CN102191312A

CN102191312A - 抑癌基因启动子甲基化检测在口腔白斑癌变评估中的应用

Info

Publication number: CN102191312A
Application number: CN2010101257819A
Authority: CN
Inventors: 蒋伟文; 柳杨
Original assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2010-03-16
Filing date: 2010-03-16
Publication date: 2011-09-21

Abstract

本发明公开了一种抑癌基因启动子甲基化检测在口腔白斑癌变评估中的应用，在DNA水平上通过定量检测抑癌基因启动子甲基化在口腔白斑组织中的表达，评估口腔白斑癌变的风险。若RASSF1A和MGMT基因中的一种或两种的启动子区域甲基化表达阳性，则预测口腔白斑癌变风险高，若RASSF1A和MGMT两种基因的启动子区域甲基化表达阴性，则预测口腔白斑癌变风险低。本发明公开的技术方案可以辅助医生做出判断，使临床医生根据口腔白斑患者的甲基化水平更好的评估白斑患者的癌变风险，及时制定出合适的治疗方案，提高患者的生活质量。

Description

抑癌基因启动子甲基化检测在口腔白斑癌变评估中的应用

【技术领域】

本发明涉及表观遗传学领域，更具体地讲，涉及抑癌基因启动子甲基化检测在口腔白斑癌变评估中的应用。

【背景技术】

目前医学上对口腔白斑的癌变风险判断主要是依靠活体组织学检查，病理科医生按照WHO肿瘤国际性组织学分类标准对组织切片中上皮细胞的增生程度做出判断。通常将上皮异常增生分为轻、中、重度三级。口腔白斑伴有上皮异常增生时，其恶变潜能随上皮异常增生程度的增加而增大。临床医生依照是否存在异常增生及异常增生的程度对口腔白斑癌变风险进行评估，进行积极地相关治疗，定期随访，从而起到癌症早期预防的作用。

由于组织病理学检查是显微镜下根据上皮细胞形态及排列对上皮增生程度做出判断，带有主观性，存在一定的差异。这种差异不仅表现在不同病理科医生对同张切片的判断，也表现在同一个病理科医生对同一张切片不同时期做出的诊断。因此，要做出相对准确的判断，对病理切片质量及病理科医生提出很高的要求。另外，切取活检的部分组织是否能完全代表口腔白斑病变全貌，也是大家争议的问题。同时临床上存在一部分白斑癌变的病人，其癌变前白斑病变组织切片并不存在上皮异常增生的改变，这种现象对目前预测白斑癌变的金标准提出了挑战。

抑癌基因启动子甲基化使抑癌基因失活，从而导致肿瘤的发生，DNA甲基化与癌症的发生密切相关。正常组织中，在基因启动子区域的CpG岛常处于非甲基化状态。癌症发生时，抑癌基因启动子区CpG岛甲基化异常升高，抑癌基因功能丧失，这一现象在多种癌症及多个抑癌基因均存在。Hannah LuiPark等研究DCC基因甲基化在12种食管癌细胞系表达，10种细胞系DCC基因启动子甲基化高表达。当用DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine处理时，DCC基因重表达。DNA甲基化是除基因突变和杂合性缺失引起抑癌基因失活外的另一个重要机制。

【发明内容】

本发明的目的是提供抑癌基因启动子甲基化检测在口腔白斑癌变评估中的应用，在基因水平上通过定量检测抑癌基因启动子甲基化在口腔白斑组织中的表达，评估口腔白斑癌变的风险。

为实现上述目的，本发明公开以下技术方案：

抑癌基因启动子甲基化检测在口腔白斑癌变评估中的应用，所述抑癌基因是RASSF1A基因和MGMT基因中的一种或两种。

抑癌基因启动子甲基化检测在口腔白斑癌变评估中的应用包括如下步骤，

(1)获得口腔白斑患者病变组织，提取组织DNA；

(2)重亚硫酸盐处理已提取DNA；

(3)定量甲基化特异性聚合酶链反应检测RASSF1A，MGMT启动子甲基化表达；

(4)若RASSF1A和MGMT基因中的一种或两种的启动子区域甲基化表达阳性，则预测口腔白斑癌变风险高，若RASSF1A和MGMT两种基因的启动子区域甲基化表达阴性，则预测口腔白斑癌变风险低。

甲基化表达数值＞0，癌变风险增大。

本发明的积极效果：

从正常黏膜上皮细胞到癌变细胞转变的过程是分级多步骤进行的，基因水平的改变往往早于细胞水平改变。基于这一理论，抑癌基因启动子甲基化表达阳性往往先于细胞水平的改变，可以较上皮异常增生提前评估白斑癌变的风险，提示患者积极预防及必要时采取治疗措施。同时，实验结果显示，不存在异常增生的上皮，RASSF1A，MGMT甲基化表达不一定是阴性。这就对口腔白斑及鳞癌手术切除病变范围及适应症提出了新的挑战。

本发明采用定量甲基化特异性聚合酶链反应(QMSP)提高检测技术的特异性和敏感性，对抑癌基因启动子在白斑组织中的甲基化表达进行定量的测定。用标准的实验化流程，操作规范及质控各操作节点的检测指标，使此项检测技术操作可行，检测结果稳定。实验结果完全自动化，可重复性好。通过对待选抑癌基因启动子甲基化表达拷贝数的比较，客观地对白斑癌变风险作出评估，克服了组织病理切片读片过程中的主观性及差异性。

本发明公开的技术方案可以辅助医生做出判断，使临床医生根据口腔白斑患者的分子水平更好的评估白斑患者的癌变风险，及时制定出合适的治疗方案，提高患者的生活质量。

【附图说明】

图1为检测基因引物及探针序列；

图2a为ACTB标准曲线，图2b为RASSF1A标准曲线，图2c为MGMT标准曲线；其中纵坐标Crossing Point表示交叉点，横坐标Log Concentration表示对数浓度；

图3为检测基因甲基化在组织中的表达情况，其中P值为甲基化表达数值在口腔癌症组和白斑组比较；

图4为RASSF1A启动子甲基化在白斑中表达与临床参数的单因素回归分析；

图5为基因甲基化表达评估白斑癌变的单因素回归分析。RASSF1A值＞0时，白斑癌变风险增大5.88倍；MGMT值＞0时，白斑癌变风险增大4.03倍；MGMT或RASSF1A任意值＞0时，白斑癌变风险增大5.1倍。

【具体实施方式】

以下结合附图对本发明做详细说明。

实施例1

I、组织样本DNA重亚硫酸盐处理：

(1)临床获取组织后，取25片20um组织的冰冻切片用1％蛋白酶K(Merck)，48℃消化过夜，次日苯酚-氯仿法提取DNA，溶解在100ulTE溶液中。

(2)2ug提取的DNA样本与0.2mol/L NaOH溶液混匀，50℃，20min变性。变性后的DNA在500ul新鲜配制重亚硫酸盐溶液中(2.5M重亚硫酸盐，125mM对苯二酚及3M NaOH混合液)70℃孵育3h。用Wizard Clean-up试剂盒(Promega)纯化处理后的DNA，0.3mol/L的NaOH溶液作用10min后，加入1ul糖元及350ul乙醇过夜沉淀DNA。

(3)13000rmp，15min离心得到重亚硫酸盐处理后的DNA，溶于60ul双蒸水中待检测用。

II、定量甲基化PCR测定基因启动子甲基化表达：

(1)待测基因甲基化引物、探针序列见图1。(甲基化引物探针序列参考文献1，2，由invitrogen公司合成)

(2)标准曲线的制备：取健康人白细胞提取DNA，SssI甲基化转移酶(NewEngland Biolabs)进行体外甲基化后，重亚硫酸盐处理得DNA，梯度稀释，做QMSP标准品，制备ACTB，MGMT，RASSF1A甲基化表达的标准曲线(图2a，图2b，图2c)。

(3)QMSP反应体系(10ul反应体系)：200nM probe，600nM引物，platinumTaq polymerase(Invitrogen)0.75U，200uM dNTP，16.6mM硫酸铵，67mMTrizma，6.7mM氯化镁，10mM巯基乙醇及0.1％二甲基亚砜，3ul重亚硫酸盐处理的DNA作为反应模板。

(4)QMSP在Roche LightCycler 480 Sequence Detector System 384板实施，QMSP反应条件如下：95℃10min；95℃10sec，60℃20sec 45个循环。每个待测样本重复3次，用绝对定量法计算甲基化表达数值。

III、比较抑癌基因启动子甲基化在不同组织中表达：

以ACTB作为内参基因，计算待测基因甲基化在检测组织中表达的拷贝数。本发明在实验中检测77例白斑，32例口腔鳞癌，40例正常组织。用SPSS软件包统计数据。RASSF1A，MGMT基因启动子甲基化在口腔白斑，口腔鳞癌及正常组织中的表达率及数值见图3。口腔鳞癌组织检测基因甲基化数值明显高于白斑组(RASSF1A：P＝.000；MGMT：P＝.020)。癌症组和白斑组RASSF1A甲基化表达数值均明显高于正常组，P值分别为.000和.002(Mann Whitney Utest)；MGMT甲基化表达鳞癌组明显高于正常组(P＝.002)。

另外，对RASSF1A甲基化表达状态与白斑样本临床及病理相关信息作单因素回归分析(图4)发现，上皮异常增生程度是RASSF1A甲基化阳性的一个重要影响因素。具有重度及中度异常增生程度的组织RASSF1A甲基化阳性率比单纯增生或仅有轻度异常增生组高6.42倍(95％CI，1.23-33.36；P＝.027)。在上皮中度及重度异常增生组中(0.0010±0.0035)的表达水平明显高于上皮仅有轻度或者单纯增生组(0.0000±0.0002)(P＝.013，Mann Whitney U test)。对基因甲基化状态对白斑癌变的风险评估回归分析显示，与甲基化表达阴性相比，RASSF1A甲基化表达阳性，白斑癌变风险提高5.88倍(95％CI 2.19-15.74，P＝.000.MGMT甲基化表达阳性，白斑癌变风险提高4.03倍(95％CI 1.17-13.86，P＝.027.)。当MGMT和RASSF1A有一个基因甲基化表达阳性时，白斑癌变风险提高5.10倍(95％CI 2.07-12.60，P＝.000.)(见图5)。

以上分析结果显示，RASSF1A，MGMT基因启动子甲基化可以作为口腔白斑癌变风险评估的组织标记物。

参考文献

1.Xing M，Cohen Y，Mambo E，et al：Early occurrence of RASSF1Ahypermethylation and its mutual exclusion with BRAF mutation in thyroidtumorigenesis.Cancer Res 64：1664-1668，2004

2.Hoque MO，Begum S，Topaloglu O，et al：Quantitation of promotermethylation of multiple genes in urine DNA and bladder cancer detection.J NatlCancer Inst 98：996-1004，2006

Claims

1.抑癌基因启动子甲基化检测在口腔白斑癌变评估中的应用，其特征在于：所述抑癌基因是RASSF1A基因和MGMT基因中的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的抑癌基因启动子甲基化检测在口腔白斑癌变评估中的应用，其特征在于：包括如下步骤，

(1)获得口腔白斑患者病变组织，提取组织DNA；

(2)重亚硫酸盐处理已提取DNA；

3.根据权利要求2所述的抑癌基因启动子甲基化检测在口腔白斑癌变评估中的应用，其特征在于：甲基化表达数值＞0，癌变风险增大。