CN109580570B - 一种生物组织荧光显微分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种生物组织荧光显微分析方法，以0.1‑1mg/mL的荧光有机聚合物纳米膜水溶液培养生物组织。本发明的荧光纳米膜具有良好的生物相容性，可用于植物组织培养液。本发明所获得有机聚合物纳米膜，具有很高的相对荧光量子产率(＞60％)，可作为荧光探针，用于生物组织的荧光显微成像。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物组织荧光显微成像分析方法，尤其涉及使用有机聚合物纳米膜的荧光显微成像分析方法。
背景技术
具有荧光特性的二维聚合物，在光电子器件、生物传感器及功能性墨水等领域，有着潜在的应用(Chem.Soc.Rev.2018,47,3265-3300)。然而，具有荧光特性的二维有机聚合物，到目前为止，尚未见文献报道。二维聚合物的研究虽有报道(Accounts of chemicalresearch2015,48(8),2221-2229)，但在溶液中合成二维有机聚合物，通常需要借助额外的底物或界面使单体分子预组装成二维的几何形状(Nature chemistry 2012,4(4),287-291；Angewandte Chemie 2016,55(1),213-217)。在无模板、表面或界面辅助的情况下，在溶液中规模化制备二维有机聚合物，仍然是一项富有挑战性的课题。
生物组织光学成像技术具有无损伤、非电离化辐射的特点，能够显示组织中各种化学组分和结构，提供有用的功能信息；因此，在生物组织诊断中具有重大应用价值。
荧光材料是实现生物组织荧光成像的重要物质基础。利用荧光材料标记细胞样品中某些特定结构或成分，用波长较短的光激发荧光材料分子使其处于高能态，再对其退激过程中所发射的波长相对较长的荧光进行显微成像，即为荧光显微技术。采用该技术，不仅可以克服普通光学显微术难以直接对无色透明的细胞样品进行成像的缺点，更重要的是还能通过标记细胞中特定的结构或者分子、离子实现“功能成像”。
在实际应用过程中，在浓度极低的情况下仍具有较高的荧光强度和较高的相对量子产率，是荧光材料领域追求的目标。然而，多数荧光材料的相对量子产率低于50％(Angewandte Chemie,2010,49,4430-4434；ACS Nano,2016,10,4410-4420)。因此，获得具有生物相容性、相对量子产率高于50％的荧光材料，并使之在生物组织成像中得以应用，不仅具有重要的科学意义，而且具有重要的应用价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种生物组织荧光显微成像方法。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种荧光有机聚合物纳米膜用于生物组织荧光显微分析的方法。
优选的，以0.1-1mg/mL的荧光有机聚合物纳米膜水溶液培养生物组织。
一种生物组织荧光显微分析方法，步骤如下：
1)取生物组织，置于浓度为0.1-1mg/mL的荧光有机聚合物纳米膜水溶液中，室温下浸泡5-10h；
2)将浸泡过的生物组织用纱布包好，并转移至培养皿中，将培养皿转移至20-35℃的恒温箱中，恒温箱相对湿度保持为50-70％；用荧光有机聚合物纳米膜水溶液使纱布保持湿润，培养生物组织2-7天。
3)在紫外灯下，观测培养后的生物组织。
本发明所述的室温为室内的一般温度，一般为16-35℃，优选18-30℃。
优选的，步骤3)所述的紫外灯，为350-450nm波长的紫外灯。更优选的，步骤3)所述的紫外灯，为365nm波长、405nm波长的紫外灯。
优选的，所述生物组织为植物组织；更优选的，植物组织为绿豆芽或黄豆芽。
优选的，所述具有荧光的有机聚合物纳米膜，纳米膜的厚度为20-60nm。在水溶液中纳米膜的相对量子产率为66-76％。优选的，有机聚合物纳米膜水溶液在434-440nm激发波长下的荧光强度达6400-6500。
优选的，聚合物纳米膜水溶液在200-400nm波长激发下的发射峰位于437±3nm，即434-440nm。
优选的，所述荧光有机聚合物纳米膜水溶液的制备方法，包括步骤如下：
1)获得具有荧光特性的有机聚合物粉体；
2)将步骤1)中所述有机聚合物粉体在超声辅助下溶解于蒸馏水中，获得具有荧光特性的有机聚合物纳米膜水溶液。
一种具有荧光的有机聚合物纳米膜的制备方法，包括步骤如下：
1)获得具有荧光特性的有机聚合物粉体；
2)将步骤1)中所述有机聚合物粉体在超声辅助下溶解于蒸馏水中，获得具有荧光特性的有机聚合物纳米膜水溶液；
3)将步骤2)中所述有机聚合物纳米膜的水溶液冷冻干燥，获得具有荧光特性的有机聚合物纳米膜粉体。
优选的，步骤1)所述的有机聚合物粉体的制备，包括下列步骤：
a.将柠檬酸与半胱氨酸混合、研磨，得混合物A；半胱氨酸，为L-半胱氨酸或D-半胱氨酸；柠檬酸与半胱氨酸，其物质的量之比为(1-3):1。
b.将混合物A转移至容器B中，将容器B置于可控温加热炉中150-170℃加热1-4h，将容器B从加热炉中取出，置于室温环境中冷却，得有机聚合物粉体。容器，其材质为不锈钢、玻璃或陶瓷。混合物A与容器B，混合物A的体积不超过占容器B容积的50％。
步骤2)所述的有机聚合物粉体溶解于蒸馏水，其聚合物浓度为0.005-16mg/mL。
步骤2)所述的超声辅助，其超声功率为100-300W，超声时长为1-5min。
步骤3)所述的冷冻干燥，其冷冻温度为零下40-50℃，真空度小于200Pa。
本发明的有益效果是：
1、本发明在无模板、表面或界面辅助的情况下，在溶液中规模化制备有机聚合物纳米膜，方法简单，成本低，有利于规模化应用。
2、本发明所获得的有机聚合物纳米膜，具有很高的相对荧光量子产率(＞60％)。
3、本发明所获得的荧光有机聚合物纳米膜，具有良好的生物相容性，适用于植物组织荧光显微分析。
附图说明
图1为样品S-1的TEM图。
图2为样品S-2的TEM图。
图3为样品S-3的TEM图。
图4为样品S-4的TEM图。
图5为样品S-5的TEM图。
图6为样品S-6的TEM图。
图7为样品S-7的AFM图。
图8为样品S-8的SEM图。
图9为样品S-9的TEM图。
图10为三种有机聚合物纳米膜在水溶液中的荧光光谱图；三种有机聚合物纳米膜在水溶液中的浓度均为0.005mg/mL；三种有机聚合物纳米膜对应的粉体的制备条件为：柠檬酸与L-半胱氨酸物质的量之比分别为1:1、2:1和3:1，反应温度为160℃，反应时间为1h。
图11为分别以蒸馏水、荧光有机聚合物纳米膜(0.125mg/mL)为培养液所培养的豆芽的数码相机照片；激发波长为365nm。
图12为以荧光有机聚合物纳米膜(1mg/mL)为培养液所培养的绿豆芽切片的LSCM照片。
图13为以荧光有机聚合物纳米膜(0.1mg/mL)为培养液所培养的黄豆芽切片的LSCM照片。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图对本发明的技术方案做进一步阐述，这些实施例只是为了阐述本发明的技术方案，而不能视为对本发明权利要求内容的限制。
实施例中的柠檬酸购自天津市富宇精细化工有限公司；L-半胱氨酸、D-半胱氨酸购自上海麦克林生化科技有限公司。
扫描电镜(SEM)照片经日本Hitachi Regulus8220型场发射扫描电子显微镜检测获得；透射电镜(TEM)照片经日本JEOL JEM-2100型高分辨透射电子显微镜检测获得；激光扫描共聚焦显微照片(LSCM)经德国Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜检测获得；原子显微镜(AFM)照片经Multimode 8Nanoscope V system扫描探针显微镜检测获得。
实施例1
一种荧光有机聚合物纳米膜的制备方法，步骤如下：
将柠檬酸和L-半胱氨酸按物质的量之比1:1混合，研磨均匀，然后转移至烧杯中，将烧杯置于150℃烘箱中加热2h；将烧杯取出置于室温环境中冷却，得棕黄色粉体。
称取适量粉体，超声辅助(100W,40kHz,5min)溶解于蒸馏水中，配成浓度为1mg/mL的水溶液，得荧光有机聚合物纳米膜水溶液
取样，记为样品S-1，进行TEM观测(附图1)。
实施例2
一种荧光有机聚合物纳米膜的制备方法，步骤如下：
将柠檬酸和L-半胱氨酸按物质的量之比2:1混合，研磨均匀，然后转移至烧杯中，将烧杯置于160℃烘箱中加热1h；将烧杯取出置于室温环境中冷却，得棕黄色粉体。
称取适量粉体，超声辅助(200W,40kHz,3min)溶解于蒸馏水中，配成浓度为0.005mg/mL的水溶液，得荧光有机聚合物纳米膜水溶液。
取样，记为样品S-2，进行TEM观测(附图2)。
实施例3
一种荧光有机聚合物纳米膜的制备方法，步骤如下：
将柠檬酸和L-半胱氨酸按物质的量之比2:1混合，研磨均匀，然后转移至烧杯中，将烧杯置于170℃烘箱中加热1h；将烧杯取出置于室温环境中冷却，得棕黄色粉体。
称取适量粉体，超声辅助(300W,40kHz,1min)溶解于蒸馏水中，配成浓度为1mg/mL的水溶液，得荧光有机聚合物纳米膜水溶液。
取样，记为样品S-3，进行TEM观测(附图3)。
实施例4
一种荧光有机聚合物纳米膜的制备方法，步骤如下：
将柠檬酸和L-半胱氨酸按物质的量之比2:1混合，研磨均匀，然后转移至烧杯中，将烧杯置于160℃烘箱中加热1h；将烧杯取出置于室温环境中冷却，得棕黄色粉体。
称取适量粉体，超声辅助(100W,40kHz,5min)溶解于蒸馏水中，配成浓度为2mg/mL的水溶液，得荧光有机聚合物纳米膜水溶液。
取样，记为样品S-4，进行TEM观测(附图4)。
实施例5
一种荧光有机聚合物纳米膜的制备方法，步骤如下：
将柠檬酸和L-半胱氨酸按物质的量之比2:1混合，研磨均匀，然后转移至烧杯中，将烧杯置于160℃烘箱中加热4h；将烧杯取出置于室温环境中冷却，得棕黄色粉体。
称取适量粉体，超声辅助(200W,40kHz,3min)溶解于蒸馏水中，配成浓度为1mg/mL的水溶液，得荧光有机聚合物纳米膜水溶液。
取样，记为样品S-5，进行TEM观测(附图5)。
实施例6
一种荧光有机聚合物纳米膜的制备方法，步骤如下：
将柠檬酸和L-半胱氨酸按物质的量之比2:1混合，研磨均匀，然后转移至烧杯中，将烧杯置于160℃烘箱中加热1h；将烧杯取出置于室温环境中冷却，得棕黄色粉体。
称取适量粉体，超声辅助(200W,40kHz,3min)溶解于蒸馏水中，配成浓度为16mg/mL的水溶液，得荧光有机聚合物纳米膜水溶液。
取样，记为样品S-6，进行TEM观测(附图6)。
实施例7
一种荧光有机聚合物纳米膜的制备方法，步骤如下：
将柠檬酸和L-半胱氨酸按物质的量之比2:1混合，研磨均匀，然后转移至烧杯中，将烧杯置于160℃烘箱中加热1h；将烧杯取出置于室温环境中冷却，得棕黄色粉体。
称取适量粉体，超声辅助(300W,40kHz,1min)溶解于蒸馏水中，配成浓度为1mg/mL的水溶液，得荧光有机聚合物纳米膜水溶液。
取样，记为样品S-7，进行AFM观测(附图7)。
将有机聚合物纳米膜水溶液冷冻干燥(零下45±2度，真空度70-100Pa)，得有机聚合物纳米膜粉体。
取样，记为样品S-8，进行SEM观测(附图8)。
实施例8
一种荧光有机聚合物纳米膜的制备方法，步骤如下：
将柠檬酸和D-半胱氨酸按物质的量之比3:1混合，研磨均匀，然后转移至烧杯中，将烧杯置于160℃烘箱中加热1h；将烧杯取出置于室温环境中冷却，得棕黄色粉体。
称取适量粉体，超声辅助(100W,40kHz,5min)溶解于蒸馏水中，配成浓度为1mg/mL的水溶液，得荧光有机聚合物纳米膜水溶液。
取样，记为样品S-9，进行TEM观测(附图9)。
结果分析
从样品的形貌结果(附图1至附图9)看，当柠檬酸与半胱氨酸物质的量之比为(1-3):1、反应温度为150-170℃、反应时间为1-4h时，所得的有机聚合物粉体在水溶液中的浓度为0.005-16mg/mL时，均能得到有机聚合物纳米膜。其中，多数情况下纳米膜的厚度为20-60nm(附图7)。
附图10为三种有机聚合物纳米膜在水溶液中的荧光光谱图，三种有机聚合物纳米膜在水溶液中的浓度均为0.005mg/mL，三种有机聚合物纳米膜对应的粉体的制备条件为：柠檬酸与L-半胱氨酸物质的量之比分别为1:1、2:1和3:1，反应温度为160℃，反应时间为1h。从附图10可以看出，三种有机聚合物纳米膜在水溶液中均呈现出较强的荧光特性。对应柠檬酸与L-半胱氨酸物质的量之比分别为1:1、2:1和3:1的有机聚合物粉体，在水溶液中所形成的纳米膜的相对量子产率分别为70％、76％和66％。
实施例9
一种荧光有机聚合物纳米膜用于生物组织荧光显微分析的方法，步骤如下：
(1)取50颗市售绿豆(产地：山东)，置于浓度为0.125mg/mL体积为100mL的荧光有机聚合物纳米膜水溶液中，室温下浸泡7h；荧光有机聚合物的制备条件为：柠檬酸与半胱氨酸物质的量之比为2:1，反应温度为160℃，反应时间为1h。
(2)将浸泡过的绿豆用纱布包好，并转移至培养皿中，将培养皿转移至25℃的恒温箱中，恒温箱相对湿度保持为50-70％；以荧光有机聚合物纳米膜水溶液为培养液，定期用培养液使纱布保持湿润，待绿豆发芽后，定时测量豆芽的长度。
(3)在365激发波长下用数码相机对豆芽进行拍照，在405激发波长下用激光扫描共聚焦显微镜对豆芽组织进行拍照。
为了便于说明荧光有机聚合物纳米膜的生物相容性，在对比实验中，用蒸馏水作为培养液代替实施例9中的荧光有机聚合物纳米膜水溶液，其余条件和操作不变。
表1为不同培养时间下绿豆芽的平均长度，平均长度为20颗豆芽的平均值；聚合物纳米膜水溶液的浓度为0.125mg/mL。
表1为不同培养时间下绿豆芽的平均长度。从表1可以看出，以荧光有机聚合物纳米膜水溶液(0.125mg/mL)为培养液培养的绿豆芽，其长度与以蒸馏水为培养液培养的绿豆芽长度相比，没有明显差异，这说明荧光有机聚合物纳米膜具有良好的生物相容性。
附图11为分别以蒸馏水、荧光有机聚合物纳米膜(0.125mg/mL)为培养液所培养的绿豆芽，在365nm波长的紫外灯下，所拍摄的数码相机照片。与以蒸馏水为培养液所培养的绿豆芽相比(附图11a)，以荧光有机聚合物纳米膜为培养液所培养的绿豆芽(附图11b)具有明显强的荧光。
实施例10
一种荧光有机聚合物纳米膜在植物组织荧光显微分析中的应用，步骤如下：
取50颗市售绿豆(产地：山东)，置于浓度为1mg/mL体积为100mL的荧光有机聚合物纳米膜水溶液中，室温下浸泡5h。荧光有机聚合物的制备条件为：柠檬酸与半胱氨酸物质的量之比为2:1，反应温度为160℃，反应时间为1h。
将浸泡过的绿豆用纱布包好，并转移至培养皿中，将培养皿转移至25℃的恒温箱中，恒温箱相对湿度保持为50-70％；以上述荧光有机聚合物纳米膜水溶液为培养液，定期用培养液使纱布保持湿润，培养138h后，取豆芽，切片，进行LSCM观测。
附图12为以荧光有机聚合物纳米膜(1mg/mL)为培养液所培养的豆芽切片的LSCM照片。由附图12可以看出，豆芽切片组织在405nm波长激发下，具有很强的荧光，且豆芽切片组织清晰可辨。这说明荧光纳米膜可以用于生物组织荧光显微成像。
实施例11
一种荧光有机聚合物纳米膜用于生物组织荧光显微分析的方法，步骤如下：
(1)取50颗市售黄豆(产地：山东)，置于浓度为0.1mg/mL体积为100mL的荧光有机聚合物纳米膜水溶液中，室温下浸泡7h；荧光有机聚合物的制备条件为：柠檬酸与半胱氨酸物质的量之比为2:1，反应温度为160℃，反应时间为1h。
(2)将浸泡过的黄豆用纱布包好，并转移至培养皿中，将培养皿转移至25℃的恒温箱中，恒温箱相对湿度保持为50-70％；以荧光有机聚合物纳米膜水溶液为培养液，定期用培养液使纱布保持湿润，待黄豆发芽后，定时测量豆芽的长度。
(3)在365激发波长下用数码相机对豆芽进行拍照，在405激发波长下用激光扫描共聚焦显微镜对豆芽组织进行拍照。
为了便于说明荧光有机聚合物纳米膜的生物相容性，在对比实验中，用蒸馏水作为培养液代替实施例11中的荧光有机聚合物纳米膜水溶液，其余条件和操作不变。
表2为不同培养时间下黄豆芽的平均长度，平均长度为15颗豆芽的平均值；聚合物纳米膜水溶液的浓度为0.1mg/mL。
表2为不同培养时间下黄豆芽的平均长度。从表2可以看出，以荧光有机聚合物纳米膜水溶液(0.1mg/mL)为培养液培养的黄豆芽，其长度与以蒸馏水为培养液培养的黄豆芽长度相比，没有明显差异，这说明荧光有机聚合物纳米膜具有良好的生物相容性。
附图13为分别以蒸馏水、荧光有机聚合物纳米膜(0.1mg/mL)为培养液所培养的黄豆芽，在405nm波长下，所拍摄的豆芽切片的激光扫描共聚焦显微照片。
由附图13可以看出，黄豆芽切片组织在405nm波长激发下，具有很强的荧光，且豆芽切片组织清晰可辨；这说明荧光有机聚合物纳米膜适用于生物组织荧光显微成像分析。
Claims (10)
1.一种生物组织荧光显微分析方法，以0.1‒1 mg/mL的荧光有机聚合物纳米膜水溶液培养生物组织；
所述荧光有机聚合物纳米膜水溶液的制备方法，包括步骤如下：
1）获得具有荧光特性的有机聚合物粉体；
a. 将柠檬酸与半胱氨酸混合、研磨，得混合物A；半胱氨酸，为L-半胱氨酸或D-半胱氨酸；柠檬酸与半胱氨酸，其物质的量之比为(1‒3) : 1；
b. 将混合物A转移至容器B中，将容器B置于可控温加热炉中150‒170 °C加热1‒4 h，将容器B从加热炉中取出，置于室温环境中冷却，得有机聚合物粉体；
2）将步骤1）中所述有机聚合物粉体在超声辅助下溶解于蒸馏水中，其聚合物浓度为0.005‒16 mg/mL；获得具有荧光特性的有机聚合物纳米膜水溶液。
2.如权利要求1所述的一种生物组织荧光显微分析方法，步骤如下：
1）取生物组织，置于浓度为0.1‒1 mg/mL的荧光有机聚合物纳米膜水溶液中，室温下浸泡5‒10 h；
2）将浸泡过的生物组织用纱布包好，并转移至培养皿中，将培养皿转移至20‒35 °C的恒温箱中，恒温箱相对湿度保持为50‒70%；用荧光有机聚合物纳米膜水溶液使纱布保持湿润，培养生物组织2‒7天；
3）在紫外灯下，观测培养后的生物组织。
3.如权利要求 2所述的生物组织荧光显微分析方法，其特征在于，步骤3）所述的紫外灯，为350‒450 nm波长的紫外灯。
4.如权利要求2所述的生物组织荧光显微分析方法，其特征在于，所述生物组织为植物组织。
5.如权利要求2所述的生物组织荧光显微分析方法，其特征在于，植物组织为绿豆芽或黄豆芽。
6.如权利要求1‒5任一项所述的方法，其特征在于，所述的荧光有机聚合物纳米膜，纳米膜的厚度为20‒60 nm；在水溶液中，纳米膜的相对量子产率为66‒76%。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，聚合物纳米膜水溶液在200‒400 nm波长激发下的发射峰位于437 ± 3 nm。
8.如权利要求1‒5任一项所述的方法，其特征在于，一种荧光有机聚合物纳米膜的制备方法，包括步骤如下：
1）获得具有荧光特性的有机聚合物粉体；
2）将步骤1）中所述有机聚合物粉体在超声辅助下溶解于蒸馏水中，获得具有荧光特性的有机聚合物纳米膜水溶液；
3）将步骤2）中所述有机聚合物纳米膜的水溶液冷冻干燥，获得具有荧光特性的有机聚合物纳米膜粉体。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的有机聚合物粉体的制备中，
容器，其材质为不锈钢、玻璃或陶瓷；混合物A与容器B，混合物A的体积不超过容器B容积的50%。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，
步骤2）所述的超声辅助，其超声功率为100‒300 W，超声时长为1‒5 min；
步骤3）所述的冷冻干燥，其冷冻温度为零下40‒50 °C，真空度小于200 Pa。
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