WO2017069567A1 - Ｌ-쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-쓰레오닌을 생산하는 방법 - Google Patents

Ｌ-쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-쓰레오닌을 생산하는 방법 Download PDF

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이광호
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    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01019—Threonine ammonia-lyase (4.3.1.19)

Definitions

  • the present application relates to recombinant microorganisms that produce threonine, and methods of producing L-threonine using the same.
  • Threonine is an essential amino acid that is widely used in feed, food additives and animal growth promoters. It is also used as a synthetic raw material for fluids and pharmaceuticals.
  • threonine degradation pathway with enhancement of threonine biosynthesis genes (ex. Ppc, aspC, thrABC) is known to improve yield (Kwang-Ho Lee). , et al., Molecular System Biology 2007). Genes on the threonine degradation pathway include tdh, tdcB, glyA, and ilvA. Among these, ilvA (Threonine Deaminase) is known as the major threonine degradation gene.
  • Corynebacterium spp. Or Escherichia spp. Strains produce 2-ketobutyrate and biosynthesize isoleucine through the ilvA gene, which is a threonine degradation pathway.
  • Methanococcus Microorganisms such as jannaschii are known to be able to synthesize 2-ketobutyl acid and isoleucine based on acetyl-CoA and pyruvate via citramalate synthase (cimA) (Atsumi, Liao JC, Appl Environ Microbiol., 2008).
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a method for effectively producing threonine, and as a result, the activity of the threonine deaminase (IlvA) enzyme in the threonine producing strain is reduced, and the citramalate synthetase (cimA) gene can improve the yield of threonine production and overcome the existing problems of delayed culture due to acetate accumulation (Xie X, et al., J Ind Microbiol Biotechnol. 2014). It confirmed and completed this application.
  • One object of the present application is to provide a recombinant microorganism that produces threonine with high efficiency.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing threonine using the microorganism.
  • the recombinant microorganism producing threonine of the present application reduces or inactivates the activity of threonine deaminase (ilvA) and introduces the activity of citramalate synthase (cimA). As a result, the accumulation of acetate in the microorganisms is reduced or improved, and the threonine production is excellent. Accordingly, the industrial scale may be widely used for the efficient and economic production of threonine.
  • Fig. 2 is a schematic diagram showing a gene map of the introduction plasmid pMu-R6K plasmid used in the mini-Mu gene insertion method used for introduction of a threonine biosynthesis gene.
  • one aspect of the present application is to reduce or inactivate the activity of threonine deaminase (IlvA), having the activity of citramalate synthase (citramalate synthase), Provided are recombinant microorganisms that produce threonine.
  • IlvA threonine deaminase
  • citramalate synthase citramalate synthase
  • threonine refers to an amino acid having the formula HO 2 CCH (NH 2 ) CH (OH) CH 3 as one of the essential amino acids which are not produced in the body as hydroxy- ⁇ -amino acid.
  • threonine may be the optical isomer L type or D type, but is not limited thereto.
  • producing threonine in the present application means the ability to produce and accumulate threonine in or on the microorganism when the microorganism is cultured in the medium.
  • Such threonine producing ability may be a property retained by a wild type strain or a property conferred or enhanced by strain improvement.
  • threonine deaminase (EC4.3.1.19) is also referred to as threonine ammonia-lyase or threonine dehydratase and the like. It is an enzyme that catalyzes the conversion of leonin into ⁇ -ketobutyrate and ammonia. Since the ⁇ -ketobutyrate thus produced is used as a precursor of isoleucine, the biosynthesis of isoleucine is not normal when the threonine deaminase is deficient, which may inhibit the growth of microorganisms.
  • threonine deaminase enzyme and “gene encoding the same” may include any protein having such a threonine deaminase activity and any gene encoding the same without limitation.
  • the threonine deaminase can be easily obtained from a known database such as the American Biotechnology Information Center (NCBI) or the Japanese DNA Data Bank (DDBJ), for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO. It may be.
  • NCBI American Biotechnology Information Center
  • DDBJ Japanese DNA Data Bank
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is at least 70%, specifically at least 80%, more specifically at least 90%, even more specifically at least 95%, even more specifically at least 98%, most specifically 99 Any protein having substantially threonine deaminase activity as an amino acid sequence showing at least% homology may be included in the scope of the present application without limitation.
  • sequence having homology with the sequence is an amino acid sequence having a biological activity substantially the same as or corresponding to that of the protein of SEQ ID NO: 7, some sequences have an amino acid sequence deleted, modified, substituted or added. Obviously included in the scope of the application.
  • the gene encoding the threonine deaminase may have a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • the polynucleotide may be variously modified in the coding region due to degeneracy of the codon or in consideration of the codon preferred in the organism to express the protein, without changing the amino acid sequence of the protein.
  • the polynucleotide sequence may have, for example, a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 30, and may have a nucleotide sequence having an homology of 80%, specifically 90% or more, more specifically 99% or more. However, it is not limited thereto.
  • homology means the degree of coincidence with a given amino acid sequence or base sequence and may be expressed in percentage.
  • homologous sequences thereof having the same or similar activity as a given amino acid sequence or base sequence are designated as "% homology".
  • % homology For example, using standard software that calculates parameters such as score, identity and similarity, in particular BLAST 2.0, or by hybridization experiments used under defined stringent conditions The appropriate hybridization conditions to be defined are within the scope of the art (see, eg, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1989) and can be determined by methods well known to those skilled in the art.
  • reduced activity of an enzyme means that the activity of the enzyme is reduced compared to the intrinsic activity of the wild type or pre-mutation state.
  • activation in the present application means that when the expression of the gene encoding the enzyme is reduced to a low level or no expression at all compared to the wild strain, and even if the expression is not active or reduced. Reduction or inactivation of the enzyme can be accomplished by any method known in the art.
  • deletion of part or all of the polynucleotide encoding the enzyme modification of the expression control sequence to reduce the expression of the polynucleotide, modification of the polynucleotide sequence on the chromosome to attenuate the activity of the protein, or a combination thereof It may be carried out in the method selected from, but is not particularly limited thereto.
  • the method for deleting a part or all of the polynucleotide encoding the protein is performed by replacing a polynucleotide encoding an intrinsic target protein in a chromosome with a polynucleotide or a marker gene in which some nucleic acid sequences are deleted through a bacterial chromosome insertion vector. Can be performed.
  • a method of modifying an expression control sequence so that expression of the polynucleotide is reduced or deleted is not particularly limited, and the nucleic acid sequence may be deleted, inserted, non-conserved, or conserved to further weaken the activity of the expression control sequence. It can be carried out by inducing a mutation on an expression control sequence by substitution or a combination thereof, or by replacing with a nucleic acid sequence having weaker activity.
  • the expression control sequence may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosomal binding site, and a sequence that controls the termination of transcription and translation, but is not limited thereto.
  • a method of modifying a polynucleotide sequence on a chromosome is carried out by inducing a mutation in the sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof to further weaken the activity of the protein, or weaker. It can be carried out by replacing with a polynucleotide sequence modified to have activity, but is not limited thereto.
  • the term "recombinant vector” refers to a DNA preparation containing a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding said target protein operably linked to a suitable regulatory sequence to enable expression of the target protein in a suitable host.
  • the regulatory sequence may comprise a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the recombinant vector can be transformed into a suitable host cell and then replicated or functioned independently of the host genome and integrated into the genome itself.
  • the recombinant vector used in the present application is not particularly limited as long as it is replicable in a host cell, and may be produced using any vector known in the art.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc. can be used as a phage vector or cosmid vector, and pBR-based, pUC-based, pBluescriptII-based, etc.
  • pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based and the like can be used.
  • the vector usable in the present application is not particularly limited and known expression vectors can be used. Specifically, pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vector and the like can be used.
  • a polynucleotide encoding a target protein in a chromosome may be introduced through a chromosome insertion vector in a host cell.
  • Introduction of the polynucleotide into the chromosome may be by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • transformation in the present application means introducing a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the transformed polynucleotide it may include all of them, whether inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome.
  • operably linked means that the gene sequence is functionally linked with a promoter sequence for initiating and mediating the transcription of a polynucleotide encoding a target protein of the present application.
  • citramalate synthase (EC2.3.1.182) is an enzyme that catalyzes the process of converting acetyl-CoA and pyruvate to citramalate and coenzyme A. This enzyme is called Methanococcus jannaschii ) (Howell et al., J Bacteriol. 181: 331-333, 1999), Leptospira interogans (Xu et al., J Bacteriol.
  • Geobacter Sulfurdu It has been found in archaea such as Geobacter sulfurreducens and participates in the threonine-independent pathway of isoleucine biosynthesis (Risso et al., J Bacteriol. 190: 2266-2274, 2008).
  • the enzyme has high specificity for pyruvate as a substrate and is typically inhibited by isoleucine.
  • citramalate synthase enzyme and “gene encoding it” include without limitation any protein having such citramalate synthase activity and any gene encoding the same.
  • sequence of the enzyme can be easily obtained from a known database such as the American Biotechnology Information Center (NCBI) or the Japanese DNA Data Bank (DDBJ).
  • it may be citramalate synthase derived from Metanococcus yanashi, and may be composed of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3.
  • the gene encoding the citramalate synthase may have a base sequence encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • the polynucleotide sequence for example, may have a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, the homology thereof is 80% or more, specifically 90% As described above, more specifically, it may have a nucleotide sequence of 99% or more, but is not limited thereto.
  • a protein having substantially citramalate synthase activity as an amino acid sequence showing at least 98% and most specifically at least 99% may be included in the scope of the present application without limitation.
  • sequence has homology with the sequence and the amino acid sequence having the same or corresponding biological activity as the protein of the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, some sequences It is obvious that cases having amino acid sequences deleted, modified, substituted or added are also included in the scope of the present application.
  • the term “recombinant microorganism” may include without limitation genetically engineered mutant microorganisms, and if genetically engineered is possible, genus Escherichia , Corynebacterium , Brevibacterium It may be, but not limited to, genus Serratia , genus Providencia .
  • the recombinant microorganism of the present application may be a Corynebacterium microorganism or Escherichia microorganism, in particular the Corynebacterium microorganism may be Corynebacterium glutamicum ,
  • the microorganism of the genus Escherichia may be Escherichia coli .
  • the recombinant microorganism may be naturally a strain having a threonine-producing ability as a parent strain, or may be a strain having a mutation introduced therein to enhance the threonine-producing ability.
  • Mutations that enhance the threonine production capacity may be, for example, to enhance genes associated with threonine biosynthesis or to attenuate genes associated with threonine degradation pathways.
  • the gene associated with the threonine biosynthesis is the pntAB gene encoding pyridine nucleotide transhydrogenase, the asd encoding the aspartate- ⁇ -semialdehyde dehydrogenase.
  • Gene an aspC gene encoding aspartate aminotransferase, a gdhA gene encoding glutamate dehydrogenase, phosphoenol pyruvate carboxylase It may be one or more genes selected from the group consisting of the ppc gene, the aspA gene encoding aspartase, the threonine operon (thrO), and the gene associated with the threonine degradation pathway is threonine dehydrogena.
  • Tdh gene kata, encoding threonine dehydrogenase It may be a metallic threonine di Hydra hydratase one or more genes selected from the group consisting of the genes tdcB, etc. encoding the (catabolic threonine hydratase).
  • Another aspect of the present application provides a method of producing threonine, comprising culturing the recombinant microorganism of the present application in a medium, and recovering threonine from the microorganism or the medium.
  • culturing a recombinant microorganism producing threonine in which the activity of the threonine deaminase enzyme is reduced or inactivated and the activity of the citramalate synthase enzyme is introduced, and the microorganism or It provides a method for producing threonine comprising recovering threonine from the medium.
  • Recombinant microorganisms producing the threonine deaminase, citramalate synthase, and threonine in the present application are as described above.
  • the term "culture” refers to the growth of microorganisms under appropriately artificially controlled environmental conditions.
  • the step of culturing microorganisms for example, Corynebacterium microorganisms or Escherichia microorganisms may use any culture conditions and culture methods known in the art.
  • the step of culturing the microorganism according to the present application for example, Corynebacterium microorganism or Escherichia microorganism is not particularly limited, but known batch culture method, continuous culture Method, fed-batch culture method and the like.
  • the medium used for the culture must meet the requirements of the particular strain in an appropriate manner and those skilled in the art can appropriately use it according to the known contents.
  • Culture media for Corynebacterial strains or Escherichia spp. Strains are known (e.g., Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology.Washington D.C., USA, 1981).
  • the culture conditions are not particularly limited thereto, but using a basic compound (for example, sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia) or an acidic compound (for example, phosphoric acid or sulfuric acid), an appropriate pH (for example, pH 5 to 9, preferably PH 6 to 8, most preferably pH 6.8).
  • a basic compound for example, sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia
  • an acidic compound for example, phosphoric acid or sulfuric acid
  • an appropriate pH for example, pH 5 to 9, preferably PH 6 to 8, most preferably pH 6.8.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit bubble generation.
  • Oxygen or an oxygen-containing gas mixture may be introduced into the culture to maintain aerobic conditions, and the temperature of the culture is usually 20 ° C. to 45 ° C., preferably 25 ° C. to 40 ° C. Incubation is continued until maximum production of threonine is obtained. For this purpose it is usually achieved in 10 to 160 hours. Threonine may be excreted in the culture medium or contained in cells.
  • the culture medium used may include sugars and carbohydrates (e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose), fats and fats (e.g. soybean oil, sunflower seeds) as carbon sources.
  • sugars and carbohydrates e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose
  • fats and fats e.g. soybean oil, sunflower seeds
  • fatty acids e.g. palmitic acid, stearic acid and linoleic acid
  • alcohols e.g. glycerol and ethanol
  • organic acids e.g. acetic acid
  • Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate) and the like can be used individually or in combination, but is not limited thereto.
  • organic compounds such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea
  • inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate
  • potassium dihydrogen phosphate dipotassium hydrogen phosphate
  • sodium-containing salts may be used individually or in combination, but is not limited thereto.
  • metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate
  • essential growth-promoting substances such as, but not limited to, amino acids and vitamins.
  • suitable precursors to the culture medium may be used.
  • the raw materials described above may be added batchwise or continuously in a suitable manner to the culture in the culture process, but is not limited thereto.
  • the step of recovering threonine from the microorganism or the medium may be performed by a suitable method known in the art according to a culture method, for example, batch, continuous or fed-batch culture method.
  • a suitable method known in the art according to a culture method, for example, batch, continuous or fed-batch culture method.
  • the known threonine recovery method is not particularly limited, but centrifugation, filtration, extraction, spraying, drying, thickening, precipitation, crystallization, electrophoresis, fractional dissolution (eg ammonium sulfate precipitation), chromatography (Eg, HPLC, ion exchange, affinity, hydrophobicity and size exclusion) may be used, but is not limited thereto.
  • the activity of the threonine deaminase (IlvA) is reduced or inactivated and provides for the production of threonine of recombinant microorganisms having the activity of citramalate synthase.
  • a recombinant microorganism producing threonine in which the activity of threonine deaminase (IlvA) is reduced or inactivated and has the activity of a citramalate synthase. Is as described above.
  • the recombinant microorganism producing threonine of the present application reduces or inactivates the activity of threonine deaminase (ilvA), and the citramalate synthase (cimA) By introducing the activity of), growth capacity is maintained or improved as the amount of acetate accumulation in the microorganism is reduced, and has excellent threonine production capacity.
  • threonine deaminase threonine deaminase
  • cimA citramalate synthase
  • Example 1 Production of wild type E. coli-based threonine producer
  • the mini-Mu transposon based genome insertion method (Akhverdyan VZ, Gak ER et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2011) was used to produce threonine from wild type E. coli W3110 (Accession Number ATCC9637).
  • a helper plasmid (p. 1) named pCJ-MuAB and an integrative plasmid (p. 2) named pMu-R6K were prepared.
  • helper plasmid is expressed by using arabinose-inducible ParaB promoter to express transposition factors, MuA and MuB, and to easily remove plasmids including temperature sensitive replicon It became.
  • pMu-R6K the plasmid for introduction, has a cat gene containing mu-attL / R, a mini-Mu unit, and loxP66 and loxP71 (Oleg Tolmachov, et al., Biotechnol. 2006) on both sides. And a suicidal vector that does not proliferate in normal E. coli without R6K replicon (Xiao-Xing Wei, Zhen-Yu Shi. Et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2010). ).
  • Three introduction plasmids were prepared to enhance the expression of threonine biosynthetic gene using the plasmid prepared in Example 1-1.
  • An introductory pMu-R6K plasmid prepared in Example 1-1 was purified by DNA after SmaI restriction enzyme treatment to prepare a cleaved linear cloning vector.
  • the pntAB gene was amplified by PCR of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 with W3110 genomic DNA as a template.
  • the denaturation step using SolGent TM Pfu-X DNA Polymerase is 30 seconds at 94 ° C.
  • the annealing step is 30 seconds at 55 ° C.
  • the extension step is 72 ° C. Run for 3 minutes, and this was done 30 times.
  • W3110 genomic DNA was used as a template to sequence SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 with a primer to amplify the asd gene in the same manner as described above, and SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 with a primer PCR aspC gene as described above Amplified by.
  • Threonine operon was amplified by PCR of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 from KCCM10541 (Korean Patent No. 10-0576342) genomic DNA.
  • PMu-R6K_pntAB asd aspC-thrO plasmid was prepared from each of the four types of DNA and vector DNA prepared above (Daniel G Gibson, et al., Nature Methods 2009).
  • the Gibson assembly method is first prepared 5X ISO buffer with the composition of Table 1, and then 5X ISO buffer and T5 exonuclease (Epicentre), phusion polymerase (New England Biolabs), Taq ligase (New England Biolabs) 15 ⁇ l of Gibson assembly mater mix mixed with three enzymes and 5 ⁇ l of DNA to be cloned are reacted at 50 ° C. for 1 hour. Then, an electric shock (2500 V) was applied to the TransforMaxTM EC100DTM pir-116 Electrocompetent E. coli (epicentre, USA) competent cells.
  • Gibson assembly master mix composition ingredient content 5X ISO Buffer 320 uL 10 U / uL T5 exonuclease 0.64 uL 2 U / uL Phusion polymerase 20 uL 40 U / uL Taq ligase 160 uL total dH 2 O up to 1.2 mL
  • the pMu-R6K plasmid for introduction prepared in Example 1-1 was digested with pMu-R6K plasmid after SmaI restriction enzyme treatment in the same manner as in 1-2-1 to prepare a cleaved linear cloning vector.
  • the gdhA gene was amplified by PCR using SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 with primers
  • the aspC gene was amplified by PCR using SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21 with primers.
  • thrO threonine operon
  • thrO amplified thrO (threonine operon) by PCR with primers SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 from KCCM10541 genomic DNA.
  • PMu-R6K_gdhA aspC thrO plasmid was prepared from each of the three types of DNA and vector DNA prepared above by Gibson assembly.
  • the pMu-R6K plasmid for introduction prepared in Example 1-1 was digested with pMu-R6K plasmid after SmaI restriction enzyme treatment in the same manner as in 1-2-1 to prepare a cleaved linear cloning vector.
  • the primers were amplified from the W3110 genomic DNA by PCR with SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23, and the aspA gene was amplified by PCR with SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25 with primers.
  • the thrO (threonine operon) was amplified by PCR with SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27 from KCCM10541 genomic DNA.
  • PMu-R6K_ppc aspA thrO plasmid was prepared from each of the three types of DNA and vector DNA prepared above by Gibson assembly.
  • W3110 wild-type E. coli transformed with pCJ-MuAB prepared in Example 1-1 was incubated to OD 600 0.6 at 30 ° C using LB medium containing 100 ug / L Ampicillin and 5 mM arabinose. Competent cells were prepared by centrifugation once with sterile distilled water and twice with 10% glycerol (Sambrook and Russell 2001). The prepared plasmid, pMu-R6K_pntAB asd aspC-thrO, was added to the prepared competent cells, followed by electroporation, and incubated at 37 ° C for 1 hour after addition of 1 mL SOC medium.
  • Chloramphenicol Chloramphenicol
  • LB plate medium containing chloramphenicol resistant bacteria colony was carried out by colony PCR with SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 15 to confirm that the pntAB asd aspC thrO gene was introduced on the genome.
  • chloramphenicol resistant markers catalog were removed by smearing on 0.1 L IPTG-added LB plates (Beatri'z Palmeros et al., 2000, Gene).
  • PMu-R6K_gdhA aspC thrO was sequentially introduced by the mini-Mu integration method as described above, followed by colony PCR with SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 15 to confirm the introduction. After introduction of pMu-ppc aspA thrO, SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 27 Colony PCR was used to confirm the introduction.
  • the wild-type Escherichia coli (W3110) -based threonine producing strain thus produced was named CJT1.
  • the FRT-one-step-PCR deletion method was used (Kirill A, et al., 2000, PNAS).
  • Deletion cassettes were prepared by PCR using the primers of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 using the pKD3 vector as a template. Denaturation step using SolGent TM Pfu-X DNA Polymerase (solgent, Korea) at 94 ° C for 30 seconds, annealing step at 55 ° C for 30 seconds and extension step at 72 ° C for 3 minutes was carried out for 30 times.
  • IlvA gene deletion was confirmed by colony PCR of the selected strains with primers of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 and confirming that the gene size was observed at 1.2 kb on a 1.0% agarose gel.
  • the identified strain was again transformed with pCP20 vector (Kirill A, et al., 2000, PNAS) to 1.0% via colony PCR under the same conditions again in colony obtained by plating in 100 ug / L ampicilin LB plate medium.
  • the final ilvA gene deficient strain with the gene size reduced to 150 bp on an agarose gel was prepared and confirmed that the chloramphenicol marker was removed.
  • a strain lacking ilvA in KCCM10541 was named KCCM10541-ilvA and a strain lacking ilvA in CJT1 was named CJT1-ilvA.
  • Methanococcus with CJ1 promoter (Korean Patent No. 10-0620092) Codon-optimization was performed based on jannaschii derived cimA gene to prepare Pcj1_cimA, Pcj1_cimA 2.0, Pcj1_cimA 3.7 (Atsumi, Liao JC, Appl Environ Microbiol. 2008) DNA.
  • KCCM10541-ilvA and CJT1-ilvA strains were transformed into three types of plasmid and control plasmid pCC1BAC by an electric shock (2500V) method to finally produce a strain to be used in the experiment.
  • strains transformed with pCC1BAC in two strains, KCCM10541 and CJT1 were prepared as described above.
  • the cimA gene encodes a wild type citramalate synthase, and cimA 2.0 and cimA 3.7 are mutant citramalates with increased specific activity and reduced feedback-inhibition by isoleucine. Encode the synthetase (Atsumi, Liao JC, Appl Environ Microbiol. 2008).
  • the amino acid sequences for cimA 2.0 and cimA 3.7 are SEQ ID NOs: 2 and 3, respectively, and the nucleotide sequences correspond to SEQ ID NOs: 5 and 6.
  • KCCM10541 or KCCM10541-ilvA KCCM10541 pCC1BAC Based on the KCCM10541 or KCCM10541-ilvA KCCM10541 pCC1BAC, KCCM10541-ilvA pCC1BAC: Pcj1_cimA, KCCM10541-ilvA pCC1BAC: Based on ilvA, recombinant microorganisms of CJT1 pCC1BAC, CJT1-ilvA pCC1BAC, CJT1-ilvA pCC1BAC: Pcj1_cimA, CJT1-ilvA pCC1BAC: Pcj1_cimA 2.0, CJT1-ilvA pCC1BAC: Pcj1_cimA 3.7 were prepared.
  • Example 4 Threonine via Flask Evaluation of ilvA Deficient and cimA Expressing Strains Productivity Check
  • Flask evaluation was performed to compare the threonine production of the strains prepared in Example 3.
  • the flask test streaked each strain into 25 ug / L Chloramphenicol LB plates and incubated for 16 hours in a 33 ° C. incubator, then inoculated a single colony into 2 mL of LB medium and then 200 rpm. Incubated for 12 hours in a / 33 °C incubator.
  • 25 mL of the threonine production flask medium of Table 3 was added to a 250 mL flask, and 500 ⁇ L of the culture medium previously cultured was added thereto.
  • the flask was incubated for 48 hours at 200 rpm / 33 °C incubator, and then compared to the amount of threonine obtained in each strain using HPLC, the results are shown in Table 4 below.
  • Threonine Production Flask Medium Composition Composition Concentration (per liter) glucose 70 g Ammonium sulfate 25 g KH 2 PO 4 1 g MgSO 4 7 H 2 O 0.5 g FeSO 4 7H 2 O 5 mg MnSO 4 8H 2 O 5 mg ZnSO 4 5 mg Calcium carbonate 30 g Yeast extract 2 g Methionine 0.3 g pH 6.8
  • Threonine Production in Production Strains by Flask Culture Strain OD Sugar Consumption (g / L) Threonine Production (g / L) Acetate production amount (g / L) KCCM10541 pCC1BAC 21.6 70 34.7 0.35 KCCM10541-ilvApCC1BAC 5.5 12.0 6.6 0.11 KCCM10541-ilvApCC1BAC: Pcj1_cimA 18.5 70 37.5 0.15 KCCM10541-ilvApCC1BAC: Pcj1_cimA 2.0 22.5 70 38.3 0.10 KCCM10541-ilvApCC1BAC: Pcj1_cimA 3.7 23.2 70 37.8 0.08 CJT1pCC1BAC 35.2 70 11.4 2.15 CJT1-ilvApCC1BAC 6.4 13.6 3.0 1.24 CJT1-ilvApCC1BAC: Pcj1_cimA 30.6 70 14.3 1.42 CJT1-ilvApCC1

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Abstract

본 출원은 쓰레오닌 생산하는 재조합 미생물, 및 이를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ-쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 Ｌ-쓰레오닌을 생산하는 방법
본 출원은 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물, 및 이를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.
쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료, 식품 첨가제 및 동물성장 촉진제로 널리 사용되며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다.
미생물을 이용한 쓰레오닌 생산방법에 있어서, 수율을 향상시키기 위해 쓰레오닌 생합성 유전자(ex. ppc, aspC, thrABC) 강화와 함께 쓰레오닌 분해 경로를 차단하는 방법이 알려져 있다(Kwang-Ho Lee, et al., Molecular System Biology 2007). 쓰레오닌 분해 경로 상의 유전자로는 tdh, tdcB, glyA, ilvA 등이 있는데, 이들 중 ilvA (쓰레오닌 디아미나제, Threonine deaminase)가 가장 주요한 쓰레오닌 분해 유전자로 알려져 있다. 분해 유전자 중 ilvA 유전자를 결손할 경우 쓰레오닌의 수율은 크게 향상하지만 고가의 이소루신(isoleucine)에 대한 요구성이 나타나는 문제가 있으므로 일반적으로는 ilvA 활성 약화 및 isoleucine에 대한 고민감성 변이를 적용하는 것으로 알려져 있다(Akhverdian Valery Z, et al.).
한편, 코리네박테리움 속 균주 또는 에스케리키아 속 균주는 쓰레오닌 분해 경로인 ilvA 유전자를 통해서 2-케토부틸산(2-ketobutyrate)를 생성하고 이소루신을 생합성 한다. 하지만 Methanococcus jannaschii와 같은 미생물은 시트라말레이트 합성효소(citramalate synthase, cimA)를 통해서 아세틸-CoA와 피루베이트를 기질로 하여 2-케토부틸산 및 이소루신을 합성할 수 있다고 알려져 있다 (Atsumi, Liao JC, Appl Environ Microbiol., 2008).
본 발명자들은 쓰레오닌을 효과적으로 생산하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 쓰레오닌 생산 균주에 쓰레오닌 디아미나제(Threonine deaminase, IlvA) 효소의 활성을 감소시키고, 시트라말레이트 합성효소(citramalate synthase, cimA) 유전자를 도입하는 방법으로 쓰레오닌 생산 수율을 향상시키고 아세테이트 축적에 따라 배양이 지연되는 기존 문제점(Xie X, et al., J Ind Microbiol Biotechnol. 2014)을 극복할 수 있음을 확인하고, 본 출원을 완성하게 되었다.
본 출원의 하나의 목적은 쓰레오닌을 고효율로 생산하는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 이용하여 쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물은 쓰레오닌 디아미나제 효소(threonine deaminase, ilvA)의 활성이 감소 또는 불활성화되고, 시트라말레이트 신타아제 효소(citramalate synthase, cimA)의 활성이 도입됨으로써 미생물 내 아세테이트 축적량이 감소됨에 따라 생장능이 유지되거나 향상되며, 우수한 쓰레오닌 생산능을 가지게 되었다. 이에 따라, 산업적 규모에서도 쓰레오닌의 효율적이고 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 mini-Mu 유전자 삽입 방법에 이용되는 헬퍼 플라스미드인 pCJ-MuAB 플라스미드의 유전자 지도를 나타내는 개요도이다.
도 2는 쓰레오닌 생합성 유전자 도입에 사용되는 mini-Mu 유전자 삽입 방법에 이용되는 도입용 플라스미드 pMu-R6K 플라스미드의 유전자 지도를 나타내는 개요도이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 출원의 일 양태는 쓰레오닌 디아미나제 효소(threonine deaminase, IlvA)의 활성이 감소 또는 불활성화되고, 시트라말레이트 신타아제 효소(citramalate synthase)의 활성을 가지는, 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물을 제공한다.
본 출원에서 용어 "쓰레오닌"은 하이드록시-α-아미노산으로 체내에서 생성되지 않는 필수 아미노산의 하나로 화학식 HO2CCH(NH2)CH(OH)CH3인 아미노산을 의미한다. 본 출원에서 쓰레오닌은 광학이성질체 L형 또는 D형일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "쓰레오닌을 생산하는"은 해당 미생물이 배지에서 배양될 때 미생물 내 또는 상기 배지에 쓰레오닌을 생산 및 축적하는 능력을 나타냄을 의미한다. 이러한 쓰레오닌 생성능은 야생형 균주에 의해 보유된 특성이거나 균주 개량에 의해 부여 또는 증강된 특성일 수 있다.
본 출원에서 용어 "쓰레오닌 디아미나제(EC4.3.1.19)"는 쓰레오닌 암모니아리아제(threonine ammonia-lyase) 또는 쓰레오닌 디하이드라타제(threonine dehydratase) 등으로도 지칭되며, 쓰레오닌을 α-케토부티레이트(α-ketobutyrate)와 암모니아로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다. 이렇게 생성된 α-케토부티레이트는 이소루신의 전구체로 사용되기 때문에, 상기 쓰레오닌 디아미나제를 결손시키는 경우 이소루신의 생합성이 정상적이지 않아서 미생물의 생장이 저해될 수 있다.
본 출원에서 용어 "쓰레오닌 디아미나제 효소" 및 "이를 코딩하는 유전자"에는 상기와 같은 쓰레오닌 디아미나제 활성을 가지는 임의의 단백질 및 이를 코딩하는 임의의 유전자가 제한없이 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 쓰레오닌 디아미나제는 미국 생물공학정보센터(NCBI) 또는 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 공지의 데이터베이스로부터 용이하게 얻을 수 있으며, 그 예로 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다. 그러나, 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 이에 한정되지 않는다.
또한, 서열번호 7의 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 쓰레오닌 디아미나제 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 출원의 범주에 포함될 수 있다.
나아가, 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 서열번호 7의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 출원의 범주에 포함됨은 자명하다.
또한, 상기 쓰레오닌 디아미나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면 서열번호 30의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 99% 이상인 염기서열을 가질 수 있다. 그러나 이에 한정되지는 않는다.
본 출원에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고(예, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1989 참고), 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.
본 출원에서 용어 "효소의 활성이 감소"된다는 것은 해당 효소의 활성이 야생형 또는 변이 전 상태의 내재적 활성에 비해 감소되는 것을 의미한다.
또한 본 출원에서 용어 "불활성화"란 해당 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 야생 균주에 비하여 낮은 수준으로 감소하거나 전혀 발현이 되지 않는 경우 및 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 상기 효소의 활성의 감소 또는 불활성화는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
구체적으로 해당 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 결실, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현 조절 서열의 변형, 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 방법에 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기에서 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다.
다음으로, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소 또는 결실되도록 발현 조절서열을 변형하는 방법은, 특별히 이에 한정되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열 상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서 용어 "재조합 벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 재조합 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 재조합 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용하여 제작될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 구체적으로는 pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 숙주세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 도입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원에서 용어 "시트라말레이트 신타아제(EC2.3.1.182)"는 아세틸-CoA와 파이루베이트를 시트라말레이트 및 코엔자임 A로 변환하는 과정을 촉매하는 효소이다. 이 효소는 메타노코커스 야나시(Methanococcus jannaschii)(Howell et al., J Bacteriol. 181: 331-333, 1999), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interogans)(Xu et al., J Bacteriol. 186: 5400-5409, 2004), 지오박터 설푸레두센스(Geobacter sulfurreducens) 등의 고세균류에서 발견되었으며, 이소루신 생합성의 쓰레오닌-비의존형 경로에 참여한다(Risso et al., J Bacteriol. 190: 2266-2274, 2008). 상기 효소는 기질로서 파이루베이트에 대한 특이성이 높고, 전형적으로 이소루신에 의해 저해된다.
본 출원에서 용어 "시트라말레이트 신타아제 효소" 및 "이를 코딩하는 유전자"에는 상기와 같은 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 임의의 단백질 및 이를 코딩하는 임의의 유전자가 제한 없이 포함된다. 상기 효소의 서열은 미국 생물공학정보센터(NCBI) 또는 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 공지의 데이터베이스로부터 용이하게 얻을 수 있다.
구체적으로는, 메타노코커스 야나시 유래의 시트라말레이트 신타아제일 수 있으며, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
또한, 상기 시트라말레이트 신타아제를 코딩하는 유전자(cimA 유전자)는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들면, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 99% 이상인 염기서열을 가질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하거나, 또는 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 기능상 동일한 다수의 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩할 수 있기 때문에, 이에 한정되지 않는다.
또한, 실질적으로 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱 더 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 출원의 범주에 포함될 수 있다.
나아가, 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 출원의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어 "재조합 미생물"은 유전자 조작된 변이 미생물을 제한없이 포함할 수 있으며, 유전자 조작이 가능하다면 에스케리키아 속 미생물(genus Escherichia), 코리네형 미생물(Corynebacterium), 브레비형 미생물(Brevibacterium), 세라티아 속 미생물(genus Serratia), 프로비덴시아 속 미생물(genus Providencia)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 출원의 재조합 미생물은 코리네박테리움 속 미생물 또는 에스케리키아 속 미생물일 수 있으며, 특히 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있고, 상기 에스케리키아 속 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.
본 출원에서 상기 재조합 미생물은 천연적으로 쓰레오닌 생산능을 가지는 균주를 모균주로 한 것일 수 있으며, 또는 쓰레오닌 생산능을 강화시키고자 변이가 도입된 변이 균주를 모균주로 한 것일 수도 있다. 상기 쓰레오닌 생산능을 강화시키는 변이는 예를 들어 쓰레오닌 생합성과 관련된 유전자를 강화하거나 쓰레오닌 분해 경로와 관련된 유전자를 약화시키는 것일 수 있다. 상기 쓰레오닌 생합성과 관련된 유전자는 피리딘 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나제(Pyridine nucleotide transhydrogenase)를 코딩하는 pntAB 유전자, 아스파르테이트-β-세미알데히드 디하이드로게나아제(aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 asd 유전자, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(Aspartate aminotransferase)를 코딩하는 aspC 유전자, 글루타메이트 디하이드로게나아제(glutamate dehydrogenase)를 코딩하는 gdhA 유전자, 포스포에놀 피루베이트 카르복실라제(phosphoenol pyruvate carboxylase)를 코딩하는 ppc 유전자, 아스파르타제(aspartase)를 코딩하는 aspA 유전자, 쓰레오닌 오페론(thrO) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자일 수 있으며, 쓰레오닌 분해 경로와 관련된 유전자는 쓰레오닌 디하이드로게나제(threonine dehydrogenase)를 코딩하는 tdh 유전자, 카타볼릭 쓰레오닌 디하이드라타제(catabolic threonine hydratase)를 코딩하는 tdcB 유전자 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자일 수 있다.
본 출원의 다른 양태는, 본 출원의 상기 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 미생물 또는 배지로부터 쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함하는 쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 쓰레오닌 디아미나제 효소의 활성이 감소 또는 불활성화되고, 시트라말레이트 신타아제 효소의 활성이 도입된, 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 미생물 또는 배지로부터 쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함하는 쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공한다.
본 출원에서 상기 쓰레오닌 디아미나제, 시트라말레이트 신타아제, 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물은 상기 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원에서 미생물, 예를 들어 코리네박테리움 속 미생물이나 에스케리키아 속 미생물을 배양하는 단계는 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법을 사용할 수 있다. 상기 방법에 있어서, 본 출원에 따른 미생물, 예를 들어 코리네박테리움 속 미생물이나 에스케리키아 속 미생물을 배양하는 단계을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며 당업자는 공지된 내용에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 코리네박테리아 속 균주나 에스케리키아 속 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981).
이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 쓰레오닌의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. 쓰레오닌은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 또한, 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 미생물 또는 배지로부터 쓰레오닌을 회수하는 단계는 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당업계에 공지된 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 쓰레오닌 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 HPLC, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 다른 양태는
쓰레오닌 디아미나제 효소(threonine deaminase, IlvA)의 활성이 감소 또는 불활성화되고, 시트라말레이트 신타아제 효소(citramalate synthase)의 활성을 가지는 재조합 미생물의 쓰레오닌을 생산 용도를 제공한다.
상기 용도에 있어서, 쓰레오닌 디아미나제 효소(threonine deaminase, IlvA)의 활성이 감소 또는 불활성화되고, 시트라말레이트 신타아제 효소(citramalate synthase)의 활성을 가지는, 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 설명한 바와 같이, 본 출원의 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물은 쓰레오닌 디아미나제 효소(threonine deaminase, ilvA)의 활성이 감소 또는 불활성화되고, 시트라말레이트 신타아제 효소(citramalate synthase, cimA)의 활성이 도입됨으로써 미생물 내 아세테이트 축적량이 감소됨에 따라 생장능이 유지되거나 향상되며, 우수한 쓰레오닌 생산능을 갖는다.
이하, 실시예를 통하여 본 출원을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 출원을 예시하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 야생형 대장균 기반 쓰레오닌 생산주 제작
1-1. 유전자 도입용 플라스미드와 헬퍼 플라스미드(helper plasmid) 제작
야생형 대장균 W3110(기탁번호 ATCC9637)으로부터 쓰레오닌을 생산하기 위해서 mini-Mu 트랜스포존 기반의 게놈 삽입 방법(Akhverdyan VZ, Gak ER et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2011)을 사용하였다. mini-Mu 삽입방법을 이용하기 위해서 pCJ-MuAB라고 명명한 헬퍼 플라스미드(helper plasmid, 도 1)와 pMu-R6K라고 명명한 도입용 플라스미드(integrative plasmid, 도 2)를 제작하였다. pCJ1-MuAB, 헬퍼 플라스미드는 아라비노스에 의해 발현이 유도되는(arabinose-inducible) ParaB 프로모터를 이용하여 트랜스포지션 인자, MuA와 MuB가 발현되며 온도 민감성 리플리콘을 포함하여 쉽게 플라스미드를 제거할 수 있도록 제작되었다. pMu-R6K, 도입용 플라스미드는 mini-Mu 유닛인 Mu-attL/R과 양쪽 측면에 loxP66과 loxP71 (Oleg Tolmachov, et al., Biotechnol. 2006)를 포함한 cat 유전자를 가진다. 그리고 R6K 리플리콘을 가지고 있어서 pir 유전자를 갖지 않는 일반 대장균 내에서는 증식이 되지 않는 자살 벡터(suicidal vector)의 특징을 가진다(Xiao-Xing Wei, Zhen-Yu Shi.et al., Appl Microbiol Biotechnol.2010).
1-2. 쓰레오닌 생합성 유전자 강화를 위한 도입용 플라스미드 클로닝
상기 실시예 1-1에서 제작한 플라스미드를 이용하여 쓰레오닌 생합성 유전자 발현 강화를 위해서 3가지 도입용 플라스미드를 제작하였다.
1-2-1 : pMu-R6K_pntAB asd aspC-thrO
상기 실시예 1-1에서 제조된 도입용 pMu-R6K 플라스미드를 SmaI 제한효소 처리 후 DNA 정제하여 절단된 선형 클로닝 벡터를 준비하였다. W3110 genomic DNA를 주형으로 서열번호 8 및 서열번호 9를 프라이머로 PCR하여 pntAB 유전자를 증폭하였다. 구체적으로 SolGentTM Pfu-X DNA Polymerase (solgent, DNA)를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 3분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하였다.
또한, W3110 genomic DNA를 주형으로 서열번호 10 및 서열번호 11을 프라이머로 PCR 하여 asd 유전자를 상기와 같은 방법으로 증폭하였고, 서열번호 12 및 서열번호 13을 프라이머로 PCR 하여 aspC 유전자를 상기와 같은 방법으로 증폭하였다.
KCCM10541 (대한민국 등록특허 제10-0576342호) genomic DNA로부터 서열번호 14 및 서열번호 15를 프라이머로 PCR하여 쓰레오닌 오페론(thrO)을 증폭하였다. 상기에 준비된 각각의 4 종류의 DNA와 벡터 DNA를 Gibson assembly 방법을 통해서 pMu-R6K_pntAB asd aspC-thrO 플라스미드를 제작하였다(Daniel G Gibson, et al., Nature Methods 2009).
상기 Gibson assembly 방법은 먼저 하기 표 1의 조성으로 5X ISO 버퍼를 제조한 후 하기 표 2의 조성으로 5X ISO 버퍼와 T5 exonuclease(Epicentre), phusion polymerase(New England Biolabs), Taq ligase(New England Biolabs) 3종의 효소를 혼합한 Gibson assembly mater mix 15 ㎕와 클로닝을 하고자 하는 DNA들 5 ㎕를 50℃ 1시간 반응시킨다. 이후 TransforMaxTM EC100DTM pir-116 Electrocompetent E.coli(epicentre, USA) 컴피턴드 세포에 전기충격(2500V)을 가하였다. 상기로부터 균주를 회수하여, 100 μg/L 암피실린(ampicillin)을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37 ℃에서 하룻밤 배양한 후 암피실린 내성을 보이는 균주를 선별하였다. 이렇게 선별된 균주로부터 플라스미드를 획득하여 최종적으로는 원하는 염기서열을 가지는 플라스미드임을 sequencing 분석으로 확인하였다.
5X ISO 버퍼 조성
성분 함유량
1M Tris-HCl pH 7.5 3 mL
2M MgCl2 150 uL
100nM dNTP mix 240 uL
1M DTT 300 uL
PEG-8000 1.5 g
100 mM NAD 300 uL
총합 dH2O up to 6 mL
dH2O : 증류수, distilled water.
Gibson assembly master mix 조성
성분 함유량
5X ISO 버퍼 320 uL
10 U/uL T5 exonuclease 0.64 uL
2 U/uL Phusion polymerase 20 uL
40 U/uL Taq ligase 160 uL
총합 dH2O up to 1.2 mL
1-2-2 : pMu-R6K_gdhA aspC thrO
상기 실시예 1-1에서 제조한 도입용 pMu-R6K 플라스미드를 상기 1-2-1과 같은 방법으로 pMu-R6K 플라스미드를 SmaI 제한효소 처리 후 DNA 정제하여 절단된 선형 클로닝 벡터를 준비하였다. W3110 genomic DNA로부터 서열번호 18 및 서열번호 19를 프라이머로 PCR하여 gdhA 유전자를 증폭하였고, 서열번호 20 및 서열번호 21를 프라이머로 PCR하여 aspC 유전자를 증폭하였다. thrO(쓰레오닌 오페론)은 KCCM10541 genomic DNA로부터 서열번호 14 및 서열번호 15를 프라이머로 PCR하여 thrO(쓰레오닌 오페론)을 증폭하였다. 상기에 준비된 각각의 3종류의 DNA와 벡터 DNA를 Gibson assembly 방법을 통해서 pMu-R6K_gdhA aspC thrO 플라스미드를 제작하였다.
1-2-3 : pMu-ppc aspA thrO
상기 실시예 1-1에서 제조한 도입용 pMu-R6K 플라스미드를 상기 1-2-1과 같은 방법으로 pMu-R6K 플라스미드를 SmaI 제한효소 처리 후 DNA 정제하여 절단된 선형 클로닝 벡터를 준비하였다. W3110 genomic DNA로부터 서열번호 22 및 서열번호 23을 프라이머로 PCR하여 ppc 유전자를 증폭하였고, 서열번호 24 및 서열번호 25를 프라이머로 PCR하여 aspA 유전자를 증폭하였다. KCCM10541 genomic DNA로부터 서열번호 26 및 서열번호 27을 프라이머로 PCR하여 thrO(쓰레오닌 오페론)을 증폭하였다. 상기에 준비된 각각의 3종류의 DNA와 벡터 DNA를 Gibson assembly 방법을 통해서 pMu-R6K_ppc aspA thrO 플라스미드를 제작하였다.
1-3. 쓰레오닌 생합성 강화 야생형 대장균 제작
실시예 1-1에서 제작한 pCJ-MuAB를 형질전환한 W3110 야생형 대장균을 100 ug/L 암피실린(Ampicillin)과 5 mM 아라비노스가 첨가된 LB 배지를 이용하여 30 ℃ 에서 OD600 0.6까지 배양시킨 후 원심분리기를 통해서 멸균 증류수로 1회, 10% 글리세롤 (glycerol) 로 2회 세척하여 컴피턴트 세포를 제작하였다(Sambrook and Russell 2001). 준비된 컴피턴트 세포에 도입용 플라스미드, pMu-R6K_pntAB asd aspC-thrO를 전기충격(electroporation)을 가하고, 1 mL SOC 배지를 첨가한 후 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 25 ug/L 클로람페니콜(Chloramphenicol)이 포함된 LB 평판배지에 도말한 후 클로람페니콜 내성균 콜로니를 서열번호 10과 서열번호 15로 colony PCR을 수행하여 pntAB asd aspC thrO 유전자가 genome 상에 도입된 것을 확인하였다. 이후 선별 균주에서 pJW168 플라스미드를 형질전환 후 0.1 mM IPTG 첨가된 LB 평판배지에 도말하여 클로람페니콜 내성마커(cat)를 제거하였다(Beatri'z Palmeros et al., 2000, Gene). 상기와 같은 mini-Mu integration 방법으로 순차적으로 pMu-R6K_gdhA aspC thrO를 도입하고 서열번호 18과 서열번호 15로 colony PCR하여 도입여부를 확인하였고, pMu-ppc aspA thrO 도입 후 서열번호 22와 서열번호 27으로 colony PCR하여 도입여부를 확인하였다. 이렇게 제작된 야생형 대장균(W3110) 기반 쓰레오닌 생산 균주를 CJT1이라고 명명하였다.
실시예 2: ilvA 유전자 결손 균주 제작
쓰레오닌 대표 분해 경로인 ilvA 유전자를 결손시키기 위해서, FRT-one-step-PCR deletion 방법을 사용하였다(Kirill A, et al., 2000, PNAS). pKD3 벡터를 주형으로 서열번호 28과 서열번호 29번의 프라이머를 이용하여 PCR 방법을 통한 결손 카세트 (deletion cassette)를 제작하였다. SolGentTM Pfu-X DNA Polymerase (solgent, Korea)를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94 ℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55 ℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72 ℃에서 3분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하였다.
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0 % 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.2 kbp 크기의 밴드로부터 ilvA 결손카세트를 정제하였다. pKD46(Kirill A, et al., 2000, PNAS) 벡터가 도입된 KCCM10541 pKD46과 CJT1 pKD46 균주를 100 ug/L 암피실린(ampicilin)과 5 mM 아라비노스 (L-arabinose)가 포함된 LB 배지에서 30 ℃/200 rpm으로 OD600 = 0.6까지 배양한 후, 멸균 증류수로 1회, 10 % 글리세롤(glycerol)로 2회 세척하여 컴피턴트 세포를 제작하였다. 상기 제작된 컴피턴트 세포에 ilvA 결손카세트를 전기충격(2500V)을 통해 도입하였다. 이후 1 mL SOC 배지를 첨가한 후 37 ℃에서 하룻밤 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주를 서열번호 28과 서열번호 29의 프라이머로 colony PCR한 후 1.0 % 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.2 kb로 관찰되는 것을 확인함으로써 ilvA 유전자 결손을 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터 (Kirill A, et al., 2000, PNAS)로 형질전환시켜 100 ug/L 암피실린(ampicilin) LB 평판 배지에서 도말하여 얻어진 colony에서 다시 동일한 조건의 colony PCR을 통하여 1.0 % 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 150 bp로 작아진 최종 ilvA 유전자 결손 균주를 제작하였고, 클로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하였다. KCCM10541에 ilvA가 결손된 균주를 KCCM10541-ilvA라 명명하고 CJT1에 ilvA가 결손된 균주를 CJT1-ilvA라고 명명하였다.
실시예 3: cimA 유전자 도입 균주의 제작
CJ1 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호)가 포함된 Methanococcus jannaschii 유래 cimA 유전자를 기반으로 코돈-최적화(codon-optimization)하여, Pcj1_cimA, Pcj1_cimA 2.0, Pcj1_cimA 3.7(Atsumi, Liao JC, Appl Environ Microbiol. 2008) DNA를 제작하였다. 유전자 합성시 양쪽 측면에 BamHI site를 첨가하여 CopyControl pCC1BAC(BamHI) (Epicentre, USA)에 subcloning하여 최종적으로 cimA 유전자를 발현하는 pCC1BAC: Pcj1_cimA, pCC1BAC: Pcj1_cimA 2.0, pCC1BAC: Pcj1_cimA 3.7 플라스미드를 제작하였다. 그리고 KCCM10541-ilvA, CJT1-ilvA 균주에 상기의 3종 플라스미드와 대조군(Control) 플라스미드인 pCC1BAC을 전기충격(2500V) 방법으로 형질전환하여 최종적으로 실험에 사용할 균주를 제작하였다. 그리고 실험 비교를 위해서 상기와 같은 방법으로 KCCM10541, CJT1 두 균주에 pCC1BAC을 형질전환한 균주도 제작하였다.
상기에서 cimA 유전자는 야생형 시트라말레이트 합성효소(citramalate synthase)를 코딩하며, cimA 2.0 및 cimA 3.7은 특이적 활성이 증가하고 이소루신에 의한 피드백-저해(feedback-inhibition)가 감소한 변이형 시트라말레이트 합성효소를 코딩한다(Atsumi, Liao JC, Appl Environ Microbiol. 2008). cimA 2.0 및 cimA 3.7에 대한 아미노산 서열은 각각 서열번호 2 및 3이고, 염기서열은 서열번호 5 및 6에 해당한다.
상기 KCCM10541 또는 KCCM10541-ilvA를 기반으로 KCCM10541 pCC1BAC, KCCM10541-ilvA pCC1BAC, KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA, KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0, KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7의 재조합 미생물을 제조하였으며, CJT1 또는 CJT1-ilvA를 기반으로 CJT1 pCC1BAC, CJT1-ilvA pCC1BAC, CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA, CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0, CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7의 재조합 미생물을 제조하였다.
본 발명자들은 상기 재조합 미생물 중 'CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA', 'CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0', 'CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7'의 재조합 미생물을 각각 'CA03-8303', 'CA03-8304', 'CA03-8305'로 명명한 후 부다페스트 조약 하에 2014년 12월 5일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 각각 수탁번호 'KCCM11632P', 'KCCM11633P', 'KCCM11634P'를 부여받았다.
실시예 4: ilvA 결손 및 cimA 발현 균주의 플라스크 평가를 통한 쓰레오닌 생산성 확인
상기 실시예 3에서 제작한 균주들의 쓰레오닌 생산량을 비교하기 위해서 플라스크 평가를 수행하였다. 플라스크 테스트는 각각의 균주를 25 ug/L 클로람페니콜(Chloramphenicol) LB 플레이트에 스트리킹(streaking)하고 33 ℃ 배양기에 16시간 동안 배양한 후, 단일 콜로니(colony)를 LB 배지 2 mL에 접종한 후 200 rpm/33 ℃ 배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 그리고 250 mL 플라스크에 하기 표 3의 쓰레오닌 생산 플라스크 배지 25 mL를 넣고, 앞서 배양한 배양액을 500 uL씩 투입하였다. 이후, 플라스크를 200 rpm/33 ℃ 배양기에서 48 시간 동안 배양한 후, HPLC를 이용해서 각각 균주에서 얻어진 쓰레오닌 양을 비교하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
쓰레오닌 생산 플라스크 배지 조성
조성물 농도(리터당)
포도당 70 g
Ammonium Sulfate 25 g
KH2PO4 1 g
MgSO4·7H2O 0.5 g
FeSO4·7H2O 5 mg
MnSO4·8H2O 5 mg
ZnSO4 5 mg
탄산칼슘 30 g
효모 엑기스 2 g
메치오닌 0.3 g
pH 6.8
플라스크 배양을 통한 생산균주의 쓰레오닌 생산
균주 OD 당 소모량(g/L) 쓰레오닌 생산량(g/L) Acetate 생성량(g/L)
KCCM10541 pCC1BAC 21.6 70 34.7 0.35
KCCM10541-ilvApCC1BAC 5.5 12.0 6.6 0.11
KCCM10541-ilvApCC1BAC:Pcj1_cimA 18.5 70 37.5 0.15
KCCM10541-ilvApCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0 22.5 70 38.3 0.10
KCCM10541-ilvApCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7 23.2 70 37.8 0.08
CJT1pCC1BAC 35.2 70 11.4 2.15
CJT1-ilvApCC1BAC 6.4 13.6 3.0 1.24
CJT1-ilvApCC1BAC:Pcj1_cimA 30.6 70 14.3 1.42
CJT1-ilvApCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0 36.0 70 14.7 1.32
CJT1-ilvApCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7 37.0 70 14.5 1.34
상기 표 4에서 확인한 바와 같이, ilvA가 결손된 KCCM10541-ilvA pCC1BAC, CJT1-ilvA pCC1BAC 두 균주는 ilvA가 결손되지 않은 KCCM10541 pCC1BAC, CJT1 pCC1BAC 균주에 비해서 이소루신에 대한 요구로 인해서 성장이 잘 일어나지 않는 것을 관찰하였다(OD 값 참고). 그러나, 이에 3 종류의 cimA가 도입된 변이 균주(KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA, KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0, KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7, CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA, CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0 및 CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7)에서 모두 성장이 회복되고, 쓰레오닌 생성량도 약 10 내지 30 % 가량 증가하며, 아세테이트 생성량도 약 30 내지 60 % 감소하는 것을 확인하였다.
특히, ilvA 결손 균주에 cimA를 도입한 경우보다 cimA 2.0 또는 cimA 3.7을 도입한 경우에 균주 성장능이 20 % 이상 우수해지고 쓰레오닌 생성량도 다소 증가하고, 아세테이트 생성량도 더욱 감소하는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2016011907-appb-I000001
Figure PCTKR2016011907-appb-I000002
Figure PCTKR2016011907-appb-I000003

Claims (7)

  1. 쓰레오닌 디아미나제 효소(threonine deaminase, IlvA)의 활성이 감소 또는 불활성화되고, 시트라말레이트 신타아제 효소(citramalate synthase)의 활성을 가지는, 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 쓰레오닌 디아미나제는 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는, 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 시트라말레이트 신타아제는 메타노코커스 야나시(Methanococcus jannaschii) 유래의 시트라말레이트 신타아제인, 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 시트라말레이트 신타아제는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는, 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 코리네박테리움 속 미생물 또는 에스케리키아 속 미생물인, 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이고, 상기 에스케리키아 속 미생물은 대장균(Escherichia coli)인, 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 미생물 또는 배지로부터 쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함하는, 쓰레오닌을 생산하는 방법.
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