WO2017038939A1 - 口腔前癌病変の検出方法 - Google Patents

口腔前癌病変の検出方法 Download PDF

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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a precancerous lesion in the oral cavity, and more specifically, to a method for noninvasively detecting a precancerous lesion in the oral cavity by analyzing DNA contained in a mouthwash (gargle).
  • the oral cavity is an organ that has important functions such as mastication, swallowing, and articulation that are indispensable for human survival and life, it is generally low in recognition of oral cancer, and initially has poor subjective symptoms. Early detection of oral cancer is not a satisfactory situation because there are many mucosal diseases presenting with clinical symptoms. The 5-year survival rate for oral cancer is about 65%.
  • non-invasive screening methods such as fecal occult blood test for colorectal cancer, X-ray test for gastric cancer, mammography test for breast cancer, etc. have not been established.
  • oral cancer screening including the discovery of pre-oral cancer lesions, medical examination by specialists is necessary, and at present, large-scale screening is virtually impossible.
  • screening tests by staining using a dye such as toluidine blue are known, but the diagnostic accuracy is not always satisfactory.
  • leukoplakia is a precancerous lesion of oral cancer with a relatively high frequency of white keratinization found in the buccal mucosa, tongue, gingiva and the like.
  • Known causes of leukoplakia include smoking and alcohol stimulation, mechanical stimulation due to dentures, vitamin deficiency, etc., but there are many cases of unknown causes.
  • the lesion may be raised or painful, but if it does not rise and is painless, it is often not noticed even if it develops. However, especially when it is formed on the tongue, it is highly likely to become malignant, and it is regarded as a typical precancerous lesion.
  • resection is the most reliable, but when the lesion is extensive, treatment is performed while the lesion is detected early and the progress is observed for reasons such as dysfunction resulting from resection. Is considered appropriate.
  • Patent Documents 1 and 2 As methods for detecting oral cancer, methods for detecting oral disease metabolites or transcriptome patterns in saliva have been proposed (Patent Documents 1 and 2).
  • Non-patent Documents 1 and 2 a gene group showing abnormal methylation specific to oral cancer.
  • the methods described in Non-Patent Documents 1 and 2 are capable of noninvasive detection of oral squamous cell carcinoma by detecting abnormal methylation of a specific tumor-related gene contained in the gargle of a subject. Is reported. However, there has been no report on a method for detecting a precancerous lesion so far.
  • the oral cavity is an organ having an important function, and it is necessary to respond as soon as there is an abnormality.
  • early detection and early treatment are the most reliable and realistic countermeasures. From the viewpoint of better prognosis and functional preservation, it is very important to detect oral precancerous lesions early.
  • the present inventors cannot realize a noninvasive method that enables early detection of precancerous lesions such as leukoplakia that may develop oral cancer by large-scale screening. I examined.
  • the present inventors were able to identify cancer suppressor genes showing specific methylation abnormalities using gargle as a sample, and to establish a highly accurate detection system for oral precancerous lesions using them. .
  • the present invention provides the following. 1.
  • the method according to 1 above comprising comparing the methylation of the detected DNA with the methylation of the DNA in the control sample. 3. 3. The method according to 1 or 2 above, wherein the DNA is one or more kinds of DNA selected from RASSF1, DAPK1, CD44, BRCA2, FHIT, CDKN2A, and HIC1 gene promoter region DNA. 4). 3. The method according to 1 or 2 above, wherein the DNA is one or more kinds of DNA selected from DNAs of promoter regions of RASSF1, DAPK1, CD44, and BRCA2 genes. 5). 3. The method according to 1 or 2 above, wherein the DNA is one or more kinds of DNA selected from DNAs of promoter regions of RASSF1, CD44, BRCA2, DAPK1, and FHIT genes.
  • oral precancerous lesions such as leukoplakia can be detected non-invasively and simply using gargle. Since DNA is more stable than proteins and RNA, it is excellent in storage and transport, and abnormal DNA methylation is observed early in the lesion and before onset. Methylation is also useful as a marker for early detection of oral cancer and assessment of carcinogenic risk.
  • the distribution of abnormal DNA methylation in the promoter region of 15 genes is compared between the healthy group and the leukoplakia group.
  • the vertical axis shows the average percentage of methylation of each group in each gene promoter region.
  • Statistically significant hypermethylation was observed in the leukoplakia group for all genes described.
  • the accuracy of leukoplakiosis detection is shown by the ROC curve. All had AUC> 0.85 and showed a good detection rate.
  • the distribution of abnormal methylation for each of the promoter regions of the seven genes is shown in the leukoplakia group and the healthy group.
  • Each section represents one subject in the leukoplakia group or the healthy group, the white section indicates the absence of abnormal methylation, and the black section indicates the presence of abnormal methylation. It was shown that there was a clear difference between the leukoplakia group and the healthy group.
  • B ROC curve based on the results with RASSF1, FHIT, DAPK1, CD44, and BRCA2 genes. Both results show good detection accuracy.
  • the present invention provides a method for acquiring data for diagnosis of a precancerous oral cavity in a subject by detecting DNA methylation of a specific gene in a gargle collected from the subject.
  • the “gargle” is particularly suitable for non-invasive diagnosis because it contains exfoliated cells of the mucous membrane of the entire oral cavity, ease of collection, ease of processing for detection, and the like.
  • the subject is a human subject, and includes a patient who may have an abnormality in the oral cavity, and a subject who can be a subject of extensive screening such as a medical examination.
  • the “gargle liquid” refers to a liquid sample after the subject has gargled with an appropriate amount of water or an aqueous solution.
  • the aqueous solution is not particularly limited, and examples thereof include physiological saline, distilled water, and general tap water.
  • the method of gargle is not particularly limited, but taking into account the reliable collection of DNA and the burden on the subject, the mouth contains, for example, 10 to 50 mL, preferably about 20 to 30 mL of physiological saline, Gargle for 20 to 90 seconds, preferably 30 to 60 seconds.
  • oral precancerous lesions include, but are not limited to, leukoplakia, erythroderma, lichen planus and the like.
  • the DNA to be detected for methylation suitable for detection of oral precancerous lesions is the following group of genes: RASSF1 (Ras association domain family member 1), DAPK1 (death-associated protein kinase 1), CD44, BRCA2 (breast cancer susceptibility gene 2), FHIT (fragile histidine triad gene), CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), HIC1 (hypermethylated in cancer 1), CASP8 (caspase 8), RAR ⁇ (retinoic acid receptor beta), CDKN2B (cyclin-dependent kinase inhibitor 2B), CHFR (checkpoint with forkhead and ring finger domains, E3 ubiquitin protein ligase), ATM (capillary dilated ataxia-related gene variant: ataxia telangiectasia mutated), CDKN1B (cyclin-dependent kinase inhibitor 1B), BRCA1 (breast
  • Table 1 shows the gene name and symbol, the position on the chromosome, and the NCBI registration number for each of the above genes.
  • the present invention detects the presence or absence of DNA methylation in the promoter region of one or more genes selected from the genes listed in Table 1 above from the subject, thereby diagnosing oral precancerous lesions in the subject For getting data for. If the DNA is methylated, the subject is highly likely to have oral precancerous lesions, and if the DNA is not methylated, the possibility is low.
  • the data used for diagnosis may be data of 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 10 or more, or all genes of the above genes.
  • One embodiment of the present invention comprises detecting methylation in one or more DNAs wherein the DNA is selected from DNA in the promoter region of RASSF1, DAPK1, CD44, BRCA2, FHIT, CDKN2A, and HIC1 gene, It is a method.
  • Another embodiment of the present invention is the above method, wherein the DNA comprises detecting methylation in one or more DNAs selected from DNAs of promoter regions of RASSF1, DAPK1, CD44, and BRCA2 genes.
  • the DNA comprises detecting methylation in one or more DNAs selected from DNA in the promoter region of RASSF1, CD44, BRCA2, DAPK1, and FHIT genes It is.
  • the present invention also provides a method for diagnosing the presence of a pre-oral cancer lesion in a subject or the morbidity of the pre-cancerous lesion in a subject by detecting methylation of DNA of a specific gene in a mouthwash collected from the subject. To do.
  • this method it can be diagnosed whether a subject is suffering from oral precancerous lesions such as leukoplakia, erythema and lichen planus, or whether the risk of suffering is high.
  • the possibility of suffering from oral cancer can be diagnosed by this method.
  • the method comprises The following 15 genes: RASSF1, DAPK1, CD44, BRCA2, FHIT, CDKN2A, HIC1, CASP8, RAR ⁇ , CDKN2B, CHFR, ATM, CDKN1B, BRCA1, and one or more selected from the DNA of the promoter region of CADM1 Detect the presence or absence of methylation in DNA, Comparing detected DNA methylation with DNA methylation in a control sample.
  • One embodiment of the method comprises detecting methylation in one or more DNAs selected from DNA in the promoter region of RASSF1, DAPK1, CD44, BRCA2, FHIT, CDKN2A, and HIC1 genes.
  • Another embodiment of the method includes detecting methylation in one or more DNAs selected from DNA in the promoter region of RASSF1, DAPK1, CD44, and BRCA2 genes.
  • Yet another embodiment of the method comprises detecting methylation in one or more DNAs selected from DNA in the promoter region of RASSF1, CD44, BRCA2, DAPK1, and FHIT genes.
  • DNA sequences such as genes contained in the human genome can be easily obtained by constructing various databases and searching by gene name or registration number (reference number) in the database.
  • the present invention aims to detect methylation in a target DNA sequence, and detects methylation by a method capable of discriminating a sequence having a methylated base from an unmethylated sequence.
  • cytosine is converted to uracil, resulting in a sequence different from the sequence containing methylated cytosine.
  • two sets of primers that can amplify a sequence containing methylated cytosine and a sequence containing unmethylated cytosine, and the presence or absence of amplification or the sequence of DNA amplified by performing a PCR reaction Can be determined.
  • Examples of commercially available kits that can be used in this method include EpiScope MSP Kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the length of the primer is not particularly limited. For example, an amplification product having a length of 80 to 500 bases including a base site that may be methylated by using 20 to 45 lengths is used. You should get it.
  • an MS-MLPA Method of Multiplex Ligation Probe Amplification
  • a PCR product is obtained only when a probe capable of hybridizing to a target region is set and the probe is hybridized.
  • the probe can be designed corresponding to the target base sequence.
  • MRC-Holland includes a probe that can detect abnormal methylation in the promoter regions of 26 types of tumor suppressor genes. This kit uses a 5 'probe and a 3' probe to hybridize to the target sequence and then performs ligation, followed by a PCR reaction using universal primers bound to both sides of the probe. Can be amplified.
  • DNA methylation may occur in the target sequence, for example, an unmethylated hybridization product can be cleaved using the methylation sensitive restriction enzyme simultaneously with the ligation. Thereby, an amplification product is obtained only when methylation occurs.
  • methylation-sensitive restriction enzymes include AccII, HhaI, HapII, HaeIII and the like. These enzymes can be obtained from, for example, Takara Bio Inc.
  • the length of the probe is not particularly limited.
  • a probe having a length of 80 to 500 that can hybridize to a region containing a base site that may be methylated may be used.
  • capillary electrophoresis can be performed to detect the presence or absence of each amplification product.
  • the method of the present invention includes determining the methylation of the specific DNA as an index based on whether or not the DNA is cleaved by a methylation-sensitive restriction enzyme such as HhaI.
  • HhaI is a restriction enzyme derived from Haemophilus haemolyticus (ATCC 10014). When cleaved by HhaI, no methylation occurs in the DNA, and when it is not cleaved by HhaI, It can be determined that methylation has occurred.
  • All of the promoter regions of the genes described in Table 1 above contain a GCGC sequence that is a cleavage site for HhaI, and the probe can be prepared to contain that sequence.
  • the detection of DNA methylation is not limited to the above method, and any means used in the art may be used.
  • the method of the present invention provides data for diagnosing whether or not there is a pre-oral cancer lesion by detecting a methylation abnormality in the DNA of the promoter region of the specific gene described above.
  • “abnormal methylation” or “abnormal methylation” means methylation that is not detected in a normal sample (control sample) derived from a healthy person.
  • the gene In the case of a tumor suppressor gene, the gene must be expressed in a normal state. On the other hand, if suppression of the expression of the tumor suppressor gene by methylation results in carcinogenesis, the cancer suppressor gene of a healthy person It is considered that the promoter site of is not methylated. However, methylation may occur in a normal state, and even a healthy person may have potential methylation that is not associated with a disease. In that case, methylation at that site is not determined to be “abnormal”. Therefore, the methylation of the detected DNA is preferably compared to the DNA methylation in the control sample.
  • the method of the present invention comprises a step of detecting DNA methylation in the promoter region of the above gene in the gargle collected from the subject, and the detected methylation is converted to DNA methylation in the same region in the control sample ( The presence or absence).
  • the presence of oral precancerous lesions is indicated when there is methylation different from the control sample.
  • methylation data in normal samples (control samples) can be acquired in advance, it is not necessary to acquire methylation information in control samples at the same time for diagnosis of oral precancerous lesions in a subject. It will be understood that there is no.
  • the DNA that the present inventors found to be significantly methylated in oral precancerous lesions was identified using gargle fluid obtained from patients with leukoplakia and normal subjects who are typical oral precancerous lesions. .
  • a significant increase in methylation compared to healthy individuals can be confirmed by using statistical techniques commonly used in the art. Examples of such methods include, but are not limited to, t-test, Mann-Whitney U test, creation of ROC curve (Receiver Operatorating Characteristic curve, receiver operating characteristic curve), logistic regression analysis, and the like.
  • the subject is or is affected by a pre-cancerous lesion of the oral cavity when the methylation of the DNA identified above in the mouthwash collected from the subject is significantly elevated compared to the methylation in the control sample This suggests that the risk of
  • “significantly” means that the significance level for rejecting the null hypothesis in each statistical method is 5% or less, preferably 1% or less.
  • the present invention also provides abnormal methylation of DNA selected from DNA in the promoter region of RASSF1, DAPK1, CD44, BRCA2, FHIT, CDKN2A, HIC1, CASP8, RAR ⁇ , CDKN2B, CHFR, ATM, CDKN1B, BRCA1, and CADM1 genes.
  • a kit for the detection of oral precancerous lesions comprising a primer or probe for detecting. Depending on the DNA to be detected, only specific primers or probes in the kit can be used, or a kit containing only such specific primers or probes can be provided.
  • probes having nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 8, 19 and 20, respectively, can be included in the kit. .
  • the kit preferably contains a primer or probe particularly suitable for diagnosis of oral precancerous lesions. Therefore, the kit of the present invention is, for example, a primer or probe for detecting abnormal methylation of one or more kinds of DNA selected from DNA in the promoter region of RASSF1, DAPK1, CD44, BRCA2, FHIT, CDKN2A, and HIC1 gene As long as it contains. In addition, the kit of the present invention only needs to contain a primer or probe for detecting abnormal methylation of one or more types of DNA selected from DNAs in the promoter regions of RASSF1, CD44, and BRCA2 genes.
  • the kit of the present invention includes a primer or a probe for detecting abnormal methylation of one or more types of DNA selected from DNAs of promoter regions of RASSF1, CD44, BRCA2, DAPK1, and FHIT genes. It ’s fine.
  • probes that can be included in the kit of the present invention include one or more probes having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 30.
  • the kit can also contain an aqueous solution for inclusion in the gargle, such as physiological saline, various DNA extraction procedures, hybridization and ligation, various reagents for PCR reactions, restriction enzymes, and the like as appropriate.
  • an aqueous solution for inclusion in the gargle such as physiological saline, various DNA extraction procedures, hybridization and ligation, various reagents for PCR reactions, restriction enzymes, and the like as appropriate.
  • the subjects were allowed to rinse with 20 ml of physiological saline for 30 seconds, and the entire amount of the gargle was collected. Centrifuge 5 ml of the obtained sample at 2,000 rpm for 5 minutes (KUBOTA6800 (manufactured by Kubota Corporation)), wash with physiological saline, and then centrifuge again at 2,000 rpm for 5 minutes to make a pellet twice. Stored at -80 ° C until use.
  • MS-PLPA was performed by a conventional method using an MS-MLPA kit (MRC-Holland).
  • MS-MLPA kit MRC-Holland
  • probes corresponding to 26 genes having HhaI cleavage sites in ME001-C1CTumor suppressor-1 included in the kit were used. Two kinds of probes are used for one kind of gene, and these probes have one or two HhaI cleavage sites in either or both of them.
  • HhaI Promega
  • PCR is performed, fragment analysis is performed using 3130 Genetic Genetic Analyzer (ABI), peak area using Gene Mapper (v4.1, ABI) After calculating, statistical processing was performed.
  • Table 2 shows the symbols of 15 genes that were found to have increased abnormal methylation of the promoter region in the leukoplakia group as compared with the healthy group, and the sequence numbers of the probes used for detection.
  • the distribution of abnormal DNA methylation in the promoter region of these genes is shown in FIG. 1 as a boxplot by comparing the healthy group with the leukoplakia group.
  • ROC DNA methylation in the promoter region of 7 genes (RASSF1, DAPK1, CD44, BRCA2, FHIT, CDKN2A, and HIC1) that have a result of AUC> 0.8 among the genes shown in Table 3
  • the curve is shown in FIG.
  • the promoter regions of these genes were found to be more useful marker candidates for the detection of leukoplakia.
  • RASSF1, CD44, and BRCA2 which show sensitivity and specificity of 80% or more alone, have the same level of sensitivity in any combination of the two, but the sensitivity is comparable. Or the tendency to decline was seen. This also applies to the combination of the three genes. If analysis is performed using the cut-off value set above, there may be a false negative by making a determination based on the combination of genes, which necessarily improves accuracy. It became clear that it was not connected.
  • fm 0.6615648xRASSF1 + 0.2922162xFHIT + 0.1885340xDAPK1 + 0.5206504xCD44 + 0.5737340xBRCA2
  • Figure 4 shows the results. More specifically, there was only one case of discrepancy between the leukoplakia group and the healthy group, and the sensitivity was 98.2%, and the specificity was 94.7%.
  • gargle Since gargle is non-invasive, inexpensive and easy to collect, it is an ideal sample for testing and can also be included in general health checkup evaluation items.
  • DNA methylation abnormalities are seen early in the lesion and before onset, it is possible to detect oral cancer early and evaluate the risk of carcinogenesis. Can contribute to preventive medicine.

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Abstract

口腔癌を発症する可能性のある前癌病変を大規模なスクリーニングで早期発見することを可能とする非侵襲的な方法を提供する。　被験者から採取したうがい液中のDNAのメチル化を検出することによって被験者における口腔前癌病変の診断のためのデータを取得する方法であって、DNAが以下の群の遺伝子：RASSF1、DAPK1、CD44、BRCA2、FHIT、CDKN2A、HIC1、CASP8、RARβ、CDKN2B、CHFR、ATM、CDKN1B、BRCA1、及びCADM1から選択される1種以上のDNAのプロモーター領域のDNAであることを特徴とする、上記方法を提供する。

Description

口腔前癌病変の検出方法
　本発明は、口腔前癌病変の検出方法に関し、より具体的には、含嗽液（うがい液）中に含まれるDNAの解析によって口腔前癌病変を非侵襲的に検出する方法に関する。
　口腔は、人間の生存及び生活に欠かせない咀嚼・嚥下・構音といった重要な機能を有する器官であるにもかかわらず、一般には口腔癌に対する認識は低く、初期では自覚症状が乏しいこと、また類似した臨床症状を呈する粘膜疾患も多いこと等から、口腔癌の早期発見は満足できる状況ではない。口腔癌の5年生存率は65％程度である。
　口腔癌では、大腸癌のための便潜血検査や胃癌のためのX線検査、乳癌のためのマンモグラフィー検査等のような、非侵襲的な検診方法は確立されていない。口腔前癌病変の発見も含む口腔癌検診のためには専門医による診察が必要であり、現時点において、大規模の検診は事実上不可能である。また、トルイジンブルー等の色素を用いた染色によるスクリーニング検査も知られているが、診断精度は必ずしも満足できるものではない。
　一方、白板症は、頬粘膜、舌、歯肉等に見られる白い角化性の比較的頻度の高い口腔癌の前癌病変である。白板症の発症原因としては、喫煙やアルコールによる刺激、義歯等による機械的刺激、ビタミン不足等が知られているが、原因不明の症例も多い。また、病変部が隆起する場合や痛みを伴う場合もあるが、隆起せず、痛みもない場合には発症しても気づかないことが多い。しかしながら、特に舌にできた場合には悪性化する可能性が高く、前癌病変の代表的なものとされている。白板症の治療としては、切除が最も確実なものであるが、病変が広範囲である場合には切除によって機能障害が生じる等の理由から、病変を早期に発見し、経過を観察しながら治療法を決定することが適切と考えられている。
　口腔癌の検出のための方法として、唾液中の口腔疾患代謝産物あるいはトランスクリプトームパターンを検出する方法が提案されている（特許文献１及び２）。
　また、DNAのメチル化、具体的には例えばシトシンのピリミジン環の5位炭素原子へのメチル基の付加反応がエピジェネティクスに関与しており、発癌にも関わっていることが報告されてきている。本発明者等は先に、口腔癌に特異的な異常メチル化を示す遺伝子群を見出し、報告している（非特許文献１及び２）。非特許文献１及び２に記載の方法は、被験者のうがい液中に含まれる特定の腫瘍関連遺伝子の異常メチル化を検出することで、口腔扁平上皮癌の非侵襲的な検出が可能であることを報告したものである。
　しかしながら、これまでに前癌病変の検出方法についての報告はなされていない。
特開2011-229532号公報 特表2013-505428号公報
J. Oral. Maxillofac Surg., Vol.70, Issue 6, p.1486-1494, August 6, 2011 Cancer, September 1, 2012, DOI: 10.1002/cncr.27417
　上記の通り、口腔は重要な機能を有する器官であり、異変があった場合には早急に対応することが必要である。また、口腔癌患者の生存率を劇的に向上させる治療法が見出されていない現状では、早期発見及び早期治療が最も確実かつ現実的な対処法である。より良好な予後及び機能の温存の観点から、口腔前癌病変を早期に発見することが非常に重要である。
　上記の課題に鑑み、本発明者等は、口腔癌を発症する可能性のある白板症等の前癌病変を大規模なスクリーニングで早期発見することを可能とする非侵襲的な方法が実現できないかと検討した。
　その結果、本発明者等は、うがい液を試料として特異的なメチル化異常を示す癌抑制遺伝子を同定し、それらを用いた高精度の口腔前癌病変の検出システムを確立することができた。
　すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．被験者から採取したうがい液中のDNAのメチル化を検出することによって被験者における口腔前癌病変の診断のためのデータを取得する方法であって、DNAが以下の群の遺伝子：
　　RASSF1（Ras関連ドメインファミリーメンバー1：Ras association domain family member 1、NM_170714.1）、
　　DAPK1（細胞死関連タンパク質キナーゼ1：death-associated protein kinase 1、NM_004938.2）、
　　CD44（NM_001001391.1）、
　　BRCA2（乳癌感受性遺伝子2：breast cancer susceptibility gene 2、NM_000059.3）、
　　FHIT（脆弱ヒスチジン三連残基遺伝子：fragile histidine triad gene、NM_002012.2）、
　　CDKN2A（サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A：cyclin-dependent kinase inhibitor 2A、NM_058195.3）、
　　HIC1（hypermethylated in cancer 1、NM_006497.3）、
　　CASP8（カスパーゼ8：caspase 8、NM_001080125）、
　　RARβ（レチノイン酸受容体β：retinoic acid receptor beta、NM_000965.3）、
　　CDKN2B（サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2B：cyclin-dependent kinase inhibitor 2B、NM_078487.2）、
　　CHFR（有糸分裂チェックポイント遺伝子：checkpoint with forkhead and ring finger domains, E3 ubiquitin protein ligase、NM_001161344.1）、
　　ATM（毛細血管拡張性運動失調症関連遺伝子変異型：ataxia telangiectasia mutated、NM_000051.3）、
　　CDKN1B（サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１B：cyclin-dependent kinase inhibitor 1B、NM_004064.3）、
　　BRCA1（乳癌感受性遺伝子1：breast cancer susceptibility gene 1、NM_007294.3）、及び
　　CADM1（細胞接着分子1：cell adhesion molecule 1、NM_001098517.1）
から選択される1種以上の遺伝子のプロモーター領域のDNAであることを特徴とする、上記方法。
２．検出されたDNAのメチル化を、対照サンプルにおけるDNAのメチル化と比較することを含む、上記１記載の方法。
３．DNAがRASSF1、DAPK1、CD44、BRCA2、FHIT、CDKN2A、及びHIC1遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAである、上記１又は２記載の方法。
４．DNAがRASSF1、DAPK1、CD44、及びBRCA2遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAである、上記１又は２記載の方法。
５．DNAがRASSF1、CD44、BRCA2、DAPK1、及びFHIT遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAである、上記１又は２記載の方法。
６．DNAのメチル化が、配列番号１～３０に示されるヌクレオチド配列を有するプローブを用いて検出可能なものである、上記１～５のいずれか記載の方法。
７．口腔前癌病変が白板症である、上記１～６のいずれか記載の方法。
８．RASSF1、DAPK1、CD44、BRCA2、FHIT、CDKN2A、HIC1、CASP8、RARβ、CDKN2B、CHFR、ATM、CDKN1B、BRCA1、及びCADM1遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択されるDNAの異常メチル化を検出するためのプライマー又はプローブを含む、口腔前癌病変の検出のためのキット。
９．配列番号１～３０に示されるヌクレオチド配列を有する１以上のプローブを含む、上記８記載のキット。
１０．口腔前癌病変が白板症である、上記８又は９記載のキット。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-172327号の開示内容を包含する。
　本発明により、白板症等の口腔前癌病変を、うがい液を用い、非侵襲的かつ簡便に検出することができる。DNAはタンパク質及びRNAと比較して安定であることから保存や輸送に優れ、また、DNAメチル化の異常は病変の早期や発症前から見られることから、本発明者等が見出したDNAの異常メチル化は、口腔癌の早期検出及び発癌リスクの評価のためのマーカーとしても有用である。
15種の遺伝子のプロモーター領域におけるDNA異常メチル化の分布を健常群と白板症群とで比較して示す。縦軸は各遺伝子プロモーター領域における各群のメチル化の平均パーセンテージを示す。記載の全ての遺伝子において、白板症群に統計学的に有意な高メチル化がみられた。 表２に示す遺伝子群のうちAUC値が特に高かった7種の遺伝子のプロモーター領域のDNAのメチル化について、白板症検出の精度をROC曲線にて示す。全てAUC>0.85であり、良好な検出率を示した。 7種の遺伝子のプロモーター領域のそれぞれについての異常メチル化の分布状況を白板症群及び健常群で示す。それぞれの区画が白板症群又は健常群での一被験者を示し、白い区画は異常メチル化の不存在を、黒い区画は異常メチル化の存在を示す。白板症群と健常者群の間には明らかな差異が存在することが示された。 Ａ：RASSF1、FHIT、DAPK1、CD44、BRCA2遺伝子のプロモーター領域のメチル化についてのロジスティック分析の結果を示す。Ｂ：RASSF1、FHIT、DAPK1、CD44、BRCA2遺伝子での結果に基づくROC曲線を示す。いずれの結果も良好な検出精度を示している。
　本発明は、被験者から採取したうがい液中の特定遺伝子のDNAのメチル化を検出することによって、被験者における口腔前癌病変の診断のためのデータを取得する方法を提供する。「うがい液」は、口腔全体の粘膜の剥離細胞が含まれること、採取の容易さ、検出のための処理の簡便さ等から、非侵襲的な診断のために特に好適である。本発明において、被験者は、ヒト被験者であり、口腔内に異常を有する可能性のある患者、及び健康診断等の広範なスクリーニングの対象となり得る被験者を含む。
　本明細書において、「うがい液」とは、被験者が適量の水又は水性溶液による含嗽（うがい）をしたのちの液体サンプルをいう。水性溶液としては、特に限定するものではないが、例えば生理食塩水、蒸留水、あるいは一般的な水道水等が挙げられる。
　含嗽の方法は、特に限定するものではないが、DNAの確実な採取、及び被験者の負担等を考慮すれば、例えば10～50mL、好ましくは20～30mL程度の生理食塩水等を口に含み、20～90秒間、好ましくは30～60秒間のうがいとするのが良い。
　本明細書において、「口腔前癌病変」としては、限定するものではないが、白板症、紅板症、扁平苔癬等が挙げられる。
　本発明の方法において、口腔前癌病変の検出のために好適であるメチル化検出対象のDNAは、以下の群の遺伝子：
　　RASSF1（Ras関連ドメインファミリーメンバー1：Ras association domain family member 1）、
　　DAPK1（細胞死関連タンパク質キナーゼ1：death-associated protein kinase 1）、
　　CD44、
　　BRCA2（乳癌感受性遺伝子2：breast cancer susceptibility gene 2）、
　　FHIT（脆弱ヒスチジン三連残基遺伝子：fragile histidine triad gene）、
　　CDKN2A（サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A：cyclin-dependent kinase inhibitor 2A）、
　　HIC1（hypermethylated in cancer 1）、
　　CASP8（カスパーゼ8：caspase 8）、
　　RARβ（レチノイン酸受容体β：retinoic acid receptor beta）、
　　CDKN2B（サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2B：cyclin-dependent kinase inhibitor 2B）、
　　CHFR（有糸分裂チェックポイント遺伝子：checkpoint with forkhead and ring finger domains, E3 ubiquitin protein ligase）、
　　ATM（毛細血管拡張性運動失調症関連遺伝子変異型：ataxia telangiectasia mutated）、
　　CDKN1B（サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１B：cyclin-dependent kinase inhibitor 1B）、
　　BRCA1（乳癌感受性遺伝子1：breast cancer susceptibility gene 1）、及び
　　CADM1（細胞接着分子1：cell adhesion molecule 1）
のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAである。
　表１に、上記の遺伝子のそれぞれについて、遺伝子名及びシンボル、染色体上の位置、及びNCBI登録番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明は、被験者由来の上記の表１に記載された遺伝子から選択される１種以上の遺伝子のプロモーター領域のDNAのメチル化の有無を検出し、それによって、被験者における口腔前癌病変の診断のためのデータを取得するものである。上記DNAがメチル化されている場合、その被験者は口腔前癌病変を有している可能性が高く、メチル化されていない場合にはその可能性は低いと判定することができる。診断のために利用されるデータは、上記の遺伝子の2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、10種以上、あるいは全部の遺伝子のデータであって良い。
　本発明の一実施形態は、DNAがRASSF1、DAPK1、CD44、BRCA2、FHIT、CDKN2A、及びHIC1遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAにおけるメチル化を検出することを含む、上記の方法である。
　本発明の別の実施形態は、DNAがRASSF1、DAPK1、CD44、及びBRCA2遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAにおけるメチル化を検出することを含む、上記の方法である。
　本発明の更に別の実施形態は、DNAがRASSF1、CD44、BRCA2、DAPK1、及びFHIT遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAにおけるメチル化を検出することを含む、上記の方法である。
　本発明はまた、被験者から採取したうがい液中の特定遺伝子のDNAのメチル化を検出することによって、被験者における口腔前癌病変の存在又は口腔前癌病変への罹患可能性を診断する方法を提供する。本方法によって、被験者が白板症、紅板症、扁平苔癬等の口腔前癌病変に罹患しているか、または罹患するリスクが高いか否かを診断することができる。また、本方法によって、口腔癌への罹患可能性を診断することができる。
　より具体的には、本方法は、
　　以下の15種の遺伝子：RASSF1、DAPK1、CD44、BRCA2、FHIT、CDKN2A、HIC1、CASP8、RARβ、CDKN2B、CHFR、ATM、CDKN1B、BRCA1、及びCADM1のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAにおけるメチル化の有無を検出し、
　　検出されたDNAのメチル化を、対照サンプルにおけるDNAのメチル化と比較する
ことを含む。
　本方法の一実施形態は、RASSF1、DAPK1、CD44、BRCA2、FHIT、CDKN2A、及びHIC1遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAにおけるメチル化を検出することを含む。
　本方法の別の実施形態は、RASSF1、DAPK1、CD44、及びBRCA2遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAにおけるメチル化を検出することを含む。
　本方法の更に別の実施形態は、RASSF1、CD44、BRCA2、DAPK1、及びFHIT遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAにおけるメチル化を検出することを含む。
　ヒトゲノムに含まれる遺伝子等のDNA配列は、現在では種々のデータベースの構築により、遺伝子名又はデータベースにおける登録番号（参照番号）等によって検索することで、容易に入手できるようになっている。本発明は、目的のDNA配列中におけるメチル化の検出を目的とするものであり、メチル化した塩基を有する配列とメチル化していない配列とを識別できる方法によってメチル化を検出する。
　例えば、サンプルを予めバイサルファイトで処理することで、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換され、メチル化されているシトシンを含む配列と異なる配列を生じる。これを利用して、メチル化シトシンを含む配列と非メチル化シトシンを含む配列とをそれぞれ増幅可能な2セットのプライマーを設計し、PCR反応を行うことで増幅の有無又は増幅されるDNAの配列を決定することができる。この方法に使用できる市販のキットとして、例えばEpiScope MSP Kit（タカラバイオ株式会社製）が挙げられる。プライマーの長さは、特に限定するものではないが、例えば20～45個の長さのものを使用して、メチル化する可能性のある塩基部位を含む80～500個の塩基長の増幅産物を得るようにすれば良い。
　あるいはまた、標的の領域にハイブリダイズ可能なプローブを設定し、プローブがハイブリダイズした場合にのみPCR産物が得られるMS-MLPA（Methylation Specific-Multiplex Ligation Probe Amplification）法を用いることもできる。プローブは、標的の塩基配列に対応して設計することができる。例えば、市販されているMS-MLPAキット（MRC-Holland社）には、26種の癌抑制遺伝子のプロモーター領域における異常メチル化を検出することが可能なプローブが含まれている。このキットでは、5'側プローブと3'側プローブを使用して標的の配列にハイブリダイズさせた後でライゲーションを行い、その後、プローブの両側に結合させたユニバーサルプライマーを用いてPCR反応を行って増幅することができる。標的配列中にはDNAのメチル化が生じている可能性があるため、上記のライゲーションと同時にメチル化感受性制限酵素を用いて、例えばメチル化していないハイブリダイゼーション産物を切断することができる。これにより、メチル化が生じた場合にのみ増幅産物が得られることとなる。メチル化感受性制限酵素としては種々の酵素が知られており、例えばAccII、HhaI、HapII、HaeIII等を挙げることができる。これらの酵素は、例えばタカラバイオ株式会社等から入手することができる。
　プローブの長さは、特に限定するものではないが、例えばメチル化する可能性のある塩基部位を含む領域にハイブリダイズし得る80～500個の長さのものを使用するようにすれば良い。
　本発明の方法において好適に使用することができるプローブとして、限定するものではないが、例えば配列番号１～３０に示されるヌクレオチド配列を有するプローブを挙げることができる。従って、一実施形態において、本発明の方法は、DNAのメチル化を、配列番号１～３０に示されるヌクレオチド配列を有するプローブを用いて検出することを含む。
　PCR反応の後、例えばキャピラリー電気泳動を行って、各増幅産物の有無を検出することができる。
　従って、特に限定するものではないが、本発明の方法は、上記の特定のDNAのメチル化を、メチル化感受性制限酵素、例えばHhaIによる該DNAの切断の有無を指標として決定することを含む。HhaIは、ヘモフィラス・ヘモリティカス（Haemophilus haemolyticus）(ATCC 10014)由来の制限酵素であり、HhaIによって切断された場合にはそのDNAにおいてメチル化が生じておらず、HhaIによって切断されない場合にはそのDNAにおいてメチル化が生じているものと判定することができる。尚、上記の表１に記載した遺伝子のプロモーター領域にはいずれもHhaIの切断部位であるGCGC配列が含まれており、プローブはその配列を含むように作製することができる。
　尚、DNAのメチル化の検出は、上記の方法に限定されるものではなく、当分野で用いられているいずれの手段を用いて行っても良い。
　本発明の方法は、上記の特定の遺伝子のプロモーター領域のDNAにおけるメチル化の異常を検出し、それによって口腔前癌病変を有するか否かを診断するためのデータを提供するものである。本明細書において、「メチル化の異常」又は「異常メチル化」とは、健常者由来の正常サンプル（対照サンプル）では検出されないメチル化を意味するものとする。
　癌抑制遺伝子の場合、正常な状態では遺伝子が発現していなければならず、一方メチル化によって癌抑制遺伝子の発現に抑制がかかると、結果として発癌してしまうことから、健常者の癌抑制遺伝子のプロモーター部位はメチル化していないと考えられる。しかしながら、正常な状態でメチル化が生じている場合があり得、更に健常者であっても疾患とは関連しない潜在的なメチル化が生じている場合があり得る。その場合、その部位のメチル化は「異常」とは判定されない。従って、検出されたDNAのメチル化は、対照サンプルにおけるDNAのメチル化と比較することが好ましい。
　従って、本発明の方法は、被験者から採取したうがい液中の上記遺伝子のプロモーター領域のDNAのメチル化を検出するステップと、検出されたメチル化を、対照サンプルにおける同じ領域のDNAのメチル化（の有無）と比較するステップを含み得る。対照サンプルと異なるメチル化が存在する場合に、口腔前癌病変が存在する可能性が示される。しかしながら、正常サンプル（対照サンプル）におけるメチル化のデータは予め取得することが可能であるため、ある被験者における口腔前癌病変の診断のために、対照サンプルにおけるメチル化の情報を同時に取得する必要はないことは理解されるであろう。
　本発明者等が口腔前癌病変において有意にメチル化されていることを見出したDNAは、代表的な口腔前癌病変である白板症患者及び健常者から取得したうがい液を用いて特定された。健常者と比較した有意なメチル化の上昇は、当分野で通常行われる統計的な手法を使用することで確認することができる。そのような手法としては、限定するものではないが、例えばt検定、Mann-Whitney U検定、ROC曲線（Receiver Operatorating Characteristic curve、受信者動作特性曲線）の作成、ロジスティック回帰分析等が挙げられる。
　被験者から採取したうがい液中の上記で特定したDNAのメチル化が、対照サンプルにおけるメチル化と比較して有意に上昇している場合に、被験者が口腔前癌病変に罹患しているか、または罹患するリスクが高いことが示唆される。ここで、「有意に」上昇しているとは、各統計手法において帰無仮説を棄却する有意水準が５％以下、好ましくは１％以下のものを言う。
　本発明はまた、RASSF1、DAPK1、CD44、BRCA2、FHIT、CDKN2A、HIC1、CASP8、RARβ、CDKN2B、CHFR、ATM、CDKN1B、BRCA1、及びCADM1遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択されるDNAの異常メチル化を検出するためのプライマー又はプローブを含む、口腔前癌病変の検出のためのキットを提供する。検出対象のDNAに応じて、キット中の特定のプライマー又はプローブのみを使用することができ、また、そうした特定のプライマー又はプローブのみを含むキットを提供することもできる。
　例えば、RASSF1、DAPK1、CD44、及びBRCA2遺伝子のプライマー領域のDNAのメチル化の検出のためには、配列番号３～８、１９及び２０に示すヌクレオチド配列をそれぞれ有するプローブをキットに含めることができる。
　キットは、口腔前癌病変の診断のために特に適したプライマー又はプローブを含めることが好ましい。従って、本発明のキットは、例えばRASSF1、DAPK1、CD44、BRCA2、FHIT、CDKN2A、及びHIC1遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAの異常メチル化を検出するためのプライマー又はプローブを含むものであれば良い。また、本発明のキットは、RASSF1、CD44、及びBRCA2遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAの異常メチル化を検出するためのプライマー又はプローブを含むものであれば良い。更に、本発明のキットは、RASSF1、CD44、BRCA2、DAPK1、及びFHIT遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAの異常メチル化を検出するためのプライマー又はプローブを含むものであれば良い。
　本発明のキットに含めることができるプローブとしては、例えば配列番号１～３０に示されるヌクレオチド配列を有する１以上のプローブが挙げられる。
　キットにはまた、うがい液に含めるための水性溶液、例えば生理食塩水、DNAの抽出操作、ハイブリダイゼーション及びライゲーション、PCR反応等のための各種試薬、制限酵素等を適宜含めることができる。
　臨床的に白板症が疑われ、組織学的な確定診断が得られた白板症症例患者（ｎ＝19）及び対照群として口腔内診査で異常のみられなかった健常者55名を被験者とした。
　被験者に生理食塩水20mlで30秒間含嗽させ、うがい液を全量採取した。得られたサンプル5mlを2,000rpmで5分間遠心分離し（KUBOTA6800(久保田商事株式会社製)）、生理食塩水で洗浄した後、再度2,000rpmで5分間遠心分離する操作を2回繰り返してペレットとし、使用まで-80℃に保存した。
　DNeasy Blood and Tissue Kits（Qiagen, Valencia, CA）でDNAを抽出後、MS-MLPAキット（MRC-Holland社）を用いて常法によりMS-PLPAを行った。プローブセットとしては、キットに含まれるME001-C1 Tumor suppressor-1のうち、HhaI切断部位を有する26種の遺伝子に対応するプローブを用いた。1種の遺伝子に対してそれぞれ2種のプローブを用い、これらのプローブはそのいずれかあるいは双方にHhaIの切断部位を1個又は2個有している。ハイブリダイゼーション及びライゲーションと共にHhaI（Promega社製）による切断を行った後にPCRを行い、3130 Genetic Analyser（ABI社）を用いてフラグメント解析し、Gene Mapper（v4.1、ABI社）を用いてピーク面積を算出後、統計処理を行った。
［DNA異常メチル化の分布及び白板症群と健常群との比較］
　MS-MLPAキットに含まれる26種の癌抑制遺伝子のメチル化状態を検討した。定量化された各遺伝子のメチル化レベルをt検定又はMann-Whitney U検定で比較検討した。
　表２に、健常群と比較して白板症群でプロモーター領域の異常メチル化が上昇していることが見出された15種の遺伝子のシンボル及び検出に用いたプローブの配列番号を示す。また、これらの遺伝子のプロモーター領域におけるDNA異常メチル化の分布を健常群と白板症群とで比較して箱ひげ図として図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［ROC解析］
　表１及び図１に示す15種の遺伝子についての結果に基づいて、P≧0.01の結果となった遺伝子は対象から除外し、P＜0.01の結果となった各遺伝子のプロモーター領域のメチル化について、白板症の検出をエンドポイントとしてROC曲線を作成し、曲線下面積（Area Under the Curve、AUC）値（％）を求めた。また、ROC曲線により得られた感度及び特異度から、診断法として用いる際のカットオフ値を設定した。表３は、15種の遺伝子について、これらの数値をAUC値の高い順に示したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示した遺伝子の中でAUC値＞0.8の結果が得られた7種の遺伝子（RASSF1、DAPK1、CD44、BRCA2、FHIT、CDKN2A、及びHIC1）のプロモーター領域のDNAのメチル化についてのROC曲線を図２に示す。図２から明らかなように、これらの遺伝子のプロモーター領域が白板症の検出のためにより有用なマーカー候補であることが判明した。
［白板症検出精度の検討］
　ROC解析で良好なAUC値を示した7種の遺伝子のプロモーター領域の異常メチル化の結果に基づいて、白板症検出の正準判別解析を行った。結果を図３に示す。この結果から明らかな通り、7種の遺伝子のプロモーター領域のDNAはいずれも白板症群と健常群とで異常メチル化の傾向が明確に異なっていた。
　また、白板症の検出に対する指標としてのこれらのDNAの有用性をフィッシャー検定、感度及び特異度を用いて検討した。各遺伝子についてのプロモーター領域のメチル化の有無を表４にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４の結果から明らかな通り、いずれの遺伝子のプロモーター領域のDNAも、健常群と白板症群とを単独で有意に識別し得ることが確認された。その中でも、感度及び特異度を考慮すると、いずれも80％以上であるRASSF1、CD44及びBRCA2の3種の遺伝子が特に有用であることが明らかとなった。
［複数の遺伝子の組み合わせに基づく診断法の検討］
　単独で良好な検出感度及び検出特異度を示したRASSF1、CD44及びBRCA2の3種の遺伝子の結果を用い、それらの遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化の検出を組み合わせた診断法の確立が可能か否かを検討した。表５に示す通り、健常群では異常メチル化がほとんど検出されないのに対して、白板症群では複数の遺伝子で異常メチル化が生じている場合が多いことが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　一方、表５の結果に示す通り、単独で80％以上の感度及び特異度を示すRASSF1、CD44及びBRCA2は、いずれの2種の組み合わせにおいても、特異度は上昇するものの、感度は同程度か又は低下する傾向が見られた。これは3種の遺伝子の組み合わせにおいても同様であり、上記で設定したカットオフ値を用いて解析した場合、遺伝子の組み合わせによる判定を行うことで偽陰性となる場合があり、必ずしも精度の向上にはつながらないことが明らかとなった。
［5種の遺伝子による組合せに基づく診断法の確立］
　RASSF1、CD44及びBRCA2に加えて単独での検出精度が高かったDAPK1及びFHITを用い、これら5種の遺伝子のプロモーター領域のメチル化を指標として用いる白板症検出の正準判別解析を行った。
　RASSF1、FHIT、DAPK1、CD44、BRCA2を用いたロジスティック分析を行い、下記の式：
fm=0.6615648xRASSF1+0.2922162xFHIT+0.1885340xDAPK1+0.5206504xCD44+0.5737340xBRCA2
を得ることができた。これを用いて判別すると、5種の遺伝子のプロモーター領域のメチル化を統合した評価（Fm）：
Fm = -0.02176+0.20975x(0.6615648xRASSF1+0.2922162xFHIT+0.1885340xDAPK1+0.5206504xCD44+0.5737340xBRCA2)
は、白板症群と健常群で大きく異なっていた。
　図４に結果を示す。より詳細には、白板症群及び健常群でそれぞれ不一致は1例のみであり、感度は98.2%、特異度は94.7%と非常に高い検出精度を得ることができた。
　うがい液は非侵襲的で安価かつ簡便に採取できることから、検査のための理想的な試料であり、一般的な健康診断の評価項目に含めることもできる。また、DNAメチル化の異常は病変の早期や発症前から見られることから、口腔癌の早期検出及び発癌リスクの評価が可能となり、被験者自身が発癌リスクを認識することで、生活習慣の改善や予防医療に貢献することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (10)

  1. 　被験者から採取したうがい液中のDNAのメチル化を検出することによって被験者における口腔前癌病変の診断のためのデータを取得する方法であって、DNAが以下の群の遺伝子：
    　　RASSF1（Ras関連ドメインファミリーメンバー1：Ras association domain family member 1、NM_170714.1）、
    　　DAPK1（細胞死関連タンパク質キナーゼ1：death-associated protein kinase 1、NM_004938.2）、
    　　CD44（NM_001001391.1）、
    　　BRCA2（乳癌感受性遺伝子2：breast cancer susceptibility gene 2、NM_000059.3）、
    　　FHIT（脆弱ヒスチジン三連残基遺伝子：fragile histidine triad gene、NM_002012.2）、
    　　CDKN2A（サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A：cyclin-dependent kinase inhibitor 2A、NM_058195.3）、
    　　HIC1（hypermethylated in cancer 1、NM_006497.3）、
    　　CASP8（カスパーゼ8：caspase 8、NM_001080125）、
    　　RARβ（レチノイン酸受容体β：retinoic acid receptor beta、NM_000965.3）、
    　　CDKN2B（サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2B：cyclin-dependent kinase inhibitor 2B、NM_078487.2）、
    　　CHFR（有糸分裂チェックポイント遺伝子：checkpoint with forkhead and ring finger domains, E3 ubiquitin protein ligase、NM_001161344.1）、
    　　ATM（毛細血管拡張性運動失調症関連遺伝子変異型：ataxia telangiectasia mutated、NM_000051.3）、
    　　CDKN1B（サイクリン依存性キナーゼ阻害因子１B：cyclin-dependent kinase inhibitor 1B、NM_004064.3）、
    　　BRCA1（乳癌感受性遺伝子1：breast cancer susceptibility gene 1、NM_007294.3）、及び
    　　CADM1（細胞接着分子1：cell adhesion molecule 1、NM_001098517.1）
    から選択される1種以上の遺伝子のプロモーター領域のDNAであることを特徴とする、上記方法。
  2. 　検出されたDNAのメチル化を、対照サンプルにおけるDNAのメチル化と比較することを含む、請求項１記載の方法。
  3. 　DNAがRASSF1、DAPK1、CD44、BRCA2、FHIT、CDKN2A、及びHIC1遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAである、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　DNAがRASSF1、DAPK1、CD44、及びBRCA2遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAである、請求項１又は２記載の方法。
  5. 　DNAがRASSF1、CD44、BRCA2、DAPK1、及びFHIT遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択される1種以上のDNAである、請求項１又は２記載の方法。
  6. 　DNAのメチル化が、配列番号１～３０に示されるヌクレオチド配列を有するプローブを用いて検出可能なものである、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　口腔前癌病変が白板症である、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　RASSF1、DAPK1、CD44、BRCA2、FHIT、CDKN2A、HIC1、CASP8、RARβ、CDKN2B、CHFR、ATM、CDKN1B、BRCA1、及びCADM1遺伝子のプロモーター領域のDNAから選択されるDNAの異常メチル化を検出するためのプライマー又はプローブを含む、口腔前癌病変の検出のためのキット。
  9. 　配列番号１～３０に示されるヌクレオチド配列を有する１以上のプローブを含む、請求項８記載のキット。
  10. 　口腔前癌病変が白板症である、請求項８又は９記載のキット。
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