WO2017069476A1 - 목단피 추출물의 분획물을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

목단피 추출물의 분획물을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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조홍익
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/65—Paeoniaceae (Peony family), e.g. Chinese peony

Definitions

  • the invention mokdanpi (Moutan Cortex Radicis) as a fraction of the composition for the prevention and treatment of liver diseases containing the extract, more specifically mokdanpi extract fraction a, between the prevention or treatment a pharmaceutical composition of the disease, including as an active ingredient of, and It relates to a nutraceutical composition.
  • the liver plays various roles in metabolism of lipids, detoxification, bile excretion, storage of various nutrients, hematopoietic and blood coagulation, and regulation of circulating blood volume, and is one of the essential organs for life support.
  • the function of the liver is to manage energy metabolism, so that all the nutrients absorbed from food are metabolized into substances that can produce energy in the liver and are supplied or stored throughout the body.
  • the liver has the function of synthesizing, storing, and distributing about 2,000 kinds of enzymes, albumin, and serum proteins of coagulation factors, bile acids, phospholipids, and cholesterol.
  • the function of detoxifying drugs, alcohol, toxic substances, etc. the function of excretion of various metabolites into the duodenum, and the immune function plays an important role in maintaining life.
  • hepatitis which causes inflammation of the liver in general, occupies most of the liver disease, and depending on the aspect, it can be divided into acute hepatitis and chronic infection, depending on the cause, viral hepatitis, alcoholic hepatitis, drug hepatitis.
  • liver diseases caused by such abnormalities include fatty liver, hepatitis, cirrhosis, liver cancer, and the like. The mechanism of the progression of liver disease is not fully understood, but it is known that the development of advanced liver disease such as fatty liver and cirrhosis is accompanied by secondary cell damage after primary fatty liver development.
  • liver disease since liver disease is not detected in the early stage of the disease and is found to be progressed considerably, it is at the top of the cause of death both domestically and globally.
  • liver disease Currently, the treatment methods of liver disease that are generally used are largely divided into diet and pharmaceutical therapy, and in most cases, these two methods are used in combination.
  • drugs with various mechanisms of action may be used depending on the cause and type of liver disease, for example, ursodexoycholic acid, silymarine, biphenyl Hepatocellular regeneration accelerators such as dimethyldicarboxylate (DDB), glutathione, carnitine orotate, glycyrrhizin, multivitamins, etc.
  • DDB dimethyldicarboxylate
  • glutathione glutathione
  • carnitine orotate glycyrrhizin
  • multivitamins etc.
  • liver function aids such as acyclovir Drugs such as antiviral agents, corticosteroids, 6-mercaptopurine (6-mercaptopurine, 6-MP), immunosuppressants such as azathioprine, and fibrosis inhibitors such as D-penicillamine Is generally used.
  • acyclovir Drugs such as antiviral agents, corticosteroids, 6-mercaptopurine (6-mercaptopurine, 6-MP), immunosuppressants such as azathioprine, and fibrosis inhibitors such as D-penicillamine Is generally used.
  • 6-MP 6-mercaptopurine
  • immunosuppressants such as azathioprine
  • fibrosis inhibitors such as D-penicillamine Is generally used.
  • the bark of the genus Peony belongs to the genus Paeoniaceae ( Paeonia suffruticosa Andrews) root bark has been widely used in oriental medicine because it has the effect of blue fever, live blood, and ischemia.
  • Bark extracts have been reported to inhibit the release of chemokines, IL-8 and MCP-1, and also to inhibit the expression of inflammatory mediators iNOS and COX-2 in vitro. It is known that the extract of bark skin has very high inhibitory activity against HIV integrase, and paeonol, the main component of bark skin, inhibits the production of free radicals by inhibiting xanthine oxidase. It is known to inhibit the release of TNF- ⁇ , an inflammation mediator.
  • the present inventors have made efforts to find natural substances as a prophylactic or therapeutic agent for liver disease.
  • hepatic ischemia and reperfusion caused blood flow disorders, acute liver failure due to galactosamine / lipopolysaccharide (GalN / LPS), and acetaminophen (APAP).
  • GalN / LPS galactosamine / lipopolysaccharide
  • APAP acetaminophen
  • the present invention has been made to solve the above problems, the inventors of the present invention is to reduce the blood ALT concentration by the fraction treatment of the extract of the bark, extract of hepatic TLR4 protein expression, inhibition of hepatic IL-1 ⁇ protein expression, and The present invention was completed based on the effect of inhibiting lipid peroxidation in liver.
  • an object of the present invention is a Moutan Radicis Cortex ) It is to provide a composition for the prevention or treatment of liver disease, comprising the ethyl acetate fraction of the extract as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a dietary supplement for the prevention or improvement of liver disease, comprising ethyl acetate fraction of the extract of the bark as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of liver disease, comprising a fraction of the extract of Moutan Radicis Cortex as an active ingredient.
  • the extract may be extracted with one or more solvents selected from the group consisting of water, alcohols having 1 to 4 carbon atoms, and mixed solvents thereof.
  • the fraction is obtained by dividing the bark extract with at least one solvent selected from the group consisting of hexane, butanol, methylene chloride, acetone, ethyl acetate, ethyl ether, chloroform, water, and mixed solvents thereof.
  • the solvent may be water, hexane, butanol, or ethyl acetate, and more preferably ethyl acetate.
  • the liver disease may be selected from the group consisting of hepatitis, hepatotoxicity, cholestasis, fatty liver, cirrhosis, hepatic ischemia, alcoholic liver disease, liver abscess, hepatic coma, liver atrophy, and liver cancer. .
  • the composition may inhibit an increase in the concentration of alanine aminotransferase (ALT) in the blood.
  • ALT alanine aminotransferase
  • the composition may inhibit an increase in the amount of expression of TLR (Toll-like receptor) 4 or IL-1 ⁇ (Interleukin 1 beta) protein in the liver.
  • TLR Toll-like receptor
  • IL-1 ⁇ Interleukin 1 beta
  • the composition may inhibit lipid peroxidation in the liver.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving liver disease, comprising a fraction of the extract of the bark as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating liver disease comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • the present invention provides a novel use for the fraction of the extract of the bark dermis for the preparation of a therapeutic agent for liver disease.
  • the composition according to the present invention is a Moutan Radicis Cortex ) extract as an active ingredient, using the composition to effectively reduce the blood ALT concentration, which is an indicator of liver damage, inhibits the increase in the expression of TLR4 or IL-1 ⁇ protein in the liver, hepatic lipid peroxidation It was also specifically confirmed that it could be suppressed. Therefore, the present invention has the advantage that it can be used in the body for a long time because it exhibits excellent liver protection effect and almost no toxicity and side effects by using a natural-derived active ingredient, which can be usefully used as a composition for preventing or treating liver disease. It is expected to be able.
  • ALT alanine aminotransferase
  • Figure 2a shows the change in ALT activity according to the ethyl acetate fraction treatment (1.25, 2.5 and 5 mg / kg) of the extract of the bark skin, for blood flow disorder due to hepatic ischemia and reperfusion
  • Figure 2b is the hexane fraction treatment (1, 5 and 25 mg / kg) change in ALT activity
  • 2c changes in ALT activity according to butanol fraction treatment (1, 5 and 25 mg / kg)
  • 2d is ALT activity in water fraction treatment (1, 5 and 25 mg / kg). It is the result of comparing activity change.
  • Figure 3a shows the amount of TLR4 protein expression according to the ethyl acetate fraction treatment (1.25 and 2.5 mg / kg) of the bark extract, hepatic ischemia and hemoperfusion caused by reperfusion
  • Figure 3b is treated with ethyl acetate fraction of the bark extract (1.25 and IL-1 ⁇ according to 2.5 mg / kg) This is a result of comparing the amount of protein expression.
  • Figure 4 is a result of comparing the changes in ALT activity according to the ethyl acetate fraction treatment (1.25, 2.5 and 5 mg / kg) of the extract of the bark skin for acute liver failure due to GalN / LPS.
  • FIG. 5 shows TLR4 or IL-1 ⁇ according to the ethyl acetate fraction treatment (1.25, 2.5 and 5 mg / kg) of the extract of Bark skin for acute liver failure due to GalN / LPS This is a result of comparing the amount of protein expression.
  • MDA malondialdehyde
  • the present invention is Moutan Radicis Cortex ) provides a composition for preventing or treating liver disease, comprising a fraction of the extract as an active ingredient, the composition comprises a pharmaceutical composition or nutraceutical composition.
  • the present invention can be effectively prevent or treat liver disease because the side effects of the conventional therapeutics are insignificant even when extracted from natural products for a long time and have an inhibitory effect on hepatocellular necrosis and liver damage.
  • moutan skin refers to a medicinal herb made from the roots of Paeonia suffruticosa Andrews. It has been used for symptoms, blood pressure rise, blood removal, bruises, anti-inflammatory pain, boil treatment, early appendicitis, etc.
  • the main pharmacological effects of bark skin are analgesic, sedation, antipyretic, anticonvulsion, anti-inflammatory, antithrombotic, antiallergic, gastric juice. Secretion suppression, uterine mucosal bleeding, antibacterial activity has been reported.
  • the extracting solvent to prepare the extract of the bark from the bark skin, by fractionation, to prepare a fraction of the bark extract of the present invention.
  • the bark extract may be extracted according to a conventional method known in the art for extracting the extract from natural products, that is, using a conventional solvent under the conditions of conventional temperature, pressure.
  • the bark extract in the present invention may be extracted using one or more solvents selected from the group consisting of water, alcohols having 1 to 4 carbon atoms, and mixed solvents thereof, preferably ethanol. Extracting the extract of the neck bark may be extracted through various methods such as hot water extraction, cold extraction, reflux extraction, ultrasonic extraction, but is not limited thereto.
  • the prepared extract may be removed after the filtering or concentration or drying process to remove the solvent, it can be carried out both filtration, concentration and drying.
  • the filtration may be performed using a filter paper or a reduced pressure filter
  • the concentration may be performed under a reduced pressure concentrator
  • the drying may be a freeze drying method, but is not limited thereto.
  • the extract extracted with the solvent is then subjected to the fractionation process with a solvent selected from the group consisting of hexane, butanol, methylene chloride, acetone, ethyl acetate, ethyl ether, chloroform, water and mixtures thereof.
  • a solvent selected from the group consisting of hexane, butanol, methylene chloride, acetone, ethyl acetate, ethyl ether, chloroform, water and mixtures thereof.
  • a solvent selected from the group consisting of hexane, butanol, methylene chloride, acetone, ethyl acetate, ethyl ether, chloroform, water and mixtures thereof.
  • it may be water, hexane, butanol, and ethyl acetate, and more preferably ethyl acetate, but is not limited thereto.
  • liver disease which is a disease to be improved, prevented or treated by the composition of the present invention refers to a problem in one or more of the various functions performed by the liver, which means that normal metabolism cannot be performed.
  • the most common hepatitis is hepatitis, which is divided into acute hepatitis and chronic hepatitis. In general, acute hepatitis is easy to treat and is benign. Acute hepatitis includes viral hepatitis, alcoholic hepatitis, and addictive hepatitis. The most common hepatitis disease is hepatitis caused by viruses.
  • the liver disease may preferably be hepatitis, hepatotoxicity, cholestasis, fatty liver, cirrhosis, liver ischemia, alcoholic liver disease, liver abscess, hepatic coma, liver atrophy and liver cancer, but is not limited thereto.
  • Fractions of the extract of the bark of the present invention can inhibit the increase in the concentration of ALT (alanine aminotransferase) in the blood in hepatocytes.
  • ALT alanine aminotransferase
  • alanine aminotransferase an enzyme that is present in large amounts in hepatocytes and is an enzyme that is specific for liver disease.
  • the normal range of ALT is 7-56 units per liter of serum.
  • the enzyme catalyzes the chemical reaction in the cell that transfers the amino group from the donor molecule to the donor molecule and is used as a specific indicator of liver status because it is present in large amounts in hepatocytes.
  • Fractions of the extract of the bark of the present invention can inhibit the increase in TLR (Toll-like receptor) 4 protein expression in liver tissue.
  • TLR Toll-like receptor 4 protein
  • Fractions of the extract of the bark of the present invention can inhibit the increase in the amount of IL-1 ⁇ protein expression in liver tissue.
  • IL-1 ⁇ Interleukin 1 beta protein
  • IL-1 ⁇ Interleukin 1 beta protein
  • monocytes and macrophages a monokine produced by monocytes and macrophages, corresponds to an inflammatory cytokine, and recognizes inflammation in the liver. Used as an indicator.
  • Fractions of the extract of the bark of the present invention can inhibit lipid peroxidation in liver tissue.
  • lipid peroxidation used in the present invention refers to lipid peroxidation by adding oxygen to unsaturated fatty acid, which is a lipid component.
  • Lipid peroxide generated in vivo causes injury to the biological membrane system, and enzymes, proteins, hormones, vitamins, etc. It can be used as an indicator of liver disease because it denatures and causes cell death or necrosis.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of liver disease by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment used in the present invention means any action that improves or advantageously changes the symptoms for liver disease by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the extract of the neck dermis in various liver injury animal models including hepatic ischemia and reperfusion, hepatic impairment by galactosamine / lipopolysaccharide (GalN / LPS) and drug liver damage by acetaminophen (APAP)
  • GalN / LPS galactosamine / lipopolysaccharide
  • APAP acetaminophen
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is conventionally used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, Polyvinyl pyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • it may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • compositions of the present invention can be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, and the dosage is determined by the condition and weight of the patient, Depending on the extent, drug form, route of administration, and time, it may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level refers to the type of disease, the severity, the activity of the drug, The sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of the drug, and other factors well known in the medical art can be determined.
  • the pharmaceutical compositions according to the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be readily determined by one skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, condition, weight of the patient, the absorption of the active ingredient in the body, the inactivation rate and excretion rate, the type of disease, the drug used in general 100 to 500 mg / kg body weight may be administered daily or every other day, or divided into 1 to 3 times a day.
  • the dose may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., the above dosage does not limit the scope of the present invention by any method.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving liver disease comprising a fraction of the extract of the bark skin as an active ingredient.
  • the term " improvement" means any action that at least reduces the parameters associated with the condition being treated, such as the extent of symptoms.
  • the health functional food composition may be used simultaneously or separately with the medicament for treatment before or after the onset of the disease for the prevention or improvement of liver disease.
  • the active ingredient may be added to the food as it is, or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention or improvement).
  • the compositions of the invention are added in an amount of up to 15% by weight, preferably up to 10% by weight relative to the raw materials.
  • the amount may be below the above range.
  • the health functional food composition of the present invention in addition to containing the active ingredient as an essential ingredient in the indicated ratio, is not particularly limited to other ingredients, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents such as, tauumatin, stevia extracts (e.g., Rebaudioside A, glycyrzin, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the proportion of the natural carbohydrate can be appropriately determined by the choice of those skilled in the art.
  • the nutraceutical composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese, chocolate), pectic acid and salts thereof, Alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks and the like.
  • these components can be used independently or in combination. The proportion of such additives may also be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the invention provides a method of treating liver disease comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • "individual” means a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, a mammal, such as a primate, mouse, dog, cat, horse, and cow, which is human or non-human. do.
  • mice were supplied with ICR male mice (21-23 g) from Daehan Biolink Co., Ltd. and purified for 1 week before being used for the experiment. All experimental animals were purified in a laboratory where the contrast was adjusted at temperature and 12 hour intervals, and the solid feed (Dae Biolink) and water were ingested freely. All animal experiments were approved by the Animal Experiment Ethics Committee of the College of Pharmacy, Sungkyunkwan University, and were tested according to the guidelines of the National Institutes of Health (NIH publication No. 86-23, revised 1985).
  • mice were fasted for 18 hours and then anesthetized with ketamine (ketamine, 6 mg / kg) and xylazine (xylazine, 8 mg / kg), and laparotomy along the midline of the abdomen, leading to oxygenation in the left branch of the portal vein and in the liver.
  • Hepatic artery and bile ducts were clamped to cause ischemia for 60 minutes and then the clamps were removed to cause perfusion.
  • Blood was collected from the abdominal aorta at 5 hours of reperfusion, and the left and middle lobes of the liver were extracted and stored at ⁇ 80 ° C. for analysis.
  • the control group (sham) performed the same procedure as above without placing clamps only in the left branch of the portal vein, hepatic artery and bile duct.
  • the extracts of the neck skin or fractions thereof were administered orally two times at the same time once a day from 2 days before surgery (48 hours and 24 hours before hepatic ischemia surgery), and once or before 1 hour before surgery.
  • mice were fasted for 18 hours and then intraperitoneally administered GalN (800 mg / kg) and LPS (40 ⁇ g / kg). Blood was collected from the abdominal aorta at 6 hours after GalN / LPS administration, and the left and middle lobes of the liver were extracted and stored at 80 ° C. for analysis.
  • the control group was administered intraperitoneally only with physiological saline and all the test methods were performed as above.
  • test substance was administered orally twice a day at the same time 2 days before GalN / LPS administration (48 hours and 24 hours before GalN / LPS administration), and once orally once per hour on the day of GalN / LPS administration It was.
  • mice were fasted for 18 hours and then APAP (400 mg / kg) was administered intraperitoneally. Blood was collected from the abdominal aorta 24 hours after APAP administration, and the left and middle lobes of the liver were extracted and stored at ⁇ 80 ° C. for analysis. The control group was administered intraperitoneally only with physiological saline and all the test methods were performed as above.
  • test substance was administered orally two times at the same time once a day from two days before APAP administration (48 hours and 24 hours before APAP administration) and orally at 1 hour before administration on the day of APAP administration.
  • Blood ALT activity was measured with a spectrophotometer (spectrophotometer, UV-1601, Simadzu, Japan) using the IVDLab kit (IVD Lab, Korea).
  • the liver tissue was homogenized in a RIPA protein extraction solution (CellNest, Korea) in a 10-fold volume to extract the protein and centrifuged at 13,000 x g, 4 °C for 6 minutes to take only the supernatant.
  • the collected supernatant was quantified using a BCA protein assay kit (Pierce Biotechnology, IL, USA), and then mixed 1: 1 with 2 x Western sample buffer and heated and denatured in boiling water for 7 minutes.
  • Protein samples (16 ⁇ g) were separated by SDS-PAGE and electrophoresed on polyvinyllidene fluoride membrane (Millipore, MA, USA) using Semi-Dry Trans-Blot Cell (Bio-Rad Laboratories, CA, USA).
  • the electrophoretic membrane was washed with TBS / T and then blocked with TBS / T containing 5% (w / v) skim milk for 1 hour at room temperature. After reacting with the primary antibody for 12 hours at 4 °C, and the secondary antibody for 1 hour at room temperature, it was developed using an ECL detection system (iNtRON Biotechnology Inc.).
  • Each band was quantified using TOTALLAB TL 120 software (Nonlinear Dynamics Ltd., Newcastle, UK) and the primary antibodies used were: TLR4 (1: 10000 dilution, Santa cruz biotechnology Inc., CA, USA) , IL-1 ⁇ (1: 2500 dilution, BioVision, CA, USA) and ⁇ -actin (1: 5000 dilution, Sigma Aldrich, MO, USA). The measurement results were normalized to ⁇ -actin.
  • MDA malondialdehyde
  • the serum ALT activity of the sham mice before the hepatic ischemia operation was 63.1 ⁇ 7.4 U / L, but after 5 hours of reperfusion, the serum ALT activity of the control group was before the hepatic ischemia operation. 163.1-fold increase compared to mice, through which hepatocellular damage was confirmed through hepatic ischemia surgery.
  • the ALT activity of 100 mg / kg of 70% ethanol extract was significantly inhibited in the blood ALT activity compared to the control group, and the ALT activity of 30 or 300 mg / kg of 70% ethanol extract was significantly compared to the control group. Showed a tendency to be slightly suppressed.
  • TLR4 protein in liver tissue was significantly increased 1.6 times compared to the control group in ischemia and reperfusion, but as shown in FIG. 3A, 70% ethanol extract ethyl acetate fractions 1.25 and 2.5 mg / kg and 70% ethanol extract 100 mg / It was confirmed that the expression of kg significantly inhibited its expression.
  • IL-1 ⁇ in liver tissue Protein expression was significantly increased by 1.7-fold compared with the control group in ischemia and reperfusion, but as shown in FIG. 3B, the expression of 70% ethanol extract ethylacetate fraction 1.25 and 2.5 mg / kg of bark skin significantly inhibited its expression. It was confirmed that 100 mg / kg administration of% ethanol extract showed only a tendency to reduce its expression.
  • the water, butanol, hexane or ethyl acetate (EA) fractions showed better inhibitory effect on blood ALT activity and hepatic TLR4 or IL-1 ⁇ protein expression compared to 70% ethanol extracts of bark skin.
  • the ethyl acetate fraction of these shows the best effect, that is, the best liver protection effect.
  • the following examples were carried out in-depth experiments on the ethyl acetate fraction.
  • the blood ALT activity before the fraction treatment was 45.0 ⁇ 8.7 U / L in the control (control), and 6 hours after GalN / LPS administration, 16.7 times increased compared to the control, as shown in Figure 4, 70% Ethanol extract Ethyl acetate fractions 1.25, 2.5 and 5 mg / kg administration significantly inhibited the increase of ALT due to GalN / LPS.
  • administration of fractions 1.25 and 2.5 mg / kg resulted in 100 mg / kg ethanol extract of In comparison (when considering the 13.3% yield), it showed an excellent inhibitory effect on ALT activity.
  • the protein expression level of TLR4 in liver tissue was significantly increased by 2.1 times compared to the control group during GalN / LPS treatment before the fraction treatment.
  • 1.25 and 2.5 mg / kg of ethyl acetate fractions of 70% ethanol extract of neck bark were administered.
  • the expression was significantly suppressed, and the administration of 100 mg / kg of 70% ethanol extract showed only a tendency to decrease the expression.
  • the blood ALT activity before the fraction treatment was 35.2 ⁇ 8.0 U / L in the control (control), 24 hours after APAP administration, blood ALT activity was increased 249.0 times compared to the control, as shown in Figure 6,
  • Administration of 1.25 mg / kg of the ethyl acetate fraction of 70% ethanol significantly inhibited the increase of ALT due to APAP, and administration of 2.5 and 5 mg / kg showed a tendency to suppress the increase of ALT due to APAP.
  • the administration of 100 mg / kg of 70% ethanol extract of bark skin did not affect the ALT increase due to APAP.
  • MDA malondialdehyde
  • FIG. 7 administration of 70% ethanol extract of bark skin 70% ethanol extract significantly inhibited the increase of MDA due to APAP, while administration of 100 mg / kg of bark skin 70% ethanol extract to APAP. It was confirmed that it did not affect the increase in MDA.
  • ethylacetate fraction showed a remarkably superior liver protection effect compared to 70% ethanol extract of bark bark, and thus it is expected to be useful as a composition for preventing or treating liver disease. .
  • the composition according to the present invention is a Moutan Radicis Cortex ) extract as an active ingredient, using the composition to effectively reduce the blood ALT concentration, which is an indicator of liver damage, inhibits the increase in the expression of TLR4 or IL-1 ⁇ protein in the liver, hepatic lipid peroxidation It was also specifically confirmed that it could be suppressed. Therefore, the present invention has the advantage that it can be used in the body for a long time because it exhibits excellent liver protection effect and almost no toxicity and side effects by using a natural-derived active ingredient, which can be usefully used as a composition for preventing or treating liver disease. It is expected to be able.

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Abstract

본 발명은 간질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 목단피 (Moutan Radicis Cortex) 추출물의 분획물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 상기 조성물을 이용하여 혈중 ALT 농도를 효과적으로 감소시키고, 간장 내 TLR4 또는 IL-1β 단백질 발현의 증가를 억제시키며, 간장 내 지질과산화 또한 억제시킬 수 있음을 구체적으로 확인하였는바, 간질환의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

목단피 추출물의 분획물을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 목단피 (Moutan Cortex Radicis ) 추출물의 분획물을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물로서, 보다 구체적으로 목단피 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
간은 우리 몸에서 지질 등의 대사 작용, 해독, 담즙의 배설, 각종 영양소의 저장, 조혈이나 혈액 응고, 및 순환 혈액량의 조절 등 다양한 역할을 담당하고 있으며, 생명 유지를 위한 필수적인 장기 중 하나이다. 간의 기능을 보다 구체적으로 살펴보면, 우선, 에너지 대사를 관리하는 기능이 있어 음식물에서 흡수된 모든 영양소들이 간에서 에너지를 생산할 수 있는 물질로 대사되어 전신에 공급되거나 저장된다. 둘째, 간은 약 2,000 여종의 효소, 알부민, 응고 인자들의 혈청 단백질, 담즙산, 인지질, 콜레스테롤 등의 지방 등을 합성하고 저장하며 분배하는 기능이 있다. 셋째, 해독 및 분해 기능으로서 약물, 술, 독성물질 등을 해독시키는 기능, 각종 대사산물을 십이지장으로 배설하는 기능 및 면역 기능이 있어 생명 유지에 중요한 역할을 하고 있다.
한편, 일반적으로 간에 염증이 생기는 간염이 간질환의 대부분을 차지하며, 양상에 따라 급성 간염과 만성 감염, 원인에 따라 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 약물성 간염 등으로 나눌 수 있다. 또한, 이런 이상으로 유발되는 간질환에는 지방간, 간염, 간경변증, 간암 등이 있다. 간질환의 진행 과정의 기전은 완전히 밝혀지지는 않았으나 일차적으로 지방간이 발생된 후 이차적인 세포 손상이 수반되어 지방간 및 간경화 등의 진행성 간질환으로 발전하는 것으로 알려져 있다. 또한, 간질환은 초기에 자각 증상이 없어 상당히 진행되어서야 발견되기 때문에, 국내뿐만 아니라 세계적으로 사망 원인의 수위를 차지하고 있다.
현재, 일반적으로 이용되고 있는 간질환의 치료방법은 크게 식이요법과 약제요법으로 구분되며, 대부분의 경우에 이 두 가지 방법을 병용하고 있다. 간질환에 대한 약제요법에서는 간질환의 발병 원인 및 종류에 따라 다양한 작용기전을 갖는 약제들이 이용될 수 있는데, 예를 들면, 우루소데옥시콜린산 (ursodexoycholic acid), 실리마린 (silymarine), 바이페닐디메틸디카복실레이트 (biphenyldimethyldicarboxylate, DDB), 글루타티온 (glutathione), 오로트산 카르니틴 (carnitine orotate), 글리시르히진 (glycyrrhizin), 종합 비타민제 등과 같은 간세포 재생 촉진제 및 간 기능 보조제, 아시클로바 (acyclovir)와 같은 항바이러스제, 코티코스테로이드 (corticosteroid), 6-머캅토퓨린 (6-mercaptopurine, 6-MP), 아자티오프린 (azathioprine) 등과 같은 면역억제제, D-페니실아민 (penicillamine)과 같은 섬유화 억제제 등의 약제가 일반적으로 사용되고 있다. 그러나 이들 약제들의 제한적인 간 보호 효과와 부작용 등에 의해 근본적인 간질환 치료에 어려움을 겪고 있다. 이에, 오늘날 생체 적합성이 우수하고, 부작용의 우려가 적은 천연물 유래 간질환 치료제에 대한 관심이 고조되고 있으며, 주요한 과제의 대상이 되고 있으나 (한국공개 특허 10-2015-0098161), 대다수의 천연물의 경우, 유효 용량뿐만 아니라 정확한 약리효과에 대한 기초 연구결과가 미약하여 간질환 치료제로의 이용에 어려움을 겪고 있다.
한편, 목단피는 작약과 (Paeoniaceae)에 속하는 목단 (Paeonia suffruticosa Andrews)의 뿌리껍질로 한의학적으로 청열양혈, 활혈산어, 퇴허혈 작용을 가지고 있어 널리 이용되어 왔다. 목단피 추출물은 생체 외에서 케모카인 (chemokine)의 일종인 IL-8 및 MCP-1의 유리를 억제하며, 또한 염증 매개인자인 iNOS 및 COX-2 발현을 억제하는 활성이 보고되었다. 목단피의 추출물이 HIV 인테그레이즈 (HIV integrase)에 대하여 억제 활성이 매우 우수하다고 알려졌으며, 목단피의 주성분인 파에오놀 (paeonol)은 잔틴 옥시다아제 (xanthine oxidase)를 억제하여 활성산소의 생성을 억제 시키며, 염증매개인자인 TNF-α의 유리를 억제한다고 알려져 있다.
이와 같은 배경 하에서, 본 발명자들은 간질환의 예방 또는 치료제로서 천연물질을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 간장 허혈 및 재관류로 인한 혈류장애, galactosamine/lipopolysaccharide (GalN/LPS)에 의한 급성 간부전 및 acetaminophen (APAP)에 의한 약물 간손상을 포함하는 다양한 간손상에 목단피 추출물의 분획물을 처리한 경우, 우수한 간 보호 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 목단피 추출물의 분획물 처리에 의한 혈중 ALT 농도의 감소, 간장 내 TLR4 단백질 발현의 억제, 간장 내 IL-1β 단백질 발현의 억제, 및 간장 내 지질과산화 억제 효과를 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 목단피 (Moutan Radicis Cortex) 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 간질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 목단피 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 목단피 (Moutan Radicis Cortex) 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 분획물은 목단피 추출물을 헥산, 부탄올, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 물, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 분획한 것일 수 있으며, 상기 용매는 바람직하게는 물, 헥산, 부탄올, 또는 에틸아세테이트일 수 있고, 보다 바람직하게는 에틸아세테이트이다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 간질환은 간염, 간독성, 담즙울체, 지방간, 간경변, 간허혈, 알코올성 간질환, 간 농양, 간성 혼수, 간 위축증, 및 간암으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 혈중 ALT (alanine aminotransferase)의 농도 증가를 억제시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 간장 내 TLR (Toll-like receptor) 4 또는 IL-1β (Interleukin 1 beta) 단백질의 발현양 증가를 억제시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 간장 내 지질과산화를 억제시킬 수 있다.
본 발명은 목단피 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 간질환 치료제 제조를 위한 목단피 추출물의 분획물에 대한 신규한 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 목단피 (Moutan Radicis Cortex) 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하며, 상기 조성물을 이용하여 간 손상의 지표인 혈중 ALT 농도를 효과적으로 감소시키고, 간장 내 TLR4 또는 IL-1β 단백질 발현의 증가를 억제시키며, 간장 내 지질과산화 또한 억제시킬 수 있음을 구체적으로 확인하였다. 따라서 본 발명은 천연물 유래 활성 성분을 이용함으로써, 우수한 간 보호 효능을 나타냄과 함께 독성 및 부작용이 거의 없어 장기간 체내에 사용할 수 있는 장점을 가지는바, 간질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 간장 허혈 및 재관류로 인한 혈류장애에 대하여, 목단피 추출물 처리 (30, 100 및 300 mg/kg)에 따른 ALT (alanine aminotransferase) 활성 변화를 비교한 결과이다.
도 2a는 간장 허혈 및 재관류로 인한 혈류장애에 대하여, 목단피 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 (1.25, 2.5 및 5 mg/kg)에 따른 ALT 활성 변화를, 도 2b는 헥산 분획물 처리 (1, 5 및 25 mg/kg)에 따른 ALT 활성 변화를, 2c는 부탄올 분획물 처리 (1, 5 및 25 mg/kg)에 따른 ALT 활성 변화를 2d는 물 분획물 처리 (1, 5 및 25 mg/kg)에 따른 ALT 활성 변화를 비교한 결과이다.
도 3a는 간장 허혈 및 재관류로 인한 혈류장애에 대하여, 목단피 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 (1.25 및 2.5 mg/kg)에 따른 TLR4 단백질 발현양을, 도 3b는 목단피 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 (1.25 및 2.5 mg/kg)에 따른 IL-1β 단백질 발현양 변화를 비교한 결과이다.
도 4는 GalN/LPS로 인한 급성 간부전에 대하여, 목단피 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 (1.25, 2.5 및 5 mg/kg)에 따른 ALT 활성 변화를 비교한 결과이다.
도 5는 GalN/LPS로 인한 급성 간부전에 대하여, 목단피 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 (1.25, 2.5 및 5 mg/kg)에 따른 TLR4 또는 IL-1β 단백질 발현양 변화를 비교한 결과이다.
도 6은 APAP로 인한 약물 간손상에 대하여, 목단피 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 (1.25, 2.5 및 5 mg/kg)에 따른 ALT 활성 변화를 비교한 결과이다.
도 7은 APAP로 인한 약물 간손상에 대하여, 목단피 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리 (1.25, 2.5 및 5 mg/kg)에 따른 말론디알데히드 (malondialdehyde, MDA) 양 변화를 비교한 결과이다.
본 발명은 목단피 (Moutan Radicis Cortex) 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 간질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 포함한다.
특히, 본 발명은 천연물로부터 추출하여 장기간 복용해도 종래 치료제가 지닌 부작용이 미미하며, 간세포 괴사 및 간 손상에 대한 억제 효과를 가지므로 효과적으로 간질환을 예방하거나 치료할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "목단피 (Moutan Radicis Cortex)"는 작약과의 목단 (Paeonia suffruticosa Andrews)의 뿌리껍질로 만든 약재를 말하며, 혈열로 인한 생리불순, 생리통, 멍들었을 때, 토혈, 코피, 반점이 나타나는 증상, 허열로 인해 뼛골이 쑤시는 증상, 혈압상승, 어혈제거, 타박상, 소염 진통, 종기치료, 맹장염 초기 등에 사용되어 왔다. 목단피의 주요한 약리작용으로는 진통, 진정, 해열, 항경련, 항염증, 항혈전, 항알레르기, 위액 분비 억제, 자궁점막출혈, 항균작용 등이 보고되어 있다.
본 발명에서, 추출 용매를 이용하여 목단피로부터 목단피 추출물을 제조한 후, 이를 분획함으로써, 본 발명의 목단피 추출물의 분획물을 제조한다.
이때, 목단피 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 예컨대, 본 발명에서 목단피 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다. 목단피 추출물을 추출하는 방법은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 통하여 추출할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제조된 추출물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 예컨대, 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 동결 건조법 등을 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 헥산, 부탄올, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 실시한다. 바람직하게는 물, 헥산, 부탄올, 및 에틸아세테이트일 수 있으며, 보다 바람직하게는 에틸아세테이트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 조성물에 의한 개선, 예방 또는 치료 대상 질병인 "간질환"은 간이 수행하는 여러 가지 기능 중 한 가지 이상의 기능에 문제가 생겨 정상적으로 대사를 수행할 수 없는 것을 말한다. 간질환에서 가장 많이 나타나는 것은 간염으로 급성 간염과 만성 간염으로 나뉘며, 일반적으로는 급성 간염이 치료하기 쉽고 양성에 속한다. 급성간염은 원인별로 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 중독성 간염 등이 있으며, 간질환 중 현재 가장 많이 발견되는 것은 바이러스에 의한 간염이다. 상기 간질환은 바람직하게 간염, 간독성, 담즙울체, 지방간, 간경변, 간허혈, 알코올성 간질환, 간농양, 간성 혼수, 간 위축증 및 간암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 목단피 추출물의 분획물은 간세포에서 혈중 ALT (alanine aminotransferase)의 농도 증가를 억제시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "ALT (alanine aminotransferase)"는 알라닌 아미노전이효소라고도 하며, 간세포에 다량 존재하는 효소로 간질환에 특이적인 지표가 되는 효소이다. ALT의 정상범위는 혈청 1 리터당 7~56 단위이다. 상기 효소는 아미노 그룹을 공여 분자에서 수여분자로 전이시키는 세포내의 화학반응을 촉매하며, 간세포에 다량 존재하므로 간 상태를 나타내는 특이적인 지표로 이용된다.
본 발명의 목단피 추출물의 분획물은 간 조직에서 TLR (Toll-like receptor) 4 단백질 발현양 증가를 억제시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "TLR (Toll-like receptor) 4 단백질"은 세균, 바이러스, 기생충 등의 병원체에 대한 초기단계의 생체방어의 자연면역에서 병원체를 구성하고 있는 성분의 특유한 분자패턴을 직접, 인식하는 수용체의 하나로서, 그람음성세균-유래 지질다당 (LPS)을 인식하는 지표로 이용된다.
본 발명의 목단피 추출물의 분획물은 간 조직에서 IL-1β 단백질 발현양 증가를 억제시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "IL-1β (Interleukin 1 beta) 단백질"은 단핵구 및 대식세포에 의해 생산되는 모노카인인 인터류킨-1의 패밀리 중 하나로, 염증성 사이토카인에 해당하며, 간 내 염증을 인식하는 지표로 이용된다.
본 발명의 목단피 추출물의 분획물은 간 조직에서 지질과산화를 억제시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "지질과산화"는 지질 성분인 불포화지방산에 산소가 첨가되어 지질이 과산화되는 것으로, 생체 내에서 생긴 과산화지질은 생체막계에 상해를 주고, 또 효소, 단백, 호르몬, 비타민 등을 변성시켜 세포의 기능저하나 괴사를 야기하므로, 임상적으로 간질환의 지표로 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 간질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 간질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 실시예에서는, 간장 허혈 및 재관류로 인한 혈류장애, galactosamine/lipopolysaccharide (GalN/LPS)에 의한 급성 간부전 및 acetaminophen (APAP)에 의한 약물 간손상을 포함하는 다양한 간손상 동물모델에 목단피 추출물 또는 추출물의 분획물을 처리함으로써, 간 손상에 따른 치료 효과를 확인하고자 하였다. 그 결과, 목단피 추출물의 분획물을 처리한 군에서, 간 손상을 나타내는 지표인 혈중 ALT 농도가 유의적으로 감소하였으며, 상기 결과는 목단피 추출물을 처리한 군과 비교하여 현저하게 우수하였으며, 특히 에틸아세테이트 용매를 사용한 분획물의 경우, 다른 용매 군과 비교시 보다 우수한 효과를 나타내는바, 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다 (실시예 2 내지 5 참조).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 100 내지 500 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 목단피 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이때 상기 건강기능식품 조성물은 간질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
본 발명의 건간기능식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적 (예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간질환의 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비 및 실험방법
1-1 목단피 추출물 및 이의 분획물 추출
표준품 규격의 목단피 (약초약업사) 300 g을 준비하였다. 상기 목단피를 70 % 에탄올을 추출용매로 하여 5시간동안 환류하에서 온침 (55~60℃)을 실시하여 2회 추출하였다. 추출 후 얻어진 여액을 감압 농축하여 70 % 에탄올을 제거하고 목단피 추출물을 수득하였다. 최종 목단피 추출물은 55.8 g으로 수득률이 18.6%였다. 이후, 70 % 에탄올 추출물 40 g을 증류수 400 ml에 현탁하고 동량의 헥산, 에틸아세테이트 (EA), 부탄올 및 물 용매를 사용하여 각각 3회 반복 순차적으로 분배 추출하였다. 얻어진 모든 용매 분획은 감압 하에서 농축하여 핵산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물을 각각 2.1, 5.3, 4.2 및 17.6 g 얻었다.
1-2. 실험 동물
실험 동물은 ㈜ 대한바이오링크로부터 ICR계 웅성 생쥐 (21-23 g)를 공급받아 1 주일 동안 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 모든 실험 동물은 온도 및 12 시간 간격으로 명암이 조절되는 실험실에서 순화하였으며, 고형 사료 (대한바이오링크) 및 물은 자유롭게 섭취시켰다. 모든 동물 실험은 성균관대학교 약학 대학 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았으며, National Institutes of Health의 가이드라인 (NIH publication No. 86-23, revised 1985)에 따라 실험하였다.
1-3. 간장 허혈 및 재관류 손상
마우스를 18 시간 동안 절식시킨 후 케타민 (ketamine, 6 mg/kg) 및 자일라진 (xylazine, 8 mg/kg)으로 마취시켰으며, 복부 정중선을 따라 개복하여 문맥의 왼쪽분지와 간장 내 산소 공급에 주된 역할을 하는 간동맥 및 담관을 클램핑하여 60 분간 허혈을 유발시킨 후 클램프를 제거하여 재관류를 일으켰다. 재관류 5 시간에 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취하고 간의 좌엽 및 중앙엽을 적출하여 -80℃에 보관 후 분석에 사용하였다. 대조군 (sham)은 문맥의 왼쪽 분지, 간동맥 및 담관에 클램프만을 놓지 않고 모든 시험법을 위와 동일하게 시행하였다.
목단피 추출물 또는 이의 분획물은 수술 2 일 전부터 1 일 1 회 동일한 시각에 2회 경구 투여하였으며 (간장 허혈 수술 전 48 시간 및 24 시간), 수술 당일에는 수술 1 시간 전에 1회 경구 투여하였다.
1-4. Galactosamine/lipopolysaccharide (GalN/LPS) 유도 급성 간부전
마우스를 18 시간 동안 절식시킨 후 GalN (800 mg/kg) 및 LPS (40 μg/kg)를 복강 내 투여하였다. GalN/LPS 투여 후 6 시간에 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취하고 간의 좌엽 및 중앙엽을 적출하여 80 ℃에 보관 후 분석에 사용하였다. 대조군은 생리적 식염수만을 복강 내 투여하고 모든 시험법을 위와 동일하게 시행하였다.
실험물질은 GalN/LPS 투여 2일 전부터 1일 1회 동일한 시각에 2회 경구 투여하였으며 (GalN/LPS 투여 전 48 시간 및 24 시간), GalN/LPS 투여 당일에는 투여 전 1시간에 1회 경구 투여하였다.
1-5. Acetaminophen (APAP) 유도 약물 간손상
마우스를 18 시간 동안 절식시킨 후 APAP (400 mg/kg)를 복강 내 투여하였다. APAP 투여 후 24 시간에 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취하고 간의 좌엽 및 중앙엽을 적출하여 -80℃에 보관 후 분석에 사용하였다. 대조군은 생리적 식염수만을 복강 내 투여하고 모든 시험법을 위와 동일하게 시행하였다.
실험물질은 APAP 투여 2일 전부터 1 일 1 회 동일한 시각에 2회 경구 투여하였으며 (APAP 투여 전 48 시간 및 24 시간), APAP 투여 당일에는 투여 전 1 시간에 경구 투여하였다.
1-6. 혈중 alanine aminotransferase (ALT) 활성 확인
혈중 ALT 활성은 IVDLab kit (아이비디랩, 한국)를 사용하여 분광광도계 (spectrophotometer, UV-1601, Simadzu, 일본)로 측정하였다.
1-7. 간 조직 내 TLR4 및 IL-1β 단백질 발현량 확인
간 조직을 RIPA 단백질 추출 용액 (CellNest, 한국)에 10 배 부피로 균질화하여 단백질을 추출한 후 13,000 x g, 4 ℃에서 6 분간 원심분리하여 상층액만을 취하였다. 채취한 상층액을 BCA protein assay kit (Pierce Biotechnology, IL, 미국)를 이용하여 정량한 후, 2 x Western sample buffer와 1:1로 혼합하여 끓는 물에서 7 분 동안 가열 및 변성시켰다. 단백질 샘플 (16 μg)을 SDS-PAGE로 분리한 후 Semi-Dry Trans-Blot Cell (Bio-Rad Laboratories, CA, 미국)을 이용하여 polyvinyllidene fluoride membrane (Millipore, MA, 미국)에 전기영동 하였다. 전기영동한 맴브레인을 TBS/T로 세척한 후 5% (w/v) skim milk를 넣은 TBS/T로 상온에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 1차 항체와 4 ℃에서 12 시간, 2차 항체와 상온에서 1 시간 동안 반응시킨 후, ECL 검출 시스템 (iNtRON Biotechnology Inc.)을 이용하여 발색시켰다.
각각의 밴드는 TOTALLAB TL 120 소프트웨어 (Nonlinear Dynamics Ltd., Newcastle, 영국)를 이용하여 정량하였으며, 사용한 1차 항체는 다음과 같다: TLR4 (1:10000 희석, Santa cruz biotechnology Inc., CA, 미국), IL-1β (1:2500 희석, BioVision, CA, 미국) 및 β-actin (1:5000 희석, Sigma Aldrich, MO, 미국). 측정 결과는 β-actin으로 표준화하였다.
1-8. 간 조직 내 지방과산화 확인
지방과산화의 최종 산물인 말론디알데히드 (malondialdehyde, MDA) 양의 측정을 위해 균질화된 간 조직의 현탁액에 티로바르비탈산 (thiobarbituric acid)을 처치하여 반응시킨 후, 1,1,3-3 테트라에톡시 프로판 (Sigma Aldrich)을 표준물질로 사용하여 535 nm에서 분광광도적으로 측정하여 분석하였다.
1-9. 통계분석
모든 실험결과는 평균 ± 표준오차로 나타내었으며, 이에 대한 통계학적인 분석은 one-way ANOVA를 시행하여 P < 0.05 수준에서 통계학적 유의성을 검정하였다.
실시예 2. 간장 허혈 및 재관류 손상에 대한 목단피 추출물이 혈중 ALT 활성에 미치는 영향 확인
본 실시예에서는, 간세포 손상의 지표인 혈중 ALT 활성을 비교함으로써, 목단피 추출물의 처리에 따른 간 보호 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-3 및 실시예 1-6의 방법으로 실험하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 간장 허혈 수술 전 마우스 (sham)의 혈중 ALT 활성은 63.1 ± 7.4 U/L였으나, 재관류 5 시간 경과 후, 대조군 (vesicle)의 혈중 ALT 활성이 간장 허혈 수술 전 마우스에 비해 163.1배 증가하였으며, 이를 통해 간장 허혈 수술을 통한 간세포 손상을 확인하였다. 목단피 70% 에탄올 추출물을 100 mg/kg 처리한 군은 대조군과 비교하여 혈중 ALT 활성을 현저히 억제시켰으며, 목단피 70% 에탄올 추출물을 30 또는 300 mg/kg 처리한 군은 대조군과 비교하여 혈중 ALT 활성을 경미하게 억제시키는 경향을 보였다.
실시예 3. 간장 허혈 및 재관류 손상에 대한 목단피 추출물 분획물의 보호 효과
본 실시예에서는, 목단피 추출물의 분획물 처리에 따른 간 보호 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-3, 1-6 및 1-7의 방법으로 목단피 70% 에탄올 추출물의 물, 부탄올, 헥산 또는 에틸아세테이트 (EA) 분획물에 대하여, 혈중 ALT 활성 및 간장 내 TLR4 또는 IL-1β 단백질 발현양을 비교하였다.
3-1. 혈중 ALT 활성
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 목단피 추출물의 물, 헥산 및 부탄올 분획물을 처리한 군에서, 대조군과 비교하여 혈중 ALT 활성에 별다른 차이를 나타내지 않았다. 그러나, 이와는 달리, 목단피 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 처리한 군 (1.25, 2.5 및 5 mg/kg)에서는, 대조군과 비교하여 혈중 ALT 활성을 모든 용량군에서 현저하게 억제시켰을 뿐만 아니라, 상기 실시예 2의 목단피 70% 에탄올 추출물을 처리한 군과 비교하였을 때에도 (수득률 13.3% 고려 시), 보다 적은 투여량에도 불구하고 현저히 우수한 혈중 ALT 활성 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.
3-2. 간장 내 TLR4 및 IL-1β 단백질 발현량
간 조직 내 TLR4 단백질 발현량은 허혈 및 재관류 시 대조군에 비해 1.6배로 현저히 증가하였으나, 도 3A에 나타난 바와 같이, 목단피 70% 에탄올 추출물 에틸아세테이트 분획물 1.25 및 2.5 mg/kg 및 70% 에탄올 추출물 100 mg/kg 투여 시 그 발현을 현저히 억제시킴을 확인하였다. 간 조직 내 IL-1β 단백질 발현량은 허혈 및 재관류 시 대조군에 비해 1.7배로 현저히 증가하였으나, 도 3B에 나타낸 바와 같이, 목단피 70% 에탄올 추출물 에틸아세테이트 분획물 1.25 및 2.5 mg/kg 투여 시 그 발현을 현저히 억제시켰으며, 목단피 70% 에탄올 추출 100 mg/kg 투여는 그 발현을 감소시키는 경향만을 나타냄을 확인하였다.
상기 내용을 종합한 결과, 목단피 70% 에탄올 추출물에 비하여, 이의 물, 부탄올, 헥산 또는 에틸아세테이트 (EA) 분획물이 보다 우수한 혈중 ALT 활성 억제 효과 및 간장 내 TLR4 또는 IL-1β 단백질 발현 억제 효과를 나타냈으며, 특히 이들 중 에틸아세테이트 분획물이 가장 우수한 효과, 즉 가장 우수한 간 보호 효과를 나타냄을 확인하였다. 이에 하기 실시예는 에틸아세테이트 분획물에 대하여 보다 심층적인 실험을 실시하였다.
실시예 4. GalN/LPS로 인한 급성 간부전에 대한 목단피 추출물 에틸아세테이트 분획물의 보호 효과
본 실시예에서는, 상기 실시예들로부터 확인한 목단피 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 GalN/LPS로 인한 급성 간부전에도 효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-3, 1-4, 1-6 및 1-7의 방법으로 실험하였다.
4-1. 혈중 ALT 활성
그 결과, 분획물 처리 전 혈중 ALT 활성은 대조군 (control)에서 45.0 ± 8.7 U/L이었으며, GalN/LPS 투여 후 6시간에서, 대조군에 비해 16.7 배 증가하였으나, 도 4에 나타낸 바와 같이, 목단피 70% 에탄올 추출물 에틸아세테이트 분획물 1.25, 2.5 및 5 mg/kg 투여 시, GalN/LPS로 인한 ALT 증가를 현저히 억제시켰으며, 특히 분획물 1.25 및 2.5 mg/kg 투여는 목단피 70% 에탄올 추출물 100 mg/kg 투여와 비교해 볼 때 (13.3% 수득률 고려 시) 우수한 ALT 활성 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.
4-2. 간장 내 TLR4 단백질 발현량
또한, 분획물 처리 전 GalN/LPS 처치 시 간 조직 내 TLR4의 단백질 발현량은 대조군에 비해 2.1 배로 현저히 증가하였으나, 도 5에 나타낸 바와 같이, 목단피 70% 에탄올 추출물 에틸아세테이트 분획물 1.25 및 2.5 mg/kg 투여 시, 그 발현을 현저히 억제시켰으며, 70% 에탄올 추출물 100 mg/kg 투여는 그 발현을 감소시키는 경향만을 나타냄을 확인하였다.
실시예 5. APAP로 인한 약물 간손상에 대한 목단피 추출물 분획물의 보호 효과
본 실시예에서는, 상기 실시예들로부터 확인한 목단피 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 APAP로 인한 약물 간손상에도 효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-3, 및 1-5 내지 1-7의 방법으로 실험하였다.
5-1. 혈중 ALT 활성
그 결과, 분획물 처리 전 혈중 ALT 활성은 대조군 (control)에서 35.2 ± 8.0 U/L이었으며, APAP 투여 후 24 시간에서, 혈중 ALT 활성은 대조군에 비해 249.0 배 증가하였으나, 도 6에 나타낸 바와 같이, 목단피 70% 에탄올 추출물 에틸아세테이트 분획물 1.25 mg/kg 투여 시, APAP로 인한 ALT 증가를 현저히 억제시켰으며, 2.5 및 5 mg/kg 투여는 APAP로 인한 ALT 증가를 억제시키는 경향을 나타내었다. 그러나 이와는 달리 목단피 70% 에탄올 추출물 100 mg/kg 투여는 APAP로 인한 ALT 증가에 영향을 주지 않았음을 확인하였다.
5-2. 간장 내 지질과산화
또한, 분획물 처리 전 지방과산화의 최종 산물인 말론디알데히드 (malondialdehyde, MDA)의 간장 내 농도는 대조군에서 0.26 ± 0.01 nmol/mg 단백질이었으며, APAP 투여 후 24 시간에서, 간장 내 MDA 농도는 대조군에 비해 2.4 배 증가하였으나, 도 7에 나타낸 바와 같이, 목단피 70% 에탄올 추출물 에틸아세테이트 분획물 1.25 mg/kg 투여 시, APAP로 인한 MDA 증가를 현저히 억제시켰으나, 목단피 70% 에탄올 추출물 100 mg/kg 투여는 APAP로 인한 MDA 증가에 영향을 주지 않았음을 확인하였다.
상기 내용을 종합한 결과, 목단피 70% 에탄올 추출물에 비하여, 에틸아세테이트 분획물이 현저하게 우수한 간 보호 효과를 나타냄을 확인하였는 바, 간질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 조성물은 목단피 (Moutan Radicis Cortex) 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하며, 상기 조성물을 이용하여 간 손상의 지표인 혈중 ALT 농도를 효과적으로 감소시키고, 간장 내 TLR4 또는 IL-1β 단백질 발현의 증가를 억제시키며, 간장 내 지질과산화 또한 억제시킬 수 있음을 구체적으로 확인하였다. 따라서 본 발명은 천연물 유래 활성 성분을 이용함으로써, 우수한 간 보호 효능을 나타냄과 함께 독성 및 부작용이 거의 없어 장기간 체내에 사용할 수 있는 장점을 가지는바, 간질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (9)

  1. 목단피 (Moutan Radicis Cortex) 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 간질환은 간염, 간독성, 담즙울체, 지방간, 간경변, 간허혈, 알코올성 간질환, 간 농양, 간성 혼수, 간 위축증, 및 간암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 혈중 ALT (alanine aminotransferase)의 농도 증가를 억제시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 간장 내 TLR (Toll-like receptor) 4 또는 IL-1β (Interleukin 1 beta) 단백질의 발현양 증가를 억제시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 간장 내 지질과산화를 억제시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 목단피 (Moutan Radicis Cortex) 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. 제1항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간질환의 예방 또는 치료 방법.
  9. 간질환 치료제 제조를 위한 목단피 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 용도.
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