WO2017090157A1 - 血管新生抑制剤 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to an angiogenesis inhibitor that suppresses angiogenesis.
  • Angiogenesis is a physiological phenomenon in which new blood vessels branch from blood vessels, and plays an important role in organ formation, development of the corpus luteum, wound healing, etc. in the early stages of animal development. It is known that this excessive occurrence of angiogenesis is involved in many diseases such as malignant tumors, psoriasis, rheumatism, atherosclerosis, retinopathy (see Non-patent Documents 1 and 2).
  • angiogenesis includes proliferation, differentiation, migration, luminal formation of vascular endothelial cells and the like.
  • Angiogenesis is mainly controlled by several different growth factors and their receptors. Among these, vascular endothelial growth factor (VEGF) is considered to be the most important regulator in angiogenesis.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF is a dimeric glycoprotein unique to endothelial cells. VEGF overexpression occurs in various tumors and causes tumor angiogenesis. VEGF is also overexpressed in other pathological conditions such as rheumatoid arthritis and retinal neovascularization.
  • VEGFR2 VEGF receptor 1
  • VEGFR2 VEGF receptor 2
  • VEGF When VEGF binds to VEGFR2, receptor dimerization and autophosphorylation occur, resulting in phosphorylation and activation of several downstream signaling proteins including Akt, ERK1 / 2, p38 MAPK. These signaling proteins play an important role in cancer cell survival, proliferation, migration, and reorganization.
  • angiogenesis inhibitors have been developed and used for the purpose of treatment and prevention.
  • side effects such as hemoptysis, nosebleed, thrombosis, hypertension, proteinuria, and perforation are known for the angiogenesis inhibitors currently being developed.
  • chronic diseases such as malignant tumors, rheumatism, and arteriosclerosis
  • long-term administration is required and a safe anti-angiogenic agent is required, but use is limited due to side effects as described above. .
  • the present invention has been made to solve the above-described problems, and an object thereof is to provide a drug effective for suppressing angiogenesis that causes disease.
  • An angiogenesis inhibitor according to the present invention comprises a first step of degrading starch extracted from rice bran with glucoamylase to obtain a water-soluble polysaccharide extract, and L. lentinula edodes as basidiomycetes. Ammonium sulfate is added to the cultured culture filtrate, the second step of obtaining the enzyme complex from this precipitate, and the enzyme complex obtained in the second step is added to the water-soluble polysaccharide extract obtained in the first step. By reacting at pH 4.0 to 5.0 for 30 to 60 minutes and further reacting at pH 5.5 to 6.5 for 30 to 60 minutes, the water-soluble polysaccharide extract obtained in the first step is biologically decorated. The product produced by the third step of applying is used as an active ingredient and is used to suppress angiogenesis.
  • the product is a polysaccharide complex.
  • FIG. 1E is a photograph showing the results of culturing by adding 3 mg / mL of an angiogenesis inhibitor in addition to VEGF in a state where HUVECs and HDF coexist.
  • FIG. 2A is a characteristic diagram showing the results of quantifying the area of the lumen 10 days after culturing in the presence of HUVECs and HDF in each condition by image data processing in observation with an optical microscope.
  • FIG. 2B is a characteristic diagram showing the results of quantifying the length of the lumen 10 days after culturing in the presence of HUVECs and HDF in each condition by image data processing in observation with an optical microscope.
  • FIG. 1E is a photograph showing the results of culturing by adding 3 mg / mL of an angiogenesis inhibitor in addition to VEGF in a state where HUVECs and HDF coexist.
  • FIG. 2A is a characteristic diagram showing the results of quantifying the area of the lumen 10 days after culturing in the presence of HUVECs
  • FIG. 2C is a characteristic diagram showing the result of quantification of the number of branch points in the lumen 10 days after culturing in the presence of HUVECs and HDF in each condition by image data processing in observation with an optical microscope.
  • FIG. 2D is a characteristic diagram showing the results of quantification of the number of lumen branches 10 days after culturing in the presence of HUVECs and HDF in each condition by image data processing in observation with an optical microscope.
  • FIG. 3 is a characteristic diagram showing the results of measuring the formazan product with a microplate reader in the culture results of each condition of Example 2.
  • FIG. 4A is a photograph showing the result of culturing without adding anything in Example 3.
  • FIG. 4B is a photograph showing the results of culture with VEGF added in Example 3.
  • FIG. 4C is a photograph showing the results of culturing with the addition of 0.3 mg / mL of an angiogenesis inhibitor in addition to VEGF in Example 3.
  • FIG. 4D is a photograph showing the results of culturing with the addition of 1 mg / mL of an angiogenesis inhibitor in addition to VEGF in Example 3.
  • FIG. 4E is a photograph showing the results of culturing with the addition of 3 mg / mL of an angiogenesis inhibitor in addition to VEGF in Example 3.
  • FIG. 5 is a characteristic diagram showing measurement by observation with an optical microscope of a cell migration state under each condition of Example 3.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of Western blot analysis in a cell extract under each condition of HUVECs in Example 4.
  • FIG. 5 is a characteristic diagram showing measurement by observation with an optical microscope of a cell migration state under each condition of Example 3.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of Western blot analysis in a cell extract under each condition of HUV
  • FIG. 7A is a characteristic diagram showing phosphorylation of VEGFR2 under each condition of the fourth embodiment.
  • FIG. 7B is a characteristic diagram showing phosphorylation of Akt under each condition of the fourth embodiment.
  • FIG. 7C is a characteristic diagram showing phosphorylation of ERK1 / 2 under each condition of the fourth embodiment.
  • FIG. 7D is a characteristic diagram showing phosphorylation of p38 under each condition of the fourth embodiment.
  • starch extracted from rice bran is decomposed with glucoamylase to obtain a water-soluble polysaccharide extract.
  • a water-soluble polysaccharide extract For example, 5 liters of water is added to 1000 g of rice bran, heated to 100 ° C. and subjected to hot water extraction for 60 minutes, and then insoluble matters are filtered off.
  • the starch in the filtered filtrate is hydrolyzed with glucoamylase to obtain a rice bran hemicellulose extract.
  • hemicellulose can be used.
  • hemicellulose of the grass family plant is excellent as a raw material.
  • an enzyme complex is prepared by cultivating Lentinurda edodes of Bassidiomycetes.
  • the lentinula ededes may be conventionally called lentinus edodes. This medium composition is shown in Table 1 below.
  • the Enzyme-LE 3 g obtained was added to 4.5 liters of rice bran hemicellulose (water-soluble polysaccharide) extract, and the pH was first adjusted to 4.5. The mixture is reacted at 40 ° C. for 30 minutes, and further adjusted to pH 6.0 and reacted for 30 minutes to produce rice bran hemicellulose (RBX-LE: product) modified by Lentinula edodes extracellular enzyme.
  • the initial reaction may be performed at pH 4.0 to 5.0 for 30 to 60 minutes. Further, the next reaction may be performed at a pH of 5.5 to 6.5 for 30 to 60 minutes.
  • the produced product is an active ingredient of the angiogenesis inhibitor in the present embodiment.
  • the main component of the substance serving as an active ingredient is xylan mainly composed of ⁇ -1,4 xylopyranose chains.
  • the product produced as described above is sterilized, sterilized and concentrated as it is, it can be used as a liquid agent for an angiogenesis inhibitor. Furthermore, it can be pulverized by freeze-drying or spray-drying and used as an angiogenesis inhibitor for tablets and granules.
  • Example 1 First, Example 1 will be described.
  • human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and human skin fibroblasts (HDF) are targeted as angiogenesis suppression models.
  • Example 2 Next, Example 2 will be described.
  • HUVECs are targeted as an angiogenesis suppression model.
  • FIGS. 4A, 4B, 4C, 4D, and 4E The optical micrographs of each sample are shown in FIGS. 4A, 4B, 4C, 4D, and 4E.
  • FIG. 4A is a photograph showing the result of culturing without adding anything.
  • FIG. 4B is a photograph showing the results of culturing with VEGF added.
  • FIG. 4C is a photograph showing the results of culturing with 0.3 mg / mL of an angiogenesis inhibitor in addition to VEGF.
  • FIG. 4D is a photograph showing the results of culturing with 1 mg / mL of an angiogenesis inhibitor added to VEGF.
  • FIG. 4E is a photograph showing the results of culturing with 3 mg / mL of an angiogenesis inhibitor in addition to VEGF.
  • Example 4 Next, Example 4 will be described.
  • HUVECs are targeted as an angiogenesis suppression model.
  • HUVECs were analyzed by Western blot. HUVECs were pre-cultured for 30 minutes with and without angiogenesis inhibitor (3 mg / mL), added with VEGF (10 ng / mL), and cultured for 15 minutes. Proteins were extracted by dissolving HUVECs, centrifuging, and collecting the supernatant. The extracted protein was analyzed by Western blot. Images were captured with an image capturing device “Ez-Capture MG AE-9300 (manufactured by Atto Corporation)” and analyzed with analysis software “CS Analyzer 3.0 (manufactured by Atto Corporation)”. FIG. 6 shows the result of capturing an image. The analysis results are shown in FIGS. 7A, 7B, 7C, and 7D.
  • HUVECs increased phosphorylation of vascular endothelial growth factor receptor VEGFR2, serine / threonine kinase Akt, mitogen-activated protein kinase ERK1 / 2, and p38 by adding VEGF.
  • VEGFR2 vascular endothelial growth factor receptor 2
  • serine / threonine kinase Akt serine / threonine kinase Akt
  • mitogen-activated protein kinase ERK1 / 2 mitogen-activated protein kinase ERK1 / 2
  • p38 mitogen-activated protein kinase ERK1 / 2
  • angiogenesis inhibitor of the present invention is effective in suppressing angiogenesis that causes disease.

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Abstract

米糠を熱水で抽出し、不溶物を濾別し、この濾液をグルコアミラーゼで処理してでんぷんを分解して得た水溶性多糖体抽出液と、バシディオミセテス類のレンチニュラエドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）を培養した培養濾液に硫酸アンモニウムを加え、この沈澱物から得た酵素の複合体とを加え、ｐＨ４．５で３０～６０分反応させ、さらにｐＨ６．０で３０～６０分反応させることによって、水溶性多糖体抽出液に生物学的装飾を施した生成物質を、例えば、除菌、滅菌して濃縮し、疾病の原因となる血管新生の抑制に有効な血管新生抑制剤とする。

Description

血管新生抑制剤
　本発明は、血管新生を抑制する血管新生抑制剤に関する。
　血管新生を抑制することで、癌などの疾病を治療する試みがなされている。血管新生は、血管から新たな血管が分岐する生理現象であり、動物の発生初期の器官形成や黄体の発達、傷の治癒などに重要な役割を担っている。この血管新生の過剰な発生が、悪性腫瘍、乾癬、リウマチ、アテローム性動脈硬化、網膜症など多くの疾病に関与することが知られている（非特許文献１，非特許文献２参照）。
　血管新生の過程は、増殖、分化、遊走、血管内皮細胞の管腔形成などを含んでいる。血管新生は、主に幾つかの異なる増殖因子と、これらのレセプターにより制御されている。この中で、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管形成において最も重要な制御因子と考えられる。ＶＥＧＦは、内皮細胞に特有な二量体糖タンパク質である。ＶＥＧＦの過剰発現は、さまざまな腫瘍で生じ、腫瘍の血管形成を引き起こす。ＶＥＧＦは他の病的状態、例えば慢性関節リウマチ、網膜新生血管でも過剰に発現する。
　ＶＥＧＦの血管新生促進作用には、２つのチロシンキナーゼレセプター、ＶＥＧＦレセプター１（ＶＥＧＦＲ１）とＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）の結合が介在する。ＶＥＧＦＲ２の方が、ＶＥＧＦＲ１よりもチロシンキナーゼ活性が高いことから、ＶＥＧＦＲ２が血管新生の中心的なシグナル伝達経路と考えられる。
　ＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ２に結合すると、レセプターの二量体化と自己リン酸化が起き、この結果、Ａｋｔ，ＥＲＫ１／２，ｐ３８ ＭＡＰＫを含む幾つかの下流の情報伝達タンパクのリン酸化と活性化を引き起こす。これらの情報伝達タンパクが、癌細胞の生存、増殖、遊走、再組織化に重要な役割を演じている。
J. Folkman , "Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease", Nature Medicine, vol.1, pp.27-31, 1995. N. Ferrara , "Role of vascular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis", Kidney International, vol.56, pp.794-814, 1999.
　上述したように、血管新生が悪性腫瘍など様々な疾患の発症や進行に関与することから、治療や予防を目的に血管新生阻害剤が開発・利用されている。しかしながら、現在開発されている血管新生抑制剤には、喀血、鼻血、血栓症、高血圧、タンパク尿、穿孔などの副作用が知られている。悪性腫瘍やリウマチ、動脈硬化など慢性疾患が、多いため、長期間の服用が必要であり安全な血管新生抑制剤が求められているが、上述したような副作用のため、使用が限られている。
　本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、疾病の原因となる血管新生の抑制に有効な薬剤を提供することを目的とする。
　本発明に係る血管新生抑制剤は、米糠より抽出したでんぷんをグルコアミラーゼで分解して水溶性多糖体抽出液を得る第１過程と、バシディオミセテス類のレンチニュラエドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）を培養した培養濾液に硫酸アンモニウムを加え、この沈澱物から酵素の複合体を得る第２過程と、第１過程で得た水溶性多糖体抽出液に第２過程で得た酵素の複合体を加えてｐＨ４.０～５.０で３０～６０分反応させ、さらにｐＨ５．５～６.５で３０～６０分反応させることによって、第１過程で得た水溶性多糖体抽出液に生物学的装飾を施す第３過程とにより生成した生成物質を有効成分として含み、血管新生の抑制に用いられる。
　上記血管新生抑制剤において、生成物質は、多糖複合体である。
　以上説明したことにより、本発明によれば、疾病の原因となる血管新生の抑制に有効な薬剤が提供できるという優れた効果が得られる。
図１Ａは、何も加えずにＨＵＶＥＣｓとＨＤＦとを共存させて培養した結果を示す写真である。 図１Ｂは、ＨＵＶＥＣｓとＨＤＦとを共存させてＶＥＧＦを加えて培養した結果を示す写真である。 図１Ｃは、ＨＵＶＥＣｓとＨＤＦとを共存させた状態に、ＶＥＧＦに加えて血管新生抑制剤を０．３ｍｇ／ｍＬ加えて培養した結果を示す写真である。 図１Ｄは、ＨＵＶＥＣｓとＨＤＦとを共存させた状態に、ＶＥＧＦに加えて血管新生抑制剤を１ｍｇ／ｍＬ加えて培養した結果を示す写真である。 図１Ｅは、ＨＵＶＥＣｓとＨＤＦとを共存させた状態に、ＶＥＧＦに加えて血管新生抑制剤を３ｍｇ／ｍＬ加えて培養した結果を示す写真である。 図２Ａは、各条件でＨＵＶＥＣｓとＨＤＦとを共存させて培養した１０日後の管腔の面積の定量を光学顕微鏡の観察における画像データ処理により実施した結果を示した特性図である。 図２Ｂは、各条件でＨＵＶＥＣｓとＨＤＦとを共存させて培養した１０日後の管腔の長さの定量を光学顕微鏡の観察における画像データ処理により実施した結果を示した特性図である。 図２Ｃは、各条件でＨＵＶＥＣｓとＨＤＦとを共存させて培養した１０日後の管腔の分岐点数の定量を光学顕微鏡の観察における画像データ処理により実施した結果を示した特性図である。 図２Ｄは、各条件でＨＵＶＥＣｓとＨＤＦとを共存させて培養した１０日後の管腔の枝数の定量を光学顕微鏡の観察における画像データ処理により実施した結果を示した特性図である。 図３は、実施例２の各条件の培養結果において、ホルマザン生成物をマイクロプレートリーダーで測定した結果を示す特性図である。 図４Ａは、実施例３において、何も加えずに培養した結果を示す写真である。 図４Ｂは、実施例３において、ＶＥＧＦを加えて培養した結果を示す写真である。 図４Ｃは、実施例３において、ＶＥＧＦに加えて血管新生抑制剤を０．３ｍｇ／ｍＬ加えて培養した結果を示す写真である。 図４Ｄは、実施例３において、ＶＥＧＦに加えて血管新生抑制剤を１ｍｇ／ｍＬ加えて培養した結果を示す写真である。 図４Ｅは、実施例３において、ＶＥＧＦに加えて血管新生抑制剤を３ｍｇ／ｍＬ加えて培養した結果を示す写真である。 図５は、実施例３の各条件における細胞の遊走状態の光学顕微鏡の観察による計測を示す特性図である。 図６は、実施例４におけるＨＵＶＥＣｓの各条件による細胞抽出液におけるウエスタンブロット解析の結果を示す写真である。 図７Ａは、実施の形態４の各条件におけるＶＥＧＦＲ２のリン酸化を示す特性図である。 図７Ｂは、実施の形態４の各条件におけるＡｋｔのリン酸化を示す特性図である。 図７Ｃは、実施の形態４の各条件におけるＥＲＫ１／２のリン酸化を示す特性図である。 図７Ｄは、実施の形態４の各条件におけるｐ３８のリン酸化を示す特性図である。
　以下、本発明の実施の形態について説明する。本発明の実施の形態における血管新生抑制剤の製造について説明する。
　まず、米糠より抽出したでんぷんをグルコアミラーゼで分解し、水溶性多糖体抽出液を得る。例えば、米糠１０００ｇに水５リットルを加え、これを１００℃に加熱して熱水抽出を６０分間行った後、不溶物を濾別する。このように、米糠より熱水で抽出して不溶物を濾別した後、濾別した濾液中のでんぷんをグルコアミラーゼで加水分解することにより、米糠ヘミセルロース抽出液を得る。米糠以外にもヘミセルロースであれば使用し得る。特にイネ科の植物のヘミセルロースは原料として優れている。
　次に、バシディオミセテス類のレンチニュラエドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）を培養した酵素複合体を作製する。なお、レンチニュラエドデスは、慣用的にレンチナスエドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ　ｅｄｏｄｅｓ）と呼ばれる場合もある。この培地組成について、以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上述した培地での培養の後、培養濾液に硫酸アンモニウムを５０％飽和となるように加え、生じた沈澱物を分別し、Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓの酵素複合体（Ｅｎｚｙｍｅ－ＬＥ）を得る。
　上述したようにＥｎｚｙｍｅ－ＬＥを得た後、前述した米糠ヘミセルロース（水溶性多糖体）抽出液４．５リットルに、得られたＥｎｚｙｍｅ－ＬＥ３ｇを加え、最初にｐＨを４．５に調整し、４０℃で３０分反応させて、さらにｐＨを６．０に調整して３０分反応させ、Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓの菌体外酵素によって修飾された米糠ヘミセルロース（ＲＢＸ－ＬＥ：生成物質）を作製する。なお、最初の反応は、ｐＨ４.０～５.０で３０～６０分反応させればよい。また、次の反応は、ｐＨ５．５～６.５で３０～６０分反応さ競ればよい。作製した生成物質が、本実施の形態における血管新生抑制剤の有効成分である。この有効成分となる物質の主成分は、β－１,４キシロピラノース鎖を主とするキシランであることが分析の結果判明している。
　以上に説明したように、本発明における血管新生抑制剤は、米糠より抽出したでんぷんをグルコアミラーゼで分解して得られた水溶性多糖体抽出液に、バシディオミセテス類のレンチニュラエドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）を培養した培養濾液に硫酸アンモニウムを加え、この沈澱物から得られた酵素の複合体を加えてｐＨ４.０～５.０で３０～６０分反応させ、さらにｐＨ５．５～６.５で３０～６０分反応させることによって、水溶性多糖体抽出液に生物学的装飾を施すことにより生成した生成物質を有効成分として含み、血管新生の抑制に用いられる。生成物質は、多糖複合体である。
　例えば、上述したようにして作製した生成物質を除菌、滅菌してこのまま濃縮すれば、血管新生抑制剤の液剤として使用することができる。さらに凍結乾燥やスプレードライによって粉体化して錠剤、顆粒の血管新生抑制剤として使用することもできる。
　ここで、ＲＢＸ－ＬＥの理化学的性質は以下の表２に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　次に、上述した本実施の形態における血管新生抑制剤の効果について、実施例を用いて説明する。
［実施例１］
　始めに、実施例１について説明する。実施例１では、血管新生抑制モデルとして、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）およびヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を対象とする。
＜実験内容＞
　ＨＵＶＥＣｓとＨＤＦとを共存させ、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを加えた場合と加えない場合、実施の形態における血管新生抑制剤を加えた場合と加えない場合についてそれぞれ培養した。血管新生抑制剤については、添加量を、０．３ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬの３点とした。
　各々の培養状態について、１０日後の状態を光学顕微鏡で観察した。観察により得られた写真を図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅに示す。図１Ａは、何も加えずに培養した結果を示す写真である。図１Ｂは、ＶＥＧＦを加えて培養した結果を示す写真である。図１Ｃは、ＶＥＧＦに加えて血管新生抑制剤を０．３ｍｇ／ｍＬ加えて培養した結果を示す写真である。図１Ｄは、ＶＥＧＦに加えて血管新生抑制剤を１ｍｇ／ｍＬ加えて培養した結果を示す写真である。図１Ｅは、ＶＥＧＦに加えて血管新生抑制剤を３ｍｇ／ｍＬ加えて培養した結果を示す写真である。
　また、光学顕微鏡の観察における撮像（画像）データ処理により、培養１０日後の管腔形成（面積、長さ、分岐点数、枝数）について定量した。図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅに示す画像データの処理により定量した。この定量では、血管新生定量ソフトウエアＶｅｒ．２（倉敷紡績株式会社製）を用いた解析により実施した。図２Ａは、面積（Area）の定量結果を示した特性図である。図２Ｂは、長さ（Length）の定量結果を示した特性図である。図２Ｃは、分岐点数（Joint）の定量結果を示した特性図である。図２Ｄは、枝数（Path）の定量結果を示した特性図である。いずれの図においても「control」は、何も加えずに培養した場合の結果である。
＜実験結果＞
　定量の結果、図２Ａ，図２Ｂ，図２Ｃ，図２Ｄに示すように、血管の面積、長さ、分岐点数、枝数のいずれにおいても、実施の形態における血管新生抑制剤を添加した場合、濃度依存的に管腔形成を抑制していることが示された。実施の形態における血管新生抑制剤を添加した場合、面積は３ｍｇ／ｍＬ、長さ、分岐点数、枝数は、１および３ｍｇ／ｍＬで、ＶＥＧＦのみ添加した場合に比べ有意な差が認められた。
［実施例２］
　次に、実施例２について説明する。実施例２では、血管新生抑制モデルとして、ＨＵＶＥＣｓを対象とする。
＜実験内容＞
　ＨＵＶＥＣｓを２４時間培養した後、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを加えた場合と加えない場合、実施の形態における血管新生抑制剤を加えた場合と加えない場合について、さらに７２時間それぞれ培養した。血管新生抑制剤については、添加量を、０．３ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬの３点とした。また、培養した各サンプルに対し、１０μＬのＭＴＴを添加し、４時間経過後のホルマザン生成物をマイクロプレートリーダーで測定した。
＜実験結果＞
　測定の結果、図３に示すように、実施の形態における血管新生抑制剤は、濃度依存的にＨＵＶＥＣｓの増殖を抑制していることが示された。添加した血管新生抑制剤の量が多いほど、ＨＵＶＥＣｓの増殖が抑制されている。血管新生抑制剤の添加量が、１ｍｇ／ｍＬおよび３ｍｇ／ｍＬで、ＶＥＧＦは添加して血管新生抑制剤は添加していない場合（control）に比べ有意な差が認められた。
［実施例３］
　次に、実施例３について説明する。実施例３では、血管新生抑制モデルとして、ＨＵＶＥＣｓを対象とし、細胞の遊走状態を測定した。
＜実験内容＞
　細胞の遊走を測定するため、コラーゲンでコーティングした容器にＨＵＶＥＣｓが１層で成育するように２４時間培養した。培養により、容器の底にシート状にＨＵＶＥＣｓが成長した。シート状に成育したＨＵＶＥＣｓの層を無菌的にひっかき、細胞がない部分を作製した。ひっかくことにより浮遊した細胞を取り除き、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを加えた場合と加えない場合、実施の形態における血管新生抑制剤を加えた場合と加えない場合について、２１時間それぞれ培養した。血管新生抑制剤については、添加量を、０．３ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬの３点とした。
　培養した各サンプルに対し、光学顕微鏡の観察によりひっかいた部分の細胞数を計測した。各サンプルの光学顕微鏡写真を図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅに示す。図４Ａは、何も加えずに培養した結果を示す写真である。図４Ｂは、ＶＥＧＦを加えて培養した結果を示す写真である。図４Ｃは、ＶＥＧＦに加えて血管新生抑制剤を０．３ｍｇ／ｍＬ加えて培養した結果を示す写真である。図４Ｄは、ＶＥＧＦに加えて血管新生抑制剤を１ｍｇ／ｍＬ加えて培養した結果を示す写真である。図４Ｅは、ＶＥＧＦに加えて血管新生抑制剤を３ｍｇ／ｍＬ加えて培養した結果を示す写真である。
＜実験結果＞
　遊走状態の計測の結果、図５に示すように、血管新生抑制剤は、濃度依存的にＨＵＶＥＣｓの遊走を抑制していることが示された。添加した血管新生抑制剤の量が多いほど、ＨＵＶＥＣｓの遊走が抑制されている。血管新生抑制剤の添加量が、１ｍｇ／ｍＬおよび３ｍｇ／ｍＬで、ＶＥＧＦは添加して血管新生抑制剤は添加していない場合（control）に比べ有意な差が認められた。
［実施例４］
　次に、実施例４について説明する。実施例４では、血管新生抑制モデルとして、ＨＵＶＥＣｓを対象とする。
＜実験内容＞
　血管新生抑制剤の効果が、ＶＥＧＦＲ２とその下流の情報伝達タンパク質の抑制に関与するかどうか調べるため、ＨＵＶＥＣｓをウエスタンブロットにより分析した。ＨＵＶＥＣｓを血管新生抑制剤（３ｍｇ／ｍＬ）がある場合とない場合で３０分間前培養し、そこにＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）添加し１５分間培養した。ＨＵＶＥＣｓを溶解し、遠心分離し、上清を分取することで、タンパク質を抽出した。抽出したタンパク質をウエスタンブッロトにより解析した。画像取り込み装置「Ｅｚ－Ｃａｐｔｕｒｅ　ＭＧ　ＡＥ－９３００（アトー株式会社製）」で画像を取り込み、解析ソフトウエア「ＣＳ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　３．０（アトー株式会社製）」で解析した。画像の取り込み結果を図６に示す。また、解析結果を図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄに示す。
＜実験結果＞
　解析の結果、ＨＵＶＥＣｓは、ＶＥＧＦの添加により、血管内皮細胞増殖因子受容体であるＶＥＧＦＲ２、セリン・スレオニンキナーゼであるＡｋｔ、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼであるＥＲＫ１／２、ｐ３８のリン酸化が増加することが判明した。また、血管新生抑制剤の前処理が、上述した血管新生に関わる各情報伝達タンパク質のリン酸化を抑制することが示された。なお、図６の「β－actin」に示すように、アプライした各ＨＵＶＥＣｓ抽出液中サンプルのタンパク質の総量は全てにおいて等しい。
　以上に説明したように、本発明の血管新生抑制剤によれば、疾病の原因となる血管新生の抑制に有効であることがわかる。

Claims (2)

  1. 　米糠より抽出したでんぷんをグルコアミラーゼで分解して水溶性多糖体抽出液を得る第１過程と、
    　バシディオミセテス類のレンチニュラエドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）を培養した培養濾液に硫酸アンモニウムを加え、この沈澱物から酵素の複合体を得る第２過程と、
    　前記第１過程で得た水溶性多糖体抽出液に前記第２過程で得た酵素の複合体を加えてｐＨ４.０～５.０で３０～６０分反応させ、さらにｐＨ５．５～６.５で３０～６０分反応させることによって、前記第１過程で得た水溶性多糖体抽出液に生物学的装飾を施す第３過程と
    　により生成した生成物質を有効成分として含み、
     血管新生の抑制に用いられることを特徴とする血管新生抑制剤。
  2. 　請求項１記載の血管新生抑制剤において、前記生成物質は、多糖複合体であることを特徴とする血管新生抑制剤。
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