定化バッファー（0.5% スクロース、0.05% コール酸ナトリウム、50mM Tris-HCl、pH 7.5）に移して浸漬し、室温で３０分以上静置した。メンブレンを引き上げ、ペーパータオル上に置き、室温で一晩乾燥させた。このようにして得られたメンブレンは、乾燥剤と共にアルミパウチに入れて保存することができる。
５－４　コンジュゲートパッドの作製
５－４－１　第一抗体の金コロイド標識
　トラスツズマブの金コロイド標識は、以下の手順で行った。
（１）ハーセプチン（登録商標）注射用６０を添付文書のとおりに溶解し、蒸留水で希釈して７０μｇ／ｍＬのトラスツズマブ溶液を調製した。
（２）２ｍＬの５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（pH8.0）に金コロイド液（Gold Colloid 40nm、BBI solution社）１８ｍＬを加え、攪拌しながら２ｍＬの上記トラスツズマブ溶液を添加した。
（３）さらに、１％ ＰＥＧ２００００を１．１ｍＬ加え、攪拌した。
（４）８，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清が１ｍＬ程度残るように余分な上清を除去した。
（５）超音波洗浄機を用いて、残した上清に沈殿を分散させた。
（６）金コロイド保存バッファー（20mM Tris-HCl (pH8.2), 0.05% PEG 20,000, 150mM NaCl, 1%BSA, 0.1% NaN3）２０ｍＬを加え、攪拌した。
（７）（４）および（５）を再度行った。
（８）２回目の（５）で得られた分散液５０μＬを分取し、金コロイド保存バッファー９５０μＬを加えてＯＤ５２０を測定した。
（９）金コロイド保存バッファーでＯＤ５２０＝６．０になるように調製し、金コロイド標識第一抗体の溶液を得た。
５－４－２　コンジュゲートパッドの作製
　上記調製した金コロイド標識第一抗体の溶液５００μＬに、蒸留水５００μＬと金コロイド塗布バッファー（20mM Tris-HCl (pH8.0), 0.05% PEG 20,000, 5% スクロース）１ｍＬとを混合し、軽く攪拌した。グラスファイバーパッド（300mm）１枚あたり、上記混合液１．６ｍＬを均等に塗布した。パッドをデシケーターに入れ室温で一夜以上かけて減圧乾燥を行った。乾燥後のコンジュゲートパッドは、シリカゲルを同封したビニール袋内で遮光保存することができる。
５－５　ラテラルフローストリップの作製
　縦６０ｍｍ×横３００ｍｍのイムノクロマト用バッキングシートの上端から１５ｍｍのところに、縦２５ｍｍ×横３００ｍｍのメンブレンの上端が来るように貼り付けた。メンブレンの下端はバッキングシートの下端から20mmとなる。次に、縦２０ｍｍ×横３００ｍｍの吸収パッドの上端をバッキングシートの上端に合わせて貼り付けた。この際、吸収パッドはメンブレンと５ｍｍほど重なる。次いで、縦８ｍｍ×横３００ｍｍのコンジュゲートパッドを、その下端がバックシートの下端から１４ｍｍの位置となるように貼り付けた。この際、コンジュゲートパッドの上端側２ｍｍほどが、メンブレンシートの上に重なる。さらに、縦１８ｍｍ×横３００ｍｍのサンプルパッドの下端をバックシートの下端に合わせて貼り付けた。この際、サンプルパッドの上端側は４ｍｍが、コンジュゲートパッドの上に重なる。貼り合わせたシートを５ｍｍ幅に切断してラテラルフローストリップを作製した。作製したラテラルフローストリップは、シリカゲルと共にアルミパウチに入れ、室温で保存することができる。
〔実施例６：胃がん細胞株由来タンパク質抽出液中のＨＥＲ２タンパク質の検出〕
１．実験材料および方法
（１）試料
　参考例２で調製した９種類のヒト胃がん細胞株由来のタンパク質抽出液を使用した。コントロールとして、参考例２で調製した乳がん細胞株ＭＣＦ７由来のタンパク質抽出液を使用した。
（２）ストリップ
　実施例５で作製したラテラルフローストリップを使用した。
（３）検出方法
　タンパク質抽出液からのタンパク質量が２μｇ、液量が１００μＬ（タンパク質濃度０．０２ｍｇ／ｍＬ）となるように試料を調製し、試料の全量をサンプルパッド部分に添加して展開させた。コントロールラインおよびテストラインの着色を目視で観察した。
２．結果
　結果を図７に示した。図７の上段の数値は、上記参考例２においてＥＬＩＳＡで定量した単位タンパク質量あたりのＨＥＲ２タンパク質量を示し、図７の中段の数値は、上段の数値に基づいて算出したストリップ当たりのＨＥＲ２タンパク質量を示している。ストリップ当たりのＨＥＲ２タンパク質量が１０ｎｇを超えると実施例５で作製したラテラルフローストリップで検出できる可能性が図７より考えられた。
〔実施例７：試料中のＨＥＲ２タンパク質濃度の検討〕
１．実験材料および方法
（１）試料
　参考例１で調製したＧＬＭ１のタンパク質抽出液を使用した。試料中の総タンパク質濃度（μｇ／ｍＬ）が０．２、０．０２、０．００２、０．０００２および０．００００２の５種類の試料を調製した。
（２）ストリップ
　実施例５で作製したラテラルフローストリップを使用した。
（３）検出方法
　各試料を１００μＬずつサンプルパッド部分に添加して展開させ、コントロールラインおよびテストラインの着色を目視で観察した。
２．結果
　結果を図８に示した。図８の上段の数値は試料中の総タンパク質濃度を示し、図８の中段の数値はストリップ当たりのＨＥＲ２タンパク質量を示している。ストリップ当たりのＨＥＲ２タンパク質量が１０ｎｇを超えると実施例５で作製したラテラルフローストリップで検出できる可能性が図８からも考えられた。
〔実施例８：異種移植片（Xenograft）由来試料およびヒト生検試料中のＨＥＲ２タンパク質濃度の検討〕
１．実験材料および方法
（１）異種移植片（Xenograft）由来試料の調製
　ＧＬＭ１およびＭＫＮ４５をそれぞれヌードマウスの皮下に接種し、腫瘍を形成させた。上部消化管内視鏡検査時に使用する生検鉗子を用いて腫瘍組織からサンプルを採取し、重量を測定した後、液体窒素中で保存した。採取した組織にＴ－ＰＥＲ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Thermo Scientific社）を加え、ホモジナイザー（ニッピ社, BioMasher II）でホモジナイズした。得られた組織溶解液を遠心分離し（10,000×ｇ、４℃、５分間）、その上清をタンパク質抽出液として－８０℃で保存した。使用時に融解して試験に供した。
（２）ヒト検体由来試料の調製
　胃がん患者から採取した生検検体を使用した。ＨＥＲ２の免疫染色でＨＥＲ２陽性であることを確認した症例の検体を使用した。対照として、同一患者の健常部の胃生検検体を使用した。上記（１）と同じ方法で、Ｔ－ＰＥＲ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを加えてホモジナイズ、遠心分離してタンパク質抽出液を調製し、－８０℃で保存した。使用時に融解して試験に供した。
（３）ストリップ
　実施例５で作製したラテラルフローストリップを使用した。
（４）検出方法
　上記（１）、（２）で調製した各タンパク質抽出液のＨＥＲ２濃度をＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Novus Biologicals社、NBP1-84823）を用いて算出した。上記４サンプルを、超純水を用いてすべて２００倍に希釈し、その１００μＬをサンプルパッド部分に添加して展開させた。コントロールラインおよびテストラインの着色を目視で観察した。
　結果を図９に示した。図９の上段の数値はストリップ当たりのＨＥＲ２タンパク質量を示している。図９から明らかなように、ＧＬＭ１由来の異種移植片（Xenograft）およびヒト腫瘍部の生検検体において、ＨＥＲ２を検出することができた。この結果から、作製したストリップを用いて、腫瘍組織からのタンパク抽出液でもＨＥＲ２タンパク質を検出できることが示された。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
　１　　　メンブレン
　２　　　吸収パッド
　３　　　コンジュゲートパッド
　４　　　サンプルパッド
　５　　　バックシート
　６　　　抗ＨＥＲ２タンパク質抗体固相化領域
　７　　　コントロール抗体固相化領域

Claims (18)

  1. 　ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬の投与が有効ながん患者を選択するためのキットであって、がん組織中のＨＥＲ２タンパク質を検出するためのラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップを含み、該テストストリップは、試料が流れる方向の上流から順に、試料を添加するサンプルパッド、第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が保持されたコンジュゲートパッド、第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域および第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体に結合する抗体が固相化された領域を有するメンブレン、ならびに吸収パッドが連結された構成を有し、前記第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体および第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体のいずれか一方に、前記抗体医薬を用いることを特徴とするキット。
  2. 　前記抗体医薬が、トラスツズマブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブ－エムタンシンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載のキット。
  3. 　前記第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体がコロイド微粒子で標識されていることを特徴とする請求項１または２に記載のキット。
  4. 　前記第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体に前記抗体医薬を用いることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のキット。
  5. 　前記第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体に前記抗体医薬を用いることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のキット。
  6. 　前記メンブレンが、第三の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域、または、第三の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域と第四の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域をさらに含み、前記第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体、前記第三の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体および前記第四の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体はそれぞれ異なる前記抗体医薬であることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のキット。
  7. 　被験者から採取されたがん組織から調製したタンパク質抽出液を試料とすることを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載のキット。
  8. 　前記がん組織が生検組織であることを特徴とする請求項７に記載のキット。
  9. 　前記がん組織が上部消化管のがん組織であることを特徴とする請求項７または８に記載のキット。
  10. 　ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬の投与が有効ながん患者を選択する方法であって、以下の工程（１）～（３）を含むことを特徴とする方法：
    （１）被験者から採取されたがん組織から試料を調製する工程、
    （２）前記ＨＥＲ２タンパク質を治療標的分子とする抗体医薬を用いたラテラルフローイムノアッセイにより前記試料中のＨＥＲ２タンパク質を検出する工程、および
    （３）前記ラテラルフローイムノアッセイで陽性を示した被験者を選択する工程。
  11. 　前記抗体医薬が、トラスツズマブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブ－エムタンシンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記工程（２）において、試料が流れる方向の上流から順に、試料を添加するサンプルパッド、第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が保持されたコンジュゲートパッド、第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域および第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体に結合する抗体が固相化された領域を有するメンブレン、ならびに吸収パッドが連結された構成を有するラテラルフローイムノアッセイ用テストストリップを用い、前記第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体および第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体のいずれか一方に、前記抗体医薬を用いることを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 　前記第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体がコロイド微粒子で標識されていることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記第一の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体に前記抗体医薬を用いることを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 　前記第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体に前記抗体医薬を用いることを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。
  16. 　前記メンブレンが、第三の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域、または、第三の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域と第四の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体が固相化された領域をさらに含み、前記第二の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体、前記第三の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体および前記第四の抗ＨＥＲ２タンパク質抗体はそれぞれ異なる抗体医薬であることを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。
  17. 　前記がん組織が生検組織であることを特徴とする請求項１０～１６のいずれかに記載の方法。
  18. 　前記がん組織が上部消化管のがん組織であることを特徴とする請求項１０～１７のいずれかに記載の方法。
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