KR20190052815A - Mat1-1 교배형 유전자를 갖는 아스페르길루스 루추엔시스 신규 미생물 및 이의 용도 - Google Patents

Mat1-1 교배형 유전자를 갖는 아스페르길루스 루추엔시스 신규 미생물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Mat1-1 교배형 유전자를 갖는 아스페르길루스 루추엔시스 신규 미생물 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 신규 미생물 아스페르길루스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis) M2102균주(KACC93294P) 또는 M2104균주(KACC93293P)는 Mat1-1 교배형 유전자를 갖는 것으로써, 유성생식을 가능하게 한다는 것이 큰 특징이다.
본 발명에 의해, 유성생식이 가능해진 아스페르길루스 루추엔시스 신규 미생물이 제공됨에 따라 자연 교배가 가능해져 암수 교잡에 의한 다양한 후손생성이 가능해지며, 유해한 돌연변이의 발생위험이 없고 안정성도 높으며 보다 적은 비용으로 주류와 다류 제조의 핵심곰팡이인 아스페르길루스 루추엔시스의 유용한 균주를 육종할 수 있게 된다.

Description

Mat1-1 교배형 유전자를 갖는 아스페르길루스 루추엔시스 신규 미생물 및 이의 용도{New microorganism of Aspergillus luchuensis having Mat1-1 mating type and the use thereof}
본 발명은 Mat1-1 교배형 유전자를 갖는 아스페르길루스 루추엔시스 신규 미생물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유성생식을 가능하도록 Mat1-1 교배형 유전자를 갖는 신규 미생물 아스페르길루스 루추엔시스 및 이의 용도에 관한 것이다.
곰팡이는 통상적으로 유성생식과 무성생식 2가지 방법으로 후손을 퍼뜨리는 것으로써, 무성생식(無性生殖)의 경우에는 배우자와의 교배없이 자체적으로 분생포자를 만들어 후손을 퍼뜨리는 반면, 유성생식(有性生殖)의 경우에는 자연스럽게 상대 배우자와의 교배를 통하여 포자를 만들어 후손을 퍼뜨리는 것이 특징이다.
다시 말해, 유성생식의 경우에는 자연스럽게 상대배우자와의 유전적조합을 통하여 다양한 후손을 만들 수 있는 반면, 무성생식의 경우에는 자연스러운 암수교잡이 불가능하여 유전적배경이 동일한 후손을 만들어, 형질이 우수한 균주를 선발하기 위해서는 별도로 방사선과 자외선을 조사하여 변이를 유발하거나 유전자 재조합 기술을 사용하여야 한다. 그러나, 이러한 상기 기술들은 과도하고 치명적인 유전적 변이가 발생하여 안정성이 떨어지며, 또한 유전자 재조합의 경우에는 사회적 인식문제로 식용곰팡이의 사용에는 큰 제약이 따르고 있다.
아스페르길루스 루추엔시스 균주는 통상적으로 한국의 막걸리, 일본의 소주, 아와모리주, 중국의 보이차 제조시 발효과정에서 매우 중요하게 작용하는 곰팡이인 것으로써, 흔히 무성생식으로 번식하는 것으로 알려져 있다. 일본 등에서 아스페르길루수 루추엔시스의 교배형을 조사하였는데 조사된 곰팡이는 모두 Mat1-2의 단일 교배형을 가지는 것으로 조사된 바, 유성생식이 불가한 것으로 조사되었다.
이와 같이, 현재는 Mat1-1 교배형을 가지는 아스페르길루스 루추엔시스 균주는 세계적으로 보고되지 않아 주류 또는 다류 발효 제조시에 사용하는 아스페르길루스 루추에시스 균주의 육종 시에는 현재까지 방사선조사, 유전자 재조합 등을 사용하였으며, 안정성이 떨어지거나, 비용이 많이 들어가는 문제점이 있다. 이에 현재로는 Mat1-1 교배형을 가지는 아스페르길루스 루추엔시스 균주를 찾는 것이 시급한 실정이다.
1. Anbazhagan Mageswari et al. 2016. Analysis of the Mat1-1 and Mat1-2 gene ration in Black koji molds isolated from meju. Mycobiology. 44: 269-276. 2. Osamu Yamada et al. 2016. Genome sequence of Aspergillus luchuensis NBRC 4314. DNA Research. 23: 507-515. 3. SB Hong et al. 2013. Aspergillus luchuensis, an industrially important black Aspergillus in East Asia. PLoS One 8 e63769.
본 발명의 목적은 유성생식이 이루어질 수 있도록 Mat1-1 교배형 유전자를 갖는 아스페르길루스 루추엔시스 신규미생물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 신규 미생물 아스페르길루스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis) M2102균주(KACC93294P) 또는 M2104균주(KACC93293P)는 Mat1-1 교배형 유전자를 갖는 것으로써, 유성생식을 가능하게 한다는 것이 큰 특징이다.
본 발명의 주류 또는 다류 제조용 미생물 제제는 상기와 같은 신규 미생물 아스페르길루스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis) M2102균주(KACC93294P) 또는 M2104균주(KACC93293P)를 유효성분으로 포함하는 것이 특징이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않는다.
본 발명에 의해, 유성생식이 가능해진 아스페르길루스 루추엔시스 신규 미생물이 제공됨에 따라 자연 교배가 가능해져 암수 교잡에 의한 다양한 후손생성이 가능해지며, 유해한 돌연변이의 발생위험이 없고 안정성도 높으며 보다 적은 비용으로 주류와 다류 제조의 핵심곰팡이인 아스페르길루스 루추엔시스의 유용한 균주를 육종할 수 있게 된다.
도 1은 아스페르길루스 루추엔시스 동종 균주간의 교배형 유전자 형태를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
A의 1~15 레인: KACC 46772, 46771, 45131, 41731, 47234, 47004, 47235, M29, M532, M1003, M2009, M2093, M2096, M2097
B의 1~8레인: KACC M2098, M2099, M2102, M2103, M2104, 46490, M2106, M2113.
도 2는 본 발명에서 분리한 신규균주인 M2102 균주와 M2104 균주의 β-tubulin 유전자 염기서열을 바탕으로 작성된 분자계통도 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.
본 발명의 발명자들은 아스페르길루스 루추엔시스 종이 Mat1-1 또는 Mat1-2 유전자 중 하나를 가지는 자웅이주 곰팡이인 점을 착안하여, 기존에 알려지지 않은 Mat1-1 교배형 유전자를 가진 아스페르길루스 루추엔시스를 발굴하는 것을 큰 목적으로 하여, 여러 주류, 장류 등을 대상으로 균주의 분리를 시행하였으며, 그 중 2 균주인 M2102균주 또는 M2104균주에서 교배형 유전자 중 Mat1-1 유전자(일반적으로, 유성세대 포자를 형성시킬 수 있는 배우자를 의미함)만이 증폭됨을 확인하였다.
여기서 Mat1-1 유전자는 기존 아스페르길루스 루추엔시스의 교배형으로 알려진 Mat1-2 유전자의 상대 배우자 유전형을 의미하는 것으로써, 이 유전자의 발굴로 인해 추후 주류 또는 다류 발효제조시 별도의 유전자 변형 과정 없이도 유성생식을 가능하게 하여 자연교배로 인한 다양한 아스페르길루스 루추엔시스의 유용한 균주를 육종할 수 있게 되어 최종 주류 또는 다류 생산시 품질이 우수한 제품들을 생산할 수 있는 미생물 제제로 사용이 가능함을 알 수 있다.
상기 확인된 2 균주인 M2102균주 또는 M2104균주를 대상으로 β-tubulin 유전자 염기서열을 바탕으로 분자계통도를 확인한 결과, 상기 선발균주들은 아스페르길루스 속의 여러 균주들과 가까운 근연관계에 속하며, 아스페르길루스 루추엔시스 균주와 가장 높은 상동성(각각 99.93%)을 보이는 것으로 아스페르길루스 루추엔시스의 신규한 균주로 밝혀졌다.
이에, 본 발명은 상기 선발 2균주를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 2017. 10. 20일 수탁번호 KACC93294P, KACC93293P를 각각 부여받았으며, 이는 서열번호 1로 기재되는 염기서열 전체 또는 그것의 일부로 이루어지며, 각각 510bp 및 487bp의 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 구성됨을 확인하였다.
본 발명의 미생물 제제(배양액)는 상기 신규 M2102균주 또는 M2104균주를 하나이상 포함하는 것으로, 상기 균주의 생장온도, rpm, 시간 등 어느 조건이든 적용가능하여 이를 한정하지 않으나, 상기 실험결과를 토대로 특히 28~34℃에서 균주활성이 가장 잘 일어남을 알 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 균주의 분리 및 각 유전자 증폭 결과 확인
1. 실험방법
1) 균주 분리 및 배양방법
전국의 주류, 장류 등으로부터 아스페르길루스 루추엔시스 총23 균주들을 분리하였다.
2) 유전자 증폭형 특이 프라이머 설계 및 PCR 증폭 조건 설정
(1) 게놈 DNA 추출 (Genomic DNA isolation)
Malt extract broth(MEB) 배지 10mL에 각 균주들을 접종하고 200rpm, 25~28℃, 2~3일간 배양하여 균사를 얻었다. 얻어진 균사를 얼린 다음 동결건조한 후 갈아서 고운가루로 만들고 DNeasy Plant Mini kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 전체 게놈 DNA를 추출하여 교배형 유전자(Mat) 증폭에 사용하였다.
(2) 유전자 증폭을 위한 프라이머
Primer Sequence
Mat1-1F-An 5'-GCGGCCACTGAACAGTTTCATTGCT-3’
Mat1-1R-An 5'-TGATGGAGTATGCCTTGGCTACGATG-3’
Mat1-2F 5'-TTCCTCGTCCGCCAAATGCA-3’
Mat1-2R 5'-GAGATGATGTTCGACGCTTC-3’
(3) PCR mixture 조성
10x PCR buffer 5μL, 2.5mM dNTP 3μL, 농도 100pmol의 프라이머 각각(Mat1-1F-An, Mat1-1R-An) 0.4μL, Taq DNA 합성효소 0.3μL, 멸균 탈염수 39.9μL, DNA 주형가닥 1μL(10ng)을 넣어 총 50uL의 PCR mixture를 만들었다.
(4) PCR 반응 조건
Mat1-1 교배형 유전자는 95℃에 5분간 반응 후, 95℃에 30초간 변성하고 72℃에서 2분간 풀림과 증폭을 25번 진행하였고 마지막 증폭을 72℃에서 5분간 실시하여 Mat1-1 교배형 유전자를 증폭하였고, Mat1-2 교배형 유전자는 95℃에 5분간 반응 후, 95℃에 1분간 변성하고 58℃에서 1분간 풀림을 한 다음 72℃에서 30초간 증폭을 25번 진행하였고 마지막 증폭을 72℃에서 5분간 실시하여 Mat1-2 교배형 유전자를 증폭하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 하기 표 2 및 도 1과 같이 나타났다.
KACC no. 균주 정보 분리원과 지역 교배형
46772 NBRC4281=RIB2642=CBS205.80 (A.luchuensis 표준균주) 아와모리 코지, 일본 오키나와 MAT1-2
46771 NBRC4308=CBS117.80=NRRL4886
(A.kawachii 표준균주)		 소주코지, 일본 큐슈 MAT1-2
46516 CF1005(A.kawachiii 한국막걸리제조 백국균) 막걸리코지, 한국 충무발효 MAT1-2
45131 NBRC4121=NRRL4796=CBS564.65(A.acidus 표준균주) 아와모리 코지, 일본 오키나와 MAT1-2
41731 CBS119384=NR15-1(A.coreanus 표준균주) 누룩, 한국 보은 MAT1-2
47234 JCM2261=IAM2112(A.awamori 표준균주) 아와모리 코지, 일본 오키나와 MAT1-2
47004 NBRC4123=NRRL4797=IAM2397=ATCC16884=CBS565.65=IMI175963 아와모리 코지, 일본 오키나와 MAT1-2
47235 JCM22302=IAM2255=CBS125.52=R-0436(A.inuii 표준균주) 흑국균, 일본 오키나와 MAT1-2
47005 K-4133=NRRL 4750=CBS 128.52 일본 미상 MAT1-2
M*29 　 메주(양평) MAT1-2
M532 　 메주(횡성) MAT1-2
M1003 　 메주(여주) MAT1-2
M2009 　 메주(용인) MAT1-2
M2093 　 메주(용인) MAT1-2
M2096 　 메주(용인) MAT1-2
M2097 　 메주(용인) MAT1-2
M2098 　 메주(용인) MAT1-2
M2099 　 메주(순창) MAT1-2
M2102 　 메주(순창) MAT1-1
M2103 　 메주(용인) MAT1-2
M2104 　 메주(안성) MAT1-1
46490 　 메주(용인) MAT1-2
M2106 　 메주(용인) MAT1-2
M2113 　 메주(양평) MAT1-2
상기 표 1에 나타나 있듯이, 아스페르길루스 루추엔시스 종은 Mat1-1 또는 Mat1-2 유전자 중 하나를 가지는 자웅이주 곰팡이인 것으로 확인되었으며, 도 1에 나타나 있듯이, 상기 균주들 중에서도 주류용 코지에서 분리한 8균주 모두, 메주에서 분리한 15균주 중 13균주 등 대부분이 Mat1-2의 300bp의 밴드를 형성하는 반면, 2균주(M2102, M2104)에서만 Mat1-1 유전자가 증폭되되, 약 200bp의 단편의 Mat1-1 유전자가 증폭됨을 확인하였다.
이에, 상기 표 1에 나타낸 23균주 중에 Mat1-1 교배형 유전자를 갖는 균주인 순창지역의 메주에서 분리한 M2102균주와 안성지역의 메주에서 분리한 M2104균주를 채택하여 하기와 같이 유전자 분석을 시행하였다.
<실시예 2> M2102, M2104 균주의 DNA 추출 및 β-tubulin유전자 분석
1. 실험방법
상기 실시예 1을 통해 최종 선발된 균주인 M2102 균주와 M2104 균주의 β-tubulin 유전자 염기서열을 바탕으로 분자계통도를 작성하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 도 2에 나타나 있듯이 상기 실시예 1에서 선발된 신규균주들은 최종 신규미생물 아스페르길루스 루추엔시스 균주로 동정됨을 확인하였으며, 이에 첨부된 기탁증명서에 기재되어 있듯이, 상기 M2102균주와 M2104균주를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 2017. 10. 20일 수탁번호 KACC93294P, 93293P를 각각 부여받았다.
상기 결과들과 같이, 본 발명에 의해 유성생식이 가능해진 Mat1-1 교배형 유전자를 갖는 아스페르길루스 루추엔시스 신규 미생물이 제공됨에 따라 자연 교배가 가능해져 암수 교잡에 의한 다양한 후손생성이 가능해지며, 유해한 돌연변이의 발생위험이 없고 안정성도 높으며 보다 적은 비용으로 주류와 다류 제조의 핵심곰팡이인 아스페르길루스 루추엔시스의 유용한 균주를 육종할 수 있게 된다.
상기의 본 발명은 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
기탁기관명 : 국립농업과학원 농업유전자원센터
수탁번호 : KACC93294P
수탁일자 : 20171020
기탁기관명 : 국립농업과학원 농업유전자원센터
수탁번호 : KACC93293P
수탁일자 : 20171020
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> New microorganism of Aspergillus luchuensis having Mat1-1 mating type and the use thereof <130> P2017-0250 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 510 <212> DNA <213> Aspergillus luchuensis M2102 <400> 1 tggtacgtat tcactgccac tggattgggg atggataaca tcatctctca agctatctcg 60 gcttgagttc agatgttatt tatcgggtat atagctatcg ggttaagaac acgtctaaca 120 actcaacagg cagaccatct ctggcgagca cggccttgac ggctccggtg tgtaagtgca 180 actttttcac acctctcaat tggtcgacaa tgtggaaagg attgggtttc ctgacacgca 240 ggatagttac aatggcacct ccgacctcca gctggagcgc atgaacgtct acttcaacga 300 ggttagatca caccgtccct gagttttttc acgacaatat catcaatgtc ctgaccactt 360 cagcaggcta gcggtaacaa gtatgtcccc cgtgccgtcc tcgtcgatct cgagcccggt 420 accatggacg ctgtccgtgc cggtcccttc ggccagctct tccgtcccga caacttcgtc 480 ttcggccagt ccggtgctgg taacaactgg 510 <210> 2 <211> 487 <212> DNA <213> Aspergillus luchuensis M2104 <400> 2 tcggtgctgc tttctggtac gtattcactg ccactggatt ggggatggat aacatcatct 60 ctcaagctat ctcggcttga gttcagatgt tatttatcgg gtatatagct atcgggttaa 120 gaacacgtct aacaactcaa caggcagacc atctntggcg agcacggcct tgacggctcc 180 ggtgtgtaag tgcaactttt tcacacctct caattggtcg acaatgtgga aaggattggg 240 tttcctgaca cgcaggatag ttacaatggc acctccgacc tccagctgga gcgcatgaac 300 gtctacttca acgaggttag atcacaccgt ccctgagttt tttcacgaca atatcatcaa 360 tgtcctgacc acttcagcag gctagcggta acaagtatgt cccccgtgcc gtcctcgtcg 420 atctcgagcc cggtaccatg gacgctgtcc gtgccggtcc cttcggccag ctcttccgtc 480 ccgacaa 487

Claims (5)

  1. 서열번호 1로 표현되는 염기서열로 이루어지며 Mat1-1 교배형 유전를 갖는,
    신규 미생물 아스페르길루스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis) M2102균주(KACC93294P).
  2. 서열번호 2로 표현되는 염기서열로 이루어지며 Mat1-1 교배형 유전를 갖는,
    신규 미생물 아스페르길루스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis) M2104균주(KACC93293P)
  3. 제1항에 있어서,
    상기 신규 미생물은 유성생식이 가능한 것이 특징인,
    신규 미생물 아스페르길루스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis) M2102균주(KACC93294P).
  4. 제2항에 있어서,
    상기 신규 미생물은 유성생식이 가능한 것이 특징인,
    신규 미생물 아스페르길루스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis) M2104 균주(KACC93293P)
  5. 제1항에 따른 신규 미생물 아스페르길루스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis) M2102균주(KACC93294P) 또는 제2항에 따른 신규 미생물 아스페르길루스 루추엔시스(Aspergillus luchuensis) M2104균주(KACC93293P)를 유효성분으로 포함하는,
    주류 또는 다류 제조용 미생물 제제.
KR1020170148568A 2017-11-09 2017-11-09 Mat1-1 교배형 유전자를 갖는 아스페르길루스 루추엔시스 신규 미생물 및 이의 용도 KR102024211B1 (ko)

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