WO2016204510A1 - Ｍｎｈｃ ⅱａ를 이용한 심혈관계 질환 진단 방법 - Google Patents

Ｍｎｈｃ ⅱａ를 이용한 심혈관계 질환 진단 방법 Download PDF

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    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing cardiovascular diseases using NMHC IIA. More particularly, the present invention relates to a cardiovascular disease diagnostic composition comprising an agent for measuring the level of NMHC IIA, and a kit for diagnosing cardiovascular disease comprising the composition. And a method for diagnosing cardiovascular disease and a drug delivery complex comprising an agent capable of binding to NMHC IIA.
  • Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease caused by vascular damage caused by various risk factors such as hypertension, obesity and diabetes. As atherosclerosis progresses, it is also a major cause of major cardiovascular diseases such as stroke, myocardial infarction and limb ischemic necrosis. Maintaining the function of vascular endothelial cells in the development of atherosclerosis is important. Many studies have shown that adequate stress levels of shear flow due to normal laminar flow are required to maintain normal function of vascular endothelial cells. Research has been reported to be maintained. Normal blood flow, laminar flow, increases the expression of anti-arterial genes in vascular endothelial cells, whereas abnormal blood flow, disturbed flow, is known to increase the expression of genes that promote atherosclerosis.
  • vascular endothelial dysfunction is recognized as a marker of early stage of atherosclerosis.
  • a carotid artery ligation model has been established as an animal model that causes abnormal vortex flow, in which the left carotid artery (LCA), partially ligation, is exposed to slow vortex flow and within two weeks of atherosclerotic plaque. It has been reported that abnormal vortex flow caused by left carotid artery partial ligation can acutely induce vascular endothelial dysfunction and promote the development of atherosclerosis.
  • LCA left carotid artery
  • Korean Patent No. 870233 discloses a peptide for diagnosing, preventing and treating atherosclerosis
  • International Publication No. 2010-018870 discloses atherosclerosis diagnosis for further improving the accuracy of detection of atherosclerosis lesions.
  • a polypeptide marker is disclosed
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 2015-0028213 discloses a novel peptide capable of specifically binding to dysfunction vascular endothelial cells and a kit for diagnosing a cardiovascular disease including the same. .
  • NMHC IIA non-muscle myosin heavy chain IIA, Myosin-9
  • Myosin-2 vascular endothelial cells exposed to abnormal vortex blood flow.
  • the NMHC IIA can be used as a diagnostic marker for various cardiovascular diseases including atherosclerosis, and completed the present invention.
  • One object of the present invention is to provide a composition for diagnosing cardiovascular diseases comprising an agent capable of detecting NMHC IIA in vascular endothelial cells.
  • Another object of the present invention to provide a kit for diagnosing a cardiovascular disease comprising the composition.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for diagnosing cardiovascular disease.
  • Another object of the present invention is to provide a drug delivery complex comprising an agent capable of binding to NMHC IIA.
  • NMHC IIA provided by the present invention, it is possible to specifically diagnose the onset of cardiovascular disease, and thus will be widely used for the treatment of more effective cardiovascular disease.
  • Figure 1a is a graph showing the results of comparing the expression level of the anti-inflammatory genes eNOS and KLF2 expressed in the vascular endothelial cells of the left carotid artery and the right carotid artery of the carotid partial ligation animal model.
  • Figure 1b is a micrograph and a graph showing the results of comparing the expression level of VCAM-1 and ICAM-1, which is an inflammation-inducing gene expressed in the vascular endothelial cells of the left carotid artery and the right carotid artery of the carotid partial ligation animal model.
  • Figure 1c is a micrograph showing the formation of atherosclerotic plaques in the left carotid artery and the right carotid artery of the carotid partial ligation animal model.
  • FIG. 2A is a graph showing a result of comparing the number of phages detected for each round obtained in the left carotid artery (LCA) with the number of phages detected for each round obtained in the right carotid artery (RCA) .
  • Figure 2b is a graph showing the results of phage display panning in each organ of the carotid artery ligation animal model, and comparing the number of phages obtained therefrom.
  • Figure 3a is a micrograph showing the results of confirming the morphological changes caused by blood flow shear stress in the mouse vascular endothelial cells iMAEC cells.
  • Figure 3b is a photograph showing the result of confirming the change in the expression level of inflammation-related genes by blood flow shear stress in the mouse vascular endothelial cells.
  • Figure 3c is a micrograph showing the results of confirming the morphological changes caused by blood flow shear stress in human HUVEC cells vascular endothelial cells.
  • Figure 3d is a photograph showing the result of confirming the change in the expression level of inflammation-related genes due to blood flow shear stress in human HUVEC cells vascular endothelial cells.
  • Figure 4a is a micrograph showing the result of confirming the binding level of the six peptides in the mouse vascular endothelial cells iMAEC cells.
  • Figure 4b is a micrograph showing the results of confirming the binding level of the six peptides to the human vascular endothelial HUVEC cells.
  • Figure 4c is a graph showing the results of analyzing the binding level of the six peptides in the mouse vascular endothelial cells iMAEC cells.
  • Figure 4d is a graph showing the results of analyzing the binding level of the six peptides in human vascular endothelial HUVEC cells.
  • Figure 5a is a fluorescent photograph showing the result of confirming whether the binding to the left carotid artery (LCA) and the right carotid artery (RCA) through the administration of phage expressing six DESPs and through immunostaining.
  • FIG. 5B shows the internalization of bound phages in blood vessels, wherein the bound phages (white arrows) on the surface of blood vessels were confirmed by z stack imaging (red: phage, blue :) with confocal microscopy. Nucleus, green: elastic layer of blood vessels).
  • FIG. 5C shows the biodistribution of DESP-expressing phage selected from mice.
  • Various organs including the carotid artery, were extracted for quantification of homing phage in tissue and homogenized for titration of phage counts. Bars represent the ratio of bound phages to the total number of ECs as the mean ⁇ SD of three individual experiments. * Indicates significant differences compared to other organs except liver and spleen (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 5D is a graph showing whether each phage expressing CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3) and CPRRSHPIC (SEQ ID NO: 9) bound to the left carotid artery (LCA) can bind to other organs.
  • 6A is a photograph showing the anatomical regions of aortic tissue.
  • FIG. 6B is a fluorescence micrograph showing phages expressing CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3) and CPRRSHPIC (SEQ ID NO: 9), which are a kind of DESPs, bound to aortic tissue.
  • Figure 6c is a photograph showing the anatomical region of the branch of the aorta.
  • FIG. 6D is a fluorescence micrograph showing phages expressing CPRRSHPIC (SEQ ID NO: 9) and CPRRSHPIC (SEQ ID NO: 9), which are a kind of DESPs, bound to branch tissue of the aorta.
  • FIG. 7A shows the overall shape of the isolated human pulmonary artery (upper), where the human pulmonary artery is divided into a straight L part and an R part with branches (bottom).
  • FIG. 7B is a fluorescence micrograph showing a state in which a phage expressing CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3), which is a type of DESPs, is bound to pulmonary artery tissue, in which a represents a region in which vortex blood flow occurs, and b represents normal blood flow. Represents a region, and c represents a branch region.
  • CLIRRTSIC SEQ ID NO: 3
  • 7C is a fluorescence micrograph showing a state in which phage expressing CPRRSHPIC (SEQ ID NO: 9), which is a type of DESPs, is bound to pulmonary artery tissue, where a is a region in which vortex blood flow is generated, and b is a normal blood flow. Represents a region, and c represents a branch region.
  • SEQ ID NO: 9 phage expressing CPRRSHPIC
  • Figure 9a is a fluorescence micrograph showing the results of the introduction of various polymer materials (BPEI-SS-PEG-siGLO) to HUVEC cells, human vascular endothelial cells, siGLO represents a negative control, Lipofectamine-siGLO represents a positive control.
  • BPEI-SS-PEG-siGLO polymer materials
  • Figure 9b is a graph showing the results of comparing the mRNA level changes of ICAM1 according to the introduction of BPEI-SS-PEG or BPEI-SS-PEG-siICAM1 in the right carotid artery (RCA) and the left carotid artery (LCA) of the carotid partial ligation animal model to be.
  • Figure 10a is a photograph, graph and chart showing the results of detecting a protein with a changed expression level, depending on whether biotin-labeled CLIRRTSIC in HUVEC cells.
  • FIG. 10B is a graph showing the results of mass spectrometry of six proteins whose expression levels were changed according to whether biotin-labeled CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3) was treated with HUVEC cells.
  • Figure 10c is a photograph showing the results of Western blot analysis using HUVEC cell-derived proteins and anti-NMHC IIA antibody immunoprecipitated using a biotin-labeled CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3).
  • Figure 11a is a photograph and graph showing the results of Western blot analysis for the expression level of NMHC IIA expressed in HUVEC cells cultured in LSS or OSS state.
  • Figure 11b is a photograph showing the results of immunofluorescence staining using anti-NMHC IIA antibody in HUVEC cells cultured in LSS or OSS state.
  • the present inventors anticipate that the vortex flow may be involved in the early stages of the development of various cardiovascular diseases caused by abnormal vascular endothelial cells, and produced a carotid artery partial ligation animal model that reflects this, using the animal model.
  • the present invention provides a composition for diagnosing a cardiovascular disease comprising an agent for measuring the level of NMHC IIA as one embodiment.
  • NMHC IIA non-muscle myosin heavy chain IIA
  • Myosin-9 myosin 9
  • the NMHC IIA is used as a diagnostic marker for various diseases.
  • the NMHC IIA may be used as a marker for diagnosing liver metastasis of colorectal cancer, a marker for diagnosing acute exacerbation of COPD.
  • it can be used as an active ingredient of the inhibitor of the PRRS virus.
  • NMHC IIA consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 was detected in vascular endothelial cells exposed to the vortex flow.
  • cardiovascular disease is intended to encompass not only direct diseases caused by various causes such as abnormalities of the circulatory system, dysfunction, damage, etc., but also secondary diseases derived by such direct diseases. Means.
  • the cardiovascular disease may be interpreted to mean a disease caused by dysfunctional vascular endothelial cells among the wide range of cardiovascular diseases defined above, for example, hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, cardiovascular Artery stenosis, angina pectoris, peripheral artery stenosis, ischemic artery disease, arteriosclerosis cerebrovascular disease, and the like, as another example, may be atherosclerosis, the cardiovascular disease NMHC provided by the present invention in vascular endothelial cells Detecting IIA can diagnose its onset.
  • cardiovascular diseases for example, hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, cardiovascular Artery stenosis, angina pectoris, peripheral artery stenosis, ischemic artery disease, arteriosclerosis cerebrovascular disease, and the like, as another example, may be atherosclerosis, the cardiovascular disease NMHC provided by the present invention in vascular endothelial cells Detecting IIA can diagnose its onset.
  • diagnosis of the present invention means confirming the presence or characteristic of a pathological state.
  • diagnosis may be interpreted as checking whether the cardiovascular disease occurs.
  • the term "agent for measuring the level of NMHC IIA” refers to an agent used in a method for measuring the level of NMHC IIA expressed in vascular endothelial cells.
  • an agent used in a method for measuring the level of NMHC IIA expressed in vascular endothelial cells For example, Western blotting, ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay (Immunoprecipitation Assay) ), Antibodies or aptamers used in methods such as the Complement Fixation Assay, FACS, and protein chip assays.
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • Ouchterlony immunodiffusion Ouchterlony immunodiffusion
  • rocket immunoelectrophoresis tissue immunostaining
  • the term "antibody” refers to a proteinaceous molecule capable of specifically binding to an antigenic site of a protein or peptide molecule. Such an antibody may be prepared by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method. The protein encoded by the marker gene can be obtained and prepared by conventional methods from the obtained protein.
  • the form of the antibody is not particularly limited and, if it is a polyclonal antibody, a monoclonal antibody or antigen-binding, a part thereof may be included in the antibody of the present invention and may include all immunoglobulin antibodies, as well as humanized antibodies. It may also contain a special antibody of.
  • the antibodies include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least antigen binding function and may be Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • the antibody may be an antibody capable of specifically binding to NMHC IIA, and as an example, a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or part thereof capable of specifically binding to NMHC IIA Can be
  • aptamer refers to a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA, or modified nucleic acid) having a stable tertiary structure as a substance capable of specifically binding to a target substance to be detected in a sample. Means, through the binding can specifically confirm the presence of the target material in the sample.
  • Preparation of the aptamer is synthesized by determining the sequence of the oligonucleotide having a selective and high binding ability to the target protein to be identified according to the general aptamer preparation method, and then synthesize the 5 'end or 3' end of the oligonucleotide By binding to a functional group of the linker, -SH, -COOH, -OH or -NH2.
  • the aptamer may be an aptamer that can specifically bind to NMHC IIA, for example, may be a DNA aptamer that can specifically bind to the NMHC IIA.
  • whether or not the treatment of the DESP to the HUVEC cells in order to identify the target protein expressed in the vascular endothelial cells exposed to the vortex flow and the DESP having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 can bind
  • NMHC IIA non-muscle myosin heavy chain IIA, Myosin.
  • CLIRRTSIC SEQ ID NO: 3
  • the present invention provides a kit for diagnosing a cardiovascular disease comprising the composition for diagnosing a cardiovascular disease.
  • the kit of the present invention can be used to diagnose the onset of cardiovascular disease by measuring the level of NMHC IIA level from a sample from vascular endothelial cells derived from an individual concerned about cardiovascular disease, but is not particularly limited thereto.
  • antibodies, aptamers, as well as one or more other constituent compositions, solutions or devices suitable for analytical methods for measuring the levels of the proteins may be included.
  • sample refers to a direct subject which is isolated from an individual suffering from cardiovascular disease and measures the expression level of NMHC IIA.
  • sample refers to a direct subject which is isolated from an individual suffering from cardiovascular disease and measures the expression level of NMHC IIA.
  • the term "individual” of the present invention may include, without limitation, mammals including rats, livestock, humans, and the like, which are likely to develop or develop cardiovascular diseases.
  • the kit of the present invention may be an ELISA kit for measuring the level of NMHC IIA.
  • the kit is not particularly limited thereto, but may be a substrate, a suitable buffer, or a color development enzyme for immunological detection of NMHC IIA. Or a secondary antibody labeled with a fluorescent substance, a chromogenic substrate, and the like.
  • the substrate is not particularly limited thereto, but a nitrocellulose membrane, a 96 well plate synthesized with a polyvinyl resin, a 96 well plate synthesized with a polystyrene resin, a slide glass made of glass, and the like may be used.
  • peroxidase alkaline phosphatase
  • the fluorescent material is not particularly limited, but may be FITC, RITC, and the like, and the colorant substrate solution is not particularly limited thereto.
  • kits of the present invention may include reagents such as the reagents required for carrying out the negative and positive control reactions or the buffers required for the hybridization reactions.
  • reagents such as the reagents required for carrying out the negative and positive control reactions or the buffers required for the hybridization reactions.
  • the optimum amount of reagent used in a particular reaction can be readily determined by one of ordinary skill in the art having knowledge of the subject matter herein.
  • the kit of the present invention may comprise the aforementioned components in a separate package or compartment.
  • the present invention provides a method for diagnosing cardiovascular disease by measuring the expression level of NMHC IIA from a biological sample or confirming its intracellular location.
  • the diagnostic method for cardiovascular diseases includes the steps of: (a) measuring the expression level of non-muscle myosin heavy chain IIA (NMHC IIA) from a biological sample isolated from the subject; And (b) comparing the measured expression level of NMHC IIA with the expression level measured from a biological sample isolated from a normal individual.
  • NMHC IIA non-muscle myosin heavy chain IIA
  • the biological sample is not particularly limited thereto, but may be, for example, vascular endothelial cells, blood including vascular endothelial cells, tissue including vascular endothelial cells, and the like. Same as above.
  • the method for diagnosing a cardiovascular disease may include determining whether NMHC IIA is present in a cell membrane from a biological sample of a subject to be examined.
  • the biological sample is the same as described above, and the method of confirming whether or not the NMHC IIA is present in the cell membrane is not particularly limited thereto.
  • immunofluorescence staining using an anti-NMHC IIA antibody may be used. have.
  • NMHC IIA is present in the cell membrane region of the biological sample derived from the subject, it may be determined that the cardiovascular disease has occurred in the subject, and the NMHC IIA is expressed in the cell membrane region. If it is confirmed that it does not exist, it can be determined that the cardiovascular disease did not develop in the test subject.
  • the present invention provides a drug delivery system for treating cardiovascular disease, including an agent and a drug capable of binding to NMHC IIA (non-muscle myosin heavy chain IIA).
  • NMHC IIA non-muscle myosin heavy chain IIA
  • agent capable of binding to NMHC IIA refers to an agent capable of specifically binding to NMHC IIA expressed in vascular endothelial cells, and may be, for example, a peptide, an antibody, or an aptamer.
  • drug carrier of the present invention is a combination of an agent capable of binding to the NMHC IIA and a drug to be delivered to a cell or tissue expressing NMHC IIA, which is a cause of cardiovascular disease, thereby expressing the NMHC IIA. It means a substance capable of delivering the drug to the tissue or cells.
  • the drug carrier may be used for treating cardiovascular diseases, wherein the cardiovascular diseases are the same as described above.
  • the term "drug” of the present invention means a substance having a therapeutic effect on cardiovascular diseases that can be delivered to cells or tissues expressing the NMHC IIA through an agent capable of binding to the NMHC IIA.
  • the drug is not particularly limited thereto, but may be, for example, an active ingredient exhibiting a prophylactic or therapeutic effect of a cardiovascular disease, and various cardiovascular disease specific therapeutic agents, and as another example, a prophylactic or therapeutic effect of a cardiovascular disease.
  • Compounds, peptides, proteins, nucleic acids, or combinations thereof may be observed.
  • RNA DNA
  • SIRNA short interfering RNA
  • ODNs antisense oligodeoxynucleotides
  • ribozymes DNAzymes
  • microRNAs microRNAs, or combinations thereof
  • the drug delivery agent provided in the present invention may further include an agent capable of binding the NMHC IIA and a non-peptide polymer material capable of effectively binding the drug.
  • non-peptidyl polymer material refers to a biocompatible polymer material having two or more repeating units bonded thereto, and the repeating units may be linked to each other through any covalent bonds other than peptide bonds.
  • the molecular weight is not particularly limited thereto, but may be 1 to 100 kDa as one example, and may be 1 to 20 kDa as another example.
  • the non-peptidyl polymer material is bound to the agent and the drug that can bind to the NMHC IIA, respectively, even when the agent and the drug that can bind to the NMHC IIA can not directly bind
  • the non-peptidyl polymer material may include a reagent capable of binding to NMHC IIA and a reactor capable of binding to a drug, respectively.
  • the reactor included in the non-peptidyl polymer material is not particularly limited, but may be, for example, an aldehyde group, a propionaldehyde group, a butylaldehyde group, a maleimide group, a succinimide, and the like.
  • the reactor When the reactor is an aldehyde group, non-specific reactions can be minimized so that the non-peptidyl polymer material can be more effectively bound to agents and drugs capable of binding to NMHC IIA.
  • the reactor may include one kind alone or multiple kinds in combination in the non-peptidyl polymer material, for example, one end of the maleimide group, the other end of the aldehyde group, propionaldehyde group or butylaldehyde group It may have, and may include the same hydroxyl group at both ends.
  • the non-peptidyl polymer material including the reactor is not particularly limited thereto.
  • PEG polyethylene glycol
  • polypropylene glycol a copolymer of ethylene glycol and propylene glycol
  • polyoxyethylated polyol polyvinyl alcohol
  • poly Biodegradable polymers such as saccharides, dextran, polyvinyl ethyl ether, PLA (polylactic acid), and PLGA (polylactic-glycolic acid,
  • DESPs having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 9 specifically binds to HUVEC cells cultured in vortex flow conditions (Fig. 8), among which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • the complex having DESP bound to the siRNA can specifically deliver the siRNA to HUVEC cells cultured in vortex flow conditions (FIG. 9A) and can deliver the siRNA to vascular endothelial cells of a carotid artery ligation animal model. It was confirmed (FIG. 9B).
  • the agent capable of binding to the NMHC IIA provided by the present invention may be a carrier for drug or gene delivery to vascular endothelial cells affected by the vortex flow, thus functioning early atherosclerotic lesions. It can be seen that the abnormal vascular endothelial cells may be useful for specific local delivery of a drug or gene of interest.
  • Example 1 dysfunctional vascular endothelial cells Peptide excavation
  • a carotid partial ligation animal model is used to detect dysfunctional vascular endothelial cells by specifically binding to dysfunctional vascular endothelial cells induced by vortex flow that provides blood flow shear stress.
  • Example 1-1 Carotid Artery Partial ligation Production of animal models
  • Carotid partial ligation animal models were constructed by ligating the arterial vessels except the superior thyroid artery in the branches of the left carotid artery (LCA) of 6-week-old male C57BL / 6 mice. The produced animal model was confirmed that the left carotid artery is exposed to a rapidly slow vortex flow, causing dysfunction of vascular endothelial cells, acute atherosclerosis within two weeks.
  • LCA left carotid artery
  • RNAs were separated from vascular endothelial cells of the left carotid artery (LCA) and the right carotid artery (RCA) of the mouse, and the expression levels of the anti-inflammatory genes eNOS and KLF2 were analyzed by RT-PCR (FIG. 1A). .
  • Figure 1a is a graph showing the results of comparing the expression level of the anti-inflammatory genes eNOS and KLF2 expressed in the vascular endothelial cells of the left carotid artery and the right carotid artery of the carotid partial ligation animal model. As shown in Figure 1a, it was confirmed that the anti-inflammatory gene is expressed at a very low level in the partially ligated LCA compared to the normal blood vessel RCA.
  • Figure 1b is a micrograph and a graph showing the results of comparing the expression level of VCAM-1 and ICAM-1, which is an inflammation-inducing gene expressed in the vascular endothelial cells of the left carotid artery and the right carotid artery of the carotid partial ligation animal model. As shown in Figure 1b, it was confirmed that the inflammation-induced gene is expressed at a very high level in the partially ligated LCA compared to the normal blood vessel RCA.
  • Figure 1c is a micrograph showing the formation of atherosclerotic plaques in the left carotid artery and the right carotid artery of the carotid partial ligation animal model. As shown in Figure 1c, atherosclerotic plaques were not formed in the normal blood vessel RCA, it was confirmed that the atherosclerotic plaques were formed in the partially ligated LCA.
  • the manufactured carotid partial ligation animal model can be used as an arteriosclerosis animal model.
  • Example 1-2 phage display Panning
  • Phage display panning was performed using a Ph.D-C7C phage display peptide library kit (New England Biolabs, Inc.).
  • Example 1 In the carotid artery partial ligation animal model prepared in Example 1-1, 1 x 10 11 pfu of phage was injected into the tail vein of the mouse 3 days after the carotid artery partial ligation, and in vivo panning was performed for 10 minutes. The animal model was then anesthetized and physiological saline was injected to remove unbound phage. Acidic phage eluate was added to isolate phages bound to carotid endothelial cells of the carotid artery, and the isolated phages were infected with Escherichia coli, followed by counting and amplifying phages to complete the first round, which was repeated three times in total. Rounds were performed (FIG. 2A).
  • FIG. 2A is a graph showing a result of comparing the number of phages detected for each round obtained in the left carotid artery (LCA) with the number of phages detected for each round obtained in the right carotid artery (RCA) .
  • the number of phages obtained by performing phage display panning in the left carotid artery (LCA) where partial ligation was performed increased rapidly after three rounds, but in the right carotid artery (RCA) where partial ligation was not performed.
  • the number of phages obtained by performing display panning did not show any change.
  • phage display panning was performed on each organ (liver, spleen, heart, lung, kidney, brain, muscle, LCA or RCA) of the carotid partial ligation animal model, and the results were compared (FIG. 2B). .
  • Figure 2b is a graph showing the results of phage display panning in each organ of the carotid artery ligation animal model, and comparing the number of phages obtained therefrom. As shown in Figure 2b, among the organs other than the liver and spleen belonging to the reticulum endothelial system including a plurality of endothelial cells, it was confirmed that the highest level of phage is detected in LCA.
  • Phage obtained by the panning was infected with E. coli, and the infected E. coli was inoculated and cultured in LB / IPTG / X-gal solid medium to obtain blue colonies. The obtained colonies were cultured and phage DNA was obtained therefrom, and then the sequence of the obtained phage DNA was determined to confirm the amino acid sequence of the peptide expressed therefrom. By comparing the determined sequences, peptides were selected that were present only in the partially carotid left carotid artery or more in the left carotid artery than in the right carotid artery (Table 1).
  • Example 1-3 Verification of the Effect of Exposed Peptides on Dysfunctional Vascular Endothelial Cells
  • Example 1-2 Whether or not the six peptides discovered in Example 1-2 showed specificity for dysfunctional vascular endothelial cells, using iMAEC and HUVEC which are a kind of vascular endothelial cells.
  • iMAEC a mouse arterial endothelial cell
  • DMEM medium 10% FBS, 50 g / ml endothelial cell growth supplement (ECGS) and 1% penicillin / streptomycin
  • Human umbilical vein endothelial cells were also inoculated in Medium 200 medium (5% FBS and LSGS (low-serum growth)) and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions.
  • Blood saturated shear stress was applied to the saturated cultured iMAEC and HUVEC using a cone and plate viscometer.
  • the blood flow shear stress was treated for 48 hours under conditions of applying laminar shear stress (LSS) similar to normal blood flow to 25 dyne / cm 2 or applying oscillatory shear stress (OSS) to ⁇ 5 dyne / cm 2.
  • LSS laminar shear stress
  • OSS oscillatory shear stress
  • Figure 3a is a micrograph showing the results of confirming the morphological changes caused by blood flow shear stress in the mouse vascular endothelial cells iMAEC cells. As shown in Figure 3a, the vascular endothelial cells in the LSS state of normal blood flow was observed to be longer in the same direction as the direction of the shear stress flow, but in the abnormal OSS state showed an irregular orientation.
  • Figure 3b is a photograph showing the result of confirming the change in the expression level of inflammation-related genes by blood flow shear stress in the mouse vascular endothelial cells.
  • the expression of anti-inflammatory genes such as eNOS and KLF2 increased in the LSS state
  • the expression of inflammatory genes such as VCAM1, ICAM1, MCP1 increased in the OSS state.
  • Figure 3c is a micrograph showing the results of confirming the morphological changes caused by blood flow shear stress in human HUVEC cells vascular endothelial cells. As shown in Figure 3c, the same as confirmed in iMAEC, a mouse arterial endothelial cell, the vascular endothelial cells were observed to be elongated in the same direction as the direction of the shear stress flow in the LSS state of normal blood flow, but abnormal In the OSS state, the orientation was irregular.
  • Figure 3d is a photograph showing the result of confirming the change in the expression level of inflammation-related genes due to blood flow shear stress in human HUVEC cells vascular endothelial cells.
  • the expression of anti-inflammatory genes such as eNOS and KLF2 is increased in the LSS state
  • the inflammation-induced genes such as VCAM1, ICAM1, and MCP1 are increased in the OSS state, as shown in iMAEC, a mouse arterial endothelial cell. It was confirmed that the expression of.
  • Example 1-2 phage expressing each of the six peptides discovered in Example 1-2 were added to each of the cultured two cells, and reacted for 1 hour by 6 x 10 6 pfu, and then washed with PBS for binding. Unused phages were removed.
  • Each endothelial cell was then fixed with 4% paraformaldehyde solution, washed with PBS, perforated by addition of PBS containing 0.2% Triton-X for 20 minutes, and washed again with PBS. Then, 10% donkey serum solution was added and blocked for 1 hour, the primary antibody against M13 bacteriophage was added, and then reacted overnight at 4 ° C, and washed with PBS.
  • a donkey's anti-mouse IgG antibody-FITC was added and reacted at room temperature for 30 minutes, and counterstaining was performed with DAPI.
  • confocal microscopy was used to compare the binding level of phage to vascular endothelial cells cultured in a stable, LSS or OSS state where no shear stress was applied (FIGS. 4A to 4D).
  • Figure 4a is a micrograph showing the result of confirming the binding level of the six peptides in the mouse vascular endothelial cells iMAEC cells.
  • phage expressing CLIRRTSIC SEQ ID NO: 3
  • CNLLLRTQC SEQ ID NO: 8
  • CPRRSHPIC SEQ ID NO: 9
  • Figure 4b is a micrograph showing the results of confirming the binding level of the six peptides to the human vascular endothelial HUVEC cells.
  • phage expressing CLIRRTSIC SEQ ID NO: 3
  • CNLLLRTQC SEQ ID NO: 8
  • CPRRSHPIC SEQ ID NO: 9
  • CLHPPLTLC SEQ ID NO: 10
  • Figure 4c is a graph showing the results of analyzing the binding level of the six peptides in the mouse vascular endothelial cells iMAEC cells. As shown in Figure 4c, the degree of difference, but the phage expressing the six peptides was confirmed that the binding is significantly increased in the OSS state compared to the LSS.
  • Figure 4d is a graph showing the results of analyzing the binding level of the six peptides in human vascular endothelial HUVEC cells. As shown in Figure 4d, the degree of difference, but the phage expressing the six peptides was confirmed that the binding is significantly increased in the OSS state compared to the LSS.
  • the six peptides were found to be dysfunctional endothelial cells-specific peptides (DESPs).
  • Example 1-4 Effect Verification of DESPs Using Carotid Artery Ligation Animal Model
  • Phages expressing the six DESPs were injected into the blood vessels of the carotid artery partial ligation animal model, and the body was washed with physiological saline containing 10 U / ml of heparin, fixed with 4% flyformaldehyde solution, and then physiologically After washing again with saline, the left carotid artery (LCA), the right carotid artery (RCA) and the aorta were removed, and the extracted tissue was washed with PBS. In the same manner as in Example 1-3, except for washing the tissue, using a donkey's anti-mouse IgG-R antibody as a secondary antibody, and reacting the secondary antibody for 2 hours. Immunostaining.
  • Figure 5a is a fluorescent photograph showing the result of confirming whether the binding to the left carotid artery (LCA) and the right carotid artery (RCA) through the administration of phage expressing six DESPs and through immunostaining. As shown in Figure 5a, it was confirmed that each phage expressing CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3) and CPRRSHPIC (SEQ ID NO: 9) specifically binds to the partially ligated LCA, while not binding to normal RCA.
  • CLIRRTSIC SEQ ID NO: 3
  • CPRRSHPIC SEQ ID NO: 9
  • FIG. 5B shows internalization of bound phages in blood vessels, where bound phages (white arrows) bound on the surface of blood vessels were confirmed by z stack imaging with confocal microscopy (red: phage, blue: Nucleus, green: elastic layer of blood vessels),
  • FIG. 5C shows the biodistribution of DESP-expressing phages selected from mice, extracting various organs including the carotid artery for quantification of homing phages in tissues and titrating phage counts Homogenized. Bars represent the ratio of bound phages to the total number of ECs as the mean ⁇ SD of three individual experiments. * Indicates significant differences compared to other organs except liver and spleen (p ⁇ 0.05). 5b and 5c, it was confirmed that the phages bound to the left carotid artery (LCA) were bound to the surface of blood vessels.
  • LCA left carotid artery
  • FIG. 5D is a graph showing whether each phage expressing CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3) and CPRRSHPIC (SEQ ID NO: 9) bound to the left carotid artery (LCA) can bind to other organs. As shown in Figure 5d, among the organs except the liver and spleen belonging to the reticuloendothelial system, it was confirmed that the highest level of phage was detected in LCA.
  • aortic tissue is divided into branches, Greater curvature (GC), Lesser curvature (LC), and Thoracic aorta (TA), and vortex flow occurs in the branch and LC regions, and in the GC and TA regions. Normal blood flow is known to occur (FIG. 6A).
  • 6A is a photograph showing the anatomical regions of aortic tissue.
  • the aorta is extracted from the animal model of carotid partial ligation atherosclerosis, and phage expressing 3 x 10 11 pfu of DESP is added to each site of the aorta, and then reacted at 37 ° C. for 3 hours, followed by washing and binding. Unused phages were removed. Subsequently, immunostaining was performed in the same manner as in Example 1-3 except for targeting the aorta, using an anti-mouse IgG-R antibody as a secondary antibody, and reacting the secondary antibody for 2 hours. It was. Fluorescence microscopy was used to compare the binding level of phage to aortic tissue (FIGS. 6B-6D).
  • FIG. 6B is a fluorescence micrograph showing a state in which phages expressing CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3) and CPRRSHPIC (SEQ ID NO: 9), which are a kind of DESPs, are bound to aortic tissue, and among the six DESPs provided by the present invention, FIG. (SEQ ID NO: 3) and CPRRSHPIC (SEQ ID NO: 9) were confirmed to bind to the aortic tissue and to the LC region in which the vortex flow occurred among the aortic tissues.
  • CLIRRTSIC SEQ ID NO: 3
  • CPRRSHPIC SEQ ID NO: 9
  • the branch area where the aortic blood flow occurs in the aortic tissue is the near area (NA) of orifice of branch vessels (NA-1 and NA-2) and the DA (distant area).
  • NA-1 and NA-II are known to generate vortex flow and normal blood flow in the DA region (FIG. 6C).
  • Figure 6c is a photograph showing the anatomical region of the branch of the aorta.
  • FIG. 6D is a fluorescence micrograph showing phages expressing CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3) and CPRRSHPIC (SEQ ID NO: 9), which are a kind of DESPs, bound to branch regions of aortic tissue.
  • CLIRRTSIC SEQ ID NO: 3
  • CPRRSHPIC SEQ ID NO: 9
  • the two DESPs can specifically bind to dysfunctional vascular endothelial cells induced by vortex flow.
  • Example 1-6 Intra-arterial Positioning with DESPs
  • Example 1-5 From the results of Example 1-5, it was confirmed that the phage expressing the two types of DESPs binds to the LC and branch regions in which the vortex flow occurs in the aortic tissue. ) And binding specificity of the phage expressing the two types of DESPs to the site where the vortex flow (OSS) occurs.
  • OSS vortex flow
  • FIG. 7A shows the shape of the isolated human pulmonary artery (upper), and divided the human pulmonary artery into a straight L part and an R part having branches (bottom).
  • cryosections were obtained from pulmonary arteries of humans who had been removed from patients undergoing pulmonary resection, and phages expressing 3 ⁇ 10 11 pfu of DESP were added to the obtained cryosections and reacted at 37 ° C. for 3 hours, followed by washing. To remove unbound phage. Subsequently, immunization was performed in the same manner as in Example 1-3, except that the frozen sections were subjected to an anti-mouse IgG-R antibody as a secondary antibody, and the secondary antibody was reacted for 2 hours. Stained. Fluorescence microscopy was used to compare the level of binding of phage to human aortic tissue (FIGS. 7B and 7C).
  • FIG. 7B is a fluorescence micrograph showing a state in which a phage expressing CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3), which is a type of DESPs, is bound to pulmonary artery tissue, in which a represents a region in which vortex blood flow occurs, and b represents normal blood flow. Represents a region, and c represents a branch region.
  • CLIRRTSIC SEQ ID NO: 3
  • 7C is a fluorescence micrograph showing a state in which phage expressing CPRRSHPIC (SEQ ID NO: 9), which is a type of DESPs, is bound to pulmonary artery tissue, where a is a region in which vortex blood flow is generated, and b is a normal blood flow. Represents a region, and c represents a branch region.
  • SEQ ID NO: 9 phage expressing CPRRSHPIC
  • CLIRRTSIC SEQ ID NO: 3
  • CPRRSHPIC SEQ ID NO: 9
  • the two DESPs can bind not only to vascular endothelial cells of mouse but also to human vascular endothelial cells.
  • Example 2 siRNA delivery to vascular endothelial cells using DESPs
  • DESPs having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 9 can bind to vascular endothelial cells of humans as well as mice, expression of specific proteins in vascular endothelial cells using the DESPs To determine whether it can deliver the siRNA that can inhibit the.
  • DESPs having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 9 were synthesized, respectively, and biotin was labeled on each of these DESPs. Subsequently, each biotin-labeled DESPs were added to HUVEC cells, which are human vascular endothelial cells cultured for 48 hours in an LSS or OSS state, at a level of 20 ⁇ M and reacted for 4 hours, followed by the same method as in Example 1-3. Immunostaining was performed. Streptavidin-bound Qdot (525nM, green) was added to the immunostained HUVEC cells, and the binding levels of the DESPs were compared using a fluorescence microscope (FIG. 8). At this time, HUVEC cells not treated with DESPs were used as a control.
  • HUVEC cells which are human vascular endothelial cells cultured for 48 hours in an LSS or OSS state
  • FIG. 8 is a fluorescence micrograph showing the results of comparing the binding level of CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3) or CPRRSHPIC (SEQ ID NO: 9), which is a type of DESPs, in HUVEC cells, which are human vascular endothelial cells. .
  • CLIRRTSIC SEQ ID NO: 3
  • CPRRSHPIC SEQ ID NO: 9
  • DESPs having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 9 synthesized in Example 2-1 were respectively bonded to PEG, a polymer material, to synthesize a polymer material (BPEI-SS-PEG) to which DESPs were bound.
  • SiGLO a red fluorescently labeled siRNA, was added to the BPEI-SS-PEG in a ratio of 10: 1, 20: 1, or 30: 1 (N / P ratio) and reacted at room temperature for 30 minutes, thereby allowing the BPEI-SS- to react.
  • Each of the obtained BPEI-SS-PEG-siGLO was introduced into HUVEC cells, which are human vascular endothelial cells cultured for 48 hours in an LSS or OSS state, and the red fluorescence expressed in the introduced cells was measured by a fluorescence microscope (FIG. 9a). In this case, cells in which siGLO was introduced without the polymer material were used as a negative control, and cells in which siGLO was introduced using lipofectamine as a positive control.
  • Figure 9a is a fluorescence micrograph showing the results of the introduction of various polymer materials (BPEI-SS-PEG-siGLO) to HUVEC cells, human vascular endothelial cells, siGLO represents a negative control, Lipofectamine-siGLO represents a positive control. As shown in FIG.
  • DESP of SEQ ID NO: 3 specifically binds to HUVEC cells cultured in vortex flow conditions.
  • Example 2-3 DESPs Used carotid artery Partial ligation SiRNA delivery to vascular endothelial cells in animal models
  • siRNA (siICAM1) for ICAM1 was added to the polymer material (BPEI-SS-PEG) to which two kinds of DESPs were bound and reacted to obtain respective BPEI-SS-PEG-siICAM1. It was. Subsequently, RCA and LCA were extracted from the animal model after 1 day, with or without injection of each of the obtained BPEI-SS-PEG-siICAM1 through the tail vein of the carotid partial ligation animal model. And mRNA levels of ICAM1 expressed in the vascular endothelial cells of the RCA and LCA were compared by a real time-qPCR technique (FIG. 9B). In this case, BPEI-SS-PEG-siICAM1 coupled with CLNQQTAIC (SEQ ID NO: 41) was used instead of the two types of DESPs.
  • CLNQQTAIC SEQ ID NO: 41
  • Figure 9b is a graph showing the results of comparing the mRNA level changes of ICAM1 according to the introduction of BPEI-SS-PEG or BPEI-SS-PEG-siICAM1 in the right carotid artery (RCA) and the left carotid artery (LCA) of the carotid partial ligation animal model to be. As shown in FIG.
  • the mRNA level of ICAM1 was higher in LCA compared to RCA in the carotid artery ligation animal model not injected with BPEI-SS-PEG-siICAM1, but the carotid artery injected with BPEI-SS-PEG-siICAM1
  • the mRNA level of ICM1 in LCA was lower than that of LCA without injection of BPEI-SS-PEG-siICAM1. It was confirmed that the level.
  • CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3) is a peptide that specifically binds to dysfunctional vascular endothelial cells caused by vortex flow, and when the peptide is used to effectively deliver a target object to dysfunctional vascular endothelial cells caused by vortex flow I could see that.
  • CLIRRTSIC SEQ ID NO: 3
  • the aim of this study was to identify target proteins expressed in vascular endothelial cells.
  • HUVEC cells which are human vascular endothelial cells cultured for 48 hours in an LSS or OSS state, were reacted for 4 hours with or without adding the biotin-labeled CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3).
  • CLIRRTSIC biotin-labeled CLIRRTSIC
  • 3 ⁇ g of streptavidin was added to 1.6 mg of the lysate obtained by crushing the HUVEC cells, reacted at 4 ° C. overnight, and then 20 ⁇ l protein-A / G beads were added and reacted for 3 hours, followed by immunoprecipitation. Was performed.
  • the immunoprecipitated proteins were electrophoresed, and proteins representing differences for each sample were detected (FIG. 10A).
  • Figure 10a is a photograph, graph and chart showing the results of detecting a protein with a changed expression level, depending on whether biotin-labeled CLIRRTSIC in HUVEC cells. As shown in Figure 10a, according to the treatment of the biotin-labeled CLIRRTSIC for HUVEC cells, it was confirmed that the expression level of the six proteins were changed.
  • FIG. 10B is a graph showing the results of mass spectrometry of six proteins whose expression levels were changed according to whether biotin-labeled CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3) was treated with HUVEC cells. As shown in Figure 10b, five of the six proteins were NMHC IIA (non-muscle myosin heavy chain IIA, Myosin-9), it was confirmed that one is Annexin A2.
  • FIG 10c is a photograph showing the results of Western blot analysis using HUVEC cell-derived proteins and anti-NMHC IIA antibody immunoprecipitated using a biotin-labeled CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3). As shown in Figure 10c, it was confirmed that immunoprecipitated HUVEC cell-derived protein binds to the anti-NMHC IIA antibody using the biotin-labeled CLIRRTSIC.
  • the target protein binding to CLIRRTSIC in HUVEC cells cultured in the OSS state was NMHC IIA, and the NMHC IIA was present on the cell surface when vascular endothelial cells were exposed to the vortex flow.
  • Example 3-1 the target protein binding to CLIRRTSIC in HUVEC cells cultured in OSS state is NMHC IIA, and the NMHC IIA is present on the cell surface when vascular endothelial cells are exposed to vortex flow. As confirmed, the effect of the OSS condition on the expression of NMHC IIA was analyzed.
  • HUVEC cells which are human vascular endothelial cells cultured in LSS or OSS state for 48 hours, were crushed to obtain respective lysates, and Western blot analysis using anti-NMHC IIA antibody was performed (FIG. 11A).
  • Figure 11a is a photograph and graph showing the results of Western blot analysis for the expression level of NMHC IIA expressed in HUVEC cells cultured in LSS or OSS state. As shown in Figure 11a, it was confirmed that the expression level of NMHC IIA is increased in HUVEC cells cultured in the OSS state rather than the LSS state.
  • HUVEC cells which are human vascular endothelial cells cultured for 48 hours in an LSS or OSS state
  • DAPI staining was performed on the nucleus (FIG. 11B).
  • Figure 11b is a photograph showing the results of immunofluorescence staining using anti-NMHC IIA antibody in HUVEC cells cultured in LSS or OSS state.
  • NMHC IIA was not clearly detected in HUVEC cells cultured in the LSS state, but in view of the Western blot analysis, NMHC IIA was expressed in the HUVEC cells cultured in the LSS state, but the expressed NMHC IIA was analyzed to be uniformly distributed in the cytoplasm. In contrast, it was confirmed that NMHC IIA was concentrated in the cell membrane region in HUVEC cells cultured in OSS.
  • NMHC IIA is expressed in HUVEC cells, but when the HUVEC cells are exposed to the vortex flow, the expression level of the NMHC IIA is increased, and the increased NMHC IIA is moved to the cell membrane region. .
  • NMHC IIA in the vascular endothelial cells exposed to the vortex flow, the expression level of NMHC IIA is increased, and thus the NMHC IIA with the increased expression level moves to the cell membrane and moves to the cell membrane.
  • NMHC IIA can bind to CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3), it was found that the CLIRRTSIC (SEQ ID NO: 3) can deliver biopolymers such as siRNA to vascular endothelial cells exposed to the vortex flow.

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Abstract

본 발명은 NMHC IIA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 심혈관계 질환 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 심혈관계 질환 진단용 키트, 심혈관계 질환의 진단방법 및 NMHC IIA에 결합할 수 있는 제제를 포함하는 약물 전달 복합체에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 NMHC IIA를 이용하면, 와류성 혈류에 의한 심혈관계 질환의 발병여부를 특이적으로 진단할 수 있으므로, 보다 효과적인 심혈관계 질환의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

ＭＮＨＣ ⅡＡ를 이용한 심혈관계 질환 진단 방법
본 발명은 NMHC IIA를 이용한 심혈관계 질환 진단 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 NMHC IIA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 심혈관계 질환 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 심혈관계 질환 진단용 키트, 심혈관계 질환의 진단 방법 및 NMHC IIA에 결합할 수 있는 제제를 포함하는 약물 전달 복합체에 관한 것이다.
동맥경화증은 고혈압, 비만 및 당뇨병 등 다양한 위험인자들에 의한 혈관손상에서 기인한 만성 염증성 질환으로 혈관벽이 좁아지거나 막히는 질환이다. 동맥경화증은 진행됨에 따라 뇌졸중, 심근경색, 사지 허혈성 괴사 등 주요 심혈관계 질환 유발의 주원인이기도 하다. 동맥경화증의 발생에는 혈관내피세포의 기능의 유지가 중요한데, 많은 연구결과로부터 혈관내피세포의 기능을 정상으로 유지하기 위해서는 정상적인 혈류흐름(Laminar flow)에 의한 적정수준의 혈류전단응력(Shear stress)이 유지되어야 한다는 연구결과들이 보고되고 있다. 정상적인 혈류흐름인 laminar flow는 혈관내피세포에서 항동맥경화 유전자의 발현을 증가시키는 반면, 비정상적인 혈류흐름인 와류성 혈류(disturbed flow)는 동맥경화증을 촉진하는 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 실제 임상에서도 동맥경화증은 와류성 혈류가 발생하는 동맥의 분지부위, 심하게 굽어지는 부분의 안쪽 부분에 주로 발생함이 보고되었다. 이들 연구결과는 비정상적인 와류성 혈류가 혈관내피세포의 기능이상을 유도하고 동맥경화증의 중요한 유발인자라는 점을 시사하므로, 혈관내피세포의 기능이상은 동맥경화증 발생 초기 단계의 마커로서 인식되고 있다.
최근, 비정상적인 와류성 혈류흐름을 유발시킨 동물모델로서 경동맥 부분결찰 모델이 확립되었는데, 상기 모델에서 부분 결찰된 좌측 경동맥(Left carotid artery, LCA)은 느린 와류성 혈류에 노출됨으로써 2주 이내에 동맥경화반이 형성되며, 이로부터 좌측 경동맥 부분결찰을 통해 발생한 비정상적인 와류성 혈류는 급성으로 혈관내피세포 기능이상을 유도하여 동맥경화증의 발생을 촉진할 수 있다는 점이 보고되었다.
이러한 동맥경화증을 효과적으로 진단하기 위한 기술을 개발하기 위하여 다양한 연구가 수행되고 있다. 예를 들어, 한국등록특허 제870233호에는 동맥경화 진단, 예방 및 치료용 펩타이드가 개시되어 있고, 국제공개특허 제2010-018870호에는 동맥 경화 병변의 검출의 정밀도를 더욱 향상시킬 수 있는 동맥 경화 진단용 폴리펩타이드 마커가 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2015-0028213호에는 기능이상(dysfunction) 혈관내피세포에 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 심혈관계 질환의 진단용 키트가 개시되어 있다. 그러나, 이들 동맥경화증을 진단하는데 사용되는 펩타이드는 구체적인 표적 단백질이 규명되지 않아서, 상기 펩타이드를 사용하여 동맥경화증의 발병을 진단한 경우, 진단성공여부를 확인하기 위하여는 별도의 생검이 필요하다는 단점이 있었다. 이에 따라, 동맥경화증이 유발되는 혈관내피세포에서 발현되는 마커 단백질을 규명하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 보고되지 않고 있다.
본 발명자들은 보다 효과적으로 동맥경화증을 진단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, NMHC IIA(non-muscle myosin heavy chain IIA, Myosin-9)가 비정상적인 와류성 혈류에 노출된 혈관내피세포에서 발현수준이 증가될 뿐만 아니라 세포질에서 세포막으로 이동함을 확인하므로, 상기 NMHC IIA를 동맥경화증을 포함하는 다양한 심혈관계 질환의 진단용 마커로서 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 혈관내피세포에서 NMHC IIA을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 심혈관계 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 심혈관계 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 심혈관계 질환의 진단방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 NMHC IIA에 결합할 수 있는 제제를 포함하는 약물 전달 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명에서 제공하는 NMHC IIA를 이용하면, 심혈관계 질환의 발병여부를 특이적으로 진단할 수 있으므로, 보다 효과적인 심혈관계 질환의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 경동맥 부분결찰 동물모델의 좌측 경동맥과 우측 경동맥의 혈관내피세포에서 발현되는 항염증 유전자인 eNOS와 KLF2의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 경동맥 부분결찰 동물모델의 좌측 경동맥과 우측 경동맥의 혈관내피세포에서 발현되는 염증유발 유전자인 VCAM-1과 ICAM-1의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 현미경사진 및 그래프이다.
도 1c는 경동맥 부분결찰 동물모델의 좌측 경동맥과 우측 경동맥에서 동맥경화반의 형성여부를 나타내는 현미경 사진이다.
도 2a는 좌측 경동맥(Left Carotid Artery, LCA)에서 얻어진 각 라운드별로 검출된 파지의 수와 우측 경동맥(Right Carotid Artery, RCA)에서 얻어진 각 라운드별로 검출된 파지의 수를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2b는 경동맥 부분결찰 동물모델의 각 장기에서 파지 디스플레이 패닝을 수행하고, 이로부터 얻어진 파지의 수를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 마우스 혈관내피세포인 iMAEC 세포를 대상으로 혈류전단응력에 의한 형태변화를 확인한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 3b는 마우스 혈관내피세포인 iMAEC 세포를 대상으로 혈류전단응력에 의한 염증관련 유전자의 발현수준 변화를 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3c는 사람의 혈관내피세포인 HUVEC 세포를 대상으로 혈류전단응력에 의한 형태변화를 확인한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 3d는 사람의 혈관내피세포인 HUVEC 세포를 대상으로 혈류전단응력에 의한 염증관련 유전자의 발현수준 변화를 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 4a는 마우스 혈관내피세포인 iMAEC 세포를 대상으로 6종 펩타이드의 결합수준을 확인한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 4b는 사람의 혈관내피세포인 HUVEC 세포를 대상으로 6종 펩타이드의 결합수준을 확인한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 4c는 마우스 혈관내피세포인 iMAEC 세포를 대상으로 6종 펩타이드의 결합수준을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4d는 사람의 혈관내피세포인 HUVEC 세포를 대상으로 6종 펩타이드의 결합수준을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 6종의 DESPs를 발현시키는 파지를 투여하고 면역염색을 통해 이들이 좌측 경동맥(LCA)과 우측 경동맥(RCA)에 대한 결합여부를 확인한 결과를 나타내는 형광사진이다.
도 5b는 혈관 내 결합된 파지의 내재화를 나타내는 것으로, 혈관의 표면 상에 결합된 파지(백색 화살표)를 공초점현미경으로 z 스택 이미지화(z stack imaging)에 의해 확인하였다(적색: 파지, 청색: 핵, 녹색: 혈관의 탄력층).
도 5c는 마우스에서 선발된 DESP-발현 파지의 생체분포를 나타낸 것으로, 조직 내 귀소 파지의 정량을 위해 경동맥을 비롯한 다양한 장기를 적출하고 파지 개수의 적정을 위해 균질화하였다. 막대는 3회의 개별 실험의 평균±SD로서 EC의 총 개수에 대한 결합된 파지의 비율을 나타내는 것이다. *는 간 및 비장을 제외한 다른 장기와 비교한 유의미한 차이를 나타낸다(p<0.05).
도 5d는 상기 좌측 경동맥(LCA)에 결합된 CLIRRTSIC(서열번호 3) 및 CPRRSHPIC(서열번호 9)를 발현시키는 각 파지가 다른 장기에 대하여도 결합할 수 있는지를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 대동맥 조직의 해부학적 영역을 나타내는 사진이다.
도 6b는 DESPs의 일종인 CLIRRTSIC(서열번호 3)와 CPRRSHPIC(서열번호 9)를 각각 발현시키는 파지가 대동맥 조직에 결합된 상태를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 6c는 대동맥의 branch 부위의 해부학적 영역을 나타내는 사진이다.
도 6d는 DESPs의 일종인 CPRRSHPIC(서열번호 9)와 CPRRSHPIC(서열번호 9)를 각각 발현시키는 파지가 대동맥의 branch 조직에 결합된 상태를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 7a는 분리된 인간 폐동맥의 전체 형태(상부)를 나타낸 것으로, 인간 폐동맥을 중심점에서 곧은(straight) L 부분과 가지를 갖는 R 부분으로 구분하였다(하부).
도 7b는 DESPs의 일종인 CLIRRTSIC(서열번호 3)를 발현시키는 파지가 폐동맥 조직에 결합된 상태를 나타내는 형광현미경 사진으로서, a는 와류성 혈류가 발생되는 영역을 나타내고, b는 정상혈류가 발생되는 영역을 나타내며, c는 branch 영역을 나타낸다.
도 7c는 DESPs의 일종인 CPRRSHPIC(서열번호 9)를 발현시키는 파지가 폐동맥 조직에 결합된 상태를 나타내는 형광현미경 사진으로서, a는 와류성 혈류가 발생되는 영역을 나타내고, b는 정상혈류가 발생되는 영역을 나타내며, c는 branch 영역을 나타낸다.
도 8은 사람 혈관내피세포인 HUVEC 세포에 있어서, LSS 또는 OSS 조건에 따른, DESPs의 일종인 CLIRRTSIC(서열번호 3) 또는 CPRRSHPIC(서열번호 9)의 결합수준을 비교한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 9a는 사람 혈관내피세포인 HUVEC 세포에 다양한 고분자 물질(BPEI-SS-PEG-siGLO)을 도입한 결과를 나타내는 형광현미경 사진으로서, siGLO는 음성 대조군을 나타내고, Lipofectamine-siGLO는 양성 대조군을 나타낸다.
도 9b는 경동맥 부분결찰 동물모델의 우측 경동맥(RCA)와 좌측 경동맥(LCA)에서 BPEI-SS-PEG 또는 BPEI-SS-PEG-siICAM1의 도입에 따른 ICAM1의 mRNA 수준변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10a는 HUVEC 세포에 바이오틴이 표지된 CLIRRTSIC의 처리여부에 따라, 발현수준이 변화된 단백질을 검출한 결과를 나타내는 사진, 그래프 및 도표이다.
도 10b는 HUVEC 세포에 대한 바이오틴이 표지된 CLIRRTSIC(서열번호 3)의 처리여부에 따라 발현수준이 변화된 6종 단백질을 질량분석하여 동정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10c은 바이오틴이 표지된 CLIRRTSIC(서열번호 3)를 이용하여 면역침강된 HUVEC 세포유래 단백질과 항-NMHC IIA 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 11a는 LSS 또는 OSS 상태에서 배양된 HUVEC 세포에서 발현된 NMHC IIA의 발현수준에 대한 웨스턴 블럿 분석결과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 11b는 LSS 또는 OSS 상태에서 배양된 HUVEC 세포를 대상으로 항-NMHC IIA 항체를 이용한 면역형광염색을 수행한 결과를 나타낸 사진이다.
본 발명자들은 와류성 혈류가 혈관내피세포의 이상에 의해 유발되는 각종 심혈관계 질환의 발병초기에 관여할 것으로 예상하고, 이를 반영하는 동물모델인 경동맥 부분결찰 동물모델을 제작하였으며, 상기 동물모델을 이용하여 기능이상(dysfunction) 혈관내피세포에 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 심혈관계 질환의 진단용 조성물, 상기 펩타이드 또는 조성물을 포함하는 심혈관계 질환의 진단용 키트 및 이의 진단 방법, 상기 펩타이드를 포함하는 약물 전달 복합체, 및 이를 이용한 심혈관계 질환의 예방 또는 치료 방법을 개발하였다(한국공개특허 제2015-0028213호). 그러나, 상기 펩타이드가 기능이상 혈관내피세포에 결합할 때, 상기 펩타이드가 실제적으로 결합하는 표적 단백질에 대하여는 확인하지 못하였으므로, 상기 펩타이드에 결합할 수 있는 표적단백질을 규명하였다. 그 결과, 와류성 혈류에 노출된 혈관내피세포에서는 NMHC IIA(non-muscle myosin heavy chain IIA, Myosin-9)의 발현수준이 증가하고, 이처럼 발현수준이 증가된 NMHC IIA는 세포막으로 이동하여 상기 펩타이드와 결합함을 확인하였다.
따라서, 혈관내피세포에서 NMHC IIA를 검출할 수 있는 제제를 사용할 경우, 심혈관계 질환의 발병을 조기에 진단할 수 있음을 알 수 있었다. 상기 NMHC IIA와 심혈관계 질환의 발병간의 상관관계는 지금까지 전혀 알려져 있지 않고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 NMHC IIA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 심혈관계 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "NMHC IIA(non-muscle myosin heavy chain IIA)"란, 마이오신 9(Myosin-9)이라고도 하고, MYH9 유전자에 의하여 발현되는 단백질을 의미한다. 상기 NMHC IIA는 다양한 질환의 진단마커로서 사용되고 있는데, 예를 들어 대장암의 간전이 진단용 마커, 성 폐쇄성 폐질환(COPD)의 급성 악화 진단용 마커 등으로 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, PRRS 바이러스의 감염을 억제하여, 상기 PRRS 바이러스의 감염억제제의 유효성분으로도 사용될 수 있다. 상기 NMHC IIA를 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_002473, NP_002464 등). 예를 들어, 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 42의 아미노산 서열로 구성된 NMHC IIA를 와류성 혈류에 노출된 혈관내피세포에서 검출하였다.
본 발명의 용어 "심혈관계 질환"이란, 생체 내 순환계 시스템의 이상, 기능장애, 손상 등의 다양한 원인으로 인하여 발생되는 직접적인 질환뿐만 아니라, 이러한 직접적인 질환에 의해 파생되는 2차적 질환을 포함하는 것을 포괄적으로 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 심혈관계 질환은 상기 정의된 광범위한 심혈관계 질환 중에서도 기능이상 혈관내피세포에 의해 유발되는 질환을 의미하는 것으로 해석될 수 있는데, 일 예로서, 고지혈증, 고혈압, 동맥경화증, 심장관상동맥 협착증, 협심증, 말초동맥 협착증, 허혈성동맥질환, 동맥경화성 뇌혈관질환 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 동맥경화증이 될 수 있는데, 상기 심혈관계 질환은 혈관내피세포에서 본 발명에서 제공하는 NMHC IIA를 검출함에 의하여 그의 발병여부를 진단할 수 있다.
본 발명의 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 심혈관계 질환의 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "NMHC IIA의 수준을 측정하는 제제"란, 혈관내피세포에서 발현되는 NMHC IIA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 일 예로서 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩 분석법(protein chip assay) 등의 방법에 사용되는 항체 또는 앱타머가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 NMHC IIA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 일 예로서, NMHC IIA에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란, 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는데, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있다. 상기 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 링커의 작용기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 -NH2로 변형시킴으로써 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 앱타머는 NMHC IIA에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머가 될 수 있고, 일 예로서, 상기 NMHC IIA에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머가 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 와류성 혈류에 노출된 혈관내피세포에서 발현되어 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 DESP가 결합할 수 있는 표적 단백질을 규명하기 위하여, HUVEC 세포에 상기 DESP의 처리여부에 따라 발현수준이 변화되는 6종의 단백질을 발굴하고(도 10a), 이들 단백질을 질량분석을 통해 동정한 결과, 상기 6종의 단백질 중 5종이 NMHC IIA(non-muscle myosin heavy chain IIA, Myosin-9)임을 확인하였으며(도 10b), 상기 DESP가 NMHC IIA와 결합할 수 있는지를 웨스턴 블럿 분석을 통해 확인하였다(도 10c). 이어, 상기 NMHC IIA가 와류성 혈류에 의해 발현수준이 변화되는지를 확인한 결과, 웨스턴 블럿 분석을 통해 혈관내피세포가 와류성 혈류에 노출될 경우 그의 발현수준이 증가하고(도 11b), 세포질로부터 세포막으로 이동함을 확인하였다(도 11b).
따라서, 와류성 혈류에 노출된 혈관내피세포에서는 NMHC IIA의 발현수준이 증가하고, 이처럼 발현수준이 증가된 NMHC IIA는 세포막으로 이동하며, 상기 세포막으로 이동한 NMHC IIA는 CLIRRTSIC(서열번호 3)와 결합할 수 있고, 상기 CLIRRTSIC(서열번호 3)는 siRNA와 같은 생체고분자 물질을 상기 와류성 혈류에 노출된 혈관내피세포로 전달할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명은 다른 양태로서, 상기 심혈관계 질환 진단용 조성물을 포함하는 심혈관계 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 심혈관계 질환의 발병이 우려되는 개체에서 유래된 혈관내피세포로부터 시료로부터 NMHC IIA의 수준의 수준을 측정하여 심혈관계 질환의 발병여부를 진단하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 단백질의 수준을 측정하기 위한 항체, 앱타머 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다.
본 발명의 용어 "시료"란, 심혈관계 질환이 발병된 개체에서 분리되어 NMHC IIA의 발현수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미하고, 일 예로서 심혈관계 질환이 발병된 환자의 혈관내피세포 또는 상기 혈관내피세포를 포함하는 혈액, 조직시료 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"란 심혈관계 질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
구체적인 일 예로서, 본 발명의 키트는 NMHC IIA의 수준을 측정하기 위한 ELISA 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, NMHC IIA의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
다른 예로서, 본 발명의 키트는 음성 및 양성 대조군 반응을 수행하는데 필요한 시약 또는 혼성화 반응에 필요한 완충액과 같은 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 이용되는 시약의 최적량은 본 명세서의 내용을 파악한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 분리된 패키지 또는 컴파트먼트에 상술한 성분들을 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태로서, 생물학적 시료로부터 NMHC IIA의 발현수준을 측정하거나 또는 세포내 위치를 확인하여 심혈관계 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
일 예로서, 본 발명에서 제공하는 심혈관계질환의 진단방법은 (a) 검사대상 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 NMHC IIA(non-muscle myosin heavy chain IIA)의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 NMHC IIA의 발현수준을 정상 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 측정된 발현수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 생물학적 시료에서 측정된 NMHC IIA의 수준이 정상 개체의 생물학적 시료로부터 측정된 수준과 비교하여 유의하게 증가하는 경우에는 상기 검사대상 개체에서 심혈관계 질환이 발병하였다고 판정할 수 있고, 유의하게 증가하지 않은 경우에는 상기 개체에서 심혈관계 질환이 발병하지 않았다고 판정할 수 있다. 이때, 상기 생물학적 시료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 혈관내피세포, 혈관내피세포를 포함하는 혈액, 혈관내피세포를 포함하는 조직 등이 될 수 있고, 상기 NMHC IIA의 수준을 측정하는 방법은 상술한 바와 동일하다.
다른 예로서, 본 발명에서 제공하는 심혈관계질환의 진단방법은 검사대상 개체의 생물학적 시료로부터 NMHC IIA가 세포막에 존재하는지의 여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
이때, 상기 생물학적 시료는 상술한 바와 동일하고, 상기 NMHC IIA가 세포막에 존재하는지의 여부를 확인하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 항-NMHC IIA 항체를 이용한 면역형광염색법 등을 사용할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 검사대상 개체로부터 유래된 생물학적 시료의 세포막 부위에 NMHC IIA가 존재하는 것으로 확인된 경우에는 상기 검사대상 개체에서 심혈관계 질환이 발병하였다고 판정할 수 있고, 상기 세포막 부위에 NMHC IIA가 존재하지 않는 것으로 확인된 경우에는 상기 검사대상 개체에서 심혈관계 질환이 발병하지 않았다고 판정할 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태로서, NMHC IIA(non-muscle myosin heavy chain IIA)에 결합할 수 있는 제제와 약물을 포함하는 심혈관계질환 치료용 약물 전달체를 제공한다.
본 발명의 용어 "NMHC IIA에 결합할 수 있는 제제"란, 혈관내피세포에서 발현되는 NMHC IIA에 특이적으로 결합할 수 있는 제제를 의미하는데, 일 예로서 펩타이드, 항체 또는 앱타머가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "약물 전달체"란, 상기 NMHC IIA에 결합할 수 있는 제제와 심혈관계 질환의 발병원인이 되는 NMHC IIA가 발현된 세포 또는 조직에 전달하고자 하는 약물이 결합되어, 상기 NMHC IIA이 발현된 조직 또는 세포로 상기 약물을 전달할 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 약물 전달체는 심혈관계 질환을 치료하는 용도로 사용될 수 있는데, 상기 심혈관계 질환은 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 용어 "약물"이란, 상기 NMHC IIA에 결합할 수 있는 제제를 통해 상기 NMHC IIA이 발현되는 세포 또는 조직으로 전달될 수 있는 심혈관계질환에 대한 치료학적 효과를 갖는 물질을 의미한다. 상기 약물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 심혈관계 질환의 예방 또는 치료효과를 나타내는 유효성분으로서 각종 심혈관계 질환 특이적인 치료제일 수 있고, 다른 예로서 심혈관계 질환의 예방 또는 치료효과를 나타내는 화합물, 펩타이드, 단백질, 핵산 또는 이들의 조합이 될 수 있으며, 또 다른 예로서 동맥경화증을 촉진하는 인자로 알려진 대표적인 세포접착분자인 VCAM-1 또는 ICAM-1의 발현을 특이적으로 억제하는 효과를 나타내는 RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), 앱타머, 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme), 디엔에이자임(DNAzyme), microRNA 또는 이들의 조합인 핵산이 될 수 있다.
한편, 본 발명에서 제공하는 약물 전달체는 상기 NMHC IIA에 결합할 수 있는 제제와 약물을 효과적으로 결합시킬 수 있는 비펩타이드성 고분자 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "비펩타이드성 고분자 물질"이란, 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체적합성 고분자 물질을 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩티드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결될 수 있고, 이들의 분자량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 1 내지 100 kDa이 될 수 있고, 다른 예로서 1 내지 20 kDa이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 비펩타이드성 고분자 물질은 상기 NMHC IIA에 결합할 수 있는 제제와 약물에 각각 결합하여, 상기 NMHC IIA에 결합할 수 있는 제제와 약물이 직접적으로 결합할 수 없는 경우에도, 상기 약물 전달체를 형성할 수 있도록 하는 역할을 수행하는데, 이를 위하여 상기 비펩타이드성 고분자 물질은 NMHC IIA에 결합할 수 있는 제제 및 약물과 각각 결합될 수 있는 반응기를 포함할 수 있다. 상기 비펩타이드성 고분자 물질에 포함된 반응기는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 알데히드기, 프로피온알데히드기, 부틸알데히드기, 말레이미드(maleimide)기, 석시니미드(succinimide) 등이 될 수 있고, 특히, 상기 반응기가 알데히드기인 경우에는 비특이적 반응을 최소화하여 상기 비펩타이드성 고분자 물질이 보다 효과적으로 NMHC IIA에 결합할 수 있는 제제와 약물에 결합할 수 있다. 또한, 상기 반응기는 비펩타이드성 고분자 물질에 한 종류가 단독으로 포함되거나 또는 다양한 종류가 복합적으로 포함될 수 있는데, 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드기를, 다른 쪽 말단에는 알데히드기, 프로피온알데히드기 또는 부틸알데히드기를 가질 수도 있고, 양쪽 말단에 히드록시기를 동일하게 포함할 수도 있다.
상기 반응기를 포함하는 비펩타이드성 고분자 물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질중합체, 키틴류, 히아루론산 등이 될 수 있고, 다른 예로서 폴리에틸렌글리콜이 될 수 있다. 뿐만 아니라, 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 서열번호 3 또는 9의 아미노산 서열을 갖는 DESPs가 와류성 혈류조건에서 배양된 HUVEC 세포에 특이적으로 결합하고(도 8), 이 중에서도 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 DESP가 siRNA와 결합된 복합체는 와류성 혈류 조건에서 배양된 HUVEC 세포에 상기 siRNA를 특이적으로 전달할 수 있으며(도 9a), 경동맥 부분결찰 동물모델의 혈관내피세포로 상기 siRNA를 전달할 수 있음을 확인하였다(도 9b).
상기 결과로부터, 본 발명에서 제공하는 NMHC IIA에 결합할 수 있는 제제가 와류성 혈류에 의하여 영향을 받은 혈관내피세포로의 약물 또는 유전자 전달을 위한 전달체가 될 수 있으며, 따라서 초기 동맥경화증 병소의 기능이상 혈관내피세포로 목적하는 약물 또는 유전자의 특이적 국소 전달에 유용할 수 있음을 알 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 기능이상 혈관내피세포에 특이적인 펩타이드의 발굴
혈류전단응력을 변화시킨 동물모델로서 경동맥 부분결찰 동물모델을 사용하여 혈류전단응력을 제공하는 와류성 혈류에 의해 유도되는 기능이상 혈관내피세포에 특이적으로 결합하여 상기 기능이상 혈관내피세포를 검출할 수 있는 새로운 펩타이드를 발굴하고자 하였다.
실시예 1-1: 경동맥 부분결찰 동물모델의 제작
6주령의 수컷 C57BL/6 마우스의 좌측 경동맥(Left carotid artery, LCA)의 가지 중에서 상갑상샘동맥(superior thyroid artery)을 제외한 나머지 동맥혈관들을 결찰하여, 경동맥 부분결찰 동물모델을 제작하였다. 상기 제작된 동물모델은 결찰된 좌측 경동맥이 급격하게 느린 와류성 혈류에 노출되어 혈관내피세포의 기능이상이 유발되고, 2주 이내에 급성으로 동맥경화증이 유발됨을 확인하였다.
이어, 상기 마우스의 좌측 경동맥(LCA) 및 우측 경동맥(RCA)의 각 혈관내피세포로부터 각각의 RNA를 분리하여 항염증 유전자인 eNOS와 KLF2의 발현수준을 RT-PCR을 통해 분석하였다(도 1a).
도 1a는 경동맥 부분결찰 동물모델의 좌측 경동맥과 우측 경동맥의 혈관내피세포에서 발현되는 항염증 유전자인 eNOS와 KLF2의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1a에서 보듯이, 항염증 유전자는 정상 혈관인 RCA에 비하여 부분결찰된 LCA에서 매우 낮은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
또한, 상기 마우스의 좌측 경동맥(LCA) 및 우측 경동맥(RCA)의 각 혈관내피세포로부터 각각의 RNA를 분리하여 염증유발 유전자인 VCAM-1과 ICAM-1의 발현수준을 분석하였다(도 1b).
도 1b는 경동맥 부분결찰 동물모델의 좌측 경동맥과 우측 경동맥의 혈관내피세포에서 발현되는 염증유발 유전자인 VCAM-1과 ICAM-1의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 현미경사진 및 그래프이다. 도 1b에서 보듯이, 염증유발 유전자는 정상 혈관인 RCA에 비하여 부분결찰된 LCA에서 매우 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
끝으로, 상기 마우스의 좌측 경동맥(LCA) 및 우측 경동맥(RCA)에서 동맥경화반의 형성여부를 확인하였다(도 1c).
도 1c는 경동맥 부분결찰 동물모델의 좌측 경동맥과 우측 경동맥에서 동맥경화반의 형성여부를 나타내는 현미경 사진이다. 도 1c에서 보듯이, 정상 혈관인 RCA에서는 동맥경화반이 형성되지 않았으나, 부분결찰된 LCA에서는 동맥경화반이 형성됨을 확인하였다.
따라서, 상기 제작된 경동맥 부분결찰 동물모델은 동맥경화 동물모델로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 1-2: 파지 디스플레이 패닝
Ph.D-C7C phage display peptide library kit(New England Biolabs, Inc.)를 사용하여 파지 디스플레이 패닝을 수행하였다.
상기 실시예 1-1에서 제작된 경동맥 부분결찰 동물모델을 대상으로, 경동맥 부분 결찰 3일 후에 마우스의 꼬리 정맥에 1 x 1011pfu의 파지를 주사하고, 10분간 생체내 패닝을 수행하였다. 이어, 상기 동물모델을 마취시키고, 생리식염수를 주사하여 결합되지 않은 파지를 제거하였다. 산성의 파지 용출액을 가하여 경동맥의 혈관내피세포에 결합된 파지를 분리시키고, 분리된 파지를 대장균에 감염시킨 다음, 파지수를 계수하고, 증폭시켜서 1라운드를 완료하고, 이를 3회 반복하여 총 3라운드를 수행하였다(도 2a).
도 2a는 좌측 경동맥(Left Carotid Artery, LCA)에서 얻어진 각 라운드별로 검출된 파지의 수와 우측 경동맥(Right Carotid Artery, RCA)에서 얻어진 각 라운드별로 검출된 파지의 수를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2a에서 보듯이, 부분결찰이 수행된 좌측 경동맥(LCA)에서 파지 디스플레이 패닝을 수행하여 얻어진 파지의 수는 3라운드를 거친 후에 급격히 증가하였으나, 부분결찰이 수행되지 않은 우측 경동맥(RCA)에서 파지 디스플레이 패닝을 수행하여 얻어진 파지의 수는 별다른 변화를 나타내지 않음을 확인하였다.
한편, 상기 경동맥 부분결찰 동물모델의 각 장기(간, 비장, 심장, 폐, 신장, 뇌, 근육, LCA 또는 RCA)를 대상으로, 파지 디스플레이 패닝을 수행하고, 그 결과를 비교하였다(도 2b).
도 2b는 경동맥 부분결찰 동물모델의 각 장기에서 파지 디스플레이 패닝을 수행하고, 이로부터 얻어진 파지의 수를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2b에서 보듯이, 다수의 내피세포를 포함하는 세망내피계에 속하는 간과 비장을 제외한 장기 중에서, LCA에서 가장 높은 수준의 파지가 검출됨을 확인하였다.
상기 패닝을 수행하여 수득한 파지를 대장균에 감염시키고, 감염된 대장균을 LB/IPTG/X-gal 고형배지에 접종 및 배양하여 푸른색 콜로니를 수득하였다. 상기 수득한 콜로니를 배양하고 이로부터 파지 DNA를 수득한 다음, 수득한 파지 DNA의 서열을 결정하여 이로부터 발현되는 펩타이드의 아미노산 서열을 확인하였다. 결정된 서열을 비교하여, 부분 결찰한 좌측 경동맥에만 존재하거나 우측 경동맥에 비해 좌측 경동맥에 더 많이 존재하는 펩타이드를 선별하였다(표 1).
마우스모델의 LCA와 RCA에서 측정된 펩타이드의 빈도
서열번호 펩타이드 LCA RCA 서열번호 펩타이드 LCA RCA
1 CKMTRSTIC 29 22 21 CRTKLRKLC 1
2 CKIMISISC 19 30 22 CHMQIMHRC 1
3 CLIRRTSIC 8 2 23 CTRMMLRIC 1
4 CPLLTKLKC 8 4 24 CTPRQTRMC 1
5 CTHRRSTPC 7 5 25 CMLNITRRC 1
6 CHIPSIHSC 8 8 26 CRKLPRISC 1
7 CQMMLIRRC 4 4 27 CPLQPKSIC 1
8 CNLLLRTQC 5 1 28 CPIRHRPIC 1
9 CPRRSHPIC 4 29 CRTMRIRLC 1
10 CLHPPLTLC 6 2 30 CMRQRRNRC 2
11 CKMNIRLSC 2 31 CPRRRLKRC 1
12 CILRKIRPC 4 4 32 CHQLPIRPC 1
13 CSRRPTSIC 1 1 33 CPIKTTITC 1
14 CLIRLILQC 1 2 34 CRRQTSTHC 1
15 CRMRKTLRC 1 1 35 CNPMTRLIC 2
16 CQPHHSIIC 1 1 36 CPIRHRPIC 1
17 CSTHIPSHC 1 1 37 CTLHKSRSC 1
18 CILRRRKRC 1 1 38 CTRIISNTC 1
19 CSIRIHRRC 1 39 CKLINTLKC 1
20 CSLRRHPIC 1 40 CQMTRSTIC 1
상기 표 1에서 보듯이, LCA 에서만 높은 수준으로 존재하거나, RCA에 비하여 LCA에서 현저하게 수준이 증가되는 펩타이드를 검출한 결과, 서열번호 3, 4, 5, 8, 9 또는 10의 펩타이드가 LCA 에서만 높은 수준으로 존재하거나, RCA에 비하여 LCA에서 현저하게 수준이 증가되는 펩타이드임을 확인하였다.
실시예 1-3: 발굴된 펩타이드가 기능이상 혈관내피세포에 미치는 효과 검증
상기 실시예 1-2에서 발굴된 6종의 펩타이드가 기능이상 혈관내피세포에 대해 특이성을 나타내는지의 여부를, 혈관내피세포의 일종인 iMAEC 및 HUVEC를 사용하여 확인하고자 하였다.
먼저, 마우스 동맥 내피세포인 iMAEC를 DMEM 배지(10% FBS, 50 g/ml ECGS(endothelial cell growth supplement) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 접종하고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다.
또한, 사람 제대정맥 내피세포인 HUVEC를 Medium 200 배지(5% FBS 및 LSGS(low-serum growth))에 접종하고, 37℃ 및 5% C02 조건에서 배양하였다.
상기 포화배양된 iMAEC 및 HUVEC에 cone and plate viscometer를 사용하여 혈류전단응력을 가하였다. 이때, 혈류전단응력은 정상 혈류와 유사한 LSS(laminar shear stress)를 25 dyne/㎠로 가하거나 또는 비정상 혈류와 유사한 OSS(oscillatory shear stress)를 ±5 dyne/㎠로 가하는 조건하에서 48시간 동안 처리하고, 이에 의하여 혈관내피세포가 받는 영향을 분석하였다(도 3a 내지 3d).
도 3a는 마우스 혈관내피세포인 iMAEC 세포를 대상으로 혈류전단응력에 의한 형태변화를 확인한 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 3a에서 보듯이, 정상적인 혈류흐름인 LSS 상태에서 혈관내피세포는 전단응력 흐름의 방향과 같은 방향으로 형태가 길어지는 것을 관찰할 수 있었지만, 비정상적인 OSS 상태에서는 불규칙한 방향성을 나타내었다.
도 3b는 마우스 혈관내피세포인 iMAEC 세포를 대상으로 혈류전단응력에 의한 염증관련 유전자의 발현수준 변화를 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 도 3b에서 보듯이, LSS 상태에서는 eNOS와 KLF2와 같은 항염증 유전자의 발현이 증가하는 반면, OSS 상태에서는 VCAM1, ICAM1, MCP1과 같은 염증유발 유전자의 발현이 증가됨을 확인하였다.
도 3c는 사람의 혈관내피세포인 HUVEC 세포를 대상으로 혈류전단응력에 의한 형태변화를 확인한 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 3c에서 보듯이, 마우스 동맥 내피세포인 iMAEC 에서 확인된 것과 동일하게, 정상적인 혈류흐름인 LSS 상태에서 혈관내피세포는 전단응력 흐름의 방향과 같은 방향으로 형태가 길어지는 것을 관찰할 수 있었지만, 비정상적인 OSS 상태에서는 불규칙한 방향성을 나타내었다.
도 3d는 사람의 혈관내피세포인 HUVEC 세포를 대상으로 혈류전단응력에 의한 염증관련 유전자의 발현수준 변화를 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 도 3d에서 보듯이, 마우스 동맥 내피세포인 iMAEC 에서 확인된 것과 동일하게, LSS 상태에서는 eNOS와 KLF2와 같은 항염증 유전자의 발현이 증가하는 반면, OSS 상태에서는 VCAM1, ICAM1, MCP1과 같은 염증유발 유전자의 발현이 증가됨을 확인하였다.
한편, 상기 배양된 2종의 세포에, 상기 실시예 1-2에서 발굴된 6종의 펩타이드 각각을 발현하는 파지를 6 x 106 pfu씩 가하여 1시간 동안 반응시킨 다음, PBS로 세척하여 결합하지 않은 파지를 제거하였다. 이어, 상기 각 내피세포를 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정시키고, PBS로 세척하였으며, 0.2% Triton-X가 포함된 PBS를 20분 동안 가하여 천공시키고, 다시 PBS로 세척하였다. 그런 다음, 10% 당나귀 혈청 용액을 가하고 1시간 동안 블로킹시켰으며, M13 박테리오파지에 대한 1차항체를 가한 다음 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰으며, PBS로 세척하였다. 이어, 2차항체인 당나귀의 항-마우스 IgG 항체-FITC를 가하고 30분간 실온에서 반응시켰으며, DAPI로 대조염색을 실시하였다. 끝으로, 공초점 현미경을 사용하여 전단응력이 가하여 지지 않은 안정상태, LSS 또는 OSS 상태에서 배양된 혈관내피세포에 대한 파지의 결합수준을 비교하였다(도 4a 내지 4d).
도 4a는 마우스 혈관내피세포인 iMAEC 세포를 대상으로 6종 펩타이드의 결합수준을 확인한 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 4a에서 보듯이, 상기 iMAEC 세포에는 CLIRRTSIC(서열번호 3), CNLLLRTQC(서열번호 8) 및 CPRRSHPIC(서열번호 9)를 발현시키는 파지가 LSS에 비해 OSS 상태에서 현저하게 그 결합이 증가됨을 확인하였다.
도 4b는 사람의 혈관내피세포인 HUVEC 세포를 대상으로 6종 펩타이드의 결합수준을 확인한 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 4b에서 보듯이, 상기 HUVEC 세포에는 CLIRRTSIC(서열번호 3), CNLLLRTQC(서열번호 8), CPRRSHPIC(서열번호 9) 및 CLHPPLTLC(서열번호 10)를 발현시키는 파지가 LSS에 비해 OSS 상태에서 현저하게 그 결합이 증가됨을 확인하였다.
도 4c는 마우스 혈관내피세포인 iMAEC 세포를 대상으로 6종 펩타이드의 결합수준을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4c에서 보듯이, 정도의 차이는 있으나, 상기 6종의 펩타이드를 발현시키는 파지는 LSS에 비해 OSS 상태에서 현저하게 그 결합이 증가됨을 확인하였다.
도 4d는 사람의 혈관내피세포인 HUVEC 세포를 대상으로 6종 펩타이드의 결합수준을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4d에서 보듯이, 정도의 차이는 있으나, 상기 6종의 펩타이드를 발현시키는 파지는 LSS에 비해 OSS 상태에서 현저하게 그 결합이 증가됨을 확인하였다.
따라서, 상기 결과를 종합하면, 상기 발굴된 6종의 펩타이드는 기능이상 혈관내피세포에 특이적인 펩타이드(Dysfunctional Endothelial cells-Specific Peptides, DESPs)임을 알 수 있었다.
실시예 1-4: 경동맥 부분결찰 동물모델을 이용한 DESPs의 효과검증
경동맥 부분결찰 동물모델의 혈관에 상기 6종의 DESPs를 발현시키는 파지를 투여하고, 10 U/㎖의 헤파린을 포함하는 생리식염수로 체내를 세척하였으며, 4% 파리포름알데히드 용액으로 고정시킨 다음, 생리식염수로 다시 세척하고, 좌측 경동맥(LCA), 우측 경동맥(RCA) 및 대동맥을 적출하였으며, 적출된 조직을 PBS로 세척하였다. 상기 세척된 조직을 대상으로 하고, 2차 항체로서 당나귀의 항-마우스 IgG-R 항체를 사용하며, 2차 항체를 2시간 동안 반응시키는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-3과 동일한 방식으로 면역염색하였다. 공초점 현미경을 사용하여 부분 결찰된 좌측 경동맥, 결찰되지 않은 우측 경동맥 및 대동맥의 혈관내피세포에 대한 파지의 결합수준을 비교하였다(도 5a 내지 5d).
도 5a는 6종의 DESPs를 발현시키는 파지를 투여하고 면역염색을 통해 이들이 좌측 경동맥(LCA)과 우측 경동맥(RCA)에 대한 결합여부를 확인한 결과를 나타내는 형광사진이다. 도 5a에서 보듯이, CLIRRTSIC(서열번호 3) 및 CPRRSHPIC(서열번호 9)를 발현시키는 각 파지는 부분결찰된 LCA에 특이적으로 결합하는 반면, 정상적인 RCA에는 결합하지 않음을 확인하였다.
도 5b는 혈관 내 결합된 파지의 내재화를 나타내는 것으로, 혈관의 표면 상에 결합된 파지(백색 화살표)를 공초점현미경으로 z 스택 이미지화(z stack imaging)에 의해 확인하였고(적색: 파지, 청색: 핵, 녹색: 혈관의 탄력층), 도 5c는 마우스에서 선발된 DESP-발현 파지의 생체분포를 나타낸 것으로, 조직 내 귀소 파지의 정량을 위해 경동맥을 비롯한 다양한 장기를 적출하고 파지 개수의 적정을 위해 균질화하였다. 막대는 3회의 개별 실험의 평균±SD로서 EC의 총 개수에 대한 결합된 파지의 비율을 나타내는 것이다. *는 간 및 비장을 제외한 다른 장기와 비교한 유의미한 차이를 나타낸다(p<0.05). 도 5b 및 5c에서 보듯이, 상기 좌측 경동맥(LCA)에 결합된 파지는 혈관의 표면에 결합되어 있음을 확인하였다.
도 5d는 상기 좌측 경동맥(LCA)에 결합된 CLIRRTSIC(서열번호 3) 및 CPRRSHPIC(서열번호 9)를 발현시키는 각 파지가 다른 장기에 대하여도 결합할 수 있는지를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5d에서 보듯이, 세망내피계에 속하는 간과 비장을 제외한 장기 중에서, LCA에서 가장 높은 수준의 파지가 검출됨을 확인하였다.
실시예 1-5: 대동맥 조직을 이용한 DESPs의 효과검증
상기 경동맥 부분결찰 동맥경화증 동물모델은 인위적으로 와류성 혈류를 유도하여 만든 급성 모델이기 때문에, 해부/생리학적으로 항상 다양한 혈류전단응력에 노출되어 있는 대동맥 조직을 대상으로 상기 DESPs가 결합되는 부위를 확인하고자 하였다. 일반적으로, 대동맥 조직은 크게 branch, GC(Greater curvature), LC(Lesser curvature) 및 TA(Thoracic aorta)의 영역으로 구분되는데, 상기 branch와 LC 영역에서는 와류성 혈류가 발생하고, GC와 TA 영역에서는 정상적인 혈류가 발생한다고 알려져 있다(도 6a). 도 6a는 대동맥 조직의 해부학적 영역을 나타내는 사진이다.
먼저, 상기 경동맥 부분결찰 동맥경화증 동물모델에서 대동맥을 적출하고, 상기 적출된 대동맥의 각 부위에 3 x 1011 pfu의 DESP를 발현하는 파지를 가하여 37℃에서 3시간동안 반응시킨 다음, 세척하여 결합되지 않은 파지를 제거하였다. 이어, 상기 대동맥을 대상으로 하고, 2차 항체로서 항-마우스 IgG-R 항체를 사용하며, 2차 항체를 2시간 동안 반응시키는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-3과 동일한 방식으로 면역염색하였다. 형광현미경을 사용하여 대동맥 조직에 대한 파지의 결합수준을 비교하였다(도 6b 내지 6d).
도 6b는 DESPs의 일종인 CLIRRTSIC(서열번호 3)와 CPRRSHPIC(서열번호 9)를 각각 발현시키는 파지가 대동맥 조직에 결합된 상태를 나타내는 형광현미경 사진으로서, 본 발명에서 제공하는 6종의 DESPs 중에서 CLIRRTSIC(서열번호 3) 및 CPRRSHPIC(서열번호 9)가 대동맥 조직에 결합되고, 상기 대동맥 조직 중에서도 와류성 혈류가 발생하는 LC 영역에 결합됨을 확인하였다.
또한, 대동맥 조직에서 와류성 혈류가 발생하는 branch 영역은 branch orifice에서 가까운 부위(Near Areas (NA) of orifice of branch vessels)를 NA-1과 NA-2로, 먼 부위(Distant area)를 DA)로 구분하였는데, 상기의 NA-1과 NA-II는 와류성 혈류가 발생하고, DA 영역에서는 정상적인 혈류가 발생한다고 알려져 있다(도 6c). 도 6c는 대동맥의 branch 부분의 해부학적 영역을 나타내는 사진이다.
도 6d는 DESPs의 일종인 CLIRRTSIC(서열번호 3)와 CPRRSHPIC(서열번호 9)를 각각 발현시키는 파지가 대동맥 조직의 branch 영역에 결합된 상태를 나타내는 형광현미경 사진으로서, 본 발명에서 제공하는 6종의 DESPs 중에서 CLIRRTSIC(서열번호 3) 및 CPRRSHPIC(서열번호 9)가 대동맥의 branch 영역 중에서도 와류성 혈류가 발생하는 NA-1과 NA-II 영역에 결합됨을 확인하였다.
따라서, 상기 2종의 DESPs는 와류성 혈류에 의해 유도되는 기능이상 혈관내피세포에 특이적으로 결합할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 1-6: DESPs가 결합되는 동맥내 위치 확인
상기 실시예 1-5의 결과로부터, 2종의 DESPs를 발현시키는 파지가 대동맥 조직 중에서도 와류성 혈류가 발생하는 LC와 branch 영역에 결합됨을 확인하였으므로, 상기 인간의 폐동맥을 대상으로 하여 정상혈류(LSS)와 와류성 혈류(OSS)가 발생하는 부위에 대한 상기 2종의 DESPs를 발현시키는 파지의 결합특이성을 확인하고자 하였다.
이를 위하여 사람의 폐동맥을 중심점에서 곧은(straight) L 부분과 가지를 갖는 R 부분으로 구분하였다(도 7a). 도 7a는 분리된 사람의 폐동맥의 형태(상부)를 나타낸 것으로, 인간 폐동맥을 중심점에서 곧은(straight) L 부분과 가지를 갖는 R 부분으로 구분하였다(하부).
구체적으로, 폐절제술을 받은 환자로부터 적출된 사람의 폐동맥으로부터 동결절편을 수득하고, 수득한 동결절편에 3 x 1011 pfu의 DESP를 발현하는 파지를 가하여 37℃에서 3시간동안 반응시킨 다음, 세척하여 결합되지 않은 파지를 제거하였다. 이어, 상기 동결절편을 대상으로 하고, 2차 항체로서 항-마우스 IgG-R 항체를 사용하며, 2차 항체를 2시간 동안 반응시키는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-3과 동일한 방식으로 면역염색하였다. 형광현미경을 사용하여 인간의 대동맥 조직에 대한 파지의 결합수준을 비교하였다(도 7b 및 7c).
도 7b는 DESPs의 일종인 CLIRRTSIC(서열번호 3)를 발현시키는 파지가 폐동맥 조직에 결합된 상태를 나타내는 형광현미경 사진으로서, a는 와류성 혈류가 발생되는 영역을 나타내고, b는 정상혈류가 발생되는 영역을 나타내며, c는 branch 영역을 나타낸다.
도 7c는 DESPs의 일종인 CPRRSHPIC(서열번호 9)를 발현시키는 파지가 폐동맥 조직에 결합된 상태를 나타내는 형광현미경 사진으로서, a는 와류성 혈류가 발생되는 영역을 나타내고, b는 정상혈류가 발생되는 영역을 나타내며, c는 branch 영역을 나타낸다.
도 7b 및 7c에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 6종의 DESPs 중에서 CLIRRTSIC(서열번호 3) 및 CPRRSHPIC(서열번호 9)가 사람의 폐동맥 조직에 결합되고, 상기 폐동맥 조직 중에서도 와류성 혈류가 발생하는 영역과 branch 영역에 결합됨을 확인하였다.
따라서, 상기 2종의 DESPs는 마우스의 혈관내피세포 뿐만 아니라 사람의 혈관내피세포에도 결합할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2: DESPs를 이용한 혈관내피세포로의 siRNA 전달
상기 실시예 1의 결과로부터, 서열번호 3 또는 9의 아미노산 서열을 갖는 DESPs가 마우스 뿐만 아니라 사람의 혈관내피세포에 결합할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 DESPs를 사용하여 혈관내피세포에 특정 단백질의 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 전달할 수 있는지에 대하여 확인하고자 하였다.
실시예 2-1: HUVEC 세포에 대한 DESPs의 결합활성 분석
상기 서열번호 3 또는 9의 아미노산 서열을 갖는 DESPs를 각각 합성하고, 이들 각 DESPs에 바이오틴을 표지하였다. 이어, LSS 또는 OSS 상태에서 48시간 동안 배양된 사람 혈관내피세포인 HUVEC 세포에 상기 바이오틴이 표지된 각 DESPs를 20μM의 수준으로 가하고, 4시간 동안 반응시킨 후, 상기 실시예 1-3과 동일한 방식으로 면역염색을 수행하였다. 상기 면역염색된 HUVEC 세포에 스트렙타비딘이 결합된 Qdot (525nM, green)을 가하여 반응시키고, 형광현미경을 사용하여 상기 각 DESPs의 결합수준을 비교하였다(도 8). 이때, 대조군으로는 DESPs를 처리하지 않은 HUVEC 세포를 사용하였다.
도 8은 사람 혈관내피세포인 HUVEC 세포에 있어서, LSS 또는 OSS 조건에 따른, DESPs의 일종인 CLIRRTSIC(서열번호 3) 또는 CPRRSHPIC(서열번호 9)의 결합수준을 비교한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다. 도 8에서 보듯이, 2종류의 DESPs는 와류성 혈류조건에서 배양된 HUVEC 세포에는 결합되지만, 정상혈류조건에서 배양된 HUVEC 세포에는 결합되지 않음을 확인하였다. 또한, 상기 와류성 혈류조건에서 배양된 HUVEC 세포에 대한 2종류의 DESPs의 결합수준을 비교한 결과, CLIRRTSIC(서열번호 3)가 상대적으로 높은 결합활성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 2-2: DESPs를 이용한 혈관내피세포로의 siRNA 전달
실시예 2-1에서 합성된 서열번호 3 또는 9의 아미노산 서열을 갖는 DESPs를 각각 고분자 물질인 PEG에 결합시켜서, DESPs가 결합된 고분자 물질(BPEI-SS-PEG)를 합성하였다. 상기 BPEI-SS-PEG에 적색형광이 표지된 siRNA인 siGLO를 10:1, 20:1 또는 30:1의 비율(N/P 비율)로 가하고 실온에서 30분 동안 반응시켜서, 상기 BPEI-SS-PEG의 PEG 부분에 siGLO가 포집된 형태의 DESPs가 결합된 각각의 고분자 물질인 BPEI-SS-PEG-siGLO(N/P=10, N/P=20 또는 N/P=30)을 수득하였다. 상기 수득한 각각의 BPEI-SS-PEG-siGLO를 LSS 또는 OSS 상태에서 48시간 동안 배양된 사람 혈관내피세포인 HUVEC 세포에 도입하고, 도입된 세포에서 발현되는 적색 형광을 형광현미경으로 측정하였다(도 9a). 이때, 음성 대조군으로는 상기 고분자 물질 없이 siGLO가 도입된 세포를 사용하고, 양성 대조군으로는 리포펙타민을 사용하여 siGLO가 도입된 세포를 사용하였다.
도 9a는 사람 혈관내피세포인 HUVEC 세포에 다양한 고분자 물질(BPEI-SS-PEG-siGLO)을 도입한 결과를 나타내는 형광현미경 사진으로서, siGLO는 음성 대조군을 나타내고, Lipofectamine-siGLO는 양성 대조군을 나타낸다. 도 9a에서 보듯이, CLIRRTSIC(서열번호 3)는 와류성 혈류조건에서 배양된 HUVEC 세포에 특이적으로 도입되고 N/P 비율이 증가할 수록 HUVEC 세포로의 도입효율이 증가한 반면, CPRRSHPIC(서열번호 9)는 N/P=10인 경우에는 와류성 혈류조건에서 배양된 HUVEC 세포에 특이적으로 도입되었으나, N/P 비율이 증가하면 와류성 혈류조건 뿐만 아니라 정상 혈류조건에서 배양된 HUVEC 세포에 모두 도입됨을 확인하였다.
따라서, 와류성 혈류 조건에서 배양된 HUVEC 세포에 대하여는 서열번호 3의 DESP가 특이적으로 결합함을 알 수 있었다.
실시예 2-3: DESPs를 이용한 경동맥 부분결찰 동물모델의 혈관내피세포로의 siRNA 전달
상기 실시예 2-2의 방법에 따라, 2종류의 DESPs가 결합된 고분자 물질(BPEI-SS-PEG)에 ICAM1에 대한 siRNA(siICAM1)를 가하고 반응시켜서 각각의 BPEI-SS-PEG-siICAM1를 수득하였다. 이어, 상기 경동맥 부분결찰 동물모델의 꼬리정맥을 통해 상기 수득한 각각의 BPEI-SS-PEG-siICAM1를 주사하거나 또는 주사하지 않고, 1일이 경과된 후, 상기 동물모델로부터 RCA와 LCA를 각각 적출하였으며, 상기 RCA와 LCA의 혈관내피세포에서 발현되는 ICAM1의 mRNA 수준을 Real time-qPCR 기법을 통해 비교하였다(도 9b). 이때, 대조군으로는 2종류의 DESPs 대신에 CLNQQTAIC(서열번호 41)이 결합된 BPEI-SS-PEG-siICAM1를 사용하였다.
도 9b는 경동맥 부분결찰 동물모델의 우측 경동맥(RCA)와 좌측 경동맥(LCA)에서 BPEI-SS-PEG 또는 BPEI-SS-PEG-siICAM1의 도입에 따른 ICAM1의 mRNA 수준변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 9b에서 보듯이, BPEI-SS-PEG-siICAM1를 주사하지 않은 경동맥 부분결찰 동물모델에서는 ICAM1의 mRNA 수준이 RCA에 비하여 LCA에서 높은 수준을 나타내었으나, BPEI-SS-PEG-siICAM1를 주사한 경동맥 부분결찰 동물모델에서는 CLIRRTSIC(서열번호 3)을 포함하는 BPEI-SS-PEG-siICAM1를 주사한 경우에만, LCA에서의ICAM1의 mRNA 수준은 BPEI-SS-PEG-siICAM1를 주사하지 않은 LCA에 비하여 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.
따라서, CLIRRTSIC(서열번호 3)는 와류성 혈류에 의한 기능이상 혈관내피세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드이며, 상기 펩타이드를 사용하면 와류성 혈류에 의한 기능이상 혈관내피세포에 목적하는 대상을 효과적으로 전달할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3: CLIRRTSIC에 결합하는 표적 단백질 규명
실시예 3-1: CLIRRTSIC에 결합하는 표적 단백질의 발굴
상기 실시예 2-3의 결과로부터 CLIRRTSIC(서열번호 3)는 와류성 혈류에 의한 기능이상 혈관내피세포에 특이적으로 결합하는 펩타이드임을 확인하였으므로, 질량분석(Mass spectrometry)을 수행하여 상기 펩타이드에 결합할 수 있는 기능이상 혈관내피세포에서 발현되는 표적 단백질을 발굴하고자 하였다.
구체적으로, LSS 또는 OSS 상태에서 48시간 동안 배양된 사람 혈관내피세포인 HUVEC 세포에 바이오틴이 표지된 CLIRRTSIC(서열번호 3)를 가하거나 또는 가하지 않고 4시간 동안 반응시켰다. 이어, 상기 HUVEC 세포를 파쇄하여 수득한 파쇄물 1.6 mg에 3 ㎍의 스트렙타비딘을 가하고, 4℃에서 하룻밤동안 반응시킨 다음, 20㎕ protein-A/G 비드를 가하고, 3시간 동안 반응시켜서 면역침강을 수행하였다. 상기 면역침강된 단백질을 전기영동하고, 각 시료별로 차이를 나타내는 단백질을 검출하였다(도 10a).
도 10a는 HUVEC 세포에 바이오틴이 표지된 CLIRRTSIC의 처리여부에 따라, 발현수준이 변화된 단백질을 검출한 결과를 나타내는 사진, 그래프 및 도표이다. 도 10a에서 보듯이, HUVEC 세포에 대한 바이오틴이 표지된 CLIRRTSIC의 처리여부에 따라, 6종 단백질의 발현수준이 변화되었음을 확인하였다.
상기 확인된 6종의 단백질을 대상으로, 질량분석(Mass spectrometry)을 수행하여, 상기 각 단백질을 동정하였다(도 10b).
도 10b는 HUVEC 세포에 대한 바이오틴이 표지된 CLIRRTSIC(서열번호 3)의 처리여부에 따라 발현수준이 변화된 6종 단백질을 질량분석하여 동정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 10b에서 보듯이, 상기 6종의 단백질 중에서 5종은 NMHC IIA(non-muscle myosin heavy chain IIA, Myosin-9)이고, 하나는 Annexin A2임을 확인하였다.
이에, 상기 바이오틴이 표지된 CLIRRTSIC(서열번호 3)가 NMHC IIA와 결합할 수 있는지의 여부를 확인하기 위하여, 상기 면역침강된 단백질과 항-NMHC IIA 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다(도 10c).
도 10c은 바이오틴이 표지된 CLIRRTSIC(서열번호 3)를 이용하여 면역침강된 HUVEC 세포유래 단백질과 항-NMHC IIA 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석결과를 나타내는 사진이다. 도 10c에서 보듯이, 바이오틴이 표지된 CLIRRTSIC를 이용하여 면역침강된 HUVEC 세포유래 단백질이 항-NMHC IIA 항체와 결합함을 확인하였다.
따라서, OSS 상태에서 배양된 HUVEC 세포에서 CLIRRTSIC와 결합하는 표적 단백질은 NMHC IIA 이고, 상기 NMHC IIA는 혈관내피세포가 와류성 혈류에 노출될 경우, 세포표면에 존재함을 알 수 있었다.
실시예 3-2: NMHC IIA의 세포내 발현부위 분석
상기 실시예 3-1의 결과로부터 OSS 상태에서 배양된 HUVEC 세포에서 CLIRRTSIC와 결합하는 표적 단백질은 NMHC IIA 이고, 상기 NMHC IIA는 혈관내피세포가 와류성 혈류에 노출될 경우, 세포표면에 존재함을 확인하였으므로, 상기 OSS 조건이 NMHC IIA의 발현에 미치는 영향을 분석하고자 하였다.
구체적으로, LSS 또는 OSS 상태에서 48시간 동안 배양된 사람 혈관내피세포인 HUVEC 세포를 파쇄하여 각각의 파쇄물을 수득하고, 항-NMHC IIA 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다(도 11a).
도 11a는 LSS 또는 OSS 상태에서 배양된 HUVEC 세포에서 발현된 NMHC IIA의 발현수준에 대한 웨스턴 블럿 분석결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 도 11a에서 보듯이, LSS 상태 보다는 OSS 상태에서 배양된 HUVEC 세포에서 NMHC IIA의 발현수준이 증가됨을 확인하였다.
한편, LSS 또는 OSS 상태에서 48시간 동안 배양된 사람 혈관내피세포인 HUVEC 세포를 대상으로 항-NMHC IIA 항체를 이용한 면역형광염색을 수행하고, 핵을 대상으로 DAPI 염색을 수행하였다(도 11b).
도 11b는 LSS 또는 OSS 상태에서 배양된 HUVEC 세포를 대상으로 항-NMHC IIA 항체를 이용한 면역형광염색을 수행한 결과를 나타낸 사진이다. 도 11b에서 보듯이, LSS 상태에서 배양된 HUVEC 세포에서는 NMHC IIA가 뚜렷하게 검출되지 않았으나, 상기 웨스턴 블럿 분석결과에 비추어 볼 때, 상기 LSS 상태에서 배양된 HUVEC 세포에서도 NMHC IIA는 발현되지만, 상기 발현된 NMHC IIA는 세포질내에 균일하게 분포되어 있는 것으로 분석되었다. 이에 반하여, OSS 상태에서 배양된 HUVEC 세포에서는 NMHC IIA가 세포막 부위에 밀집되어 있음을 확인하였다.
따라서, NMHC IIA는 HUVEC 세포에서 발현되지만, 상기 HUVEC 세포가 와류성 혈류에 노출될 경우, 상기 NMHC IIA의 발현수준이 증가되고, 발현수준이 증가된 NMHC IIA는 세포막 부위로 이동함을 알 수 있었다.
상기 실시예 1 내지 3의 결과를 종합하면, 와류성 혈류에 노출된 혈관내피세포에서는 NMHC IIA의 발현수준이 증가하고, 이처럼 발현수준이 증가된 NMHC IIA는 세포막으로 이동하며, 상기 세포막으로 이동한 NMHC IIA는 CLIRRTSIC(서열번호 3)와 결합할 수 있고, 상기 CLIRRTSIC(서열번호 3)는 siRNA와 같은 생체고분자 물질을 상기 와류성 혈류에 노출된 혈관내피세포로 전달할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (19)

  1. NMHC IIA(non-muscle myosin heavy chain IIA)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 심혈관계질환 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 NMHC IIA는 서열번호 42의 아미노산 서열로 구성되는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 NMHC IIA의 발현수준을 측정하는 제제는 상기 NMHC IIA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머(aptamer)를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 심혈관계 질환은 고지혈증, 고혈압, 동맥경화증, 심장관상동맥 협착증, 협심증, 말초동맥 협착증, 허혈성동맥질환 또는 동맥경화성 뇌혈관질환인 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 심혈관계 질환 진단용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 키트는 ELISA 키트인 것인 키트.
  7. (a) 검사대상 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 NMHC IIA(non-muscle myosin heavy chain IIA)의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 NMHC IIA의 발현수준을 정상 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 측정된 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는,
    심혈관계질환의 진단방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈관내피세포, 혈관내피세포를 포함하는 혈액 또는 혈관내피세포를 포함하는 조직인 것인 방법.
  9. 검사대상 개체의 생물학적 시료로부터 NMHC IIA가 세포막에 존재하는지의 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 심혈관계질환의 진단방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈관내피세포, 혈관내피세포를 포함하는 혈액 또는 혈관내피세포를 포함하는 조직인 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 확인은 항-NMHC IIA 항체를 이용한 면역형광염색법에 의하여 수행되는 것인 방법
  12. NMHC IIA(non-muscle myosin heavy chain IIA)에 결합할 수 있는 제제와 약물을 포함하는 심혈관계질환 치료용 약물 전달체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 제제는 펩타이드, 항체 또는 앱타머인 것인 전달체.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 약물은 화합물, 펩타이드, 단백질, 핵산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 전달체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 핵산은 RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), 앱타머, 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme), 디엔에이자임(DNAzyme), microRNA 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 전달체.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 심혈관계 질환은 고지혈증, 고혈압, 동맥경화증, 심장관상동맥 협착증, 협심증, 말초동맥 협착증, 허혈성동맥질환 또는 동맥경화성 뇌혈관질환인 것인 전달체.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 약물 전달체는 비펩타이드성 고분자 물질을 추가로 포함하는 것인 전달체.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 비펩타이드성 고분자 물질은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 단독 중합체, 폴리프로필렌글리콜 단독 중합체, 에틸 글리콜-프로필렌글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸 에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 전달체.
  19. 제12항에 있어서,
    상기 약물 전달체는 리포좀인 것인 전달체.
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