WO2016190774A1 - Оптимизированная нуклеотидная последовательность и фармацевтическая композиция на ее основе с пролонгированной экспрессией трансгена vegf - Google Patents

Оптимизированная нуклеотидная последовательность и фармацевтическая композиция на ее основе с пролонгированной экспрессией трансгена vegf Download PDF

Info

Publication number
WO2016190774A1
WO2016190774A1 PCT/RU2015/000852 RU2015000852W WO2016190774A1 WO 2016190774 A1 WO2016190774 A1 WO 2016190774A1 RU 2015000852 W RU2015000852 W RU 2015000852W WO 2016190774 A1 WO2016190774 A1 WO 2016190774A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
vegf
mrna
deletion
plasmid dna
Prior art date
Application number
PCT/RU2015/000852
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Сергей Львович КИСЕЛЕВ
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен"
Priority to AU2015396177A priority Critical patent/AU2015396177B2/en
Priority to CA2985608A priority patent/CA2985608C/en
Priority to EA201700456A priority patent/EA039395B1/ru
Priority to MX2017013206A priority patent/MX2017013206A/es
Priority to CN201580080399.1A priority patent/CN107614687B/zh
Priority to EP15893474.5A priority patent/EP3305901B1/en
Priority to BR112017023058-5A priority patent/BR112017023058B1/pt
Publication of WO2016190774A1 publication Critical patent/WO2016190774A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Definitions

  • the invention relates to biotechnology, namely to the development of optimized gene therapy drugs with high stability and prolonged expression of the vegf transgene.
  • Gene-therapeutic drugs are becoming increasingly important in modern medicine - a group of drugs whose active ingredient is gene constructs - nucleic acids containing one or more genes encoding therapeutic proteins.
  • Neovasculgen OJSC Human Stem Cell Institute Institute
  • Russia RU NoJlIl-000671 dated 09/28/11
  • Ukraine RU JY O 899/13300200000 OT 01/25/2013
  • the safest variants of gene constructs carrying a transgene include plasmid DNA. It is plasmid DNA with the vegf gene that is the active substance of the Neovasculgen gene therapy mentioned above. Main problem
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) plasmid DNA as a vector for the delivery of a transgene to target cells is recognized by the absolute majority of researchers as low transfection efficiency: only 1-2% of the total number of molecular gene constructs enter cells and / or are expressed by them [2]. 5 At the same time, the number of molecules of plasmid DNA entering the cell and the total number of transfected cells are one of the main factors that directly determine the level of production of therapeutic protein and, accordingly, the biological effect of the drug.
  • the second - an alternative approach - is to extend the lifetime of the transcription product of the introduced genetic construct -
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) mRNA, which leads to an increase in the number of translation cycles and, accordingly, an increase in the resulting amount of therapeutic protein due to its prolonged production.
  • the fundamental foundations of this approach were formed due to the accumulation of information on the regulation of mRNA lifetime.
  • a number of regulatory molecules are described that are involved in modulating the stability of mRNAs, such as RNA-binding proteins and regulatory RNAs (microRNAs, long non-coding RNAs). It is important that the effect of these substances on mRNA is mediated through binding to its 3 '- untranslated region (3'UTR) containing special sequences - destabilizing elements, in particular, an adenine-uridine-enriched element (AU-rich element).
  • a number of substances such as AU-rich element RNA-binding protein 1 (AUF 1), tristetraprolin (TTP), KH-type splicing regulatory protein (KSRP), binding to specific 3'UTR sites induce mRNA degradation, while others, for example polyadenylate-binding protein-interacting protein 2 (PAIP2), on the contrary, provides stabilization of mRNA [3, 4].
  • AUF 1 AU-rich element RNA-binding protein 1
  • TTP tristetraprolin
  • KSRP KH-type splicing regulatory protein
  • PAIP2 polyadenylate-binding protein-interacting protein 2
  • 3 'UTR nucleotide sequence is of fundamental importance for the transduction of regulatory influences whose mRNA is an effector, and for determining the mRNA lifetime as a whole.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) life of mRNA.
  • site-directed mutagenesis methods have been developed that allow technically performing the necessary changes in the gene construct and, accordingly, mRNA as a product of its transcription.
  • the qualitative and quantitative composition of the destabilizing elements 3 'UTR is also determined by the coding region of the nucleic acid.
  • 3'UTR determines not only the mRNA lifetime, but also other components of its “physiology”, such as transport from the cell nucleus, cytoplasmic localization, translation efficiency, etc., determines the complexity and, in many respects, the unpredictability of modeling the mRNA lifetime through a change in the 3 'UTR sequence, which can be expressed both in an increase in the transcript lifetime and in a decrease.
  • SUBSTITUTE SHEET far from all genes (described by most researchers for G-CSF), and, on the other hand, it does not exhaust the list of destabilizing elements, and therefore, the extension of mRNA life could be leveled.
  • the sequence is strictly specified and has a length of 100 nucleotides [6].
  • VEGF production by targeted cells for example, human cells of the HEK293 line, multipotent mesenchymal stromal cells, human fibroblasts, etc.
  • targeted cells for example, human cells of the HEK293 line, multipotent mesenchymal stromal cells, human fibroblasts, etc.
  • plasmid DNA penetrated by increasing the life span of a specific mRNA of the indicated gene using optimizing his 3'UTR.
  • VEGF is a family of biologically active proteins first isolated by J. Folkman et al. in 1971 [8], which are considered one of the main auto- and paracrine factors of regulation of vasculo-, angio-
  • VEGF-A SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) (VEGF-A, B; PIGF) and lymphogenesis (VEGF-C, D); produced by cells of all body tissues, including epithelial.
  • VEGF-A (isoforms 121, 5 145, 148, 165, 183, 189, 206) has the greatest influence on the formation of blood vessels [9].
  • Three types of VEGF receptors have been found. Type 1 and 2 are involved in angiogenesis, 3 - in the formation of lymphatic vessels. Moreover, the type 1 receptor has a greater affinity for VEGF, however, its tyrazine kinase activity is much lower than that of the type 2 receptor, which is regarded as one of the regulatory mechanisms that prevent excessive VEGF activity. Accordingly, it is through the type 2 receptor that VEGF effects are normally realized [10, 11]. After the interaction of VEGF with a specific type 2 receptor, autophosphorylation of its intracellular tyrosine sites (Y951, 1054, 1059, 1175, 1214) of the kinase and carboxyterminal domains occurs [11],
  • phospholipase Su hydrolyzes a number of intracellular proteins, such as Su, CP3 phospholipases, adapter proteins SRK, NCK, SHB, SCK, etc., which are the first links in complex cascades of signal transduction that change the morphofunctional state of target cells (mainly, endothelial).
  • phospholipase Su hydrolyzes
  • SRH is involved in the polymerization of actin and the formation of stress fibrils that provide cell migration and motor activity, in general
  • VEGF phosphoinositide-3-kinase-protein kinase B
  • PI3K / AKT axis modulates the work of endothelial fururing synthase using calcium ions, which is accompanied by an increase in NO production and an increase in vascular permeability, which is a necessary link in angiogenesis (Fig. 3) [13, 14].
  • VEGF through type 5 specific receptor of type 2 induces the activation, migration, proliferation and differentiation of endotheliocytes and their progenitor cells, increasing cell survival, which, combined with modulation of intercellular interactions and increasing vascular permeability, are necessary conditions for the formation of capillaries of similar structures with subsequent remodeling into "mature" vessels
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • various variants of the gene encoding it are used to create gene constructs indicated for the treatment of patients with diseases
  • bone tissue both in the case of primary and secondary osteohistogenesis, it is the vessels that grow into loose fibrous connective or cartilage tissue that create the necessary
  • VEGF also exerts a direct stimulating effect on the cells of the osteoblastic differential, which not only produce VEGF [24], but also express its receptors of types 1 and 2 as in
  • VEGF has a wide spectrum of action on the cells of endothelial and mesenchymal cell lines. Its main biological effect is associated with the induction of the formation of blood and lymphatic vessels, however, apparently, other direct mechanisms of the direct action of differentferons on cells through receptor and intracrine mechanisms are also characteristic of VEGF.
  • plasmid DNA with the vegf gene characterized by prolonged transgene expression, would become an effective tool in the development of drugs and gene-activated medical devices intended not only for treating patients with diseases of the cardiovascular system, but also another pathology in which a local increase in VEGF in the affected area would enhance the reparative process.
  • Fig. 1 Dynamics of production (accumulation) of mRNA by cell cultures transfected with various variants of gene constructs: 1 -
  • Seq # l original gene construct
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Fig. 2.
  • Fig. 3 Dynamics of vegf gene mRNA production by transfected cell culture: A - endogenous production (culture of non-transfected cells); B is the original gene construct (Seq # l); C is the optimized gene construct Seq # l 1.
  • Fig. 5 Change in blood flow in the ischemic limb at different follow-up periods: ⁇ Non ChLI control, ⁇ ChLI pop treated, ⁇ Water for injection, - Seq # ll (200 mkg 1 and 14 d), - Seq # ll (100 mkg x 14 d).
  • Fig. 7. CD34 + -cells / muscle fibers ratio. 1 - non ChLI control; 2 - ChLI non treated; 3 - water for injection; 4 - Seq # l 1 (100 mkg x 14 d).
  • Fig. 8 Defects of the parietal bones of rabbits, 30 days. after implantation of osteoplastic materials: A - calcium phosphate with plasmid DNA Seq # l 1, B - calcium phosphate without plasmid DNA.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) constructs carrying various changes in the 3 'UTR nucleotide sequence of the vegf therapeutic gene were analyzed compared to the original gene construct (Seq # l, which we developed earlier). Examples of the influence of some changes are given in table 1. As can be seen from the data presented, some changes in the nucleotide sequence (deletions or substitutions) had a positive effect on life expectancy (for example, deletion of C 1079), others did not have any effect (for example, deletion of C 1100) or led to a decrease in mRNA life (for example, deletion C 1090). In this case, the difference in the lifespan of the vegf gene mRNA in the cell in extreme cases (deletion C 1079 - increase; deletion C 1090 - decrease) averaged more than 6 hours with an average mRNA life of 6 hours.
  • the obtained variant of the genetic construct is characterized by the maximum mRNA lifetime and, accordingly, the largest total production of VEGF protein, exceeding that characteristic of the original gene constructs (Seq # l).
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Based on the developed optimized gene construct and adjuvants providing cryoprotection, stabilization of pH and obtaining an isotonic solution for injection, pharmaceutical compositions with pronounced angiogenic 5 activity were created.
  • compositions are intended for use in the case of diseases and pathological conditions, the treatment of which requires stimulation of angiogenesis (tissue ischemia) or reparative tissue regeneration, which can be accomplished through activation of angiogenesis (restoration of the integrity of peripheral nerves, skeleton bones, etc.)
  • angiogenesis tissue ischemia
  • reparative tissue regeneration which can be accomplished through activation of angiogenesis (restoration of the integrity of peripheral nerves, skeleton bones, etc.)
  • nucleotide numbering is based on the original reference sequence of the gene construct Seq # l.
  • HEK293 cells in an amount of 2 ⁇ 10 5 were placed in the wells of a 6-well plate with DMEM / F-12 culture medium supplemented with
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 10% FBS. After the cells were attached to the culture medium, 10 ⁇ g of one of the obtained plasmid DNA variants was added (in 100 ⁇ l of water for injection). As a negative control, 100 ⁇ l of water for injection without plasmid DNA was used, which allowed us to estimate the level of 5 production of endogenous vegf mRNA. To determine the level of vegf gene expression by RT-PCR from cells at 6, 12, 24, 36, and 48 hours after transfection, total RNA was isolated on the columns using the PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen, USA), according to the manufacturer's instructions.
  • pelleted cells were carefully lysed in a volume of 350 ⁇ l of lysis buffer in the presence of 1% ⁇ -mercaptoethanol. An equal volume of 70% ethanol was added, vortexed and transferred to columns. Centrifuged for 1 min. at 12.4 thousand about. min The centrifuged liquid was drained. 600 ⁇ l of wash solution 1 was added to the membrane, centrifuged for 15 sec. at 12.4
  • target genes (in moles) were determined compared to the expression of the ⁇ -actin housekeeping gene using the real-time PNR kit in the presence of SYBR Green I and a reference dye
  • ROX (Synthol, Russia) Figure 1. shows an example of one of the nucleotide substitutions that provide an increase in mRNA life.
  • mutations were identified that positively affect the mRNA lifetime (deletion C 1071, deletion C 1079, deletion T 1111, substitution A for C 1144, deletion A 1148, deletion C 1155, deletion A 1173, deletion G 1183, deletion C 1185, replacement of G by C 1536
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) and etc.). These changes in various combinations of 4-10 mutations were summarized in synthetic constructs, including the coding part of the vegf gene and 3'UTR, optimized with respect to the vegf gene. The main options obtained are presented by Seq # 2-ll. To select 5 the most optimal variant from the developed gene constructs, a comparative study was performed, during which the dynamics of mRNA accumulation by transfected cells was determined using PCR-RT, as described above. The results of the main ten gene constructs in the form of a fold of an increase in the concentration of mRNA at 24 and 48 h after transfection are presented in Fig. one.
  • the 25 optimized constructs exceeded the parameter value in the control, where the original plasmid DNA was used for transfection.
  • the developed plasmid DNA carrying the vegf gene was studied in vitro to quantify the production of VEGF protein by HEK273 cells.
  • the concentration of therapeutic protein was determined in the culture medium using ELISA 6, 12, 24, 48, 72 and 96 hours after transfection of cells. It turned out that the accumulated concentration of therapeutic protein in the culture medium of cells transfected with the gene construct significantly exceeded the parameter value in the control, including in groups with alternative variants of the developed gene constructs, characterized by the non-optimal 3'UTR sequence of the vegf gene and the standard transgenic mRNA lifetime ( fig. 3).
  • Determination of the accumulated concentration of VEGF protein in the culture medium allows us to judge the dynamics of its production by cells and the quantitative increase at each control period, however, it does not allow to assess the intracellular protein concentration at each of the time points. Moreover, the determination of the level of
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) VEGF protein in cells at the deadlines for observation.
  • cells after 4 days. cultivations were subjected to Western blot analysis using standard techniques using antibodies to the VEGF protein.
  • Protein concentration was the highest in the lysate of cells transfected with the optimized gene construct Seq # 11 (Fig. 4).
  • the protein level in the case of cells transfected with the original construct at this observation period was slightly higher than the endogenous concentration (control).
  • the conditioned medium of cells transfected with optimized gene constructs was characterized by a statistically significantly greater angiogenic activity as determined in the standard HUVEC tube formation assay.
  • the main technical result of the present invention is to increase the total production of therapeutic protein by increasing the mRNA lifetime achieved by detecting optimal changes in the 3'UTR sequence of the vegf gene.
  • Unexpected was the fact that the replacement of only one nucleotide in the target region had such a pronounced effect on the lifespan of mRNA and, accordingly, the production of therapeutic protein.
  • researchers made other changes involving a much larger number of nucleotides.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) safety and leveling the effect on other aspects of mRNA metabolism are precisely the minimal, point changes, if they allow you to achieve the desired effect. It is important to note that the length of the 3'UTR sequence of the vegf gene is at least 250 nucleotides, therefore, the total number of single, point mutations in the form of a substitution of one nucleotide for another is at least 750. Considering other possible variations (deletions, duplications, insertions), and also taking into account the involvement of more than one site, the number of variants of gene constructs differing in the 3'UTR of the vegf gene is hundreds of thousands. Thus, the identification of several variants of sequence changes leading to an increase in the lifespan of mRNA without negative impact on other aspects of its functioning is tantamount to winning the lottery.
  • compositions based on the developed optimized gene constructs and pharmacologically acceptable excipients, represented by at least one cryoprotectant with filler properties and a pH stabilizer, in effective quantities, providing an isotonic plasmid DNA solution for injection.
  • composition of the pharmaceutical composition ensuring the preservation of the properties of optimized plasmid DNA, is:
  • - plasmid DNA from 0.1 to 10 mg / ml, preferably from 0.5 to 4 mg / ml, most preferably from 0.8 to 1.2 mg / ml.
  • - glucose (dextrose) from 200 to 400 mm, preferably from 250 to 350 mm, most preferably from 280 mm to 320 mm.
  • sodium phosphate (a mixture of trisubstituted, disubstituted and monosubstituted sodium phosphates) in a concentration of from 3 to 30 mm, preferably from 5 to 20 mm, most preferably from 8 to 12 mm.
  • the pH of the solution is from 7.0 to 9.0, preferably from 7.2 to 8.5, most preferably from 7.4 to 8.2.
  • composition of one of the variants of the pharmaceutical composition is as follows:
  • Example 1 A model of chronic lower limb ischemia.
  • mice 90
  • HINC chronic lower limb ischemia
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) blood flow perfusion rate in an ischemic and healthy limb.
  • Example 2 A model of bone defect of critical size.
  • nucleic acid incubation with a solution of plasmid DNA according to Seq # l l in Humm phosphate buffer at a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ l at a temperature of 37 ° C and constant shaking for 12 hours).
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) a) washing (treatment with 5 mm phosphate solution in a volume of 1 ml 3 times);
  • a gene-activated osteoplastic material (experimental group) consisting of calcium phosphate and plasmid DNA Seq # l l was implanted into defects of the right parietal bones, into defects of the left
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) bone tissue.
  • the data obtained indicate that the introduction of Seq # ll plasmid DNA into the region of a bone defect of critical dimensions led to a pronounced induction of reparative osteogenesis, which may be due to both the mediated effect through angiogenesis and the direct effect of VEGF on the mesenchymal cell line.
  • an optimized gene construct with the vegf gene can be effective in treating other pathological conditions that require activation of the reparative process, such as damage to the skin and musculoskeletal system, peripheral nerve injuries, diabetic foot syndrome, amyotrophic lateral sclerosis.
  • Vascular endothelial growth factor gene therapy improves nerve regeneration in a model of obstetric brachial plexus palsy. Neurol Res. 2015; 37 (3): 197-203.
  • Kessler JA Vascular endothelial growth factor gene transfer for diabetic polyneuropathy.Ann Neurol. 2009; 65 (4): 362-4.
  • VEGF165-GAM Vascular endothelial growth factor gene-activated matrix
  • VEGF vascular endothelial growth factor-A

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Выявлены точечные изменения нуклеотидной последовательности 3'UTR гена vegf, которые существенно увеличивают время жизни продукта его транскрипции - мРНК в клетках млекопитающих. Экспериментальным путем выбрана генная конструкция с оптимальным перечнем выявленных мутаций, характеризующаяся наибольшим временем жизни мРНК. Подтвержден биологический эффект разработанной генной конструкции и фармацевтической композиции на ее основе in vitro и in vivo.

Description

Оптимизированная нуклеотидная последовательность и фармацевтическая композиция на ее основе с пролонгированной экспрессией трансгена vegf
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к разработке оптимизированных геннотерапевтических препаратов с высокой стабильностью и пролонгированной экспрессией трансгена vegf.
Современный уровень техники
Геннотерапевтические препараты
Все большее значение в современной медицине приобретают геннотерапевтичекие препараты - группа лекарственных средств, действующим веществом которых являются генные конструкции - нуклеиновые кислоты, содержащие один или несколько генов, кодирующих терапевтические белки.
К настоящему времени в мире уже зарегистрированы и внедрены в клиническую практику 5 таких препаратов, а несколько сотен находятся на стадиях экспериментальных и клинических исследований. Общее количество клинических исследований в рамках генной терапии с 1989 года превысило 1900 [1]. Один из 5 зарегистрированных геннотерапевтических препаратов - «Неоваскулген» (ОАО «Институт Стволовых Клеток Человека») - разработан нами и внедрен в клиническую практику на территории России (РУ NoJlIl-000671 от 28.09.11) и Украины (РУ JYO899/13300200000 ОТ 25.01.2013).
Таким образом, в условиях развития биотехнологии сформировался принципиально новый класс фармацевтических препаратов - геннотерапевтические лекарственные средства.
К наиболее безопасным вариантам генных конструкций, несущих трансген, относится плазмидная ДНК. Именно плазмидная ДНК с геном vegf является действующим веществом упомянутого выше геннотерапевтического препарата «Неоваскулген». Главной проблемой
1
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) плазмидной ДНК как вектора для доставки трансгена в клетки-мишени абсолютным большинством исследователей признается низкая эффективность трансфекции: лишь 1-2% от общего количества молекул генных конструкций поступает в клетки и/или экспрессируется ими [2]. 5 При этом, количество молекул поступившей в клетку плазмидной ДНК и общее число трансфицированных клеток являются одними из основных факторов, напрямую определяющих уровень продукции терапевтического белка и, соответственно, биологический эффект лекарственного средства. В этой связи, в условиях развития геннотерапевтических препаратов как ю нового фармакологического класса высоко актуальной является разработка методов, направленных на увеличение продукции терапевтического белка, кодируемого генной конструкцией при снижении количества вводимого в организм препарата или повышении эффективности действия. Это особенно важно для плазмидной ДНК, эффективность трансфекции
15 которой крайне низкая.
Повышение общей концентрации терапевтического белка может быть обеспечено посредством двух основных подходов. Первый - наиболее очевидный - состоит в увеличении уровня трансфекции генных конструкций. Иными словами, чем большее количество плазмидной ДНК
20 поступит в клетки-мишени, тем большая концентрация кодируемого ей белка будет продуцирована. В рамках данного подхода предложен целый ряд физических и химических методов. Однако физические методы увеличения уровня трансфекции требуют применения специального оборудования и не всегда безопасны и выполнимы в клинической практике.
25 Химические же методы требуют изменения состава геннотерапевтического препарата, что требует дополнительных ресурсов для производства, а также может быть сопряжено с негативными эффектами добавленных компонентов.
Второй - альтернативный подход - заключается в продлении времени зо жизни продукта транскрипции введенной генетической конструкции -
2
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) мРНК, что приводит к увеличению количества циклов трансляции и, соответственно, повышению результирующего количества терапевтического белка за счет его пролонгированной продукции. Фундаментальные основы данного подхода были сформированы за счет накопления сведений о регуляции времени жизни мРНК. Так, описан целый ряд регуляторных молекул, вовлеченных в модуляцию стабильности мРНК, такие как РНК-связывающие протеины и регуляторные РНК (микроРНК, длинный некодирующие РНК). Важно, что воздействие указанных веществ на мРНК опосредуется через связывание с ее 3 '- нетранслируемой областью (3'UTR), содержащей специальные последовательности - дестабиизирующие элементы, в частности, аденин- уридин-обогащенный элемент (AU-rich element). Ряд веществ, такие как AU-rich element RNA-binding protein 1 (AUF l), tristetraprolin (TTP), KH-type splicing regulatory protein (KSRP), связываясь со специфическими сайтами 3'UTR индуцируют деградацию мРНК, тогда как другие, например polyadenylate-binding protein-interacting protein 2 (PAIP2), наоборот, обеспечивают стабилизацию мРНК [3, 4].
Координация процессов деградации и стабилизации мРНК имеет важное значение для нормального функционирования клеток, а некоторые патологические состояния воспалительного или онкологического генеза, по мнению ряда авторов, могут быть связаны с посттранскрипционной дисрегуляцией, приводящей либо к недостаточной, либо к избыточной продукции факторов роста, онкогенов и других биологически активных веществ [4]. В этой связи, последовательность нуклеотидов 3 'UTR имеет принципиальное значение для трансдукции регуляторных влияний, эффектором которых является мРНК, и детерминации времени жизни мРНК в целом.
Анализируя данные современного уровня техники, становится очевидным, что изменение последовательности нуклеотидов 3 'UTR, особенно дестабилизирующих элементов, может обеспечить продление
3
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) жизни мРНК. Более того, разработаны методы сайт-направленного мутагенеза, позволяющие технически выполнить необходимые изменения в генной конструкции и, соответственно, мРНК как продукта ее транскрипции. Однако до сих пор нет точных, исчерпывающих и систематизированных данных о том, какие варианты последовательности 3 'UTR, какие ее минорные сайты или их комбинации за какие аспекты функционирования мРНК отвечают [3]. Отчасти это связно с тем, что количество изоформ мРНК, отличающихся последовательностью нуклеотидов 3'UTR, варьирует в широких пределах, в том числе из-за альтернативных сплайсинга и полиаденилирования. При этом, качественный и количественный состав дестабилизирующих элементов 3 'UTR определяется также и кодирующей областью нуклеиновой кислоты. Все это, в сочетании с тем фактом, что 3'UTR определяет не только время жизни мРНК, но и другие составляющие ее «физиологии», как транспорт из ядра клетки, цитоплазматическая локализация, эффективность трансляции и т.д., предопределяет сложности и, во многом, непредсказуемость моделирования времени жизни мРНК через изменение последовательности 3 'UTR, что может выражаться как в увеличении времени жизни транскрипта, так и в снижении.
Несмотря на все трудности и недостаточную изученность вопроса детерминации, или «программирования», времени жизни мРНК через изменение последовательности 3 'UTR, предпринимаются попытки эмпирически подобрать такие варианты изменений в соответствующей области конкретных вариантов генных конструкций, которые увеличили бы стабильность мРНК без негативного влияния на ее функционирование.
В частности, описан способ увеличения продукции трансгена за счет замены последовательности AU-rich элемента, представленной AUUUA, на другие варианты и их комбинации, ограниченные следующими: AUGUA,
AUAUA, GUGUG, AGGGA, GAGAG [5]. Однако, указанная последовательность дестабилизирующего элемента в 3 'UTR характерна
4
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) далеко не для всех генов (описана большинством исследователей для G- CSF), а, с другой стороны - ей не исчерпывается перечень дестабилизирующих элементов, в связи с чем, продление жизни мРНК может быль нивелировано.
Другими авторами разработана специальная последовательность
3 'UTR гена эритропоэтина, обеспечивающая пролонгированную продукцию трансгена, входящего в состав плазмидной ДНК. Последовательность строго конкретизирована и имеет длину 100 нуклеотидов [6].
Описаны также способы элиминации специфических последовательностей 3 'UTR, ответственных за связывание с различными микроРНК, индуцирующими деградацию мРНК [7].
Однако большинство предлагаемых изменений последовательности 3 'UTR относятся к протяженным делециям или заменам, что неизбежно сопряжено с риском возникновения негативных эффектов на метаболизм мРНК. Кроме того, предлагаемые решения крайне зависимы от кодирующей области гена, поэтому одни неприменимы, другие недостаточно эффективны для гена vegf и продления жизни продукта его транскрипции.
Стоящие же перед нами задачи сводились к необходимости увеличить продукцию VEGF таргетными клетками (на примере клеток человека линии НЕК293, мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, фибробластов человека и пр.), в которые проникла плазмидная ДНК, за счет увеличения продолжительности жизни специфической мРНК указанного гена с помощью оптимизиции его 3'UTR.
VEGF и его биологическая роль
VEGF - семейство биологически активных белков, впервые выделенных J. Folkman с соавт. в 1971 [8], которые считаются одними из основных ауто- и паракринных факторов регуляции васкуло-, ангио-
5
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) (VEGF-A, В; PIGF) и лимфогенеза (VEGF-C, D); вырабатываются клетками всех тканей организма, включая эпителиальные.
В постнатальном периоде развития человека наибольшее влияние на формирование кровеносных сосудов оказывает VEGF-A (изоформы 121, 5 145, 148, 165, 183, 189, 206) [9]. Обнаружены три типа рецепторов VEGF. 1 и 2 тип вовлечены в ангиогенез, 3 - в образование лимфатических сосудов. При этом, рецептор 1 типа обладает большей афинностью к VEGF, однако его тиразинкиназная активность гораздо ниже, чем у рецептора 2 типа, что расценивается как один из регуляторных механизмов, предотвращающих ю избыточную активность VEGF. Соответственно, именно через рецептор 2 типа в норме реализуются эффекты VEGF [10, 11]. После взаимодействия VEGF со специфическим рецептором 2 типа происходит аутофосфорилирование его внутриклеточных тирозиновых сайтов (Y951 , 1054, 1059, 1175, 1214) киназных и карбокситерминального доменов [11],
15 которые, в свою очередь, активируют ряд внутриклеточных белков, таких как фосфолипазы Су, СрЗ, адаптерные белки SRK, NCK, SHB, SCK и др., являющиеся первыми звеньями сложных каскадов трансдукции сигналов, изменяющих морфофункциональное состояние клеток-мишеней (главным образом, эндотелиальных). В частности, фосфолипаза Су гидролизирует
20 мембранный фосфолипид Р1Р2 с образованием диацилглицерола и инозитол-1 ,4,5-трифосфата, увеличивающего внутриклеточное содержание кальция, которые вместе активируют протеинкиназу С, которая, в свою очередь, запускает последовательную активацию сигнального пути RAS- ERK, приводящего к индукции митоза. В результате, повышается
25 пролиферативная активность эндотелиальных клеток [10]. Фосфолипаза
СРЗ участвует в полимеризации актина и формировании стресс-фибрилл, обеспечивающих миграцию и двигательную активность клеток, в целом
[12]. Через активацию сигнального пути «фосфоинозитид-3-киназа - протеинкиназа В» (PI3K/AKT) VEGF блокирует апоптоз, ингибируя зо каспазы 3, 7 и 9, тем самым повышая выживаемость клеток. Кроме того,
6
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) ось PI3K/AKT с помощью ионов кальция модулирует работу эндотелиальной ΝΟ-синтазы, что сопровождается увеличением продукции NO и повышением проницаемости сосудов, что является необходимым звеном в ангиогенезе (рис. 3) [13, 14]. Таким образом, VEGF через 5 специфический рецептор 2 типа индуцирует активацию, миграцию, пролиферацию и дифференцировку эндотелиоцитов и их клеток- предшественниц, повышение выживаемости клеток, что в сочетании с модуляцией межклеточных взаимодействий и повышением проницаемости сосудов служит необходимыми условиями формирования капилляро- ю подобных структур с последующим ремоделированием в «зрелые» сосуды
[10-16].
Учитывая роль VEGF как ключевого ангиогенного фактора, различные варианты кодирующего его гена используются для создания генных конструкций, показанных для лечения пациентов с заболеваниями
15 сердечно-сосудистой системы ишемического генеза [17, 18]. Кроме того, неспецифический ангиогенный эффект таких геннотерапевтических препаратов может оказать положительное влияние при других патологических состояниях, требующих активации репаративного процесса: травмы периферических нервов [19], синдром диабетической
20 стопы [20], боковой амиотрофический склероз [21], повреждения костей скелета [22, 23] и др.
Что касается костной ткани, то как в случае первичного, так и вторичного остеогистогенеза именно сосуды, прорастающие в рыхлую волокнистую соединительную или хрящевую ткани, создают необходимые
25 условия для дифференцировки резидентных клеток в остеобластическом направлении, а также для миграции камбиальных резервов
(периваскулярно и с кровотоком). Помимо опосредованного через ангиогенез влияния, VEGF оказывает и прямое стимулирующее действие на клетки остеобластического дифферона, которые не только продуцируют зо VEGF [24], но и экспрессируют его рецепторы 1 и 2 типов как в
7
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) эмбриогенезе [25], так и в постнатальном периоде развития [26]. Показано, что под воздействием VEGF пролиферация камбиальных клеток костной ткани значительно увеличивается (до 70%), а также активируется миграция остеогенных клеток по градиенту концентрации VEGF [27-29].
В последние годы, помимо канонического - рецепторного - механизма действия VEGF, появились данные о принципиально ином механизме, который обозначают как «интракринный». Подтверждением этому стали результаты исследований, продемонстрировавших, что прогениторные клетки, коммитированные в остеобластическом направлении (экспрессирующие Osx), синтезируют VEGF не только «на экспорт», но и для обеспечения собственной дифференцировки в остеобластическом направлении [30].
Таким образом, VEGF обладает широким спектром действия на клетки эндотелиальной и мезенхимальных клеточных линий. Основной его биологический эффект связан с индукцией формирования кровеносных и лимфатических сосудов, однако, по всей видимости, для VEGF характерны и другие механизмы прямого действия на клетки различных дифферонов через рецепторные и интракринные механизмы.
В этой связи, плазмидная ДНК с геном vegf, характеризующаяся пролонгированной экспрессией трансгена, стала бы эффективным инструментом в разработке лекарственных препаратов и ген- активированных медицинских изделий, предназначенных не только для лечения пациентов с заболеваниями сердечно-сосудистой системы, но и другой патологией, при которой локальное повышение уровня VEGF в affected area обеспечило бы усиление репаративного процесса.
Перечень иллюстраций:
Рис. 1. Динамика продукции (накопления) мРНК культурами клеток, трансфицированными различными вариантами генных конструкций: 1 -
Seq#l (исходная генная конструкция), 2 - Seq#2, 3 - Seq#3, 4 - Seq#4, 5 - Seq#5, 6 - Seq#6, 7 - Seq#7, 8 - Seq#8, 9 - Seq#9, 10 - Seq# 10, 11 - Seq#l l
8
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Рис. 2. Динамика продукции (накопления) мРНК гена vegf трансфицированной культурой клеток: А - исходная генная конструкция (Seq# l); В - оптимизированная генная конструкция SEQ#11. Результаты представлены как кратное увеличение по сравнению с уровнем продукции мРНК эндогенного VEGF.
Рис. 3. Динамика продукции мРНК гена vegf трансфицированной культурой клеток: А - эндогенная продукция (культура нетрансфицированных клеток); В - исходная генная конструкция (Seq#l); С - оптимизированная генная конструкция Seq#l 1.
Рис. 4. Белок VEGF, выделенный из клеточных культур, трансфицированных генными конструкциями, 4 сут. после трансфекции: А - оптимизированной генной конструкцией Seq#l l ; В - исходной генной конструкцией (Seq#l l); С - контроль, культура нетрансфицированных клеток. Вестерн-блоттинг, нормализация по β-актину.
Рис. 5. Изменение уровня кровотока в ишемизированной конечности на разных сроках наблюдения: ~ Non ChLI control, ~ ChLI поп treated, ~ Water for injection, -- Seq#l l (200 mkg 1 and 14 d), -- Seq#l l (100 mkg x 14 d).
Рис. 6. Ишемизированная мышца через 35 сут. после операции и введения: А - воды для инъекций, В - Seq#l 1 (200 mkg χ 1 and 14 d).
Рис. 7. CD34+-cells / muscle fibers ratio. 1 - non ChLI control; 2 - ChLI non treated; 3 - water for injection; 4 - Seq#l 1 (100 mkg x 14 d).
Рис. 8. Дефекты теменных костей кроликов, 30 сут. после имплантации остеопластических материалов: А - кальциевый фосфат с плазмидной ДНК Seq#l 1 , В - кальциевый фосфат без плазмидной ДНК.
Рис. 9. Карта оптимизированной последовательности Seq#l l .
Краткое описание настоящего изобретения
С использованием методов сайт-направленного мутагенеза и количественного ПЦР анализа молекул РНК в клетке нами были
9
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) проанализированы конструкции, несущие различные изменения последовательности нуклеотидов 3 'UTR терапевтического гена vegf, по сравнению с исходной генной конструкцией (Seq#l , разработана нами ранее). Примеры влияния некоторых изменений приведены в табл.1. Как видно из приведенных данных, некоторые изменения нуклеотидной последовательности (делеции или замены) сказывались на продолжительности жизни положительным образом (например делеция С 1079), другие не оказывали никакого влияния (например, делеция С 1100) или приводили к уменьшению жизни мРНК (например, делеция С 1090). При этом разница в продолжительности жизни мРНК гена vegf в клетке в крайних случаях (делеция С 1079 - увеличение; делеция С 1090 - уменьшение) составляла в среднем более 6 ч. при средней жизни мРНК 6 ч.
На втором этапе исследования все изменения, оказывающие положительное влияние, были использованы для создания ряда вариантов генных конструкций, несущих от четырех до десяти "положительных" мутаций в различных комбинациях, т.е. отличающихся последовательностью нуклеотидов на отрезке 1070 - 1600 (Seq#2-l l).
На основании полученных данных нами была выбрана и синтезирована оригинальная 3'UTR концевая часть гена vegf, которая в совокупности с кодирующей частью гена обеспечивала увеличение продолжительности жизни транскипта гена на 70% (SEQ#11), в которую были сведены некоторые мутации, оказавшие в совокупности наибольшее положительное влияние, а именно: делеция С 1079, делеция Т 1111 , замена А на С 1144, делеция А 1148, делеция С 1155, делеция А 1173, делеция С
1185, замена G на С 1536.
Полученный вариант генетической конструкции характеризуется максимальным временем жизни мРНК и, соответственно, наибольшей общей продукцией белка VEGF, превышающей таковую, характерную для исходной генных конструкций (Seq#l).
10
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) На основе разработанной оптимизированной генной конструкции и адъювантов, обеспечивающих криопротекцию, стабилизацию рН и получение изотонического раствора для инъекций, были созданы фармацевтические композиции, обладающие выраженной ангиогенной 5 активностью.
Разработанные фармацевтические композиции предназначена для применения в случае заболеваний и патологических состояний, в лечении которых требуется стимуляция ангиогенеза (ишемия тканей) или репаративной регенерации тканей, которая может быть осуществлена через ю активацию ангиогенеза (восстановление целостности периферических нервов, костей скелета и др.)
Для производства разработанных фармацевтических композиций создан бактериальный (E.colli) штамм-продуцент генной конструкции Seq#l l , депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов в
15 соответствии с Будапештским Договором по международному депонированию микроорганизмов с целью патентования. Номер депонирования штамма VKM B-2967D. Справку о Международном депонировании штамма прилагаем.
20 Подробное описание настоящего изобретения
Сайт-направленный мутагенез 3 'UTR гена vegf был выполнен с использованием QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, США), согласно инструкции производителя.
В результате сайт-направленного мутагенеза исходной плазмидной
25 ДНК (Seq#l), нами были получены различные варианты изменений в 3'UTR гена vegf. Полученные варианты плазмидной ДНК с геном vegf, отличающиеся последовательностью 3'UTR, были использованы для трансфекции клеток линии НЕК293 с последующим определением динамики накопления продукта экспрессии генной конструкции - мРНК зо гена vegf.
11
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Позиция* Изменение Исходный Скорректирован Влияние на ну леотид ный нуклеотид время
жизни мРНК
1071 делеция С - увеличение
1079 делеция С - увеличение
1090 делеция С - уменьшение
1100 делеция с - нет влияния
1111 делеция т - увеличение
1113 замена G С нет влияния
1144 замена А С увеличение
1146 делеция G - уменьшение
1148 делеция А - увеличение
1150 делеция С - нет влияния
1155 делеция С - увеличение
1158 делеция С - уменьшение
1173 делеция А - увеличение
1175 делеция С - уменьшение
1183 делеция G - увеличение
1184 делеция С - уменьшение
1185 делеция С - увеличение
1187 замена А С нет влияния
1536 замена G с увеличение
Табл. 1. Примеры некоторых проведенных изменений нуклеотидной последовательности и их влияние на продолжительность жизни мРНК.
* Примечание: нумерация нуклеотидов приведена по исходной эталонной последовательности генной конструкции Seq#l .
Для этого, клетки НЕК293 в количестве 2x 105 помещали в лунки 6- луночного планшета с культуральной средой DMEM/F-12 с добавлением
12
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 10% FBS. После прикрепления клеток в культуральную среду вносили 10 мкг одного из полученных вариантов плазмидной ДНК (в 100 мкл воды для инъекций). В качестве негативного контроля использовали 100 мкл воды для инъекций без плазмидной ДНК, что позволяло оценить уровень 5 продукции мРНК эндогенного vegf. Для определения уровня экспрессии гена vegf методом РТ-ПЦР из клеток через 6, 12, 24, 36 и 48 ч. после трансфекции выделяли общую РНК на колонках с помощью набора PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen, США), согласно инструкции производителя. Кратко, осажденные клетки тщательно лизировали в ю объеме 350 мкл лизирующего буфера в пристутсвии 1% β- меркаптоэтанола. Добавляли равный объем 70% этанола, вортексировали и переносили на колонки. Центрифугировали 1 мин. при 12,4 тыс. об. мин. Сливали отцентрифугированную жидкость. Добавляли на мембрану 600 мкл промывочного раствора 1, центрифугировали 15 сек. при 12,4
15 тыс.об.мин, убирали жидкость. Добавляли на мембрану 500 мкл промывочного раствора 2, центрифугировали при тех же условиях, убирали жидкость. Повторяли отмывку с промывочным раствором 2. Переносили колонки в новые пробирки и центрифугировали 1 мин. при 12,4 тыс.об.мин. Переносили колонки в пробирки для сбора РНК.
20 Непосредственно на мембрану вносили 15 мкл воды, без РНКаз, инкубировали 1 мин. при комнатной температуре, центрифугировали 90 сек. при 12,4 тыс.об.мин. До дальнейшего применения пробы хранились при температуре -80°С. Далее проводили синтез первой цепи кДНК с помощью реактивов компании Promega (США). Уровень экспрессии
25 таргетных генов (в молях) определяли по сравнению с экспрессией гена домашнего хозяйства β-актина с помощью набора для проведение ПНР в реальном времени в присутствии SYBR Green I и референсного красителя
ROX (Синтол, Россия) На рис 1. приведен пример одной из нуклеотидных замен, обеспечивающих увеличение жизни мРНК.
зо Постановка реакции обратной транскрипции:
13
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 1) на льду: к 10 мкл РНК добавляли 2,5 мкл Random Hexamer, инкубировали 5 мин. при 70°С;
2) убирали лед;
3) осаждали капли;
4) приготавливали смесь для каждого образца:
- 5 мкл буфера для обратной транскриптазы MMLV 5Х
- 1,25 дНТП
- 1 ,25 RNase Inhibitor
- 1 мкл ММЬУТранскриптазы
- 4 мкл Н20
5) добавляли по 12,5 мкл смеси в каждую пробирку, инкубировали 1 ч. при 37°С;
6) останавливали реакции инкубацией при 75 °С в течение 5 мин.
Все образцы кДНК хранились при температуре -80С.
Для выполнении ПЦР в реальном времени использовали прямые и обратные праймеры к vegf и β-actin (табл. 2): Реакционную смесь для ПЦР в реальном времени в присутствии SYBR Green I применяли согласно инструкции производителя. Измерения проводили на приборе CFX90 Touch Real-time PCR Detection System.
Figure imgf000015_0001
Табл. 2. Праймеры для выполнения ПЦР.
В результате проведенных исследований были выявлены мутации, положительно влияющие на время жизни мРНК (делеция С 1071 , делеция С 1079, делеция Т 1111 , замена А на С 1144, делеция А 1148, делеция С 1155, делеция А 1173, делеция G 1183, делеция С 1185, замена G на С 1536
14
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) и др.). Указанные изменения в различных комбинациях из 4-10 мутаций были сведены в синтетические конструкты, включающие кодирующую часть гена vegf и 3'UTR, оптимизированные по отношению к гену vegf. Основные из полученных вариантов представлены Seq#2-l l . Чтобы 5 выбрать наиболее оптимальный вариант из разработанных генных конструкций было выполнено сравнительное исследование, в ходе которого определяли динамику накопления мРНК трансфицированными клетками с помощью ПЦР-РТ, как указано выше. Результаты основных десяти генных конструкций в виде кратности увеличения концентрации ю мРНК на сроках 24 и 48 ч после трансфекции представлены на рис. 1.
Как следует из графика, в некоторых случаях комбинации нескольких мутаций, каждая из которых в отдельности оказывала положительное влияние на время жизни мРНК, не сопровождались значимым увеличением накопления мРНК, по сравнению с исходной генной конструкцией (Seq# l).
15 Среди генных конструкций, характеризовавшихся увеличением времени жизни мРНК, отсутствие снижения концентрации определялось только в случае Seq#l l, тогда как в остальных случаях уровень мРНК снижался через 48 ч. после трансфекции по сравнению с показателем на сроке 24 ч. В этой связи, именно данная генная конструкция была выбрана как
20 наиболее оптимальная и подвергнута дальнейшим сравнительным исследованиям.
На рис. 2. приведен результат ПЦР-РТ конструкции Seq#l l в сравнении с неоптимизированной последовательностью Seq#l . На приведенном графике видно, что уже через 12 ч. уровень мРНК гена VEGF
25 оптимизированной конструкции превышал значение параметра в контроле, где для трансфекции была использована исходная плазмидная ДНК.
Важно, что динамика прироста концентрации мРНК в обеих группах совпадала с пиком на отметке в 24 ч. после трансфекции. Однако только в случае исходной генной конструкции наблюдалось постепенное снижение зо уровня мРНК, обусловленное быстрой биодеградацией молекул, тогда как
15
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) в случае оптимизированной конструкции (Seq#l l) определялась фаза «плато» длительностью не менее 6 ч. с последующим плавным снижением концентрации мРНК. При этом на крайней временной точке разница между группами по данному показателю составила 190%.
Разработанная плазмидная ДНК, несущая ген vegf, была исследована in vitro для количественной оценки продукции белка VEGF клетками НЕК273. При этом, концентрация терапевтического белка определялась в культуральной среде с помощью ELISA через 6, 12, 24, 48, 72 и 96 ч. после трансфекции клеток. Оказалось, что накопленная концентрация терапевтического белка в культуральной среде клеток, трансфицированных генной конструкцией, значительно превышала значение параметра в контроле, в том числе в группах с альтернативными вариантами разработанных генных конструкций, характеризовавшихся неоптимальной последовательностью 3'UTR гена vegf и стандартным временем жизни мРНК трансгена (рис. 3). Важно, что максимальный прирост концентрации VEGF в культуральной среде обеих групп трансфицированных клеток (увеличение в 2,3-2,4 раза) наблюдался через 36 часов после начала эксперимента, что соответствовало данным ПЦР-РТ с пиковой концентрацией мРНК генных конструкций на временной точке 24 часа. В дальнейшем, если концентрация белка VEGF в среде трансфицированных оптимизированной генной конструкцией клеток продолжала нарастать высокими темпами, то в группе с исходной плазмидной ДНК прирост существенно замедлялся, незначительно превышая прирост в контрольной группе (культура без трансфекции).
Определение накопленной концентрации белка VEGF в культуральной среде позволяет судить о динамике его продукции клетками и количественном приросте на каждом контрольном сроке, однако не позволяет оценить внутриклеточную концентрацию белка на каждой из временных точек. При этом особенно важным в комплексной оценке времени жизни мРНК генных конструкций является определение уровня
16
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) белка VEGF в клетках на крайних сроках наблюдения. В этой связи, клетки после 4 сут. культивирования были подвергнуты Вестерн-блоттинг анализу по стандартной методике с использованием антител к белку VEGF. Концентрация белка оказалась наибольшей в лизате клеток, трансфицированных оптимизированной генной конструкцией Seq# 11 (рис. 4). При этом уровень белка в случае клеток, трансфицированных исходной конструкцией, на данном сроке наблюдения незначительно превышал эндогенную концентрацию (контроль).
Более того, кондиционированная среда клеток, трансфицированных оптимизированными генными конструкциями, характеризовалась статистически значимо большей ангиогеннной активностью, определенной в стандартном тесте HUVEC tube formation assay.
Сопоставляя результаты проведенных исследований, можно заключить, что мРНК оптимизированной генной конструкции (Seq#l l) характеризовалась большим временем жизни, что привело к более длительной продукции высоких концентраций терапевтического белка VEGF вплоть до крайних сроков наблюдения. Исходная же генная конструкция характеризовалась меньшей стабильностью мРНК, коротким и менее выраженным биологическим эффектом.
Таким образом, основной технический результат настоящего изобретения состоит в увеличении общей продукции терапевтического белка за счет увеличения времени жизни мРНК, достигнутой посредством выявления оптимальных изменений последовательности 3'UTR гена vegf. Неожиданным стал тот факт, что замена всего одного нуклеотида в целевой области оказала столь выраженный эффект на продолжительность жизни мРНК и, соответственно, продукцию терапевтического белка. Во всех известных работах в данной области исследователи выполняли другие изменения, с вовлечением гораздо большего количества нуклеотидов.
Учитывая недостаточную изученность функционального предназначения каждого сайта в 3'UTR мРНК, наиболее благоприятными с точки зрения
17
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) безопасности и нивелирования влияния на другие аспекты метаболизма мРНК являются именно минимальные, точечные изменения, в случае, если они позволяют добиться нужного эффекта. Важно отметить, что длина последовательности 3'UTR гена vegf составляет не менее 250 нуклеотидов, следовательно, общее количество только единичных, точечных мутаций в виде замены одного нуклеотида на другой составляет не менее 750. Принимая во внимание другие возможные варианты изменений (делеции, дупликации, инсерции), а также с учетом задействования более одного сайта, количество вариантов генных конструкций, отличающихся 3'UTR гена vegf составляет сотни тысяч. Таким образом, выявление нескольких вариантов изменений последовательности, приводящих к увеличению продолжительности жизним мРНК без негативного влияния на другие аспекты ее функционирования равносильно выигрышу в лотерею.
Учитывая опыт в разработке геннотерапевтических препаратов нами были созданы фармацевтические композиции на основе разработанной оптимизированных генных конструкций и фармакологически приемлемых вспомогательных веществ, представленных, по меньшей мере, одним криопротектантом, обладающим свойствами наполнителя, и стабилизатором рН, в эффективных количествах обеспечивающих получение изотонического раствора плазмидной ДНК для инъекций.
Состав фармацевтической композиции, обеспечивающий сохранение свойств оптимизированной плазмидной ДНК, представляет собой:
- плазмидная ДНК от 0,1 до 10 мг/мл, предпочтительно от 0,5 до 4 мг/мл, наболее предпочтительно от 0,8 до 1,2 мг/мл.
- глюкоза (декстроза) от 200 до 400 мМ, предпочтительно от 250 до 350 мМ, наболее предпочтительно от 280 мМ до 320 мМ.
фосфат натрия (смесь тризамещенного, двузамещенного и однозамещенного фосфатов натрия) в концентрации от 3 до 30 мМ, предпочтительно от 5 до 20 мМ, наболее предпочтительно от 8 до 12 мМ.
18
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) pH раствора от 7,0 до 9,0, предпочтительно от 7,2 до 8,5, наиболее предпочтительно от 7,4 до 8,2 .
Состав одного из вариантов фармацевтической композиции следующий:
5 - плазмидная ДНК по Seq#l 1 - 1 ,2 мг;
- декстрозы моногидрат - 60 мг;
- натрия гидрофосфата додекагидрат - 3,94 мг;
- натрия дигидрофосфата дигидрат - 0,16 мг.
Данный вариант были использован в исследованиях, описанных в ю примерах.
Разработанные генные конструкции и фармацевтические композиции на их основе были исследованы in vivo в экспериментальных моделях, воспроизводящих основные патофизиологические и патоморфологические симптомы, характерные для заболеваний, являющихся известными
15 показаниями к применению плазмидной ДНК с геном vegf.
Пример 1. Модель хронической ишемии нижних конечностей.
Исследование было выполнено на иммунодефицитных мышах (п=90), которым для моделирования хронической ишемии нижней конечности (ХИНК) выполнялось пересечение правой бедренной артерии в
20 паховой области. Введение фармацевтической композиции на основе плазмидной ДНК по Seq#l l выполнялось в двух вариантах: 100 мкг однократно на 14-е сут. и по 200 мкг двукратно с на 1-е и 14-е сут. - в проксимальный и дистальный участок послеоперационной раны. Контролем служили три группы животных: здоровые, оперированные но
25 без введения каких-либо веществ; оперированные с введением воды для инъекций. Животных выводили из эксперимента через 7, 21, 35 сут. после операции, конечности подвергали гистологическому исследованию с определением количества сосудов и отношения числа эндотелиоцитов к мышечным волокнам. На сроках 1 , 7, 14, 21 , 28 и 35 сут. выполняли зо лазерную сканирующую доплерометрию для определения уровня
19
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) кровотока (blood flow perfusion rate) в ишемизированной и здоровой конечности.
Оказалось, что независимо от дозы и режима введения, уровень кровотока в ишемизированной конечности увеличивался только в 5 экспериментальных группах через 7 сут. после введение разработанного геннотерапевтического препарата. Уровень кровотока увеличивался, достигая к крайнему сроку наблюдения значений, близких к параметру здоровых животных. В контрольных группах оперированных животных уровень кровотока оставался на низком уровне без положительной ю динамики (рис. 5).
Функциональные результаты были подтверждены данными гистологического исследования. В экспериментальных группах было выявлено большее количество сосудов (рис. 6), а также большее отношение С034+-клеток (эндотелиоцитов) к мышечным волокнам (рис. 7).
15 Пример 2. Модель костного дефекта критического размера.
Разработанная генная конструкция по Seq#l l была объединена с матриксом из кальциевого фосфата по ранее разработанному протоколу:
1. Подготовка носителя:
а) отмывка (инкубирование в 0,5 М фосфатного буфера в объеме 1 мл 20 при температуре 37°С при постоянном встряхивании в течение 12 ч.);
б) уравновешивание (обработка 10 мМ фосфатного буфера в объеме 1 мл при температуре 37°С при постоянном встряхивании, 3 раза по 10 мин.);
в) высушивание (инкубирование при температуре 37°С до полного 25 высыхания - 3 ч.).
2. Нанесение нуклеиновой кислоты (инкубирование с раствором плазмидной ДНК по Seq#l l в ЮмМ фосфатном буфере в концентрации 1 мкг/мкл при температуре 37°С и постоянном встряхивании в течение 12 ч.).
зо 3. Обработка полученного комплекса «носитель-генная конструкция»:
20
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) а) отмывка (обработка 5 мМ раствором фосфата в объеме 1 мл 3 раза);
б) высушивание (инкубирование при температуре 37°С до полного высыхания - 3 ч.).
5 Полученный ген-активированный костный графт был исследован в ортотопических условиях. Исследование было выполнено на кроликах породы Шиншилла (п=15). Каждому животному выполнялись два одинаковых симметричных полнослойных дефекта обеих теменных костей, диаметром по 10 мм, которые являются «критическими» для кроликов, так ю как естественный восстановительный процесс, без каких-либо оптимизирующих влияний не завершается полной консолидацией. В дефекты правых теменных костей имплантировали ген-активированный остеопластический материал (экспериментальная группа), состоящий из кальциевого фосфата и плазмидной ДНК Seq#l l , в дефекты левых
15 теменных костей - носитель без плазмидной ДНК (контрольная группа).
Животных выводили из эксперимента через 30, 60 и 90 сут., результаты оценивали с использованием компьютерной томографии и гистологических методов.
В связи с исходно высокой плотностью выбранного носителя (около
20 1800 HU) и длительностью его биорезорбции (более 6 мес.) объективно оценить признаки репаративного остеогенеза в сравнительном аспекте не удалось. Однако по данным гистологического исследования, только в случае применения ген-активированного остеопластического материала признаки остеогенеза наблюдались уже через 30 сут. после операции в
25 центральной части дефекта (рис. 8).
Как видно на рис. 8 гранулы материла, расположенные в центральной части дефекта, выполненного рыхлой волокнистой соединительной тканью, являлись источником репаративного остеогенеза, тогда как в контроле кальциевый фосфат без плазмидной ДНК был окружен только зо рыхлой волокнистой соединительной тканью без признаков образования
21
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) костной ткани. Полученные данные свидетельствуют о том, что введение плазмидной ДНК Seq#l l в область костного дефекта критических размеров привело к выраженной индукции репаративного остеогенеза, что может быть обусловлено как опосредованным через ангиогенез действием, так и прямым влиянием VEGF на клетки мезенхимальной линии.
Таким образом, представленные выше примеры иллюстрируют тот факт, что разработанная оптимизированная генная конструкция и фармацевтическая композиция на ее основе обладают выраженной ангиогенной активностью, что позволяет рассчитывать на эффективность ее использования в лечении ишемических заболеваний сердечно- сосудистой системы. Кроме того, оптимизированная генная конструкция с геном vegf может оказаться эффективной в лечении других патологических состояний, требующих активации репаративного процесса, таких как: повреждения кожи и опорно-двигательного аппарата, травмы периферических нервов, синдром диабетической стопы, боковой амиотрофический склероз.
Список ссылочной литературы:
1. Gene therapy clinical . trials worldwide. http://www.abedia.com/wiley/years.php.
2. Grigorian A.S., Schevchenko K.G Some possible molecular mechanisms of VEGF encoding plasmids functioning. Cell. Tanspl. Tiss. Engin. 2011. VI (3): 24-8.
3. Baboo S., Cook P.R. "Dark matter" worlds of unstable RNA and protein.
Nucleus 2014; 5(4): 281-6.
4. Vislovukh A., Vargas T.R., Polesskaya A. et al. Role of 3 '-untranslated region translational control in cancer development, diagnostics and treatment. World
J. Biol. Chem. 2014; 5(1): 40-57.
5. Malter J. Method to increase regulatory molecule production. US patent jYo5,587,300; 24.12.1996.
6. Sytkowski A.J., Grodberg J. Erythropoietin DNA having modified 5' and 3'
22
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) sequences and its use to prepare EPO therapeutics. US patent N°6, 153,407; 28.11.2000
7. Mauro V.P., Chappell S.A., Zhou W. et al. Reengineering mRNA primary structure for enhanced protein production. US patent application JY22012/0053333 Al ; 01.03.2012.
8. Folkman J., Merler E., Abernathy C. et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. J. Exp. Med. 1971 ; 133(2): 275-88.
. Goel H.L., Mercurio A.M. VEGF targets the tumour cell. Nat. Rev. Cancer.
2013; 13(12): 871-82.
1 O.Koch S., Claesson- Welsh L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2012; 2(7): a006502.
1 l .Matsumoto Т., Bohman S., Dixelius J. et al. VEGF receptor-2 Y951 signaling and a role for the adapter molecule TSAd in tumor angiogenesis. EMBO J. 2005; 24(13): 2342-53.
12. Bhattacharya R., Kwon J., Li X. et al. Distinct role of PLCbeta3 in VEGF- mediated directional migration and vascular sprouting. J. Cell Sci. 2009; 122(Pt 7): 1025-34.
13. Coultas L., Chawengsaksophak K., Rossant J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature 2005; 438(7070): 937-45.
H.Olsson A.K., Dimberg A., Kreuger J. et al. VEGF receptor signalling - in control of vascular function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006; 7(5): 359-71.
15. Ma X.N., Li Q.P., Feng Z.C. Research progress in cytokines and signaling pathways for promoting pulmonary angiogenesis and vascular development. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2013; 15(9): 800-5.
16. Арутюнян И.В., Кананыхина Е.Ю., Макаров A.B. Роль рецепторов VEGF-A165 в ангиогенезе. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2013; VIII(l): 12-8.
17. Cherviakov lu.A., Staroverov I.N., Nersesian E.G. et al. The opportunities for genie therapy of chronic obliterating diseases of lower limbs arteries.
23
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Khirurgiia (Mosk). 2014; (4): 40-5.
Willyard C. Limb-saving medicines sought to prevent amputation. Nature Medicine 2012; 18(3): 328.
Hillenbrand M., Holzbach Т., Matiasek K. et al. Vascular endothelial growth factor gene therapy improves nerve regeneration in a model of obstetric brachial plexus palsy. Neurol Res. 2015; 37(3): 197-203.
Kessler JA. Vascular endothelial growth factor gene transfer for diabetic polyneuropathy.Ann Neurol. 2009; 65(4): 362-4.
Zavalishin I. A., Bochkov N.P., Suslina Z.A. et al. Gene therapy of amyotrophic lateral sclerosis.ByFui Exp Biol Med. 2008; 145(4): 483-6.
Zhao D.M., Yang J.F., Wu S.Q. et al. Effect of vascular endothelial growth factor 165 gene transfection on repair of bone defect: experiment with rabbits. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2007; 87(25): 1778-82.
Geiger F., Bertram H., Berger I. et al. Vascular endothelial growth factor gene-activated matrix (VEGF165-GAM) enhances osteogenesis and angiogenesis in large segmental bone defects. J. Bone Miner. Res. 2005; 20(11): 2028-35.
Neve A., Cantatore F.R, Corrado A. et al. In vitro and in vivo angiogenic activity of osteoarthritic and osteoporotic osteoblasts is modulated by VEGF and vitamin D3 treatment. Regul. Pept. 2013; 184: 81-4.
Marini M., Sarchielli E., Toce M. et al. Expression and localization of VEGF receptors in human fetal skeletal tissues. Histol. Histopathol. 2012; 27(12): 1579-87.
Tombran-Tink J., Barnstable CJ. Osteoblasts and osteoclasts express PEDF, VEGF- A isoforms, and VEGF receptors: possible mediators of angiogenesis and matrix remodeling in the bone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 316(2): 573-9.
Mayr-Wohlfart U., Waltenberger J., Hausser H. et al. Vascular endothelial growth factor stimulates chemotactic migration of primary human osteoblasts. Bone 2002; 30(3): 472-7.
24
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) D' Alimonte I., Nargi E., Mastrangelo F. et al. Vascular endothelial growth factor enhances in vitro proliferation and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells. J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 2011 ; 25(1): 57-69. Yang Y.Q., Tan YY, Wong R. et al. The role of vascular endothelial growth factor in ossification. Int. J. Oral Sci. 2012; 4(2): 64-8.
Berendsen A.D., Olsen B.R. How vascular endothelial growth factor-A (VEGF) regulates differentiation of mesenchymal stem cells. J. Histochem. Cytochem. 2014; 62(2): 103-8.
25
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

Claims

Формула изобретения:
1. Способ продления времени жизни мРНК трансгена в клетке млекопитающего, трансфицированной генной конструкцией, предусматривающий проведение точечных делений в 3" некодирующей области гена фактора роста эндотелия сосудов (vegf), при котором делетированный нуклеотид не заменяется, либо заменяется на цитозин в точках замещения гуанина или аденина, затем определяется время жизни мРНК при каждой делеции, сведения анализируются и конструируется генная конструкция, содержащая З'некодирующую область с совокупностью одиночных делеций и/или замен на цитозин, показавших наилучший результат по продлению жизни мРНК.
2. Способ по п.1, где трансфицированная генная конструкция позволяет увеличить количество кодируемого трансгеном белка.
3. Способ по п.1 , где З'-некодирующая область мРНК является некодирующей областью гена, выбранного из: vegfl21, vegf 145, vegfl65, vegf 185, и других возможных изоформ гена фактора роста эндотелия сосудов.
4. Плазмидная ДНК с оптимизированной последовательностью 3'- некодирующец области гена фактора роста эндотелия сосудов, выбранного из изоформ: 121 , 145, 165, 185 или других, содержащая в 3 '-некодирующей области одну или несколько делеций и/или замен одиночных нуклеотидов, сконструированная для осуществления способа по п.1.
5. Плазмидная ДНК гена фактора роста эндотелия сосудов vegf 165, представленная на Seq#l l, пригодная для осуществления способа по п.1, отличающаяся тем, что содержит следующие делеции и замещения: в положении 1079 - С-делеция, 1111 - Т-делеция, 1144 - А/С-замена, 1148 - А-делеция, 1155 - С-делеция, 1173 - А-делеция, 1185 - А-делеция, 1536 - G/C-замена.
6. мРНК плазмидной ДНК по пп.4 или 5, содержащая 3 '- некодирующую область, соответствующую одной или нескольким
25
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) делециям и/или заменам одиночных нуклеотидов плазмидной ДНК по пп.4 или 5.
7. Фармацевтическая композиция для регенерации соединительной, мышечной, нервной тканей, включающая плазмидную ДНК по пп.4 или 5 и, по меньшей мере, один криопротектант и стабилизатор рН.
8. Применение плазмидной ДНК по п.5 в регенерации соединительной, нервной, мышечной, костной тканей, тканей сердечно-сосудистой системы.
26
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2015/000852 2015-05-26 2015-12-07 Оптимизированная нуклеотидная последовательность и фармацевтическая композиция на ее основе с пролонгированной экспрессией трансгена vegf WO2016190774A1 (ru)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2015396177A AU2015396177B2 (en) 2015-05-26 2015-12-07 Optimized nucleotide sequence and pharmaceutical composition based thereon with prolonged VEGF transgene expression
CA2985608A CA2985608C (en) 2015-05-26 2015-12-07 Optimized nucleotide sequence and pharmaceutical composition based thereon with prolonged vegf transgene expression
EA201700456A EA039395B1 (ru) 2015-05-26 2015-12-07 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННОЙ КОНСТРУКЦИИ И ПЛАЗМИДНАЯ ДНК С УВЕЛИЧЕННЫМ ВРЕМЕНЕМ ЖИЗНИ мРНК ТРАНСГЕНА VEGF В КЛЕТКЕ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО, ПЛАЗМИДНАЯ ДНК ГЕНА VEGF165, мРНК, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК
MX2017013206A MX2017013206A (es) 2015-05-26 2015-12-07 Secuencia de nucleotidos optimizada y composicion farmaceutica basada en la misma con expresion de transgen vegf prolongada.
CN201580080399.1A CN107614687B (zh) 2015-05-26 2015-12-07 具有延长的vegf转入基因表达的优化的核苷酸序列和基于它的药物组合物
EP15893474.5A EP3305901B1 (en) 2015-05-26 2015-12-07 Optimized nucleotide sequence and pharmaceutical composition based thereon with prolonged vegf transgene expression
BR112017023058-5A BR112017023058B1 (pt) 2015-05-26 2015-12-07 Método de triagem para mrnas de vegf com tempo de vida prolongado, dna plasmídico e seu uso, e composição farmacêutica para a regeneração de tecidos nervosos, conjuntivos e musculares

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015119768A RU2612497C2 (ru) 2015-05-26 2015-05-26 Оптимизированная нуклеотидная последовательность и фармацевтическая композиция на ее основе с пролонгированной экспрессией трансгена vegf
RU2015119768 2015-05-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016190774A1 true WO2016190774A1 (ru) 2016-12-01

Family

ID=57392933

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2015/000852 WO2016190774A1 (ru) 2015-05-26 2015-12-07 Оптимизированная нуклеотидная последовательность и фармацевтическая композиция на ее основе с пролонгированной экспрессией трансгена vegf

Country Status (10)

Country Link
US (2) US9896493B2 (ru)
EP (1) EP3305901B1 (ru)
CN (1) CN107614687B (ru)
AU (1) AU2015396177B2 (ru)
BR (1) BR112017023058B1 (ru)
CA (1) CA2985608C (ru)
EA (1) EA039395B1 (ru)
MX (1) MX2017013206A (ru)
RU (1) RU2612497C2 (ru)
WO (1) WO2016190774A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114908089B (zh) * 2021-02-08 2024-03-15 上海细胞治疗集团有限公司 3’utr的构建方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5587300A (en) * 1994-04-26 1996-12-24 Wisconsin Ulumni Research Foundation Method to increase regulatory molecule production

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6153407A (en) 1992-07-28 2000-11-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics
AU742365B2 (en) 1997-03-14 2002-01-03 Selective Genetics, Inc. Adenoviral vectors with modified tropism
US6627436B2 (en) 1997-10-31 2003-09-30 Stratagene Vector for gene expression in prokaryotic and eukaryotic systems
BR9908754A (pt) 1998-03-13 2000-11-28 American Home Prod Composições liofilizada e lìquida de polinucleotìdeo e farmacêutica, processos para tratar um paciente mamìfero e para preparar uma composição liofilizada de polinucleotìdeo, produto liofilizado de polinucleotìdeo, e, processo para liofilizar uma composição de polinucleotìdeo
US7598079B2 (en) * 1998-12-24 2009-10-06 Novation Pharmaceuticals, Inc. Assay for identifying compounds which affect stability of mRNA
AU5646300A (en) 1999-02-10 2000-08-29 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Methods of stimulating angiogenesis
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
US7288521B2 (en) 2000-04-06 2007-10-30 Franco Wayne P Growth factor therapy mobilization of stem cells into the peripheral blood
CN1351055A (zh) 2000-10-26 2002-05-29 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人的血管内皮生长因子165受体(vegf－165r)10.67和编码这种多肽的多核苷酸
CA2451311A1 (en) * 2001-06-20 2003-01-03 Ludwig Institute For Cancer Research Stimulation of vascularization with vegf-b
US7981863B2 (en) 2001-09-19 2011-07-19 Neuronova Ab Treatment of Parkinson's disease with PDGF
CN100431611C (zh) 2002-07-04 2008-11-12 朱静亚 多肽－脂质体与人血管内皮生长因子基因重组质粒复合物及用途
WO2004050126A2 (en) 2002-12-02 2004-06-17 Anges Mg, Inc. Compositions for treating or preventing angiogenesis-dependent symptoms
EP1791945A1 (en) 2004-09-17 2007-06-06 Centelion Stable liquid formulations of plasmid dna
RU2297848C2 (ru) 2005-05-11 2007-04-27 Александр Веньяминович Иткес Генно-инженерная конструкция vegf-ибмед (vegf-ibmed)
ES2338400B1 (es) 2008-05-06 2011-09-14 David Benet Ferrus Conjunto de moleculas antiangiogenicas y su uso.
JP5735927B2 (ja) 2009-02-24 2015-06-17 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート タンパク質生産の増強のためのｍＲＮＡの一次構造の再操作
US8367350B2 (en) 2009-04-29 2013-02-05 Morehouse School Of Medicine Compositions and methods for diagnosis, prognosis and management of malaria
RU2431669C2 (ru) * 2009-06-23 2011-10-20 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина" Способ получения лекарственного препарата генетически модифицированных клеток
RU2542385C2 (ru) * 2012-08-31 2015-02-20 Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" Способ получения фармацевтической композиции для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, фармацевтическая композиция, полученная этим способом, и способ лечения ишемии тканей и/или органов человека

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5587300A (en) * 1994-04-26 1996-12-24 Wisconsin Ulumni Research Foundation Method to increase regulatory molecule production

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHVALB P.G. ET AL.: "«Effektivnost i bezopasnost primeneniya preparata ''Neovaskulgen'' v kompleksnoi terapii patsientov s khronicheskoi ishemiei nizhnikh konechnostei (IIb-III faza klinicheskikh ispytanii", KLETOCHNAYA TRANSPLANTOLOGIYA I TKANEVAYA INZHENERIYA, vol. VI, no. 3, 2011, pages 76 - 83, XP009504673 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3305901A1 (en) 2018-04-11
RU2015119768A (ru) 2016-12-20
EA201700456A1 (ru) 2018-06-29
CN107614687B (zh) 2021-05-28
CA2985608A1 (en) 2016-12-01
CN107614687A (zh) 2018-01-19
CA2985608C (en) 2021-06-15
EP3305901B1 (en) 2020-09-30
US20180086800A1 (en) 2018-03-29
MX2017013206A (es) 2018-02-15
BR112017023058A2 (pt) 2018-10-16
RU2612497C2 (ru) 2017-03-09
US20160347803A1 (en) 2016-12-01
US10040837B2 (en) 2018-08-07
EP3305901A4 (en) 2018-10-24
EA039395B1 (ru) 2022-01-21
AU2015396177B2 (en) 2019-02-28
AU2015396177A1 (en) 2017-11-02
US9896493B2 (en) 2018-02-20
BR112017023058B1 (pt) 2024-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Berger et al. Mediation of the acute stress response by the skeleton
Jing et al. The role of microRNAs in bone remodeling
Chen et al. miR‐136‐3p targets PTEN to regulate vascularization and bone formation and ameliorates alcohol‐induced osteopenia
Tang et al. miR-383 negatively regulates osteoblastic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in rats by targeting Satb2
Shyu et al. Hyperbaric oxygen‐induced long non‐coding RNA MALAT1 exosomes suppress MicroRNA‐92a expression in a rat model of acute myocardial infarction
JP2019531075A (ja) インスリン受容体との結合力が減少された、インスリンアナログ及びその用途
Scanlon et al. Loss of Cbl-PI3K interaction modulates the periosteal response to fracture by enhancing osteogenic commitment and differentiation
Liu et al. A novel transgenic murine model with persistently brittle bones simulating osteogenesis imperfecta type I
Lee et al. Nedd4 deficiency in vascular smooth muscle promotes vascular calcification by stabilizing pSmad1
Yang et al. Collagen type V a2 (COL5A2) is decreased in steroid-induced necrosis of the femoral head
JPWO2011111824A1 (ja) マイクロｒｎａを用いた心筋細胞の増殖方法
Wang et al. MicroRNA-133a regulates the viability and differentiation fate of bone marrow mesenchymal stem cells via MAPK/ERK signaling pathway by targeting FGFR1
Xie et al. miR‐196b‐5p Regulates Osteoblast and Osteoclast Differentiation and Bone Homeostasis by Targeting SEMA3A
RU2612497C2 (ru) Оптимизированная нуклеотидная последовательность и фармацевтическая композиция на ее основе с пролонгированной экспрессией трансгена vegf
Cong et al. MiR-1 is a critical regulator of chondrocyte proliferation and hypertrophy by inhibiting Indian hedgehog pathway during postnatal endochondral ossification in miR-1 overexpression transgenic mice
US20090233854A1 (en) Novel application of apelin
KR102308102B1 (ko) Ccr2를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물
CN111705061B (zh) 和心脏疾病相关的piRNA-P1与piRNA-P1反义核苷酸、应用和药物
EP4188392A1 (en) Long non-coding rna as therapeutic target in cardiac disorders and cardiac regeneration
WO2020139154A1 (en) Gene therapy dna vector and its application
Nagamine et al. XRASGRP2 expression during early development of Xenopus embryos
KR102446150B1 (ko) Soluble CCR2 발현 유도된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물
CN111701021B (zh) Nipa2作为药物靶点在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物中的应用
Wongwitwichot et al. Induction of rat marrow stromal cells by FGF2 and insulin activates transcription of runx2 gene through ap1 consensus sequence
KR20200056241A (ko) Ｒｂｍ3 활성제를 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15893474

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015893474

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2017/013206

Country of ref document: MX

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015396177

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20151207

Kind code of ref document: A

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112017023058

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2985608

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: 112017023058

Country of ref document: BR

Free format text: 1. COM BASE NA RESOLUCAO 228/09, SOLICITA-SE QUE SEJA APRESENTADO NOVO CONTEUDO DE LISTAGEM DE SEQUENCIA NOS MOLDES DA RESOLUCAO NO 187 DE 27/04/2017, POIS O CONTEUDO DO ARQUIVO DA LISTAGEM DE SEQUEENCIA NAO FOI APRESENTADO NO PADRAO OMPI ST.25. 2. APRESENTE A TRADUCAO SIMPLES DA FOLHA DE ROSTO DA CERTIDAO DE DEPOSITO DA PRIORIDADE REIVINDICADA; OU DECLARACAO DE QUE OS DADOS DO PEDIDO INTERNACIONAL ESTAO FIELMENTE CONTIDOS NA PRIORIDADE REIVINDICADA, CONTENDO TODOS OS DADOS IDENTIFICADORES (NUMERO DA PRIORIDADE, DATA, DEPOSITANTE E INVENTORES), CONFORME O PARAGRAFO UNICO DO ART. 25 DA RESOLUCAO 77/2013. CABE SALIENTAR NAO FOI POSSIVEL INDIVIDUALIZAR OS TITULARES DA CITADA PRIORIDADE, INFORM

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: 112017023058

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112017023058

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20171025