CN109596590B - 有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜用于植物组织荧光显微分析的方法 - Google Patents
有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜用于植物组织荧光显微分析的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种植物组织荧光显微成像分析方法，尤其涉及使用有荧光的有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜的荧光显微成像分析方法。一种植物组织荧光显微成像分析方法，使用有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜；以0.1‑1mg/mL的复合纳米膜水溶液培养生物组织。本发明所获得有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜，具有生物相容性，可用于生物组织的培养液，并可作为荧光指示剂，用于生物组织荧光显微成像。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物组织荧光显微成像分析方法，尤其涉及使用有荧光的有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜的荧光显微成像分析方法。
背景技术
对植物组织进行观察实验，常使用切片观察法。切片观察虽然可以方便地观察植物组织的形态，但不可避免地会破坏植物组织，不适合活体分析。
具有生物相容性的碳基荧光材料在传感、细胞成像及癌症诊断与治疗领域有着重要的应用(Sensors and Actuators B:Chemical,242(2017)1210-1215；ACS appliedmaterials&interfaces,7(2015)23231-23238；ACS nano,9(2015)11455-11461.)。如果用于活的生物体的荧光分析，荧光材料的浓度应当尽可能低；这就要求荧光材料在比较低的浓度下具有尽可能高的荧光强度和量子产率。但多数碳基荧光材料的相对量子产率不超过50％(ACS applied materials&interfaces,7(2015)23231-23238；ACS nano,9(2015)11455-11461.)，因此限制了它们的应用。
寻找高的荧光强度和量子产率的荧光材料，尤其是具有生物相容性的碳基二维荧光材料，依然是一项本领域亟待解决的、富有挑战性的难题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种植物组织荧光显微成像分析方法，尤其是提供一种使用有荧光的有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜的荧光显微成像分析方法。
一种植物组织荧光显微成像分析方法，使用有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜。
优选的，以0.1-1mg/mL的复合纳米膜水溶液培养生物组织。
优选的，所述植物组织为绿豆、黄豆、绿豆芽、黄豆芽等。
一种使用有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜的植物组织荧光显微分析方法，步骤如下：
(1)取植物组织，置于培养液中室温下浸泡5-10h；培养液为浓度为0.1-1mg/mL；
(2)将浸泡过的植物组织用纱布包好，并转移至培养皿中，将培养皿转移至20-35℃的恒温箱中，恒温箱相对湿度保持为50-70％；定期用培养液使纱布保持湿润，培养植物组织2-7天。
(3)取步骤(2)培养的植物组织，切片，进行激光扫描共聚焦显微观测。
所述培养液为有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜水溶液。
本发明所述的室温为室内的一般温度，一般为16-35℃，优选18-30℃。
所述的有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜，二氧化硅与有机聚合物的质量为(0.005-0.5):1。浓度为0.005mg/mL的复合纳米膜水溶液，在240-400nm波长激发下，其发射峰位于437±4nm(即433-440nm)，相对量子产率为74-81％。
所述有机聚合物为柠檬酸与半胱氨酸混合研磨后于160℃加热炉中热处理1h所形成的聚合物。将有机聚合物粉体在超声辅助下溶解于水，有机聚合物分子在水溶液中能够自组装形成有机聚合物纳米膜，所获得的水溶液称为有机聚合物纳米膜水溶液。
一种有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜，采用下列制备方法制备：
1)获得具有荧光特性的有机聚合物粉体；
2)将步骤1)中所述有机聚合物粉体在超声辅助下溶解于蒸馏水中，获得具有荧光特性的有机聚合物纳米膜水溶液A；
3)往步骤2)所得A溶液中加入有机硅的乙醇溶液；室温下搅拌反应4-12h，得混合液B；所述的有机硅，其水解后产生的二氧化硅与步骤1)所述有机聚合物粉体的质量比为(0.005-0.5):1。
4)将步骤3)所得混合液B冷冻干燥，获得具有荧光特性的有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜粉体。
优选的，步骤1)所述的有机聚合物粉体的制备，包括下列步骤：
a.将柠檬酸与半胱氨酸混合、研磨，得混合物C；半胱氨酸，为L-半胱氨酸或D-半胱氨酸。所述步骤a中的柠檬酸与半胱氨酸，其物质的量之比为2:1。
b.将混合物C转移至容器D中，将容器D置于可控温加热炉中160℃加热1h，将容器D从加热炉中取出，置于室温环境中冷却，得有机聚合物粉体。所述容器，其材质为不锈钢、玻璃或陶瓷。所述步骤b中的混合物C与容器D，混合物C的体积不超过占容器D容积的50％。
步骤2)所述的有机聚合物粉体溶解于蒸馏水，其聚合物浓度为1mg/mL。步骤2)所述的超声辅助，其超声功率为100W，超声时长为5min。
步骤3)所述的有机硅，为正硅酸乙酯、二甲基二甲氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、辛基三乙氧基硅烷、十七氟癸基三乙氧基硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷其中的一种或它们之间的组合。
步骤3)所述的乙醇溶液，其中，乙醇溶液的体积与步骤2)中所述蒸馏水的体积比为1:(1-9)。
步骤3)所述的搅拌，搅拌方式为磁力搅拌或机械搅拌，搅拌速率为100-300转/分。
步骤4)所述的冷冻干燥，其冷冻温度为零下40-50℃，真空度小于200Pa。
本发明的有益效果是：
1、本发明所获得有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜，具有生物相容性，可用于生物组织的培养液，并可作为荧光指示剂，用于生物组织荧光显微成像。
2、本发明在无模板、表面或界面辅助的情况下，在溶液中规模化制备有机聚合物纳米膜，方法简单，成本低，有利于规模化应用。本发明所获得有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜，其相对荧光量子产率大于70％，高于单独的有机聚合物纳米膜的相对量子产率。
3、本发明的植物组织荧光分析方法，简便易行、成本低，适于推广应用。
附图说明
图1为样品S-3的SEM图。
图2为样品S-7的SEM图。
图3为346nm波长激发下，样品水溶液的荧光发射光谱图；样品浓度均为0.005mg/mL。
图4为360nm波长激发下，样品乙醇/水溶液(体积比1:1)的荧光发射光谱图；样品浓度均为0.005mg/mL。
图5为以(a)蒸馏水和(b)复合纳米膜S-7的水溶液(0.125mg/mL)为培养液所培养的绿豆芽的数码相机照片；激发波长为365nm。
图6为以复合纳米膜S-3的水溶液(1mg/mL)为培养液所培养的绿豆芽切片的LSCM照片，激发波长为405nm。
图7为以复合纳米膜S-3的水溶液(1mg/mL)为培养液，培养72h后黄豆芽切片的LSCM照片。
LSCM(laser scanning confocal microscope)，是激光扫描共聚焦显微镜的英文缩写。激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图对本发明的技术方案做进一步阐述，这些实施例只是为了阐述本发明的技术方案，而不能视为对本发明权利要求内容的限制。
实施例中的柠檬酸购自天津市富宇精细化工有限公司；L-半胱氨酸、D-半胱氨酸购自上海麦克林生化科技有限公司。
扫描电镜(SEM)照片经日本Hitachi Regulus8220型场发射扫描电子显微镜检测获得；激光扫描共聚焦显微照片(LSCM)经德国Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜检测获得；荧光光谱经日本Hitachi F-4600FL荧光光谱仪检测获得。
实施例1
一种有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜的制备方法，步骤如下：
(1)将柠檬酸和L-半胱氨酸按物质的量之比2:1混合，研磨均匀，然后转移至烧杯中，将烧杯置于160℃烘箱中加热1h；将烧杯取出置于室温环境中冷却，得棕黄色粉体A。
(2)称取65mg粉体A，超声辅助(100W,40kHz,5min)溶解于58.5mL蒸馏水中，得荧光有机聚合物纳米膜水溶液B；移取5.4μmol正硅酸乙酯，转移至6.5mL无水乙醇中，得溶液C。
(3)搅拌下，将溶液C加入到溶液B中，室温下搅拌反应12h，得混合液D。
(4)将混合液D冷冻干燥，得有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜粉体，记为样品S-1。
实施例2
将实施例1步骤(2)中的5.4μmol正硅酸乙酯，换成21.6μmol正硅酸乙酯，其余条件不变。
所得有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜粉体样品记为S-2。
实施例3
将实施例1步骤(2)中的5.4μmol正硅酸乙酯，换成43.2μmol正硅酸乙酯，其余条件不变。
所得有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜粉体样品记为S-3，取样品S-3进行SEM观测(附图1)。
实施例4
将实施例1步骤(2)中的5.4μmol正硅酸乙酯，换成86.4μmol正硅酸乙酯，其余条件不变。
所得有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜粉体样品记为S-4。
实施例5
将实施例1步骤(2)中的5.4μmol正硅酸乙酯，换成0.17mmol正硅酸乙酯，其余条件不变。
所得有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜粉体样品记为S-5。
实施例6
将实施例1步骤(2)中的5.4μmol正硅酸乙酯，换成0.34mmol正硅酸乙酯，其余条件不变。
所得有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜粉体样品记为S-6。
实施例7
将实施例1步骤(2)中的5.4μmol正硅酸乙酯，换成0.54mmol正硅酸乙酯，其余条件不变。
所得有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜粉体样品记为S-7，取样品S-7进行SEM观测(附图2)。
实施例8
一种有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜的制备方法，步骤如下：
(1)将柠檬酸和L-半胱氨酸按物质的量之比2:1混合，研磨均匀，然后转移至烧杯中，将烧杯置于160℃烘箱中加热1h；将烧杯取出置于室温环境中冷却，得棕黄色粉体A。
(2)称取65mg粉体A，超声辅助(100W,40kHz,5min)溶解于32.5mL蒸馏水中，得荧光有机聚合物纳米膜水溶液B；移取43.2μmol二甲基二甲氧基硅烷，转移至32.5mL无水乙醇中，得溶液C。
(3)搅拌下，将溶液C加入到溶液B中，室温下搅拌反应4h，得混合液D。
(4)将混合液D冷冻干燥，得有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜粉体，记为S-8。
实施例9
将实施例8步骤(2)中的二甲基二甲氧基硅烷，换成3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，其余条件不变。
所得有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜粉体样品记为S-9。
实施例10
将实施例8步骤(2)中的二甲基二甲氧基硅烷，换成辛基三乙氧基硅烷，其余条件不变。
所得有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜粉体样品记为S-10。
实施例11
将实施例8步骤(2)中的二甲基二甲氧基硅烷，换成十七氟癸基三乙氧基硅烷，其余条件不变。
所得有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜粉体样品记为S-11。
实施例12
将实施例8步骤(2)中的43.2μmol二甲基二甲氧基硅烷，换成21.6μmol正硅酸乙酯加21.6μmol十二烷基三乙氧基硅烷，其余条件不变。
所得有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜粉体样品记为S-12。
实施例13
一种有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜在植物组织荧光显微分析中的应用，步骤如下：
(1)取50颗市售绿豆(产地：山东)，置于培养液中室温下浸泡7h；培养液为浓度为0.125mg/mL、体积为100mL的样品S-7的水溶液。
(2)将浸泡过的绿豆用纱布包好，并转移至培养皿中，将培养皿转移至25℃的恒温箱中，恒温箱相对湿度保持为50-70％；定期用培养液使纱布保持湿润，待绿豆发芽后，定时测量豆芽的长度。
为了便于说明有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜的生物相容性，在对比实验中，用蒸馏水作为培养液代替实施例13中的复合纳米膜水溶液，其余条件和操作不变。
实施例14
一种有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜在植物组织荧光显微分析中的应用，步骤如下：
(1)取50颗市售绿豆(产地：山东)，置于培养液中室温下浸泡5h；培养液为浓度为1mg/mL、体积为100mL的样品S-3的水溶液。
(2)将浸泡过的绿豆用纱布包好，并转移至培养皿中，将培养皿转移至25℃的恒温箱中，恒温箱相对湿度保持为50-70％；定期用培养液使纱布保持湿润，待培养99h后，取豆芽，切片，进行LSCM观测。
实施例15
一种有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜在植物组织荧光显微分析中的应用，步骤如下：
(1)取50颗市售黄豆(产地：山东)，置于培养液中室温下浸泡7h；培养液为浓度为1mg/mL、体积为100mL的样品S-3的水溶液。
(2)将浸泡过的黄豆用纱布包好，并转移至培养皿中，将培养皿转移至25℃的恒温箱中，恒温箱相对湿度保持为50-70％；定期用培养液使纱布保持湿润，待绿豆发芽后，定时测量豆芽的长度。待培养72h后，取豆芽，切片，进行LSCM观测。
结果分析
图1和2分别为有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜样品S-3和S-7的SEM图。从图1和2可以看出，样品S-3和S-7均为带有褶皱的纳米膜，膜的厚度为20-60nm。
样品S-1、S-2、S-3、S-4、S-5、S-6与S-7中，二氧化硅与有机聚合物粉体的质量比依次为0.005、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32和0.50。图3为样品S-1至S-7的水溶液(浓度均为0.005mg/mL)在346nm波长激发下的荧光发射光谱图。从图3中可以看出，在相同浓度下，有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜水溶液的荧光强度均高于单独有机聚合物纳米膜水溶液的荧光强度。重要的是，相比于单独的有机聚合物纳米膜，有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜的相对量子产率明显提升(表1)。
表1样品水溶液的相对荧光强度和相对量子产率比较(浓度均为0.005mg/mL)
样品S-3、S-8、S-9、S-10、S-11与S-12中，二氧化硅与有机聚合物粉体的质量比均为0.04，所用有机硅分别为正硅酸乙酯、二甲基二甲氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、辛基三乙氧基硅烷、十七氟癸基三乙氧基硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷。
图4为在360nm波长激发下，样品在乙醇/水(体积比为1:1)的混合溶液中的荧光发射光谱图，样品的浓度均为0.005mg/mL。从图4可以看出，不同有机硅修饰所得的复合纳米膜，其荧光强度均明显高于有机聚合物纳米膜的荧光强度。重要的是，相比于单独的有机聚合物纳米膜，不同有机硅修饰所得的复合纳米膜的相对量子产率均明显提升(表2)。
表2样品乙醇/水溶液(体积比1:1)的相对荧光强度和相对量子产率比较(浓度均为0.005mg/mL)
表3为实施例13中不同培养时间下所培养的绿豆芽的长度。从表3可以看出，以复合纳米膜S-7的水溶液(0.125mg/mL)为培养液培养的绿豆芽，其长度与以蒸馏水为培养液培养的豆芽长度相比，没有明显差异，这说明有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜具有良好的生物相容性。
表3分别以蒸馏水、复合纳米膜S-7水溶液(0.125mg/mL)为培养液不同时间下绿豆芽的平均长度
图5为分别以蒸馏水(图5a)、复合纳米膜S-7的水溶液(0.125mg/mL)(图5b)为培养液培养112h的绿豆芽，在365nm波长的紫外灯下，所拍摄的数码相机照片。与以蒸馏水为培养液所培养的豆芽相比，以有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜为培养液所培养的豆芽具有明显强的荧光。
图6为以复合纳米膜S-3的水溶液(1mg/mL)为培养液，培养112h后绿豆芽切片的LSCM照片。由图6可以看出，豆芽切片组织在405nm波长激发下，具有很强的荧光，且豆芽切片组织清晰可辨；这说明荧光纳米膜适用于生物组织荧光显微成像。
表4为实施例15中不同培养时间下所培养的黄豆芽的长度。从表4可以看出，以复合纳米膜S-3水溶液(0.125mg/mL)为培养液培养的黄豆芽，其长度与以蒸馏水为培养液培养的豆芽长度相比，没有明显差异，再次说明有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜具有良好的生物相容性。
表4分别以蒸馏水、复合纳米膜S-3水溶液(1mg/mL)为培养液不同时间下黄豆芽的平均长度
图7为以复合纳米膜S-3的水溶液(1mg/mL)为培养液，培养72h后黄豆芽切片的LSCM照片。由图7可以看出，豆芽切片组织在405nm波长激发下，具有很强的荧光，且豆芽切片组织清晰可辨；这说明荧光纳米膜适用于生物组织荧光显微成像。
Claims (8)
1.一种植物组织荧光显微成像分析方法，其特征是，使用有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜；所述的有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜，二氧化硅与有机聚合物的质量比为(0.005-0.5):1；
步骤如下：
(1)取植物组织，置于培养液中室温下浸泡5-10h；培养液为浓度为0.1-1mg/mL；
(2)将浸泡过的植物组织用纱布包好，并转移至培养皿中，将培养皿转移至20-35℃的恒温箱中，恒温箱相对湿度保持为50-70％；定期用培养液使纱布保持湿润，培养植物组织2-7天；
(3)取步骤(2)培养的植物组织，切片，进行LSCM观测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养液为有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜水溶液。
3.如权利要求2所述的植物组织荧光显微成像分析方法，其特征是，以0.1-1mg/mL的复合纳米膜水溶液培养生物组织。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，浓度为0.005mg/mL的复合纳米膜水溶液，在240-400nm波长激发下，其发射峰位于437±4nm，相对量子产率为74-81％。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，一种有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜，采用下列制备方法制备：
1)获得具有荧光特性的有机聚合物粉体；
2)将步骤1)中所述有机聚合物粉体在超声辅助下溶解于蒸馏水中，获得具有荧光特性的有机聚合物纳米膜水溶液A；
3)往步骤2)所得A溶液中加入有机硅的乙醇溶液；室温下搅拌反应4-12h，得混合液B；所述的有机硅，其水解后产生的二氧化硅与步骤1)所述有机聚合物粉体的质量比为(0.005-0.5):1；
4)将步骤3)所得混合液B冷冻干燥，获得具有荧光特性的有机聚合物/二氧化硅复合纳米膜粉体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的有机聚合物粉体的制备，包括下列步骤：
a.将柠檬酸与半胱氨酸混合、研磨，得混合物C；半胱氨酸，为L-半胱氨酸或D-半胱氨酸；所述步骤a中的柠檬酸与半胱氨酸，其物质的量之比为2:1；
b.将混合物C转移至容器D中，将容器D置于可控温加热炉中160℃加热1h，将容器D从加热炉中取出，置于室温环境中冷却，得有机聚合物粉体；所述容器，其材质为不锈钢、玻璃或陶瓷；所述步骤b中的混合物C与容器D，混合物C的体积不超过占容器D容积的50％。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的有机聚合物粉体溶解于蒸馏水，其聚合物浓度为1mg/mL；步骤2)所述的超声辅助，其超声功率为100W，超声时长为5min；
步骤3)所述的有机硅，为正硅酸乙酯、二甲基二甲氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、辛基三乙氧基硅烷、十七氟癸基三乙氧基硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷其中的一种或它们之间的组合；
步骤3)所述的乙醇溶液，其中，乙醇溶液的体积与步骤2)中所述蒸馏水的体积比为1:(1-9)；
步骤3)所述的搅拌，搅拌方式为磁力搅拌或机械搅拌，搅拌速率为100-300转/分。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的冷冻干燥，其冷冻温度为零下40-50℃，真空度小于200Pa。
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