WO2017073728A1 - 超薄膜光ルミネッセンスセンサー - Google Patents

超薄膜光ルミネッセンスセンサー Download PDF

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WO2017073728A1
WO2017073728A1 PCT/JP2016/082056 JP2016082056W WO2017073728A1 WO 2017073728 A1 WO2017073728 A1 WO 2017073728A1 JP 2016082056 W JP2016082056 W JP 2016082056W WO 2017073728 A1 WO2017073728 A1 WO 2017073728A1
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WO
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compound
nanosheet
ultra
thin
physical
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/082056
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English (en)
French (fr)
Inventor
俊宣 藤枝
宮川　拓也
健人 山岸
武岡　真司
敏 新井
団 鈴木
佐藤　裕崇
タットサン フォードン
ファーディナンダス
Original Assignee
学校法人早稲田大学
ナンヤン テクノロジカル ユニヴァーシティ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Definitions

  • the present invention relates to an ultra-thin photoluminescence sensor.
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Thin-film photoluminescence sensors containing fluorescent molecules that have oxygen / pH sensitivity and whose luminescence intensity changes due to physical or chemical action have been researched and developed for a long time. Is an issue.
  • the present invention is an ultra-thin photoluminescence sensor comprising a laminated film comprising a plurality of polymer nanosheets, wherein the laminated film comprises a luminescent compound whose optical properties change with respect to a physical or chemical parameter to be measured.
  • An ultra-thin photoluminescence sensor comprising at least one polymeric nanosheet to be supported is provided.
  • the ultra-thin photoluminescence sensor may further include at least one polymer nanosheet carrying a luminescent compound having different optical properties with respect to the physical or chemical parameter.
  • a polymer nanosheet carrying a luminescence compound insensitive to the physical or chemical parameters as a reference compound may be included as a reference nanosheet for the ratiometric method.
  • the physical or chemical parameter is selected from the group consisting of gas concentration, oxygen concentration, nitrogen concentration, pressure, temperature, metal ion concentration, pH, membrane potential, and active oxygen concentration. There may be at least one kind.
  • the luminescent compound is a compound sensitive to oxygen or pressure, a compound sensitive to temperature, a compound sensitive to pH, a compound sensitive to CO 2 gas, or a compound sensitive to calcium. It may be at least one selected from the group consisting of a compound, a compound having zinc sensitivity, a compound having magnesium sensitivity, a compound having sodium sensitivity, a compound having membrane potential sensitivity, and a compound having active oxygen sensitivity .
  • the luminescent compound is oxygen or pressure sensitive compound from PtOEP (platinum octaethylporphyrin), and temperature sensitive compound is EuDT (Eu-tris (dinaphthoylmethane) -bis-trioctylphosphine oxide).
  • magnesium sensitive compounds are Mag-Fuar-2 TM
  • the compound with sodium sensitivity is from CoroNa Green TM
  • the compound with membrane potential sensitivity is ANEPPS (Di-4-ANEPPS, Di-8-ANEPPS)
  • the active oxygen sensitive compound may be at least one selected from CellROX R.
  • the luminescent compound is a compound introduced into the sheet surface, and the compound is a compound having calcium sensitivity, a compound having pH sensitivity, a compound having active oxygen sensitivity, or ATP sensitivity Or at least one selected from the group consisting of a compound having cAMP sensitivity, a compound having cGMP sensitivity, and a compound having glutamate sensitivity.
  • the luminescent compound is a compound to be introduced on the sheet surface, a compound having calcium sensitivity is from GCamP, a compound having pH sensitivity is from pHTomato, and a compound having active oxygen sensitivity Is at least one selected from the group consisting of Hyper, ATP-sensitive compounds from Perceval, cAMP-sensitive compounds from Flamindo, cGMP-sensitive compounds from FlincG, and glutamate-sensitive compounds from iGluSnFR.
  • a compound having calcium sensitivity is from GCamP
  • a compound having pH sensitivity is from pHTomato
  • a compound having active oxygen sensitivity Is at least one selected from the group consisting of Hyper, ATP-sensitive compounds from Perceval, cAMP-sensitive compounds from Flamindo, cGMP-sensitive compounds from FlincG, and glutamate-sensitive compounds from iGluSnFR.
  • the reference compound insensitive to the physical or chemical parameter to be measured includes an organic fluorescent compound, an organometallic complex, an inorganic fluorescent material, carbon, and a nanotube (near infrared). There may be at least one selected from the group consisting of:
  • the organic fluorescent compound is at least one selected from the group consisting of Rhodamine 101 and Rhodamine 800, the organometallic complex is from an iridium complex (Irppy3), and the inorganic fluorescent material is from the group consisting of QuantumDot.
  • the organometallic complex is from an iridium complex (Irppy3)
  • the inorganic fluorescent material is from the group consisting of QuantumDot.
  • the ultra thin film photoluminescence sensor may have a thickness of less than 1 ⁇ m or less than 500 nm, preferably less than 500 nm.
  • the polymer nanosheet is made of at least one selected from the group consisting of polymethyl methacrylate (PMMA), polystyrene (PS), polyester, elastomer, conductive polymer, and polysaccharide. It may be a filmed polymer nanosheet.
  • the ultra-thin photoluminescence sensor of the present invention may be used as a nanosheet for application to a cell culture-related substrate.
  • the cell culture-related substrate may be selected from petri dishes, glass, or multiplate wells.
  • the present invention is also a method for measuring a physical or chemical parameter of a subject or a change thereof using an ultra-thin photoluminescence sensor, wherein the ultra-thin photoluminescence sensor is a laminate of a plurality of polymer nanosheets.
  • the film is a film, and the laminated film provides a method comprising at least one polymer nanosheet carrying a luminescent compound whose optical properties change with respect to a physical or chemical parameter to be measured.
  • the method may further comprise at least one polymeric nanosheet carrying a luminescent compound having different optical properties with respect to the physical or chemical parameters.
  • a polymer nanosheet carrying a luminescence compound insensitive to the physical or chemical parameters as a reference compound is used as a reference nanosheet, Calculate the ratio of the measured intensity of luminescence from the reference compound to the measured intensity of luminescence from the luminescent compound, There is a case where a measurement value in a measurement device is corrected by a ratiometric method.
  • the physical or chemical parameter is at least one selected from the group consisting of gas concentration, oxygen concentration, nitrogen concentration, pressure, temperature, metal ion concentration, pH, membrane potential, and active oxygen concentration. It may be.
  • the luminescent compound sensitive to the physical or chemical parameter to be measured is a compound sensitive to oxygen or pressure from PtOEP, and a compound having a temperature sensitive compound is EuDT, EuTTA.
  • Rhodamine B pH sensitive compounds from 2 ′ , 7′-Dichlorofluorescein and fluorescein, CO 2 gas sensitive compounds from Benzobisimidazolium, calcium sensitive compounds from Fluo4, zinc sensitive compounds from FluoZin
  • the magnesium-sensitive compound is selected from Mag-Fuar-2
  • the sodium-sensitive compound is selected from CoroNa Green
  • the membrane potential-sensitive compound is selected from ANEPS
  • the active oxygen-sensitive compound is selected from CellROX. is there.
  • the luminescent compound having sensitivity to the parameter to be measured is a compound introduced to the sheet surface, and is a compound having calcium sensitivity, a compound having pH sensitivity, a compound having active oxygen sensitivity And at least one selected from the group consisting of a compound having ATP sensitivity, a compound having cAMP sensitivity, a compound having cGMP sensitivity, and a compound having glutamate sensitivity.
  • the luminescent compound having sensitivity to the parameter to be measured is a compound introduced into the sheet surface, the compound having calcium sensitivity is from GCamP, the compound having pH sensitivity is from pHTomato, A compound having active oxygen sensitivity is selected from Hyper, a compound having ATP sensitivity is selected from Perceval, a compound having cAMP sensitivity is selected from Flamindo, a compound having cGMP sensitivity is selected from FlincG ⁇ , and a compound having glutamate sensitivity is selected from iGluSnFR. May be a seed.
  • the reference luminescent compound insensitive to the physical or chemical parameter to be measured is at least one selected from the group consisting of organic fluorescent compounds, organometallic complexes, and inorganic fluorescent materials. There is a case.
  • the reference compound insensitive to the physical or chemical parameter to be measured includes an organic fluorescent compound from Rhodamine 101 or Rhodamine 800, an organometallic complex from an iridium complex (Irppy3), and an inorganic fluorescent compound.
  • the material may be at least one selected from QuantumDot, carbon, or nanotube (near infrared).
  • the luminescent compound sensitive to the physical or chemical parameter to be measured is a compound sensitive to oxygen or pressure, a compound having a temperature sensitive compound, a compound having pH sensitivity, A group consisting of a compound having sensitivity to CO 2 gas, a compound having sensitivity to calcium, a compound having sensitivity to zinc, a compound having sensitivity to magnesium, a compound having sensitivity to sodium, a compound having sensitivity to membrane potential, and a compound having sensitivity to active oxygen May be at least one selected from.
  • the parameter may be at least one selected from the group consisting of temperature, gas concentration, oxygen concentration, nitrogen concentration, metal ion concentration, and pH.
  • the ultrathin film photoluminescence sensor may have a thickness of less than 1 ⁇ m or less than 500 nm, preferably less than 500 nm, and more preferably less than 200 nm.
  • the polymer nanosheet is a polymer nanosheet obtained by forming at least one member of the group consisting of polymethyl methacrylate (PMMA), polystyrene (PS), polyester, elastomer, conductive polymer, and polysaccharide.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PS polystyrene
  • polyester polystyrene
  • elastomer polystyrene
  • conductive polymer polysaccharide
  • an ultrathin film photoluminescence sensor including a fluorescent molecule having temperature, oxygen and pH sensitivity, and having a luminescence intensity that changes due to a change in a physical quantity or a chemical quantity thereof.
  • the spatio-temporal resolution and low stickiness due to (micrometer) are improved, and an ultrathin film photoluminescence sensor having a nanosheet with high spatiotemporal resolution and high stickability can be provided.
  • FIG. 3A Fluorescence spectrum diagram of nanosheets bearing PtOEP under various oxygen concentrations
  • FIG. 3B The effect of various oxygen concentrations on the fluorescence intensity of nanosheets bearing PtOEP
  • FIG. 3C Fluorescence spectrum diagram of the laminated film of PtOEP-supported nanosheet and Rhodamine®101-supported nanosheet under various oxygen concentrations.
  • support microsheet was image
  • Time resolution of PtOEP-carrying nanosheets and PtOEP-carrying microsheets taken with a video camera, and images of each frame compared in time series; spatiotemporal resolution comparison results.
  • FIG. 8A Fluorescence spectrum of EuDT-carrying nanosheet
  • Fig. 8B Fluorescence intensity of EuDT-carrying nanosheet when temperature is changed and temperature relationship
  • Fig. 8C Fluorescence spectrum of Rhodamine 800-carrying nanosheet
  • FIG. 8D A graph showing the relationship between the fluorescence intensity of Rhodamine® 800-supported nanosheet and the temperature when the temperature is changed.
  • FIG. 11A A graph showing a region of interest (ROI); FIG.
  • FIG. 11B A graph plotting the relationship between temperature and fluorescence intensity during heating and heat dissipation in the region of interest.
  • ⁇ represents the temperature resolution (the value obtained by dividing the standard deviation of the normalized ratio by the slope of the temperature sensitivity plot) at each temperature during heating and during heat dissipation.
  • FIG. 11C is a diagram showing temperature resolution at various temperatures when the area of ROI is changed. The figure showing the numerical value of the temperature change in each ROI with the image which observed the temperature change by the beetle's spontaneous movement in the state which stuck the laminated film of EuDT carrying
  • the ratiometric method can be used for the change in the received light density (so-called out-of-focus) of the measuring device due to defocusing.
  • Reference diagram showing that correction is possible. The figure showing the image obtained by causing the focus shift
  • One embodiment of the present invention is an ultra-thin photoluminescence sensor comprising a laminated film including a plurality of polymer nanosheets, wherein the laminated film is a physical or chemical parameter to be measured. It is an ultra-thin photoluminescence sensor including at least one polymer nanosheet carrying a luminescence compound whose optical properties change with respect to the above.
  • the ultra-thin photoluminescence sensor of the present invention may further include at least one polymer nanosheet carrying a luminescent compound having different optical properties with respect to the physical or chemical parameters.
  • the ultrathin film photoluminescence sensor of the present invention can be an ultrathin film photoluminescence sensor constructed by laminating at least two polymer nanosheets of a sensor layer and a reference layer, and the ultrathin film photoluminescence sensor.
  • the luminescence sensor can be used as a ratiometric fluorescence or luminescence sensor.
  • the sensor layer comprises physical or chemical compounds in the nanosheet by including fluorescent or phosphorescent compounds in the nanosheet that are sensitive to the measurement parameters or have different optical properties that differ in the type of the physical or chemical parameters.
  • the reference layer hereinafter referred to as “reference nanosheet” contains a reference luminescent compound that is not sensitive or less sensitive to those measured parameters.
  • Each nanosheet layer consists of a flexible polymer layer with a thickness of less than 1 ⁇ m, preferably less than 500 nm, more preferably less than 200 nm.
  • a thickness of less than 1 ⁇ m preferably less than 500 nm, more preferably less than 200 nm.
  • ultra-thin film is used to mean that the film thickness is sufficiently smaller than “thin film”.
  • the nanosheet having a film thickness of less than 1 ⁇ m described in the present specification is significantly superior in sticking property to an object as compared to a microsheet having a film thickness of 1 ⁇ m or more, and when used as a film luminescence sensor, The temporal resolution and spatial resolution are significantly better than the microsheet.
  • the present invention laminates such an ultra-thin film, the total film thickness is less than 1 ⁇ m, and the above-described thin film sheet having a thickness of 1 ⁇ m or more is remarkably superior even in the laminated state.
  • nanosheet such an ultrathin film having a nanosheet layer of less than 1 ⁇ m, preferably less than 500 nm, more preferably less than 200 nm may be referred to as “nanosheet”.
  • luminescence refers to fluorescence or phosphorescence generated by energy released when a substance such as a compound receives energy by a physical or chemical action and is excited to a transition state and returns to a ground state.
  • photoluminescence photoluminescence excited by light is preferred among luminescence.
  • the “luminescent compound” refers to a compound capable of inducing a luminescence phenomenon, preferably a photoluminescence phenomenon, and is generally “fluorescent compound”, “phosphorescent compound”, “fluorescent dye” and “phosphorescent dye”. Including the compounds referred to as
  • the “luminescent compound” means a “luminescent compound” that is sensitive to a physical or chemical parameter to be measured, and a physical or chemical substance that is insensitive or low-sensitive or has a sensitive luminescent compound. It is classified as a “reference luminescent compound” that is sensitive to a physical or chemical parameter that is different from the parameter, and unless otherwise specified herein, the “luminescent compound” is a physical or chemical parameter to be measured. It refers to a luminescent compound having sensitivity to it.
  • reference luminescence compound is hereinafter referred to as “reference compound”.
  • the “reference compound” utilizes a characteristic that is insensitive or less sensitive to a physical or chemical characteristic to be measured, and is mainly used as a reference compound in a ratiometric method.
  • the fluorescence of the reference compound is “reference fluorescence”
  • the compound emitting the fluorescence is “reference fluorescence compound”
  • the phosphorescence of the reference compound is “reference phosphorescence”
  • the compound emitting the phosphorescence is “reference phosphorescence”.
  • Compound may be described.
  • the “ratiometric method” means that at least two kinds of luminescent compounds having different emitted light wavelengths or at least one kind of luminescent compounds having two different emitted light wavelengths are used and emitted from each compound. And the ratio of each received light amount of the reference luminescence, or the ratio of each received light amount in the measuring device, using the ratio of the received light amount to receive light of the luminescent compound based on a change in operation or irradiated light amount It includes a method of correcting the amount change and calculating the amount of radiation. Furthermore, it includes not only the synchrotron radiation wavelength but also a method of measuring at the same synchrotron radiation wavelength but at two or more different excitation wavelengths.
  • the ratiometric method uses, for example, a luminescent compound that is sensitive to a physical or chemical parameter to be measured and a non-sensitive reference compound, and from a luminescent compound at the same position on the same two-dimensional image.
  • the amount of luminescence and the amount of luminescence from the reference compound can be measured separately based on the difference in the excitation light wavelength and / or the radiation light wavelength, and the ratio of the luminescence amount of the luminescence compound to the reference compound can be determined.
  • a wavelength filter is used to alternately switch excitation light having a wavelength width including the excitation wavelength of the luminescent compound and excitation light having an ultra-wide width including the excitation wavelength of the reference compound in a short time.
  • the wavelength of the emitted light is separately measured with a measuring device (receiver), and the ratio of the amount of received light from both compounds is determined to determine the influence of the movement of the subject on the amount of received light.
  • the focus of the measuring device It is possible to correct the influence of the shift (so-called defocus) on the amount of received light.
  • the optical properties are different means that the excitation wavelength and / or the emission wavelength for the luminescent compound are different.
  • examples of physical or chemical parameters to be measured include gas concentration, oxygen concentration, nitrogen concentration, pressure, temperature, metal ion concentration, pH, membrane potential, and active oxygen concentration.
  • Sensitivity to the physical or chemical parameter can be, for example, luminescence or reversible caused by a luminescent compound that reflects the physical or chemical parameter or is caused by a chemical that the physical or chemical parameter affects. Brought about by quenching.
  • examples of luminescent compounds having different optical properties with different types of physical or chemical parameters include different excitation wavelengths and / or different emissions for the physical or chemical parameters.
  • a luminescent compound having a wavelength may be mentioned.
  • examples of the luminescence compound include compounds having sensitivity to oxygen or pressure, compounds having temperature sensitivity, compounds having pH sensitivity, compounds having CO 2 gas sensitivity, and calcium sensitivity.
  • Compounds having zinc, compounds having zinc sensitivity, compounds having magnesium sensitivity, compounds having sodium sensitivity, compounds having membrane potential sensitivity, and compounds having active oxygen sensitivity can be selected from these compounds.
  • the luminescent compound is oxygen or pressure sensitive compound from PtOEP (platinum octaethylporphyrin), temperature sensitive compound is EuDT (Eu-tris (dinaphthoylmethane) -bis-trioctylphosphine oxide) ), EuTTA (Eu-thenolytrifluoroacetonate) and rhodamine B (Rhodamine B), pH sensitive compounds from 2 ′, 7′-Dichlorofluorescein and fluorescein, CO 2 gas sensitive compounds are benzobisimidazolium, J Am. Chem. Soc., 2012, 134, pp 17846?
  • the compound with calcium sensitivity is Fluo4 TM (1- [2-amino-5- (2,7-difluoro-6-hydroxy-3- Oxo-9-xanthenyl) phenoxy] -2- (2-amino-5-methylphenoxy) ethane-N, N, N ', N'-tetraacetic acid, bentaacetoxymethyl ester) FluoZin TM (FluoZin-1 TM: ?
  • a membrane potential sensitive compound is an ANEPPS (AminoNaphthylEthenylPyridinium derivative , Di-4-ANEPPS: 3- (4- [2- [6- (dibutylamino) naphthalen-2-yl] ethenyl] pyridi nium-1-yl) propane-1-sulfonate); Di-8-ANEPPS: 4- (2- [6- (Dioctylamino) -2-naphthalenyl] ethenyl) -1- (3-sulfopropyl) pyridinium inner salt) And compounds having active oxygen sensitivity selected from CellROX R (Ahn HY et al., J Am Chem Soc. 2012, 14; 134: 4721-30), some of which are commercially available It is possible to obtain these, or to manufacture and use them by a known method.
  • the luminescence compound can be a compound introduced by bonding to the sheet surface.
  • These compounds include calcium sensitive compounds, pH sensitive compounds, active oxygen sensitive compounds, ATP sensitive compounds, cAMP sensitive compounds, cGMP sensitive compounds, glutamic acid sensitive compounds, etc. Examples thereof include compounds having direct sensitivity to the ions and compounds therein and having sensitivity.
  • these compounds can be bonded to the nanosheet surface by a coupling reaction using a condensing agent such as NHS and EDC / DCC, click chemistry using azido alkyne, or the like.
  • a compound having calcium sensitivity is GCamP (Mao T et al., PLoS ONE; 2008, 3 e1796)
  • a compound having pH sensitivity is pHTomato.
  • compounds with active oxygen sensitivity are hyper
  • compounds having a ATP sensitive Perceval (Berg J, et al., Nat Meth 2009; 6:. .?
  • At least one of the luminescent compounds is a reference nanosheet for a ratiometric method, and is a reference fluorescence or reference that is insensitive to a physical or chemical parameter to be measured.
  • Polymer nanosheets carrying phosphorescent compounds can be included.
  • Examples of the reference compound insensitive to the physical or chemical parameter to be measured include an organic fluorescent compound, an organometallic complex, and an inorganic fluorescent material, and at least one of them is used. Can do.
  • the luminescent compound insensitive to the physical or chemical parameter to be measured has an organic fluorescent dye Rhodamine 101 (CAS number 116450-56-7: 2- (1H, 2H, 3H, 5H, 6H, 7H, 11H, 12H, 13H, 15H, 16H, 17H-pyrido [3,2,1-ij] quinolizino [1 ', 9': 6,7,8] chromeno [2,3-f] quinolin-18-ium-9-yl) benzoate, 2- (2,3,6,7,12,13,16,17-octahydro-1H, 5H, 11H, 15H-pyrido [3,2,1-ij ] quinolizino [1 ', 9': 6,7,8] chromeno [2,3-f] quinolin-4-ium-9-yl) benzoate), or Rhodamine800 (CAS number 137993-41-0: 9-Cyano -2,3,6,7,12,13,16,
  • examples of the material of the polymer nanosheet include polymethyl methacrylate (PMMA), polystyrene (PS), polyester (polylactic acid / polylactic glycolic acid copolymer / polycaprolactone, etc. (Including biodegradable polymers), polymer nanosheets formed with elastomers, conductive polymers, polysaccharides, and the like, which are commercially available or can be produced by known methods.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PS polystyrene
  • polyester polylactic acid / polylactic glycolic acid copolymer / polycaprolactone, etc.
  • biodegradable polymers polymer nanosheets formed with elastomers, conductive polymers, polysaccharides, and the like, which are commercially available or can be produced by known methods.
  • nanosheets with a single layer or about two layers have a total thickness of less than 1 ⁇ m, they can be affixed to various surfaces without an adhesive or adhesive. Furthermore, it is possible to easily construct a multi-parameter sensor by using a multilayer nanosheet in which a plurality of nanosheets containing compounds for measuring various parameters are laminated together. Examples of measurable parameters include (but are not limited to) oxygen concentration, temperature, pH, and the like. Excitation by a light source generates photoluminescence corresponding to the value of a physical or chemical parameter. Furthermore, this nanosheet sensor can obtain a higher spatiotemporal resolution than a microsheet sensor having a thickness of 1 ⁇ m or more.
  • the film when used as a temperature sensor, heat can be quickly entered and exited by reducing the film thickness, and high response speed, relaxation speed, and sensitivity can be obtained. Further, since fluorescence in the ultraviolet / visible region is used, a higher spatial resolution can be shown as compared with general infrared thermography using infrared rays having longer wavelengths.
  • the method for creating a two-layer nanosheet sensor for parameter measurement mainly includes the following steps (see FIG. 1). a) As a sacrificial film layer, a water-soluble polymer such as PVA or pullulan is formed on the substrate. b) The sensor compound and polymer are dissolved in the solvent. At this time, a solvent that is inert to the compound and the polymer is selected to prepare a polymer solution. c) The polymer solution is spin-coated on the sacrificial film layer to form a nanosheet sensor. d) The sacrificial membrane layer is dissolved by immersing in water, and a self-standing nanosheet sensor is obtained in water.
  • the self-supporting nanosheet sensor is scooped up from the water with a mesh. This operation is performed for each of the sensor layer and the reference layer.
  • a reference layer, a sensor layer, and a mesh can be formed from above by superimposing the reference layer on the sensor layer.
  • PMMA dissolved in dichloromethane, toluene, ethyl acetate, or acetone
  • PS dissolved in dichloromethane, toluene or ethyl acetate
  • the polymer can then be selected from PS and PMMA.
  • PS nanosheets are highly sensitive to nitrogen and PMMA nanosheets are highly sensitive to oxygen.
  • nanosheets can be made using various polymers such as polyesters, elastomers, conductive polymers and polysaccharides. In the present invention, an appropriate combination of the above-described polymers, compounds, and solvents is selected.
  • Another embodiment of the present invention is a method for measuring a physical or chemical parameter of a subject with said ultrathin photoluminescence sensor.
  • it is a method for measuring a physical or chemical parameter with high accuracy by using a ratiometric method.
  • a method of measuring a physical or chemical parameter of a subject or a change thereof using an ultra-thin photoluminescence sensor wherein the ultra-thin photoluminescence sensor includes a plurality of polymer nanosheets
  • the laminated film is a method comprising at least one polymer nanosheet carrying a luminescent compound whose optical properties change with respect to a physical or chemical parameter to be measured.
  • the method can further use at least one polymer nanosheet carrying a luminescent compound having different optical properties with respect to the physical or chemical parameters.
  • At least one of the luminescent compounds is a polymer nanosheet containing a reference fluorescent or reference phosphorescent compound that is insensitive to the physical or chemical parameter to be measured as a reference compound
  • the physical or chemical parameter of the measurement object is determined by using the emitted light from the polymer nanosheet carrying the reference compound insensitive to the physical or chemical parameter of the measurement object as a reference.
  • the amount of received light at a specific position on the two-dimensional image received by the measuring device for the emitted light of the luminescent compound sensitive to the radiation, and the emission of the reference compound insensitive to the physical or chemical parameter of the measurement object There is a method including a step of determining a ratio between the specific position on the two-dimensional image received by the measurement device for light and the received light amount at the same position.
  • an object having a known absolute value of a physical or chemical parameter to be measured is measured in advance, and a so-called calibration curve is created by obtaining the measured value, and a physical or chemical parameter to be measured is separately provided.
  • the absolute value of the physical or chemical parameter value of the test object can be obtained by measuring an object whose value is unknown and applying the measurement value to the calibration curve.
  • the change over time in physical or chemical parameters of the test object can also be determined as a change amount or a relative change rate.
  • Examples of the physical or chemical parameters include gas concentration, oxygen concentration, nitrogen concentration, pressure, temperature, metal ion concentration, pH, membrane potential, and active oxygen concentration.
  • examples of the luminescent compound sensitive to the physical or chemical parameter to be measured include a compound sensitive to oxygen or pressure, a compound having a temperature sensitive dye, pH Sensitive compounds, CO 2 gas sensitive compounds, calcium sensitive compounds, zinc sensitive compounds, magnesium sensitive compounds, sodium sensitive compounds, membrane potential sensitive compounds, and active oxygen sensitivity It can be selected and used from the compound which has.
  • the luminescent compound sensitive to the physical or chemical parameter to be measured is a compound sensitive to oxygen or pressure from PtOEP (platinum octaethylporphyrin).
  • PtOEP platinum octaethylporphyrin
  • Compounds with EuDT Eu-tris (dinaphthoylmethane) -bis-trioctylphosphine oxide
  • EuTTA Eu-thenolytrifluoroacetonate
  • Rhodamine B pH-sensitive compounds from 2 ' , 7'-Dichlorofluorescein and fluorescein, CO 2 gas sensitivity
  • the sensitive compound can be selected from
  • a compound introduced into the sheet surface can be used as a luminescent compound having sensitivity to the parameter to be measured.
  • these compounds include calcium sensitive compounds, pH sensitive compounds, active oxygen sensitive compounds, ATP sensitive compounds, cAMP sensitive compounds, cGMP sensitive compounds, glutamic acid sensitive compounds, etc. You can choose from and use.
  • the luminescent compound having sensitivity to the parameter to be measured includes, as an example of a compound introduced into the sheet surface, more specifically, a compound having calcium sensitivity is GCamP, a compound having pH sensitivity is pHTomato, and active oxygen
  • a compound having sensitivity is Hyper
  • the compound having ATP sensitivity is Perceval
  • the compound having cAMP sensitivity is Flamindo
  • the compound having cGMP sensitivity is FlincG ⁇
  • the compound having glutamate sensitivity is iGluSnFR, and the like.
  • Examples of the reference compound insensitive to the physical or chemical parameter to be measured include organic fluorescent dyes, organometallic complexes, and inorganic fluorescent materials.
  • examples of the reference compound insensitive to the physical or chemical parameter to be measured include the organic fluorescent dye Rhodamine 101 or Rhodamine 800, the organometallic complex iridium complex (Irppy3), and the inorganic fluorescence.
  • the material is QuantumDot, carbon or nanotube (near infrared).
  • the thickness of the ultra-thin photoluminescence sensor is less than 1 ⁇ m, preferably less than 500 nm, more preferably less than 200 nm.
  • Examples of the material of the polymer nanosheet include polymethyl methacrylate (PMMA), polystyrene (PS), polyester, elastomer, conductive polymer, and polysaccharide, and a polymer nanosheet obtained by forming these films can be used.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PS polystyrene
  • polyester polyester
  • elastomer conductive polymer
  • polysaccharide polysaccharide
  • the prepared nanosheet is composed of oxygen-sensitive compound PtOEP (platinum octaethylporphyrin) (nanosheet 1 (manufactured by PS), film thickness: 146 ⁇ 16 nm, roughness 2 ⁇ 1 nm), oxygen-insensitive compound (for ratiometric measurement) Rhodamine® 101) (Nanosheet 2 (manufactured by PMMA), film thickness: about 200 nm) was obtained (FIG. 1).
  • PtOEP platinum octaethylporphyrin
  • Adhesiveness The microsheet carrying the sensor compound described in the prior art documents 1 and 2 is not flexible and cannot be attached to an article on the surface without using an adhesive or a pressure-sensitive adhesive. On the other hand, the high adhesiveness to the article shown by the nanosheet expands the application of the nanosheet carrying the sensor compound as a sensor.
  • Nanosheets can be easily applied to various surfaces using mesh, wire loop, or capillary force.
  • a PtOEP-supported nanosheet with a film thickness of 150 nm is affixed to each marking part of a: skin surface, b: coin, c: plastic model, d: plastic model, visible light (upper), PtOEP fluorescence photograph
  • FIG. 2B shows an image in which a brain slice is fixed to a cell culture dish (glass bottom dish) using a nanosheet as an example of the substrate for cell tissue culture.
  • the PtOEP-carrying nanosheet showed excellent adhesion without using an adhesive or a pressure-sensitive adhesive.
  • this high adhesion can give an accurate measurement result.
  • the nanosheet of the present invention is useful for use as a bioassay tool for cell screening or cell / tissue culture, and can be applied to cell culture-related substrates such as petri dishes, glass, and multiplate wells.
  • the phosphorescence spectrum diagram of the laminated film of nanosheet 1 and nanosheet 2 is shown in FIG. 3C.
  • the phosphorescence intensity of PeOEP decreased as the oxygen concentration increased on the nanosheet 1 side, while Rhodamine® 101 (excitation wavelength: 560 nm, maximum fluorescence wavelength) supported on the nanosheet 2. Fluorescence from 589 nm) hardly changed even when the oxygen concentration was changed (FIG. 3C). From these results, it was shown that by using the Rhodamine® 101-supported nanosheet as a reference nanosheet, the PtOEP-supported nanosheet can be used as an ultrathin photoluminescence sensor that is ratiometric to the oxygen concentration.
  • FIG. 5 shows the spatio-temporal resolution of a sheet having a film thickness of 1 ⁇ m or more (hereinafter referred to as “microsheet”).
  • microsheet a film thickness of 1 ⁇ m or more
  • the time resolution when nitrogen gas was blown onto the microsheet, the time for the intensity to change until it became constant was 0.7 seconds, whereas the nanosheet (150 nm thickness) was less than 0.1 seconds.
  • the region of change in the strength of the microsheet is larger than that of the nanosheet. Therefore, the nanosheet has a high spatio-temporal resolution compared to a 1 ⁇ m thick microsheet cage. The results indicated that a film thickness of at least less than 1 ⁇ m is desirable to achieve high spatiotemporal resolution.
  • FIG. 6 shows the change over time in the ratio of the phosphorescence intensity of MilliQ water aerated with nitrogen gas or oxygen gas to the phosphorescence intensity obtained by measuring MilliQ water left in an atmospheric environment.
  • Milli-Q water aerated with nitrogen gas gradually decreases from about 2.5 times the phosphorescence intensity of milli-Q water in the atmospheric environment, and decreases to phosphorescence intensity in milli-Q water in the atmospheric environment after about 15 minutes. did.
  • Milli-Q water ventilated with oxygen gas gradually increased from 0.7 times the phosphorescence intensity of Milli-Q water in the atmospheric environment, and increased to the phosphorescence intensity of Milli-Q water in the atmospheric environment after about 10 minutes.
  • nanosheet carrying PtOEP can be used not only as a sensor for oxygen concentration in gas but also as a sensor for dissolved oxygen in water.
  • nanosheets have excellent adhesion to various articles because of their thin film thickness, and various articles without using adhesives or adhesives. It can be attached to the skin surface. Then, it verified whether the function as an oxygen sensor could be exhibited in the state stuck on the skin.
  • the nanosheet 3 was produced using a mixed solution of PMMA: 2.0 wt% and EuDT: 0.05 wt%, and the nanosheet 4 was produced by mixing polystyrene (PS): 2.0 wt% and Rhodamine 800: 0.05 wt%. The solution was used.
  • the thickness of the obtained nanosheet 3 was 163 ⁇ 13 nm, the surface roughness was 9 ⁇ 4 nm, the thickness of the nanosheet 4 was 167 nm ⁇ 14 nm, and the surface roughness was 8 ⁇ 4 nm.
  • the laminated film affixed to the dorsal flight muscle was irradiated with excitation wavelengths for EuDT and Rhodamine® 800 (EuDT was in the 405 nm band and Rhodamine® 800 was in the 640 nm band), and respective fluorescence images were acquired (left figure in FIG. 9C). , Middle figure). Further, from these fluorescence images, the fluorescence image of Rhodamine® 800 was used as a reference, and the fluorescence image of EuDT was processed by the ratiometric method. That is, the signal intensity of the temperature-sensitive EuDT channel was divided by the signal intensity of the temperature-insensitive Rhodamine-800 channel (right figure in FIG. 9C). It was shown that the image obtained by this ratiometric method can correct the intensity change caused by the focal plane change caused by the movement of the measurement object or the displacement of the microscope.
  • FIG. 10 shows the results of observing temporal changes in fluorescence intensity from EuDT-supported nanosheets and Rhodamine 800-supported nanosheets at this time.
  • the left figure shows the measured ROI, and the right figure shows the change over time in the average luminescence intensity of EuDT and Rhodamine 800.
  • EuDT showed temperature sensitivity, and observed a cycle of increase and decrease in fluorescence intensity with intermittent temperature changes at a constant fluorescence intensity range with good reproducibility.
  • Rhodamine® 800 was insensitive to temperature changes.
  • the temperature change was repeated 950 times in the EuDT-supported nanosheet (40 millisecond excitation was repeated 950 times at 1 second intervals), a stable change in fluorescence intensity was exhibited.
  • FIG. 11 shows the relationship between the flight muscle temperature change and the fluorescence intensity ratio of EuDT / Rhodamine 800 obtained by measuring by infrared thermography when the flight muscle was heated with laser light and the temperature was raised.
  • the fluorescence intensity ratio was calculated using Image J (https://imagej.nih.gov/ij/).
  • Image J https://imagej.nih.gov/ij/.
  • the flight muscle temperature and EuDT / Rhodamine 800 fluorescence intensity ratio showed a good linear relationship, showing a change in the fluorescence intensity ratio of 1.38% / ° C during heating and 1.72% / ° C during heat dissipation (FIG. 11B). ).
  • results The results are shown in FIG.
  • the temperature rise at ROI (region of interest) 4 and 5 near the flight muscle midline is 3.00 ° C and 3.55 ° C respectively, and the temperature rises toward the outside, 4.10 ° C at ROI 1 and 4.79 at ROI 8.
  • a temperature rise of °C was shown. From the result of this temperature mapping, the shape of the muscle fiber of the beetle flight muscle was drawn, and the nonuniformity of the flight muscle fever during the beetle stimulation was clarified.
  • the vertical axis of the graph represents the normalized luminescence intensity, and the fluorescence intensity of RhodaminedB and NIRrhod101 is described as 100% in a focused state.
  • the distance between the subject and the image receiving device shifts from the focal plane to 4 ⁇ m and 8 ⁇ m, that is, so-called out-of-focus, the received light intensity in the measuring device that receives the fluorescence decreases.
  • the size of the image increases. That is, since the total light emission amount does not change, the light reception amount per unit area is reduced accordingly.
  • the ratiometric method is essential in order not to impair the accuracy when measuring over time with respect to physical or chemical changes in the living body.
  • such correction by the ratiometric method is not only a defocusing but also a subject that emits fluorescence having a compound sensitive to physical or chemical parameters due to the motion of the subject and the fluorescence received.
  • the corrected image can be obtained by calculating the ratio with the reference fluorescence as in the case of the defocusing. You can get it.
  • a micro-thickness oxygen concentration sensing sheet was fabricated on a glass plate (thickness 0.12 to 0.17 mm) using the stencil method (PS 2.0 wt%, PtOEP 0.005 wt%). Furthermore, nitrogen gas was blown at the same pressure on both sheets of PS nanosheets (thickness: 150 nm) carrying PtOEP on the same glass plate, and the results of changes in the phosphorescence intensity of PtOEP in the microsheets and nanosheets were 29 fps. Monitored with a video camera at a shooting speed of. In this embodiment, both sheets were excited by a UV lamp (excitation light 365 nm).
  • nanosheets When comparing the reaction rate of phosphorescence intensity of PtOEP to nitrogen gas flow, nanosheets showed higher spatiotemporal resolution than microsheets in terms of oxygen sensitivity (ie, spatial resolution> 4 times, temporal resolution> 10 times) ( Figure) 4).
  • the time required to change the environmental parameters (gas permeation, temperature increase) in the sensor also decreases.
  • the sensor thickness is less than 1 ⁇ m, the exchange of gas and heat is faster than the microsheet, which indicates a high spatio-temporal resolution for the nanosheet.
  • the results show the importance of film thicknesses of less than 1 micrometer and improve the sensitivity and usefulness of thin film photoluminescence sensors for environmental and biomedical applications.
  • a microsheet shows the spatio-temporal resolution of a 1 ⁇ m sheet (referred to as a microsheet).
  • the time resolution when nitrogen gas was blown onto the microsheet, the time for the intensity to change until it became constant was 0.7 seconds, whereas the nanosheet (film thickness 150 nm) was less than 0.1 seconds.
  • the region of change in the strength of the microsheet is larger than that of the nanosheet. Therefore, the nanosheet has higher spatio-temporal resolution than a microsheet having a thickness of 1 ⁇ m or more. From this result, a thickness of at least less than 1 ⁇ m is desirable to achieve high spatiotemporal resolution.
  • Adhesion Nanosheets carrying sensor compounds can be easily attached to various surfaces via mesh, wire loops, or water pressure (FIGS. 2 and 7).
  • the oxygen sensitivity of PtOEP-supported PS nanosheets on the skin surface is shown (FIG. 7).
  • the microsheets carrying the sensor compound found in Prior Art Documents 1 and 2 are not flexible and cannot be attached to the surface without using an adhesive or a pressure-sensitive adhesive.
  • the adhesion exhibited by the nanosheet is understood to expand the application of the nanosheet carrying the sensor compound as a sensor.
  • the calculated ratio value showed an accurate change with respect to the temperature rise and fall with the heat generation from the flight muscle (the flight muscle temperature change was monitored using an infrared thermography camera and correlated) (FIG. 11). From this, it can be said that the sensor system using the nanosheet can be measured even in a minute living tissue such as a beetle flying muscle. Infrared thermography cameras have a problem that the limit of absorption of infrared rays by water and spatial resolution is only 10 ⁇ m in living body imaging. Therefore, this nanosheet sensor is expected to be a promising tool in mapping the temperature of wet surfaces such as tissue. This nanosheet sensor can map the surface temperature by analysis of image J (FIG. 12).
  • the ultrathin film sensor of the present invention uses a ratiometric method.
  • the ratiometric method as shown in FIG. 13, for the luminescence intensity reduction from luminescent compounds sensitive to physical or chemical parameters due to subject movement or defocus, The ratio of the luminescence intensity from the reference compound is used to map the physical or chemical parameter to be measured. As a result, it is possible to correct a change in the amount of received light in the measuring apparatus due to the movement of the subject or the defocus.
  • Luminescent compounds sensitive to physical or chemical parameters and luminescent compounds insensitive to physical or chemical parameters At least two luminescent compounds of the compound are used in the ratiometric method. These various luminescent compounds are likely to interfere with accurate physical or chemical parameter measurements by causing fluorescence resonance energy transfer to each other or to each other and attenuating luminescence. .
  • the ultra-thin photoluminescence sensor of the present invention a single nanosheet contains only one kind of luminescent compound, and since such nanosheets are stacked and used, a plurality of luminescent compounds are converted into fluorescence resonance energy transfer (FRET). ) Is not close to the nanosheet interface. Therefore, it is understood that the ultrathin film photoluminescence sensor of the present invention has no or very little influence of fluorescence resonance energy transfer.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • an extremely thin (150 to 200 nm thick) sensor compound-supporting nanosheet was constructed. It was confirmed that these nanosheet sensors have high spatiotemporal resolution and can be applied to any type of surface. Furthermore, the two-layer nanosheet sensor of sensor nanosheet and reference nanosheet was able to achieve the measurement by the ratiometric method that more accurately measures the surface parameters. These characteristics were not found in the sensor compound-carrying sheet having a micrometer thickness.
  • Nanosheet 1 PtOEP-supported PS nanosheet, oxygen sensor
  • Figs. 4 and 5 High spatio-temporal resolution
  • the present invention is useful for environment measurement in outer space, the sea floor, disasters and security, and particularly for preventing accidents in extreme environments where high spatiotemporal resolution is required.
  • Nanosheet 3 (EuDT-supported PMMA nanosheet: temperature sensor) and Nanosheet 4 (Rhodamine 800-supported PS nanosheet: reference of temperature sensor) as biological tissue imaging (FIGS. 9 to 12).
  • the two-layer structure was easily constructed and could be applied to muscle tissue without using an adhesive or adhesive (FIGS. 2, 7, and 9 to 12).
  • These nanosheet sensors were able to measure temperature changes in minute tissues (FIGS. 11 and 12). It can also be applied to wet surfaces such as living tissue. From these results, the nanosheet sensor is promising for biological surface mapping using a microscope or an endoscope.
  • the ultra-thin luminescence sensor of the present invention can be applied to a wide range of functions such as functional management of living tissues during surgery including management of transplanted organs and quality control seals for monitoring changes in food temperature.

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Abstract

複数の高分子ナノシートを含む積層膜からなる超薄膜光ルミネッセンスセンサーであって、前記積層膜は、測定対象である物理的又は化学的パラメータに対して光学特性が変化するルミネッセンス化合物を担持する少なくとも1つの高分子ナノシートを含む超薄膜光ルミネッセンスセンサー、さらに、前記物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のルミネッセンス化合物をリファレンス化合物として担持する高分子ナノシートをレシオメトリック法のためのリファレンスナノシートを含む超薄膜光ルミネッセンスセンサー及びその使用方法等を提供する。

Description

超薄膜光ルミネッセンスセンサー
　本発明は、超薄膜光ルミネッセンスセンサーに関する。
　極めて重大な事故の発生を避けるために、特に宇宙空間・海底・災害・安全保障などの極限環境下において、作業環境に由来する物理量又は化学量（例：ガス濃度、温度、pH）をモニターすることは重要である。このため、これらの値を検出、モニターするために、金属電極上に変換物質として機能するものを有する電極方式を利用した電気化学的センサーが通常利用されてきた。しかし、電気化学的センサーは、外部電源や設備との有線接続を要し、デザイン、サイズや設置場所に制限や限界がある。
　柔軟な形状で、さまざまな物理量又は化学量を有線接続でなくカメラで光学的に検出可能なセンサーが強く求められている。このような背景のもと、酸素／pH感受性を有し、物理的又は化学的な作用により発光強度が変化する蛍光分子を含有した薄膜状光ルミネッセンスセンサーが長い間研究開発されているが、時空間分解能や貼付性の低さが課題である（特許文献１、非特許文献１）。
国際公開公報パンフレットWO2003036293 A1(2003)
S. Schreml他 「Luminescent Dual Sensors Reveal Extracellular pH-Gradients and Hypoxia on Chronic Wounds That Disrupt Epidermal Repair」, Theranostics 2014, Vol. 4, Issue 7 pp721-735．
　酸素／pH感受性を有し、物理的又は化学的な作用により発光強度が変化する蛍光分子を含有した薄膜状光ルミネッセンスセンサーが長い間研究開発されているが、時空間分解能や貼付性の低さが課題である。
　本発明は、複数の高分子ナノシートを含む積層膜からなる超薄膜光ルミネッセンスセンサーであって、前記積層膜は、測定対象である物理的又は化学的パラメータに対して光学特性が変化するルミネッセンス化合物を担持する少なくとも1つの高分子ナノシートを含む超薄膜光ルミネッセンスセンサーを提供する。
　前記超薄膜光ルミネッセンスセンサーは、さらに、前記物理的又は化学的パラメータに対して異なる光学特性を有するルミネッセンス化合物を担持する少なくとも1つの高分子ナノシートを含む場合がある。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーにおいて、前記物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のルミネッセンス化合物をリファレンス化合物として担持する高分子ナノシートをレシオメトリック法のためのリファレンスナノシートとして含む場合がある。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーにおいて、前記物理的又は化学的パラメータが、ガス濃度、酸素濃度、窒素濃度、圧力、温度、金属イオン濃度、pH、膜電位及び活性酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１種である場合がある。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーにおいて、前記ルミネッセンス化合物が、酸素又は圧力に対して感受性を有する化合物、温度感受性を有する化合物、pH感受性を有する化合物、CO2ガス感受性を有する化合物、カルシウム感受性を有する化合物、亜鉛感受性を有する化合物、マグネシウム感受性を有する化合物、ナトリウム感受性を有する化合物、膜電位感受性を有する化合物、及び、活性酸素感受性を有する化合物からなる群から選択される少なくとも１種である場合がある。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーにおいて、前記ルミネッセンス化合物は、酸素又は圧力の感受性を有する化合物がPtOEP(platinum octaethylporphyrin)から、温度感受性を有する化合物がEuDT (Eu-tris (dinaphthoylmethane)-bis-trioctylphosphine oxide)、EuTTA (Eu-thenolytrifluoroacetonate)及びローダミンB（Rhodamine B）から、pH感受性を有する化合物が2',7'-Dichlorofluorescein及びfluoresceinから、CO2ガス感受性を有する化合物がベンゾビスイミダゾリウム（Benzobisimidazolium）から、カルシウム感受性を有する化合物がFluo4TMから、亜鉛感受性を有する化合物がFluoZinTM (FluoZin-1TM、FluoZin？-2及び、FluoZin-3TM）から、マグネシウム感受性を有する化合物がMag-Fuar-2TMから、ナトリウム感受性を有する化合物がCoroNa GreenTMから、膜電位感受性を有する化合物がANEPPS (Di-4-ANEPPS、Di-8-ANEPPS）から、並びに、活性酸素感受性を有する化合物がCellROXRから選択される少なくとも１種である場合がある。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーにおいて、前記ルミネッセンス化合物がシート表面に導入される化合物であって、該化合物は、カルシウム感受性を有する化合物、pH感受性を有する化合物、活性酸素感受性を有する化合物、ATP感受性を有する化合物、cAMP感受性を有する化合物、cGMP感受性を有する化合物、及び、グルタミン酸感受性を有する化合物からなる群から選択される少なくとも1種である場合がある。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーにおいて、前記ルミネッセンス化合物が、シート表面に導入される化合物であって、カルシウム感受性を有する化合物がGCamPから、pH感受性を有する化合物がpHTomatoから、活性酸素感受性を有する化合物がHyperから、ATP感受性を有する化合物がPercevalから、cAMP感受性を有する化合物がFlamindoから、cGMP感受性を有する化合物がFlincGから、グルタミン酸感受性を有する化合物がiGluSnFRからなる群から選択される少なくとも1種である場合がある。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーにおいて、前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のリファレンス化合物が、有機蛍光化合物、有機金属錯体、無機蛍光材料、カーボン及びナノチューブ（近赤外線）からなる群から選択される少なくとも１種である場合がある。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーにおいて、前記有機蛍光化合物がRhodamine101及びRhodamine800から、有機金属錯体がイリジウム錯体（Irppy3）から、並びに、無機蛍光材料がQuantumDotからなる群から選択される少なくとも1種である場合がある。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーにおいて、前記超薄膜光ルミネッセンスセンサーの厚さが1μm未満又は500nm未満、好ましくは500nm未満である場合がある。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーにおいて、前記高分子ナノシートは、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリスチレン(PS)、ポリエステル、エラストマー、導電性ポリマー及び多糖類からなる群から選択される少なくとも1種を製膜した高分子ナノシートである場合がある。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーは、細胞培養関連基材への貼付用ナノシートとして使用される場合がある。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーにおいて、細胞培養関連基材は、シャーレ、ガラス又はマルチプレートウェルから選択される場合がある。
　また、本発明は、超薄膜光ルミネッセンスセンサーを使用して被験体の物理的若しくは化学的パラメータ又はその変化を測定する方法であって、前記超薄膜光ルミネッセンスセンサーは、複数の高分子ナノシートの積層膜であり、前記積層膜は、測定対象である物理的又は化学的パラメータに対して光学特性が変化するルミネッセンス化合物を担持する少なくとも１つの高分子ナノシートを含む方法を提供する。
　前記方法は、さらに、前記物理的又は化学的パラメータに対して異なる光学特性を有するルミネッセンス化合物を担持する少なくとも1つの高分子ナノシートを含む場合がある。
　本発明の方法において、前記物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のルミネッセンス化合物をリファレンス化合物として担持する高分子ナノシートをリファレンスナノシートとして用い、
　前記ルミネッセンス化合物からのルミネッセンスの測定強度に対して、前記リファレンス化合物からのルミネッセンスの測定強度の比を算定し、
　測定デバイスにおける測定値をレシオメトリック法によって補正する場合がある。
　本発明の方法において、前記物理的又は化学的パラメータは、ガス濃度、酸素濃度、窒素濃度、圧力、温度、金属イオン濃度、pH、膜電位及び活性酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１種である場合がある。
　本発明の方法において、前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して感受性を有するルミネッセンス化合物は、酸素又は圧力に対して感受性を有する化合物がPtOEPから、温度感受化合物を有する化合物がEuDT、EuTTA及びRhodamine Bから、pH感受性を有する化合物が2',7'-Dichlorofluorescein及びfluoresceinから、CO2ガス感受性を有する化合物がBenzobisimidazoliumから、カルシウム感受性を有する化合物がFluo4から、亜鉛感受性を有する化合物がFluoZinから、マグネシウム感受性を有する化合物がMag-Fuar-2から、ナトリウム感受性を有する化合物がCoroNa Greenから、膜電位感受性を有する化合物がANEPSから、並びに、活性酸素感受性を有する化合物がCellROXから選択される場合がある。
　本発明の方法において、前記測定対象のパラメータに対して感受性を有するルミネッセンス化合物は、シート表面に導入される化合物であって、カルシウム感受性を有する化合物、pH感受性を有する化合物、活性酸素感受性を有する化合物、ATP感受性を有する化合物、cAMP感受性を有する化合物、cGMP感受性を有する化合物、グルタミン酸感受性を有する化合物からなる群から選択される少なくとも1種である場合がある。
　本発明の方法において、前記測定対象のパラメータに対して感受性を有するルミネッセンス化合物は、シート表面に導入される化合物であって、カルシウム感受性を有する化合物がGCamPから、pH感受性を有する化合物がpHTomatoから、活性酸素感受性を有する化合物がHyperから、ATP感受性を有する化合物がPercevalから、cAMP感受性を有する化合物がFlamindoから、cGMP感受性を有する化合物がFlincGβから、グルタミン酸感受性を有する化合物がiGluSnFRから選択される少なくとも1種である場合がある。
　本発明の方法において、前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のリファレンスルミネッセンス化合物が、有機蛍光化合物、有機金属錯体及び無機蛍光材料からなる群から選択される少なくとも１種である場合がある。
　本発明の方法において、前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のリファレンス化合物は、有機蛍光化合物がRhodamine101又はRhodamine800から、有機金属錯体がイリジウム錯体（Irppy3）から、及び、無機蛍光材料がQuantumDotやカーボン又はナノチューブ（近赤外線）から選択される少なくとも１種である場合がある。
　本発明の方法において、前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して感受性を有するルミネッセンス化合物が、酸素又は圧力に対して感受性を有する化合物、温度感受化合物を有する化合物、pH感受性を有する化合物、CO2ガス感受性を有する化合物、カルシウム感受性を有する化合物、亜鉛感受性を有する化合物、マグネシウム感受性を有する化合物、ナトリウム感受性を有する化合物、膜電位感受性を有する化合物、及び、活性酸素感受性を有する化合物からなる群から選択される少なくとも１種である場合がある。
　本発明の方法において、前記パラメータが、温度、ガス濃度、酸素濃度、窒素濃度、金属イオン濃度及びpHからなる群から選択される少なくとも1種である場合がある。
　本発明の方法において、前記超薄膜光ルミネッセンスセンサーの厚さが、1μm未満又は500nm未満、好ましくは500nm未満であり、より好ましくは200nm未満である場合がある。
　本発明の方法において、前記高分子ナノシートは、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリスチレン(PS)、ポリエステル、エラストマー、導電性ポリマー及び多糖類からなる群の少なくとも1種を製膜した高分子ナノシートである場合がある。
　本発明により、温度、酸素及びpH感受性を有し、これらの物理量や化学量の変化により発光強度が変化する蛍光分子を含む超薄膜状光ルミネッセンスセンサーであって、厚さ（膜厚：数十マイクロメートル）に起因する時空間分解能や貼付性の低さが改善され、時空間分解能と貼付性の高いナノシートを有する超薄膜状光ルミネッセンスセンサーを提供できる。
本発明のナノシート及びその積層膜を製造する工程、及び、ナノシートに担持したルミネッセンス化合物を表した図。 PtOEP担持ナノシートの高い接着性を表す可視光写真及び蛍光写真を表す図。a:皮膚表面、b:コイン、c:プラスチックモデル、d:プラスチックモデルにPtOEP担持ナノシートを各マーキング部位に貼付した物品に対して、上段は可視光写真、下段はPtOEPの蛍光写真を表す。 細胞培養用ディッシュ（ガラスボトムディッシュ）にナノシートを用いて脳スライスを固定した画像図。上段左図：脳スライスを固定した細胞培養用ディッシュの全体写真の図、上段右図：光学顕微鏡写真図、下段左図：脳スライスにナノシートを貼付した模式図、下段右図：PtOEPの蛍光顕微鏡写真図。 PtOEP担持ナノシート及びRhodamine 101担持ナノシートの蛍光スペクトル図；図３Ａ：PtOEP担持ナノシートの酸素各種濃度下における蛍光スペクトル図；図３Ｂ：PtOEP担持ナノシートの蛍光強度に対する酸素各種濃度の影響をシュテルン-フォルマー（Stern- Volmer）プロットで表した図；図３Ｃ：PtOEP担持ナノシートとRhodamine 101担持ナノシートの積層膜の酸素各種濃度下における蛍光スペクトル図。 PtOEP担持ナノシートの時空分解能を評価した図； PtOEP担持ナノシートとPtOEP担持マイクロシートの空間分解能を比較した図（左側：ナノシート、右側：マイクロシート）。 PtOEP担持ナノシートの時空分解能を評価した図；PtOEP担持ナノシートとPtOEP担持マイクロシートの時間分解能を比較した図。 PtOEP担持ナノシートとPtOEP担持マイクロシートの時間分解能をビデオカメラで撮影して、各フレームの画像を時系列に比較した図；実験の模式図　PET基板上に貼付したナノシート酸素センサーと厚さ1 μm以上の酸素センサーの模式図。 PtOEP担持ナノシートとPtOEP担持マイクロシートの時間分解能をビデオカメラで撮影して、各フレームの画像を時系列に比較した図；PtOEP担持PSナノシート及び1 μm以上のマイクロシートの蛍光像及び模式図。 PtOEP担持ナノシートとPtOEP担持マイクロシートの時間分解能をビデオカメラで撮影して、各フレームの画像を時系列に比較した図；時空間分解能の比較結果。 水中の溶存酸素各種濃度の変化をPtOEP担持ナノシートで経時的に観測した結果を表す図。 PtOEP担持ナノシートをヒト上腕皮膚上に貼付し、窒素気流及び酸素気流を吹き付けた可視光及び蛍光写真の図。a)窒素気流を吹き付けた時の可視光写真、b)窒素気流を吹き付けた時の蛍光写真、c)酸素気流を吹き付けた時の可視光写真、d)酸素気流を吹き付けた時の蛍光写真。 EuDT ナノシートの蛍光に与える各種温度の影響を表す図。図８Ａ：EuDT担持ナノシートの蛍光スペクトルを表す図；図８Ｂ：温度を変化した時のEuDT担持ナノシートの蛍光強度と温度との関係とを表す図；図８Ｃ：Rhodamine 800担持ナノシートの蛍光スペクトルを表す図；図８Ｄ：温度を変化した時のRhodamine 800担持ナノシートの蛍光強度と温度との関係を表す図。 甲虫(Dicronorrhina derbyana)背側の飛翔筋へのEuDT担持ナノシートとRhodamine 800担持ナノシートとの積層膜の各蛍光画像及びレシオメトリック法で処理した画像の図。図９Ａ：貼付位置の説明図（左側飛翔筋に貼付の場合）；図９Ｂ：積層膜を貼付した飛翔筋の可視光写真；図９Ｃ：EuDT担持ナノシートによる蛍光画像（左）、Rhodamine 800担持ナノシートによる蛍光画像（中）、及び、レシオメトリック法で処理した画像（右）。 甲虫の飛翔筋にEuDT担持ナノシートとRhodamine 800担持ナノシートとの積層膜を貼付し、赤外線レーザーを間歇的に照射し、飛翔筋温度を変化させた時のEuDT及びRhodamineからの蛍光強度を経時的に観測した結果を表す図。左図：関心領域(ROI)を表した図。右図：経時的な蛍光強度の変化を表す図。 EuDT担持ナノシートとRhodamine 800担持ナノシートとの積層膜による温度変化測定と赤外線サーモグラフィーによる温度変化測定との温度分解能を比較した図。図１１Ａ：関心領域(ROI)を示した図；図１１Ｂ：関心領域における加温時と放熱時の温度と蛍光強度との関係をプロットした図。なお、▲は、加温時と放熱時の各温度における温度分解能（正規化比率の標準偏差を温度感受性のプロットの傾き)で割った値）を表す。；図１１Ｃ：ROIの面積を変化した場合における各種温度における温度分解能を表した図。 甲虫の飛翔筋にEuDT担持ナノシートとRhodamine 800担持ナノシートとの積層膜を貼付した状態で、甲虫の自発運動による温度変化を観測した画像、及び、各ROIにおける温度変化の数値を表す図。上段左図：測定したROIを示した図；上段右図：刺激前、刺激後、放熱後の温度変化をマッピングした画像；下段表：各ROIにおける変化温度の測定値。 レシオメトリック法を用いるルミネッセンスセンサーナノシートでの所望とする物理的又は化学的パラメータの画像による二次元的な観測において、焦点ずれによる測定装置の受光密度の変化（所謂ピンボケ）に対してレシオメトリック法で補正可能であることを表す参考図。Rhodamine Bの担持シートとNIRrhod101の担持シートとを、焦点ずれを惹起して得られた画像とその時の蛍光強度のプロット、及び、レシオメトリック法で補正したプロットを表した図。
１．超薄膜光ルミネッセンスセンサー
　本発明の実施形態の1つは、複数の高分子ナノシートを含む積層膜からなる超薄膜光ルミネッセンスセンサーであって、前記積層膜は、測定対象である物理的又は化学的パラメータに対して光学特性が変化するルミネッセンス化合物を担持する少なくとも１つの高分子ナノシートを含む超薄膜光ルミネッセンスセンサーである。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーは、さらに、前記物理的又は化学的パラメータに対して異なる光学特性を有するルミネッセンス化合物を担持する少なくとも1つの高分子ナノシートを含むことができる。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーは、センサー層とリファレンス層の少なくとも二層の高分子ナノシートが互いに積層されることにより構築された超薄膜光ルミネッセンスセンサーとすることが可能であり、該超薄膜光ルミネッセンスセンサーは、レシオメトリックな蛍光又は発光センサーとして使用できる。センサー層は、測定パラメータに対して感受性を有する又は前記物理的又は化学的パラメータの種類が相違する異なった光学特性を有する蛍光化合物又はりん光化合物をナノシート中に含むことにより、物理的又は化学的パラメータを測定するようにデザインされており、リファレンス層（以下、「リファレンスナノシート」と記載する）は、それらの測定パラメータに対して感受性を有しない又は感受性が小さいリファレンスルミネッセンス化合物を含んでいる。各ナノシート層は、厚さ1μm未満、好ましくは500nm未満、より好ましくは200nm未満の柔軟な高分子層からなる。なお、高分子ナノシートについては、例えば、T. Fujie、S. Takeoka, 「Advances in Nanosheet Technology Towards Nanomedical Engineering in Nanobiotechnology」、 D. A. Phoenix 及びA. Waqar編、 One Central Press、英国、 2014、pp.68-94.を参照することができる。
　本明細書において、「超薄膜」とは、「薄膜」と比較して、十分に膜厚が小さいとの意味で使用される。例えば、本明細書において記載される膜厚が1μm未満のナノシートは、膜厚が1μm以上のマイクロシートと比較して、物体に対する貼付性が顕著に優れ、膜ルミネッセンスセンサーとして使用する場合にも、時間分解能、空間分解能がマイクロシートよりも顕著に優れる。また、本発明は、係る超薄膜を積層するものの、その総膜厚は1μm未満であり、前記の1μm以上の膜厚の薄膜シートとは、積層した状態においても顕著に優れている。
　本明細書において、かかる1μm未満の、好ましくは500nm未満の、より好ましくは200nm未満のナノシート層を有する超薄膜を、「ナノシート」と記載する場合がる。
　本明細書において、「ルミネッセンス」とは、化合物等の物質が物理的又は化学的な作用によってエネルギーを受け取って遷移状態に励起され、基底状態に戻る際に放出されるエネルギーによる蛍光又はりん光等の発光現象及びその放射光をいい、本発明においては、好ましくは、ルミネッセンスの中でも、光によって励起される光ルミネッセンス（フォトルミネッセンス）をいう。
　本明細書において、「ルミネッセンス化合物」とは、ルミネッセンス現象、好ましくは、光ルミネッセンス現象を惹起可能な化合物をいい、一般に「蛍光化合物」、「りん光化合物」、「蛍光色素」及び「りん光色素」と言われる化合物を含む。
　本明細書で前記「ルミネッセンス化合物」とは、測定の対象とする物理的又は化学的パラメータに感受性の「ルミネッセンス化合物」と、非感受性若しくは感受性が小さい又はルミネッセンス化合物が感受性を有する物理的又は化学的パラメータとは相違する物理的又は化学的パラメータに感受性を有する「リファレンスルミネッセンス化合物」とに分類され、本明細書において特に説明しない限り「ルミネッセンス化合物」は測定の対象とする物理的又は化学的パラメーターに対して感受性を有するルミネッセンス化合物をいう。
　本明細書において、「リファレンスルミネッセンス化合物」を、以下「リファレンス化合物」と記載する。該「リファレンス化合物」は、測定対象とする物理的又は化学的特性に対して非感受性又は感受性が小さい特性を利用し、主に、レシオメトリック法におけるリファレンス化合物として使用される。また、リファレンス化合物の蛍光を「リファレンス蛍光」と、その蛍光を発する化合物を「リファレンス蛍光化合物」と、リファレンス化合物のりん光を「リファレンスりん光」と、そのりん光を発する化合物を「リファレンスりん光化合物」と記載する場合がある。
　本明細書において、「レシオメトリック法」とは、放射光波長の異なる少なくとも2種類のルミネッセンス化合物、又は2種類の異なる放射光波長をもつ少なくとも1種類のルミネッセンス化合物を使用し、各化合物から放出されるルミネッセンス、及び、リファレンスルミネッセンスの各放射光量又は測定装置における各受光量の比率を利用する方法であって、前記受光量の比率を用いて、動作又は照射光量の変化に基づく前記ルミネッセンス化合物の受光量の変化を補正し、放射光量を算出する方法を含む。さらに、放射光波長に限らず、同じ放射光波長であるが、2種類以上の異なる励起波長で計測する手法も含む。
　レシオメトリック法は、例えば、測定対象とする物理的又は化学的パラメータに対して感受性を有するルミネッセンス化合物と、非感受性のリファレンス化合物とを用い、同一二次元画像上の同一位置のルミネッセンス化合物からの発光量と、リファレンス化合物からの発光量とを、励起光波長及び／又は放射光波長の相違に基づいて分別して測定し、リファレンス化合物に対するルミネッセンス化合物の発光量の比を求めることにより実施できる。より具体的には、例えば、波長フィルターを使用し、ルミネッセンス化合物の励起波長を含む波長幅の励起光とリファレンス化合物の励起波長を含むは超幅の励起光とを、短時間に交互にスイッチングし、これに呼応した発光の波長を測定装置（受像機）で分別測定して、両化合物からの発光の受光量の比を求めることにより、被写体の動作の受光量に及ぼす影響、測定装置の焦点ずれ（所謂、ピンボケ）による受光量に及ぼす影響を補正することができる。
　本明細書において、「光学特性が相違する」とは、ルミネッセンス化合物に対する励起波長及び／又は放射波長が相違することを意味する。
　本発明において、測定対象である物理的又は化学的パラメータの例として、ガス濃度、酸素濃度、窒素濃度、圧力、温度、金属イオン濃度、pH、膜電位及び活性酸素濃度等が挙げられる。
　前記の物理的又は化学的パラメータに対する感受性は、例えば、ルミネッセンス化合物が、前記物理的又は化学的パラメータを反映する又は前記物理的又は化学的パラメータが影響を与える化学物質により惹起される発光又は可逆的な消光等によってもたらされる。
　本明細書において、物理的又は化学的パラメータの種類が相違する異なった光学特性を有するルミネッセンス化合物の例としては、前記物理的又は化学的パラメータに対して、異なった励起波長及び／又は異なった放射波長を有するルミネッセンス化合物が挙げられる。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーにおいて、前記ルミネッセンス化合物の例として、酸素又は圧力に対して感受性を有する化合物、温度感受性を有する化合物、pH感受性を有する化合物、CO2ガス感受性を有する化合物、カルシウム感受性を有する化合物、亜鉛感受性を有する化合物、マグネシウム感受性を有する化合物、ナトリウム感受性を有する化合物、膜電位感受性を有する化合物、及び、活性酸素感受性を有する化合物が挙げられ、これらの化合物から選択できる。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーにおいて、前記ルミネッセンス化合物は、酸素又は圧力の感受性を有する化合物がPtOEP (platinum octaethylporphyrin)から、温度感受性を有する化合物がEuDT (Eu-tris(dinaphthoylmethane)-bis-trioctylphosphine oxide)、EuTTA (Eu-thenolytrifluoroacetonate)及びローダミンB（Rhodamine B）から、pH感受性を有する化合物が2',7'-Dichlorofluorescein及びfluoresceinから、CO2ガス感受性を有する化合物がベンゾビスイミダゾリウム（Benzobisimidazolium、J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, pp 17846？17849）から、カルシウム感受性を有する化合物がFluo4TM（1－[2－アミノ-5-（２，７－ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-9-キサンテニル）フェノキシ]-2-（2-アミノ-5-メチルフェノキシ）エタン-N,N,N',N'-四酢酸,ベンタアセトキシメチルエステル）から、亜鉛感受性を有する化合物がFluoZinTM (FluoZin-1TM:2-[N-(carboxymethyl)-4-(2,7-difluoro-3-oxido-6-oxoxanthen-9-yl)-2-methoxyanilino]acetate、FluoZin？-2:Glycine, N-(carboxymethyl)-N-[4-[[(2',7'-difluoro-3',6'-dihydroxy-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H), 9'-[9H]xanthen]-5-yl]carbonyl]amino]2-methoxyphenyl]-, tetrapotassium salt及び、FluoZin-3TM: 2-[2-[2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]-5-methoxyphenoxy]ethoxy]-4-(2,7-difluoro-3-oxido-6-oxo-4a,9a-dihydroxanthen-9-yl)anilino]acetate)から、マグネシウム感受性を有する化合物がMag-Fuar-2TM(5-Oxazolecarboxylic acid, 2-[5-[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethoxy]-6-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-2-benzofuranyl]-(acetyloxy)methyl ester)から、ナトリウム感受性を有する化合物がCoroNa GreenTM（Meier SDら、J Neurosci Methods. 2006, 15;155(2):251-9）から、膜電位感受性を有する化合物がANEPPS (AminoNaphthylEthenylPyridinium誘導体、Di-4-ANEPPS: 3-(4-[2-[6-(dibutylamino)naphthalen-2-yl]ethenyl]pyridinium-1-yl)propane-1-sulfonate) ；Di-8-ANEPPS ：4-(2-[6-(Dioctylamino)-2-naphthalenyl]ethenyl)-1-(3-sulfopropyl)pyridinium inner salt）から、並びに、活性酸素感受性を有する化合物がCellROXR(Ahn HYら、J Am Chem Soc. 2012, 14;134:4721-30）から選択される化合物が挙げられ、これらの一部は商業的に利用可能であり、これらを入手して、又は、公知の方法で製造して使用できる。
　また、本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーの例として、前記ルミネッセンス化合物はシート表面に結合させることにより導入される化合物を使用することができる。これらの化合物は、カルシウム感受性を有する化合物、pH感受性を有する化合物、活性酸素感受性を有する化合物、ATP感受性を有する化合物、cAMP感受性を有する化合物、cGMP感受性を有する化合物、グルタミン酸感受性を有する化合物等、溶液中のイオンや化合物と直接的に作用して感受性を有する化合物を挙げることができる。例えば、これらの化合物を、NHSとEDC/DCCなどの縮合剤を用いたカップリング反応、アジドーアルキンによるクリックケミストリーなどによってナノシート表面に結合できる。
　このルミネッセンス化合物が、シート表面に導入される化合物の例として、より具体的には、カルシウム感受性を有する化合物がGCamP (Mao Tら、PLoS ONE;2008, 3 e1796)、pH感受性を有する化合物がpHTomato (Li Yら、Nat Neurosci. ; 15: 1047？1053)、活性酸素感受性を有する化合物がHyper (Belousov VVら、Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat. Meth. 2006; 3:281？286）、ATP感受性を有する化合物がPerceval (Berg Jら、Nat. Meth. 2009; 6:161？166)、cAMP感受性を有する化合物がFlamindo　(Fluorescent cAMP indicator)、cGMP感受性を有する化合物がFlincG (Nausch LWら、Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105:365-70、グルタミン酸感受性を有する化合物がiGluSnFR (Marvin JSら、Nat Methods. 2013 Feb;10:162-70)を挙げることができ、これらの化合物は公知の方法で製造して使用できる。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーにおいて、例えば、前記ルミネッセンス化合物の少なくとも１種が、レシオメトリック法のためのリファレンスナノシートとして、測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のリファレンス蛍光又はリファレンスりん光化合物を担持する高分子ナノシートを含むことができる。
　前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のリファレンス化合物の例として、有機蛍光化合物、有機金属錯体、及び、無機蛍光材料が挙げられ、これらの中の少なくとも１種を使用することができる。
　より具体的な例として、前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のルミネッセンス化合物は、有機蛍光色素がRhodamine101(CAS番号 116450-56-7: 2-(1H,2H,3H,5H,6H,7H,11H,12H,13H,15H,16H,17H-pyrido[3,2,1-ij]quinolizino[1',9':6,7,8]chromeno[2,3-f]quinolin-18-ium-9-yl)benzoate, 2-(2,3,6,7,12,13,16,17-octahydro-1H,5H,11H,15H-pyrido[3,2,1-ij]quinolizino[1',9':6,7,8]chromeno[2,3-f]quinolin-4-ium-9-yl)benzoate)、又はRhodamine800 (CAS番号137993-41-0：　9-Cyano-2,3,6,7,12,13,16,17-octahydro-1H,5H,11H,15H-xantheno[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']diquinolizin-18-ium perchlorate）、有機金属錯体がイリジウム錯体（(Irppy)3: イリジウム, トリス[2-(2-ピリジニル-κN)フェニル-κC]）、及び、無機蛍光材料がコロイド状量子ドット（QuantumDot）、並びに、カーボン又はナノチューブ（近赤外線）が挙げられ、これらは商業的に利用可能であり、又は、公知の方法で製造でき、これらを入手又は製造して使用できる。
　本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーにおいて、前記高分子ナノシートの材質の例としては、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリスチレン(PS)、ポリエステル（ポリ乳酸・ポリ乳酸グリコール酸共重合体・ポリカプロラクトンなどの生分解性高分子を含む）、エラストマー、導電性ポリマー及び多糖類等を製膜した高分子ナノシートが挙げられ、これらは、商業的に利用可能であり、又は、公知の方法で製造できる。
　単層又は2層程度のナノシートは、トータル1μm未満という膜厚ゆえに接着剤又は粘着剤なしでさまざまな表面に貼付することが可能である。さらに、種々のパラメータを測定する化合物を含む複数のナノシートを互いに積層させた多層ナノシートにより、マルチパラメータセンサーを容易に構築することが可能となる。測定可能なパラメータの例としては酸素濃度、温度、pHなど（これらに限られない）が挙げられる。光源による励起により、物理的又は化学的パラメータの値に対応した光ルミネッセンスが生成される。さらに、このナノシートセンサーは、膜厚が1μm以上のマイクロシートセンサーと比較して高い時空間分解能を得ることができる。さらに、温度センサーとして使用する場合に、膜厚が薄くなることにより、熱の出入りが速やかとなり、高い応答速度、緩和速度、感受性を得ることができる。また、紫外・可視領域の蛍光を用いることから、それよりも波長の長い赤外線を用いる一般的な赤外線サーモグラフィーと比較して、高い空間分解能を示すことができる。
　これらの本願発明の優れた特性は、下記の方法で製造し、実施できる。
　パラメータ測定のための2層構造のナノシートセンサーの作成方法は、主に以下のステップからなる（図１参照）。
a) 犠牲膜層として、PVAやプルランのような水溶性高分子を基板上に製膜する。
b) センサー化合物およびポリマーを溶媒に溶解させる。この際、溶媒は化合物およびポリマーに対し不活性のものを選択し、ポリマー溶液を作成する。
c) 前記ポリマー溶液を犠牲膜層の上にスピンコートし、ナノシートセンサーを作成する。
d) 水中に浸漬させることで犠牲膜層を溶解させ、自立性(self-standing)のナノシートセンサーを水中にて得る。
e) レシオメトリック測定に用いる際は、前記自立性のナノシートセンサーを水中からメッシュで掬い上げる。この操作はセンサー層、リファレンス層それぞれに対して行う。
f) センサー層をリファレンス層の上に重ね、センサー層側のメッシュをセンサー層から剥がす。この際、上からセンサー層、リファレンス層、メッシュとなる。また、リファレンス層をセンサー層の上に重ねることで、上からリファレンス層、センサー層、メッシュとすることも可能である。
g) 測定対象表面に対して二層ナノシートセンサーを、上からリファレンス層、センサー層、測定対象の順になるように貼り付け、メッシュ側に水や食塩水などの水性の溶媒を加えてメッシュのみを剥がし、測定対象に二層ナノシートセンサーを貼付又は密着させる。
　以下に、より具体的に説明する。
　我々は、膜厚が10から100ナノメーターのオーダーと極めて薄い高分子フィルムを製造し、酸素／温度に感受性を有する又は感受性を有しない蛍光分子が埋め込まれることでフィルムを機能的なものにする簡便な技術を発明した。ナノシートは高分子ポリマーの柔軟性によって高い追従性を有し、ファンデルワールス力により生体組織を含むさまざまな基体上に高い密着性を有する。センサー化合物をナノシート中に埋め込むために、我々は高分子ポリマー、蛍光/りん光化合物及び溶媒の適切な組み合わせを選択した。センサー化合物はナノシートの高分子マトリックス中で作用しなければならない。ポリマーはセンサー化合物の蛍光特性に対して不活性でなければならない。一方、溶媒はポリマーに対して充分な溶解性を持ってなければならない、また、センサー化合物の安定性に影響を与えてはならない。例えば、PMMA (ジクロロメタン、トルエン、エチルアセテート又はアセトン中に溶解する)は、前記化合物のリークが最小となり蛍光強度が安定するので、例えば、ローダミンＢ、EuTTA、EuDT、PtOEPの埋め込みに使用され得る。PS(ジクロロメタン、トルエン又はエチルアセテートに溶解する)は、さらにガス濃度に対する感受性がポリマーの組成を変えることで変化できる。そこでポリマーはPSやPMMAから選択されうる。例えば、我々はPSナノシートが窒素に対して高い感受性を示し、PMMAナノシートが酸素に対して高い感受性を示すことを実証した。しかし、ナノシートは、ポリエステル、エラストマー、導電性ポリマーや多糖類などのさまざまなポリマーを用いて製造され得る。本発明では、上記したポリマー、化合物、及び溶媒の適当な組み合わせが選択される。
２．超薄膜光ルミネッセンスセンサーによって被験体の物理的又は化学的パラメータを測定する方法
　本発明のもう1つの実施態様は、前記の超薄膜光ルミネッセンスセンサーによって被験体の物理的又は化学的パラメータを測定する方法、特に、レシオメトリック法を用いることによって、物理的又は化学的パラメーターを精度の高く測定する方法である。
　より具体的な例としては、超薄膜光ルミネッセンスセンサーを使用して被験体の物理的又は化学的パラメータ又はその変化を測定する方法であって、前記超薄膜光ルミネッセンスセンサーは、複数の高分子ナノシートの積層膜であり、前記積層膜は、測定対象である物理的又は化学的パラメータに対して光学特性が変化するルミネッセンス化合物を担持する少なくとも１つの高分子ナノシートを含む方法である。
　前記方法は、さらに、前記物理的又は化学的パラメータに対して異なる光学特性を有するルミネッセンス化合物を担持する少なくとも1つの高分子ナノシートを使用することができる。
　本発明の方法の1つの形態として、前記ルミネッセンス化合物の少なくとも1種が、前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のリファレンス蛍光又はリファレンスリン光化合物をリファレンス化合物として含む高分子ナノシートからの放射光をリファレンスとして、測定デバイスにおける測定値をレシオメトリック法によって補正する方法が挙げられる。
　本発明の方法の例として、前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のリファレンス化合物を担持する高分子ナノシートからの放射光をリファレンスとして、前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して感受性を有するルミネッセンス化合物の放射光に対する測定デバイスが受像する二次元画像上の特定の位置の受光量と、前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のリファレンス化合物の放射光に対する測定デバイスが受像する二次元画像上の前記特定の位置と同一位置の受光量との比を求めるステップを含む方法が挙げられる。
　前記受光量の比に基づいて、被験体又は測定装置の位置及び／又は照射光量の変化に基づく受光量の変化に対して、前記ルミネッセンス化合物による放射光量に対する測定装置の受光量を補正するステップを含むことができる。測定対照の物理的又は化学的パラメータに対して感受性を示す化合物を有するナノシートと一緒に、リファレンス化合物を有するナノ―シートを積層することにより、これらの化合物を単層膜中に担持させる場合に惹起される蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)による干渉が惹起する測定デバイスにおける受光量の低下の問題を回避できる。
　また、予め測定対象の物理的又は化学的パラメーターの絶対値が既知の物体を測定し、その測定値を求めて所謂検量線を作成して置き、別途、測定対象の物理的又は化学的バラメーターの値が未知の物体を測定し、測定値を前記検量線に適用して算定することにより、被験物体の物理的又は化学的パラメーター値の絶対値を求めることができる。
　本発明の方法を使用して、被験物体の物理的又は化学的パラメーターの経時的な変化を、変化量又は相対的な変化割合として求めることもできる。
　前記物理的又は化学的パラメータの例としては、ガス濃度、酸素濃度、窒素濃度、圧力、温度、金属イオン濃度、pH、膜電位及び活性酸素濃度等が挙げられる。
　本発明の方法の実施形態において、前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して感受性を有するルミネッセンス化合物の例として、酸素又は圧力に対して感受性を有する化合物、温度感受色素を有する化合物、pH感受性を有する化合物、CO2ガス感受性を有する化合物、カルシウム感受性を有する化合物、亜鉛感受性を有する化合物、マグネシウム感受性を有する化合物、ナトリウム感受性を有する化合物、膜電位感受性を有する化合物、及び、活性酸素感受性を有する化合物等から選択され使用できる。
　より具体的な例としては、前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して感受性を有するルミネッセンス化合物は、酸素又は圧力に対して感受性を有する化合物がPtOEP (platinum octaethylporphyrin)から、温度感受色素を有する化合物がEuDT (Eu-tris(dinaphthoylmethane)-bis-trioctylphosphine oxide)、EuTTA (Eu-thenolytrifluoroacetonate)及びRhodamine Bから、pH感受性を有する化合物が2',7'-Dichlorofluorescein及びfluoresceinから、CO2ガス感受性を有する化合物がBenzobisimidazoliumから、カルシウム感受性を有する化合物がFluo4から、亜鉛感受性を有する化合物がFluoZinから、マグネシウム感受性を有する化合物がMag-Fuar-2から、ナトリウム感受性を有する化合物がCoroNa Greenから、膜電位感受性を有する化合物がANEPS、並びに、活性酸素感受性を有する化合物がCellROXから選択できる。
 また、前記測定対象のパラメータに対して感受性を有するルミネッセンス化合物として、シート表面に導入される化合物を使用できる。これらの化合物の例として、カルシウム感受性を有する化合物、pH感受性を有する化合物、活性酸素感受性を有する化合物、ATP感受性を有する化合物、cAMP感受性を有する化合物、cGMP感受性を有する化合物、グルタミン酸感受性を有する化合物等から選択して使用できる。
　前記測定対象のパラメータに対して感受性を有するルミネッセンス化合物は、シート表面に導入される化合物の例として、より具体的には、カルシウム感受性を有する化合物がGCamP、pH感受性を有する化合物がpHTomato、活性酸素感受性を有する化合物がHyper、ATP感受性を有する化合物がPerceval、cAMP感受性を有する化合物がFlamindo、cGMP感受性を有する化合物がFlincGβ、グルタミン酸感受性を有する化合物がiGluSnFR等が挙げられる。
　前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のリファレンス化合物の例としては、有機蛍光色素、有機金属錯体及び無機蛍光材料が挙げられる。
　前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のリファレンス化合物の例は、より具体的には、有機蛍光色素がRhodamine101又はRhodamine800、有機金属錯体がイリジウム錯体（Irppy3）、及び、無機蛍光材料がQuantumDotやカーボン又はナノチューブ（近赤外線）か挙げられる。
　前記超薄膜光ルミネッセンスセンサーの厚さが、1μm未満、好ましくは500nm未満、より好ましくは200nm未満である。
　前記高分子ナノシートの材質としては、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリスチレン(PS)、ポリエステル、エラストマー、導電性ポリマー及び多糖類が挙げられ、これらを製膜した高分子ナノシートを使用できる。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。ここに記述される実施例は本発明の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
1. PtOEP担持ナノシート及びRhodamine 101担持ナノシート並びにそれらの積層膜の製造（図１）
　以下はナノシートセンサーの作製方法のいくつかの例である。
　我々は、厚さ150～200nmの温度感受性1種類、酸素感受性1種類、及び、それらのレファランスナノシートとして非感受性2種類の4タイプのナノシートを用いたセンサーを製造した。それはスピンコート技術（図１）により作製された。最初に、グラビアコーターを用いて、PETフィルム上にpolyvinyl alcohol (PVA)を製膜した。その後、スピンコーターを用いて、PET/PVA層の上にポリマー及び化合物の溶液をスピンコートした。作製されたナノシートは、酸素感受性のある化合物PtOEP(platinum octaethylporphyrin)（ナノシート1(PS製）、膜厚：146±16nm、粗さ2±1nm）、酸素感受性のない化合物（レシオメトリック測定のためのRhodamine 101）（ナノシート2（PMMA製）、膜厚：約200nm）を得た（図１）。
密着性
　先行技術文献１、２に記載のセンサー化合物を担持するマイクロシートは柔軟性がなく、接着剤又は粘着剤を用いずに表面には物品に貼付することができない。一方、ナノシートで示される物品に対する高い密着性は、センサー化合物を担持するナノシートのセンサーとしての応用を広げる。
　ナノシートはメッシュ、ワイヤループ、あるいは毛管力を利用してさまざまな表面に容易に貼付できる。図２Ａに、膜厚：150nmのPtOEP担持ナノシートを、a:皮膚表面、b:コイン、c:プラスチックモデル、d:プラスチックモデルの各マーキング部位に貼付し、可視光（上段）、PtOEPの蛍光写真（下段）を、図２Ｂに細胞組織培養用基材の例として、細胞培養用ディッシュ（ガラスボトムディッシュ）にナノシートを用いて脳スライスを固定した画像を示した。いずれの物品に対しても、接着剤又は粘着剤を使用しなくともPtOEP担持ナノシートは優れた密着性を示した。したがって、物理的又は化学的パラメータの測定において、この高い密着性は、正確な測定結果をもたらすことができる。そして、例えば、細胞スクリーニングや細胞・組織培養のバイオアッセイツールとしての使用に本発明のナノシートは有用であり、シャーレ、ガラス及びマルチプレートウェル等の細胞培養関連基材への貼付も可能である。
2. PtOEP担持ナノシートとRhodamine 101ナノシートの蛍光強度に及ぼす酸素濃度の影響とレシオメトリック法
　PtOEP担持ナノシート（ナノシート1)、及びPtOEP担持ナノシート（ナノシート1)とRhodamine 101担持ナノシート（ナノシート2)の積層膜を用い、各種酸素濃度環境下における酸素感受性、非感受性は、蛍光分光光度計を用いて定量的に解析した(図３、励起光の波長：560nm）。
　ナノシート1におけるPtOEPのりん光は、ナノシートに担持された状態においても酸素濃度の上昇に伴い低下することが確認された（図３Ａ）。この650nmのりん光波長の強度と酸素濃度との関係をシュテルン-フォルマーの式に基づきプロットすると、その一次回帰直線は相関係数R=0.9977と良好な直線性を示した（図３Ｂ）。
　また、ナノシート1とナノシート2との積層膜のりん光スペクトル図を図３Ｃに示す。酸素濃度の変化に伴いナノシート1側では、図３Ａと同様に、酸素濃度の上昇に伴いPeOEPのりん光強度は低下した一方、ナノシート2に担持されたRhodamine 101（励起波長：560nm、最大蛍光波長；589nm）からの蛍光は、酸素濃度が変化してもほとんど変化しなかった（図３Ｃ）。本結果より、Rhodamine 101担持ナノシートをリファレンスナノシートとして使用することにより、PtOEP担持ナノシートにより酸素濃度に対してレシオメトリックな超薄膜光ルミネッセンスセンサーとして使用できることが示された。
3. PtOEPを担持するナノシートとマイクロシートとの時空間分解能の比較
　ステンシル法を用いてガラスプレート(厚み0.12～0.17 mm)上に、マイクロ厚（膜厚：9μm)の酸素濃度センシングシートを作製した(ポリスチレン（PS）2.0 wt%、PtOEP 0.005 wt%)。さらに、同じガラスプレート上にPtOEPを担持するPSナノシート（膜厚：150nm）を貼付して、両シートに窒素ガスを同じ圧力で吹き付け、マイクロシートとナノシート中のPtOEPのりん光強度の変化の結果を29 fpsの撮影スピードでビデオカメラでモニターした。
結果
　PtOEPを担持するナノシート及びマイクロシートの両シート共UVランプ（励起光365nm）により励起された。窒素ガスフローに対するPtOEPのりん光強度の応答速度を比較したところ、ナノシートは酸素感受性に関してマイクロシートよりも高い時空間分解能を示した（空間分解能：約6.7倍、時間分解能：10～30倍） (図４Ａ，図４Ｂ)。シートタイプのセンサーにおいては、シート厚の減少に伴って、センサー中の環境パラメータ（ガス、温度）を変化するのに要する時間も減少する。センサーの厚さが1μm未満の場合、膜厚方向に対するガス拡散や熱伝導はマイクロシートよりも早く飽和状態となるため、ナノシートの方が高い時空間分解能が示される。この結果は1マイクロメートル未満の膜厚の重要性を示し、また、環境や生物医学的な応用のための薄膜状光ルミネッセンスセンサーの感受性や有用性を向上した。
　さらに、図５は、膜厚が1μm以上のシート（以下、「マイクロシート」と言う）の時空間分解能を示す。時間分解能に関して、窒素ガスをマイクロシートに吹き付けた際に、強度が一定になるまで変化する時間が0.7秒であったのに対して、ナノシート（150nm厚）は0.1秒未満であった。空間分解能に関して、マイクロシートの強度の変化の領域はナノシートよりも大きい。したがって、ナノシートは、1μm厚のマイクロシート に比較して高い時空間分解能を有する。この結果から、少なくとも1μm未満の膜厚が高い時空間分解能を達成するために望ましいことが示された。
4. PtOEPを担持するナノシートによる水中の溶存酸素の測定
　窒素ガスを通気したミリＱ水、大気環境下に放置したミリＱ水、酸素ガスを通気したミリＱ水を、大気環境下、PtOEPを担持するナノシート（膜厚：150nm）上に留置し、その後の酸素濃度の変化に伴うりん光強度の変化をデジタルカメラ (NEX-C3, ソニー株式会社、東京)で測定した。
　大気環境下に放置したミリＱ水を測定して得られたりん光強度に対する、窒素ガス又は酸素ガスを通気したミリＱ水のりん光強度の比に対する経時変化を図６に示した。窒素ガスを通気したミリＱ水は、大気環境下ミリＱ水の約2.5倍のりん光強度から徐々に減少し、約15分後には、大気環境下のミリＱ水でのりん光強度まで減少した。一方、酸素ガスを通気したミリＱ水は大気環境下ミリＱ水の0.7倍のりん光強度から徐々に増加し、約10分後には、大気環境下ミリＱ水のりん光強度まで上昇した。
　これらの結果は、PtOEPを担持するナノシートは、気体中の酸素濃度に対するセンサーとしてだけではなく、水中の溶存酸素に対するセンサーとしても使用できることを示している。
5. PtOEP担持ナノシートのヒト皮膚への貼付
　上記のとおり、ナノシートは膜厚が薄いところから種々の物品に対して優れた密着性を有し、粘着剤や接着剤を使用しなくとも種々の物品に貼付できる特性を有し、皮膚表面にも貼付できる。そこで、皮膚に貼付した状態で、酸素センサーとしての機能を発揮できるかについて検証した。
　ヒトの左側上腕の皮膚表面にPtOEP担持ナノシートを貼付し、このナノシート表面に窒素気流を吹き付けることにより局所的に酸素濃度を低下させ、又は、酸素気流を吹き付けることにより局所的に酸素濃度を増加させ、これらの酸素濃度の変化をPtOEP担持ナノシートが測定可能であるか検討、評価した。
　結果を図７に示した。窒素気流を吹き付けた部位、すなわち、酸素濃度が局所的に低下した部位は、PtOEPのりん光強度が上昇することが確認された（図７a、b）。一方、酸素気流を吹き付けると、PtOEP担持ナノシートからのりん光強度は低下した（図７c、d）。これらの結果より、PtOEP担持ナノシートは、粘着剤や接着剤等を使用することなく、人体の臓器等に貼付でき、酸素濃度センサーとして酸素濃度をモニターできることが示された。
1. EuDT担持ナノシート及びRhodamine 800担持ナノシート並びにそれらの積層膜の製造（図１）
　温度感受性蛍光化合物としてEuDT(Eu-tris(dinaphthoylmethane)- bis-trioctylphosphine oxide)を、温度非感受性のリファレンス化合物としてRhodamine 800を使用した以外は、実施例１と同様の方法で、各化合物を担持するナノシート（以下、それぞれをナノシート3、ナノシート4と記載）を製造した（図１）。なお、ナノシート3の製造には、PMMA:2.0wt%とEuDT:0.05wt%の混合溶液を用い、ナノシート4の製造には、ポリスチレン(PS)：2.0wt%とRhodamine 800：0.05wt%の混合溶液を使用した。得られたナノシート3の膜厚は163±13nm、表面粗さは9±4nm、ナノシート4の膜厚は167nm±14nm、表面粗さは8±4nmであった。
2. EuDT担持ナノシートとRhodamine 800担持ナノシートの温度が蛍光強度に及ぼす影響
　EuDT担持ナノシート(ナノシート3)及びRhodamine 800担持ナノシート（ナノシート4）の各種温度における蛍光強度を測定した。EuDT担持ナノシートの温度変化に対する光ルミネッセンスによる発光スペクトルの変化(温度変化; 29oC～45 oC、2 oCごと、図８Ａ)、EuDT担持ナノシートの温度変化に対する発光スペクトルのピーク(619nm)の強度変化（図８Ｂ）、Rhodamine 800担持ナノシートの温度変化に対する発光スペクトル変化(温度変化; 29oC～ｂ45 oC、2 oCごと、図８Ｃ)、及び、Rhodamine 800担持ナノシートの温度変化に対する発光スペクトルのピーク(702 nm)強度の変化（図８Ｄ）を表す。
　その結果、EuDT担持ナノシートは温度感受性、Rhodamine 800担持ナノシートは温度に対して非感受性であることが示された。
3. EuDT担持ナノシートとRhodamine 800担持ナノシートの生体温度の測定への応用
　Dicronorrhina derbyana（以下、「甲虫」(beetle)と記載）の背側背板を剥離し、飛翔筋（dorso-ventral muscle及びdorso-longitudinal muscle）を露出し、この露出された飛翔筋にナノシート3とナノシート4との積層膜（二重膜）を内側側をナノシート3として貼付した。この積層膜は、粘着剤や接着剤を使用しなくとも、甲虫の飛翔筋に貼付可能であった（図９Ａ、Ｂ）。
　この背側飛翔筋に貼付された積層膜にEuDTとRhodamine 800のそれぞれに対する励起波長を照射し（EuDTは405nm帯域、Rhodamine 800は640nm帯域)、それぞれの蛍光画像を取得した（図９Ｃの左図、中図）。さらに、これらの蛍光画像より、Rhodamine 800の蛍光画像をリファレンスとして、EuDTの蛍光画像をレシオメトリック法による処理を実施した。即ち、温度感受性のEuDTチャネルの信号強度を温度非感受性のRhodamine 800チャネルの信号強度で割る処理を行った（図９Ｃ右図）。このレシオメトリック法によって得られた画像は、測定対象の動きや顕微鏡のずれにより生じる焦点面変化に起因する強度変化を矯正できることが示された。
4. 甲虫飛翔筋の温度変化に伴うEuDT及びRhodamine 800の蛍光強度変化の観測
　ナノシート3と4との積層膜を貼付した甲虫の飛翔筋に赤外線レーザー光（波長：980nm, Viasho, 北京、中国）を間歇的に照射することにより、飛翔筋の温度を変化させた。このときのEuDT担持ナノシートとRhodamine 800担持ナノシートからの蛍光強度の時間的変化を観測した結果を図１０に示した。左図は測定したROIを、右図は、EuDTとRhodamine 800の平均ルミネッセンス強度の経時的変化を表す。
　EuDTは温度感受性を示し、再現性良く一定の蛍光強度幅で間歇的な温度変化に伴った蛍光強度の上昇及び低下のサイクルを認めた。一方、Rhodamine 800は温度変化に対して非感受性であった。なお、EuDT担持ナノシートに温度変化は、950回繰り返して変化させても（40ミリ秒の励起を1秒間隔で950回反復）、安定な蛍光強度の変化を示した。
5. 赤外線サーモグラフィーとの比較（温度分解能とROI面積との関係）
　上記と同様に飛翔筋に甲虫のEuDT担持ナノシートとRhodamine 800担持ナノシートの積層膜を貼付後、赤外線レーザーで飛翔筋を加熱し、EuDT及びRhodamine 800の蛍光強度比を測定することにより温度変化を測定した。また、同時に赤外線サーモグラフィー（Ti 400;Fluke, ワシントン州、米国）を使用し、前記積層膜と赤外線サーモグラフィーで得られる温度変化の値とを比較した。
結果
　レーザー光で飛翔筋を加熱し、温度を上昇させた場合の赤外線サーモグラフィーで測定して得られた飛翔筋の温度変化とEuDT/Rhodamine 800の蛍光強度比との関係を図１１に示した。蛍光強度比は、イメージJ (https://imagej.nih.gov/ij/)で算出した。その結果、飛翔筋温度とEuDT/Rhodamine 800蛍光強度比とは良い直線関係を示し、加熱時は1.38％/℃の、放熱時は1.72％/℃の蛍光強度比の変化を示した（図１１Ｂ）。
　また、ROIの面積を55x55μm2、110x110μm2、220x220μm2及び440x440μm2と変化させると、ROIの大きさが小さい程標準偏差が大きいものの、逆に、ROIの大きさが小さい程、サーモグラフィーカメラによる測定と比較して相対的に温度分解能は高くなるとの結果を得た（図１１Ｃ）。
6. 甲虫飛翔筋の自発運動に伴う温度変化マッピング
　甲虫は後肢をピンセットでつかむ刺激を与えると、飛翔筋の温度が上昇する逃避運動を誘発される。そこで、飛翔筋に上記積層膜を貼付し、刺激を与える前、刺激後及び放熱後の蛍光強度の変化を測定することにより、飛翔筋温度の変化をマッピングした。
結果
　結果を図１２に示した。飛翔筋正中線近傍であるROI（関心領域）4、5での温度上昇は各3.00℃及び3.55℃を示し、外側側にいくに従って温度上昇は大きくなり、ROI 1では4.10℃、ROI 8では4.79℃の温度上昇を示した。本温度マッピングの結果から、甲虫の飛翔筋の筋繊維の形状を描出することで、甲虫刺激時の飛翔筋の発熱の不均一性を明らかにできた。
　本結果は、EuDT担持ナノシートとRhodamine 800担持ナノシートを用い、各蛍光画像をレシオメトリック法で処理することにより、動作を伴う動物において、高い空間分解能を維持したまま温度変化を測定できることを示すものである。
参考例
被験体の位置変化による測定結果への影響へのレシオメトリック法による矯正
　上記に、レシオメトリック法によって得られた画像は、測定対象の動きや顕微鏡のずれにより生じる焦点面変化に起因する強度変化を矯正できることを記載した。この点をより明確に表すため、細胞内温度分布を、温度感受性の蛍光化合物であるRhodamine Bと温度非感受性の蛍光化合物であるNIRrhod101で、焦点面をずらしながら得られた画像と、その蛍光強度比を表した図を図１３に示した。
　グラフの縦軸が正規化した発光強度を表し、Rhodamine BとNIRrhod101のそれぞれの蛍光強度について、焦点が合っている状態での値を100%として記載する。被写体と受像装置との距離について焦点面からの位置が4μm、8μmとずれるに従い、即ち、所謂ピンボケになるに従い、蛍光を受像する測定装置における受光強度は減少する。一方、ピントがずれると像の大きさは大きくなる。すなわち、総発光量は変わらないため、その分単位面積あたりの受光量は下がる。しかし、Rhodamine BとNIRrhod101からの蛍光の受光強度の比をとることで、ピントのズレによる変化を補正することが可能となる。このような焦点面に対する被写体の変化は、サンプルの動き、顕微鏡のズレ等で惹起される。したがって、生体の物理的又は化学的な変化に対して経時的に測定を行う場合の正確性を損なわないためにレシオメトリック法が必須である。
　また、このようなレシオメトリック法による矯正は、単に焦点ずれだけではなく、被写体の動作等による物理的又は化学的パラメータに対して感受性を有する化合物を有し蛍光を発する被写体と、その蛍光を受光する蛍光カメラ等の受光装置との物理的な距離の変化による受光量の変化に対しても、上記の焦点ずれの場合と同様に、リファレンス蛍光との比を求めることにより、矯正された画像を取得できる。
　総括
　以上の結果をまとめると、従来の方法、デバイス、物質に対する本発明の優位性として以下が挙げられる。
時空間分解能
　ステンシル法を用いてガラスプレート(厚み0.12～0.17mm)上に、マイクロ厚の酸素濃度センシングシートを作製した(PS 2.0wt%, PtOEP 0.005wt%)。さらに、同じガラスプレート上にPtOEPを担持するPSナノシート（厚さ：150nm）を貼付した両シートに窒素ガスを同じ圧力で吹き付け、マイクロシートとナノシート中のPtOEPのりん光強度の変化の結果を29fpsの撮影速度でビデオカメラでモニターした。この実施形態では、両シート共UVランプ（励起光365nm）により励起された。窒素ガスフローに対するPtOEPのりん光強度の反応速度を比較したところ、ナノシートは酸素感受性に関してマイクロシートよりも高い時空間分解能を示した（すなわち、空間分解能＞4倍、時間分解能＞10倍） (図４)。シートタイプのセンサーにおいては、シート厚が減少するに従って、センサー中の環境パラメータ（ガス透過、温度増加）を変化するのに要する時間も減少する。センサーの厚さが1μm未満の場合、ガスや熱の交換はマイクロシートよりも早くなり、それにより、ナノシートに対する高い時空間分解能が示される。この結果は1マイクロメートル未満の膜厚の重要性を示し、また、環境や生物医学的な応用のための薄膜状光ルミネッセンスセンサーの感受性や有用性を向上した。図５は1μmシート（マイクロシートと言う）の時空間分解能を示す。時間分解能に関して、窒素ガスをマイクロシートに吹き付けた際に、強度が一定になるまで変化する時間が0.7秒であったのに対して、ナノシート（膜厚150nm）は0.1秒未満であった。空間分解能に関して、マイクロシートの強度の変化の領域はナノシートよりも大きい。したがって、ナノシートは、1μm以上の膜厚のマイクロシート に比較して高い時空間分解能を有する。この結果から、少なくとも1μm未満の厚さが高い時空間分解能を達成するために望ましい。
密着性
　センサー化合物を担持するナノシートは、メッシュ、ワイヤループ、あるいは水圧を介してさまざまな表面に容易に貼付できる(図２及び図７)。特に、皮膚表面上のPtOEP担持PSナノシートの酸素感受性が示される(図７)。先行技術文献１及び２に見られる、センサー化合物を担持するマイクロシートは柔軟性がなく、接着剤や粘着剤を用いずに表面に貼付することができない。ナノシートで示した密着性は、センサー化合物を担持するナノシートのセンサーとしての応用を広げると理解される。
生体イメージング
　EuDT担持PMMAナノシートとRhodamine 800担持PSナノシートの2層構造ナノシートを、メッシュを介して甲虫の飛翔筋に貼付した。そして、甲虫の後肢をピンセットでつかむことで、飛翔筋の温度が上昇する逃避モードを誘発した。この温度変化が、ナノシートセンサー(EuDT担持)からの発光強度の変化によりモニターされた。測定対象の動きや顕微鏡のずれにより生じる焦点面変化に起因する強度変化は、EuDTチャネルの信号強度をRhodamine 800チャネルの信号強度で割るレシオメトリック法により補正された。計算した比の値は、飛翔筋由来の熱発生に伴って温度上昇、下降する温度変化に対して正確な変化を示していた(飛翔筋の温度変化は赤外線サーモグラフィーカメラを用いてモニターされ、相関があった)（図１１）。このことから、このナノシートを利用したセンサーシステムは甲虫の飛翔筋のような微小な生体組織においても測定が可能であるといえる。赤外線サーモグラフィーカメラは生体イメージングに際して、赤外線の水による吸収、空間分解能の限界が10μmしかないという課題がある。それゆえ、このナノシートセンサーは組織のような濡れた表面の温度をマッピングする際の有望なツールになると期待される。このナノシートセンサーはイメージＪの分析によって表面温度をマップできる（図１２）。
位置の変化に伴うルミネッセンス画像の変化の補正
　本発明の超薄膜センサーは、レシオメトリック法を用いる。レシオメトリック法の使用により、図１３で示されたように被写体の動作や焦点ずれに起因する物理的又は化学的パラメータに感受性を有するルミネッセンス化合物からのルミネッセンスの強度低下に対して、このルミネッセンス強度に対するリファレンス化合物からのルミネッセンス強度の比を使用して、測定対象の物理的又は化学的パラメーターのマッピングを行う。これにより被写体の動作や焦点ずれに起因する測定装置での受光量の変化を補正することが可能である。
ナノシートを積層膜として使用することによるリファレンス化合物が惹起する蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）による消光の非影響
　物理的又は化学的パラメータに感受性のルミネッセンス化合物と、物理的又は化学的パラメータに非感受性のルミネッセンス化合物の少なくとも２種のルミネッセンス化合物をレシオメトリック法で使用する。これらの多種のルミネッセンス化合物は、相互に、又は一方に蛍光共鳴エネルギ－移動を惹起し、ルミネッセンスを減弱させることにより、正確な物理的又は化学的パラメータの測定を妨害する可能性が高いと考えられる。
　しかし、本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーは、１枚のナノシートには、１種のルミネッセンス化合物しか含まれず、かかるナノシートを積層して使用するため、複数のルミネッセンス化合物が蛍光共鳴エネルギ－移動(FRET)を惹起する程、近接して存在することはナノシートの境界面を除いてない。したがって、本発明の超薄膜光ルミネッセンスセンサーは、蛍光共鳴エネルギ－移動の影響はない、又は、極めて小さいものと理解される。
　本発明では、極めて薄い(厚さ150～200nm)のセンサー化合物担持ナノシートを構築した。これらのナノシートセンサーが高い時空間分解能を有し、あらゆるタイプの表面に貼付することが可能であることを確認した。さらに、センサーナノシートとリファレンスナノシートの2層型ナノシートセンサーは、表面のパラメータをより正確に測定するレシオメトリック法での測定を達成することが可能であった。これらの特徴はマイクロメータ厚のセンサー化合物担持シートには見られないものであった。
環境測定
　ガス濃度測定においてナノシート1(PtOEP担持PSナノシート、酸素センサー)は高い時空間分解能を示した（図４、図５）。本発明は、宇宙空間、海底、災害及び安全保障での環境測定、特に高い時空間分解能が求められる極限環境下での事故防止に有用である。
生体組織イメージング
　我々は、ナノシート3(EuDT担持PMMAナノシート：温度センサー)とナノシート4(Rhodamine 800担持PSナノシート：温度センサーのリファレンス)を生体組織イメージングとして開示した（図９～１２）。2層型の構造は容易に構築でき、接着剤や粘着剤を介せず、筋組織に貼付可能であった（図２、図７及び図９～１２）。これらのナノシートセンサーは微小な組織における温度変化を測定可能であった（図１１、１２）。また、生体組織のような濡れた表面にも適用可能である。これらの結果から、ナノシートセンサーは顕微鏡や内視鏡を用いた生体表面マッピングに有望である。
　さらに、本発明の超薄膜ルミネッセンスセンサーは、例えば、移植臓器の管理を含む手術時の生体組織の機能管理、及び、食品の温度変化をモニターする品質管理用シール等の幅広い範囲に応用できる。

Claims (12)

  1. 　複数の高分子ナノシートを含む積層膜からなる超薄膜光ルミネッセンスセンサーであって、
    　前記積層膜は、測定対象である物理的又は化学的パラメータに対して光学特性が変化するルミネッセンス化合物を担持する少なくとも１つの高分子ナノシートを含む、
    　ことを特徴とする超薄膜光ルミネッセンスセンサー。
  2. 　請求項１に記載の超薄膜光ルミネッセンスセンサーであって、
    　さらに、前記物理的又は化学的パラメータに対して異なる光学特性を有するルミネッセンス化合物を担持する少なくとも1つの高分子ナノシートを含む、
    　ことを特徴とする請求項１に記載の超薄膜光ルミネッセンスセンサー。
  3. 　請求項１又は２に記載の超薄膜光ルミネッセンスセンサーであって、
    　前記物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のルミネッセンス化合物をリファレンス化合物として担持する高分子ナノシートをレシオメトリック法のためのリファレンスナノシートを含む、
    　ことを特徴とする超薄膜光ルミネッセンスセンサー。
  4. 　請求項１～３のいずれか1項に記載の超薄膜光ルミネッセンスセンサーであって、
    　前記物理的又は化学的パラメータが、ガス濃度、酸素濃度、窒素濃度、圧力、温度、金属イオン濃度、pH、膜電位及び活性酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１種である、
    　ことを特徴とする超薄膜光ルミネッセンスセンサー。
  5. 　請求項１～４のいずれか1項に記載の超薄膜光ルミネッセンスセンサーであって、
    　前記ルミネッセンス化合物は、酸素又は圧力の感受性を有する化合物としてPtOEP(platinum octaethylporphyrin)から、温度感受化合物を有する化合物としてEuDT(Eu-tris(dinaphthoylmethane)-bis-trioctylphosphine oxide)、EuTTA(Eu-thenolytrifluoroacetonate)又はローダミンB（Rhodamine B）から、pH感受性を有する化合物として2',7'-Dichlorofluorescein又はfluoresceinから、CO2ガス感受性を有する化合物としてベンゾビスイミダゾリウム（Benzobisimidazolium）から、カルシウム感受性を有する化合物としてFluo4TMから、亜鉛感受性を有する化合物としてFluoZinTMから、マグネシウム感受性を有する化合物としてMag-Fuar-2TMから、ナトリウム感受性を有する化合物としてCoroNa GreenTMから、膜電位感受性を有する化合物としてANEPPS から、及び、活性酸素感受性を有する化合物としてCellROXRから選択される少なくとも１種である、
    　ことを特徴とする超薄膜光ルミネッセンスセンサー。
  6. 　請求項３～５のいずれか1項に記載の超薄膜光ルミネッセンスセンサーであって、
    　前記測定対象の物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のリファレンス化合物が、有機蛍光化合物、有機金属錯体、無機蛍光材料、カーボン又はナノチューブ（近赤外線）から選択される少なくとも１種である、
    　ことを特徴とする超薄膜光ルミネッセンスセンサー。
  7. 　請求項６に記載の超薄膜光ルミネッセンスセンサーであって、
    　前記有機蛍光化合物がRhodamine101又はRhodamine800から、有機金属錯体がイリジウム錯体（Irppy3）から、及び、無機蛍光材料がQuantumDotから選択される、
    　ことを特徴とする超薄膜光ルミネッセンスセンサー。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の超薄膜光ルミネッセンスセンサーであって、
    　前記超薄膜光ルミネッセンスセンサーの厚さが1μm未満又は500nm未満である、
    　ことを特徴とする超薄膜光ルミネッセンスセンサー。
  9. 　超薄膜光ルミネッセンスセンサーを使用して、被験体の物理的若しくは化学的パラメータ又はその変化を測定する方法であって、
    　前記超薄膜光ルミネッセンスセンサーは、複数の高分子ナノシートの積層膜であり、
    　前記積層膜は、測定対象である物理的又は化学的パラメータに対して光学特性が変化するルミネッセンス化合物を担持する少なくとも１つの高分子ナノシートを含む、
    　ことを特徴とする、方法。
  10. 　請求項９に記載の方法であって、
    　前記物理的又は化学的パラメータに対して非感受性のルミネッセンス化合物をリファレンス化合物として担持する高分子ナノシートをリファレンスナノシートとして用い、
    　前記ルミネッセンス化合物からのルミネッセンスの測定強度に対して、前記リファレンス化合物からのルミネッセンスの測定強度の比を算定し、
    　測定デバイスにおける測定値をレシオメトリック法によって補正する、
    　ことを特徴とする、方法。
  11. 　請求項９又は１０に記載の方法であって、
    　前記物理的又は化学的パラメータが、ガス濃度、酸素濃度、窒素濃度、圧力、温度、金属イオン濃度、pH、膜電位及び活性酸素濃度からなる群から選択される少なくとも１種である、
    　ことを特徴とする、方法。
  12. 　請求項９～１１のいずれか1項に記載の方法であって、
    　前記超薄膜光ルミネッセンスセンサーの厚さが1μm未満又は500nm未満である、
    　ことを特徴とする方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108333162A (zh) * 2018-02-07 2018-07-27 南方科技大学 一种荧光氧探针及其制备方法和用途
WO2019017030A1 (ja) * 2017-07-19 2019-01-24 ソニー株式会社 センサデバイス、検出装置
CN109580570A (zh) * 2019-01-02 2019-04-05 齐鲁工业大学 一种生物组织荧光显微分析方法
TWI661186B (zh) * 2018-01-25 2019-06-01 長庚大學 光學式氣體感測器與其系統及製作方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007086040A (ja) * 2005-09-26 2007-04-05 Univ Nagoya 酸素感応膜及びその製造方法
JP2008232853A (ja) * 2007-03-20 2008-10-02 Tohoku Univ 局在表面プラズモン励起型超薄膜発光型センサー
JP2013053901A (ja) * 2011-09-02 2013-03-21 Gunma Univ レシオ法に基づいた酸素センサー
JP2013200192A (ja) * 2012-03-23 2013-10-03 Ehime Univ ハイブリッド膜、ガスセンサおよび発光性センサ

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2373989A1 (en) * 2008-12-11 2011-10-12 Luxcel Biosciences Limited Optochemical sensor active element, method of its preparation and use
EP2371925B1 (en) * 2010-03-29 2012-12-12 University College Cork, National University of Ireland, Cork A sensor material, and uses thereof to simultaneously sense two analytes

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007086040A (ja) * 2005-09-26 2007-04-05 Univ Nagoya 酸素感応膜及びその製造方法
JP2008232853A (ja) * 2007-03-20 2008-10-02 Tohoku Univ 局在表面プラズモン励起型超薄膜発光型センサー
JP2013053901A (ja) * 2011-09-02 2013-03-21 Gunma Univ レシオ法に基づいた酸素センサー
JP2013200192A (ja) * 2012-03-23 2013-10-03 Ehime Univ ハイブリッド膜、ガスセンサおよび発光性センサ

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019017030A1 (ja) * 2017-07-19 2019-01-24 ソニー株式会社 センサデバイス、検出装置
US11459537B2 (en) 2017-07-19 2022-10-04 Sony Corporation Sensor device and detection apparatus
TWI661186B (zh) * 2018-01-25 2019-06-01 長庚大學 光學式氣體感測器與其系統及製作方法
CN108333162A (zh) * 2018-02-07 2018-07-27 南方科技大学 一种荧光氧探针及其制备方法和用途
CN109580570A (zh) * 2019-01-02 2019-04-05 齐鲁工业大学 一种生物组织荧光显微分析方法
CN109580570B (zh) * 2019-01-02 2021-03-12 齐鲁工业大学 一种生物组织荧光显微分析方法

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