WO2017084495A1

WO2017084495A1 - Pd-l1抗体、其抗原结合片段及其医药用途

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Publication number: WO2017084495A1
Application number: PCT/CN2016/104320
Authority: WO
Inventors: 屈向东; 胡齐悦; 徐韶瑜; 崔东冰; 金后聪; 陶维康; 张连山; 曹国庆; 孙飘扬
Original assignee: 江苏恒瑞医药股份有限公司; 上海恒瑞医药有限公司
Priority date: 2015-11-17
Filing date: 2016-11-02
Publication date: 2017-05-26
Also published as: US10815304B2; CN109608544B; BR112018009064A2; RU2727914C2; US20180334504A1; EP3378871A1; RU2018119165A; HK1247213A1; AU2016357901B2; AU2016357901A1; CA3004804A1; CN109608544A; MX2018005720A; JP6983371B2; BR112018009064A8; CN107614529B; TWI718206B; US11780923B2; KR20180071376A; RU2018119165A3

Abstract

本发明提供了一种PD-L1抗体，其抗原结合片段，以及该抗体或抗原结合片段在制备治疗PD-L1介导的疾病或病症的药物中的用途。

Description

PD-L1抗体、其抗原结合片段及其医药用途

技术领域

本发明涉及PD-L1抗体、PD-L1抗体的抗原结合片段、包含所述PD-L1抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体，以及包含所述PD-L1抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为抗癌药物的用途。

背景技术

肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗领域一个长时期的热点，其中T细胞的肿瘤免疫治疗又处于其核心位置。肿瘤免疫治疗是充分利用、调动肿瘤患者体内的杀伤性T细胞，对肿瘤进行杀伤作用，它可能是最有效的也是最安全的治疗肿瘤的途径。与此同时，肿瘤逃逸是肿瘤免疫治疗面临的一个巨大障碍，肿瘤细胞利用其自身对免疫系统的抑制作用促进了肿瘤的快速生长。

肿瘤的免疫逃逸机制与机体对肿瘤的免疫应答之间存在着极为复杂的关系。肿瘤免疫治疗早期肿瘤特异性的杀伤性T细胞是有其生物活性的，但随着肿瘤生长后期失去了杀伤的功能。所以肿瘤免疫治疗是为了最大限度的提高患者自身对肿瘤的免疫系统反应，它不但要在体内激活原有的免疫系统反应，更要维持免疫系统反应的持续时间和反应强度，才是免疫治疗肿瘤的关键。

人体内T细胞的活化采取了两条信号通路系统，除了需要通过抗原呈递细胞递呈MHC-抗原肽给T细胞提供第一信号外，还需要一系列协同刺激分子提供第二信号，进而才能使T细胞产生正常的免疫应答。这个双信号通路系统对体内免疫系统的平衡起着至关重要的作用，它严格调控机体对自身和非自身抗原产生不同的免疫应答。如果缺少协同刺激分子提供的第二信号，将会导致T细胞的无应答或持续特异性免疫应答，从而产生耐受。因此，第二信号通路在机体免疫应答的整个过程中起着非常关键的调节作用。

程序性死亡分子1(programmed death-l,PD-l)是1992年发现的表达在T细胞表面的一个蛋白受体，参与到细胞的凋亡过程之中。PD-l属于CD28家族，与细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T Iymphocyte antigen 4,CTLA-4)具有23％的氨基酸同源性，但其表达却与CTLA不同，主要表达在活化的T细胞、B细胞和髓系细胞上。PD-1有两个配体，分别为PD-L1和PD-L2。PD-L1主要表达于T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cell,DC)上，在活化后细胞上的表达能够进行上调。而PD-L2的表达相对较局限，主要表达在抗原呈递细胞上，如活化的巨噬细胞和树突状细胞。

PD-L1通过和PD-1及B7-1的结合抑制免疫系统，很多肿瘤细胞及肿瘤组织微环境的免疫细胞表达PD-L1。新的研究发现乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌及肝癌等人类肿瘤组织中检测到高PD-L1蛋白的表达，且PD-L1的表达水平和患者的临床及预后紧密相关。

由于PD-L1起到第二信号通路抑制T细胞增殖的作用，所以阻断PD-L1/PD-1之间结合成为了肿瘤免疫治疗领域一个非常有潜力的新兴靶点。

目前有多家跨国制药公司在研发针对PD-L1的单克隆抗体，它通过阻断PD-L1/PD-1之间结合，最大限度的提高患者自身对肿瘤的免疫系统反应，从而达到对肿瘤细胞进行杀伤的目的。相关的专利如：WO0139722、WO2013173223、WO2014195852、WO2013181634、WO2015048520、WO2015036511、US2014335093、WO2014100079、WO2014055897、US6803192B1、WO2014022758、US8617546B2和WO2010089411A2。

本发明提供有着高亲和力、高选择性、高生物活性的PD-L1抗体。

发明内容

本发明提供一种PD-L1抗体或其抗原结合片段，其包含任意1个选自以下的CDR区序列或其突变序列：

抗体重链可变区HCDR区序列：SEQ ID NO：10-12，SEQ ID NO：16-18；和抗体轻链可变区LCDR区序列：SEQ ID NO：13-15，SEQ ID NO：19-21；

具体如下：

其中X₁选自N或T，X₂选自R或H，X₃选自N或H，X₄选自H或G，X₅选自G或F。

在本发明一个优选的实施方案中，本发明所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其包含任选自SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的抗体重链可变区HCDR序列或其突变序列。

在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其包含任选自SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21的抗体轻链可变区LCDR序列或其突变序列。

在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中抗体轻链可变区可进一步包含鼠源κ链或鼠源κ链变体的轻链FR区、或者鼠源λ链或鼠源λ链变体的轻链FR区；其中抗体重链可变区可进一步包含鼠源IgG1或其变体的重链FR区、或IgG2或其变体的重链FR区、或IgG3或其变体的重链FR区。

在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述的包含鼠源FR区的抗体重链可变区选自SEQ ID NO：6、8或其突变序列，所述的包含鼠源FR区的抗体轻链可变区选自SEQ ID NO：7、9或其突变序列。

在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中抗体重链可进一步包含鼠源κ链或其变体的轻链恒定区、或者λ链或其变体的轻链恒定区；其中抗体轻链可进一步包含鼠源IgG1或其变体的重链恒定区、或IgG2或其变体的重链恒定区、或IgG3或其变体的重链恒定区。

在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体。根据本发明提供的PD-L1嵌合抗体或其片段，其进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG1。

在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其片段。优选，所述人源化抗体为人源化抗体9-2或人源化抗体24D5，所述人源化抗体重链可变区上的重链FR区序列来源于人种系重链，其中：人源化抗体9-2重链可变区上的重链FR区序列来源于人种系重链IGHV4-30-4*01和hjh2的组合序列；其包含人种系重链IGHV4-30-4*01的FR1、FR2、FR3区和hjh2的FR4区；人源化抗体24D5重链可变区上的重链FR区序列来源于人种系重链IGHV1-46*01和hjh6.1的组合序列；其包含人种系重链IGHV1-46*01的FR1、FR2、FR3区和hjh6.1的FR4区。进一步优选，所述人源化抗体9-2的重链FR区序列有0-10个氨基酸的回复突变，优选为一个或多个选自W47Y、V71R、G27Y、I48M、V67L、F78Y、S30T、Q39K的氨基酸回复突变，更优选为选自W47Y和V71R的氨基酸回复突变；所述人源化抗体24D5的重链FR区序列有0-10个氨基酸的回复突变，优选为一个或多个选自T74K、R72V、M48I、M70L、R38Q、L83F、V68A、和V79A的氨基酸回复突变。更进一步优选，所述人源化抗体的重链可变区序列如下：人源化抗体9-2重链可变区序列为SEQ ID NO：22所示的序列或其变体；或人源化抗体24D5重链可变区序列为SEQ ID NO：24所示的序列或其变体。

在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其片段。优选，所述的人源化抗体为人源化抗体9-2或人源化抗体24D5，所述人源化抗体轻链可变区上的轻链FR区序列来源于人种系轻链，其中：人源化抗体9-2轻链可变区上的轻链FR区序列来源于人种系轻链IGKV4-1*01和hjk4.1的组合序列；其包含人种系轻链IGKV4-1*01的FR1、FR2、FR3区和hjk4.1的FR4区；人源化抗体24D5轻链可变区上的轻链FR区序列来源于人种系轻链IGKV7-3*01和hjk2.1的组合序列；其包含人种系轻链IGKV7-3*01的FR1、FR2、FR3区和hjk2.1的FR4区。进一步优选，所述人源化抗体9-2的轻链FR区序列有0-10个氨基酸的回复突变，优选为P49S的氨基酸回复突变；所述人源化抗体24D5轻链FR区序列有0-10个氨基酸的回复突变，优选为一个或多个选自Y91F，T22S，G72E的氨基酸回复突变或者引入N85E去糖基化突变。更进一步优选，所述人源化抗体的轻链可变区序列如下：人源化抗体Ab-1轻链可变区序列为SEQ ID NO:23所示的序列或其变体；或人源化抗体Ab-2轻链可变区序列为SEQ ID NO:25所示的序列或其变体。

在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体或其片段可进一步进行亲和力成熟设计。

在本发明一个优选的实施方案中，本发明所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中X₁为T，X₂为H，X₃为H，X₄为G，X₅为F。

在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，包括人源化抗体可变区序列如下：

人源化抗体9-2：重链可变区序列为SEQ ID NO:26；轻链可变区序列为SEQ ID NO:27；

人源化抗体24D5：重链可变区序列为SEQ ID NO:28，轻链可变区序列为SEQ ID NO:29。

在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，更优选包含引入F234A和L235A突变的IgG4重链Fc区；所述人源化抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的恒定区。

在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段为人源化抗体9-2或人源化抗体24D5，其中所述人源化抗体9-2包含重链抗体序列SEQ ID NO:30，和轻链抗体序列SEQ ID NO:32；其中所述人源化抗体24D5包含重链抗体序列SEQ ID NO:34，和轻链抗体序列SEQ ID NO:36。

本发明进一步提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的如上所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明进一步提供一种编码如上所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段的DNA分子。

本发明进一步提供一种含有编码如上所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段的DNA分子的表达载体。

本发明进一步提供一种用如上所述的表达载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自细菌、酵母菌和哺乳动物细胞；优选哺乳动物细胞。

在本发明一个优选的实施方案中，本发明所述的宿主细胞为细菌，优选为大肠杆菌。

在本发明另一个优选的实施方案中，本发明所述的宿主细胞为酵母菌，优选为毕赤酵母。

在本发明另一个优选的实施方案中，根据本发明提供的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗原结合片段为Fab、Fv、ScFv、F(ab’)₂。

本发明进一步提供一种根据本发明所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段、或包含其的药物组合物，在制备用于治疗PD-L1介导的疾病或病症的药物中的用途；其中所述的疾病优选为癌症；更优选为表达PD-L1的癌症；所述的癌症最优选为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、膀胱癌；进一步优选为非小细胞肺癌、黑素瘤、膀胱癌和肾癌。

本发明进一步提供一种治疗和预防PD-L1介导的疾病或病症的方法，该方法包括给予所需患者治疗有效量的根据本发明所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段、或包含其的的药物组合物；其中所述的疾病优选为癌症；更优选为表达PD-L1的癌症；所述的癌症最优选为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌；最优选为非小细胞肺癌、黑素瘤、膀胱癌和肾癌。

附图说明

图1：人源化克隆构建时引物设计示意图。

图2：人源化克隆构建的载体构建示意图。

图3：人源化抗体对PBMC的增殖的刺激。

具体实施方式

一、术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

本发明所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。

在本发明中，本发明所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。

在本发明中，本发明所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat 编号规则(LCDR1-3，HCDE2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。

本发明的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。

术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人PD-L1的单克隆抗体。制备时用PD-L1抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源PD-L1抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。

术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所述的PD-L1嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链Fc区。所述的PD-L1嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。人抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG4。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本发明的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。

本发明中所述的“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab‘片段，F(ab’)2片段，以及与人PD-L1结合的Fv片段ScFv片段；其包含本发明所述抗体的选自SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:21中的一个或多个CDR区。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(sFv)。本发明的术语“与PD-L1结合”，指能与人PD-L1相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。

本发明中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，是指表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞。可通过对IgG上Fc段的修饰，降低或消除抗体的ADCC效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变，如选自IgG1的N297A、L234A、L235A；IgG2/4chimera，IgG4的F234A/L235A突变。

本发明中所述的融合蛋白是一种通过DNA重组得到的两个基因共表达的蛋白产物。重组PD-L1胞外区Fc融合蛋白是通过DNA重组将PD-L1胞外区和人抗体Fc片段共表达的融合蛋白。所述的PD-L1胞外区是指PD-L1蛋白表达在细胞膜以外的部分，序列见下面SEQID NO:4划线区。

现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。例如，老鼠可以用人PD-L1或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。

本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链(SEQID NO：30)和轻链(SEQID NO：32)的CDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人PD-L1特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用PH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。

“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。

“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。

“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。

“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。

“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。

本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。

本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51:263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。

“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

二、实施例与测试例

以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1、PD-L1抗原及检测用蛋白的制备

一、蛋白设计及表达

以UniProt Programmed Cell Death1 Ligand1(PD-L1)isoform1(SEQ ID NO：1)的人PD-L1全长基因(义翘神州生物技术有限公司，HG10084-M)，作为本发明PD-L1的模板，获得编码本发明抗原及检测用蛋白的基因序列，可选地与抗体重链Fc片段(如human IgG1)重组，分别克隆到pTT5载体上(Biovector，Cat#：102762)或pTargeT载体上(promega,A1410)，在293F细胞(Invitrogen，R79007)瞬转表达或CHO-S细胞(Invitrogen,k9000-20)稳定表达，纯化，获得编码本发明抗原及检测用蛋白。人PD-1基因购自ORIGENE，货号SC117011，NCBI Reference Sequence:NM_005018.1。

1、人PD-L1全长氨基酸序列

注释：

双横线部分为信号肽(Signal peptide:1–18)；

划横线部分为PD-L1胞外区(Extracellular domain：19–238)，其中19–127为Ig-like V-type Domain，133–225为Ig-like C2-type Domain；

点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain:239–259)；

斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain:260–290)。

2、免疫原：带His、PADRE标签的PD-L1：PD-L1(Extra Cellular Domain，简称ECD)-PADRE-His6

注释：划横线部分为PD-L1胞外区；点划线部分为PADRE标记；斜体部分为His6-tag标记。

3、得到带FLAG、HIS标签的PD-L1：PD-L1(ECD)-Flag-His6，用于本发明抗体的性能测试。

注释：划横线部分为PD-L1胞外区；点划线部分为FLAG-Tag标记；斜体部分为His6-tag标记。

4、PD-L1的Fc融合蛋白：PD-L1(ECD)-Fc，用作本发明的免疫抗原或检测试剂。

注释：划横线部分为PD-L1胞外区；斜体部分为human IgG1Fc部分。

5、PD-1的Fc融合蛋白：PD-1(ECD)-Fc，用于本发明抗体的性能测试。

注释：划横线部分为PD-1(ECD)胞外区；斜体部分为hFC(human IgG1)部分。

实施例2、PD-L1、PD-1重组蛋白以及杂交瘤抗体、重组抗体的纯化

1、“带His、PADRE标签的PD-L1”：PD-L1(ECD)-PADRE-His6(SEQ ID NO：2)重组蛋白的纯化步骤

将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，并将缓冲液换置换为PBS，加入咪唑至终浓度为5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡镍柱，冲洗2-5倍柱体积。将置换后的上清样品装载于Ni柱(GE，17-5318-01)上。用含有5mM咪唑的PBS溶液冲洗柱子，至A₂₈₀读数降至基线。后用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。收集的洗脱液浓缩后用凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，流动相为PBS。去聚体峰，收集洗脱峰。所得到的蛋白经电泳、肽图(安捷伦，6530Q-TOF)、LC-MS(安捷伦，6530Q-TOF)鉴定为正确后分装备用。得到带His、PADRE标签的PD-L1：PD-L1(ECD)-PADRE-His6(SEQ ID NO：2)用于本发明抗体的免疫原。

2、带His标签和Flag标签的PD-L1(ECD)-Flag-His6(SEQ ID NO：3)重组蛋白的纯化步骤

将样品高速离心去除杂质，并浓缩至适当体积。将如上IMAC柱洗出的蛋白峰装载于0.5×PBS平衡的flag亲和柱(Sigma，A2220)上，冲洗2-5倍柱体积。将除杂后的细胞表达上清样品装载于柱上。用0.5×PBS冲洗柱子，至A₂₈₀读数降至基线。用含有0.3M NaCl的PBS冲洗柱子，冲洗杂蛋白，并收集。用0.1M乙酸(pH3.5-4.0)洗脱目的蛋白，并收集，调节pH至中性。收集的洗脱液浓缩后用凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，流动相为PBS。去聚体峰，收集洗脱峰收集样品经电泳、肽图、LC-MS鉴定正确后分装备用。得到带His标签和Flag标签的PD-L1：PD-L1(ECD)-Flag-His6(SEQ ID NO：3)，用于本发明抗体的性能测试。

3、PD-L1和PD-1的Fc融合蛋白的纯化步骤

将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，浓缩至适当体积后装载于Protein A柱(GE，17-5438-01)上。用PBS冲洗柱子，至A₂₈₀读数降至基线。用100mM醋酸钠pH3.0洗脱目的蛋白。1M TrisHCl中和后的蛋白上PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化。去聚体峰，收集洗脱峰后，分装备用。此方法用来纯化PD-L1(ECD)-Fc(SEQ ID NO：4)和PD-1(ECD)-Fc(SEQ ID NO：5)。PD-L1(ECD)-Fc可用作本发明的免疫抗原或检测试剂，PD-1(ECD)-Fc用于本发明抗体的性能测试。

实施例3、抗人PD-L1杂交瘤单克隆抗体的制备

1、免疫

抗人PD-L1单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用SJL白小鼠，雌性，6周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001)。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠按两种方案(方案A和方案B)免疫，每组6-10只。免疫抗原为带His、PADRE标签的PD-L1：PD-L1(ECD)-PADRE-His6(SEQ ID NO：2)。

方案A用弗氏佐剂(sigma Lot Num：F5881/F5506)乳化：首免用弗氏完全佐剂(CFA)，其余加强免疫用弗氏不完全佐剂(IFA)。抗原与佐剂比例为1:1，100ug/只(首免)，50ug/只(加强免疫)。第0天腹膜内(IP)注射100ug/只的乳化后抗原，首免后每两周一次，共6-8周。

方案B用Titermax(sigma Lot Num：T2684)与Alum(Thremo Lot Num：77161)交叉免疫。抗原与佐剂(titermax)比例为1:1，抗原与佐剂(Alum)比例为3:1，10-20ug/只(首免)，5ug/只(加强免疫)。第0天腹膜内(IP)注射20/10μg/只的乳化后抗原，首免后每周一次，Titermax和Alum交替使用，共6-11周。免疫四周后，根据背部结块和腹部肿胀情况，选择背部或腹膜内注射抗原。

2、细胞融合

选择血清中抗体滴度高(见后面的测试例1，结合PD-L1的ELISA方法)并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合，融合前72小时冲刺免疫所选小鼠，PD-L1-His 10ug/只，腹腔注射。采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(

CRL-8287^TM)进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞用HAT完全培养基(含20％FBS、1×HAT和1×OPI的RPMI-1640培养基)重悬，分装于96孔细胞培养板中(1×10⁵/150ul/孔)，37℃、5％CO₂孵育。融合后的第5天加入HAT完全培养基，50ul/孔，37℃、5％CO₂孵育。融合后第7天～8天，根据细胞生长密度，全换液，培养基为HT完全培养基(含20％FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培养基)，200ul/孔，37℃、5％CO₂孵育。

3、杂交瘤细胞筛选

融合后第10-11天，根据细胞生长密度，进行结合PD-L1的ELISA方法检测(见测试例1)。并将结合ELISA检测的阳性孔细胞进行PD-L1/PD-1结合的阻断ELISA检测(见测试例2)，阳性孔换液，并根据细胞密度及时扩大至24孔板中。移入24孔板的细胞株经过复测后进行保种和第一次亚克隆。第一次亚克隆筛选(见测试例1)为阳性的进行保种，并进行第二次亚克隆。第二次亚克隆为阳性(见测试例1)的进行保种和蛋白表达。多次融合获得有阻断PD-L1和PD-1结合效果(见测试例2)的杂交瘤细胞。

通过阻断实验和结合实验筛选得到杂交瘤克隆9-2和24D5，用腹水法或用无血清细胞培养法进一步制备抗体，按纯化实例纯化抗体，供在检测例中使用。

其中测得杂交瘤克隆9-2的鼠抗可变区序列如下：

>9-2mVH：9-2鼠源重链可变区序列

>9-2mVL：9-2鼠源轻链可变区序列

注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。

其中测得杂交瘤克隆24D5的鼠抗可变区序列如下：

24D5-VH：24D5鼠源重链可变区序列

24D5-VL：24D5鼠源轻链可变区序列

各重链及轻链CDR区序列如下：

其中，SEQ ID NO：38为SEQ ID NO：10的X₁为N时；

SEQ ID NO：39为SEQ ID NO：17的X₄为H，X₅为G时；

SEQ ID NO：40为SEQ ID NO：13的X₂为R，X₃为N时。

实施例4、抗人PD-L1杂交瘤单克隆抗体的人源化

1、杂交瘤克隆9-2人源化构架选择

通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE软件，分别挑选与9-2和24D5同源性高的重轻链可变区种系基因作为模板，将这两个鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。其中氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。

鼠源抗体9-2的人源化轻链模板为IGKV4-1*01和hjk4.1，人源化重链模板为IGHV4-30-4*01和hjh2，人源化可变区序列如下：

>9-2hVH-CDR graft

>9-2hVL CDR graft

2、杂交瘤克隆9-2的模板选择和回复突变设计，见下表1：

表1

注：如P49S表示依照Kabat编号系统，将49位P突变回S。

Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。

表2：鼠抗9-2人源化序列组合

注：该表表示各种突变组合所得的序列。如9_2-2表示，在人源化的鼠抗体9_2-2上的有轻链h9_2_VL1、重链h9_2-VH.1A两种突变。其它类推。

3、杂交瘤克隆24D5人源化构架选择

PD-L1杂交瘤单抗24D5第96位为丝氨酸(Serine)，而胚系基因的该位点在FR3上是保守的半胱氨酸(Cysteine)，与第22位的半胱氨酸形成保守的链内二硫键。我们构建了24D5的嵌合抗体和第96位的丝氨酸回复突变为半胱氨酸的嵌合抗体，两种形式的嵌合抗体的亲和力和杂交瘤抗体一致。抗体人源化采用CDR移植策略进行，24D5的96位突变在骨架上，不会影响设计方案。

鼠源抗体24D5的人源化轻链模板为IGKV7-3*01和hjk2.1，人源化重链模板为IGHV1-46*01和hjh6.1，人源化可变区序列如下：

>24D5人源化重链可变区VH.1

>24D5人源化轻链可变区VL.1

4、杂交瘤克隆24D5的模板选择和回复突变设计，见下表3：

表3

注：如Y91F表示依照Kabat编号系统，将91位Y突变回F。

Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。

表4：鼠抗24D5人源化序列组合

注：该表表示各种突变组合所得的序列。如5表示，在人源化的鼠抗体5上的有重链h24D5_VH.1A、轻链h24D5_VL.1两种突变。其它类推。

实施例5、人源化克隆构建

设计引物PCR搭建各人源化抗体VH/VK基因片段，再与表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)进行同源重组，构建抗体全长表达载体VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。

1、引物设计：利用在线软件DNAWorks(v3.2.2)(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计多条引物合成VH/VK含重组所需基因片段：5’-30bp信号肽+VH/VK+30bp CH1/CL-3’。引物设计原则：目的基因2与目的基因1有2个aa不一样，则另设突变位点所在引物，如图1所示。

2、片段拼接：按照TaKaRa公司Primer STAR GXL DNA聚合酶操作说明书，用上面设计的多条引物，分两步PCR扩增得到VH/VK含重组所需基因片段。

3、表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)构建及酶切

利用一些特殊的限制性内切酶，如BsmBI，识别序列与酶切位点不同的特性设计构建表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)，如图2所示。BsmBI酶切载体，切胶回收备用。

4、重组构建表达载体VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr

VH/VK含重组所需基因片段与BsmBI酶切回收表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)按3:1比例分别加入DH5H感受态细胞中，0℃冰浴30min，42℃热击90s，加入5倍体积LB介质，37℃孵育45min，涂布LB-Amp平板，37℃培养过夜，挑取单克隆送测序得到各目的克隆。

5、根据本实施例的设计方案构建质粒，然后按实施例2表达纯化蛋白，用检测例SPR测定所得蛋白亲和力。

6、结果：

用BIACORE(测试例4)测定9_2-2的亲和力与嵌合抗体相似，更多的回复突变只有细微的亲和力增加。24D5的CDR直接嵌入人源化模板就有很好的亲和力，但嵌合抗体本身的亲和力就弱于杂交瘤抗体。轻链引入N85E突变，以去糖基化，可以提高产品的均一性，不影响亲和力。

最终用BIACORE测试人源化回复突变体与人源PD-L1-his或杂交瘤抗体的亲和力，筛选得到的人源化回复突变位点的选择及序列组合如下表5：

表5

实施例6、抗-PD-L1人源化抗体亲和力成熟

1、构建人源化9-2-2和24D5噬菌粒载体

人源化后的9-2-2和24D5分别以scFv模式(VH-3个GGGGS-VL)构建到噬菌粒载体中，作为野生型序列(即相对于亲和力成熟筛选得到的突变序列，作为原始或起始序列)。利用over-lap PCR拼接VH、(GGGGS)3linker、VL，采用NcoI和NotI酶切位点连接入噬菌粒载体。

2、构建噬菌体展示文库

利用构建好的野生型scFv为模板，采用codon-based引物，在引物合成过程中，突变区域每个密码子都有50％野生型的密码子和50％的NNK(反向引物为MNN))在所有CDR区引入突变构建突变文库。PCR片段经过NcoI和NotI酶切，连接到噬菌粒体载体中，最后电转化大肠杆菌TG1。每条codon-based引物建立一个独立的文库，期中9-2-2分为7个文库，24D5分为8个文库。

3、文库淘筛

文库经过拯救包装出淘筛用的噬菌体颗粒后，利用生物素化的人PD-L1(ECD)抗原和链霉亲和素磁珠进行液相法淘筛，并且每一轮筛选相对于上一轮都降低抗原浓度。三轮淘筛之后，9-2-2和24D5分别挑取250克隆进行噬菌体ELISA检测结合活性，阳性克隆进行测序。

4、表面等离子体共振(SPR)检测亲合力

经过对测序克隆进行比对分析，去除冗余序列之后，将非冗余序列转换成全长IG(γ1,κ)进行哺乳动物细胞表达。亲和纯化之后的全长IG采用BIAcore^TMX-100instrument(GE Life Sciences)进行亲合力测定。

经筛选确认选择的可变区序列：

>9-2hVH(T)

其中，CDR1为SEQ ID NO：10的X₁为T。

>9-2hVL(H)

其中，CDR1为SEQ ID NO：13的X₂为H，X₃为H。

亲和力成熟：

其中，CDR2为SEQ ID NO：17的X₄为G，X₅为F。

注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列；下划线为CDR序列，其中双下划线的位点为亲和力成熟筛选后得到的位点。

实施例7、构建和表达抗-PD-L1人源IgG4类型

由于PD-L1在活化T细胞中也有表达，如果采用野生型IgG1恒定区会引起Fc介导的效应作用，比如ADCC和CDC，从而导致活化T细胞的消减。IgG1的Fc突变比如D265A、N297A、L234A/L235A或L234F/L235A等可以降低ADCC，P331S或附近的突变可降低CDC。IgG2的突变以及IgG2/4的Fc杂交抗体也可以降低ADCC和CDC。本文选择突变IgG4以得到无ADCC和CDC的抗体。因此将亲合力成熟得到的克隆转换成IgG4类型，IgG4的核心铰链区包含S228P突变，可增强核心铰链区内的二硫键连接，从而阻止IgG4Fab臂交换，大大减少了半分子抗体的形成。并进一步引入F234A和L235A突变(mAbs 4:3,310-318；May/June2012)，此种形式的IgG4突变抗体改变CH2结构域，降低与Fc受体的相互作用而达到降低ADCC活性的效果，本发明中通过测试抗体对PD-L1CHO-S细胞的ADCC活性获得。根据本实施例表达纯化的9-2H2L10命名为HRP00049，24D529H1GF命名为HRP00052。

这些蛋白将在测试例中进一步鉴定。

IgG4类型的突变体与人源PD-L1-his或恒河猴PD-L1-his的亲合力测试，见测试例4，表6。

HRP00049：9-2(H2/L10)IgG4(AA)(S228P)

重链：HRP00049抗体重链序列

HRP00049抗体重链序列编码基因序列：

轻链：HRP00049抗体轻链序列

HRP00049抗体轻链序列编码基因序列：

HRP00052：24D5(GF)IgG4(AA)(S228P)

重链：HRP00052抗体重链序列

HRP00052抗体重链序列编码基因序列：

轻链：HRP00052抗体轻链序列

HRP00052抗体轻链序列编码基因序列：

注：划线部分为抗体重链或轻链的可变区序列，或编码其的核苷酸序列；未划线部分为抗体恒定区序列及其相应的编码核苷酸序列。

以下用生化测试方法验证本发明性能及有益效果。

测试例1、结合PD-L1的ELISA

PD-L1(ECD)-Fc(SEQ ID NO：4)1μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜，5％Skim Milk(BD，232100，PBS配制)，150μl/孔，4℃封闭过夜；洗板2次，加入细胞上清，50μl/孔，37℃温育2h；洗板3次，加入Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Human IgG(Jackson，115-035-003)，用KPL Milk(KPL，50-82-01)配制，1:5000稀释，50μl/孔，37℃温育1h。洗板4次，加入TMB，50μl/孔，37℃显色10分钟；加入1M H₂SO₄，50μl/孔，中止显色；酶标仪(BMG Labtech，NOVOStar)OD450nm读数。

测试例2、PD-L1/PD-1结合的阻断ELISA

生物素(东仁化学，LK03:3samples)和亲和素(Sigma，S2438-250UG)的稀释液为6％BSA(用含0.1％Tween20的PBS配制)，PBS为包被液；PD-L1-Fc(SEQ ID NO：4)1μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜；洗板3次。3％BSA(用含0.05％Tween20的PBS配制)120μl/孔，37℃封闭2h；洗板3次。加入细胞上清，50μl/孔。紧接着加入bio-PD-1-Fc(生物素标记的PD1-Fc，SEQ ID NO：5，2μg/ml，按东仁化学Biotin Labeling Kit-NH₂，LK03:3samples，试剂盒方法标记PD-1-FC)，50μl/孔，在振荡器上振荡片刻使之混匀，37℃温育1h；洗板6次。加入Streptavidin-Peroxidase Polymer(S2438-250UG，Sigma，1:400稀释)，50μl/孔，室温振荡温育50min；洗板6次。加入100μl/孔TMB，37℃显色5-10min；加入1M H₂SO₄，100μl/孔，中止显色；酶标仪(BMG Labtech，NOVOStar)450nm读数，计算PD-1抗体对配体PD-L1结合阻断的IC₅₀值。本发明人源化抗体对PD-L1/PD-1结合的阻断活性见下表6。

在筛选杂交瘤抗体的时候也使用了类似的单点阻断实验。

测试例3、PD-L1抗体对PD-L1和B7.1结合的阻断

本实验与以上PD-L1抗体对PD-L1和PD-1结合的阻断实验(测试例2)相似。将测试例2中的bio-human PD-1(ECD)-FC替换为bio-human-B7.1(human-B7.1，Sino Biological 10698-H03H-200)，其它步骤相同。另外，本发明用类似的方法也检测了PD-L1抗体对PD-L2-Fc(Q9BQ51，胞外域(aa20-aa220))和PD-1结合阻断的特异性，发现受测抗体不能阻断PD-L2和PD-1的结合。

在筛选杂交瘤抗体的时候也使用了类似的单点阻断实验。

本发明人源化抗体对PD-L1和B7.1结合的阻断，和对PD-L2和PD-1的结合阻断活性见下表6。

表6本发明人源化抗体的阻断活性

注：NA表示没有阻断活性。

测试例4、Biacore测定PD-L1抗体HRP00049和HRP00052对PD-L1抗原的亲和力

按照人抗捕获试剂盒(GE，BR-1008-39)说明书中所述的方法，将人抗捕获抗体共价偶联于CM5生物芯片(GE，BR-1000-12)上，从而亲和捕获本发明的PD-L1抗体。然后于芯片表面流经一系列浓度的人PD-L1抗原(Sino biological， 10084-H08H-200)，利用Biacore仪器(GE，BiacoreX100)实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线，通过拟合得到亲和力数值。在实验中每个循环解离完成后，用人抗捕获试剂盒(GE)里配置的再生溶液将生物芯片洗净再生。使用GEBIAevaluation软件以1:1(Langmuir)结合模型分析所得数据，以此法测定ka(kon)、kd(koff)和KD值。杂交瘤抗体和人源化抗体的亲和力已总结在其它实例中。下表7是亲和力成熟后抗体以及对照抗体对人PD-L1抗原(huPD-L1-his，Sino biological，10084-H08H-200)、食蟹猴PD-L1抗原(Cyno PD-L1-his，Sino biological，90251-C08H-100)和鼠PD-L1抗原(Mouse PD-L1-his，Sino biological，50010-M08H-100)的亲和力：

表7 HRP00049和HRP00052解离常数及种系选择性

测试例5、体外细胞学实验

新鲜人外周血单个核细胞(PBMC)在抗体作用下的增殖试验，用来对PD-L1抗体进行细胞活性的检测。

新鲜人PBMC(健康人随机采取)调整细胞密度为2×10⁶/ml，每孔2ml接种于6孔板，37℃、5％CO₂培养箱中放置6小时，将悬浮细胞吸走，向贴壁细胞中加入2ml含有100ng/ml GM-CSF(粒细胞集落刺激生物因子，Peprotech，AF-300-03)和100ng/ml IL-4(Peprotech，AF-200-04)的RPMI1640培养基(Hyclone，SH30809.01B)，培养2天后每孔再加入1ml含有100ng/ml GM-CSF和100ng/ml IL-4的RPMI1640培养基，继续培养2天后，每孔加入100ng/ml TNF-α(肿瘤坏死因子-α，Peprotech，AF-300-01A)，继续培养2天得到成熟树突细胞。将上述树突细胞及同种异体的T细胞分别离心重悬成浓度为1×10⁶/ml和1×10⁵/ml，于96孔板中每孔各加入100μl，抗体用PBS按一定倍数稀释成不同浓度梯度96孔板中每孔加入20μl，37℃、5％CO₂培养箱中培养5天，取100μl用

Luminescent Cell Viability Assay试剂盒(Promega，G7571)检测细胞增殖；同时，检测其细胞因子IFN-γ(干扰素-γ)的分泌。

HRP00052以及HRP00049都能有效地刺激细胞因子IFN-γ的分泌。同样的方法也用于检测人源化抗体对PBMC的增殖的刺激(图3)和对细胞因子IFN-γ的分泌的刺激(表8)。从图3和表8可发现本发明的人源化抗体相对于阳性对照MPDL3280A(Atezolizumab，WHO Drug Information,Vol.28,No.4,2014，P488)，对PBMC的增殖的刺激更强，对细胞因子IFN-γ的分泌的刺激更有效。

表8 HRP00052和HRP00049刺激PBMC释放细胞因子IFN-因

待测抗体	干扰素-γ释放EC50(ng/ml)
MPDL3280A	72.1
HRP00052	18.7
HRP00049	34

测试例6、对结核菌素刺激的PBMC增殖活性

对受测抗体HRP00052、HRP00049以及参照抗体在体外对结核菌素刺激的PBMC的增殖活性进行检测。

取15ml新鲜PBMC细胞，约3×10⁷个，加入20μl结核菌素(上海碧优生物科技，cat#97-8800)，37℃、5％CO₂培养箱培养5天。第6天，取上述培养的细胞离心，重悬至新鲜的培养基中，调整密度为5×10⁵个/ml。在96孔细胞培养板中加入190μl重悬后的细胞，将人源化抗体HRP00052、HRP00049加入上述96孔细胞培养板的对应孔中，每孔10μl，对照组和空白组分别加入10μl PBS。细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱孵育72小时后检测PBMC细胞增殖(Promega，cat#G7571)和IFN-γ的分泌(Neo Bioscience，cat#EHC102g)。结果如下表9。

表9本发明人源化抗体对结核菌素刺激的PBMC增殖活性

待检抗体	T细胞增殖EC50(ng/ml)	IFN-γEC50(ng/ml)
HRP00052	9.8	19.6
HRP00049	112	45.5
MPDL3280A	1464	353

结论：本实验证明了本发明的人源化抗体对经外源抗原刺激后的PBMC增殖具有更强的刺激作用，该特性在适用于肿瘤治疗时，有意料不到的效果。

测试例7、PD-L1抗体HRP00052抑制U87MG荷瘤小鼠肿瘤生长作用

本实验采用免疫缺陷小鼠接种人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞，成瘤后将用抗CD3抗体激活的人PBMC注射到肿瘤组织中，评价比较PD-L1抗体对脑胶质瘤U87MG小鼠皮下移植瘤的疗效。

从两名志愿者提供的血液中分离提取PBMC，使用抗CD3抗体(Miltenyi Biotec，130-093-387)培养激活PBMC。将U87MG细胞接种于免疫缺陷小鼠(维通利华，11400700081219)右肋部皮下，待肿瘤生长满2周，瘤体积≥40mm³后去除体重、肿瘤过大和过小的，按肿瘤体积将小鼠随机分组。将经CD3抗体刺激后的两名志愿者的PBMC以1:1比例混合注射到肿瘤组织中。同时开始皮下注射抗体和空白载体(5％葡萄糖溶液)，第0、7、14和21天，各给药一次共4次。

实验结果见表10，显示PD-L1抗体HRP00052的3mg/kg剂量能显著抑制人恶性脑胶质瘤U87MG小鼠皮下移植瘤的生长。

表10 PD-L1抗体对脑胶质瘤U87MG小鼠皮下移植瘤的疗效

*:P<0.05,vs空白载体

Claims

一种PD-L1抗体或其抗原结合片段，其包含任意1个选自以下的CDR区序列或其突变序列：

抗体重链可变区HCDR区序列：SEQ ID NO：10-12，SEQ ID NO：16-18；和抗体轻链可变区LCDR区序列：SEQ ID NO：13-15，SEQ ID NO：19-21；

具体如下：

其中X₁选自N或T，X₂选自R或H，X₃选自N或H，X₄选自H或G，X₅选自G或F。
根据权利要求1所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的抗体重链可变区HCDR序列或其突变序列。
根据权利要求1所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21的抗体轻链可变区LCDR序列或其突变序列。
根据权利要求1～3任一项所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ链或鼠源κ链变体的轻链FR区、或者鼠源λ链或鼠源λ链变体的轻链FR区；其中抗体重链可变区进一步包含鼠源IgG1或其变体的重链FR区、或IgG2或其变体的重链FR区、或IgG3或其变体的重链FR区。
根据权利要求4所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述的包含鼠源FR区的抗体重链可变区选自SEQ ID NO：6、8或其突变序列，所述的包含鼠源FR区的抗体轻链可变区选自SEQ ID NO：7、9或其突变序列。
根据权利要求4所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中抗体重链进一步包含鼠源κ链或其变体的轻链恒定区、或者鼠源λ链或其变体的轻链恒定区；其中抗体轻链进一步包含鼠源IgG1或其变体的重链恒定区、或IgG2或其变体的重链恒定区、或IgG3或其变体的重链恒定区。
根据权利要求1-5任一项所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体。
根据权利要求1-3任一项所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其片段。
根据权利要求8所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体为人源化抗体9-2或人源化抗体24D5，所述人源化抗体重链可变区上的重链FR区序列来源于人种系重链，其中：

人源化抗体9-2重链可变区上的重链FR区序列来源于人种系重链IGHV4-30-4*01和hjh2的组合序列；其包含人种系重链IGHV4-30-4*01的FR1、FR2、FR3区和hjh2的FR4区；或

人源化抗体24D5重链可变区上的重链FR区序列来源于人种系重链IGHV1-46*01和hjh6.1的组合序列；其包含人种系重链IGHV1-46*01的FR1、FR2、FR3区和hjh6.1的FR4区。
根据权利要求9所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体9-2的重链FR区序列有0-10个氨基酸的回复突变，优选为一个或多个选自W47Y、V71R、G27Y、I48M、V67L、F78Y、S30T、和Q39K的氨基酸回复突变，更优选为选自W47Y和V71R的氨基酸回复突变；其中所述人源化抗体24D5的重链FR区序列有0-10个氨基酸的回复突变，优选为一个或多个选自T74K、R72V、M48I、M70L、R38Q、L83F、V68A、和V79A的氨基酸回复突变。
根据权利要求9所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体的重链可变区序列如下：

人源化抗体9-2重链可变区序列为SEQ ID NO：22所示的序列或其变体；或人源化抗体24D5重链可变区序列为SEQ ID NO：24所示的序列或其变体。
根据权利要求8所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体为人源化抗体9-2或人源化抗体24D5，所述人源化抗体轻链可变区上的轻链FR区序列来源于人种系轻链，其中：

人源化抗体9-2轻链可变区上的轻链FR区序列来源于人种系轻链IGKV4-1*01和hjk4.1的组合序列；其包含人种系轻链IGKV4-1*01的FR1、FR2、FR3区和hjk4.1的FR4区；

人源化抗体24D5轻链可变区上的轻链FR区序列来源于人种系轻链IGKV7-3*01和hjk2.1的组合序列；其包含人种系轻链IGKV7-3*01的FR1、FR2、FR3区和hjk2.1的FR4区。
根据权利要求12所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体9-2的轻链FR区序列有0-10个氨基酸的回复突变，优选为P49S的氨基酸回复突变；其中所述人源化抗体24D5的轻链FR区序列有0-10个氨基酸的回复突变，优选为一个或多个选自Y91F、T22S、和G72E的氨基酸回复突变，或者引入N85E去糖基化突变。
根据权利要求12所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体的轻链可变区序列如下：

人源化抗体9-2轻链可变区序列为SEQ ID NO:23所示的序列或其变体；或人源化抗体24D5轻链可变区序列为SEQ ID NO:25所示的序列或其变体。
根据权利要求8-14任一项所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体或其抗原结合片段进行亲和力成熟设计。
根据权利要求15所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中X₁为T，X₂为H，X₃为H，X₄为G，X₅为F。
根据权利要求15或16所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体为人源化抗体9-2或人源化抗体24D5，其中所述的人源化抗体可变区序列如下：

人源化抗体9-2：重链可变区序列为SEQ ID NO：26；轻链可变区序列为SEQ ID NO：27；

人源化抗体24D5：重链可变区序列为SEQ ID NO：28，轻链可变区序列为SEQ ID NO：29。
根据权利要求17所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，更优选包含引入F234A和L235A突变的IgG4重链恒定区；所述人源化抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的恒定区。
根据权利要求17所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体9-2包含重链抗体序列SEQ ID NO:30，和轻链抗体序列SEQ ID NO:32；其中所述人源化抗体24D5包含重链抗体序列SEQ ID NO:34，和轻链抗体序列SEQ ID NO:36。
一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至19任一项所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
一种编码根据权利要求1-19任一项所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段的DNA分子。
一种含有根据权利要求21所述的DNA分子的表达载体。
一种用根据权利要求22所述的表达载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自细菌、酵母菌和哺乳动物细胞；优选哺乳动物细胞。
根据权利要求1至19任一项所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段或根据权利要求20所述的药物组合物，在制备用于治疗PD-L1介导的疾病或病症的药物中的用途，其中所述的疾病或病症优选为癌症；更优选为表达PD-L1的癌症；最优选为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌；进一步优选为非小细胞肺癌、黑素瘤、膀胱癌和肾癌。
一种治疗和预防PD-L1介导的疾病或病症的方法，包括给予所需患者治疗有效量的根据权利要求1至19任一项所述的PD-L1抗体或其抗原结合片段或根据权利要求20所述的药物组合物；其中所述的疾病优选为癌症；更优选为表达PD-L1的癌症；所述的癌症最优选为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌；最优选为非小细胞肺癌、黑素瘤、膀胱癌和肾癌。