WO2017043615A1 - 塩基性培養による麹菌の培養方法と誘導される抗菌組成物の利用 - Google Patents

塩基性培養による麹菌の培養方法と誘導される抗菌組成物の利用 Download PDF

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賜郎 藍田
豊志 浦上
直人 梶
健一 阿孫
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興人ライフサイエンス株式会社
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/34—Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to an antibacterial substance obtained by culturing koji mold and a method for producing the same.
  • Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae, Aspergillus kawachii, Aspergillus awamori, Aspergillus sojae, Aspergillus gilgulcus Aspergillus spp. It is a microorganism. It can be said that it is an excellent food in terms of safety to humans by accumulating food experiences over many years.
  • Patent Document 1 is a causative agent of periodontal disease in an extract obtained by water extraction of a solid culture produced by inoculating soybean, defatted soybean, wheat, rice, etc. with koji mold. It has been found to have antibacterial activity against Helicobacter pylori and Candida. Aspergillic acid described in Patent Document 2 has been found to be an antibacterial substance having an effect on bacteria, fungi, and molds. Further, in Patent Document 3, the presence of an antibacterial substance having an effect on bacteria, fungi, and fungi has been found in a culture liquid fraction having a molecular weight of 5,000 or more.
  • Non-Patent Document 1 Sagara et al. Reported that salt koji prepared using Miso for miso and salt (concentration of 7.5% or more) was suggested to have an antibacterial effect due to some action of Koji.
  • Non-Patent Document 2 Tsukahara and Hosaka et al.
  • Yeastcidin Yeastcidin, which has antibacterial properties against wild yeast other than sake brewer's yeast, in a supernatant obtained by culturing koji molds in a broth medium for a long period of time.
  • Non-Patent Document 3 suggests the possibility that yeastsaidin has an effect on bacteria.
  • Patent Document 4 Kitagawa et al.
  • Non-patent document 4 reports that kojic acid produced in the culture solution by Aspergillus oryzae also exhibits antibacterial effects on both gram-negative and positive bacteria.
  • the culture is basically a solid medium, and even if it is a liquid medium, a large amount (7.5% or more) of salt is required, or a complex and nutrient rich rice bran saccharified solution derived from rice and koji mold is used as a medium.
  • a complex and nutrient rich rice bran saccharified solution derived from rice and koji mold is used as a medium.
  • gonococci themselves produce antibacterial substances, rather than converting and synthesizing the components derived from the medium by the enzyme and metabolism of Aspergillus. Contains substances. Because stationary culture requires 10 to 20 days for gonococcal culture, it takes more time from 72 hours required for general gonococcal growth culture other than the production of antibacterial substances. Is done.
  • Aspergillus filamentous fungi such as Neisseria gonorrhoeae are generally known to be neutral to acidic, particularly optimal acidic conditions, and existing antibacterial substances are produced on the neutral to acidic side It was reported. Even if the pH is not adjusted, the liquidity of the medium during culture changes from neutral to acidic, so in the implementation of existing antibacterial substances, the pH has not been adjusted or has been adjusted with the intention of becoming acidic conditions. .
  • Non-Patent Document 5 Park shows that the production of antibacterial substances is promoted in Aspergillus oryzae KCTC 6909 when gonococci are cultured in combination with intermittent basic conditions every 12 hours.
  • An object of the present invention is to provide a new antibacterial substance that can be efficiently obtained from microorganisms that have dietary experience and are recognized as safe. Another object is to provide a method for inducing sufficient antibacterial substances in a short period of culture without requiring a special culture medium, that is, a method for producing a highly safe antibacterial substance with excellent industrial productivity. .
  • the present invention (1) A method for producing an antibacterial substance, comprising a step of culturing koji molds in a liquid medium maintained at pH 7 to 10.
  • the production method according to (1) above, wherein the strain is one or more strains selected from (Aspergillus tamari), Aspergillus luchuensis, and Aspergillus nigar.
  • (1) or (2) which comprises a step of maintaining the pH of the culture solution at pH 7 to 10 by combining continuous monitoring with a pH meter and a pH titration device when culturing the koji mold in a liquid medium Manufacturing method.
  • (4) The production method according to any one of (1) to (3) above, wherein a blending amount of NaCl in the liquid medium is 0 to 5% by weight. It is related to.
  • a sufficient antibacterial substance can be produced in a short period of culture without complicated processes using Aspergillus filamentous fungi, that is, koji mold that has been eaten and has been recognized as safe.
  • the medium used for culturing the koji mold may be a liquid medium having a general composition and does not require a special culture medium.
  • the antibacterial substance obtained by using this method may be a new antibacterial substance having an antibacterial spectrum different from that obtained by a known method.
  • the koji mold used for the production of the antibacterial substance of the present invention refers to Aspergillus filamentous fungi that are used in the production of fermented foods and have a dietary experience. Typically, Aspergillus oryzae, Aspergillus soyz awamori), Aspergillus glaucus, Aspergillus tamari, Aspergillus luchuensis, Aspergillus nigar. Strains that produce aflatoxins such as Aspergillus flavus are not used.
  • the medium is preferably a liquid medium.
  • the medium required for the culture does not need to be a special one, and for example, a simple YPD medium may be used.
  • the sugar source and the nitrogen source can be changed, and NaCl can be added to be 5.0% or less.
  • molasses waste molasses
  • Glucose and maltose are preferable.
  • any nitrogen source that can be assimilated by Aspergillus oryzae can be used.
  • inorganic nitrogen such as nitrate and ammonium salt, residues such as okara, soy milk, whey, wheat bran, livestock meat and yeast And enzymatic degradation products. Peptone and tryptone are preferred.
  • Culture can be carried out by shaking culture, batch culture by aeration and agitation culture, or continuous culture or electric culture method by energization.
  • the antibacterial substance of the present invention can be obtained by maintaining the medium after inoculation with Neisseria gonorrhoeae for at least 24 hours.
  • Examples of the base used for pH control include sodium hydroxide, potassium hydroxide, and an aqueous ammonia solution, but the base can be used without particular limitation.
  • the pH control value of the medium during culture is optimized for each strain of Aspergillus, but is preferably pH 7 to pH 10, more preferably pH 7.5 to pH 9.5, and further preferably pH 8.0 to pH 9.5.
  • the culture time of the koji mold is a time required for the production of the antibacterial substance, and is usually 24 hours to 120 hours.
  • the culture solution after culturing contains an antibacterial substance.
  • the culture solution containing the antibacterial substance may be used or stored as it is, preferably after removing the cells, purified as necessary, and the resulting composition containing the antibacterial substance is frozen or powdered and stored. To do.
  • raw materials that can be used for foods for the purpose of excipients and the like can be used.
  • a composition containing an antibacterial substance can be used without being purified, and can be used after being purified according to the purpose.
  • raw crude products and degradation products such as lactic acid bacteria extract and yeast extract
  • preservatives such as glycine, chitin / chitosan, polylysine, shelf life improver, EDTA and citric acid
  • chelating substances such as protease, degrading enzymes such as protease, amylase, phosphatase, etc.
  • the antibacterial substance or the composition containing the antibacterial substance obtained by the method of the present application has high safety, it can be used without particular limitation as long as it is a food.
  • it can be used for foods such as vegetables and fruits, food materials such as seasonings, and cooked foods such as side dishes.
  • it can be used in various fields such as pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, livestock and fishery feeds, microbial-derived pesticides, and plant immunity enhancement.
  • the product of the present invention can utilize known antibacterial agent usage methods.
  • the product of the present invention is uniformly mixed with the food, the concentration of the product of the present invention is adjusted as appropriate, and sprayed onto the food.
  • Yeast extract made by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd. 1% by weight, high polypeptone (made by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 2% by weight, glucose (made by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade) 2% by weight dissolved in ultrapure water
  • 900 uL was dispensed into each plate (Sumitomo Bakelite, untreated well bottom).
  • concentrations at which the compositions of Comparative Examples 1 to 5 were dissolved in the LB medium were 1%, 3%, and 5%.
  • 900 ⁇ L of LB medium was dispensed.
  • 100 ⁇ L was extracted for turbidity measurement and the plate was sealed.
  • the cells were cultured with shaking in a shaking culture apparatus (TAITEC, Invitro shaker) at 37 ° C. and 650 rpm for 24 hours.
  • the growth inhibition due to turbidity measured at a wavelength of 600 nm was compared for the culture solutions in each well.
  • the turbidity after culture was lower than the control group as antibacterial activity (+), and the same or higher turbidity was defined as antibacterial activity ( ⁇ ).
  • Example 1 was prepared by the following method. (1) Preparation of Aspergillus A. oryzae (manufactured by Higuchi Matsunosuke Shoten Co., Ltd., No. 100, “Shirakaba” for sake brewing) was used in the same manner as in Comparative Example 1 (1). The isolated and purely cultured bacteria were scored on 7 mL of a potato dextrose agar slant medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), cultured at 30 ° C. for 72 hours, and each agar medium was appropriately cut out and subjected to the following liquid culture.
  • Aspergillus A. oryzae manufactured by Higuchi Matsunosuke Shoten Co., Ltd., No. 100, “Shirakaba” for sake brewing
  • the isolated and purely cultured bacteria were scored on 7 mL of a potato dextrose agar slant medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.),
  • Example 6 In the culture of Aspergillus oryzae in Example 1, the same procedure as in Example 1 was carried out except that the pH was not constantly controlled and was adjusted to pH 8.0 with a 1 N sodium hydroxide solution every 12 hours (total 6 times). A lyophilized powder of the koji mold culture solution was obtained and used as the composition of Comparative Example 6.
  • Example 1 the antibacterial test was done according to the above-mentioned (4) antibacterial test.
  • the results of the antibacterial test are shown in Table 2 (antibacterial activity of the culture supernatant of A. oryzae whose pH is controlled in an alkaline region).
  • the composition of Comparative Example 6 showed little antibacterial activity.
  • the composition of Example 1 exhibited antibacterial activity at an addition concentration of 3% or more for Gram-negative bacteria and at an addition concentration of 1% or more for Gram-positive bacteria. Therefore, as a method for adjusting the pH of the culture solution, it is more antibacterial substances produced or produced by controlling so as to always keep the alkalinity than intermittently controlling the alkalinity. It can be seen that the antibacterial activity of the active substance is high. Moreover, in Example 1 in which the pH was controlled to be constant, stronger antibacterial activity was shown against gram-positive bacteria than gram-negative bacteria.
  • Comparative Example 3 in which the culture without pH adjustment was performed shows stronger antibacterial activity against Gram-negative bacteria than Gram-positive bacteria. From these, it was suggested that the antibacterial substance contained in the composition of Example 1 obtained by constant pH control may be an antibacterial substance different from the antibacterial substance obtained without pH adjustment.
  • the antibacterial property in the composition of Example 1 was confirmed by considering the possibility that it was a component eluted from the cells by alkali.
  • A. oryzae “Shirakaba” was cultured for 72 hours under constant control of pH 7 (neutral).
  • the obtained culture broth was adjusted to pH 9 with sodium hydroxide and divided into four parts, which were placed at room temperature for 4 days, 50 ° C. for 30 minutes, 90 ° C. for 30 minutes and 110 ° C. for 30 minutes, and then with hydrochloric acid.
  • the pH was adjusted to 7.0. About these, when culture broth freeze-dried powder was acquired and antibacterial activity was measured according to the above-mentioned (4) antibacterial test, none of the four antibacterial activities were recognized. From this result, it is confirmed that the antibacterial substance in the composition of Example 1 is not a substance eluted by treating bacterial cells with alkali, but a substance produced in culture under a constant alkali condition. It was.
  • Chitin which is a cell wall component of mycelium of filamentous fungi, and chitosan obtained by treating chitin with alkali have knowledge that it has antibacterial activity, so confirm whether the antibacterial activity of Example 1 is due to them
  • a test was carried out.
  • A. oryzae “Shirakaba” was cultured for 72 hours under a constant pH 6 control.
  • 50 mg of filamentous fungus cell wall lytic enzyme Yatalase manufactured by Takara Bio Inc.
  • the antibacterial substance in the composition of Example 1 is not a chitin or chitosan produced by dissolving the cell walls of filamentous fungi but a substance produced in culture under a constant alkali condition. It was.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various conditions can be changed.
  • the technology of the present invention is also applicable to embodiments obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments. Included in the scope.
  • an antibacterial substance is induced very efficiently by culturing koji molds in a medium maintained basic. Moreover, it was suggested that the antibacterial substance is a novel antibacterial substance that could not be obtained by a known method.
  • antibacterial substances derived from "natural” are limited, and the desired properties from various types of koji molds for users who have had difficulty finding a desirable antibacterial spectrum, acid, heat and alkali resistance It is possible to provide an antibacterial substance having Therefore, it is expected to be used in a wide range of fields such as pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, livestock and fishery feeds, microorganism-derived pesticides, and plant immunity enhancement.

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Abstract

【課題】塩基性一定制御条件下において、麹菌からの抗菌性物質を誘導させる培養方法、及び抗菌組成物を提供する。 【解決手段】 麹菌を特定範囲のｐHで維持培養することで、麹菌から抗菌性物質が誘導されることを見出した。pHメーターとpH滴定装置を組み合わせ、pH７～１０の塩基性一定制御条件下にて培養させる方法であり、かつ、該方法を利用した抗菌性物質のスクリーニングを行うことで、通常の中性から酸性pH培養では得られない高い抗菌活性及び広範な抗菌スペクトルを持った抗菌物質を製造できる。

Description

塩基性培養による麹菌の培養方法と誘導される抗菌組成物の利用
　本発明は、麹菌を培養して得られる抗菌性物質とその製造方法に関する。
　近年、食品の安全・安心や売れ残り食品の廃棄低減とコストダウンなどを実現するため、品質劣化を招く微生物汚染制御への期待は高まりつつある。
　微生物汚染の制御には、工場における製造段階での菌数管理と包材の工夫、流通段階での温度管理と共に、日持向上剤・保存料製剤の利用というアプローチが重要と考えられている。
　しかしながら、合成保存料および日持向上剤の添加は、消費者の「自然」あるいは「天然」嗜好を反映して、近年敬遠される傾向にある。「天然」に近いかたちのものとして、微生物由来の抗菌性物質もあるが、安全性を担保する十分な食経験と、幅広い微生物への有効性を兼ね備えた抗菌性物質は限られたものとなっている。
　アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)やアスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori) 、アスペルギルス・ソーエ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・グラウカス(Aspergillus glaucus)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamari)、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis)をはじめとしたアスペルギルス属糸状菌、すなわち麹菌は、清酒や焼酎、泡盛、味噌、醤油などの製造において古くから用いられてきた、発酵食品の製造に欠かすことのできない重要な微生物である。長い年月の間に食経験を蓄積させ、人への安全性において、優れた食品とも言える。
　麹菌が抗菌性に関与している可能性や知見は複数報告されている。特許文献１に記載の杉山ら(２０１２年)は大豆、脱脂大豆、麦、米などに麹菌を接種して作製した固形培養物を水抽出して得た抽出液に、歯周病の原因菌であるジンジバリス菌のほか、ピロリ菌やカンジダ菌に対する抗菌活性があることを見出されている。特許文献２に記載されているアスペルギリン酸は、細菌・真菌・カビに対して効果を有する抗菌物質であることが見出されている。さらに、特許文献３では分子量５，０００以上の培養液分画中から細菌・真菌・カビに対して効果を有する抗菌物質の存在が見出されている。
　非特許文献１において相良らは、味噌用麹菌と食塩(濃度７．５％以上)を用いて仕込んだ塩麹は、麹菌の何らかの作用により抗菌効果を持つことが示唆されることを報告した。また、非特許文献２において塚原や穂坂らは、麹菌を麹汁培地にて長期間静置培養した上清中に、清酒醸造用の酵母以外の野生酵母に抗菌性を有するイーストサイジン(Yeastcidin)が存在することを報告した。非特許文献３において数岡らは、イーストサイジンが細菌に対する効果を持つ可能性を示唆している。特許文献４において北川らは、蒸煮うるち米等の蒸煮穀類中の蛋白質をプロテアーゼ処理することによって得られた酵素処理液に、アスペルギルス属に属する醸造用麹菌を接種して静置培養することにより麹菌体外に生産される抗菌物質を見出した。非特許文献４には、アスペルギルス・オリゼー(A. oryzae)が培養液中に産生するコウジ酸についても、グラム陰性菌と陽性菌の両方に抗菌効果を示すことが報告されている。
　従来、麹菌における抗菌物質の探索はアスペルギルス・オリゼー(A. oryzae)を対象に実施されてきた。培養は基本的に固体培地であり、液体培地であったとしても、大量(７．５%以上)の食塩を必要とするか、米と麹菌由来の複雑且つ栄養豊富な米麹糖化液を培地とするなど、自由な培地の設計や工業的生産時のスケールアップが困難である。さらに、培地の原料に由来する成分を抗菌性物質誘導の必要条件とする点から、純粋に麹菌そのものが抗菌物質を作るというより、培地由来の成分を麹菌の酵素・代謝により変換合成している物質が含まれる。静置培養故に、麹菌の培養には１０～２０日間を要するなど、抗菌性物質生産以外の一般的な麹菌増殖培養に必要な７２時間からさらに時間が掛かるため、生産性を上げることが課題とされる。
　麹菌をはじめとしたアスペルギルス属糸状菌の培養は、一般的に中性から酸性、特に酸性条件を至適とすることが知られており、既存の抗菌性物質は中性～酸性側で産生することが報告されていた。pHは調整しなくとも培養中の培地液性は中性から酸性に推移するため、既存の抗菌性物質取得の実施において、pHは未調整、若しくは酸性条件になるよう意図して調整されてきた。
　非特許文献５では、１２時間おきに断続的な塩基性条件を組み合わせて麹菌を培養させた場合、アスペルギルス・オリゼー(A. oryzae) KCTC ６９０９において抗菌性物質の産生量が促進されることをParkら(２００８年)は報告している。しかし、このように１２時間おきに塩基性条件であるpH８．０に 調整する手法では、産生される抗菌性物質の絶対量は高くなかった。
国際公開２０１２／０４３７４３号 特開２００３－８１７１５号公報 特開２００３－２６６９３号公報 特開平７－１７７８９７号公報
相良 他「３F２８a０７　塩麹製造中および保存中における食塩濃度の違いによる抗菌効果について」２０１５年日本農芸化学会 学会発表 穂坂 他「麹菌(A. oryzae)の生産する抗菌性物質(Yeastcidin)の精製と性質」（１９９１年）発酵工学 第６５巻、第３号 １９１－１９７ 数岡 他「麹菌が生産する抗菌物質をもちいた食品汚染防止」平成20年度 東京農業大学 学部研究所プロジェクト 研究成果総括報告書 「New Food Industry」(１９９０年) P.２５, Vol.３２, No.７, 「Isolation  and Characterization of an Extracellular Antimicrobial Protein from A. oryzae)」 J. Agric. Food Chem. ２００８, ５６, ９６４７-９６５２
　本発明の目的は、食経験があり安全性が認められている微生物から効率的に得られる、新たな抗菌性物質を提供することである。また、特殊な培養培地を必要とせず、短期間の培養で十分な抗菌性物質を誘導する方法、すなわち安全性の高い抗菌性物質の工業的生産性に優れた製造方法を提供することである。
　このような事情を鑑みて鋭意研究を重ねた結果、食経験があり安全性が認められているアスペルギルス糸状菌、すなわち麹菌を、一般的な組成の微生物用培地を用い、pHメーターと塩基性水溶液の自動滴定装置を組み合わせたpH制御装置を用いた塩基性一定制御培養を行うことにより、アスペルギルス・オリゼー(A. oryzae)から抗菌性物質が多く産生されることを見出した。さらにこのようにして得られた抗菌性物質が、公知の方法で得られたものと異なる、新たな抗菌性物質である可能性を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、
（１）麹菌をpH ７～１０に維持された液体培地で培養する工程を含む、抗菌性物質の製造方法。
（２）前記麹菌が、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・ソーエ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・グラウカス(Aspergillus glaucus)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamari)、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus nigar)から選ばれる１種又は２種以上の菌株である、上記（１）に記載の製造方法。
（３）麹菌を液体培地で培養する際に、pHメーターによる連続モニタリングと、pH滴定装置を組み合わせ、培養液のpHをpH７～１０に維持する工程を含む、上記（１）または（２）記載の製造方法。
（４）前記液体培地へのNaClの配合量が、０～５重量％である、上記（１）～（３）のいずれかに記載の製造方法。
に係るものである。
　本発明によると、食経験があり安全性が認められているアスペルギルス糸状菌、すなわち麹菌を用いて、複雑な工程を経ることなく、短期間の培養で十分な抗菌物質を産生することができる。麹菌の培養に用いる培地としては一般的な組成の液体培地でよく、特殊な培養培地を必要としない。また、この方法を用いて得られた抗菌性物質は、公知の方法で得られたものとは異なる抗菌スペクトルを有する新たな抗菌性物質である可能性がある。
　以下、本発明を詳細に説明し、本発明の理解に供する。
本発明の抗菌性物質の製造に用いる麹菌とは、発酵食品の製造に利用され、食経験を有するアスペルギルス属糸状菌を指す。
代表的なものとしては、醸造食品製造において食経験豊富なアスペルギルス属糸状菌として、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ソーエ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawacｈii)およびアスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・グラウカス(Aspergillus glaucus)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamari)、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis) 、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus nigar)が挙げられる。アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）のような、アフラトキシンを産生する菌株は用いない。
　本発明の実施において、培地は液体培地が好ましい。
培養に必要な培地は特殊なものである必要は無く、たとえば単純なYPD培地で構わない。或いは糖源や窒素源を変更することや、NaClを５．０%以下となるよう添加することも可能である。
　麹菌の培養には、糖として、資化可能な任意の単糖類や二糖類、三糖以上の多糖類、デンプン、さらに、ショ糖製造時に副産物として生じるモラセス（廃糖蜜）の様な混合糖類などを利用でき、特に制限は無い。好ましくはグルコースとマルトースである。
　窒素源としては、麹菌が資化可能な任意の窒素源を利用することができ、具体的には硝酸塩やアンモニウム塩などの無機窒素、オカラや豆乳、ホエー、小麦ふすま、畜肉、酵母などの残渣や酵素分解物などが利用できる。好ましくはペプトンやトリプトンである。
　培養は振とう培養や通気撹拌培養によるバッチ培養、または連続培養や通電による電気培養法も利用できる。
　本発明の抗菌物質は、麹菌を接種した後の培地を２４時間以上、中性～塩基性に維持することで得られる。pH制御に用いる塩基の種類は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアの水溶液などが挙げられるが、特に制限することなく使用して製造できる。培養時にはpHモニタリング装置とpH滴定装置を組み合わせたpH制御装置を使用し、且つ通気撹拌培養による振とう培養を行うことが望ましい。
　培養中の培地のpH制御値は麹菌の菌株毎に最適化を図るが、好ましくはpH７～pH１０、より好ましくはpH７．５～pH９．５、さらに好ましくはpH８．０～pH９．５である。
　麹菌の培養時間は、抗菌性物質が産生されるのに必要な時間とし、通常２４時間から１２０時間である。
培養後の培養液は抗菌性物質を含有する。抗菌性物質を含む培養液はそのまま使用または保存しても良いし、好ましくは菌体を除去後、必要に応じて精製し、得られた抗菌性物質を含む組成物を凍結または粉末化して保存する。
　抗菌製剤の製造には、賦形剤等の目的で食品用として利用可能な原料を用いることができる。また、抗菌性物質を含む組成物を精製せずに用いることも可能であり、目的に応じて精製してから利用することもできる。
　本発明においては製造工程中、または工程後に、例えば乳酸菌抽出物や酵母抽出物などの未加工粗製物や分解物、グリシンやキチン・キトサン、ポリリジンなどの保存料や日持ち向上剤、EDTAやクエン酸などのキレート物質、プロテアーゼやアミラーゼ、ホスファターゼなどの分解酵素を添加することにより、剤としての安定性や抗菌スペクトルの拡大、抗菌物質構造や組成物の改良、収量向上、味質の改善を図ってもよい。
　本願方法により得られた抗菌性物質又は抗菌性物質を含む組成物は、安全性が高いため、食品であれば、特に制限なく使用できる。例えば、野菜、果物などの食品、調味料などの食品素材、惣菜などの調理食品などに利用できる。また、食品だけでなく医薬品、医薬部外品、化粧品、畜産・漁業での飼料、微生物由来農薬、植物の免疫強化などの多様な分野で使用することが可能である。本発明品は、公知の抗菌剤の使用方法が利用できる。例えば、食品であれば、本発明品を食品に均一に混合する、本発明品を適宜濃度調整し、食品に噴霧するなどがある。
　以下、実施例を挙げて、本発明を詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
＜pH制御を行わない培養＞
＜比較例１＞
 (１)麹菌の調製
　麹菌としては、A. oryzae  (株式会社樋口松之助商店製、No.１００株、酒造用「白峯」)を用いた。単離・純粋培養した菌を、ポテトデキストロース寒天斜面培地（日水製薬株式会社製）７mLに割線後、３０℃で７２時間培養し、適宜寒天培地毎切り出して下記液体培養に供試した。
(２)液体培地の調製
　培養は全て液体培地にて実施した。酵母エキス(日本製薬株式会社製)１重量％、ハイポリペプトン（日本製薬株式会社製）２重量％、グルコース（和光純薬工業株式会社製、特級）２重量％となるように超純水に溶解したものを基本組成のYPD培地とした。これらを１２１℃２０分間オートクレーブ処理して滅菌した後、培養に使用した。
（３）麹菌の培養～培養液凍結乾燥粉末の取得
　麹菌の培養は坂口フラスコを用いて実施した。滅菌済みの５００mL坂口フラスコに前記のとおり調製した各培地１００mLを移し、PDA培地から切り出したA. oryzae 白峯の胞子を植菌。２８℃で７２時間振とう培養した。培養終了後、培養液を金属メッシュのザル(目開き１mm)で粗ろ過したのち、ろ紙(ADVANTEC社製「７C」)でろ過して菌糸を取り除いた。取得したろ液のpHが、以降の抗菌性評価に影響を及ぼさないpH７±1になるよう水酸化ナトリウム水溶液で調整した。ろ液を１０，０００rpmで１０分間遠心分離した後、上清を回収してφ０．８μmフィルター(ADVANTEC社製)で処理したのち、φ０．２２μm(ろ過できなければφ０．４５μm)フィルターでデブリや胞子を除去した。凍結乾燥は「FreeZone-２．５」(LABCONCO社製)を用い、麹菌培養液の凍結乾燥粉末を得た。得られた凍結乾燥粉末を比較例１の組成物とした。
　＜比較例２＞
　YPD培地に加えて塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、特級）を０．５重量％配合した培地を使用する以外は、比較例１と同様に行い、得られた凍結乾燥粉末を比較例２の組成物とした。
　＜比較例３＞
　YPD培地に加えて塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、特級）を１．０重量％配合した培地を使用する以外は、比較例１と同様に行い、得られた凍結乾燥粉末を比較例３の組成物としとした。
  ＜比較例４＞
　YPD培地に加えて塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、特級）を３．０重量％配合した培地を使用する以外は、比較例１と同様に行い、得られた凍結乾燥粉末を比較例４の組成物とした。
＜比較例５＞
　YPD培地に加えて塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、特級）を５．０重量％配合した培地を使用する以外は、比較例１と同様に行い、得られた凍結乾燥粉末を比較例５の組成物とした。
　（４）抗菌性試験
　グラム陰性菌としてEscherichia coli DH5α(大腸菌)、グラム陽性菌としてBacillus subtilis (納豆菌)を被検菌として用いた。これらの各被検菌を、液体LB培地を用いて３７℃にて一晩前培養してPBS緩衝液に希釈し、２%の希釈被検菌体液を調製した。
　試料として、比較例１～５の組成物をそれぞれ液体LB培地(Difco社製『LB Broth, Miller (Luria-Bertani)』)に溶解し、フィルターろ過(φ０．４５um)した後、２４ウェルのマルチプレート（住友ベークライト社製、ウェル底面未処理）に９００uLずつ分注した。比較例１～５の組成物をLB培地に溶解する濃度は、１％、３％、５％とした。対照区については、LB培地９００μL分注した。
　前述の被検菌体液を各ウェルに９０uLずつ、最終菌体濃度０．２％となるよう分注したのち、１００uLを濁度測定のため抜き取り、プレートをシールした。振とう培養装置（TAITEC社製、Invitro shaker)で３７℃、６５０rpmにて２４時間振とう培養した。培養後、各ウェルの培養液について波長６００nmで測定した濁度による増殖抑制を比較した。
　培養後の濁度が対照区よりも低いものを抗菌活性（＋）とし、同じか高いものを抗菌活性（－）とした。
　比較例１～５の結果
比較例１～５の試料のLB培地への溶解濃度が１％、３％の場合は、比較例１～５のいずれも、グラム陰性(大腸菌)、グラム陽性(納豆菌)ともに抗菌活性は（－）であった。試料の溶解濃度が５％の場合の結果を表１（A. oryzae由来培養上清物の抗菌力（抗菌試験での試料添加濃度５％））に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示す通り、試料添加濃度５％で抗菌活性試験をしたとき、A. oryzae 白峯をpH制御無しで培養した上清の凍結乾燥物（比較例１～５）は、１％塩化ナトリウム添加で培養した比較例３を除き、抗菌性を示さなかった。比較例３については、グラム陰性菌であるE.coliに対してのみ増殖を抑制する抗菌性を示した。全体として、この培養法における抗菌性物質の産生量は低いか、抗菌性物質の抗菌活性が低いことがわかった。また、抗菌性物質の誘導に対する塩化ナトリウムの影響は少ないと推察された。
＜pH一定制御培養＞
＜実施例１＞
　実施例１については、以下の方法により調製した。 
 (１)麹菌の調製
　比較例１の（１）と同様に、A. oryzae  (株式会社樋口松之助商店製、No.１００株、酒造用「白峯」)を用いた。単離・純粋培養した菌を、ポテトデキストロース寒天斜面培地（日水製薬株式会社製）７ｍＬに割線後、３０℃で７２時間培養し、適宜寒天培地毎切り出して下記液体培養に供試した。
 (２)液体培地の調製
　比較例１の（２）と同様の方法により調製した培地を用いた。なお、YPDに加える塩化ナトリウム濃度は０．５％（５ｇ/L）とした。
（３）麹菌の培養～抗菌性物質の取得
　実施例１において、pHの一定制御培養をジャーファーメンターにて実施した。滅菌済みの２Lジャーファーメンターに調製した液体培地１Lを移し、PDA培地から切り出した胞子を植菌した。培養中はpHメーターによる連続モニタリングとpH滴定装置を組み合わせ、１規定水酸化ナトリウムを用いてpH７．５～８．５に入るように制御、温度２８℃、通気量０．８L/min、撹拌速度４００rpmにて７２時間培養した。また、発泡が激しいため、途中から滅菌済みの「消泡剤CKB」（ディスフォーム社製）を８０μL添加した。培養液について、比較例１と同様の方法により処理を行い、得られた凍結乾燥粉末を実施例１の組成物とした。
＜比較例６＞
　実施例１の麹菌の培養において、pHを一定制御ではなく、１２時間おき（計６回）に１規定水酸化ナトリウム溶液でpH８．０に調整した以外は、実施例１と同様に行って、麹菌培養液の凍結乾燥粉末を取得し、比較例６の組成物とした。
　実施例１と比較例６の組成物について、前述の（４）抗菌性試験に準じて、抗菌性試験を行った。
抗菌性試験の結果を表２（pHをアルカリ域で制御したA.oryzae培養上清の抗菌力）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すとおり、この抗菌試験系においては、比較例６の組成物は抗菌活性をほとんど示さなかった。一方、実施例１の組成物は、グラム陰性菌に対しては添加濃度３％以上において、グラム陽性菌に対しては添加濃度１％以上において、抗菌活性を示した。
このことから、培養液のpH調整方法としては、断続的にアルカリ性に制御するのに比べ、常にアルカリ性を保つように制御をする方が、抗菌性物質が多く産生される、あるいは産生される抗菌性物質の抗菌活性が高いことがわかる。
 また、pH一定制御した実施例１においては、グラム陰性菌よりグラム陽性菌に対して、より強い抗菌活性を示した。一方、pH調整を行わない培養を行った比較例３においては、グラム陽性菌よりグラム陰性菌に対してより強い抗菌活性を示している。
これらのことから、pH一定制御で得られた実施例１の組成物に含まれる抗菌性物質は、pH無調整で得られる抗菌性物質とは異なる抗菌性物質である可能性が示唆された。
＜有機酸分析＞
　乳酸や酢酸などは抗菌性を有する有機酸として知られているため、実施例１の抗菌活性が、それらの有機酸によるものであるかを確認するために試験を行った。
実施例１、比較例６のサンプル５％添加後の被検菌培地中の乳酸と酢酸の濃度を、pH緩衝化ポストカラム電気伝導度検出法によるHPLC分析により測定した。カラムはShim-pack SCR-１０２H ×２を用いた。
結果を表３（pHをアルカリ域で制御したA.oryzae培養上清の有機酸量）に示す。
　今回測定された有機酸量は、pH７付近における各々のMICを下回る１００分の１以下の濃度であることから、有機酸の抗菌性は無視できる。すなわち、抗菌性試験で見られた抗菌活性は、これらの有機酸によるものではないと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　＜アルカリ処理と抗菌性＞
　実施例１の組成物における抗菌性が、アルカリにより菌体から溶出した成分である可能性を考え、確認を行った。
　pH７（中性）一定制御で、A. oryzae 「白峯」を７２時間培養した。得られた培養液を、水酸化ナトリウムでpH９に調整して４つに分け、それぞれ室温で４日、５０℃で３０分、９０℃で３０分、１１０℃で３０分置いた後、塩酸でpH７．０に調整した。これらについて、培養液凍結乾燥粉末を取得し、前述の（４）抗菌性試験に準じて抗菌活性を測定したところ、４ついずれも抗菌活性は認められなかった。
　この結果から、実施例１の組成物中の抗菌性物質は、菌体がアルカリで処理されて溶出された物質ではなく、アルカリ一定条件下での培養において産生された物質であることが裏付けられた。
＜酵素処理と抗菌性＞
　糸状菌の菌糸の細胞壁成分であるキチンや、キチンをアルカリ処理することで得られるキトサンには抗菌活性があるという知見があるため、実施例１の抗菌活性が、それらによるものであるかを確認するために試験を行った。
pH６一定制御で、A. oryzae 「白峯」を７２時間培養した。得られた培養液１００gに、糸状菌細胞壁溶解酵素Yatalase（タカラバイオ社製）を５０mg添加し、３７℃で８時間反応させた。加熱失活後、pH７．０に調整し、その培養液凍結乾燥粉末について、前述の（４）抗菌性試験に準じて抗菌活性を測定したところ、抗菌活性は認められなかった。
 この結果から、実施例１の組成物中の抗菌性物質は、糸状菌の細胞壁が溶解して生じたキチンやキトサンではなく、アルカリ一定条件下での培養において産生された物質であることが裏付けられた。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、種々の条件変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
本発明により、塩基性に維持した培地で麹菌を培養することにより、きわめて効率的に抗菌性物質が誘導されることが見出された。またその抗菌性物質は、公知の方法では得られなかった新規の抗菌性物質であることが示唆された。
　従来、「天然」由来の抗菌性物質は限られており、望ましい抗菌スペクトルや耐酸・耐熱・耐アルカリを有するものを見つけることが困難であったユーザーに対して、多種類の麹菌から希望する特性を有する抗菌物質を提供できる可能性を有している。よって食品だけでなく医薬品、医薬部外品、化粧品、畜産・漁業での飼料、微生物由来農薬、植物の免疫強化などの広い分野において利用されてゆくことが期待される。

Claims (4)

  1. 麹菌をpH ７～１０に維持された液体培地で培養する工程を含む、抗菌性物質の製造方法。
  2. 前記麹菌が、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・ソーエ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・グラウカス(Aspergillus glaucus)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamari)、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus nigar)から選ばれる１種又は２種以上の菌株である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 麹菌を液体培地で培養する際に、pHメーターによる連続モニタリングと、pH滴定装置を組み合わせ、培養液のpHをpH７～１０に維持する工程を含む、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 前記液体培地へのNaClの配合量が、０～５重量％である、請求項１～３のいずれかに記載の製造方法。
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