WO2017119576A1 - 올레산 수화효소 2를 이용한 생물전환공정 - Google Patents

올레산 수화효소 2를 이용한 생물전환공정 Download PDF

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seq
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오덕근
송지원
이정후
전은영
강우리
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats

Definitions

  • the present invention relates to a bioconversion process using oleic acid hydratase 2, and more particularly, the present invention relates to a bioconversion process for producing medium and heavy chain omega-hydroxy fatty acids from a long chain unsaturated fatty acid substrate using a novel oleic acid hydratase 2
  • Omega-Hydroxyfatty acid is a type of fatty acid that has one hydroxyl group (hydroxyl group) at the end of fatty acid (HOCH 2 (CH 2 ) n COOH). It is used as a monomer in the production of polyethylene-based plastics. It is widely used in the production and manufacture of cosmetics and pharmaceuticals (J. Am. Chem. Soc., 132: 15451-15455, 2010). It can also be used as a precursor of long-chain dicarboxylic acid synthesis, which is widely used in the production of polyamide, polyester-based plastics, cosmetics and household goods.
  • Medium chain fatty acids are widely used in the synthesis of ester-based perfumes / perfumes, and also have excellent antibacterial activity, and are widely used in the production of cosmetics, food, and household goods.
  • Korean Patent Publication No. 2013-0132254 discloses a series of enzymes consisting of fatty acid double bond hydratase, alcohol dehydrogenase, Baeyer-Villiger monooxygenase (BVMO), and ester hydrolase (esterase). Biotransformation processes have been disclosed that produce heavy and heavy chain omega-hydroxy fatty acids from long chain unsaturated fatty acid substrates using transformants in which the reaction system is expressed.
  • the method has the advantage of using a single transformant to obtain the desired product from the substrate, whereas the expression level of each enzyme expressed in the transformant is not the same, when the expression of one enzyme is inhibited
  • the disadvantage is that the overall bioconversion process does not proceed smoothly. For example, in the case of BVMO, despite being expressed in a large amount in the transformant, the ratio of being expressed in the water-soluble state is not high, and thus shows a low level of the overall biotransformation activity.
  • a method of replacing an enzyme expressed in the transformant with an enzyme showing higher activity or increasing the ratio expressed in a water-soluble state should be developed, but there are still very few research results. It is not reported.
  • the present inventors have made intensive studies to develop a high yield of hydroxyfatty acid from unsaturated fatty acids.
  • a novel oleic hydratase exhibiting superior activity to conventional oleic hydratase from stenotropomonas maltopilaa strains. 2
  • the present invention has been completed.
  • One object of the present invention is to provide a method for producing heavy and heavy chain omega-hydroxy fatty acids from long chain unsaturated fatty acid substrates using the novel oleic acid hydratase 2.
  • Another object of the present invention is to provide a novel oleic acid hydratase 2 used in the above method.
  • Still another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the oleic acid hydratase 2.
  • Another object of the present invention is to provide a method of increasing the water-soluble expression ratio relative to the total expression level of the protein of interest.
  • FIG. 1 is a graph comparing the production rate of 10-hydroxystearic acid produced from oleic acid (oleic acid) during bioconversion using oleic acid hydrase 2 and the conventional oleic acid hydrase
  • ( ⁇ ) Represents the oleic acid concentration of the reaction solution when using oleic acid hydratase 2
  • ( ⁇ ) represents the 10-hydroxystearic acid concentration of the reaction solution when using oleic acid hydratase 2
  • ( ⁇ ) is a conventional oleic acid hydrase
  • ( ⁇ ) indicates the 10-hydroxystearic acid concentration of the reaction solution when using the conventional oleic acid hydratase.
  • FIG. 2 shows the production of 10-hydroxyoctadec-12-enoic acid produced from linoleic acid during bioconversion using recombinant Escherichia coli expressing oleic acid hydrase 2 and recombinant Escherichia coli expressing conventional oleic hydrase.
  • ⁇ indicates the linoleic acid concentration of the reaction solution when using recombinant E. coli expressing oleic acid hydratase 2.
  • ( ⁇ ) represents the linoleic acid concentration of the reaction solution when using recombinant E. coli with conventional oleic hydrase
  • ( ⁇ ) shows the concentration of 10-hydroxyoctadec-12-enoic acid in the reaction solution when using recombinant E. coli expressing the conventional oleic acid hydratase.
  • FIG. 3 is a graph showing the production rate of 10-hydroxyfatty acid produced from soybean oil at the time of bioconversion using recombinant E. coli expressing lipolytic enzyme (TTL) and oleic acid hydratase 2,
  • TTL lipolytic enzyme
  • ⁇ Represents linoleic acid
  • ⁇ represents 10-hydroxyoctadec-12-enoic acid of the reaction solution
  • ⁇ represents oleic acid of the reaction solution
  • ( ⁇ ) represents 10-hydroxystearic acid of the reaction solution.
  • Figure 4a is an electrophoresis picture of BmoF1-3'UTR CAT mRNA levels in recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT variant
  • lane 1 is recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3 ' UTR native
  • lane 2 represents recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT257
  • lane 3 represents recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT357
  • lane 4 Represents recombinant E.
  • coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT557 and lane 5 represents recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT657 .
  • 4B is a photograph showing the results of SDS-PAGE (top panel) and Western blot (bottom panel) analysis of the water soluble fraction of BmoF1 in a variant of recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3′UTR CAT .
  • Figure 4c is an electrophoresis picture showing the results of SDS-PAGE analysis of the water-insoluble fraction of BmoF1 in the variant of recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT .
  • FIG. 5A is a graph showing the bioconversion of ricinoleic acid to ester using recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR native ,
  • ( ⁇ ) represents ricinoleic acid
  • ( ⁇ ) represents 12- Ketooleic acid (12-ketooleic acid)
  • ( ⁇ ) represents the ester of 12-ketooleic acid
  • ( ⁇ ) represents 11-hydroxyundec-9-enoic acid (11-hydroxyundec-9-enoic acid).
  • FIG. 5B is a graph showing the bioconversion of ricinoleic acid to ester using recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3′UTR CAT257 .
  • FIG. 5B is a graph showing the bioconversion of ricinoleic acid to ester using recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3′UTR CAT257 .
  • 5C is a graph showing the bioconversion of ricinoleic acid to esters using recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3′UTR CAT357 .
  • 5D is a graph showing the bioconversion of ricinoleic acid to esters using recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3′UTR CAT557 .
  • FIG. 5E is a graph showing the bioconversion of ricinoleic acid to ester using recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3′UTR CAT657 .
  • FIG. 5E is a graph showing the bioconversion of ricinoleic acid to ester using recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3′UTR CAT657 .
  • Figure 6 is a diagram showing the nucleotide sequence of the synthetic 3'UTR (UTRsyn) artificially made to include 18 RNase E cleavage sites, the RNase E cleavage sites in the UTRsyn nucleotides are underlined.
  • the 13th RNase E cleavage site GCATAT indicates that the two RNase E cleavage sites GCAT and ATAT overlap.
  • Figure 7 is the result of a biotransformation in ricinoleate ester of building a pET22b-BmoF1-3'UTR syn having UTRsyn a building in Figure 6, and a recombinant E. coli BL21 (DE3) containing the same pET22b-BmoF1-3'UTR syn
  • ⁇ represents ricinoleic acid
  • ⁇ represents 12-ketooleic acid
  • ⁇ represents ester of 12-ketooleic acid
  • ( ⁇ ) represents 11 -11-hydroxyundec-9-enoic acid.
  • 8A is a graph showing the bioconversion results of ricinoleic acid to ester using recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3'UTR native , ( ⁇ ) represents ricinoleic acid, and ( ⁇ ) represents 12 -Represents the ketooleic acid (12-ketooleic acid), ( ⁇ ) represents the ester of 12-ketooleic acid
  • 8B is a graph showing the results of bioconversion from ricinoleic acid to ester using recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-MO16-3'UTR CAT257 .
  • Figure 9a is a graph showing the results of bio conversion from oleic acid to ester using recombinant E. coli BL21 (DE3) pACYC-ADH-OhyA, pJOE-E6BVMO, ( ⁇ ) represents oleic acid, ( ⁇ ) is 10-hydroxystearic Acid (10-hydroxystearic acid), ( ⁇ ) represents 10-ketostearic acid, ( ⁇ ) represents the ester of 10-ketostearic acid.
  • FIG. 9B is a graph showing the results of bioconversion from oleic acid to ester using recombinant E. coli BL21 (DE3) pACYC-ADH-OhyA-FadL, pJOE-E6BVMO, which further introduced FadL in FIG. 9A.
  • FIG. 9C is a graph showing the results of bioconversion from oleic acid to ester using recombinant E. coli BL21 (DE3) pACYC-ADH-OhyA2-FadL and pJOE-E6BVMO in which the conventional oleic hydrase was replaced with oleic hydrase 2 in FIG. 9B. to be.
  • FIG. 9D shows recombinant E. coli BL21 (DE3) pACYC-ADH-OhyA2-FadL, pJOE-, replacing the conventional pJOE-E6BVMO-3'UTR native with the 3'UTR variant pJOE-E6BVMO-3'UTR syn in FIG. 9C. It is a graph showing the results of bio conversion from oleic acid to ester using E6BVMOsyn.
  • 10A is a graph showing the bioconversion results of linoleic acid to ester using recombinant E. coli BL21 (DE3) pACYC-ADH-OhyA, pJOE-E6BVMO, where ( ⁇ ) represents linoleic acid, and ( ⁇ ) represents 10-hydroxy Octadec-12-enoic acid (10-hydroxyoctadec-12-enoic acid), ( ⁇ ) represents 10-ketooctadec-12-enoic acid (10-ketooctadec-12-enoic acid), ( Represents a ester of 10-ketooctadec-12-enoic acid.
  • FIG. 10B is a graph showing the results of bioconversion from linoleic acid to ester using recombinant E. coli BL21 (DE3) pACYC-ADH-OhyA-FadL, pJOE-E6BVMO, which further introduced FadL in FIG. 10A.
  • FIG. 10C shows the results of bioconversion from linoleic acid to ester using recombinant E. coli BL21 (DE3) pACYC-ADH-OhyA2-FadL, pJOE-E6BVMO in which the conventional oleic hydrase was replaced with oleic hydrase 2 in FIG. 10B. It is a graph.
  • Figure 10d is a 10C in the alternative introducing the conventional pJOE-E6BVMO-native 3'UTR with a 3'UTR variants pJOE-E6BVMO-3'UTR syn recombinant E. coli BL21 (DE3) pACYC-ADH- OhyA2-FadL, pJOE- A graph showing the results of bioconversion from linoleic acid to ester using E6BVMOsyn.
  • the present inventors use a transformant expressing a series of enzymatic reaction systems consisting of fatty acid double bond hydratase, alcohol dehydrogenase, BVMO (Baeyer-Villiger monooxygenase) and ester hydrolase (esterase).
  • BVMO Brown-Villiger monooxygenase
  • ester hydrolase ester hydrolase
  • the long chain unsaturated fatty acid is introduced into the transformant, and is converted into a hydroxy fatty acid by a fatty acid double bond hydrase, and the hydroxy fatty acid is produced by an alcohol dehydrogenase. It is converted into a chito fatty acid, which is converted into a fatty acid ester derivative having an ester group introduced into the fatty acid chain by BVMO, and the fatty acid ester derivative is cleaved by ester hydrolase, and thus the heavy chain fatty acid and the heavy chain omega-hydroxy fatty acid.
  • the inventors of the present invention are stenotrophomonas maltopilaa with enhanced activity of oleic acid hydratase itself.
  • maltophilia strain-derived oleic acid hydrase 2 was found to be able to obtain a variety of hydroxy fatty acids in high yield and rate, the oleic acid hydrase 2 is a novel, conventionally used stenotropomonas maltophilia-derived oleic acid hydration
  • the reaction activity and the production rate is remarkably excellent, and when the oleic acid hydrase 2 is applied to the developed transformants, it was confirmed that the production yield of the hydroxy fatty acid can be improved.
  • the BVMO expressed in the transformant is aggregated in cells when overexpressed to form inclusion bodies, so that the ratio of water-soluble expression to the total expression level of the protein is 50% or less, so that the enzyme reaction efficiency thereof
  • a method of inserting an RNase E cleavage site into 3'UTR affects the stability of mRNA to increase the expression rate of water-soluble protein.
  • a polynucleotide having a form in which a UTR having a nucleotide sequence including an RNase E cleavage site is inserted to reduce the stability of mRNA is obtained, and the polynucleotide is expressed.
  • the expression ratio of the water-soluble protein form to the total expression level of the BVMO is increased, as a result it was confirmed that can improve the enzyme reaction efficiency of BVMO.
  • the transformant uses only the long chain unsaturated fatty acids present on the outside of the cell membrane of the transformant as substrates, the long chain unsaturated fatty acids outside the cell membrane are used in the transformant.
  • the carrier protein to be introduced into the can be improved the efficiency of the biotransformation process of the transformant.
  • FadL is an E. coli-derived long chain fatty acid transport protein, and as a result, confirmed that the efficiency of the bioconversion process was improved.
  • the present inventors have described the use of a transformant expressing a series of enzymatic reaction systems consisting of fatty acid double bond hydratase, alcohol dehydrogenase, BVMO and ester / fat hydrolase to obtain a heavy chain fatty acid from a long chain unsaturated fatty acid substrate.
  • a novel fatty acid double bond hydratase, oleic acid hydratase 2 was discovered, a method of improving the water-soluble expression rate of BVMO, and the influx of substrates into the transformants.
  • a method of promoting this has been developed, which has not been reported at all until now and was first developed by the present inventors.
  • the present invention (a) oleic acid hydrase 2, alcohol dehydrogenase (Baeyer-Villiger monooxygenase) and ester / fat hydrolase (esterase / lipase) Can express; By expressing a polynucleotide conjugated to the UTR (untranslated region) that changes the mRNA stability at the 3 'end of the gene encoding the BVMO, to obtain a transformant for a biotransformation process that can induce water-soluble expression of the BVMO step; And,
  • oleate hydratase 2 of the present invention is one of oleic acid hydrases, which is a type of fatty acid hydrase that catalyzes the reaction of converting oleic acid to 10-hydroxystearic acid, stenotropomonas.
  • hydroxy fatty acids 10-hydroxyoctadec-12-enoic acid, 10-hydroxyoctadec-6,12-dienoic acid, 10 10-hydroxy fatty acid, such as hydroxyoctadec-12,15-dienoic acid, 10-hydroxypalmitoleic acid or 10-hydroxystearic acid, 9-hydroxynonanoic acid, etc.
  • the oleic acid hydratase 2 is similar to the conventional oleic hydrase in that hydroxy fatty acids can be produced from long-chain unsaturated fatty acids, but various kinds of hydroxy fatty acids (10-hydroxyoctadec-12-eno Ic acid, 10-hydroxyoctadec-6,12-dienoic acid, 10-hydroxyoctadec-12,15-dienoic acid, 10-hydroxypalmitoleic acid, 10-hydroxystearic acid, etc.) It is distinguished from the conventional oleic hydrase in that it can be produced faster than the conventional oleic hydrase.
  • the oleic acid hydrase 2 is not particularly limited as long as it can exhibit enzymatic activity to produce hydroxy fatty acid, all the amino acid sequence is added to the N- or C- terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It may comprise a peptide. In addition, it may further comprise amino acid sequences designed for specific purposes to increase the stability of the targeting sequence, tag, labeled residue, half-life or peptide.
  • alcohol dehydrogenase refers to an enzyme that reversibly catalyzes the reaction of removing hydrogen from alcohol to form aldehydes or ketones.
  • the alcohol dehydrogenase is not particularly limited as long as it can remove the hydrogen from the hydroxy fatty acid produced by the oleic acid hydratase 2 to produce a chito fatty acid.
  • Alcohol dehydrogenase from Micrococcus luteus can be used.
  • Baeyer-Villiger monooxygenase (BVMO) refers to a kind of monooxygenase which is an enzyme capable of catalyzing various oxidation reactions including a Baeyer-Villiger oxidation reaction in which ketones are oxidized to produce lactones or ester compounds. .
  • BVMO Bach-Villiger monooxygenase
  • it is catalyzed by a transformant to produce a fatty acid derivative (10-octyloxy-10-oxodecanoic acid, etc.) in which an ester group is introduced into a chain from chito fatty acids (10-chitostearic acid, etc.).
  • the BVMO is not particularly limited thereto, as long as it exhibits activity, and as an example, Pseudomonas sp. And Rhodococcus sp. Brevibacterium sp., Comanonas sp., Acinetobacter sp., Arthrobacter sp., Brachymonas strain.
  • BVMO derived from a microorganism such as sp.), more preferably Pseudomonas fluorescens ( Pseudomonas fluorescens ), Pseudomonas putida ( Pseudomonas) putida ), Pseudomonas veronii ), Rhodococcus jostii) or Pseudomonas sp HI-70 (can be the origin BVMO from Pseudomonas sp.
  • strain HI-70 Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonas fluorescens) DSM50106 derived BVMO the BmoF1 or Rhodococcus crude stitcher (Rhodococcus jostii ) may be MO16, a BVMO derived from RHA1.
  • the BVMO may be present at one or more positions of the amino acid sequence constituting the BVMO.
  • the amino acid sequence may include an amino acid sequence in which an amino acid is substituted, deleted, inserted, added or inverted, and as long as it can maintain or enhance the activity of BVMO, at least 80%, preferably 90%, relative to the amino acid sequence of BVMO Or more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, and may comprise an amino acid sequence having a homology
  • the amino acid sequence of the enzyme exhibiting the activity of the polypeptide may vary depending on the strain, and is not particularly limited thereto.
  • the microorganism containing the activity of the BVMO may be used for substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of the amino acid. It may also include naturally occurring mutant sequences or artificially mutated sequences, such as those based on individual or species differences.
  • homology refers to an identity between two different amino acid sequences or nucleotide sequences, which is a BLAST that calculates parameters such as score, identity, similarity, and the like. It can be determined by methods well known to those skilled in the art using 2.0, but is not particularly limited thereto.
  • the BVMO may be expressed from a polynucleotide to which an untranslated region (UTR) which increases mRNA stability at the 3 ′ end of a gene encoding BVMO in the transformant is bound.
  • UTR untranslated region
  • the binding of UTR to the 5 'or 3' end of the polynucleotide encoding the protein improves the stability of mRNA transcribed from the polynucleotide, thereby increasing the level of synthesis of the polypeptide.
  • the polypeptides aggregate with each other to form an inclusion body, and thus there is a problem that the level of the protein expressed in the water-soluble form generated by normal folding is reduced.
  • the RNase E cleavage site is inserted into the UTR and is used as a means for reducing the stability of the mRNA.
  • the RNase E cleavage site is not particularly limited thereto, and includes, for example, 12 to 16 RNase E cleavage sites.
  • hilD nucleotide sequence including 14 RNase E cleavage site (SEQ ID NO: 3), 15 RNase CAT257 base sequence comprising the E cleavage site (SEQ ID NO: 4), CAT357 base sequence comprising the 18 RNase E cleavage sites (SEQ ID NO: 5), CAT557 base sequence comprising the 26 RNase E cleavage sites (SEQ ID NO: 6) , CAT657 nucleotide sequence including 28 RNase E cleavage sites (SEQ ID NO: 7), synthetic base sequence (3'UTR syn , SEQ ID NO: 8) and the like can be used.
  • the technology of controlling the expression level of the protein regulates the induction level of the promoter, thereby reducing the expression level of the aggregate to produce aggregates.
  • Inhibition method 5'UTR or RBS (ribosome binding site) is used to distinguish from the slowdown in the translation level of mRNA.
  • the recombinant protein expression vector may be expressed by combining a target protein with a highly water-soluble amino acid or by connecting it with a signal sequence to secrete it into a periplasm.
  • Methods such as secretion and simultaneously expressing chaperones involved in protein folding are known, and low incubation temperatures are generally known to be advantageous for the water-soluble expression of proteins.
  • the present invention inserts a specific nucleotide sequence including a plurality of RNase E cleavage sites into 3'UTR, thereby reducing mRNA stability and inducing normal folding of the polypeptide, thereby increasing the expression of water-soluble protein. Are distinguished.
  • the term "esterase / lipase” means an enzyme that hydrolyzes an ester bond of a fat / ester compound.
  • the ester / fat hydrolase is used for the purpose of decomposing fatty acid derivatives having ester groups introduced into the chain produced by BVMO into heavy chain fatty acids and omega-hydroxy fatty acids, but is not particularly limited thereto.
  • a lipohydrolase derived from a Thermomyces lanuginosus strain, an ester hydrolase derived from Pseudomonas fluorescens strain, or the like may be used.
  • biotransformation process means a method of converting a substrate into a desired product using an enzyme or a transformant expressing the enzyme.
  • the bioconversion process may be interpreted to mean a method for producing the desired heavy chain fatty acid and heavy chain omega-hydroxy fatty acid from the long chain unsaturated fatty acid substrate using the transformant provided in the present invention.
  • the term “transformer” refers to a gene encoding the fatty acid double bond hydratase of the present invention in a host cell alone or to an alcohol dehydrogenase and Bayer-Villiger monooxygenase (BVMO). It refers to a recombinant microorganism prepared by introducing an expression vector comprising a polynucleotide containing a gene together.
  • BVMO Bayer-Villiger monooxygenase
  • the transformant may be interpreted as a main means for producing the desired heavy chain fatty acid and heavy chain omega-hydroxy fatty acid from the long chain unsaturated fatty acid substrate through the biotransformation process.
  • the host cell used in the preparation of the transformant is not particularly limited, examples of bacterial cells such as E. coli, Corynebacterium, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Yeast cells such as Saccharomyces cerevisiae and ski-irradiated Caromyces pombe; Fungal cells such as Pchia pastoris; Insect cells such as Drosophila and Spodoptera Sf9 cells; Animal cells such as CHO, COS, NSO, 293, bow melanoma cells; Or plant cells, and as another example, E. coli.
  • long chain unsaturated fatty acid refers to an unsaturated fatty acid having 16 to 20 carbon atoms among unsaturated fatty acids in which a carbon-to-carbon double bond exists as a chain-like compound having a carbon-carbon unsaturated bond and a carboxyl group in one molecule. do. Due to the nature of the unsaturated fatty acid, the long-chain unsaturated fatty acid is chemically unstable, easy to oxidize, and low in melting point, compared to saturated fatty acid. The position of the double bond included in the long-chain unsaturated fatty acid is indicated by the number of carbons attached from the carboxy group, but the fatty acids present in nature exhibit a certain arrangement. Typical fatty acids of edible oils, oleic acid and linoleic acid, have double bonds at positions 9, 9 and 12, respectively.
  • the long-chain unsaturated fatty acid is not particularly limited thereto, but oleic acid, palmitoleic acid, linoleic acid, alpha-linolenic acid, gamma-linolenic acid ( ⁇ -linolenic acid) and the like, and the method for treating the long chain unsaturated fatty acid is also not particularly limited thereto, and the method of culturing the transformant in a medium containing the long chain unsaturated fatty acid may be used.
  • the transformant of the present invention may further express a transporter protein for introducing the long-chain unsaturated fatty acid present in the medium into the transformant.
  • a carrier protein that introduces unsaturated fatty acids into the transformant may be further expressed.
  • the carrier protein to be used is not particularly limited as long as the long chain unsaturated fatty acid in the medium can be introduced into the transformant, but as an example, the protein expressed from the base sequence (SEQ ID NO: 9) encoding FadL is Can be.
  • culture refers to a method of growing a desired microorganism under artificially controlled environmental conditions.
  • the culture is to be interpreted to be carried out to provide a reaction environment for producing the desired heavy chain fatty acid and heavy chain omega-hydroxy fatty acid from the long-chain unsaturated fatty acid substrate using the transformant provided in the present invention Can be.
  • the culture method is not particularly limited thereto, but a batch or continuous culture may be used using a batch process, an injection batch or a repeated fed batch process.
  • the present invention provides oleic acid hydratase 2 expressed in said transformant.
  • the oleic acid hydratase 2 may be composed of an amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a variety of amino acid sequences added to the N- or C- terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the oleic acid hydrase 2 exhibits enzymatic activity against various unsaturated fatty acid substrates (oleic acid, palmitoleic acid, linoleic acid, alpha-linolenic acid or gamma-linolenic acid), stenotropomonas It was confirmed that the enzyme showed better enzyme activity than the known oleic acid hydratase derived from the maltophilia strain (Fig. 2 and Table 1).
  • the present invention provides oligonucleotides encoding said oleic acid hydratase 2.
  • the nucleotide sequence constituting the polynucleotide encodes a nucleotide sequence capable of encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or various amino acid sequences that may be added to the N-terminus or C-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO:
  • the nucleotide sequence may be in the form of being added to the 5'-terminal or 3 'end of the nucleotide sequence capable of encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, specifically, the sequence number capable of encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the base sequence encoding the various amino acid sequences that may be added to the nucleotide sequence of 2 or the N-terminus or C-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 5'-terminal or 3'- of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 It may be in the form added to the end. Specifically, it may be composed of the nucleotide sequence of SEQ
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence showing homology with the nucleotide sequence may also be included in the scope of the polynucleotide provided in the present invention.
  • polynucleotide sequence encoding a protein capable of expressing oleic acid hydratase 2 may have, consist essentially of, or consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the expression "having essentially, or consisting of” does not exclude a meaningless sequence addition or a naturally occurring mutation, or a latent mutation thereof, before or after the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, When expressed as a protein has the same or corresponding activity as the protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 if the "having, consisting essentially, or consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2" of the present invention It may correspond to.
  • the polynucleotide may be mutated by one or more bases substituted, deleted, inserted, or a combination thereof.
  • synthetic methods well known in the art may be used, for example, those described in Engels and Uhlmann, Angew Chem Int Ed Eng., 37: 73-127, 1988. , Triester, phosphite, phosphoramidite and H-phosphate methods, PCR and other autoprimer methods, oligonucleotide synthesis on a solid support, and the like.
  • the present invention provides a method of increasing the ratio of water soluble expression to the total expression level of a protein of interest.
  • the method of increasing the water-soluble expression ratio relative to the total expression level of the protein of interest provided by the present invention (a) untranslated region (UTR) to increase the mRNA stability at the 3 'end of the gene encoding the desired water-soluble protein Obtaining this bound polynucleotide; And (b) expressing the polynucleotide, wherein a nucleotide sequence including an RNase E cleavage site for lowering mRNA stability is inserted into the nucleotide sequence of the UTR.
  • UTR untranslated region
  • water-soluble protein refers to a protein that expresses both water-insoluble and water-soluble. In particular, when the protein is over-expressed, it means a protein having significantly less water-soluble expression compared to the total expression level.
  • desired water-soluble protein may be used interchangeably with the same meaning as the desired protein.
  • the desired water-soluble protein may be a protein having a water-soluble expression ratio of 50% or less relative to the total expression level of the protein by over-expressing the protein to be aggregated in the cell to form an inclusion body.
  • Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonasfluorescens) DSM50106 derived or Rhodococcus crude stitcher (Rhodococcus josti i) RHA1 derived BVMO (Bayer-Villiger monooxygenase) may be, more specifically, Pseudomonas fluorescein sense (Pseudomonasfluorescens) DSM50106 derived BVMO the BmoF1 or also Rhodococcus jostii ) may be MO16, which is a BVMO derived from RHA1.
  • water soluble protein refers to a protein which is transcribed and translated by expression of a gene of interest, and then shows water solubility by folding.
  • expression level of the water-soluble protein has the same meaning as the water-soluble expression of the protein, can be used interchangeably.
  • UTR untranslated region
  • non-stone portion means a portion of the mRNA chain that is not a template of the protein gene, that is, the portion that is not translated.
  • the UTR includes 5'UTR (5 'non-interpreted portion) and 3'UTR (3' non-interpreted portion).
  • 3'UTR refers to a transcription terminator that contributes to the stability of mRNA in prokaryotes. For example, it has been used to increase the stability of transcriptionally activated mRNA by inserting specific sequences (eg, REP sequences) into the 3'UTR.
  • specific sequences eg, REP sequences
  • RNase E cleavage site refers to a portion where cleavage occurs by RNase E involved in RNA processing and degradation in bacterial cells, and cleavage occurs mainly in a single strand of AU-rich region.
  • the RNase E cleavage site is present in the 3'UTR of BmoF1 or MO16, which is the water-soluble protein of the present invention, including 5 RNase E cleavage sites in the 3'UTR of BmoF1 and 3'UTR of MO16. have.
  • hilD sequence or CAT sequence was used in order to insert the RNase E cleavage site into 3'UTR.
  • the level of expression of water-soluble proteins may increase, and bioconversion activity may be increased.
  • the total expression of the protein of interest is adjusted as the number of RNase E cleavage sites is adjusted.
  • the ratio of water soluble expression to the level can be changed, and specifically, when the BmoF1 expression, as the number of RNase E cleavage sites increases, the ratio of water soluble expression to the total expression level of the protein of interest can be increased.
  • the base sequence including the RNase E cleavage site includes, for example, an hilD sequence including 12 to 16 RNase E cleavage sites, and a CAT base sequence including 13 to 30 RNase E cleavage sites.
  • a hilD sequence comprising 14 RNase E cleavage sites SEQ ID NO: 3
  • a CAT257 base sequence comprising 15 RNase E cleavage sites SEQ ID NO: 4
  • 18 RNase E CAT357 nucleotide sequence comprising the cleavage site SEQ ID NO: 5
  • CAT557 nucleotide sequence comprising the 26 RNase E cleavage sites
  • SEQ ID NO: 7 Synthetic base sequence
  • Example 1-1 Preparation of an Expression Vector and Transformed Recombinant Escherichia Coli Comprising an Oleate Hydrohydrase 2 Gene (ohyA2)
  • Stenotrophomonas maltophilia strain-derived oleic acid hydrase 2 gene was synthesized, and the following experiment was performed using the synthesized gene.
  • a primer (OhyA2A_F (SEQ ID NO: 10): 5'-CATATGAGCCAGCCCACCGCAC-3 ', OhyA2A_R (SEQ ID NO: 11): 5'-CTCGAGTCAGGGCGCGCGCCGCCTG-3') was prepared based on the DNA sequence of the synthesized oleic acid hydratase 2. PCR was performed using the prepared primers to amplify the nucleotide sequence of the gene. The amplified oleic acid hydrase 2 gene was inserted into plasmid vector pET 28 (+) a (manufactured by Novagen) using restriction enzymes Nde I and Xho I to prepare pET 28 (+) a-OhyA2.
  • the recombinant expression vector thus obtained was transformed into E. coli ER 2566 or BL21 (DE3) strain.
  • the sample containing the oleic acid hydrase 2 was prepared after culturing E. coli and purifying oleic acid hydratase 2.
  • Recombinant Escherichia coli ER 2566 of Example 1-1 was incubated at 37 ° C. under aeration conditions of 200 rpm in a flask to which 500 mL of LB medium and 50 ⁇ g / ml of kanamycin were added.
  • IPTG was added at a final concentration of 0.1 mmol / L to induce oleic hydrase expression, and the culture was incubated with stirring at 150 rpm at 16 ° C. for 12 hours. .
  • the culture was washed twice with 0.85% sodium chloride (NaCl) after centrifugation at 6,000 xg at 4 ° C. for 30 minutes, 50 mM sodium phosphate (NaH 2 PO 4 ), 300 mM sodium chloride, 10 mM immidazole. After the addition of 0.1 mM protease inhibitor (phenylmethylsulfonyl fluoride), the cell solution was disrupted with a sonicator. The cell lysate was centrifuged at 13,000 xg at 4 ° C. for 20 minutes to separate only the cell supernatant.
  • NaCl sodium phosphate
  • 10 mM immidazole 10 mM immidazole.
  • protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride
  • the cell supernatant was subjected to a fast protein liquid chromatography system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) to obtain an active fraction, and the active fraction was subjected to a histidine tag (Hisidine tag, His-tag).
  • the oleic acid hydrase 2 was purified by applying to a Hisrap HP adsorption column, and a sample containing the purified oleic acid hydrase 2 was prepared.
  • Example 1-3 Comparison of Inactivation by Substrate of Oleic Acid Hydrolase 2
  • oleic acid oleic acid
  • palmitoleic acid palmitoleic acid
  • linoleic acid linoleic acid
  • alpha-linolenic acid ⁇ -linolenic acid
  • gamma- Hydration was performed by adding linolenic acid ( ⁇ -linolenic acid) as a substrate.
  • the oleic acid hydration reaction was performed for 10 minutes in 50 mM citrate / phosphate buffer solution (pH 6.0) containing 0.14 g / L oleic acid and 0.005 g / L oleic acid hydratase 2, respectively.
  • the reaction was terminated by adding acetate (ethyl acetate), the reaction activity was compared by measuring the production of 10-hydroxystearic acid (Table 1).
  • oleic acid hydrase 2 As shown in Table 1, the hydration activity of oleic acid hydrase 2 was measured using various unsaturated fatty acids as a substrate, and the highest activity was observed in oleic acid, followed by palmitoleic acid, linoleic acid, alpha-linolenic acid, and gamma-linolenic acid. It was confirmed that the order.
  • the inactivation of the oleic acid hydratase 2 (the amount of the product according to the amount of enzyme in 7 reaction time) is J. Biotechnol. 158: 17-23, 45% for oleic acid, palmitoleic acid, linoleic acid, alpha-linolenic acid, or gamma-linolenic acid, respectively, compared to the substrate-specific inactivity of oleic acid hydratase derived from stenotropomonas maltophilia disclosed in 2012 , 10%, 80%, 90%, 130% was confirmed to be high.
  • reaction activity of oleic acid hydratase 2 was highest when oleic acid was used as a substrate, and higher than that of homologous oleic hydrase when the substrate was used.
  • Example 1-4 Production of 10 -Hydroxystearic Acid Using Oleic Acid Hydrolase 2
  • oleic acid hydrase 2 produced 10 g / L of 10-hydroxystearic acid, and showed a production rate of 3.4 g / L per hour and a conversion yield of 90% or more relative to the reduced substrate.
  • the oleic acid hydrase 2 shows a production rate of about 20% or more higher It was confirmed (FIG. 1).
  • oleic acid hydratase 2 is an oleic acid hydrase superior to oleic hydrase derived from the same strain, and it is possible to produce 10-hydroxystearic acid in high yield using the enzyme.
  • Example 1-5-1 Production of 10-hydroxyoctadec-12-enoic acid using recombinant E. coli expressing oleic acid hydratase 2
  • the recombinant Escherichia coli was cultured in Regenberg medium, and when the recombinant Escherichia coli reached the stationary phase, linoleic acid was added to the culture solution at 30 mM (8.4 g / L) for 6 hours.
  • oleic acid hydratase 2 is superior to the oleic acid hydratase derived from the same strain through the above results, and using the enzyme can produce 10-hydroxyoctadec-12-enoic acid in high yield.
  • using the enzyme can produce 10-hydroxyoctadec-12-enoic acid in high yield.
  • Example 1-5-2 Recombinant Escherichia coli and lipohydrolase expressing oleic acid hydratase 2 ( TLL 10- using) Hydroxyoctadec -12- Enoick Acid and 10- Hydroxystea Production of arsenic
  • E. coli and TLL were used to measure the hourly production of the reaction product during bioconversion and compared with conventional oleic hydratase.
  • oleic acid hydrase 2 is an oleic acid hydrase that is superior to oleic acid hydrase derived from the same strain, and in particular, the 10-hydroxyoctadec-12-enoic acid from soybean oil using the enzyme is higher It was found that the yield can be produced.
  • Pseudomonas fluorescein sense Pseudomonas fluorescens . It is known that various oxidases, including BmoF1, BVMO (Bayer-Villiger monooxygenase) derived from DSM50106, are difficult to express in water-soluble form in E. coli strains (Appl. Microbiol. Biotechnol. 73: 1065-1072, 2012).
  • BmoF1 BmoF1
  • BVMO Bach-Villiger monooxygenase
  • the stability of Salmonella enterica hilD mRNA in E. coli is significantly influenced by the presence or absence of 3'untranslated reigion (310'UTR) consisting of 310 nucleotides containing 14 RNase E cleavage sites.
  • 310'UTR 3'untranslated reigion
  • increased to 14 RNase E is significantly hilD mRNA stability in E. coli when removing hilD 3'UTR in hilD gene containing the cleavage site by hilD mRNA concentration is markedly increased, which results markedly increased amount hilD expressed in E. coli It was.
  • the present invention by introducing the RNase E cleavage site in the 3'UTR of the target gene to reduce the mRNA stability of the target gene by lowering the protein expression level per mRNA of the target gene to reduce the insoluble expression of the target gene and improve the water-soluble expression.
  • the following experiment was performed using CAT (Chloramphenicol acetyltransferase) sequence containing 28 estimated RNase E cleavage sites to increase the water-soluble expression of BmoF1 in E. coli.
  • Example 2-1 Water Soluble Expression of Protein BmoF1 Using CAT Sequence as 3′UTR
  • the amplified CAT sequence fragment is a CAT657 nucleotide sequence including 657 nucleotides, and is inserted into the HindIII-XhoI restriction enzyme region of pET22b-BmoF1 into the 3'UTR of the BmoF1 gene, thereby recombining Escherichia coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3 'UTR CAT657 was produced.
  • Example 2-1-2 Reverse transcription PCR reverse transcription PCR )In accordance mRNA Level analysis
  • Reverse transcription PCR was performed to control BmoF1-3'UTR CAT657 mRNA levels in recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT657 and to control BmoF1-3 'in recombinant E. coli BL21 (DE3) pET-BmoF1-3'UTR native . UTR native mRNA levels were compared. RNA extraction and reverse transcription PCR were performed according to the experimental method reported in the previous study (Sci. Reports 6: 29406 (doi: 10.1038 / srep29406), 2016).
  • Example 2-1- 3 3'UTR Protein expression level analysis by insertion of CAT sequence
  • variants were constructed that included partial deletion of the CAT sequence (3'UTR CAT ) inserted into the 3'UTR.
  • Fragments with partial deletion of CAT sequences inserted into the 3'UTR are forward primer CAT_F and other reverse primers CAT257_R (5'-CTCGAGCGCCCCGCCCTGCCACTCATCG-3 ', SEQ ID NO: 14), CAT357_R (5'- Amplified by PCR using CTCGAGTCCCATATCACCAGCTCA-3 ', SEQ ID NO: 15) and CAT557_R (5'-CTCGAGTATGTGTAGAAACTGCCG-3', SEQ ID NO: 16) and inserted into pET22b-BmoF1.
  • the number of RNase E cleavage sites in CAT 257, CAT357 and CAT557 was 15, 18 and 26, respectively.
  • Example 2-2-2 mRNA Level analysis
  • BmoF1 of recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT variants containing CAT sequences having different RNase E cleavage sites -3'UTR CAT mRNA levels were compared using reverse transcription PCR.
  • BmoF1-3'UTR CAT mRNA levels of recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT variants gradually decreased ( 4a)
  • the total expression level of BmoF1 of recombinant E. coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT variants decreased as the number of RNase E cleavage sites present in the CAT sequence increased (FIGS. 4B and 4C).
  • the level of water soluble expression of BmoF1 was significantly increased in Escherichia coli BL21 (DE3) pET22b-BmoF1-3'UTR CAT variants.
  • PCR was performed with Syn_F (5'-AAGCTTATAAAGGCTTAAATCACTGG-3 ', SEQ ID NO: 17) and Syn_R (5'-CTCGAGAGTGTAGGAGAATTCTTCTAACACGG-3', SEQ ID NO: 18) as forward and reverse primers. And amplified. The fragment obtained through the amplification was subcloned into the HindIII-XhoI restriction enzyme site of pET22b-BmoF1 to prepare pET22b-BmoF1-3'UTR syn .
  • Example 2-4 using CAT sequencing Rhodococcus jostii RHA1 origin BVMO Water-soluble expression
  • BVMO derived from Pseudomonas fluorescens DSM50106, Rhodococcus jostii
  • RHA1-derived BVMO ie, sequence homology with MO16, BmoF1: 23.3%, FIG. 8A
  • E. coli ChemBioChem 10: 1208-1217, 2009. Therefore, in order to improve the expression of soluble protein of MO16 in E. coli, a study was performed to increase the number of RNase E cleavage sites in 3'UTR.
  • MO16_CAT257_F 5'-AAGCTTATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT-3 ', SEQ ID NO: 19
  • MO16_CAT257_R 5'-CTCGAGCGCCCCCTGCCACTCATCG-3', SEQ ID NO: 20
  • the MO16_CAT sequence fragment was subcloned into the HindIII-XhoI restriction enzyme site of pET- MO16 to construct pET22b-MO16-3'UTR CAT257 (ChemBioChem 10: 1208-1217, 2009).
  • Example 2-4-2 Whole cell Biotransformation
  • the recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing pET-MO16-3'UTR CAT257 produced an ester product at a 35% higher rate than the recombinant E. coli BL21 (DE3) expressing the control pET-MO16-3'UTR native . Formation was confirmed to improve the catalytic activity of MO16 (Fig. 8a and 8b).
  • the results showed that the MO16 soluble protein was increased by adjusting the number of RNase E cleavage sites present in the 3'UTR to improve the water-soluble expression and bioconversion activity of the MO16 enzyme in the microorganism.
  • Example 3-1 Ester Production from Ele Coli Using E. Coli Expressing Oleic Acid Hydrolase, Alcohol Dehydrogenase (ADH) and Bayer-Villiger Monooxygenase (BVMO)
  • Oleic Acid Hydrolase (OhyA) and Micrococcus, which have been used to produce esters from oleic acid using recombinant E. coli long chain secondary alcohol dehydrogenase (ADH) derived from luteus NCTC2665, Pseudomonas Recombinant E. coli BL21 transformed with pACYC-ADH-OhyA (Angew. Chem. Int. Ed. 52: 2534-2537, 2013) and pJOE-E6BVMO (Sci. Reports 6: 29406, 2016) expressing BVMO from putida Whole cell bioconversion was performed using (DE3). Whole cell bioconversion was performed according to the experimental method reported in the previous study (Adv Synth Catal. DOI: 10.1002 / adsc. 201600216, 2016).
  • ADH E. coli long chain secondary alcohol dehydrogenase
  • pACYC-ADH-OhyA Angew. Chem. Int. Ed. 52
  • Example 3-2 Ester Production from Oleic Acid Using Recombinant E. Coli Expressing FadL
  • Example 3-2-1 FadL Expression vector comprising and the production of transformed recombinant E. coli
  • genomic DNA was extracted from E. coli and the following method was performed.
  • FadL_F (SEQ ID NO: 21): 5'-GCCACGCGATCGCTGCTTAAGTCGAAAGAAAGTA-3 '
  • FadL_R (SEQ ID NO: 22): 5'-GTCAGCGATCGCTCAGTCCTCCTGCACCAGC-3'
  • PCR PCR was performed to amplify the nucleotide sequence of the gene.
  • the amplified FadL gene was inserted into pACYC-ADH-OhyA using restriction enzyme PvuI to prepare pACYC-ADH-OhyA-FadL.
  • the recombinant expression vector and pJOE-E6BVMO obtained as described above were transformed into E. coli BL21 (DE3) strain to construct a whole cell catalyst.
  • FadL expression level can significantly increase the oleic acid bioconversion rate of the recombinant E. coli catalyst.
  • Example 3-3 Ester Production from Oleic Acid Using Recombinant Escherichia Coli Expressing Oleic Acid Hydrolase 2
  • OhyA2 cloned in Example 1-1 was introduced in place of the conventional fatty acid hydrase OhyA to construct a recombinant E. coli biocatalyst.
  • Example 3-3-1 oleic acid hydrase 2 ( OhyA2 Expression vector and the production of transformed recombinant E. coli
  • primers (OhyA2B_F (SEQ ID NO: 23): 5'-GCCACGCGATCGCTGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTA-3 ', OhyA2B_R (SEQ ID NO: 24): 5'-CGTCAGCGATCGCTAGGGCGCGCCGCC), produced a polymerase chain reaction, and produced a PCR primer. (PCR) was performed to amplify the nucleotide sequence of the gene. The amplified oleic acid hydrase 2 gene was inserted into pACYC-ADH-FadL using restriction enzyme PvuI to prepare pACYC-ADH-OhyA2-FadL.
  • the recombinant expression vector and pJOE-E6BVMO obtained as described above were transformed into E. coli BL21 (DE3) strain to construct a whole cell catalyst.
  • Recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pACYC-ADH-OhyA2-FadL and pJOE-E6BVM were constructed using pACYC-ADH-OhyA2-FadL constructed in Example 3-3-1, and the whole cell bioconversion reaction was performed. . 10 mM oleic acid was added to the reaction solution as a substrate to initiate bioconversion and the hourly production of the reaction product was measured.
  • Example 3-4 Ester Production from Oleic Acid Using Recombinant Escherichia Coli Expressing BVMO Incorporating Synthetic UTR
  • Synthetic 3'UTR (SEQ ID NO: 8) containing 18 RNAse E cleavage sites was used to improve the water-soluble expression of BVMO to increase the production yield by increasing the ester concentration of the final product.
  • Example 3-4-1 Preparation of an Expression Vector Comprising BVMO Incorporating Synthetic UTR and Transformed Recombinant Escherichia Coli
  • RNAse E cleavage site was arranged to synthesize a nucleotide sequence having 18 RNAse E cleavage sites (SEQ ID NO: 8).
  • the synthesized UTR sequences were amplified by PCR with CAT657B_F (5'-GGATCCATAAAGGCTTAAATCACTG-3 ', SEQ ID NO: 25) and CAT657B_R (5'-GGATCCAGTGTAGGAGAATTCTTCTA-3', SEQ ID NO: 26) primers as forward and reverse primers.
  • the amplified nucleotide fragment was inserted into the BamHI restriction enzyme site of pJOE-E6BVMO into 3'UTR of the E6BVMO gene to prepare pJOE-E6BVMOUTR, and the prepared pJOE-E6BVMOUTR and pACYC-ADH-OhyA2-FadL were recombinant E. coli BL21. (DE3) was transformed to construct whole cell catalyst.
  • Example 3-4-2 Whole cell Biotransformation
  • Recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) pACYC-ADH-OhyA2-FadL and pJOE-E6BVMOUTR were constructed using pJOE-E6BVMOUTR constructed in Example 3.4.1, and the whole cell bioconversion reaction was performed. 10 mM oleic acid was added to the reaction solution as a substrate to initiate bioconversion and the hourly production of the reaction product was measured.
  • Example 4 oleic hydrase, Alcohol Dehydrogenase (Alcohol dehydrogenase ) And Bayer-Billiger oxidase ( Bayer - Villiger monooxygenase , BVMO Ester Production from Linoleic Acid Using Escherichia Coli
  • Biotransformation reaction for ester production from linoleic acid was performed using the whole-cell catalysts constructed in Example 3. In order to confirm the increase in the bioconversion efficiency of each whole cell catalyst, the whole cell bioconversion reaction was performed. Whole cell bioconversion was performed in the same manner as in Example 3-1.
  • FadL is very important for linoleic acid bioconversion.

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Abstract

본 발명은 신규한 올레산 수화효소 2를 이용하여 장쇄 불포화 지방산 기질로부터 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산을 생산하는 생물전환 공정, 상기 공정에 사용되는 신규한 올레산 수화효소 2, 상기 올레산 수화효소 2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 올레산 수화효소 2와 수용성 단백질의 발현비율을 증가시키는 방법을 이용하면, 종래의 불포화 장쇄 지방산으로부터 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산을 생산하는 생물전환 공정의 효율을 증진시킬 수 있으므로, 보다 효과적인 생물전환 공정의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

올레산 수화효소 2를 이용한 생물전환공정
본 발명은 올레산 수화효소 2를 이용한 생물전환공정에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 신규한 올레산 수화효소 2를 이용하여 장쇄 불포화 지방산 기질로부터 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산을 생산하는 생물전환 공정, 상기 공정에 사용되는 신규한 올레산 수화효소 2, 상기 올레산 수화효소 2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
오메가-하이드록시지방산은 지방산의 말단에 하이드록시기(수산화기)를 1개 가지고 있는 지방산의 일종으로(HOCH2(CH2)nCOOH) 폴리에틸렌 계열의 플라스틱 제조 시 모노머로 사용되고 있으며 유화제, 접착제, 코팅제 생산과 화장품이나 의약품의 제조에 널리 이용되고 있다(J. Am. Chem. Soc., 132:15451-15455, 2010). 또한, 폴리아미드, 폴리에스터 계열의 플라스틱 제조와 화장품, 생활용품 제조에 광범위하게 사용되고 있는 장쇄 디카르복실산 합성의 전구체로도 사용될 수 있다.
중쇄 지방산은 에스터 계열의 향료/향장 물질 합성에 널리 이용되고 있고 또한 항균활성이 우수하여 화장품, 식품, 생활용품 생산에도 광범위하게 이용되고 있다.
이러한 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산은 자연계에 거의 존재하지 않기 때문에 주로 유기합성법을 이용하여 산업적으로 생산되고 있는데, 유기합성법은 고비용과 환경오염 물질이 다량 방출되는 문제점을 가지고 있다.
최근에 효소를 이용한 장쇄 지방산으로부터 중쇄 오메가-하이드록시지방산의 생산방법과 석유화합물인 하이드로카본으로부터 장쇄 디카르복실산의 제조방법이 개발되었고, 상기 효소를 이용하여 보다 효과적으로 오메가-하이드록시지방산을 생산하는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국특허공개 제2013-0132254호에는 지방산 이중결합 수화효소(hydratase), 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase), BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 및 에스터 가수분해효소(esterase)로 구성된 일련의 효소반응 시스템이 발현된 형질전환체를 사용하여, 장쇄 불포화 지방산 기질로부터 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산을 생산하는 생물전환 공정이 개시되어 있다.
상기 방법은 하나의 형질전환체를 사용하여 기질로부터 목적하는 산물을 얻을 수 있다는 장점이 있는 반면, 상기 형질전환체에서 발현되는 각 효소의 발현수준이 동일하지 않아서, 한가지 효소의 발현이 저해될 경우, 전체적인 생물전환 공정이 원활하게 진행되지 못한다는 단점이 있다. 예를 들어, BVMO의 경우에는 형질전환체 내에서 다량으로 발현되고 있음에도 불구하고, 수용성 상태로 발현되는 비율이 높지 않아서, 전체적인 생물전환 활성이 낮은 수준을 나타내고 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여는, 상기 형질전환체에서 발현되는 효소를 보다 높은 활성을 나타내는 효소로 치환하거나 또는 수용성 상태로 발현되는 비율을 증가시키는 방법 등이 개발되어야 할 것이나, 아직까지는 별다른 연구성과가 보고되지 않고 있는 실정이다. 뿐만 아니라, 기존에 보고된 지방산 이중결합 수화효소는 올레산에 대해서는 높은 활성을 보이지만 리놀레산이나 리놀렌산에 대해서는 낮은 활성을 보여 올레산뿐만 아니라 리놀레산과 리놀렌산에 대해서도 높은 활성을 갖는 새로운 지방산 이중결합 수화효소의 개발이 필요한 상황이다.
본 발명자들은 불포화지방산으로부터 하이드록시지방산을 고수율로 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 스테노트로포모나스 말토필라아 균주로부터 종래의 올레산 수화효소보다 우수한 활성을 나타내는 신규한 올레산 수화효소 2를 발굴하고, 형질전환체 내에서 고농도로 수용성 발현이 어려운 BVMO와 같은 효소들의 수용성 발현을 향상시키는 방법을 개발하였으며, 이들을 이용할 경우, 하이드록시지방산을 높은 수율과 속도로 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 신규한 올레산 수화효소 2를 이용하여 장쇄 불포화 지방산 기질로부터 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 사용되는 신규한 올레산 수화효소 2를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 올레산 수화효소 2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 제공하는 올레산 수화효소 2와 수용성 단백질의 발현비율을 증가시키는 방법을 이용하면, 종래의 불포화 장쇄 지방산으로부터 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산을 생산하는 생물전환 공정의 효율을 증진시킬 수 있으므로, 보다 효과적인 생물전환 공정의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 올레산 수화효소 2와 종래의 올레산 수화효소를 이용하여 생물전환 시 올레산 (oleic acid)으로부터 생산되는 10-하이드록시스테아르 산(10-hydroxystearic acid)의 생산속도를 비교한 그래프로서, (○)는 올레산 수화효소 2를 이용할 때 반응액의 올레산 농도를 나타내고, (●)는 올레산 수화효소 2를 이용할 때 반응액의 10-하이드록시스테아르 산 농도를 나타내며, (△)는 종래의 올레산 수화효소를 이용할 때 반응액의 올레산 농도를 나타내고, (▲)는 종래의 올레산 수화효소를 이용할 때 반응액의 10-하이드록시스테아르 산 농도를 나타낸다.
도 2는 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균과 종래의 올레산 수화효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 생물전환 시 리놀레산 (linoleic acid)으로부터 생산되는 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산(10-hydroxyoctadec-12-enoic acid)의 생산속도를 비교한 그래프로서, (○)는 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균을 이용할 때 반응액의 리놀레산 농도를 나타내고, (●) 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균을 이용할 때 반응액의 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산 농도를 나타내며, (△)는 종래의 올레산 수화효소를 재조합 대장균을 이용할 때 반응액의 리놀레산 농도를 나타내고, (▲)는 종래의 올레산 수화효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용할 때 반응액의 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산 농도를 나타낸다.
도 3은 지방 가수분해 효소 (TTL) 및 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 생물전환 시 대두유로부터 생산되는 10-하이드록시지방산의 생산속도를 나타낸 그래프로서, (○)는 반응액의 리놀레산을 나타내고, (●)는 반응액의 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산을 나타내며, (△)는 반응액의 올레산을 나타내고, (▲)는 반응액의 10-하이드록시스테아르 산을 나타낸다.
도 4a는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT 변이체에서 BmoF1-3'UTRCAT mRNA 수준을 나타낸 전기영동사진으로서, 1번 레인은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRnative를 나타내고, 2번 레인은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT257을 나타내며, 3번 레인은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT357을 나타내고, 4번 레인은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT557을 나타내며, 5번 레인은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT657을 나타낸다.
도 4b는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT의 변이체에서 BmoF1의 수용성 분획물에 대한 SDS-PAGE (상위 패널) 및 웨스턴 블럿 (하위 패널) 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 4c는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT의 변이체에서 BmoF1의 비수용성 분획물에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 5a는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRnative를 이용한, 리시놀레산에서 에스터로의 생물전환을 나타내는 그래프로서, (△)는 리시놀레산을 나타내고, (●)는 12-케토올레산(12-ketooleic acid)을 나타내며, (■)는 12-케토올레산의 에스터를 나타내고, (▲)는 11-히드록시운덱-9-이노익산(11-hydroxyundec-9-enoic acid)을 나타낸다.
도 5b는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT257을 이용한, 리시놀레산에서 에스터로의 생물전환을 나타내는 그래프이다.
도 5c는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT357을 이용한, 리시놀레산에서 에스터로의 생물전환을 나타내는 그래프이다.
도 5d는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT557을 이용한, 리시놀레산에서 에스터로의 생물전환을 나타내는 그래프이다.
도 5e는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT657을 이용한, 리시놀레산에서 에스터로의 생물전환을 나타내는 그래프이다.
도 6은 RNase E 절단 부위가 18개 포함되도록 인공적으로 만든 합성 3'UTR(UTRsyn)의 뉴클레오티드 염기서열을 나타낸 도표로서, UTRsyn 뉴클레오티드 내에서 RNase E 절단 부위는 밑줄로 표시하였다. 이때, 13번째 RNase E 절단 부위인 GCATAT는 두 개의 RNase E 절단 부위인 GCAT와 ATAT가 중첩된 것을 나타낸다.
도 7은 도 6에서 구축한 UTRsyn를 갖는 pET22b-BmoF1-3'UTRsyn를 구축하고 이를 함유한 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRsyn의 리시놀레산에서 에스터로의 생물전환 결과를 나타내는 그래프로서, (△)는 리시놀레산을 나타내고, (●)는 12-케토올레산(12-ketooleic acid)을 나타내며, (■)는 12-케토올레산의 에스터를 나타내고, (▲)는 11-히드록시운덱-9-이노익산(11-hydroxyundec-9-enoic acid)을 나타낸다.
도 8a는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRnative를 이용한, 리시놀레산에서 에스터로의 생물전환결과를 나타낸 그래프로서, (△)는 리시놀레산을 나타내고, (●)는 12-케토올레산(12-ketooleic acid)을 나타내며, (■)는 12-케토올레산의 에스터를 나타낸다
도 8b는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-MO16-3'UTRCAT257을 이용한, 리시놀레산에서 에스터로의 생물전환결과를 나타낸 그래프이다.
도 9a는 재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA, pJOE-E6BVMO를 이용한 올레산에서 에스터로의 생물전환 결과를 나타내는 그래프로서, (○)는 올레산을 나타내고, (▼)는 10-하이드록시스테아르 산 (10-hydroxystearic acid)을 나타내며, (▽)는 10-케토스테아르 산 (10-ketostearic acid)을 나타내고, (■)는 10-케토스테아르 산의 에스터를 나타낸다.
도 9b는 도 9A에서 FadL을 추가 도입한 재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA-FadL, pJOE-E6BVMO를 이용한 올레산에서 에스터로의 생물전환 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9c는 도 9B에서 종래의 올레산 수화효소를 올레산 수화효소 2로 대체 도입한 재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA2-FadL, pJOE-E6BVMO를 이용한 올레산에서 에스터로의 생물전환 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9d는 도 9C에서 종래의 pJOE-E6BVMO-3'UTRnative를 3'UTR 변이체인 pJOE-E6BVMO-3'UTRsyn로 대체 도입한 재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA2-FadL, pJOE-E6BVMOsyn를 이용한 올레산에서 에스터로의 생물전환 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10a는 재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA, pJOE-E6BVMO를 이용한, 리놀레산에서 에스터로의 생물전환 결과를 나타내는 그래프로서, (○)는 리놀레산을 나타내고, (▼)는 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산(10-hydroxyoctadec-12-enoic acid)을 나타내며, (▽)는 10-케토옥타데크-12-에노익 산(10-ketooctadec-12-enoic acid)를 나타내고, (■)는 10-케토옥타데크-12-에노익 산의 에스터를 나타낸다.
도 10b는 도 10A에서 FadL을 추가 도입한 재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA-FadL, pJOE-E6BVMO를 이용한, 리놀레산에서 에스터로의 생물전환 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10c는 도 10B에서 종래의 올레산 수화효소를 올레산 수화효소 2로 대체 도입한 재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA2-FadL, pJOE-E6BVMO를 이용한, 리놀레산에서 에스터로의 생물전환 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10d는 도 10C에서 종래의 pJOE-E6BVMO-3'UTRnative를 3'UTR 변이체인 pJOE-E6BVMO-3'UTRsyn로 대체 도입한 재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA2-FadL, pJOE-E6BVMOsyn를 이용한, 리놀레산에서 에스터로의 생물전환 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명자들은 지방산 이중결합 수화효소(hydratase), 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase), BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 및 에스터 가수분해효소(esterase)로 구성된 일련의 효소반응 시스템이 발현된 형질전환체를 사용하여, 장쇄 불포화 지방산 기질로부터 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산을 생산하는 방법을 개발한 바 있다(한국특허공개 제2013-0132254호). 즉, 상기 형질전환체에 장쇄 불포화 지방산을 가하면, 상기 장쇄 불포화 지방산이 형질전환체 내부로 도입되고, 지방산 이중결합 수화효소에 의하여 하이드록시 지방산으로 변화되며, 상기 하이드록시 지방산은 알코올 탈수소효소에 의하여 키토 지방산으로 변화되고, 상기 키토 지방산은 BVMO에 의하여 지방산 사슬내에 에스터기가 도입된 지방산 에스터 유도체로 전환되며, 상기 지방산 에스터 유도체는 에스터 가수분해효소에 의해 절단되어, 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산을 생성한다.
그러나, 상기 형질전환체를 사용할 경우, 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산의 생성수율이 예상보다 낮았기 때문에, 본 발명자들은 상기 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산의 생성수율을 향상시키는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 상기 지방산 이중결합 수화효소의 활성이 증진된 새로운 효소인 올레산 수화효소 2를 발굴하였고, 상기 BVMO를 코딩하는 유전자의 3'말단에, mRNA의 안정성을 변화시키는 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열이 삽입된 UTR을 결합시킨 형태의 폴리뉴클레오티드를 이용하면 상기 BVMO의 전체 발현수준 대비 수용성 단백질 형태의 발현 비율을 증가시켜서, BVMO의 효소반응 효율을 증진시키는 방법을 개발하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 올레산 수화효소 자체의 활성이 증진된 스테노트로포모나스 말토필라아(Stenotrophomonas maltophilia) 균주 유래 올레산 수화효소 2는 다양한 하이드록시지방산을 높은 수율과 속도로 얻을 수 있음을 확인하였는데, 상기 올레산 수화효소 2는 신규한 것으로, 종래에 사용되고 있는 스테노트로포모나스 말토필리아 유래 올레산 수화효소와 비교하여, 반응활성 및 생산속도가 현저히 우수하기 때문에, 상기 올레산 수화효소 2를 상기 개발된 형질전환체에 적용할 경우, 상기 하이드록시 지방산의 생성수율을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, 상기 형질전환체에서 발현되는 BVMO는 과발현되었을 때 세포내에서 상호 응집하여 봉입체를 형성함으로써, 상기 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율이 50% 이하가 되므로, 이의 효소반응 효율역시 발현수준에 비하여 낮다는 단점이 있었다. 이러한 단점을 극복하기 위하여, RNase E 절단 부위를 3'UTR에 삽입하여 mRNA의 안정성에 영향을 주어 수용성 단백질의 발현비율을 증가시키는 방법을 개발하였다. 즉, 상기 BVMO를 코딩하는 유전자의 3'말단에, mRNA의 안정성을 감소시키는 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열이 삽입된 UTR을 결합시킨 형태의 폴리뉴클레오티드를 수득하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키면, 상기 BVMO의 전체 발현수준 대비 수용성 단백질 형태의 발현 비율이 증가되므로, 결과적으로는 BVMO의 효소반응 효율을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.
끝으로, 상기 형질전환체는 형질전환체의 세포막 외부에 존재하는 장쇄 불포화 지방산 중에서 형질전환체 내부로 유입된 것만을 기질로 사용하기 때문에, 상기 세포막 외부에 존재하는 장쇄 불포화 지방산을 형질전환체 내부로 유입시키는 전달체 단백질을 발현시켜서 형질전환체의 생물전환공정의 효율을 향상시킬 수 있다. 이에 본 발명자들은 상기 전달체 단백질로서 대장균 유래 장쇄지방산 수송단백질인 FadL을 추가로 발현시켰으며, 그 결과, 생물전환공정의 효율이 향상됨을 확인하였다.
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 지방산 이중결합 수화효소, 알코올 탈수소효소, BVMO 및 에스터/지방 가수분해효소로 구성된 일련의 효소반응 시스템이 발현된 형질전환체를 이용하여 장쇄 불포화 지방산 기질로부터 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산을 생성하는 방법을 개량하기 위하여, 새로운 지방산 이중결합 수화효소인 올레산 수화효소 2를 발굴하고, BVMO의 수용성 발현비율을 향상시키는 방법과 형질전환체의 내부로 기질의 유입을 촉진시키는 방법을 개발하였으며, 이러한 방법은 지금까지 전혀 보고되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 (a) 올레산 수화효소 2, 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase), BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 및 에스터/지방 가수분해효소(esterase/lipase)를 발현할 수 있고; 상기 BVMO를 코딩하는 유전자의 3'말단에 mRNA 안정성을 변화시키는 UTR(untranslated region)이 결합된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 상기 BVMO의 수용성 발현을 유도할 수 있는 생물전환 공정용 형질전환체를 수득하는 단계; 및,
(b) 상기 수득한 형질전환체에 장쇄 불포화 지방산 기질을 가하고 배양하는 단계를 포함하는, 장쇄 불포화 지방산 기질로부터 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "올레산 수화효소 2(oleate hydratase 2)"란, 올레산을 10-하이드록시스테아린 산으로 전환되는 반응을 촉매하는 지방산 수화효소의 일종인 올레산 수화효소의 하나로서, 스테노트로포모나스 말토필리아 균주로부터 유래되고, 불포화지방산을 기질로 사용하여 다양한 종류의 하이드록시 지방산(10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산, 10-하이드록시옥타데크-6,12-디에노익 산, 10-하이드록시옥타데크-12,15-디에노익 산, 10-하이드록시팔미톨레산 또는 10-하이드록시스테아린 산 등의 10-하이드록시지방산, 9-하이드록시노난 산 등)을 생산할 수 있으며, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 효소 단백질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 올레산 수화효소 2는 장쇄 불포화 지방산으로부터 하이드록시 지방산을 생산할 수 있다는 점에서 종래의 올레산 수화효소와 유사하지만, 다양한 종류의 하이드록시 지방산(10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산, 10-하이드록시옥타데크-6,12-디에노익 산, 10-하이드록시옥타데크-12,15-디에노익 산, 10-하이드록시팔미톨레산, 10-하이드록시스테아린 산 등)을 종래의 올레산 수화효소 보다 빠르게 생산할 수 있다는 점에서 종래의 올레산 수화효소와 구별된다. 아울러, 상기 올레산 수화효소 2는 하이드록시 지방산을 생산하는 효소활성을 나타낼 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열이 부가된 모든 펩타이드를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)"란, 알코올에서 수소를 제거하여 알데하이드 또는 케톤을 생성하는 반응을 가역적으로 촉매하는 효소를 의미한다.
본 발명의 목적상 상기 알코올 탈수소효소는 상기 올레산 수화효소 2에 의하여 생성된 하이드록시 지방산으로부터 수소를 제거하여 키토 지방산을 생성할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 알코올 탈수소화효소를 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "Baeyer-Villiger monooxygenase(BVMO)"란, 케톤을 산화시켜서 락톤이나 에스터화합물을 생성하는 Baeyer-Villiger 산화반응을 포함하는 다양한 산화반응을 촉매할 수 있는 효소인 monooxygenase의 일종을 의미한다. 본 발명의 목적상, 형질전환체에서 발현되어 키토 지방산(10-키토스테아르산 등)으로부터 사슬내에 에스터기가 도입된 지방산 유도체(10-옥틸옥시-10-옥소데카노산 등)를 생산하는 반응을 촉매하는 활성을 나타내는 한, 상기 BVMO는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 슈도모나스속 균주(Pseudomonas sp.), 로도코커스속 균주(Rhodococcus sp). 브레비박테리움속 균주(Brevibacterium sp.), 코마노나스속 균주(Comanonas sp.), 아시네토박터속 균주(Acinetobacter sp.), 아트로박터속 균주(Arthrobacter sp.), 브라키모나스속 균주(Brachymonas sp.) 등의 미생물로부터 유래된 BVMO 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 슈도모나스 플로레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii), 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) 또는 슈도모나스속 균주 HI-70(Pseudomonas sp. strain HI-70)으로부터 유래된 BVMO가 될 수 있고, 다른 예로서, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas 　 fluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1 또는 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) RHA1 유래 BVMO인 MO16가 될 수 있다.
아울러, 상기 BVMO는 키토 지방산으로부터 사슬내에 에스터기가 도입된 지방산 유도체를 생산하는 반응을 촉매하는 활성을 나타내는 BVMO를 형질전환체에서 발현시킬 수 있는 한, BVMO를 구성하는 아미노산 서열의 하나 이상의 위치에서의 1개 또는 다수개(단백질의 아미노산 잔기의 입체 구조에 있어서의 위치나 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 2 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 5개)의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위된 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 상기 BVMO의 활성을 유지 또는 강화시킬 수 있는 한, 상기 BVMO의 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 폴리펩티드가 갖는 활성을 나타내는 효소의 아미노산 서열에 차이가 있을 수 있기 때문에 특별히 이에 제한되지는 않으며, 상기 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위 등에는 상기 BVMO의 활성을 함유하는 미생물의 개체 또는 종의 차이에 근거하는 경우 등의 천연적으로 생기는 돌연변이 서열 또는 인위적인 변이 서열까지도 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "상동성"이란, 서로 다른 두 아미노산 서열 또는 염기서열 사이의 동일성을 의미하는데, 점수(score), 동일성(identity), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0를 이용하는, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 BVMO는 상기 형질전환체에서 BVMO를 코딩하는 유전자의 3'말단에 mRNA 안정성을 증가시키는 UTR(untranslated region)이 결합된 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 것이 될 수 있다.
일반적으로 수용성 단백질을 발현시킬 때 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 또는 3'말단에 UTR을 결합시켜서 상기 폴리뉴클레오티드로부터 전사되는 mRNA의 안정성을 향상시키면, 이에 의하여 폴리펩타이드의 합성 수준이 증가하는 반면, 이에 의해, 단백질의 폴딩이 일어나기 전 폴리펩타이드의 local concentration이 증가하게 된다. 이처럼 local concentration이 증가하면, 상기 폴리펩타이드끼리 서로 응집되어 봉입체(inclusion body)를 형성하게 하게 되고 결국 정상적인 폴딩에 의해 생성되는 수용성 형태로 발현되는 단백질의 수준이 감소되는 문제점이 있다. 상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명에서는 3'UTR에 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열을 삽입하여 mRNA 안정성을 감소시키고 이에 합성되는 폴리펩타이드 수를 감소시켜 local concentration을 감소시키고 이는 결국 정상적인 폴딩에 의해 생성되는 수용성 단백질의 발현수준을 증가시켜 수용성 단백질의 발현을 증가시켰다. 이때, 상기 RNase E 절단 부위는 UTR에 삽입되어 mRNA의 안정성을 저하시키기 위한 수단으로서 사용되는데, 상기 RNase E 절단 부위는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 12 내지 16개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 hilD 염기서열, 13 내지 30개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 CAT 염기서열 등을 사용할 수 있고, 다른 예로서, 14개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 hilD 염기서열(서열번호 3), 15개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 CAT257 염기서열(서열번호 4), 18개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 CAT357 염기서열(서열번호 5), 26개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 CAT557 염기서열(서열번호 6), 28개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 CAT657 염기서열(서열번호 7), 합성염기서열(3'UTRsyn, 서열번호 8) 등을 사용할 수 있다.
상기 3'UTR에 RNase E 절단부위를 포함하는 염기서열을 삽입하여 mRNA 안정성을 감소시켜 단백질의 발현양을 조절하는 기술은 프로모터의 유도(induction) 수준을 조절하여 단백질 발현량을 감소시킴으로써 응집체 생성을 억제하는 방법, 5'UTR 또는 RBS(ribosome binding site)를 이용하여 mRNA의 번역수준에서 속도감소하는 방법과 구별된다.
대장균에서 수용성 단백질의 생성을 촉진하기 위한 방법으로, 재조합 단백질 발현 벡터 구성 시 목적 단백질을 수용성이 높은 아미노산과 결합시켜 발현시키거나 시그날 시퀀스(signal sequence)와 연결하여 페리플라즘(periplasm)으로 분비(secretion)시키는 등의 방법과 단백질 폴딩에 관여하는 샤프론(chaperone)들을 동시에 발현시키는 방법이 알려져 있고 단백질의 수용성 발현을 위해 낮은 배양온도가 일반적으로 유리하다고 알려져 있다. 그러나 상기 방법과 비교하여 본 발명은 다수의 RNase E 절단 부위를 포함하는 특정 염기서열을 3'UTR에 삽입하여, mRNA 안정성을 감소시켜 폴리펩티드의 정상적인 폴딩을 유도하여 수용성 단백질의 발현을 증가시키는 점에서 구별된다.
본 발명의 용어 "에스터/지방 가수분해효소(esterase/lipase)"란, 지방/에스터 화합물의 에스터 결합을 가수분해하는 효소를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 에스터/지방 가수분해효소는 BVMO에 의해 생성된 사슬내에 에스터기가 도입된 지방산 유도체를 중쇄 지방산과 오메가-하이드록시지방산으로 분해하려는 목적으로 사용되지만, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 일 예로서, 써모마이세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosus) 균주 유래의 지방 가수분해효소, 슈도모나스 플로레센스(Pseudomonas fluorescens) 균주 유래 에스터 가수분해효소 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "생물전환공정"이란, 효소 또는 상기 효소를 발현시키는 형질전환체를 이용하여 기질로부터 목적하는 산물로 전환시키는 방법을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 생물전환 공정은 본 발명에서 제공하는 형질전환체를 이용하여 장쇄 불포화 지방산 기질로부터 목적하는 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산을 생산하는 방법을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "형질전환체"란, 숙주세포에 본 발명의 지방산 이중결합 수화효소를 코딩하는 유전자를 단독 또는 알콜 탈수소화 효소 및 베이어-빌리거 산화효소 (Bayer-Villiger monooxygenase, BVMO)를 코딩하는 유전자를 같이 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 도입하여 제조된 재조합 미생물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환체는 상기 생물전환공정을 통하여 장쇄 불포화 지방산 기질로부터 목적하는 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산을 생산하기 위한 주요 수단으로 해석될 수 있다.
또한, 상기 형질전환체의 제조에 사용되는 숙주세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 대장균, 코리네박테륨, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물세포가 될 수 있고, 다른 예로서, 대장균이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "장쇄 불포화 지방산"이란, 한 분자 속에 탄소-탄소의 불포화결합과 카르복시기를 가지는 사슬 모양 화합물로 탄소간 이중결합이 존재하는 불포화 지방산 중에서, 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 불포화 지방산을 의미한다. 상기 불포화 지방산의 특성상 상기 장쇄 불포화 지방산은 포화 지방산에 비하여, 화학적으로 불안정하고, 산화되기 쉬우며, 융점이 낮다. 상기 장쇄 불포화 지방산에 포함되는 이중결합의 위치는 카르복시기로부터 몇 번째의 탄소에 붙어 있느냐로 나타내지만, 천연에 존재하는 지방산은 일정한 배치를 나타낸다. 식용유지의 대표적 지방산인 올레산, 리놀레산은 각각 9 및 9, 12의 위치에 이중결합을 갖는다.
본 발명에 있어서, 상기 장쇄 불포화 지방산은 특별히 이에 제한되지 않으나, 올레산(oleic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 알파-리놀렌산(α-linolenic acid), 감마-리놀렌산(γ-linolenic acid) 등이 될 수 있고, 상기 장쇄 불포화 지방산을 처리하는 방법 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 형질전환체를 장쇄 불포화 지방산이 포함된 배지에서 배양하는 방법 등을 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 형질전환체는 상기 배지내에 존재하는 장쇄 불포화 지방산을 형질전환체 내부로 유입하는 전달체 단백질을 추가로 발현시킬 수 있다.
구체적으로, 배지내에 존재하는 장쇄 불포화 지방산은 미생물의 세포막을 투과하여 생물전환 효소에 결합한 후 반응이 진행되므로, 장쇄 불포화 지방산의 세포내 유입속도를 촉진하는 것이 매우 중요하여, 상기 형질전환체에서 장쇄 불포화 지방산을 형질전환체 내부로 유입하는 전달체 단백질을 추가로 발현시킬 수 있다. 이때, 사용되는 전달체 단백질은 배지내 장쇄 불포화 지방산을 형질전환체 내부로 유입시킬 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, FadL을 코딩하는 염기서열(서열번호 9)로부터 발현된 단백질이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 목적하는 미생물을 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 본 발명에서 제공하는 형질전환체를 이용하여 장쇄 불포화 지방산 기질로부터 목적하는 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산을 생산하기 위한 반응환경을 제공하기 위하여 수행되는 것으로 해석될 수 있다.
상기 배양방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)을 사용하여 회분식 또는 연속식으로 배양하는 방법을 사용할 수 있다.
다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체에서 발현되는 올레산 수화효소 2를 제공한다.
상기 올레산 수화효소 2는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열이 부가된 형태의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 올레산 수화효소 2가 다양한 불포화 지방산 기질(올레산, 팔미톨레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산 또는 감마-리놀렌산)에 대한 효소활성을 나타냄에 있어서, 스테노트로포모나스 말토필리아 균주로부터 유래된 공지된 올레산 수화효소 보다 우수한 효소활성을 나타냄을 확인하였다(도 2 및 표 1).
지금까지 알려진 바에 의하면, 스테노트로포모나스 말토필리아 균주로부터 유래된 공지된 올레산 수화효소는 다른 균주로부터 유래된 올레산 수화효소에 비하여 상대적으로 우수한 효소활성을 나타낸다고 보고되었고(J Biotechnol., 158:17-23, 2012), 본 발명의 올레산 수화효소 2는 스테노트포모나스 말토리필리아 균주로부터 유래된 종래의 올레산 수화효소에 비하여 상대적으로 우수한 활성을 나타내므로 본 발명의 올레산 수화효소 2는 다른 균주로부터 유래된 종래의 올레산 수화효소에 비하여 상대적으로 우수한 활성을 나타낼 것으로 분석되었다.
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 올레산 수화효소 2를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기서열은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열 5'-말단 또는 3'말단에 부가된 형태가 될 수 있고, 구체적으로 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 서열번호 2의 염기서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 2의 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
또한, 올레산 수화효소 2를 나타낼 수 있는 단백질을 코딩할 수 있는 한, 상기 염기서열과 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드의 범주에 포함될 수 있는데, 구체적으로, 90% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으며, 보다 구체적으로, 95% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.
또한, 올레산 수화효소 2를 나타내는 수 있는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 2의 염기서열을 가지거나, 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것일 수 있다. 상기 "가지는, 필수적으로 구성되는, 또는 구성되는"의 표현은 서열번호 2의 염기서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 또는 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 단백질로 발현시 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩되는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 발명의 "서열번호 2의 염기서열을 가지거나, 필수적으로 구성되거나, 또는 구성되는" 경우에 해당될 수 있다.
한편, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시키는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시키는 방법은 (a) 목적하는 수용성 단백질을 코딩하는 유전자의 3'말단에 mRNA 안정성을 증가시키는 UTR(untranslated region)이 결합된 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하고, 상기 UTR의 염기서열 내에는 mRNA의 안정성을 저하시키는 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열이 삽입된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 용어 "목적하는 수용성 단백질"이란, 비수용성 및 수용성 모두 발현하는 단백질을 의미하는 것으로, 특히 단백질이 과발현되었을 때 전제 발현 수준 대비 수용성 발현이 현저히 적은 단백질을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 목적하는 수용성 단백질은 목적하는 단백질과 동일한 의미로, 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 목적하는 수용성 단백질은 과발현되었을 때 과발현된 단백질이 세포내에서 상호 응집하여 봉입체를 형성함으로써, 상기 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율이 50% 이하인 단백질일 수 있고, 일 예로 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonasfluorescens) DSM50106 유래 또는 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) RHA1 유래 BVMO(Bayer-Villiger monooxygenase)일 수 있고, 보다 구체적으로, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonasfluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1 또는 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) RHA1 유래 BVMO인 MO16일 수 있다.
본 발명의 용어 "수용성 단백질"이란, 해당유전자의 발현에 의하여 전사 및 해독된 후, 폴딩과정에 의하여 수용성을 나타나게 되는 단백질을 의미한다. 또한, 상기 수용성 단백질의 발현 수준은 단백질의 수용성 발현과 동일한 의미로, 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "UTR(untranslated region)"이란, 비해석부위라고도 하며, mRNA 사슬 중 단백질 유전자의 주형이 되지 않는 부분, 즉 번역되지 않는 부분을 의미한다. 일반적으로 상기 UTR은 5'UTR(5'비해석부위), 3'UTR(3'비해석부위)이 존재한다. 3'UTR은 원핵생물에서 mRNA의 안정성에 기여하는 전사 터미네이터를 의미한다. 예를 들어, 3'UTR로 특정서열(예를 들어, REP 서열)을 삽입하여 전사적으로 활성화된 mRNA의 안정성을 증가시키는데에 사용되고 있다. 본 발명에서는 목적하는 단백질의 전체 발현 수준 대비 수용성 발현비율을 증가시키기 위하여, 3'UTR을 이용하였다.
본 발명의 용어 "RNase E 절단 부위"란, 박테리아 세포에서 RNA의 처리 및 분해 관여하는 RNase E에 의해 절단이 일어나는 부분을 의미하며, 주로 단일 가닥의 AU-rich 영역에서 절단이 일어난다. 상기 RNase E 절단 부위는 본 발명의 목적하는 수용성 단백질인 BmoF1 또는 MO16의 3'UTR에 존재하고 있는데, BmoF1의 3'UTR에는 5개, MO16의 3'UTR에는 10개의 RNase E 절단 부위가 포함되어 있다. 본 발명에서는 RNase E 절단 부위를 3'UTR에 삽입하기 위하여, hilD 염기서열 또는 CAT 염기서열을 이용하였다.
또한, 상기 RNase E 절단 부위 수가 증가할수록 mRNA 안정성이 감소하고, 수용성 단백질의 발현수준이 증가하며, 생물전환활성을 증가시킬 수 있으므로, 상기 RNase E 절단 부위의 수가 조정됨에 따라 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현 비율을 변화시킬 수 있고, 구체적으로, 상기 BmoF1 발현하는 경우, RNase E 절단 부위 수가 증가할수록 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현 비율을 증가시킬 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열로는 일 예로서, 12 내지 16개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 hilD 염기서열, 13 내지 30개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 CAT 염기서열 등을 사용할 수 있고, 다른 예로서, 14개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 hilD 염기서열(서열번호 3), 15개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 CAT257 염기서열(서열번호 4), 18개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 CAT357 염기서열(서열번호 5), 26개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 CAT557 염기서열(서열번호 6), 28개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 CAT657 염기서열(서열번호 7), 합성염기서열(3'UTRsyn, 서열번호 8) 등을 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 올레산 수화효소 2 유전자를 이용한 생물 전환
실시예 1-1: 올레산 수화효소 2 유전자(oleate hydratase 2 gene, ohyA2)를 포함하는 발현벡터 및 형질전환된 재조합 대장균의 제조
올레산 수화효소 2를 포함하는 발현벡터 및 재조합 대장균을 제조하기 위하여, 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia) 균주 유래 올레산 수화효소 2 유전자를 합성하였고, 상기 합성된 유전자를 이용하여 하기의 실험을 수행하였다.
합성된 올레산 수화효소 2의 DNA 염기서열을 기초로 한 프라이머 (OhyA2A_F(서열번호 10): 5'-CATATGAGCCAGCCCACCGCAC-3', OhyA2A_R (서열번호 11): 5'-CTCGAGTCAGGGCGCGCGCCGCCTG-3')를 제작하였고, 제작된 프라이머로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다. 증폭시킨 올레산 수화효소 2 유전자는 제한효소 NdeⅠ 과 Xho Ⅰ을 사용하여 플라스미드 벡터 pET 28(+)a (Novagen사 제품)에 삽입하여 pET 28(+)a-OhyA2를 제작하였다.
상기와 같이 얻은 재조합 발현벡터는 대장균 ER 2566 또는 BL21(DE3) 균주에 형질전환하였다.
실시예 1-2: 올레산 수화효소 2의 제조
실시예 1-1의 방법으로 제조된 재조합 대장균으로부터 올레산 수화효소 2를 제조하기 위하여, 상기 대장균을 배양하고 올레산 수화효소 2를 정제한 후 상기 올레산 수화효소 2가 포함된 샘플을 제조하였다.
상기 실시예 1-1의 재조합 대장균 ER 2566은 500 mL의 LB 배지와 50 ㎍/ml의 카나마이신(kanamycin)을 첨가한 플라스크에서 200 rpm의 통기조건 하에서 37℃에서 배양하였다. 박테리아의 흡광도가 600 nm에서 0.6부터 0.8에 도달할 때, IPTG를 최종농도 0.1 mmol/L로 첨가하여 올레산 수화효소 발현을 유도한 후 상기 배양액을 12시간 동안 16 ℃에서 150 rpm으로 교반하면서 배양하였다.
상기 배양액은 6,000 xg로 4 ℃에서 30분 동안 원심분리 후 0.85 % 염화나트륨 (NaCl)으로 두 번 세척하였고, 50 mM 제일인산나트륨 (NaH2PO4), 300 mM 염화나트륨, 10 mM 이미다졸 (immidazole), 0.1 mM 단백분해 효소 저해제(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가한 후 상기 세포 용액을 파쇄기 (sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 13,000 xg로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리한 후 세포 상등액만을 분리하였다. 상기 세포 상등액을 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (fast protein liquid chromatography system; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에 적용하여 활성분획을 수득하고, 상기 활성분획을 히스티딘 태그 (Histidine tag, His-tag)를 이용한 히스트랩 에이치피 (Histrap HP) 흡착 컬럼에 적용하여 올레산 수화효소 2를 정제하였으며, 상기 정제된 올레산 수화효소 2를 포함하는 샘플을 제조하였다.
실시예 1-3: 올레산 수화효소 2의 기질에 따른 비활성 비교
상기 올레산 수화효소 2의 다양한 불포화지방산에 대한 반응 활성을 알아보기 위해, 올레산(oleic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 알파-리놀렌산(α-linolenic acid) 또는 감마-리놀렌산(γ-linolenic acid)을 기질로 첨가하여 수화반응을 수행하였다.
상기 올레산 수화반응은 0.14 g/L의 올레산과 0.005 g/L 올레산 수화효소 2를 함유한 50 mM 씨트레이트/포스페이트 완충용액(pH 6.0)에서 각각 10분 동안 진행하였다, 반응액 양과 같은 양의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 넣어 반응을 종료시켰으며, 반응활성은 10-하이드록시스테아르 산의 생산량을 측정하여 비교하였다 (표 1).
종래의 올레산 수화효소 (J. Biotechnol. 158:17-23, 2012)와 본 발명에서 클로닝한 올레산 수화효소 2의 기질에 따른 비활성 비교
기질 생성물 올레산 수화효소 2의 비활성(umol/ mg-1 protein min-1) 올레산 수화효소의 비활성 (umol/enzyme-1 min-1)
올레산 10-하이드록시스테아린 산 5.36 ± 0.07 3.69 ± 0.0023
팔미톨레산 10-하이드록시팔미톨레산(10-hydoroxypalmitic acid) 2.21 ± 0.03 1.95 ± 0.0018
리놀레산 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산 1.67 ± 0.19 0.91 ± 0.0005
알파-리놀렌산 10-하이드록시옥타데크-12,15-디에노익 산(10-hydroxyoctadec-12,15-dienoic acid) 1.05 ± 0.09 0.54 ± 0.0004
감마-리놀렌산 10-하이드록시옥타데크-6,12-디에노익 산(10-hydroxyoctadec-6,12-dienoic acid) 0.78 ± 0.04 0.33 ± 0.00008
표 1에서 보듯이, 다양한 불포화지방산을 기질로 사용하여 올레산 수화효소 2의 수화 반응 활성을 측정한 결과, 올레산에서 가장 높은 활성을 보였고, 이어, 팔미톨레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 감마-리놀렌산의 순서임을 확인하였다.
또한, 상기 올레산 수화효소 2의 비활성(7반응시간의 효소량에 따른 생성물의 양)은 J. Biotechnol. 158:17-23, 2012에 개시된 스테노트로포모나스 말토필리아 유래의 올레산 수화효소의 기질에 따른 비활성과 비교하여, 올레산, 팔미톨레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산 또는 감마-리놀렌산에 대해서 각각 45%, 10%, 80%, 90%, 130% 정도 높은 것을 확인하였다.
따라서, 올레산 수화효소 2의 반응활성은 올레산을 기질로 사용될 때 가장 높으며, 위의 기질이 사용될 때, 동종 유래의 올레산 수화효소보다 높음을 알 수 있었다.
실시예 1-4: 올레산 수화효소 2를 이용한 10- 하이드록시스테아르 산의 생 산
올레산 수화효소 2를 이용하여 10-하이드록시스테아르 산의 생산속도를 확인하기 위하여, pH 6.0 및 35 ℃ 조건에서 10 g/L의 올레산을 기질로 하여 생물전환 시 반응 생성물의 시간별 생산량을 측정하였고, 이를 종래의 올레산 수화효소와 비교하였다.
실험 결과, 올레산 수화효소 2는 10 g/L의 10-하이드록시스테아르 산을 생산하였고, 시간당 3.4 g/L의 생산속도와 감소된 기질 대비 90% 이상의 전환수율을 나타내었다. 또한, 종래의 올레산 수화효소 (J. Biotechnol. 158:17-23, 2012)를 이용한 10-하이드록시스테아르 산의 생산속도와 비교하여, 올레산 수화효소 2가 약 20% 이상 높은 생산속도를 나타냄을 확인하였다(도 1).
따라서, 상기 결과를 통해 올레산 수화효소 2는 동일 균주 유래의 올레산 수화효소보다 우수한 올레산 수화효소이고 상기 효소를 이용하여 10-하이드록시스테아르 산을 높은 수율로 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 1-5: 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균을 이용한 10-하이드록시지방산의 생산
실시예 1-5-1: 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균을 이용한 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산(10-hydroxyoctadec-12-enoic acid)의 생산
실시예 1-1의 재조합 대장균을 이용한 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산의 생산속도를 확인하기 위하여, 생물전환 시 반응 생성물의 시간별 생산량을 측정하였고, 이를 종래의 올레산 수화효소(J. Biotechnol. 158:17-23, 2012)와 비교하였다.
상기 재조합 대장균은 리젠버그 배지에서 배양하였고 재조합 대장균이 stationary phase에 도달하였을 때 배양액에 리놀레산을 30 mM (8.4 g/L)로 첨가하여 6시간 반응시켰다.
실험 결과, 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균은 20 mM의 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산을 생산하였고 감소된 기질 대비 전환수율은 90% 이상을 나타내었다 (도 2). 또한, 종래의 올레산 수화효소를 발현하는 재조합 대장균의 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산 생산속도를 비교한 결과, 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균이 5배 이상 높은 생산속도를 나타냄을 확인하였다 (도 2).
따라서, 상기 결과를 통해 올레산 수화효소 2는 동일 균주 유래의 올레산 수화효소보다 우수한 올레산 수화효소이고, 상기 효소를 이용하여 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산을 높은 수율로 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 1-5-2: 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균 및 지방 가수분해 효소( TLL )를 이용한 10- 하이드록시옥타데크 -12- 에노익 산 및 10- 하이드록시스테 아르 산의 생산
상기 재조합 대장균 및 지방산 가수분해 효소인 TLL(제노포커스, 대전)을 이용하여 대두유로부터 생물전환 시 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산과 10-하이드록시스테아르 산의 생산속도를 확인하기 위하여, 상기 대장균 및 TLL을 이용하여 생물전환 시 반응 생성물의 시간별 생산량을 측정하였고 이를 종래의 올레산 수화효소와 비교하였다.
실험 결과, 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균을 이용하였을 때, 7 mM의 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산과 5 mM의 10-하이드록시스테아르 산이 생산되었고 감소된 기질 대비 전환수율은 약 80% 이상을 나타내었다(도 3).
또한, 종래의 올레산 수화효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용하였을 때와 비교한 결과, 올레산 수화효소 2를 발현하는 재조합 대장균을 이용하였을 때 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산의 생산속도가 4배 이상 높은 결과를 나타내었다.
따라서, 상기 결과를 통해 올레산 수화효소 2는 동일 균주 유래 올레산 수화효소보다 우수한 올레산 수화효소임을 알 수 있었고 특히, 상기 효소를 이용하여 대두유로부터 상기 10-하이드록시옥타데크-12-에노익 산을 높은 수율로 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2: 3'UTR 엔지니어링을 통한 단백질 BmoF1의 수용성 발현
슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas 　 fluorescens) DSM50106 유래의 BVMO(Bayer-Villiger monooxygenase)인 BmoF1를 포함하여 다양한 산화효소들은 대장균 균주에서 수용성 형태로 발현하기 어렵다고 알려져 있다(Appl. Microbiol. Biotechnol. 73:1065-1072, 2012).
최근 연구에 따르면, 대장균에서 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) hilD mRNA의 안정성은 14개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 310개의 뉴클레오티드로 구성된 3'UTR (3'untranslated reigion)의 유무에 의해 현저하게 영향받음이 보고되었다(Nucleic Acids Res. 42(9):5894-5906, 2014). 예를 들어, 14개의 RNase E 절단 부위를 포함하는 hilD 3'UTR를 hilD 유전자에서 제거하였을 때 대장균에서 hilD mRNA 안정성이 현저히 증가하여 hilD mRNA 농도가 현저히 증가하였고, 이로 인하여 대장균에서 hilD 발현량이 현저히 증가하였다.
본 발명에서는 목표 유전자의 3'UTR에 RNase E 절단 부위를 도입하여 목표 유전자의 mRNA 안정성을 감소시켜 목표 유전자의 mRNA 당 단백질 발현 수준을 낮춤으로써 목표 유전자의 불용성 발현을 낮추고 수용성 발현을 향상 시키고자 하였다. 예를 들어 대장균에서 BmoF1의 수용성 발현을 높이기 위해 28개로 추정되는 RNase E 절단 부위를 포함하는 CAT(Chloramphenicol acetyltransferase) 염기서열을 이용하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
실시예 2-1: CAT 염기서열을 3'UTR로 이용한 단백질 BmoF1의 수용성 발현
실시예 2-1-1: CAT 염기서열의 유전자 클로닝
CAT 염기서열은 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로써 CAT657A_F(5'-AAGCTTATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT-3', 서열번호 12) 및 CAT657A_R(5'-CTCGAGGGCATCAGCACCTTGTCG-3', 서열번호 13) 프라이머로 PCR을 통해 pACYCDuet-1 벡터로부터 증폭하였다. 상기 증폭된 CAT 염기서열 단편은 657개의 뉴클레오티드를 포함하는 CAT657 염기서열이고, BmoF1 유전자의 3'UTR에 pET22b-BmoF1의 HindIII-XhoI 제한효소부위로 삽입하여 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT657을 제작하였다.
실시예 2-1-2: 역전사 PCR (reverse transcription PCR )에 따른 mRNA 수준 분석
역전사 PCR을 수행하여 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT657에서 BmoF1-3'UTRCAT657 mRNA 수준을 대조군인 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRnative에서 BmoF1-3'UTRnative mRNA 수준과 비교하였다. RNA 추출 및 역전사 PCR은 선행연구(Sci. Reports 6: 29406 (doi: 10.1038/srep29406), 2016)에 보고된 실험 방법에 따라 진행하였다.
그 결과, 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRCAT657에서 BmoF1-3'UTRCAT657 mRNA 수준은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRnative에서 BmoF1-3'UTRnative mRNA 수준과 비교하여 약 절반 정도까지 감소하였다(도 4a).
이를 통해, 3'UTR에 삽입된 RNase E 절단부위를 포함하는 CAT 염기서열이 mRNA 안정성에 영향을 미치는 것을 확인하였다.
실시예 2-1- 3: 3'UTR에 CAT 염기서열의 삽입에 따른 단백질 발현 수준 분석
상기 제조된 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRCAT657에서 BmoF1 단백질 발현 수준을 대조군과 비교하기 위하여, SDS-PAGE 분석과 웨스턴 블럿을 수행하였다. SDS-PAGE와 웨스턴 블럿은 선행연구(Sci. Reports 6: 29406 (doi: 10.1038/srep29406), 2016)에 보고된 실험 방법에 따라 진행하였다.
그 결과, 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRCAT657에서 BmoF1의 총 발현수준은 대조군인 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRnative에서 BmoF1의 총 발현수준보다 낮았으나(도 4b 및 4c), BmoF1의 수용성 발현수준은 재조합 대장균 BL21(DE3) pET-BmoF1-3'UTRCAT657에서 현저히 높음을 확인하였다(도 4b).
이를 통해, 3'UTR에 RNase E 절단 부위를 포함하는 CAT 염기서열을 삽입하였을 때 BmoF1 mRNA 안정성이 감소되었고 BmoF1의 수용성 단백질 발현이 현저히 증가하였음을 알 수 있었다.
실시예 2-2: 3'UTR에 삽입되는 RNase E 절단 부위의 수에 따른 mRNA 수준 및 단백질 발현수준 분석
실시예 2-2-1: 유전자 클로닝
3'UTR에 존재하는 RNase E 절단 부위 수가 mRNA 안정성과 정량적 연관성이 있는지 알아보기 위하여, 3'UTR에 삽입되는 CAT 염기서열 (3'UTRCAT)의 부분적인 삭제를 포함하는 변이체들을 제작하였다.
3'UTR에 삽입되는 CAT 염기서열이 부분 삭제된 단편들 (CAT257, CAT357 및 CAT557)은 정방향 프라이머 CAT_F 및 다른 역방향 프라이머 CAT257_R(5'-CTCGAGCGCCCCGCCCTGCCACTCATCG-3', 서열번호 14), CAT357_R(5'-CTCGAGTCCCATATCACCAGCTCA-3', 서열번호 15) 및 CAT557_R(5'-CTCGAGTATGTGTAGAAACTGCCG-3', 서열번호 16)를 이용하여 PCR을 통해 증폭하였고, pET22b-BmoF1에 삽입하였다. CAT 257, CAT357 및 CAT557에서 RNase E 절단 부위 개수는 각각 15개, 18개 및 26개가 되도록 제작하였다.
실시예 2-2-2: mRNA 수준 분석
CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위 수에 따른 mRNA 안정성의 변화를 확인하기 위하여, RNase E 절단 부위 수가 다른 CAT 서열을 포함하는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT 변이체들의 BmoF1-3'UTRCAT mRNA 수준을 역전사 PCR을 이용하여 비교분석하였다.
그 결과, CAT 염기서열의 길이가 257개의 뉴클레오티드에서부터 657개의 뉴클레오티드로 증가함에 따라, 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT 변이체들의 BmoF1-3'UTRCAT mRNA 수준은 점차 감소하였다(도 4a)
이를 통해, CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위 수가 증가할수록 mRNA 안정성이 감소함을 알 수 있었다.
실시예 2-2-3: 단백질 발현수준 분석
상기 CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위 수에 따른 단백질 발현 수준의 변화를 확인하기 위하여, SDS-PAGE 분석을 수행하여 RNase E 절단 부위 수가 다른 CAT 염기서열을 포함하는 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT 변이체들에서 BmoF1의 발현 수준을 비교분석하였다.
그 결과, CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위 수가 증가함에 따라, 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT 변이체들의 BmoF1의 총 발현 수준은 감소하였지만(도 4b 및 4c), 재조합 대장균 BL21(DE3) pET22b-BmoF1-3'UTRCAT 변이체들에서 BmoF1의 수용성 발현 수준은 현저히 증가하였다(도 4b).
이를 통해, 3'UTR의 CAT 염기서열에 존재하는 RNase E 절단 부위 수가 증가할수록, 수용성 단백질의 발현 수준이 증가함을 알 수 있었다.
실시예 2-2-4: 전세포 생물전환
실시예 2-2-2 및 2-2-3에서 기술된 BmoF1-3'UTRCAT 변이체들의 생물전환 활성을 비교분석하기 위해 pET22b-BmoF1-UTRCAT 변이체들로 형질전환된 재조합 대장균 BL21(DE3)균주들을 만들고 이들의 생물전환 활성을 비교 분석하였다. 구체적으로, 재조합 대장균 BL21(DE3)pET22b-BmoF1-UTR 변이체들을 Micrococcus luteus NCTC2665 유래의 장쇄 2차 알코올 분해효소(long chain secondary alcohol dehydrogenase, ADH) 유전자를 발현하도록 형질전환 시켜 얻은 재조합 대장균 BL21(DE3) pCOLA-ADH(Sci. Reports 6: 29406 (doi: 10.1038/srep29406)) 및 pET22b-BmoF1-3'UTR 변이체들을 제조하여 리시놀레산 생물전환을 수행하였다. 전세포 생물전환은 선행연구(Sci. Reports 6: 29406 (doi: 10.1038/srep29406), 2016)에 보고된 실험 방법에 따라 진행하였다.
그 결과, 재조합 대장균 BL21(DE3) pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTR 변이체들의 리시놀레산에 대한 생물전환 활성은 pCOLA-ADH 및 pET22b-BmoF1-3'UTRnative를 발현하는 재조합 대장균 BL21 (DE3)과 비교하여 순차적으로 생물전환 활성이 증가함을 보여주었다(도 5a 내지 5e).
또한, 초기 생물전환 속도와 RNase E 절단 부위의 수 사이에 매우 연관성이 높음을 확인하였다.
따라서, RNase E 절단 부위의 수가 증가할수록 초기 생물전환 활성이 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 종합하여 볼 때, 3'UTR 서열보다 RNase E 절단 부위의 수가 생물전환 활성에 중요하고, BmoF1의 수용성 발현 수준은 또한 3'UTR에서 RNase E 절단 부위의 수에 따라 달라지는 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 2-3: 합성 3' UTR을 이용한 단백질 BmoF1의 수용성 발현
실시예 2-3-1: 유전자 클로닝
상기 실험을 통해 생물전환 활성이 3'UTR의 RNase E 절단 부위 수 사이에 매우 연관성이 있음을 확인하여, CAT 염기서열을 기반으로 RNAse E 절단 부위를 임의로 배열하여 18개의 RNAse E 절단 부위(도 6에서 밑줄로 표시)를 갖는 3'UTRsyn(서열번호 8)을 합성하였다(도 6).
pET22b-BmoF1-3'UTRsyn를 제작하기 위하여, 정방향 및 역방향 프라이머로써 Syn_F(5'-AAGCTTATAAAGGCTTAAATCACTGG-3', 서열번호 17) 및 Syn_R(5'-CTCGAGAGTGTAGGAGAATTCTTCTAACACG-3', 서열번호 18)로 PCR을 수행하여 증폭시켰다. 상기 증폭을 통해 수득한 단편은 pET22b-BmoF1의 HindIII-XhoI 제한효소 부위로 서브클로닝하여 pET22b-BmoF1-3'UTRsyn을 제작하였다.
실시예 2-3-2: 전세포 생물전환
대장균에서 BmoF1의 생촉매 활성에 있어서 합성 3'UTR의 효과를 알아보기 위하여, pET22b-BmoF1-3'UTRsyn와 pCOLA-ADH로 형질전환 된 재조합 대장균 BL21(DE3)를 구축하고, 이를 활용하여 리시놀레산 생물전환 활성을 분석하였다.
그 결과, 유사한 개수의 RNAse E 절단 부위를 갖는 pET22b-BmoF1-3'UTRCAT357과 pET22b-BmoF1-3'UTRsyn을 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)는 매우 유사한 생물전환 결과를 보였으며, pET22b-BmoF1-3'UTRnative를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)에 비해 현저히 높은 농도의 에스터 생성물을 형성함을 통해서 BmoF1의 촉매활성이 개선됨을 확인하였다 (도 7).
상기 결과를 종합하여 볼 때, 3'UTR 서열보다 RNase E 절단 부위의 수가 수용성 단백질 발현 수준 및 생물전환 활성에 중요하다고 결론지을 수 있다.
실시예 2-4: CAT 염기서열을 이용한 Rhodococcus jostii RHA1 유래 BVMO의 수용성 발현
슈도모나스 플루오레센스 DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1과 마찬가지로, 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) RHA1 유래 BVMO(즉, MO16, BmoF1과 서열 상동성: 23.3%, 도 8a)인 MO16도 대장균에서 수용성 발현이 매우 어렵다고 알려져 있다(ChemBioChem 10:1208-1217, 2009). 따라서, 대장균에서 MO16의 수용성 단백질 발현을 향상시키기 위해서, 3'UTR에 RNase E 절단 부위 수를 늘리는 연구를 수행하였다.
실시예 2-4-1: 유전자 클로닝
pET-MO16-3'UTRCAT257를 제작하기 위하여, 정방향 및 역방향 프라이머로써 MO16_CAT257_F(5'-AAGCTTATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT-3', 서열번호 19), 및 MO16_CAT257_R(5'-CTCGAGCGCCCCCTGCCACTCATCG-3', 서열번호 20)로 PCR을 수행하여 MO16_CAT을 증폭하였다. 상기 MO16_CAT 서열 단편을 pET-MO16의 HindIII-XhoI 제한효소 부위로 서브클로닝하여 pET22b-MO16-3'UTRCAT257을 제작하였다(ChemBioChem 10:1208-1217, 2009).
실시예 2-4-2: 전세포 생물전환
대장균에서 MO16의 생촉매 활성에 있어서 3'UTR에 삽입되는 RNase E 절단 부위 수에 따른 효과를 알아보기 위하여, pET-MO16-3'UTRCAT257과 pCOLA-ADH로 형질전환된 재조합 대장균 BL21(DE3)를 구축하고 이들의 리시놀레산 생물전환 활성을 분석하였다.
그 결과, pET-MO16-3'UTRCAT257를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)는 대조군인 pET-MO16-3'UTRnative를 발현하는 재조합 대장균 BL21(DE3)보다 35% 더 높은 비율로 에스터 생성물을 형성함을 통해서 MO16의 촉매활성이 개선됨을 확인하였다 (도 8a 및 8b).
따라서, 상기 결과들을 통해 3'UTR에 존재하는 RNase E 절단 부위 수의 조정을 통해 MO16 수용성 단백질을 증가시켜 미생물에서 MO16 효소의 수용성 발현과 생물전환 활성을 개선시킴을 알 수 있었다.
실시예 3: 재조합 대장균을 이용한 올레산으로부터 에스터 생산
실시예 3-1: 올레산 수화효소, 알콜 탈수소화 효소 (Alcohol dehydrogenase, ADH) 및 베이어-빌리거 산화효소 (Bayer-Villiger monooxygenase, BVMO)를 발현하는 대장균을 이용한 올레산으로부터 에스터 생산
재조합 대장균을 이용하여 올레산으로부터 에스터를 생산하기 위해 종래 사용되었던 올레산 수화효소(OhyA)와 Micrococcus luteus NCTC2665 유래 장쇄 2차 알코올 탈수소효소(ADH), Pseudomonas putida 유래의 BVMO를 발현하는 pACYC-ADH-OhyA(Angew. Chem. Int. Ed. 52:2534-2537, 2013) 및 pJOE-E6BVMO (Sci. Reports 6: 29406, 2016)로 형질전환된 재조합 대장균 BL21(DE3)을 이용하여 전세포 생물전환을 수행하였다. 전세포 생물전환은 선행연구(Adv Synth Catal. DOI: 10.1002/adsc.201600216, 2016)에서 보고된 실험 방법에 따라 실시하였다.
그 결과, 반응액에 첨가된 기질인 올레산의 일부가 목표산물인 에스터 화합물로 전환되었으나, 올레산 수화반응 속도와 에스터 생성 속도가 높지 않아 에스터의 생성량이 매우 낮은 수준으로 관찰되었다(도 9a).
실시예 3-2: FadL을 발현시킨 재조합 대장균을 이용한 올레산으로부터 에스터 생산
도 9a에서 기질인 올레산이 세포 내로 유입되는 속도가 낮아서 전체적인 생물전환 속도가 낮은 것으로 사료되었다. 따라서, 올레산의 세포 내로 수송 속도를 높이기 위해 대장균 유래 장쇄지방산 수송단백질인 FadL 발현 수준을 높인 후 생물전환을 수행하고자 하였다.
실시예 3-2-1: FadL을 포함하는 발현벡터 및 형질전환된 재조합 대장균의 제조
FadL을 코딩하는 염기서열(서열번호 9)을 포함하는 발현벡터를 제조하기 위하여, 대장균으로부터 genomic DNA를 추출하여 하기의 방법을 수행하였다.
FadL 유전자를 증폭시키기 위해 프라이머 (FadL_F (서열번호 21): 5'-GCCACGCGATCGCTGCTTAAGTCGAAAGAAAGTA-3', FadL_R (서열번호 22): 5'-GTCAGCGATCGCTCAGTCCTCCTGCACCAGC-3')를 제작하였고, 제작된 프라이머로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다. 증폭시킨 FadL 유전자를 제한효소 PvuI을 사용하여 pACYC-ADH-OhyA에 삽입하여 pACYC-ADH-OhyA-FadL을 제작하였다.
상기와 같이 얻은 재조합 발현벡터와 pJOE-E6BVMO를 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환하여 전세포 촉매를 구축하였다.
실시예 3-2-2: 전세포 생물전환
FadL 도입에 따른 생물전환 속도 증가를 확인하기 위하여, 재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA-FadL 및 pJOE-E6BVM의 전세포 생물전환 반응을 진행하였다. 10mM의 올레산을 기질로 반응액에 투입하여 생물전환을 시작하였고 반응 생성물의 시간별 생산량을 측정하였다.
재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA-FadL 및 pJOE-E6BVM을 생촉매로 사용하였을 경우, 대부분의 올레산이 에스터로 전환 되어 에스터가 약 6 mM의 농도로 반응액에 축적되었다(도 9b). 이 결과를 대조군의 결과 (도 9a)와 비교하면, 반응시간 1시간동안에 측정된 초기 반응속도는 약 25배 증가하였고, 최종 반응 산물인 에스터 농도는 약 4배 증가함을 알 수 있었다.
따라서, 상기 결과를 통해 FadL 발현 수준을 높여 줌으로써 재조합 대장균 촉매의 올레산 생물전환 속도를 현저히 높일 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-3: 올레산 수화효소 2을 발현시킨 재조합 대장균을 이용한 올레산으로부터 에스터 생산
재조합 대장균의 올레산 생물전환 속도를 더욱 높이고자 종래의 지방산 수화효소인 OhyA 대신 실시예 1-1에서 클로닝한 OhyA2를 도입하여 재조합 대장균 생촉매를 구축하였다.
실시예 3-3-1: 올레산 수화효소 2( OhyA2 )를 포함하는 발현벡터 및 형질전환된 재조합 대장균의 제조
올레산 수화효소 2를 포함하는 발현벡터 및 재조합 대장균을 제조하기 위하여, 하기의 방법을 수행하였다.
OhyA2 유전자를 증폭시키기 위해 프라이머 (OhyA2B_F (서열번호 23): 5'-GCCACGCGATCGCTGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTA-3', OhyA2B_R (서열번호 24): 5'-CGTCAGCGATCGCTAGGGCGCGCGCCGCCTGCCCAGCGTT-3')를 제작하였고, 제작된 프라이머로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다. 증폭시킨 올레산 수화효소 2 유전자는 제한효소 PvuI을 사용하여 pACYC-ADH-FadL에 삽입하여 pACYC-ADH-OhyA2-FadL을 제작하였다.
상기와 같이 얻은 재조합 발현벡터와 pJOE-E6BVMO를 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환하여 전세포 촉매를 구축하였다.
실시예 3-3-2: 전세포 생물전환
실시예 3-3-1에서 구축한 pACYC-ADH-OhyA2-FadL를 이용하여 재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA2-FadL 및 pJOE-E6BVM를 구축하고, 이의 전세포 생물전환 반응을 진행하였다. 10 mM의 올레산을 기질로 반응액에 투입하여 생물전환을 시작하였고 반응 생성물의 시간별 생산량을 측정하였다.
재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA2-FadL 및 pJOE-E6BVM을 생촉매로 사용하였을 경우, 대부분의 올레산이 에스터로 전환 되어 에스터가 약 7.4 mM의 농도로 반응액에 관찰되었다(도 9c). 또한, Thermomyces lanuginosus 유래 지방가수분해 효소를 10 U/mL로 반응액에 투입하였을 때 nonanoic acid와 9-hydroxynonanoic acid가 각각 7.4 mM로 생성됨을 확인하였다.
올레산 생물전환 결과를 대조군의 결과(도 9b)와 비교하면, 반응시간 1시간동안에 측정된 초기 에스터 생산속도는 약 13% 증가하였고, 최종 반응 산물인 에스터 농도는 약 30% 증가함을 확인하였다.
따라서, 상기 결과를 통해 OhyA2 유전자를 사용함으로써 재조합 대장균 촉매의 올레산 생물전환 속도를 현저히 높일 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-4: 합성 UTR을 도입한 BVMO를 발현시킨 재조합 대장균을 이용한 올레산으로부터 에스터 생산
18개의 RNAse E 절단 부위를 포함하는 합성 3'UTR(서열번호 8)을 이용하여 BVMO의 수용성 발현을 개선시켜 최종 산물인 에스터 농도를 증가시킴으로써 생산 수율을 높이고자 하였다.
실시예 3-4-1: 합성 UTR을 도입한 BVMO를 포함하는 발현벡터 및 형질전환된 재조합 대장균의 제조
CAT 염기서열을 바탕으로 임의의 RNAse E 절단 부위를 나열하여 18개의 RNAse E 절단부위를 갖는 염기서열(서열번호 8)을 합성하였다.
합성된 UTR 염기서열은 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로써 CAT657B_F (5'-GGATCCATAAAGGCTTAAATCACTG-3', 서열번호 25) 및 CAT657B_R (5'-GGATCCAGTGTAGGAGAATTCTTCTA-3', 서열번호 26) 프라이머로 PCR을 통해 증폭하였다. 상기 증폭된 염기서열 단편은 E6BVMO 유전자의 3'UTR에 pJOE-E6BVMO의 BamHI 제한효소부위로 삽입하여 pJOE-E6BVMOUTR을 제작하였으며, 상기 제작된 pJOE-E6BVMOUTR과 pACYC-ADH-OhyA2-FadL을 재조합 대장균 BL21(DE3) 에 형질 전환하여 전세포 촉매를 구축하였다.
실시예 3-4-2: 전세포 생물전환
실시예 3.4.1에서 구축한 pJOE-E6BVMOUTR를 이용하여 재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA2-FadL 및 pJOE-E6BVMOUTR를 제작하고, 이의 전세포 생물전환 반응을 진행하였다. 10 mM의 올레산을 기질로 반응액에 투입하여 생물전환을 시작하였고 반응 생성물의 시간별 생산량을 측정하였다.
재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA2-FadL 및 pJOE-E6BVMOUTR을 생촉매로 사용하였을 경우, 대부분의 올레산이 에스터로 전환 되어 에스터가 약 8.5 mM의 농도로 반응액에 축적됨을 확인하였다(도 9d). 또한, Thermomyces lanuginosus 유래 지방가수분해 효소를 10 U/mL로 반응액에 투입하였을 때 nonanoic acid와 9-hydroxynonanoic acid가 각각 8.5 mM로 생성됨을 확인하였다.
올레산 생물전환 결과를 대조군의 결과(도 9c)와 비교하면, 반응시간 1시간동안에 측정된 초기 반응속도는 약 25% 증가하였고, 최종 반응 산물인 에스터 농도는 15% 증가하였다.
따라서, 상기 결과를 통해 합성 UTR을 도입한 BVMO를 이용함으로써 재조합 대장균 촉매의 올레산 생물전환 속도를 현저히 높일 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 올레산 수화효소, 알콜 탈수소화 효소(Alcohol dehydrogenase ) 및 베이어-빌리거 산화효소( Bayer - Villiger monooxygenase , BVMO )를 발현하는 대장균을 이용한 리놀레산으로부터 에스터 생산
실시예 3에서 구축된 전세포 촉매들을 이용하여 리놀레산으로부터 에스터 생산을 위한 생물전환 반응을 진행하였다. 각각의 전세포 촉매의 생물전환 효율 증가를 확인하기 위하여, 전세포 생물전환 반응을 진행하였다. 전세포 생물전환은 실시예 3-1의 방법과 동일하게 수행하였다.
재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA, pJOE-E6BVMO를 이용하여 리놀레산으로부터 에스터를 생산한 경우, 기질 소비 및 최종 산물의 생산이 거의 이루어지지 않았다(도 10a).
지방산의 세포 내 유입을 돕는 FadL을 도입시킨 재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA-FadL, pJOE-E6BVMO를 이용하여 에스터를 생산한 경우, 생물전환이 효율적으로 진행되어 5.5 mM의 리놀레산으로부터 에스터가 4 mM로 생산됨을 확인하였다(도 10b).
따라서, FadL의 발현 수준 향상이 리놀레산 생물전환에 매우 중요함을 알 수 있었다.
종래의 OhyA 대신 OhyA2를 사용한 재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA2-FadL, pJOE-E6BVMO를 이용한 생물전환의 결과에서 대조군의 결과(도 10b)와 비교하여 초기반응 속도는 2배, 최종 수율은 15% 정도 증가하였다(도 10c).
따라서, 본 발명에서 새롭게 클로닝한 OhyA2의 활성이 리놀레산 생물전환에 상당히 중요함을 확인하였다.
수용성 발현을 개선시킨 pJOE-E6BVMOUTR을 이용한 재조합 대장균 BL21(DE3) pACYC-ADH-OhyA2-FadL, pJOE-E6BVMOUTR을 이용하여 리놀레산 생물전환을 진행한 결과, 초기반응 속도는 25%, 최종 생물전환 수율은 14% 정도 증가하여, 결과적으로 5.5 mM의 리놀레산으로부터 에스터가 4.8 mM로 생성되었다(도 10d).
또한, Thermomyces lanuginosus 유래 지방가수분해 효소를 10 U/mL로 반응액에 투입하였을 때 3-nonenoic acid와 9-hydroxynonanoic acid가 각각 4.1 mM로 생성됨을 확인하였다.
따라서, 상기 결과를 통해 합성 UTR을 도입한 BVMO를 이용함으로써 재조합 대장균 촉매의 리놀레산 생물전환 속도를 현저히 높일 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (18)

  1. (a) 올레산 수화효소 2, 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase), BVMO(Baeyer-Villiger monooxygenase) 및 에스터/지방 가수분해효소(esterase/lipase)를 발현할 수 있고; 상기 BVMO를 코딩하는 유전자의 3'말단에 mRNA 안정성을 변화시키는 UTR(untranslated region)이 결합된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 상기 BVMO의 수용성 발현을 유도할 수 있는 생물전환 공정용 형질전환체를 수득하는 단계; 및,
    (b) 상기 수득한 형질전환체에 장쇄 불포화 지방산 기질을 가하고 배양하는 단계를 포함하는, 장쇄 불포화 지방산 기질로부터 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 올레산 수화효소 2는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되거나 또는 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로부터 발현되는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 알코올 탈수소효소는 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 알코올 탈수소화효소인 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 BVMO는 슈도모나스속 균주(Pseudomonas sp.), 로도코커스속 균주(Rhodococcus sp). 브레비박테리움속 균주(Brevibacterium sp.), 코마노나스속 균주(Comanonas sp.), 아시네토박터속 균주(Acinetobacter sp.), 아트로박터속 균주(Arthrobacter sp.) 및 브라키모나스속 균주(Brachymonas sp.)로 구성된 군으로부터 선택되는 미생물로부터 유래된 BVMO인 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 BVMO는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 유래의 BVMO, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DSM50106 유래 BVMO인 BmoF1 또는 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) RHA1 유래 BVMO인 MO16인 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 UTR(untranslated region)에는 mRNA의 안정성을 감소시키는 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열이 삽입된 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열은 hilD 염기서열(서열번호 3), CAT257 염기서열(서열번호 4), CAT357 염기서열(서열번호 5), CAT557 염기서열(서열번호 6), CAT657 염기서열(서열번호 7) 또는 합성염기서열(3'UTRsyn, 서열번호 8)인 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 에스터/지방 가수분해효소는 써모마이세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosus) 균주 유래의 지방 가수분해효소 또는 슈도모나스 플로레센스(Pseudomonas fluorescens) 균주 유래 에스터 가수분해효소인 것인, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 장쇄 불포화 지방산은 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 불포화 지방산인 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계를 수행하면, 장쇄 불포화 지방산 기질에 올레산 수화효소 2가 작용하여, 상기 장쇄 불포화 지방산을 하이드록시 지방산으로 전환시키고; 상기 전환된 하이드록시 지방산에 알코올 탈수소효소가 작용하여, 상기 하이드록시 지방산을 키토 지방산으로 전환시키며; 상기 전환된 키토 지방산에 BVMO가 작용하여, 상기 키토 지방산을 지방산 사슬내에 에스터기가 도입된 지방산 에스터 유도체로 전환시키고; 상기 전환된 지방산 에스터 유도체를 에스터/지방 가수분해효소가 절단하여, 중쇄 지방산과 중쇄 오메가-하이드록시 지방산을 생성하는 것인, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 형질전환체는 배지내 장쇄 불포화 지방산의 형질전환체 내부로의 유입을 촉진시키는 전달체 단백질을 추가로 발현시킬 수 있는 것인, 방법.
  12. 제12항에 있어서,
    상기 전달체 단백질은 서열번호 9의 염기서열로부터 발현되는 FadL 단백질인 것인, 방법.
  13. 제1항의 형질전환체에서 발현되고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 올레산 수화효소 2.
  14. 제13항의 올레산 수화효소 2를 코딩하고, 서열번호 2의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드.
  15. (a) 목적하는 수용성 단백질을 코딩하는 유전자의 3'말단에 mRNA 안정성을 증가시키는 UTR(untranslated region)이 결합된 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하고,
    상기 UTR의 염기서열 내에는 mRNA의 안정성을 저하시키는 RNase E 절단 부위를 포함하는 염기서열이 삽입된 것을 특징으로 하는, 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율을 증가시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 목적하는 수용성 단백질은 과발현 되었을 때, 과발현된 단백질이 세포내에서 상호 응집하여 봉입체를 형성함으로써, 상기 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현비율이 50% 이하인 단백질인 것인, 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 목적하는 수용성 단백질은 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas 　fluorescens) DSM50106 유래 또는 로도코커스 조스티(Rhodococcus jostii) RHA1 유래 BVMO(Bayer-Villiger monooxygenase)인 것인, 방법.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 RNase E 절단 부위 수의 조정에 따라 목적하는 단백질의 전체 발현수준 대비 수용성 발현 비율이 변화되는 것을 특징으로 하는, 방법.
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