WO2017060081A1 - Herzklappenmechanobioreaktor - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neuartiges tissue engineering-Bioreaktorsystem speziell geeignet für den Aufbau eines in vitro-Herzklappenkonstrukts zur Bereitstellung eines biogenen Herzklappenersatzes sowie Verfahren und Anwendungen dieses Bioreaktorsystems.

Description

BESCHREIBUNG

Titel: Herzklappenmechanobioreaktor

Die Erfindung betrifft ein neuartiges tissue engineering-Bioreaktorsystem speziell geeignet für den Aufbau eines in vitro-Herzklappenkonstrukts zur Bereitstellung eines biogenen Herzklappenersatzes sowie Verfahren und Anwendungen dieses Bioreaktorsystems.

Die Herstellung eines biogenen Organersatzes im Rahmen des tissue engineering umfasst die Gewinnung und Isolierung geeigneter biologischer Zellen, idealerweise aus dem Gewebe des Organempfängers, die Bereitstellung eines mit diesen Zellen besiedelbaren biokompatiblen Gerüst und die Besiedlung des Gerüsts mit den Zellen sowie die Kultivierung der Zellen an dem Gerüst, sodass diese konditioniert werden und gegebenenfalls differenzieren, um ein organtypisches Gewebe auszubilden, das schließlich die Organfunktion des zu ersetzenden Organs übernehmen kann. Eine häufig getrennte Besiede lung mit verschiedenen Zelltypen erlaubt, dass mehrschichtige organtypische Gewebeverbände erzeugt werden können. In der nachfolgenden Konditionierungsphase müssen die Zellen an dem sich ausbildenden in vitro- Gewebekonstrukt in der Regel noch physikalischen und/oder chemischen Faktoren ausgesetzt werden, welche die Ausbildung organtypischer Funktionen und/oder Morphologien ermöglichen. Vor allem physikalisch-mechanische Faktoren wie Dehnungsbelastung, Scherstress und Druckbeanspruchung können in bestimmten Zellpopulationen zur Ausbildung der gewünschten Gewebe- oder Organfunktionen beitragen oder diese überhaupt erst ermöglichen. Da die Kultivierung der Zellen und der in vitro-Organe in Bioreaktoren in Kontakt mit Kulturmedien stattfindet, werden Maßnahmen und Mittel entwickelt, um die konditionierenden mechanischen Faktoren in den Bioreaktoren auf die darin kultivierten Zellen und Geweben einwirken zu lassen.

Zur Herstellung eines biogenen Herzklappenersatzes, beginnt man mit einer entsprechend vorgeformten porösen Gerüststruktur aus biokompatiblem Material, die der Herzklappe ihre Grundform und primäre mechanische Eigenschaften gibt. Meist ist dies eine mehr oder weniger lange Röhre, die als Ansatzstück fungiert, in deren Mitte die eigentlichen Klappentaschen-Strukturen bzw. Klappensegel-Strukturen ausgebildet sind. Dieses Gerüst wird nun unter Kulturbedingungen mit Endothelzellen, glatten Muskelzellen sowie Bindegewebszellen besiedelt, wobei die Zellen an der Oberfläche anhaften und/oder in die Matrix des Gerüsts einwandern sollen. Während der nachfolgenden Konditionierung wird das besiedelte, noch nicht vollständig ausgebildete in vitro-Klappenkonstrukt in einem Mechanobioreaktor mit Zellkulturmedium pulsatil perfundiert. Der Scherstress des vorbeifiießenden Mediums dient den Endothelzellen dabei als Positionsinformation, dass sie sich an der Oberfläche des Konstrukts befinden, und ist ein wichtiger Einflussfaktor bei der Ausbildung eines geschlossenen Endothels. Die Dehnungsbelastung, die die Klappenelemente bei einer pulsatilen Durchströmung erfahren, dient den glatten Muskelzellen und den Fibroblasten dort vor allem als Signal für die räumliche Ausrichtung und die Bildung von zweckmäßigen Zugfasern. Typischerweise wird nach der Besiedelung mit der Perfusion behutsam begonnen und diese langsam gesteigert. Am Ende der Konditionierungsphase steht idealerweise ein Betrieb unter physiologischen Bedingungen. Darunter versteht man regelmäßig den Ruhepuls eines gesunden Erwachsenen (60 Schläge pro Minute, Diastole: 80 mmHg, Systole: 120 mmHg). Unter diesen Bedingungen wird dann meist noch für einige Tage oder Wochen kultiviert, um eine entsprechende Gewebereife zu erreichen (Reifungsphase). Die Funktion einer Herzklappe eines menschlichen Herzens ist im Wesentlichen mechanischer Natur. Die Herzklappe stellt rein technisch ein Rückschlagventil dar, das den Rückfiuss des Blutes verhindert - im Falle einer Aortenklappe aus der Aorta zurück in den Ventrikel, aus dem es gepumpt worden ist. Das Blutgefäßsystem des Organismus stellt sowohl ein Dämpfungsglied als auch einen Flusswiderstand dar. Die Dämpfung geschieht - im Falle einer Aortenklappe - vor allem durch die Elastizität der Aorta und anderer großer Arterien (Windkesseleffekt). Der Flusswiderstand im Blutkreislauf wird wesentlich durch den peripheren Gefäßwiderstand, hauptsächlich verantwortet durch Arteriolen und Kapillaren, bestimmt. Ein Bioreaktorsystem zur Herzklappenkonditionierung muss also sowohl den peripheren Gefäßwiderstand simulieren als auch ein entsprechendes Dämpfungsglied enthalten. Wichtig ist dabei der korrekte Druckverlauf auf beiden Seiten der Herzklappe. Die Herzklappe muss, während sie geschlossen ist, den Druckunterschied zwischen Aorta und Ventrikel aushalten. Ein fortschrittlicheres Konditionierungsprogramm für ein verbessertes in vitro- Herzklappenkonstrukt soll außerdem sowohl Ruhe- als auch Aktivitätsphasen des Körpers enthalten. Auch soll die Druckbelastung im Herzen abhängig von der Körperhaltung (z.B. Stehen oder Liegen) nachgeahmt werden. Um diese Vielfalt physiologischer Situationen an einem in vitro -Herzklapp enkonstrukt abbilden zu können, werden bekannte Bioreaktoren zur Kultivierung von in vitro- Herzklappenkonstrukten in umfangreiche Perfusionskreisläufe eingebaut, die verschiedene Funktionselemente des menschlichen oder tierischen Kreislaufsystems modellieren. Dies beinhaltet aber systembedingt meist volumenintensive Mittel wie Windkesselanordnungen, Durchflussbegrenzer und separate Pumpanordnungen. Nachteilig ist dabei, dass der Bedarf an Medienvolumen, aber auch der Raumbedarf solcher Anlagen durch die Verschaltung der Funktionselemente und vor allem die zur Ausbildung physiologischer Bedingungen erforderlichen geometrischen Abmessungen dieser bekannten Elemente groß sind. Daneben sind regelmäßig drucklose Bereiche im Perfusionskreislauf, besonders im Rücklaufzweig, notwendig, die ebenfalls volumenintensiv sind und ein nachteiliges Ausgasen der Kulturflüssigkeit begünstigen. Solche Apparaturen haben hohen Medienverbrauch und sind im Ganzen schlecht oder nur aufwändig temperierbar und insbesondere auch nicht befriedigend reinig- und sterilisierbar. Eine gewünschte Automatisierung der Handling-Operationen und der Einsatz von leicht austauschbaren universellen Einweg-Modulen in solchen Apparaturen nur schwer erreichbar. Außerdem ist bei solchen Bioreaktoren und Perfusionssystemen eine genauere Einstellung oder Modellierung einer bestimmten gewünschten physiologischen Bedingung oft gar nicht möglich oder es muss meist aus einer kleinen Zahl mechanisch und fluidisch fest vorgegebener Zustände des komplexen Perfusionskreislaufs vorab ausgewählt werden. Diese diskreten Zustände sind oft nicht unmittelbar und trägheitslos ineinander überführbar, oder das System muss zur Umschaltung in einen anderen Betriebszustand geöffnet und außer Betrieb gesetzt werden.

Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem bestand in der Bereitstellung eines Bioreaktorsystems zur verbesserten Kontrolle oder Einstellbarkeit einer gewünschten modellierten physiologischen Bedingung für die Konditionierung eines in vitro-Herzklappenkonstrukts bei gleichzeitig geringem Medienbedarf und insbesondere leichter Sterilisierbarkeit oder Austauschbarkeit der Teile. Besonders sollte das Bioreaktorsystem eine flexible universale pulsatile Perfusion des in vitro- Konstrukts mit über einen großen Bereich dynamisch einstellbarem oder regelbarem Druckverlauf an der Herzklappe ermöglichen.

Zusätzlich und von dem vorstehend skizzierten Problem, und davon unabhängig, besteht in bekannten Herzklappenbioreaktoren das Problem, dass zwischen Zellbesiedelungsphase und Konditionierungs- und Reifungsphase eine zeitliche Unterbrechung und insbesondere räumliche Trennung liegen muss. In bekannten Systemen muss die Besiedelung des Gerüsts mit der Zellsuspension in einem weiteren Kulturgefäß, außerhalb der Reaktorkammer, welche nur für die nachfolgende Konditionierungs- und Reifungsphase vorgesehen ist, durchgeführt werden, was einen Transfer des besiedelten Gerüsts erforderlich macht, oder die Verschaltung des gesamten Bioreaktorsystems muss zwischen diesen Phasen geändert werden, da für die Phasen jeweils ganz unterschiedliche Anforderungen an den Medienfluss und die Druckverhältnisse gestellt werden, die in bekannten Systemen nicht alle gleichzeitig erfüllt werden können. Dadurch besteht aber die Gefahr unerwünschter Kontaminationen, und das Gesamtverfahren wird schon wegen des nötigen komplexen Handlings störungsanfällig und aufwendig. Dies vermindert die Ausbeute oder Qualität der Herzklappenkonstrukte und führt zu geringer Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Eine weitere Herausforderung ist die effiziente Herstellung unter Vermeidung von Kontaminationen. Während der gesamten Herstellung muss die Herzklappe und alles, was mit ihr in Berührung kommen kann, aseptisch gehalten werden. Jeder offene Prozessschritt stellt dabei, auch wenn er in einer Sterilkammer durchgeführt wird, ein Kontaminationsrisiko und erheblichen manuellen Aufwand dar. Die Anzahl offener Prozessschritte ist also möglichst zu minimieren. Es soll daher ein integrales Bioreaktorsystem bereitgestellt werden, das zur Zellbesiedelung und Konditionierung/Reifung des in vitro-Herzklappenkonstrukts gleichermaßen geeignet ist, wodurch eine Unterbrechung des Ablaufs, zusätzliche Handling- Schritte vermieden und besonders die Gefahr von Kontaminationen und Unsterilitäten verringert oder dadurch ausgeschlossen werden soll. Damit im Zusammenhang steht auch das technische Problem, dass regelmäßig in der Praxis die Zellsuspensionen bei ausreichender Zellkonzentration nur in kleinen Mengen (Volumen) vorliegen, vor allem bei humanem oder gar allogenem Spendermaterial. Bekannte Perfusions- oder Mechanoreaktoren für die Konditionierung oder Funktionsprüfung eines Gewebes sind jedoch funktionsbedingt so ausgestaltet, dass für eine Besiedelung mit Zellen in dem Reaktor selbst zu große Totvolumina im System vorhanden sind. Bei der Besiedelung ist bisher auch problematisch, dass die Zellen aus der Suspension ungleichmäßig auf das Gerüstmaterial sedimentieren und auf dem in vivo-Konstrukt unerwünschte Zonen unterschiedlicher Zelldichte oder früher Konfluenz entstehen oder Zellen sich an den Wänden oder Fluidkanälen des Bioreaktorsystems niederschlagen und damit für die Besiedelung des in vitro -Konstrukts verloren sein können. Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem bestand damit auch in der Bereitstellung eines solchen integralen Bioreaktorsystems, das eine verbesserte Besiedelung von Gerüstmaterial mit Zellen aus einer Zellsuspension ermöglicht und insbesondere bei einem geringen Volumen an Zellsuspension eine effiziente und gleichmäßige Besiedelung des Gerüsts bei geringem Zellverlust und Zelluntergang erlaubt.

Die Erfindung löst die vorgenannten technischen Probleme und befriedigt die Anforderungen an eine effiziente automatische Herstellung von biogenen Herzklappenpräparaten durch ein neuartiges integrales Bioreaktorsystem zur Besiedelung, Kultivierung und, insbesondere gerichteten, druckgesteuerten Perfusion eines in vitro-Herzklappenkonstrukts. Dieses enthält erfindungsgemäß zumindest die im Folgenden gelisteten und charakterisierten Komponenten oder besteht in bevorzugter Ausgestaltung ausschließlich daraus:

1. mindestens eine oder genau eine Reaktorkammer (20) mit bei primärer Strömungsrichtung der Perfusion durch das in vitro-Herzklappenkonstrukt im Perfusionsbetrieb stromaufwärts liegendem (ventrikulärem) Medienport und bei primärer Strömungsrichtung der Perfusion durch das in vitro- Herzklappenkonstrukt stromabwärts liegendem (aortalem) Medienport, und mindestens einer oder genau einer in der Reaktorkammer anordenbaren und im Funktionszustand darin angeordneten Haltevorrichtung, die zumindest ein ventrikuläres Anschlussstück (Anschlussnippel oder -muffe) und ein aortales

Anschlussstück (Anschlussnippel oder -muffe) aufweist, die geeignet sind zur Aufnahme und Fixierung des in vitro-Herzklappenkonstrukts, 2. mindestens eine oder genau eine stromaufwärts liegende (ventrikelseitige) Pumpanordnung (10) mit einer, insbesondere durch Pressluft oder Druckgas, wechselnd steuerbar druckbeaufschlagbaren Arbeitskammer und einer davon durch eine bewegliche, insbesondere elastische Membran abgetrennten stromabwärts liegenden (ventrikulären) Medienkammer (Ventrikelkammer), die mit dem (stromaufwärts liegenden) ventrikulären Abschnitt oder Pol des Konstrukts über den stromaufwärts liegenden (ventrikulären) Medienport der Reaktorkammer und das ventrikuläre Anschlussstück der Haltevorrichtung in Fluidverbindung bringbar ist und mit dieser im Funktionszustand in direkter, insbesondere fluiddichter Medienverbindung steht, und

3. mindestens eine oder genau eine stromabwärts liegende (aortenseitige) Pumpanordnung (30) mit einer, insbesondere durch Pressluft oder Druckgas, wechselnd steuerbar druckbeaufschlagbaren Arbeitskammer und einer davon durch eine bewegliche, insbesondere elastische Membran abgetrennten stromabwärts liegenden Medienkammer (Aortenkammer), die mit dem aortalen

Abschnitt oder Pol des Konstrukts über den stromabwärts liegenden (aortalen) Medienport der Reaktorkammer und das aortale Anschlussstück der Haltevorrichtung in Fluidverbindung bringbar ist und mit dieser im Funktionszustand in direkter, insbesondere fluiddichter Fluidverbindung steht. Die Erfindung wird hierin am Beispiel der Herstellung einer Aortenklappe erklärt, und es werden daher die dafür zutreffenden Begrifflichkeiten der Orientierung der Bioreaktorelemente und des Herzklappenkonstrukts verwendet, ohne dass diese beschränkend zu verstehen wären. Die Erfindung ist ebenso geeignet zur Herstellung einer Pulmonalklappe sowie auch einer Bikuspidalklappe und Mitralklappe oder Trikuspidalklappe. Daher bedeuten im Zusammenhang mit dieser Erfindung - abweichend vom anatomischen Sprachgebrauch dieser Begriffe „ventrikulär", „ventrikelseitig" oder„Ventrikel-"„stromaufwärts liegend", und„aortal",„aortenseitig" oder„Aorten-" stromabwärts liegend", und zwar jeweils in Bezug auf die primäre Strömungsrichtung der Perfusion durch das in vitro-Herzklappenkonstrukt im Perfusionsbetrieb.

Die beiden stromaufwärts und stromabwärts liegenden Pumpanordnungen vermitteln erfindungsgemäß zumindest sowohl - in der Funktion einer Membranpumpe - aktiv die pulsatile Perfusion des Konstrukts in der Reaktorkammer, das heißt besonders den Medientransport durch das Bioreaktorsystem, als auch - in der Funktion eines einstellbaren Windkessels (compliance Chamber) - die komplette Drucksteuerung zur Simulation physiologischer Druckverläufe zur Konditionierung und Reifung des Konstrukts. Durch die erfindungsgemäße doppelte Pumpanordnung beiderseits des zu perfundierenden Konstrukts wird eine einfache und flexible Steuerung der Druckverläufe, und insbesondere der Druckdifferenz zwischen dem Ventrikelpol und dem Aortenpol des Konstrukts, die der wesentliche Faktor für die Konditionierung, aber auch für eine Funktionsprüfung des Herzklappengewebes ist, ermöglicht, wobei der apparative Aufwand und die Medienvolumen im System klein gehalten werden können. Die Drucksteuerung in den beiden Pumpanordnungen erfolgt durch zeitliche Kontrolle oder Steuerung des Drucks in der jeweiligen Arbeitskammer über eine rechner- und programmgestützte ventilgesteuerte Druckbeaufschlagung oder Entlüftung. Die Arbeitskammern können mit Gas oder Flüssigkeit betrieben werden, wobei der Betrieb mit Gas, Inertgas oder Luft bevorzugt ist. Die individuellen zeitlichen Druckverläufe in beiden Pumpanordnungen spielen zusammen, um den gewünschten physiologischen Druckverlauf zur Konditionierung und Reifung des Konstrukts zu simulieren. Eine erfindungsgemäße dritte Funktion beider Pumpanordnungen entsteht im Zusammenspiel mit der benachbarten Reaktorkammer und wird weiter unten näher beschrieben. Die Membran ist vorzugsweise eine flache Scheibe aus Elastomermaterial, die in das Gehäuse der Pumpanordnung gespannt, besonders zwischen Gehäusehälften geklemmt, wobei die Elastomermembran dann zusätzlich als Dichtung zwischen den Gehäuseelementen dienen kann. Bevorzugtes Membranmaterial ist ein insbesondere leicht sterilisierbares biokompatibles Elastomer oder oberflächenfunktionalisiertes Elastomer, bevorzugt ausgewählt aus: Silikonkautschuk, besonders RTV-Silikon, PU, LDPE und Latex. Neben rein gummielastischen Membranen können alternativ Materialverbünde oder Balgenkonstruktionen als bewegliche Membranen eingesetzt werden.

Diese drei Hauptkomponenten in ihrer spezifischen erfindungsgemäßen Ausgestaltung bilden ein integrales und kompaktes Bioreaktormodul, wobei die einzelnen Komponenten durch die erfindungsgemäße Anordnung zu einander zu einer ergänzenden Funktionalität des Bioreaktorsystems führen, die über eine lose Verschaltung der Einzelkomponenten, besonders in räumlicher Trennung voneinander hinausgeht. Die Erfindung sieht dabei besonders eine unmittelbare Anordnung dieser Komponenten zueinander vor. Die Verschaltung der Komponenten erfolgt in Bezug auf die primäre Strömungsrichtung der Perfusion durch das in vitro-Herzklappenkonstrukt bevorzugt ausschließlich in folgender Reihenfolge: An die stromaufwärts liegende Pumpanordnung (10) schließt sich die Reaktorkammer (20) mit der Haltevorrichtung an, auf welche die stromabwärts liegende Pumpanordnung (30) folgt. In einer bevorzugten Variante der Erfindung sind diese drei Komponenten zu einem integralen Gehäuseblock zusammengefügt, bevorzugt werden die Gehäuse der Komponenten aneinander fixiert oder sie sind zusammen in einem einstückigen (einteiligen oder mehrteiligen) Fluidblock ausgebildet. Bevorzugt besteht der Block des Bioreaktorsystems ausschließlich aus diesen drei Komponenten.

Selbstverständlich können in den einzelnen Komponenten oder Kompartimenten des vorgenannten Kernsystems oder Blocks Zugänge (Ports) in an sich bekannter Weise und Funktionalität vorgesehen sein, die insbesondere den Zugang in das geschlossene System für Medienwechsel, zum Einbringen von Wirkstoffen oder Zellsuspensionen erlauben oder in Form von Entlüftungen für blasenfreien Betrieb sorgen können.

In einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausgestaltung davon sind die stromaufwärts liegende Pumpanordnung (10) und die stromabwärts liegende Pumpanordnung (30) zum Rückfluss des Perfusionsmediums, insbesondere direkt, das heißt ohne Umwege, über eine separate Rücklaufkomponente (60) verbunden, so dass ein geschlossener Medienkreislauf entsteht. Diese Rücklaufkomponente ist besonders als mindestens ein insbesondere außerhalb der Reaktorkammer verlaufender Fluidkanal ausgebildet. In einer bevorzugten Variante sind diese vier Komponenten zu einem integralen Gehäuseblock zusammengefügt oder sie sind zusammen in einem einstückigen (einteiligen oder mehrteiligen) Fluidblock ausgebildet. Bevorzugt besteht der Block des Bioreaktorsystems ausschließlich aus diesen vier Komponenten.

Erfindungsgemäß weist der mindestens eine Rückkanal ein Rückschlagventil auf oder enthält ausschließlich dieses, um ein unerwünschtes Rückströmen von Medium von der ventrikulären Medienkammer (Hochdruckseite) in die aortale Medienkammer (Niederdruckseite) über den Rückkanal in bestimmten Druckphasen im pulsatilen Perfusionsbetrieb zu unterbinden. Der Rückkanal enthält dabei bevorzugt zusätzlich ein verstellbares Drosselventil, das bevorzugt dem Rückschlagventil in Rückströmungsrichtung nachgeschaltet ist. Der Rückkanal enthält bevorzugt ausschließlich das Rückschlagventil und das Drosselventil und verbindet dabei bevorzugt unmittelbar die beiden Medienkammern der aortalen und ventrikulären Pumpanordnungen. Das Drosselventil dient erfindungsgemäß im Perfusionsbetrieb zur Begrenzung des effektiven Strömungsquerschnitts in dem Rückkanal und damit dem gezielt einstellbaren Druckabfall im Rücklauf. Dadurch wird insbesondere ein völlig druckloser Abschnitt (Atmosphärendruck), beispielsweise in Form eines bekannten drucklosen Medienvorratsgefäßes, in dem Perfusionssystem überflüssig. Die erfindungsgemäße Anordnung und Ausgestaltung des Rückkanals erlaubt einen druckgesteuerten Perfusionsbetrieb unter Beachtung und Einstellung der dynamischen Druckdifferenz allein an der Herzklappe des in vitro-Herzklappenkonstrukts, unabhängig von den absoluten Drücken.

Die unmittelbar aneinander angrenzende Anordnung der drei Komponenten erlaubt im Zusammenspiel eine automatisierbare Zusatzfunktion der primär als Medienpumpen und zur Drucksteuerung einsetzbaren beiden Pumpanordnungen, wodurch die Reaktorkammer nahtlos zwischen einem Besiedelungsbetrieb und einem pulsatilen Perfusionsbetrieb unmittelbar und gegebenenfalls mehrfach umgeschaltet werden kann, und zwar ohne zusätzliche bauliche Umbaumaßnahmen, Transfer des Konstrukts oder sonstige Betriebsunterbrechungen. Dazu sieht die Erfindung vor, dass beide Pumpanordnungen jeweils unmittelbar benachbart an der Reaktorkammer angeordnet sind, so dass die beweglichen, insbesondere elastischen, Membranen beider Pumpanordnungen durch entsprechende Druckbeaufschlagung der jeweiligen Arbeitskammern derart aus lenkbar sind, dass sie jeweils mit den beiden (ventrikulären und aortalen) Medienports der Reaktorkammer dichtend in Eingriff kommen und diese abschließen können. Dadurch kann vorteilhafterweise insbesondere zumindest das luminale Kompartiment des Konstrukts für die Dauer dieser Druckbeaufschlagung abgeschlossen und spezifisch jeweils von dem Rest- Volumen der beiden Medienkammern der Pumpanordnungen und des übrigen Perfusionssystems abgetrennt werden. Die bewegliche Membran ist dazu bevorzugt zumindest auf der den Medienports der Reaktorkammer zugewandten Seite mit einer elastisch dichtenden und/oder hydrophoben Schichtung versehen oder besteht aus einem solchen Material. In dem Besiedelungsbetrieb des Bioreaktors kann das in vitro-Herzklappenkonstrukt vorteilhafterweise mit dort eingebrachten Zellen in Form einer Zellsuspension besiedelt werden und anschließend nahtlos in den (pulsatilen) Perfusionsbetrieb umgeschaltet werden. Ein kompliziertes Handling und ein Öffnen des Reaktorkreislaufs sind nicht erforderlich, wodurch Arbeitsweisen vereinfacht und automatisierbar werden und dabei eine Kontamination vermieden werden kann. Besonders erlaubt der automatisierbare Verschluss der Reaktorkammer eine vorteilhafte Minimierung des für die Besiedelung erforderlichen Volumens, wodurch die Menge an Zellsuspension klein gehalten und/oder die Zellkonzentration in der Suspension hoch gehalten werden kann, ohne dass ein hoher Zellverbrauch an Spendermaterial stattfindet. Die automatisierbare Besiedelung innerhalb des erfindungsgemäßen Bioreaktorsystems ist daher höchst ressourcenschonend. Diese Besiedelungsfunktion des erfindungsgemäßen Bioreaktorsystems ist dabei unabhängig von der tatsächlichen Anordnung und Betriebsweise eines angeschlossenen Perfusionssystems, wobei die Perfusion nicht ausschließlich auf die integralen Pumpanordnungen gestützt zu sein braucht, so dass weitere Pumpsysteme, wie Schlauchpumpen und oder Kolbenpumpen und/oder Beutelpumpen, sowie weitere Systeme zur Modellierung eines physiologischen Druckverlaufs an dem Konstrukt, wie Windkesselanordnungen oder ähnliche vorgesehen sein können. Bevorzugt ist im Sinne der Erfindung aber eine integrale Ausgestaltung des Bioreaktorsystems, wobei die pulsatile druckgesteuerte Perfusion im Perfusionsbetrieb ausschließlich durch die beiden Pumpanordnungen in Verbindung mit dem hierin beschriebenen Rückkanals mit Rückschlagventil und Drosselventil erfolgt und der Besiedelungsbetrieb durch Interaktion derselben beiden Pumpanordnungen in Verbindung mit der unmittelbar dazwischen angeordneten Reaktorkammer erfolgt. Der erfindungsgemäße Bioreaktor enthält eine zur Besiedelung als auch zur Perfusion des in vitro-Herzklappenkonstrukts besonders geeignete Haltevorrichtung (Klappenhalter). Diese dient der Aufnahme und insbesondere fluiddichten Fixierung des an sich tubulären Konstrukts und ist bevorzugt so ausgestaltet, dass das durch die dichte Fixierung des Konstrukts in der Haltevorrichtung gebildete Lumen (luminales Kompartiment) von dem äußeren, das Konstrukt umgebenden extraluminalen Bereich (extraluminales Kompartiment) fluidisch getrennt ist. Bevorzugt ist die Haltevorrichtung mehrteilig ausgebildet und weist ein Rahmenteil und beidseits darin eingesetzte, aber davon trennbare Anschlussstücke zur Aufnahme des Konstrukts auf. Die Anschlussstücke sind so ausgestaltet und dimensioniert, dass sie jeweils ein tubuläres Ende des Herzklappenkonstrukts aufnehmen und bevorzugt fluiddicht fixieren können. In einfacher Ausgestaltung sind die Anschlussstücke im Klemmsitz in das Rahmenteil einsetzbar und werden dort gehalten. Die Trennbarkeit der Anschlussstücke von dem Rahmenteil der Haltevorrichtung erlaubt ein einfacheres Handling bei der Fixierung des Gerüsts oder beim Abnehmen des reifen Konstrukts, das dadurch leicht automatisierbar wird. Sie erlaubt außerdem, die Reinigung und Sterilisierung des Reaktorsystems zu vereinfachen, da allein die abnehmbaren Anschlussstücke mit dem Konstrukt in Kontakt kommen und nach Verwendung einfach ausgetauscht werden können. Weiter erlaubt sie die einfache Anpassung der Haltevorrichtung an die Größe des gewünschten Konstrukts dadurch, dass Anschlussstücke in mehreren Größen (Außendurchmesser) vorgelegt werden und daraus ausgewählt werden kann. Sie erlaubt weiter, dass allein das Anschlussstück aus einem hoch biokompatiblen Material gefertigt zu sein braucht, weil nur dieses mit dem Konstrukt dauerhaft in Kontakt stehen muss. Dabei kann das Material des Anschlussstücks in an sich bekannter Weise spezifisch beschaffen sein, um ein Einwachsen von biologischen Gewebestrukturen zu ermöglichen oder zu begünstigen, um die Fluiddichtheit zwischen Konstrukt und Perfusionskreislauf zu erzielen oder über die gesamte Kultivierungsphase hinweg dauerhaft aufrecht zu erhalten. In einer Variante davon ist vorgesehen, dass die Anschlussstücke an den beiden Polen des Konstrukts bereits integraler Bestandteil des vorgegebenen Gerüsts zur Besiedelung sind und zusammen mit diesem in die Haltevorrichtung eingesetzt werden können.

Die Haltevorrichtung ist vorteilhafterweise von der Reaktorkammer körperlich getrennt und insbesondere zum Zwecke des Einspannens des Gerüsts zu Beginn der Herstellung als auch der Gewinnung der reifen Herzklappe aus der Reaktorkammer entnehmbar. Die Haltevorrichtung ist dabei so ausgestaltet und dimensioniert, das sie im Funktionszustand des Reaktors dichtend mit dem Inneren der Reaktorkammer in Eingriff kommt, so dass in Verbindung mit dem fixierten Konstrukt ein luminales Kompartiment und ein extraluminales Kompartiment in der Reaktorkammer gebildet werden. Diese sind bevorzugt durch entsprechende Zugänge (Ports), die an der Reaktorkammer ausgebildet sind, bevorzugt getrennt voneinander von außen zugänglich. Im Besiedelungsbetrieb bzw. in der Besiedelungsphase können durch diese Zugänge Zellsuspensionen jeweils getrennt an die luminale Seite oder die extraluminale Seite des Konstrukts gebracht werden, um diese getrennt mit Zellen zu besiedeln. Ebenso sind im Perfusionsbetrieb bzw. während der Konditionierungs- oder Reifungsphase, luminale und extraluminale Seite des Konstrukts getrennt für die Applikation von Wirkstoffen und/oder eine getrennte Perfusion zugänglich. Die getrennte Perfusion der beiden Kompartimente erlaubt auch eine getrennte Drucksteuerung und/oder Flusssteuerung in beiden Kompartimenten, beispielsweise für die Etablierung eines transmuralen Druckgefälles im Rahmen der Konditionierung von Gefäßabschnitten oder Gefäßanteilen einer Herzklappe.

In einer bevorzugten Ausgestaltung liegen die beiden Medienports an sich gegenüberliegenden Wänden der Reaktorkammer. Bevorzugt ist die Haltevorrichtung zwischen diese Wände einspannbar. Bevorzugt ist im Bereich der Medienports, zumindest aber auf der ventrikulären, das heißt auf der stromaufwärts liegenden Hochdruckseite, ein separates Dichtmittel in Form einer einfachen oder mehrteilige Dichtlippe, eines Federrings oder einer Labyrinthdichtung vorgesehen. In einer alternativen Variante ist eine hinreichende Abdichtung der Perfusion zwischen Haltevorrichtung und Reaktorkammerwand durch Passung erreicht, wobei sich bevorzugt ein reibungsmindernder Flüssigkeitsfilm zwischen den Wänden bildet der durch Kapillar- und Benetzungskräfte dort gehalten wird.

In einer besonderen Variante ist mindestens ein Bypasskanal in der Reaktorkammer und insbesondere in der Haltevorrichtung vorgesehen, die einen gezielten Austausch zwischen luminalem und extraluminalem Kompartiment erlaubt. Dadurch kann vorteilhafterweise erreicht werden, dass zu dem primären luminalen Perfusionskreislauf ein Nebenzweig gebildet ist, wodurch das extraluminale Kompartiment versorgt wird und somit auch dort ein Medienaustausch stattfinden kann. Durch einen einzigen Perfusionskreislauf kann so das gesamte Konstrukt in der Reaktorkammer beidseits dauerhaft versorgt werden. Um eine getrennte Zellbesiedelung auf beiden Seiten des Konstrukts zu ermöglichen und/oder um eine zelluläre oder mikrobiologische Kontamination über die Kompartimentgrenze hinweg zu unterbinden, ist der Bypasskanal mit zellabweisenden Oberfläche und/oder zelldichten Membran oder Fritte versehen.

Das Konstrukt ist in der Reaktorkammer bevorzugt in horizontaler Längsausrichtung angeordnet, das heißt die gedachte Längsachse von Ventrikelpol zu Aortenpol verläuft in etwa im rechten Winkel zum Schwerkraftvektor. Bevorzugt ist die gesamte Bioreaktoranordnung, und spezifisch der Reaktorblock mit der Reaktorkammer, horizontal angeordnet. Spezifisch zum Zwecke der Zellbesiedelung des Gerüsts in der Reaktorkammer ist die Haltevorrichtung innerhalb der Reaktorkammer besonders um die gedachte Längsachse von Ventrikelpol zu Aortenpol des Konstrukts mechanisch rotierbar. Die bevorzugt horizontale Rotationsachse verläuft bevorzugt unmittelbar durch die beiden in die Reaktorkammer an gegenüberliegenden Seiten mündenden Medienports. Dadurch wird vorteilhafterweise die schwerkraftgestützte Besiedelung des Gerüsts aus der Zellsuspension heraus (Sedimentation) verbessert und eine gleichmäßige Besiedelung des Konstrukts mit einheitlicher Zelldichte ermöglicht. Durch die Rotation des Konstrukts mit der Haltevorrichtung in der Reaktorkammer während der Besiedelungsphase bzw. im Besiedelungsbetrieb wird zum Einen eine unerwünschte frühe oder zu schnelle Zellsedimentation auf das Gerüst verhindert, weil die Zellsuspension durch die Bewegung bei der Rotation verwirbelt werden kann. Zum Anderen kann die gewünschte Sedimentation auf verschiedene Oberflächenabschnitte des Konstrukts gleichmäßig verteilt oder alternativ gezielt gerichtet werden. Dabei erlaubt eine spezifische Konstruktion des Antriebs besonders eine intermittierende sektorenweise Rotation mit Ruhephasen. Alternativ ist eine kontinuierliche Rotationsbewegung vorgesehen. Im Unterschied zur Besiedelung der Innenwand des Konstrukts kann es bei der Besiedelung der Außenseite des Konstrukts im extraluminalen Kompartiment zu einer unerwünschten Sedimentation der Zellen auf den Boden der (nicht rotierenden) Reaktorkammer kommen. Eine spezifische Variante der Haltevorrichtung enthält beiderseits kreisrunde Rahmenteile die über einzelne Längsstreben zueinander beabstandet sind. Die einzelnen Längsstreben bilden keine durchgehende Zylinderwand. Dies erlaubt vorteilhafterweise, dass die Zellen, die auf die Reaktorkammerwand gesunken sind, durch Verwirbelungen an den Längsstreben bei der Rotation resuspendiert und bevorzugt zusätzlich spezifisch auf die äußere Oberfläche des zu besiedelten Konstrukts -nach der Art eines Schaufelrades oder einer Waschtrommel - geführt werden.

In bevorzugter Ausgestaltung ist zur Vermittlung der Rotation der Haltevorrichtung eine berührungslose Krafteinkopplung der Haltevorrichtung über die Wand der Reaktorkammer hinweg von einer außenliegenden Antriebseinheit vorgesehen. Bevorzugt ist eine magnetische oder elektromagnetische Kopplung. In einer Variante weist dabei die Haltevorrichtung, besonders in dem Umfangsbereich des Rahmenteils Permanentmagnete auf. Die Antriebseinheit ist in einer ersten Variante eine um die Reaktorkammer umlaufende Struktur, besonders ein Kreisring, die Elemente zur magnetischen Kopplung der Haltevorrichtung zur Übertragung eines Drehmoments aufweist. Die Elemente sind ebenfalls Permanentmagnete, wobei die Antriebseinheit selbst rotiert und insbesondere über einen separaten (Elektro)Motor in an sich bekannter Weise über Riemen angetrieben wird. Alternativ ist die externe Antriebseinheit eine insbesondere statische Elektromagnet- oder Spulenanordnung (Stator), die zusammen mit der Haltevorrichtung als permanentmagnetischem Anker (Rotor) einen bürstenlosen Innenläufer oder einen Schrittmotor mit diskret ansteuerbaren Winkelstellungen bildet. In einer anderen Variante sind in der Haltevorrichtung an Stelle der Permanentmagnete magnetflussleitende Weicheisensegmente vorgesehen, welche in elektromagnetischer Wechselwirkung mit entsprechend segmentierten Statorwicklungen in der externen Antriebseinheit eine bevorzugt schrittweise Drehung mit diskret ansteuerbaren Winkelstellungen ermöglichen. In einer anderen Variante ist in der Haltevorrichtung an Stelle der Permanentmagnete eine Ringscheibe vorgesehen, welche in elektromagnetischer Wechselwirkung mit entsprechenden Feldspulen in der externen Antriebseinheit eine kontinuierliche Drehung durch Wirbelstromeffekte in der Ringscheibe ermöglichen. Es sind weitere Bauformen der Antriebseinheit und deren elektrischer Ansteuerung denkbar, wobei auf an sich bekannte Grundprinzipien wie Synchronantrieb, Asynchronantrieb, Reluktanzantrieb und ähnliche in Verbindung mit entsprechend getakteter Stromversorgung einschließlich variabler Frequenz oder elektronischer Kommutierung zurückgegriffen werden kann.

Das erfindungsgemäße Bioreaktorsystem ist nicht ausschließlich auf die Verwendung mit einem in vitro-Herzklappenkonstrukt beschränkt. Die spezifisch ausgebildete Haltevorrichtung des Systems erlaubt auch die Besiedelung, Kultivierung und/oder Konditionierung anderer insbesondere tubulärer in vitro-Konstrukte, wie Gefäßpräparate oder andere Organersatzkonstrukte in denen vorallem eine luminale Perfusion unter flexibler Kontrolle des Druckverlaufs erforderlich ist. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines in vitro- Herzklappenkonstrukts unter Verwendung des erfindungsgemäßen Bioreaktorsystem mit den Schritten: a) Bereitstellen eines biokompatiblen Herzklappen-Trägergerüsts, b) Aufnehmen und Fixieren des Gerüsts in der Haltevorrichtung der Reaktorkammer und c) Besiedeln des Gerüsts mit biologischen Zellen durch Einbringen einer Zellsuspension in die Reaktorkammer, und gegebenenfalls zusätzlich d) pulsatiles Perfundieren des mit biologischen Zellen besiedelten Gerüsts (Konstrukts) mit Zellkulturmedium unter gezielter pulsatiler Druckbeanspruchung der Zellen, so dass ein konditioniertes und reifes in vitro-Herzklappenkonstrukt daraus gebildet wird, wobei die pulsatile Perfusion durch wechselnde aktive Druckbeaufschlagung der jeweiligen Arbeitskammer der beiden Pumpanordnungen erfolgt.

Bevorzugt werden in Schritt (c) die Membranen der beiden Pumpanordnungen jeweils durch Druckbeaufschlagung der zugeordneten Arbeitskammern derart ausgelenkt, dass sie mit den Medienports der Reaktorkammer jeweils dichtend in Eingriff kommen und zwischen Ventrikelpol und Aortenpol des Gerüsts ein luminales Volumen abgegrenzt wird, das über einen luminalen Einlassport in der Reaktorkammer mit einer Zellsuspension beschickt wird.

Bevorzugt wird in Schritt c) die Haltevorrichtung mit dem Gerüst in der Reaktorkammer in Gegenwart der eingebrachten Zellsuspension insbesondere intermittierend rotiert, um die Besiedelung des Gerüsts mit Zellen zu vergleichmäßigen.

Bevorzugt folgt in Schritt d) die aktive Druckbeaufschlagung der Arbeitskammer der ventrikelseitigen Pumpanordnung im zeitlichen Verlauf einem vorgegebenen in vivo- Ventrikeldruckverlauf und die aktive Druckbeaufschlagung der Arbeitskammer der aortenseitigen Pumpanordnung folgt im zeitlichen Verlauf einem vorgegebenen in vivo- Aortendruckverlauf.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden beschriebenen Figuren und Varianten weiter charakterisiert.

Figur 1 zeigt eine schematische Längsschnittsansicht einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Bioreaktorsystems zur Perfusion und insbesondere Konditionierung und/oder Besiedelung eines darin aufnehmbaren tubulären in vitro -Konstrukts (50). Das Bioreaktorsystem besteht aus einer ersten stromaufwärts liegenden Pumpanordnung (10), einer Reaktorkammer (20) und einer zweiten Pumpanordnung (30). Die Pumpanordnungen (10, 30) weisen jeweils eine bewegliche, verschiebliche, insbesondere elastische Membran (12, 32) auf, welche eine über Druckleitungen (14, 34) druckbeaufschlagbare Arbeitskammer (13, 33) von einer Medienkammer (11, 31) trennt. Die Reaktorkammer (20) ist über einen stromaufwärts liegenden Medienport (21) mit der oberen Medienkammer (11) direkt verbunden. Die Reaktorkammer (20) ist über einen stromabwärts liegenden Medienport (22) mit der unteren Medienkammer (31) direkt verbunden. Über einen separaten Rückkanal (60) ist der Medienkreislauf der Perfusion geschlossen. In das Innere der Reaktorkammer (20) ist eine separate Haltevorrichtung (40) eingesetzt, worin das zu perfundierende/zu kultivierende Konstrukt (50) gehalten ist. Die Haltevorrichtung (40) ist um die horizontale Längsachse des Konstrukts (50) in der im Querschnitt daher kreisrunden Reaktorkammer (20) durch Passung drehbar gelagert. Die Haltevorrichtung (40) weist beiderseits des Konstrukts (50) insbesondere kreisrunde oder radförmige Rahmenteile (44) auf, die über einzelne Abstandsbrücken (46) zueinander beabstandet gehalten sind. In den Rahmenteilen (44) sind davon trennbare obere und untere Anschlussstücke (41, 42) angeordnet, welche als Nippel oder Muffe ausgebildet sind und die dichte Fixierung des in vitro -Konstrukts (50) in der Haltevorrichtung (40) vermitteln. Zur Herstellung einer dichten Fluidverbindung sind zur Abdichtung der Medienports (21, 22) Dichtmittel (47) an den Rahmenteilen (44) vorgesehen. Zur Rotation der Haltevorrichtung (40) sind magnetische Koppelmittel (49) in dem Rahmenteil (44) vorhanden, welche ein Drehmoment von der externen Antriebseinheit (70) mit entsprechenden magnetischen Koppelmitteln (71) ermöglichen. In dem Rückkanal (60) sind ein (schematisch dargestelltes) Rückschlagventil (61) und ein (schematisch dargestelltes) verstellbares Drosselventil (64) integriert. Die dargestellte Ausführung enthält einen optionalen extraluminalen Belüftungsport (28) eines extraluminalen Kompartiments des Reaktors und einen optionalen luminalen Entlüftungsport (29) zur Entlüftung der Perfusion des Lumens des eingespannten Konstrukts (50) sowie einen luminalen Zugangsport (24) zum Lumen des Konstrukts (50) und einen extraluminalen Zugangsport (26) zu dem extraluminalen Kompartiment, d.h. zu der Außenseite des eingespannten Konstrukts (50). In der in Figur 1 dargestellten Arbeitsphase des Perfusionsbetriebs ist die Membran (12) der stromaufwärtigen Pumpanordnung (10) durch Druckbeaufschlagung der Arbeitskammer (13) ausgelenkt und pumpt Medium aus der oberen Medienkammer (11) von dem stromaufwärtigen (ventrikulären) Pol (51) des Konstrukts (50) durch die Herzklappe zu dessen stromabwärtigen (aortalen) Pol (52). Durch das dadurch in die untere Medienkammer (31) gepumpte Medium wird die Membran (32) der stromabwärtigen Pumpanordnung (30) ebenfalls ausgelenkt, wobei der Grad der Auslenkung, d.h. die Compliance der Membran, durch den Druck in der Arbeitskammer (33) frei bestimmbar ist. Das aus der stromabwärtigen Medienkammer (31) austretende Medium kann durch den Rückkanal (60) bei einem nächsten Arbeitshub in die stromaufwärtige Medienkammer (11) zurück fließen. Das einstellbare Drosselventil (64) im Rückkanal (60) dient der Aufrechterhaltung der Druckdifferenz und ermöglicht die steuerbare Kesselfunktion in der stromabwärtigen Pumpanordnung (30).

Die Figuren 2A und 2B zeigen das Bioreaktorsystem nach Figur 1 in für die Besiedelung des eingespannten tubulären in vitro -Konstrukts (50) spezifisch geeigneten Betriebszuständen. Dabei sind durch gleichartige Druckbeaufschlagung beider Arbeitskammern (13, 33) die jeweiligen Membranen (12, 32) derart ausgelenkt, dass sie die beiden Medienports (21, 22) dicht verschließen. In Figur 2A kann dann in dem dadurch gebildeten luminalen Volumen (55) über den luminalen Port (24) Zellsuspension (80) eingebracht werden für eine spezifische Besiedelung der Innenwand des Konstrukts (50). Wie in Figur 2B dargestellt, kann über den extraluminalen Port (26) gezielt Zellsuspension (80) in das extraluminale Kompartiment (25) gebracht werden, um gezielt die Außenseite des Konstrukts (50) zu besiedeln. Durch Rotation der Haltevorrichtung (40) in der Reaktorkammer (20) kann die Zellbesiedelung auf dem Konstrukt (50) jeweils vergleichmäßigt werden. Nach Ende der Besiedelungsphase kann durch entsprechende Drucksteuerung in den Arbeitskammern (13, 33) unmittelbar auf einen Perfusionsbetrieb umgeschaltet werden, wobei die Pumpanordnungen (10 ,30) dann im Zusammenspiel wie Membranpumpe und Windkessel fungieren, um die Druckverhältnisse an dem perfundierten Konstrukt (50) zu steuern.

Beispiele Den Hauptteil des Reaktors bildet ein röhrenförmiges, horizontal angeordnetes und mit Kulturmedium gefülltes Gefäß, in dessen Mitte sich in einer Halterung die Herzklappe befindet. An beiden Enden der Röhre befindet sich jeweils eine Luftkammer die über eine flexible Membran von der Flüssigkeitsphase getrennt ist. Die distalen Enden der Luftkammern sowie die die Membranen sind aus transparentem Material gefertigt, um die optische Beobachtung der Funktion des Gewebes zu ermöglichen. Durch dynamische Regelung des Drucks in den Luftkammern können die Membranen bewegt und somit Kräfte auf die Flüssigkeiten ausgeübt werden. Der Druck in den Flüssigkeitskammern auf beiden Seiten der Klappe wird kontinuierlich gemessen. Anschlüsse für Drucksensoren sind auf der ventrikulären und der aortalen Seite des Reaktors vorhanden.

Die beim Befüllen des Bioreaktors verdrängte Luft kann ebenso wie sich während des Betriebs bildende Gasblasen entweichen. Dies geschieht über spezielle Ports in den Pumpkammern die mit einem Deckel mit eingelassener hydrophober Sterilfiltermembran (wie sie z.B. in Zellkulturflaschen Verwendung finden). Der Durchmesser der Ports ist mindestens so groß, dass darin befindliches Wasser allein durch die Schwerkraft nach unten abfließen kann. Ist der Durchmesser zu klein gestaltet - wie etwa bei Luer Lock-basierten Spritzenvorsatzfiltern - so wird einmal hineingelangtes Wasser durch die Oberflächenspannung im Zugang gehalten und blockiert so die Gasdurchlässigkeit der Membran.

Für die Besiedlung mit Zellen werden allgemein Zellsuspensionen mit hoher Zelldichte verwendet. Da die Vermehrung der Zellen bisweilen aufwändig und teuer sein kann, wird vermeiden, dass für die Besiedlung ein großes Volumen benötigt wird. Der Bioreaktor hat bedingt durch das Schlagvolumen eine Mindestgröße. Es sind aber die Pumpmembranen so angeordnet, dass sie, wenn sie unter ausreichend Druck gesetzt werden, den Raumbereich mit dem Klappenhalter dicht vom Rest des Bioreaktors abschließen. Dadurch steht für die Besiedlung ein deutlich kleinerer Raum zur Verfügung.

Im Inneren des Bioreaktors befindet sich eine herausnehmbare Halterung zur Befestigung der Herzklappe. Die Vorrichtung ist dergestalt, dass sich ein Herzklappenmodell aufnähen, ankleben oder festklemmen lässt. Idealerweise ist das Herzklappenmodell röhrenförmig, während die Klappentaschen/-segel sich in etwa mittig innerhalb des Rohres befinden. Zum Herausnehmen des Klappenhalters kann das Reaktorgefäß in der Mitte getrennt und geöffnet werden. Befinden sich bereits Zellen auf der Herzklappe so muss diese Montage unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Der Klappenhalter enthält zwei Konnektoren (Anschlussstück), auf die die Herzklappe wahlweise aufgesteckt und festgeklemmt, angenäht, festgeklebt, etc. werden kann. Abstandshalter zwischen den beiden Konnektoren spannen die Klappe zwischen den Konnektoren auf.

Um den Prozessschritt des Umsetzens der besiedelten Klappe in den Reaktor zu vermeiden, wird die Besiedlung innerhalb des Bioreaktors durchgeführt. Für das Einbringen und Ablassen der Zellsuspension steht ein entsprechender Port zur Verfügung. Eine Drehung der Herzklappe um ihre Symmetrieachse begünstigt die gleichmäßige Besiedlung mit Zellen. Ein typisches Protokoll für die Besiedlung könnte wie folgt lauten:

Einfüllen der Zellen in den Reaktorraum; 30 min ruhen lassen (Zellen sedimentieren und haften an); Klappe um einen bestimmten Winkel drehen (z.B. 45°) wieder ruhen lassen; fortführen bis mindestens eine volle Drehung erreicht ist.

Alternativ können die Drehungen so durchgeführt werden, dass immer jeweils gegenüberliegende Seiten nacheinander besiedelt werden und das in einer Reihenfolge so dass immer die größten „Lücken" zuerst gefüllt werden bis eine ausreichende Winkelabstufung erreicht ist: Einfüllen der Zellen, ruhen lassen; Drehung um 180°, ruhen lassen; Drehung um 90°, ruhen lassen; Drehung um 180°, ruhen lassen; Drehung um 135°, ruhen lassen; Drehung um 180°, ruhen lassen; Drehung um 90°, ruhen lassen; Drehung um 180°, ruhen lassen; etc.

Die Drehung des Klappenhalters erfolgt berührungsfrei von außen über magnetische Kopplung. In dem drehbaren Klappenhalter sind in ringförmiger Anordnung Magnete eingelassen. An der entsprechenden Stelle umgibt ein Ring mit Magneten den Reaktorzylinder von außen. Dieser äußere Ring kann von einem Motor gedreht werden und versetzt durch die magnetischen Kräfte den Klappenhalter ebenso in Rotationsbewegung. Je nach verwendetem Gerüstmaterial und Migrationsfähigkeit der verwendeten Zellen kann es vorteilhaft sein die Herzklappe von der luminalen Seite und der Außenseite jeweils separat mit unterschiedlichen Zellen zu besiedeln. Beispielsweise werden Endothelzellen nur auf der luminalen Seite benötigt. Die Haltevorrichtung für die Herzklappe ist mit Hilfe von Dichtungen so gestaltet, dass Lumen und extraluminaler Außenraum getrennt sind. Es existieren jeweils separate Zugangsports und Entlüftungsfilter für beide Räume.

Die durch die Herzklappe auf die Aortenseite geströmte Flüssigkeit gelangt durch einen Rückflusspfad wieder zurück auf die Ventrikelseite. Im Rückflusspfad befindet sich ein Rückschlagventil, welches verhindert, dass der Ventrikel durch den Pulsschlag sich durch den Rückflusspfad auf die Aortenseite fortpflanzt. Ein dynamisch einstellbares Quetschventil regelt den peripheren Gefäßwiderstand. Die Regelung der Drücke auf beiden Seiten der Klappe ist unabhängig und folgt jeweils ihrem eigenen Solldruck. Der periphere Gefäßwiderstand kann unabhängig eingestellt werden und bestimmt somit das Schlagvolumen und in Zusammenhang mit der Schlagfrequenz den mittleren Fluss (das Herzzeitvo lumen) .

Claims

ANSPRÜCHE

1. Bioreaktorsystem zur Kultivierung und druckgesteuerten Perfusion eines in vitro-Herzklappenkonstrukts (50), enthaltend: - Reaktorkammer (20) mit stromaufwärtigem Medienport (21) und stromabwärtigem Medienport (22),

- Haltevorrichtung (40) mit ventrikulärem Anschlussstück (41) und aortalem Anschlussstück (42) zur Aufnahme und Fixierung des Konstrukts (50) in der Reaktorkammer (10), - stromaufwärtige Pumpanordnung (10) mit druckbeaufschlagbarer Arbeitskammer (13) und einer davon durch eine bewegliche Membran (12) abgetrennten ventrikuläre Medienkammer (11), die mit dem Ventrikelpol (51) des Konstrukts (50) über den stromaufwärtigen Medienport (21) und das ventrikuläre Anschlussstück (41) in direkter Fluidverbindung steht und - stromabwärtige Pumpanordnung (30) mit druckbeaufschlagbarer Arbeitskammer (33) und einer davon durch eine bewegliche Membran (32) abgetrennten aortalen Medienkammer (31), die mit dem Aortenpol (52) des Konstrukts (50) über den stromabwärtigen Medienport (22) und das aortale Anschlussstück (42) in direkter Fluidverbindung steht.

2. Bioreaktorsystem nach Anspruch 1, wobei die aortale Medienkammer (31) mit der ventrikulären Medienkammer (11) über einen Rückkanal (60) in Fluidverbindung steht, um einen geschlossenen Medienkreislauf zu bilden, wobei der Rückkanal (60) ein Rückschlagventil (61) aufweist, um ein Rückströmen von Medium von der ventrikulären in die aortale Medienkammer zu unterbinden.

3. Bioreaktorsystem nach Anspruch 2, wobei der Rückkanal (60) ein verstellbares Drosselventil (64) aufweist zur Begrenzung des effektiven Strömungsquerschnitts in dem Rückkanal (60)

4. Bioreaktorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei stromaufwärtige Pumpanordnung (10) und stromabwärtige Pumpanordnung (30) jeweils unmittelbar benachbart an der Reaktorkammer (20) angeordnet sind, so dass die beweglichen Membranen (12, 32) bei entsprechender Druckbeaufschlagung der Arbeitskammern (13, 33) derart auslenkbar sind, dass sie mit jeweils dem stromaufwärtigen Medienport (21) und dem stromabwärtigen Medienport (22) der Reaktorkammer (20) dichtend in Eingriff kommen können, um ein zwischen Ventrikelpol (51) und Aortenpol (52) des Konstrukts (50) eingeschlossenes Volumen (55) zu bilden.

5. Bioreaktorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Haltevorrichtung (40) von der Reaktorkammer (20) körperlich getrennt ist und zumindest im Bereich des Medienports (21, 22) dichtend an der Wand der Reaktorkammer (20) anliegt.

6. Bioreaktorsystem nach Anspruch 5, wobei die Haltevorrichtung (40) innerhalb der Reaktorkammer (20) um eine horizontale Verbindungsachse zwischen Ventrikelpol

(51) und Aortenpol (52) rotierbar ist.

7. Bioreaktorsystem nach Anspruch 6, wobei die Haltevorrichtung (40) Magnetelemente (440) aufweist zur kontaktlosen Einkopplung eines Drehmoments zur Rotation der Haltevorrichtung über eine um die Reaktorkammer (20) angeordnete magnetische oder elektromagnetische Antriebseinheit (70) .

8. Verfahren zur Herstellung eines in vitro-Herzklappenkonstrukts in dem Bioreaktorsystem nach einem der vorstehenden Ansprüche, enthaltend die Schritte: a) Bereitstellen eines biokompatiblen Herzklappen-Trägergerüsts, b) Aufnehmen und Fixieren des Gerüsts (50) in der Haltevorrichtung (40) der Reaktorkammer (20) und c) Besiedeln des Gerüsts (50) mit biologischen Zellen durch Einbringen einer Zellsuspension in die Reaktorkammer (20).

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei in Schritt c) die Membranen (12, 32) beider der Reaktorkammer (20) unmittelbar benachbarten Pumpanordnungen (10, 30) durch Druckbeaufschlagung der Arbeitskammern (11, 31) derart ausgelenkt werden, dass sie mit dem stromaufwärtigen Medienport (21) und dem stromabwärtigen Medienport (22) jeweils dichtend in Eingriff kommen und zwischen Ventrikelpol (51) und Aortenpol (52) des Gerüsts (50) ein luminales Volumen (55) abgegrenzt wird und über einen luminalen Einlassport (24) mit einer Zellsuspension (80) beschickt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei in Schritt c) die Haltevorrichtung (40) mit dem Gerüst (50) in der Reaktorkammer (20) in Gegenwart der eingebrachten Zellsuspension (80) intermittierend rotiert wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10 mit dem weiteren Schritt: d) pulsatiles Perfundieren des mit biologischen Zellen besiedelten Konstrukts (50) mit Zellkulturmedium unter gezielter pulsatiler Druckbeanspruchung der Zellen, so dass ein konditioniertes und reifes in vitro- Herzklappenkonstrukt (50) daraus gebildet wird, wobei die pulsatile Perfusion durch interaktive Druckbeaufschlagung der jeweiligen Arbeitskammern (13, 33) beider Pumpanordnungen (10, 30) erfolgt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei in Schritt d) die aktive Druckbeaufschlagung der Arbeitskammer (13) der stromaufwärtigen Pumpanordnung (10) im zeitlichen Verlauf einem vorgegebenen in vivo-Ventrikeldruckverlauf folgt und die aktive Druckbeaufschlagung der Arbeitskammer (33) der stromabwärtigen Pumpanordnung (10) im zeitlichen Verlauf einem vorgegebenen in vivo- Aortendruckverlauf folgt.