WO2017082295A1 - 軟骨組織塊及びその製造方法、並びに幹細胞から軟骨組織塊を誘導するための培地 - Google Patents

軟骨組織塊及びその製造方法、並びに幹細胞から軟骨組織塊を誘導するための培地 Download PDF

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WO2017082295A1
WO2017082295A1 PCT/JP2016/083233 JP2016083233W WO2017082295A1 WO 2017082295 A1 WO2017082295 A1 WO 2017082295A1 JP 2016083233 W JP2016083233 W JP 2016083233W WO 2017082295 A1 WO2017082295 A1 WO 2017082295A1
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WO
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tissue mass
stem cells
cartilage tissue
seq
medium
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French (fr)
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義基 中島
健史 大政
正義 塚原
誠 柿谷
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Kyowa Kirin Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a cartilage tissue mass, a method for producing the same, and a medium for inducing a cartilage tissue mass from stem cells. More specifically, the present invention relates to a cartilage tissue mass formed from chondrocytes differentiated from stem cells in a medium containing Frizzled8 (FZD8) protein or a fragment thereof.
  • FZD8 Frizzled8
  • Non-patent Document 1 a method for treating traumatic cartilage deficiency in the knee joint or transected osteochondritis using autologous cultured cartilage has been developed (Non-patent Document 1).
  • this treatment method in order to prepare autologous cultured cartilage used for treatment, it is necessary to collect cartilage tissue from a site where no load is applied before surgery.
  • the number of chondrocyte divisions is also limited. For this reason, it has been difficult to prepare a large amount of a good quality cartilage tissue mass.
  • Non-Patent Document 2 discloses a cartilage tissue mass from mesenchymal stem cells and use it for treatment.
  • Mesenchymal stem cells are obtained from various tissues such as umbilical cord blood, umbilical cord, placenta, bone marrow, synovium, dental pulp, adipose tissue, and are easier to obtain than cartilage tissue.
  • mesenchymal stem cells have a higher ability to divide and proliferate than chondrocytes.
  • the cartilage tissue mass obtained by differentiation from mesenchymal stem cells is confirmed to be qualitatively inferior to the original cartilage tissue, necrosis, ossification, and cell depletion and nodules have been confirmed. Application to is not made (Non-Patent Document 2).
  • Frizzled members of the Frizzled (FZD) gene family encode a seven-transmembrane domain protein that is a receptor for Wnt signaling proteins.
  • FZD1 to 10 are known as the human FZD gene family.
  • the extracellular cysteine-rich domain (CRD) of the Frizzled protein contains a Wnt binding determinant, and the FZD solubilized receptor binds to the Frizzled protein competitively with Wnt protein and inhibits Wnt signaling. It has been reported (Non-Patent Documents 3 and 4). So far, it has not been reported to add FZD8 protein or a fragment thereof to the culture medium of animal cells or to culture stem cells in the presence of FZD8 protein or a fragment thereof.
  • the main object of the present invention is to provide a useful technique for easily preparing a high-quality cartilage tissue mass required for the treatment of joint diseases.
  • the present invention provides the following [1] to [20].
  • [1] A cartilage tissue mass formed from chondrocytes differentiated from stem cells in a medium containing Frizzled8 (FZD8) protein or a fragment thereof.
  • [2] A cartilage tissue mass comprising FZD8 protein or a fragment thereof and chondrocytes.
  • [3] The cartilage tissue mass according to [1] or [2], wherein the fragment is a polypeptide of the following (A) or (B).
  • (A) A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the cartilage tissue mass according to any one of [1] to [6], wherein the medium is a serum-free medium.
  • a method for producing a cartilage tissue mass comprising a step of inducing differentiation of a chondrocyte from a stem cell in a medium containing FZD8 protein or a fragment thereof.
  • the production method of [8], wherein the fragment is a polypeptide of the following (A) or (B).
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • a “cartilage tissue mass” refers to a structure in which a three-dimensional cartilage tissue is formed by cell accumulation of chondrocytes cultured in a sheet shape.
  • “Activity to promote formation of cartilage tissue mass from stem cells (cartilage tissue mass formation promoting activity)” means activity to induce accumulation of chondrocytes differentiated from stem cells and formation of three-dimensional cartilage tissue mass To do.
  • the “activity for promoting the formation of a cartilage tissue mass from stem cells” includes the formation of a cartilage tissue mass from a stem cell in culture in the presence of the substance, in the absence of the substance. It also means that it is promoted compared to the formation of cartilage tissue mass in culture.
  • the size or number of cartilage tissue mass obtained after culturing for a certain period in the presence of the substance is compared with the size or number of cartilage tissue mass obtained after synchronous culture in the absence of the substance.
  • the present invention provides a useful technique for easily preparing a high-quality cartilage tissue mass required for the treatment of joint diseases.
  • Example 1 which is a figure which shows the cartilage tissue mass formed by differentiation induction from a mesenchymal stem cell in presence of FZD8 polypeptide.
  • the medium according to the present invention is used for differentiating and inducing chondrocytes from stem cells to form a cartilage tissue mass, and includes FZD8 protein or a fragment thereof.
  • the composition of the medium according to the present invention may be the same as that conventionally used for inducing chondrocytes from stem cells, except that it contains FZD8 or a fragment thereof. That is, the medium according to the present invention can be prepared by adding FZD8 or a fragment thereof to a conventional chondrocyte induction medium.
  • FZD8 and fragments thereof are not limited to the species as long as they have an activity to promote the formation of cartilage tissue mass from stem cells (cartilage tissue mass formation promoting activity).
  • stem cells cartilage tissue mass formation promoting activity
  • humans such as rat, mouse, hamster or guinea pig They may be rodents, rabbits such as rabbits, ungulates such as pigs, cows, goats or sheep, cats such as dogs or cats, primates such as monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans or chimpanzees.
  • the amino acid sequence of human FZD8 is shown in SEQ ID NO: 1 (GenBank Accession No. AB043703).
  • the origin species of FZD8 and its fragments can be appropriately selected according to the origin species of the stem cells to be cultured, and preferably the same origin species as the stem cells to be cultured. For example, when culturing human-derived cells, it is preferable to use human-derived FZD8 or the like.
  • an arbitrary length polypeptide having a partial amino acid sequence of the full-length amino acid sequence of FZD8 It may be.
  • a polypeptide (148 amino acid residues) consisting of the 25th to 172nd amino acid sequence of the amino acid sequence of human FZD8 (SEQ ID NO: 1) can be mentioned.
  • the length of the polypeptide is, for example, 120 to 240, more preferably 120 to 150, in terms of the number of amino acid residues.
  • FZD8 and fragments thereof are modified proteins composed of amino acid sequences in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of wild-type FZD8 or the like as long as it has cartilage tissue mass formation promoting activity. There may be.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added can be deleted, substituted, inserted or added by a known mutant polypeptide production method such as site-directed mutagenesis. Means an amino acid sequence in which a certain number of amino acids are deleted, substituted, inserted or added (preferably 10 or less, more preferably 7 or less, even more preferably 5 or less, most preferably 1 or 2) .
  • amino acids in an amino acid sequence of a protein can be easily modified without significantly affecting the structure or function of the protein.
  • polymorphisms polymorphism
  • proteins that do not significantly change the structure or function of the protein. Therefore, in addition to the modified sequence obtained by artificially introducing mutations by a known mutant polypeptide production method, the “amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added” Naturally occurring polymorphic sequences are also included.
  • FZD8 fragment include the following polypeptides (A) or (B).
  • B Including the amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and has an activity of promoting differentiation and formation of cartilage tissue mass from stem cells
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is located in the extracellular domain of human FZD8, and is a polypeptide consisting of the 25th to 172nd amino acid sequences of the amino acid sequence of human FZD8 (SEQ ID NO: 1) ( 148 amino acid residues).
  • FZD8 fragments include the amino acid sequence of human FZD8 (SEQ ID NO: 1) located in the extracellular domain of human FZD8, amino acids 30 to 151 (122 amino acid residues), and the like. It is done.
  • FZD8 and fragments thereof may be recombinant proteins or fusion proteins in addition to proteins isolated and purified from nature, as long as they have cartilage tissue mass formation promoting activity, and have been chemically modified. May be. Isolation of natural proteins, expression of recombinant proteins, protein synthesis, or purification of these proteins can be performed by a conventionally known technique.
  • Examples of the fusion protein include a protein in which FcD and His tag are fused to the C-terminal side of FZD8 and a fragment thereof.
  • Examples of preferred recombinant proteins include the amino acid sequence of the Fc protein at the C-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (Human IgG 1, Pro100- Lys330) fused recombinant protein (see Example 1) It is done.
  • polypeptide shall be used interchangeably with “peptide” or “protein”.
  • FZD8 and fragments thereof are also simply referred to as “FZD8 polypeptide”.
  • chondrocyte induction medium examples include a medium having a composition of 90% ⁇ MEM medium, 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine, and 0.1 ⁇ M dexamethasone.
  • FBS fetal bovine serum
  • dexamethasone examples include a commercially available kit (Human Messenical Stem Cell Chronogenetic Differentiation) In the case of using Medium Bullet Kit, Takara), the content component (dexamethasoneb, ascorbate, ITS + supplement, GA-1000, sodium pyruvate, proline, L-glutamine, TGF-b3) is added as a differentiation agent.
  • a culture medium can be used.
  • the composition of the medium for culturing stem cells according to the present invention may be the same as the medium conventionally used for culturing stem cells, except that it contains the above FZD8 polypeptide. That is, the medium according to the present invention can be prepared by adding the FZD8 polypeptide to a basal medium conventionally used for culturing cells derived from animal tissues. Specific examples of the basal medium include the following.
  • Hybridoma Serum free medium Chemically Defined Hybrids' medium Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham's Medium F12K, ATCC-CRCM30, DM-160, DM-201, BME, Fischer, McCoy's 5A, Leibovitz's L-15, RITC80-7 MCDB105, MCDB107, MCDB131, MCDB153, MCDB201, NCTC109, NCTC135, Waymout 's MB752 / 1, CMRL-1066, William's medium E, Brinster's BMOC-3 Medium, Essential8 Medium (above Thermo Fisher Scientific), mTeSR1 (Stem Cell Technologies), TeSR-E8 Medium ), StemSure (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the medium according to the present invention can also be prepared by previously adding a differentiation inducing agent such as a BMP inhibitor, Wnt inhibitor, Nodal inhibitor or retinoic acid and FZD8 polypeptide to these basal media, or adding them during cell culture. .
  • a differentiation inducing agent such as a BMP inhibitor, Wnt inhibitor, Nodal inhibitor or retinoic acid and FZD8 polypeptide
  • the addition concentration of the FZD8 polypeptide in the medium according to the present invention is not particularly limited as long as it exhibits cartilage tissue mass formation promoting activity.
  • the culture medium according to the present invention may contain physiologically active substances and nutrient factors necessary for cell survival or growth as necessary. These additives may be added in advance to the medium, or may be added during cell culture.
  • the method to be added during the culture may be in any form such as one solution or a mixed solution of two or more kinds, and may be continuous or intermittent addition.
  • Nutritional factors include sugars, amino acids, vitamins, hydrolysates or lipids.
  • examples of the sugar include neutral sugars such as glucose, mannose, and fructose, acidic sugars such as sialic acid, amino sugars, sugar alcohols, and the like, and one kind or a combination of two or more kinds is used.
  • vitamins examples include d-biotin, D-pantothenic acid, choline, folic acid, myo-inositol, niacinamide, pyrodoxal, riboflavin, thiamine, cyanocobalamin or DL- ⁇ -tocopherol, and one or a combination of two or more Used.
  • the hydrolyzate examples include hydrolyzed soybeans, wheat, rice, peas, corn, cotton seeds or yeast extracts.
  • lipids include cholesterol, linoleic acid, and linolenic acid.
  • an antibiotic such as kanamycin, streptomycin, penicillin or hygromycin may be added to the medium as necessary.
  • an acidic substance such as sialic acid is added to the medium, it is desirable to adjust the pH of the medium to pH 5 to 9, preferably 6 to 8, which is a neutral range suitable for cell growth.
  • the medium according to the present invention may be a serum-containing medium or a serum-free medium. From the viewpoint of preventing contamination with heterogeneous animal-derived components, it is preferable not to contain serum or to use serum derived from the same species as the cultured stem cells.
  • Serum-free medium means medium that does not contain unconditioned or unpurified serum.
  • the serum-free medium may contain animal tissue-derived components such as purified blood-derived components and growth factors.
  • the medium according to the present invention may or may not contain a serum substitute, like serum.
  • Serum substitutes include, for example, albumin substitutes such as albumin, lipid-rich albumin and recombinant albumin, plant starch, dextran, protein hydrolysates, transferrin or other iron transporters, fatty acids, insulin, collagen precursors, trace amounts Examples thereof include elements, 2-mercaptoethanol, 3′-thioglycerol, and equivalents thereof.
  • serum substitutes include, for example, those prepared by the method described in International Publication No. 98/30679, commercially available knockout Serum Replacement (KSR), Chemically-defined Lipid concentrated (Life Technologies max) and Gluten. (Life Technologies).
  • KSR knockout Serum Replacement
  • Chemically-defined Lipid concentrated Life Technologies max
  • Gluten (Life Technologies).
  • the “stem cell” targeted by the present invention refers to an immature cell having self-replication ability and differentiation / proliferation ability, and depending on the differentiation ability, a pluripotent stem cell, a multipotent stem cell (multipotent stem cell). cell) or a unipotent stem cell.
  • a “stem cell” is generally defined as an undifferentiated cell having “self-renewal ability” capable of proliferating while maintaining an undifferentiated state and “differentiation pluripotency” capable of differentiating into all three germ layers.
  • a pluripotent stem cell means a cell having an ability to differentiate into all tissues and cells constituting a living body.
  • a multipotent stem cell means a cell having the ability to differentiate into multiple types of tissues and cells, although not all types.
  • a unipotent stem cell means a cell having the ability to differentiate into a specific tissue or cell.
  • the stem cell origin species is also not particularly limited, for example, rodents such as rats, mice, hamsters or guinea pigs, rabbit eyes such as rabbits, ungulates such as pigs, cows, goats or sheep, dogs, pigs or cats, etc. It may be a cell of a primate such as a cat, human, monkey, rhesus monkey, marmoset, orangutan or chimpanzee. In addition, the stem cells used in the present invention may be either autologous or other.
  • stem cells mesenchymal stem cells, embryonic stem cells that are known to proceed from the spheroid state to the differentiation / induction steps into various tissues through the formation of pseudo embryos called embryoid bodies (EB bodies) (Embryonic stem cells: ES cells), inducible pluripotent stem cells (induced pluripotent cells: iPS cells), embryonic reproductive (EG) cells derived from primordial germ cells, and GS cells from testicular tissues.
  • ES cells embryoid bodies
  • iPS cells inducible pluripotent stem cells
  • EG embryonic reproductive
  • Examples include multipotent germline stem (mGS) cells that are released or multipotent stem cells such as multipotent progenitor cells (MPC) that are isolated from bone marrow, but cells that retain the ability to differentiate into functional osteoblasts or chondrocytes If it is, it will not specifically limit.
  • MPC multipotent progenitor cells
  • pluripotent stem cells examples include the aforementioned ES cells or iPS cells.
  • Stem cells established by culturing early embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei are also preferred as pluripotent stem cells (Nature, 1997, 385, p. 810, Science, 1998, 280, p. 1256, Nature Biotechnology, 1999, 17, p.456, Nature, 1998, 394, p.369, Nature Genetics, 1999, 22, p.127, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, p. 14984, Nature Genetics, 2000, 24, p. 109).
  • Human ES cell lines are obtained from, for example, WA01 (H1) and WA09 (H9) from the WiCell Research Institute, and KhES-1, KhES-2 and KhES-3 from the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University (Kyoto, Japan). Is possible.
  • iPS cells include cells that have acquired multipotency similar to ES cells obtained by introducing a plurality of genes (reprogramming factors) into somatic cells such as skin cells.
  • iPS cells obtained by introducing Oct3 / 4 gene, Klf4 gene, C-Myc gene and Sox2 gene iPS cells obtained by introducing Oct3 / 4 gene, Klf4 gene and Sox2 gene (Nature Biotechnology, 2008) 26, p.101-106).
  • genes included in the reprogramming factor include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, Eras, and ECAT15.
  • -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, Glis1, etc. are exemplified, and these initialization factors may be used alone or in combination.
  • Combinations of reprogramming factors include WO2007 / 069666, WO2008 / 118820, WO2009 / 007852, WO2009 / 032194, WO2009 / 058413, WO2009 / 057831, WO2009 / 0775119, WO2009 / 079007, WO2009 / 091659, WO2009 / 101084, WO2009 / 101407, WO2009 / 102983, WO2009 / 114949, WO2009 / 117439, WO2009 / 126250, WO2009 / 126251, WO2009 / 126655, WO2009 / 157593, WO2010 / 009015, WO2010 / 033906, WO2010 / 033920, WO2010 / 042800, WO2010 / 045 626, WO2010 / 056831, WO2010 / 068955, WO2010 / 098419, WO2010 / 10
  • iPS cells can be obtained from predetermined institutions (RIKEN BioResource Center, Kyoto University, etc.).
  • human iPS cells 253G1 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0002), 201B7 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0063), 409B2 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0076), 454E2 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0077), HiPS -RIKEN-1A strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0003), HiPS-RIKEN-2A strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0009), HiPS-RIKEN-12A strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0029) or Nips-B2 strain (RIKEN Cell Bank No. HPS0223).
  • multipotent stem cells examples include somatic stem cells such as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, bone marrow stem cells, and reproductive stem cells.
  • the multipotent stem cell is preferably a mesenchymal stem cell, more preferably a bone marrow mesenchymal stem cell.
  • the mesenchymal stem cell broadly means a group of stem cells or progenitor cells that can differentiate into all or some mesenchymal cells such as osteoblasts, chondroblasts, and lipoblasts.
  • mesenchymal stem cells include human mesenchymal stem cells (PT034, Takara), human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC-BM, Takara), human umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells (hMSC-UC, Takara) and human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (hMSC-AT, Takara).
  • the method for producing a cartilage tissue mass according to the present invention includes a step of inducing differentiation of chondrocytes from stem cells in a medium containing FZD8 polypeptide.
  • the method for producing a cartilage tissue mass according to the present invention may include a culture step of culturing and proliferating stem cells as the preceding step.
  • the stem cell culturing step according to the present invention may be carried out by conventionally known batch culture (Bac Culture), fed-batch culture, continuous culture (Continuation Culture), perfusion culture (Perfusion Culture), or the like.
  • the incubator is not particularly limited, and examples thereof include flasks, dishes, petri dishes, microwell plates, microslides, chamber slides, tubes, trays, culture vessels such as culture bags or tanks.
  • the substrate of these incubators is not particularly limited, and examples thereof include glass, various plastics such as polypropylene or polystyrene, metals such as stainless steel, and combinations thereof.
  • collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, and the like are used on the substrate surface in order to induce adhesion of anchorage-dependent cells to the substrate surface of the incubator.
  • Adhesive cultures coating scaffolds such as laminin, partial structures of laminin, fibronectin and mixtures thereof (eg, Matrigel) and lysed cell membrane preparations (Lancet, 2005, 365, p. 1636-1641), polymers such as methylcellulose Examples include suspension culture using a polymer (Stem Cell Reports, 2014, 2, 5, p. 734-745), MFG-E8 (Milk fat globule-EGF factor 8) or the above-mentioned scaffolds using the protein fragment.
  • the stem cells to be cultured can be dispersed cells or non-dispersed cells.
  • Dispersed cells refer to cells that have been treated to promote cell dispersion. Examples of the dispersed cells include cells forming a small cell mass composed of 2 to 50 cells, 2 to 20 cells, or 2 to 10 cells.
  • the dispersed cells can be floating (suspension) cells or adherent cells.
  • the culture density of the stem cells in the culturing process is not particularly limited as long as the density can achieve the effect of promoting cell survival and proliferation.
  • the culture density is, for example, 1.0 ⁇ 10 1 to 1.0 ⁇ 10 7 cells / ml, preferably 1.0 ⁇ 10 2 to 1.0 ⁇ 10 7 cells / ml, more preferably 1.0 ⁇ 10 3. ⁇ 1.0 ⁇ 10 7 cells / ml, more preferably 3.0 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 7 cells / ml.
  • Temperature, dissolved CO 2 concentration, culture conditions, such as dissolved oxygen concentration and pH can be appropriately set on the basis of the techniques conventionally used for the cultivation of cells derived from animal tissue.
  • the culture temperature is not particularly limited, but may be 30 to 39 ° C., preferably 37 ° C.
  • the dissolved CO 2 concentration can be 1-10%, preferably 2-5%.
  • the oxygen partial pressure can be between 1 and 22%.
  • the cells may be cultured in the presence of feeder cells.
  • feeder cells stromal cells such as fetal fibroblasts can be used (for example, Manipulating the Mouse Embryo A, Laboratory Manual, Secondary IR, Cold Spring Harbor, Pt. Oxford University Press, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78, 12, p.7634-7638, Nature, 1981, 292, 5819, p.154-156, J. Virol., 1969, 4 , 5, p. 49-553, Science, 1996, 272, 5262, p. 722-724, J. Cell. Physiol., 1982, 112, 1, p. 89-95, International Publication No. 01/088100, 2005/080554. Issue).
  • suspension culture suspension culture on a carrier (J. Biotechnology, 2007, 132, 2, p. 227-236) or suspension culture using a polymer such as methylcellulose (Stem Cell Reports) , 2014, 2, 5, p. 734-745).
  • Stem cell suspension culture refers to culturing stem cells in a medium under non-adherent conditions as compared with the case of using an incubator or feeder cells.
  • Stem cell suspension culture includes stem cell dispersion culture and stem cell aggregation suspension culture.
  • Stem cell dispersion culture refers to culturing suspended stem cells, and includes, for example, dispersion culture of small cell clusters composed of 2 to 20 stem cells. When the dispersion culture is continued, the cultured dispersion cells form a larger stem cell mass, and then aggregated suspension culture can be performed.
  • Aggregation suspension culture includes embryoid body culture method (see Curr. Opin. Cell Biol., 1995, 7, 6, p. 862-869), SFEB method (Nature Neuroscience, 2005, 8, 3, p. 288-). 296, International Publication No. 2005/123902), and a sphere culture method (Stem Cell Reports, 2014, 2, 5, p. 734-745) in which cell lines are passaged by mechanical treatment using a mesh
  • the step of inducing differentiation of a chondrocyte from a stem cell can be performed by culturing the stem cell in a medium containing the above-described FZD8 polypeptide according to the present invention.
  • a cartilage tissue mass according to the present invention a high-quality cartilage tissue mass is produced in plate culture with a simple petri dish or the like by adding FZD8 polypeptide to a differentiation induction medium from stem cells to chondrocytes and culturing. It is possible.
  • the quality of the cartilage tissue mass means that chondrocytes that are uniformly densely observed are observed inside the cartilage tissue mass, and that cell necrosis, ossification, cell-sparse sites and nodules are not confirmed.
  • cartilage is formed, and hyaline cartilage is contained inside the tissue.
  • Non-Patent Document 2 So far, it has not been reported that a good quality cartilage tissue mass can be prepared by plate culture.
  • the cartilage tissue mass formation promoting action of the FZD8 polypeptide can form a good quality cartilage tissue mass even in plate culture.
  • a scaffold is not required, and a high-quality cartilage tissue mass can be easily produced.
  • the incubator used for the plate culture is not particularly limited, and may include a flask, a dish, a petri dish, a microwell plate, a microslide, a chamber slide, or a tray.
  • the substrate of these incubators is not particularly limited, and examples thereof include glass, various plastics such as polypropylene and polystyrene, metals such as stainless steel, or combinations thereof.
  • the seeding density of stem cells in the differentiation-inducing step is not particularly limited as long as it is a density that does not inhibit the formation of a cartilage tissue mass and the formation of a good quality cartilage tissue mass, but is preferably confluent or subconfluent (80% or more Cell density).
  • the formed cartilage tissue mass can be confirmed by staining cells with Alcian blue, for example.
  • cartilage tissue mass obtained by the above-described production method can be used for regenerative medical treatment of joint disease.
  • joint diseases include osteoarthritis, meniscus injury, rheumatoid arthritis, or traumatic arthritis.
  • a cartilage tissue mass derived from a non-human animal can be used for the same animal, but preferably a human-derived cartilage tissue mass can be used for the purpose of substituting the human cartilage tissue or supplementing the function of human cartilage.
  • cartilage tissue mass can be produced by enlarging the incubator or collecting the obtained cartilage tissue mass.
  • the cartilage tissue mass can be provided in a shape suitable for the affected area.
  • a plurality of cartilage tissue masses can be administered and embedded in the affected area according to symptoms.
  • the cartilage tissue mass according to the present invention may contain an FZD8 polypeptide resulting from the production process.
  • Example 1 Promotion of cartilage tissue mass formation from mesenchymal stem cells by FZD8 polypeptide
  • Human mesenchymal stem cells (Takara, PT034) were cultured until confluent on a 24-well plastic dish using a fully synthetic medium kit for human mesenchymal stem cells (MSCGM-CD TM , Takara, B0632).
  • Human FZD8 extracellular domain set forth in SEQ ID NO: 2 (Ala25-Pro172, GenBank accession number: Q9H461) and, Fc protein (Human IgG 1, Pro100-Lys330 ) is fused to human FZD8 solubilized receptor (Frizzled-8 / Fc Chimera, Human Recombinant, R & D, 6129-FZ-050) supplemented with 10 ng / ml, 100 ng / ml or 1000 ng / ml human mesenchymal stem cell chondrocyte differentiation medium (hMSC Differentiation BulletKit TM , Chondrogenic 300, The culture medium was replaced every 20 days and cultured for 20 days.
  • the amino acid sequence of the human FZD8 solubilized receptor is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the cells were stained with Alcian blue, and the diameter of the staining positive cartilage tissue mass was measured. The results are shown in “FIG. 1” and “Table 1”.
  • the experimental group to which the human FZD8 solubilized receptor was added formation of cartilage tissue mass was confirmed.
  • the control group to which the human FZD8 solubilized receptor was not added chondrocytes positive for cyan blue staining were observed, but no formation of cartilage tissue mass was observed.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence of human FZD8
  • SEQ ID NO: 2 amino acid sequence of human FZD8 fragment
  • SEQ ID NO: 3 amino acid sequence of human FZD8 solubilized receptor

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Abstract

関節疾患の治療に必要とされる良質な軟骨組織塊を簡便に調製するために有用な技術として、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８（ＦＺＤ８）タンパク質又はその断片を含む培地中で幹細胞から分化させた軟骨細胞から形成されてなる軟骨組織塊等を提供する。前記断片は、（Ａ）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は（Ｂ）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織隗の分化、形成を促進する活性を有するポリペプチドであってよい。

Description

軟骨組織塊及びその製造方法、並びに幹細胞から軟骨組織塊を誘導するための培地
　本発明は、軟骨組織塊及びその製造方法、並びに幹細胞から軟骨組織塊を誘導するための培地に関する。より詳しくは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８（ＦＺＤ８）タンパク質又はその断片を含む培地中で幹細胞から分化させた軟骨細胞から形成されてなる軟骨組織塊等に関する。
　関節の軟骨組織は加齢、疾患、過度の運動や事故により劣化、破損ないし欠損すると、変形性膝関節症、関節リウマチ、離断性骨軟骨炎や軟骨欠損症を発症し生活の質を低下させる。これら関節疾患に対する治療法として、ヒアルロン酸投与、マイクロフラクチャー、自家骨軟骨移植法、骨切り手術又は人工関節などが開発されている。
　また、膝関節における外傷性軟骨欠損症又は離断性骨軟骨炎を自家培養軟骨を用いて治療する方法も開発されている（非特許文献１）。この治療方法では、治療に用いる自家培養軟骨を調製するため、手術前に、荷重がかからない部位から軟骨組織を採取する必要がある。また、軟骨細胞の分裂回数にも制限がある。このため、良質な軟骨組織塊を多量に調製することは困難であった。
　そこで、間葉系幹細胞から軟骨組織塊を分化、形成させ、治療に用いる試みがなされてきている。間葉系幹細胞は、臍帯血、さい帯、胎盤、骨髄、滑膜、歯髄、脂肪組織などの種々の組織から得られ、軟骨組織に比べ入手が容易である。また、間葉系幹細胞は、軟骨細胞に比べ高い分裂増殖能を持っている。しかし、間葉系幹細胞から分化させて得られた軟骨組織塊は、本来の軟骨組織に比べて質的に劣る細胞壊死、骨化、細胞希薄な部位や結節が確認されるため、関節疾患治療への応用はされていない（非特許文献２）。
　Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）遺伝子ファミリーのメンバーは、Ｗｎｔシグナル伝達タンパク質の受容体である７回膜貫通ドメインタンパク質をコードする。ヒトＦＺＤ遺伝子ファミリーとしてＦＺＤ１～１０が知られている。Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質の細胞外にあるシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）がＷｎｔ結合決定因子を含んでいること、ＦＺＤ可溶化受容体がＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質と競合的にＷｎｔタンパク質と結合し、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害することが報告されている（非特許文献３，４）。これまで、動物細胞の培地にＦＺＤ８タンパク質又はその断片を添加することや、ＦＺＤ８タンパク質又はその断片存在下で幹細胞を培養することは報告されていない。
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，１７，４，ｐ．４１３－４２４ Ｅｘｐｅｒｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１２，１２，１０，ｐ．１３６１－１３８２ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９８，５５９３，ｐ．６０１－６０４ Ｃｅｌｌ，２０１２，１５，２，ｐ．３５１－３６５
　本発明は、関節疾患の治療に必要とされる良質な軟骨組織塊を簡便に調製するために有用な技術を提供することを主な目的とする。
　上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］～［２０］を提供する。
［１］　Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８（ＦＺＤ８）タンパク質又はその断片を含む培地中で幹細胞から分化させた軟骨細胞から形成されてなる軟骨組織塊。
［２］　ＦＺＤ８タンパク質又はその断片と、軟骨細胞と、を含んでなる軟骨組織塊。
［３］　前記断片が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである、［１］又は［２］の軟骨組織塊。
（Ａ）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性を有するポリペプチド。
［４］　前記断片が、配列番号３のポリペプチドである、［１］～［３］のいずれかの軟骨組織塊。
［５］　前記幹細胞が間葉系幹細胞又は多能性幹細胞である、［１］～［４］のいずれかの軟骨組織塊。
［６］　前記幹細胞がヒト由来である、［１］～［５］のいずれかの軟骨組織塊。
［７］　前記培地が無血清培地である、［１］～［６］のいずれかの軟骨組織塊。
［８］　ＦＺＤ８タンパク質又はその断片を含む培地中で幹細胞から軟骨細胞の分化を誘導する工程を含む、軟骨組織塊の製造方法。
［９］　前記断片が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである、［８］の製造方法。
（Ａ）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性を有するポリペプチド。
［１０］　前記断片が、配列番号３のポリペプチドである、［８］又は［９］の軟骨組織塊の製造方法。
［１１］　前記幹細胞が間葉系幹細胞又は多能性幹細胞である、［８］～［１０］のいずれかの製造方法。
［１２］　前記幹細胞がヒト由来である、［８］～［１１］のいずれかの製造方法。
［１３］　前記培地が無血清培地である、［８］～［１２］のいずれかの製造方法。
［１４］　ＦＺＤ８タンパク質又はその断片を含む、幹細胞から軟骨組織塊を分化、形成するための培地。
［１５］　前記断片が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである、［１４］の培地。
（Ａ）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性を有するポリペプチド。
［１６］　前記断片が、配列番号３のポリペプチドである、［１４］又は［１５］の培地。
［１７］　前記幹細胞が間葉系幹細胞又は多能性幹細胞である、［１４］～［１６］のいずれかの培地。
［１８］　前記幹細胞がヒト由来である、［１４］～［１７］のいずれかの培地。
［１９］　前記培地が無血清培地である、［１４］～［１８］のいずれかの培地。
［２０］　［１］～［７］のいずれかの軟骨組織塊又は［８］～［１３］のいずれかの製造方法により得られた軟骨組織塊を用いる、関節疾患の治療方法。
　本発明において、「軟骨組織塊」とは、シート状に培養された軟骨細胞が細胞集積を起こして、立体的な軟骨組織を形成したものをいう。「幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性（軟骨組織塊形成促進活性）」とは、幹細胞から分化誘導された軟骨細胞の集積と立体的な軟骨組織塊の形成を誘導する活性を意味する。また、「幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性」には、ある物質について、当該物質の存在下での培養における幹細胞からの軟骨組織塊の形成が、当該物質の非存在下での培養における軟骨組織塊の形成に比して促進されることも意味する。具体的には、当該物質の存在下で一定期間培養した後に得られる軟骨組織塊のサイズあるいは数が、当該物質の非存在下で同期間培養した後に得られる軟骨組織塊のサイズあるいは数に比べて、５％以上、１０％以上又は２０％以上、好ましくは３０％以上、４０％以上、５０％以上、より好ましくは６０％以上、７０％以上又は８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、１００％以上又はそれ以上増大することを意味する。
　本発明により、関節疾患の治療に必要とされる良質な軟骨組織塊を簡便に調製するために有用な技術が提供される。
ＦＺＤ８ポリペプチドの存在下で間葉系幹細胞から分化誘導して形成した軟骨組織塊を示す図である（実施例１）。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
１．幹細胞から軟骨組織塊を分化、形成するための培地
［ＦＺＤ８］
　本発明に係る培地は、幹細胞から軟骨細胞を分化、誘導し、軟骨組織塊を形成させるために用いられるものであって、ＦＺＤ８タンパク質又はその断片を含むことを特徴とする。本発明に係る培地の組成は、ＦＺＤ８又はその断片を含有する点を除いて、従来、幹細胞から軟骨細胞を誘導するために用いられている培地と同様であってよい。すなわち、本発明に係る培地は、従来の軟骨細胞誘導用培地に、ＦＺＤ８又はその断片を添加することにより調製できる。
　ＦＺＤ８及びその断片は、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性（軟骨組織塊形成促進活性）を有する限りにおいて由来種は限定されず、ヒトの他、ラット、マウス、ハムスター又はモルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ又はヒツジ等の有蹄目、イヌ又はネコ等のネコ目、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン又はチンパンジー等の霊長類であってよい。ヒトＦＺＤ８のアミノ酸配列を配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＢ０４３７０３）に示す。
　ＦＺＤ８及びその断片の由来種は、培養する幹細胞の由来種に応じて適宜選択することができ、好ましくは培養する幹細胞と同じ由来種とされる。例えば、ヒト由来の細胞を培養する場合は、ヒト由来のＦＺＤ８等を用いるのが好ましい。
　ＦＺＤ８の断片は、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性（軟骨組織塊形成促進活性）を有する限りにおいて、ＦＺＤ８の全長アミノ酸配列のうちの一部のアミノ酸配列を有する任意長のポリペプチドであってよい。具体的には、ヒトＦＺＤ８のアミノ酸配列（配列番号１）の２５番目～１７２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（１４８アミノ酸残基）が挙げられる。ポリペプチドの長さとしては、アミノ酸残基数で、例えば、１２０～２４０、より好ましくは１２０～１５０とされる。
　ＦＺＤ８及びその断片は、軟骨組織塊形成促進活性を有する限りにおいて、野生型ＦＺＤ８等のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる改変タンパク質等であってもよい。
　「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、挿入もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、最も好ましくは１又は２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を意味する。
　タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該タンパク質の構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、天然に存在するタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない多型（ポリモルフィズム）が存在することもまた周知である。従って、「１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列」には、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に変異を導入して得られる改変配列に加えて、天然に存在する多型配列も含まれる。
　ＦＺＤ８の断片の具体例としては、例えば、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドが挙げられる。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、好ましくは配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織塊の分化、形成を促進する活性を有するポリペプチド、好ましくは配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、幹細胞からの軟骨組織塊の分化、形成を促進する活性を有するポリペプチド。
　上記（Ａ）に関し、配列番号２で示されるアミノ酸配列は、ヒトＦＺＤ８の細胞外ドメインに位置し、ヒトＦＺＤ８のアミノ酸配列（配列番号１）の２５番目～１７２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（１４８アミノ酸残基）に相当する。ＦＺＤ８の断片の他の好適な具体例としては、ヒトＦＺＤ８の細胞外ドメインに位置し、ヒトＦＺＤ８のアミノ酸配列（配列番号１）の３０番目～１５１番目のアミノ酸（１２２アミノ酸残基）等も挙げられる。
　さらに、ＦＺＤ８及びその断片は、軟骨組織塊形成促進活性を有する限りにおいて、天然から単離・精製されたタンパク質に加えて、組換えタンパク質又は融合タンパク質であってよく、化学修飾されたものであってもよい。天然タンパク質の単離、組換えタンパク質の発現、タンパク質の合成あるいはこれらのタンパク質の精製は、従来公知の手法によって行うことができる。
　融合タンパク質としては、ＦＺＤ８及びその断片のＣ末側にＦｃタンパク質やＨｉｓ　ｔａｇを融合させたタンパク質等が挙げられる。好ましい組換えタンパク質の具体例としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＣ末端にＦｃタンパク質のアミノ酸配列（Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ1、Ｐｒｏ１００－Ｌｙｓ３３０）を融合した組換えタンパク質（実施例１参照）が挙げられる。
　本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用されるものとする。以下、ＦＺＤ８及びその断片を、単に「ＦＺＤ８ポリペプチド」とも称する。
［軟骨細胞誘導用培地］
　ＦＺＤ８ポリペプチドが添加される軟骨細胞誘導用培地としては、例えば、９０％　αＭＥＭ培地、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ　Ｌーグルタミン、０．１μＭデキサメタゾンの組成の培地がある。また、市販のキット（Ｈｕｍａｎ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
　Ｍｅｄｉｕｍ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ、Ｔａｋａｒａ社）を用いた場合には、その内容成分（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｂ、ａｓｃｏｒｂａｔｅ、ＩＴＳ　＋　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＧＡ－１０００、ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ、ｐｒｏｌｉｎｅ、Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、ＴＧＦ－ｂ３）を分化誘導剤として添加した基礎培地を用いることができる。本発明に係る幹細胞培養用の培地の組成は、上記のＦＺＤ８ポリペプチドを含有する点を除いて、従来幹細胞培養に用いられている培地と同様であってよい。すなわち、本発明に係る培地は、動物組織に由来する細胞の培養に従来用いられている基礎培地にＦＺＤ８ポリペプチドを添加することにより調製できる。基礎培地として具体的には以下を挙げることができる。
　ＲＰＭＩ-１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　ＭＥＭ培地、α-ＭＥＭ培地、１９９培地、ＩＭＤＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｓｅｒｕｍ　ｆｒｅｅ培地、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｓｅｒｕｍ　Ｆｒｅｅ培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆ-１２、Ｈａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆ-１０、Ｈａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆ１２Ｋ、ＡＴＣＣ-ＣＲＣＭ３０、ＤＭ-１６０、ＤＭ-２０１、ＢＭＥ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ　Ｌ-１５、ＲＩＴＣ８０-７、ＭＣＤＢ１０５、ＭＣＤＢ１０７、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＢ２０１、ＮＣＴＣ１０９、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ　ＭＢ７５２／１、ＣＭＲＬ-１０６６、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ　ＢＭＯＣ-３　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８　Ｍｅｄｉｕｍ（以上サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ｍＴｅＳＲ１（ステムセルテクノロジーズ社）、ＴｅＳＲ－Ｅ８　ｍｅｄｉｕｍ（ステムセルテクノロジーズ社）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（和光純薬社）、ｍＥＳＦ培地（和光純薬社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社）、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマ社）、ＲｅｐｒｏＸＦ（リプロセル社）、ＰＳＧｒｏ-ｆｒｅｅ　Ｈｕｍａｎ　ｉＰＳＣ/ＥＳＣ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＲＤ社）、ｈＰＳＣ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ社）、ＲｅｐｒｏＦＦ２（リプロセル社）、ＥＸ-ＣＥＬＬ　３０２培地（ＳＡＦＣ社）、ＥＸ-ＣＥＬＬ-ＣＤ-ＣＨＯ（ＳＡＦＣ社）又はＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ　Ｍｅｄｉｕｍ（ステムセルテクノロジーズ社）など及びこれらの混合物。
　本発明に係る培地は、これらの基礎培地にＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、Ｎｏｄａｌ阻害剤又はレチノイン酸などの分化誘導剤とＦＺＤ８ポリペプチドを予め添加あるいは細胞培養中に添加することによっても調製できる。
　本発明に係る培地におけるＦＺＤ８ポリペプチドの添加濃度は、軟骨組織塊形成促進活性を示す限りにおいて特に限定されないが、例えば、１．０ｐｇ／ｍｌ～１００．０μｇ／ｍｌ、好ましくは１．０ｎｇ／ｍｌ～１０．０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１０．０ｎｇ／ｍｌ～１０００ｎｇ／ｍｌである。
［添加物］
　本発明に係る培地には、必要に応じて細胞の生存又は増殖に必要な生理活性物質及び栄養因子などを添加できる。これらの添加物は、培地に予め添加されていてもよく、細胞培養中に添加されてもよい。培養中に添加する方法は、１溶液または２種以上の混合溶液などいかなる形態によってもよく、連続的又は断続的な添加であってもよい。
　生理活性物質としては、インシュリン、ＩＧＦ－１、トランスフェリン、アルブミンまたは補酵素Ｑ10などが挙げられる。
　栄養因子としては、糖、アミノ酸、ビタミン、加水分解物または脂質などが挙げられる。
　糖としては、グルコース、マンノースまたはフルクトースなどの中性糖、シアル酸などの酸性糖、アミノ糖、糖アルコールなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
　アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシンまたはＬ－バリンなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
　ビタミンとしては、ｄ－ビオチン、Ｄ－パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ－イノシトール、ナイアシンアミド、ピロドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはＤＬ－α―トコフェロールなどが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いられる。
　加水分解物としては、大豆、小麦、米、えんどう豆、とうもろこし、綿実または酵母抽出物などを加水分解したものが挙げられる。
　脂質としては、コレステロール、リノール酸またはリノレイン酸などが挙げられる。
　さらに、培地には、カナマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリンまたはハイグロマイシンなどの抗生物質を必要に応じて添加してもよい。シアル酸等の酸性物質を培地に添加する場合には、培地のｐＨを細胞の成育に適した中性域であるｐＨ５～９、好ましくはｐＨ６～８に調整することが望ましい。
　本発明に係る培地は、血清含培地であっても無血清培地であってもよい。異種動物由来成分の混入防止の観点からは血清を含有しないか、培養される幹細胞と同種動物由来の血清が用いられることが好ましい。
　無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。無血清培地は、精製された血液由来成分や増殖因子などの動物組織由来成分を含有していてもよい。
　本発明に係る培地は、血清と同様に、血清代替物を含んでいても含んでいなくともよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、脂質リッチアルブミン及び組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン、タンパク質加水分解物、トランスフェリン又は他の鉄輸送体、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２-メルカプトエタノール、３’-チオグリセロールあるいはこれらの均等物などが挙げられる。
　血清代替物の具体例としては、例えば、国際公開第９８／３０６７９号記載の方法により調製されるものや、市販のｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ社）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ-ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などが挙げられる。
２．軟骨組織塊の製造方法
［幹細胞］
　本発明が対象とする「幹細胞」は、自己複成能及び分化増殖能を有する未熟な細胞をいい、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ)、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ)又は単能性幹細胞(ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ)等が含まれる。「幹細胞」は、一般に、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と、三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞と定義されている。
　多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
　複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
　単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
　幹細胞の由来種も特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスター又はモルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ又はヒツジ等の有蹄目、イヌ、ブタ又はネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン又はチンパンジー等の霊長類などの細胞であってもよい。また、本発明に用いられる幹細胞は、自家、他家のいずれであってもよい。
　幹細胞としては、間葉系幹細胞、スフェロイド状態から胚様体（ＥＢ体）と呼ばれる擬似的な胚の形成を経て様々な組織への分化・誘導のステップに進むことが知られている胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）や誘導性多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、始原生殖細胞に由来する胚性生殖（ＥＧ）細胞、精巣組織からのＧＳ細胞の樹立培養過程で単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｓｔｅｍ（ｍＧＳ）細胞又は骨髄から単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ（ＭＰＣ）等の多能性幹細胞などが挙げられるが、機能を有する骨芽細胞又は軟骨細胞等へ分化能を保持する細胞であれば特に限定されない。
　多能性幹細胞としては、特に、上述のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を挙げることができる。体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した幹細胞も、多能性幹細胞としてまた好ましい（Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３８５，ｐ．８１０、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８０，ｐ．１２５６、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７，ｐ．４５６、Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９４，ｐ．３６９、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９９，２２，ｐ．１２７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９，９６，ｐ．１４９８４、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００，２４，ｐ．１０９）。
　ヒトＥＳ細胞株は、例えばＷＡ０１（Ｈ１）およびＷＡ０９（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌ　Ｒｅｓｅｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから、ＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
　ｉＰＳ細胞としては、例えば、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子（初期化因子）を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられる。例えばＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ-Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２６，ｐ．１０１-１０６）等が挙げられる。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３/４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ-Ｍｙｃ、Ｎ-Ｍｙｃ、Ｌ-Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５-２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ-ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｎａｔ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ., ２００８，２６，ｐ．７９５－７９７、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ, ２００８，２，ｐ．５２５－５２８、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ. ２００８，２６，ｐ．２４６７－２４７４、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２００８，２６，ｐ．１２６９－１２７５、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ, ２００８，３, ｐ．５６８－５７４、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ, ２００８，３，ｐ．４７５－４７９、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ, ２００８，３, ｐ．１３２－１３５、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ.，２００９，１１，ｐ．１９７－２０３、Ｎａｔ. Ｂｉｏｔｅｃｈ., ２００９，２７，ｐ．４５９－４６１、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ.，２００９，１０６，ｐ．８９１２－８９１７、Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４６１，ｐ．６４３－６４９、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２００９， ５，ｐ．４９１－５０３、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１０，６，ｐ．１６７－７４、Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６３，ｐ．１０９６－１００、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１０，２８，ｐ．７１３－７２０、Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４７４，ｐ．２２５－９に記載の組み合わせが例示される。ｉＰＳ細胞は、所定の機関（理研バイオリソースセンター、京都大学など）より入手可能である。
　ヒトｉＰＳ細胞としてより具体的には２５３Ｇ１株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ０００２）、２０１Ｂ７株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ００６３）、４０９Ｂ２株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ００７６）、４５４Ｅ２株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ００７７）、ＨｉＰＳ-ＲＩＫＥＮ-１Ａ株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ０００３）、ＨｉＰＳ-ＲＩＫＥＮ-２Ａ株（理研セルバンク Ｎｏ. ＨＰＳ０００９）、ＨｉＰＳ-ＲＩＫＥＮ-１２Ａ株（理研セルバンク Ｎｏ. ＨＰＳ００２９）又はＮｉｐｓ-Ｂ２株（理研セルバンクＮｏ. ＨＰＳ０２２３）などを挙げることができる。
　複能性幹細胞としては、特に、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞及び生殖幹細胞等の体性幹細胞等が挙げられる。複能性幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞、より好ましくは骨髄間葉系幹細胞である。なお、間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪芽細胞等の間葉系の細胞全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞又はその前駆細胞の集団を広義に意味する。間葉系幹細胞としてより具体例には、ヒト間葉系幹細胞（ＰＴ０３４，Ｔａｋａｒａ）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ－ＢＭ，Ｔａｋａｒａ）、ヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ－ＵＣ，Ｔａｋａｒａ）、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ－ＡＴ，Ｔａｋａｒａ）などを挙げることができる。
［軟骨組織塊の製造方法］
　本発明に係る軟骨組織塊の製造方法は、ＦＺＤ８ポリペプチドを含む培地中で幹細胞から軟骨細胞の分化を誘導する工程を含むことを特徴とする。また、本発明に係る軟骨組織塊の製造方法は、前段工程として、幹細胞を培養し増殖させる培養工程を含んでいてもよい。
　本発明に係る幹細胞の培養工程は、従来公知のバッチ培養（Ｂａｃｈ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（Ｆｅｄ－Ｂａｃｈ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）又は灌流培養（Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）等により行えばよい。
　培養器は、特に限定されないが、フラスコ、ディッシュ、シャーレ、マイクロウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック又はタンクなどの培養槽などが挙げられる。これらの培養器の基材も、特に限定されず、ガラスや、ポリプロピレン又はポリスチレンなどの各種プラスチック、ステンレスなどの金属並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
　本発明に係る幹細胞の培養方法としては、培養器の基材表面への足場依存性細胞の接着を誘導するため、基材表面にコラーゲン、ゼラチン、ポリ-Ｌ-リジン、ポリ-Ｄ-リジン、ラミニン、ラミニンの一部構造体、フィブロネクチン及びこれら混合物（例えばマトリゲル）並びに溶解細胞膜調製物（Ｌａｎｃｅｔ，２００５，３６５，ｐ．１６３６-１６４１）などの足場をコーティングする接着培養や、メチルセルロースなどの高分子ポリマー（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２，５，ｐ．７３４－７４５）、ＭＦＧ－Ｅ８（Ｍｉｌｋ　ｆａｔ　ｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦ　ｆａｃｔｏｒ　８）又は該タンパク質の断片を用いた上記足場が不要な浮遊培養が挙げられる。
　培養される幹細胞は、分散細胞又は非分散細胞であり得る。分散細胞とは、細胞分散を促進するために処理された細胞をいう。分散細胞としては、例えば、２～５０個、２～２０個、又は２～１０個の細胞からなる小さな細胞塊を形成している細胞が挙げられる。分散細胞は、浮遊（懸濁）細胞又は接着細胞であり得る。
　培養工程における幹細胞の培養密度は、細胞の生存及び増殖を促進する効果を達成し得るような密度である限り特に限定されない。培養密度は、例えば１．０×１０1～１．０×１０7細胞／ｍｌ、好ましくは１．０×１０2～１．０×１０7細胞／ｍｌ、より好ましくは１．０×１０3～１．０×１０7細胞／ｍｌ、さらに好ましくは３．０×１０4～１．０×１０7細胞／ｍｌである。
　温度、溶存ＣＯ2濃度、溶存酸素濃度及びｐＨなどの培養条件は、動物組織に由来する細胞の培養に従来用いられている技術に基づいて適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが３０～３９℃、好ましくは３７℃であり得る。溶存ＣＯ2濃度は、１～１０％、好ましくは２～５％であり得る。酸素分圧は、１～２２％であり得る。
　幹細胞の培養工程を接着培養で行う場合、フィーダー細胞の存在下で培養してもよい。フィーダー細胞には、胎児線維芽細胞等のストローマ細胞を用いることができる（例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９４、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９３、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，１９８１，７８，１２，ｐ．７６３４－７６３８、Ｎａｔｕｒｅ，１９８１，２９２，５８１９，ｐ．１５４－１５６、Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．，１９６９，４，５，ｐ．５４９－５５３、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７２，５２６２，ｐ．７２２－７２４、Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９８２，１１２，１，ｐ．８９－９５、国際公開第０１／０８８１００号、同第２００５／０８０５５４号参照）。
　幹細胞の培養工程を浮遊培養で行う場合、担体上での浮遊培養（Ｊ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，１３２，２，ｐ．２２７－２３６）またはメチルセルロースなどの高分子ポリマーを用いた浮遊培養（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２，５，ｐ．７３４－７４５）などが挙げられる。
　幹細胞の浮遊培養とは、培地中において、培養器又はフィーダー細胞を用いる場合に対して非接着性の条件下で幹細胞を培養することをいう。幹細胞の浮遊培養としては、幹細胞の分散培養及び幹細胞の凝集浮遊培養が挙げられる。
　幹細胞の分散培養とは、懸濁された幹細胞を培養することをいい、例えば、２～２０個の幹細胞からなる小さな細胞塊の分散培養が挙げられる。分散培養を継続した場合、培養された分散細胞がより大きな幹細胞塊を形成し、その後凝集浮遊培養が実行され得る。
　凝集浮遊培養としては、胚様体培養法（Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１９９５，７，６，ｐ．８６２-８６９参照）、ＳＦＥＢ法（Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，８，３，ｐ．２８８-２９６、国際公開第２００５／１２３９０２号）、メッシュフィルターを用いて機械的処理により細胞株を継代させるスフェア培養法（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２，５,ｐ．７３４－７４５）が挙げられる。
　幹細胞からの軟骨細胞の分化誘導工程は、上述の本発明に係るＦＺＤ８ポリペプチドを含む培地中で幹細胞を培養することによって行うことができる。本発明に係る軟骨組織塊の製造方法では、幹細胞から軟骨細胞への分化誘導培地にＦＺＤ８ポリペプチドを添加して培養することで、簡便なシャーレ等で平板培養において良質な軟骨組織塊を製造することが可能である。
　ここで、軟骨組織塊が良質であるとは、軟骨組織塊内部に、均一に密集した軟骨細胞が観察され、細胞壊死、骨化、細胞希薄な部位や結節が確認されないことを意味する。良質な軟骨組織塊では、軟骨が形成され、組織の内部に硝子軟骨が含まれる。
　従来、平板培養法によって良質な軟骨組織塊を得ることは難しいとされている。遠心機などを用いた物理的処理により細胞の積層を行ったり、足場を用いて培養を行ったりすることで三次元的な培養を行い、これによって良質な軟骨組織塊を形成する試みがなされてきた（非特許文献２）。これまで、平板培養によって良質な軟骨組織塊を調製できたことは報告されていない。
　本発明に係る軟骨組織塊の製造方法では、ＦＺＤ８ポリペプチドの軟骨組織塊形成促進作用により、平板培養であっても良質な軟骨組織塊を形成させることができるので、細胞に対する何らかの物理的処理や足場が不要となり、簡便に良質な軟骨組織塊を製造することが可能である。
　平板培養に用いられる培養器は、特に限定されないが、フラスコ、ディッシュ、シャーレ、マイクロウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド又はトレイなどが挙げられ得る。これらの培養器の基材も、特に限定されず、ガラスや、ポリプロピレン及びポリスチレンなどの各種プラスチック、ステンレスなどの金属又はそれらの組み合わせが挙げられる。
　分化誘導工程における幹細胞の播種密度は、軟骨組織塊への組織化及び良質な軟骨組織塊の形成を阻害しない密度であればよく、特に限定されないが、好ましくはコンフルエントまたはサブコンフルエント（８０％以上の細胞密度）である。
　形成された軟骨組織塊は、例えば、アルシアンブルーを用いて細胞を染色することにより確認できる。
３．軟骨組織塊を用いる関節疾患の治療
　上述の製造方法によって得られた軟骨組織塊は、関節疾患の再生医療治療のために利用できる。関節疾患としては、変形性関節症、半月板損傷、関節リウマチ又は外傷性関節炎等が挙げられる。ヒト以外の動物由来の軟骨組織塊を同じ動物に利用することもできるが、好ましくはヒト由来の軟骨組織塊をヒト軟骨組織を代替する目的又はヒト軟骨の機能を補完する目的で利用され得る。
　培養器を大きくしたり、得られた軟骨組織塊を寄せ集めたりすることで、より大きな軟骨組織塊を製造することも可能である。軟骨組織塊は、患部に適した大きさに成形して提供され得る。また、軟骨組織塊は、症状に応じて複数を患部へ投与、埋設することができる。
　本発明に係る軟骨組織塊は、製造工程に起因するＦＺＤ８ポリペプチドを含有していてもよい。
［実施例１：ＦＺＤ８ポリペプチドによる間葉系幹細胞からの軟骨組織塊形成の促進］
　ヒト間葉系幹細胞（Ｔａｋａｒａ、ＰＴ０３４）を、ヒト間葉系幹細胞専用完全合成培地キット（ＭＳＣＧＭ-ＣＤTM、Ｔａｋａｒａ、Ｂ０６３２）を用いて２４ウェルプラスチックディッシュ上でコンフルエントになるまで培養した。配列番号２に示されるヒトＦＺＤ８細胞外ドメイン（Ａｌａ２５－Ｐｒｏ１７２、ＧｅｎＢａｎｋ　アクセッションナンバー：Ｑ９Ｈ４６１）と、Ｆｃタンパク質（Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ1、Ｐｒｏ１００－Ｌｙｓ３３０）が融合したヒトＦＺＤ８可溶化受容体（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－８／Ｆｃ　Ｃｈｉｍｅｒａ，Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、Ｒ＆Ｄ、６１２９-ＦＺ-０５０）を１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ又は１０００ｎｇ／ｍｌ添加したヒト間葉系幹細胞軟骨細胞分化培地（ｈＭＳＣ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔTM、　Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ，Ｔａｋａｒａ、Ｂ３００３、血清不含）に交換し、２日毎に該培地を交換しながら２０日間培養した。ヒトＦＺＤ８可溶化受容体のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
　軟骨組織塊を識別するために細胞をアルシアンブルー染色し、染色陽性の軟骨組織塊の直径を測定した。結果を「図１」及び「表１」に示す。ヒトＦＺＤ８可溶化受容体を添加した実験群では、軟骨組織塊の形成が確認された。一方、ヒトＦＺＤ８可溶化受容体を添加していないコントロール群では、アシアンブルー染色陽性の軟骨細胞が観察されるものの、軟骨組織塊の形成は認められなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　さらに、形成された軟骨組織塊から切片を作成し、アルシアンブルー染色を行って、軟骨組織塊内部における染色陽性の細胞を観察した（ｎ＝３）。組織所見の結果を「表２」に示す。（＋）は良好に観察されたこと、（＋＋）はより良好に観察されたことを示し、（－）は観察されなかったことを示す。軟骨組織塊内部には均一に密集した軟骨細胞が観察され、細胞壊死、骨化、細胞希薄な部位や結節も確認されず、良質な軟骨組織塊が形成されていることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
配列番号１：ヒトＦＺＤ８のアミノ酸配列
配列番号２：ヒトＦＺＤ８断片のアミノ酸配列
配列番号３：ヒトＦＺＤ８可溶化受容体のアミノ酸配列

Claims (20)

  1. 　Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８（ＦＺＤ８）タンパク質又はその断片を含む培地中で幹細胞から分化させた軟骨細胞から形成されてなる軟骨組織塊。
  2. 　ＦＺＤ８タンパク質又はその断片と、軟骨細胞と、を含んでなる軟骨組織塊。
  3. 　前記断片が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである、請求項１又は２記載の軟骨組織塊。
    （Ａ）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
    （Ｂ）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性を有するポリペプチド。
  4. 前記断片が、配列番号３のポリペプチドである、請求項１～３のいずれか一項に記載の軟骨組織塊。
  5. 　前記幹細胞が間葉系幹細胞又は多能性幹細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の軟骨組織塊。
  6. 　前記幹細胞がヒト由来である、請求項１～５のいずれか一項に記載の軟骨組織塊。
  7. 　前記培地が無血清培地である、請求項１～６のいずれか一項に記載の軟骨組織塊。
  8. 　ＦＺＤ８タンパク質又はその断片を含む培地中で幹細胞から軟骨細胞の分化を誘導する工程を含む、軟骨組織塊の製造方法。
  9. 　前記断片が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである、請求項８記載の製造方法。
    （Ａ）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
    （Ｂ）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性を有するポリペプチド。
  10. 　前記断片が、配列番号３のポリペプチドである、請求項８又は９記載の軟骨組織塊の製造方法。
  11. 　前記幹細胞が間葉系幹細胞又は多能性幹細胞である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の製造方法。
  12. 　前記幹細胞がヒト由来である、請求項８～１１のいずれか一項に記載の製造方法。
  13. 　前記培地が無血清培地である、請求項８～１２のいずれか一項に記載の製造方法。
  14. 　ＦＺＤ８タンパク質又はその断片を含む、幹細胞から軟骨組織塊を分化、形成するための培地。
  15. 　前記断片が、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである、請求項１４記載の培地。
    （Ａ）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
    （Ｂ）配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、幹細胞からの軟骨組織塊の形成を促進する活性を有するポリペプチド。
  16. 　前記断片が、配列番号３のポリペプチドである、請求項１４又は１５記載の培地。
  17. 　前記幹細胞が間葉系幹細胞又は多能性幹細胞である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の培地。
  18. 　前記幹細胞がヒト由来である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の培地。
  19. 　前記培地が無血清培地である、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の培地。
  20. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の軟骨組織塊又は請求項８～１３のいずれかの製造方法により得られた軟骨組織塊を用いる、関節疾患の治療方法。

     
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