EA039395B1 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННОЙ КОНСТРУКЦИИ И ПЛАЗМИДНАЯ ДНК С УВЕЛИЧЕННЫМ ВРЕМЕНЕМ ЖИЗНИ мРНК ТРАНСГЕНА VEGF В КЛЕТКЕ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО, ПЛАЗМИДНАЯ ДНК ГЕНА VEGF165, мРНК, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННОЙ КОНСТРУКЦИИ И ПЛАЗМИДНАЯ ДНК С УВЕЛИЧЕННЫМ ВРЕМЕНЕМ ЖИЗНИ мРНК ТРАНСГЕНА VEGF В КЛЕТКЕ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО, ПЛАЗМИДНАЯ ДНК ГЕНА VEGF165, мРНК, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК Download PDFInfo
- Publication number
- EA039395B1 EA039395B1 EA201700456A EA201700456A EA039395B1 EA 039395 B1 EA039395 B1 EA 039395B1 EA 201700456 A EA201700456 A EA 201700456A EA 201700456 A EA201700456 A EA 201700456A EA 039395 B1 EA039395 B1 EA 039395B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- mrna
- gene
- plasmid dna
- vegf
- deletion
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 37
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 title claims description 9
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 title claims description 4
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 title abstract description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title abstract 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 23
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 45
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 45
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 34
- 101100372758 Danio rerio vegfaa gene Proteins 0.000 claims description 29
- 101150030763 Vegfa gene Proteins 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 3
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 2
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical group NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 229930024421 Adenine Chemical group 0.000 claims 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 3
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 claims 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 abstract description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 3
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 44
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 42
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 20
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 6
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 5
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 5
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 5
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000001582 osteoblastic effect Effects 0.000 description 4
- 210000003455 parietal bone Anatomy 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 3
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 3
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005176 AU Rich Elements Proteins 0.000 description 2
- 208000008960 Diabetic foot Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036123 Far upstream element-binding protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710133942 Far upstream element-binding protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 108091021225 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein D0 Proteins 0.000 description 2
- 102100033985 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D0 Human genes 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 2
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 2
- 208000010886 Peripheral nerve injury Diseases 0.000 description 2
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 108010065850 Tristetraprolin Proteins 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000002520 cambial effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 2
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 2
- 102100031622 mRNA decay activator protein ZFP36 Human genes 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000026341 positive regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N (2R,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N 0.000 description 1
- SPFMQWBKVUQXJV-BTVCFUMJSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;hydrate Chemical compound O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O SPFMQWBKVUQXJV-BTVCFUMJSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 241001025319 Etheostoma collis Species 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 101001001487 Homo sapiens Phosphatidylinositol-glycan biosynthesis class F protein Proteins 0.000 description 1
- 101000595923 Homo sapiens Placenta growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000707215 Homo sapiens SH2 domain-containing protein 2A Proteins 0.000 description 1
- 101600082430 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A (isoform VEGF165) Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010073713 Musculoskeletal injury Diseases 0.000 description 1
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 102100035846 Pigment epithelium-derived factor Human genes 0.000 description 1
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101710101682 Polyadenylate-binding protein-interacting protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100034313 Polyadenylate-binding protein-interacting protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 238000012193 PureLink RNA Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100031779 SH2 domain-containing protein 2A Human genes 0.000 description 1
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 description 1
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000009520 Vascular Endothelial Growth Factor C Human genes 0.000 description 1
- 108010073923 Vascular Endothelial Growth Factor C Proteins 0.000 description 1
- 102300041083 Vascular endothelial growth factor A isoform VEGF165 Human genes 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N [(1S,2R,3S,4S,5R,6S)-2,3,5-trihydroxy-4,6-diphosphonooxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@H]1OP(O)(O)=O MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000002266 amputation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000003461 brachial plexus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 description 1
- 230000007711 cytoplasmic localization Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960000673 dextrose monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 201000002342 diabetic polyneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 150000004683 dihydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000007646 directional migration Effects 0.000 description 1
- DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dodecahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000012976 mRNA stabilization Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- -1 monosubstituted sodium phosphates Chemical class 0.000 description 1
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003349 osteoarthritic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 210000005009 osteogenic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001009 osteoporotic effect Effects 0.000 description 1
- 208000021090 palsy Diseases 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 108090000102 pigment epithelium-derived factor Proteins 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010807 real-time PCR kit Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- 230000004218 vascular function Effects 0.000 description 1
- 230000006426 vascular sprouting Effects 0.000 description 1
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005282 vitamin D3 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011647 vitamin D3 Substances 0.000 description 1
- 229940021056 vitamin d3 Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Neurology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Выявлены точечные изменения нуклеотидной последовательности 3'UTR гена vegf, которые существенно увеличивают время жизни продукта его транскрипции - мРНК в клетках млекопитающих. Экспериментальным путем выбрана генная конструкция с оптимальным перечнем выявленных мутаций, характеризующаяся наибольшим временем жизни мРНК. Подтвержден биологический эффект разработанной генной конструкции и фармацевтической композиции на ее основе in vitro и in vivo.
Description
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к разработке оптимизированных геннотерапевтических препаратов с высокой стабильностью и пролонгированной экспрессией трансгена vegf.
Современный уровень техники
Геннотерапевтические препараты.
Все большее значение в современной медицине приобретают геннотерапевтичекие препараты группа лекарственных средств, действующим веществом которых являются генные конструкции нуклеиновые кислоты, содержащие один или несколько генов, кодирующих терапевтические белки.
К настоящему времени в мире уже зарегистрированы и внедрены в клиническую практику 5 таких препаратов, а несколько сотен находятся на стадиях экспериментальных и клинических исследований. Общее количество клинических исследований в рамках генной терапии с 1989 г. превысило 1900 [1]. Один из 5 зарегистрированных геннотерапевтических препаратов - Неоваскулген (ОАО Институт стволовых клеток человека) - разработан нами и внедрен в клиническую практику на территории России (РУ № ЛП-000671 от 28.09.11) и Украины (РУ № 899/13300200000 от 25.01.2013).
Таким образом, в условиях развития биотехнологии сформировался принципиально новый класс фармацевтических препаратов - геннотерапевтические лекарственные средства.
К наиболее безопасным вариантам генных конструкций, несущих трансген, относится плазмидная ДНК. Именно плазмидная ДНК с геном vegf является действующим веществом упомянутого выше геннотерапевтического препарата Неоваскулген. Главной проблемой плазмидной ДНК как вектора для доставки трансгена в клетки-мишени абсолютным большинством исследователей признается низкая эффективность трансфекции: лишь 1-2% от общего количества молекул генных конструкций поступает в клетки и/или экспрессируется ими [2]. При этом количество молекул поступившей в клетку плазмидной ДНК и общее число трансфицированных клеток являются одними из основных факторов, напрямую определяющих уровень продукции терапевтического белка и, соответственно, биологический эффект лекарственного средства. В этой связи в условиях развития геннотерапевтических препаратов как нового фармакологического класса высоко актуальной является разработка методов, направленных на увеличение продукции терапевтического белка, кодируемого генной конструкцией при снижении количества вводимого в организм препарата или повышении эффективности действия. Это особенно важно для плазмидной ДНК, эффективность трансфекции которой крайне низкая.
Повышение общей концентрации терапевтического белка может быть обеспечено посредством двух основных подходов. Первый - наиболее очевидный - состоит в увеличении уровня трансфекции генных конструкций. Иными словами, чем большее количество плазмидной ДНК поступит в клетки-мишени, тем большая концентрация кодируемого ей белка будет продуцирована. В рамках данного подхода предложен целый ряд физических и химических методов. Однако физические методы увеличения уровня трансфекции требуют применения специального оборудования и не всегда безопасны и выполнимы в клинической практике. Химические же методы требуют изменения состава геннотерапевтического препарата, что требует дополнительных ресурсов для производства, а также может быть сопряжено с негативными эффектами добавленных компонентов.
Второй - альтернативный подход - заключается в продлении времени жизни продукта транскрипции введенной генетической конструкции - мРНК, что приводит к увеличению количества циклов трансляции и, соответственно, повышению результирующего количества терапевтического белка за счет его пролонгированной продукции. Фундаментальные основы данного подхода были сформированы за счет накопления сведений о регуляции времени жизни мРНК. Так, описан целый ряд регуляторных молекул, вовлеченных в модуляцию стабильности мРНК, такие как РНК-связывающие протеины и регуляторные РНК (микроРНК, длинные некодирующие РНК). Важно, что воздействие указанных веществ на мРНК опосредуется через связывание с ее З'-нетранслируемой областью (3'UTR), содержащей специальные последовательности - дестабиизирующие элементы, в частности аденин-уридинобогащенный элемент (AU-rich element). Ряд веществ, такие как AU-rich element RNA-binding protein 1 (AUF1), tristetraprolin (TTP), KH-type splicing regulatory protein (KSRP), связываясь со специфическими сайтами 3'UTR, индуцируют деградацию мРНК, тогда как другие, например polyadenylate-binding protein-interacting protein 2 (PAIP2), наоборот, обеспечивают стабилизацию мРНК [3, 4].
Координация процессов деградации и стабилизации мРНК имеет важное значение для нормального функционирования клеток, а некоторые патологические состояния воспалительного или онкологического генеза, по мнению ряда авторов, могут быть связаны с посттранскрипционной дисрегуляцией, приводящей либо к недостаточной, либо к избыточной продукции факторов роста, онкогенов и других биологически активных веществ [4]. В этой связи последовательность нуклеотидов 3'UTR имеет принципиальное значение для трансдукции регуляторных влияний, эффектором которых является мРНК, и детерминации времени жизни мРНК в целом.
Анализируя данные современного уровня техники, становится очевидным, что изменение последовательности нуклеотидов 3'UTR, особенно дестабилизирующих элементов, может обеспечить продление жизни мРНК. Более того, разработаны методы сайт-направленного мутагенеза, позволяющие технически выполнить необходимые изменения в генной конструкции и, соответственно, мРНК как продукта ее
- 1 039395 транскрипции. Однако до сих пор нет точных, исчерпывающих и систематизированных данных о том, какие варианты последовательности 3'UTR, какие ее минорные сайты или их комбинации за какие аспекты функционирования мРНК отвечают [3]. Отчасти это связано с тем, что количество изоформ мРНК, отличающихся последовательностью нуклеотидов 3'UTR, варьирует в широких пределах, в том числе изза альтернативных сплайсинга и полиаденилирования. При этом качественный и количественный состав дестабилизирующих элементов 3'UTR определяется также и кодирующей областью нуклеиновой кислоты. Все это в сочетании с тем фактом, что 3'UTR определяет не только время жизни мРНК, но и другие составляющие ее физиологии, как транспорт из ядра клетки, цитоплазматическая локализация, эффективность трансляции и т.д., предопределяет сложности и во многом непредсказуемость моделирования времени жизни мРНК через изменение последовательности 3'UTR, что может выражаться как в увеличении времени жизни транскрипта, так и в снижении.
Несмотря на все трудности и недостаточную изученность вопроса детерминации, или программирования, времени жизни мРНК через изменение последовательности 3'UTR, предпринимаются попытки эмпирически подобрать такие варианты изменений в соответствующей области конкретных вариантов генных конструкций, которые увеличили бы стабильность мРНК без негативного влияния на ее функционирование.
В частности, описан способ увеличения продукции трансгена за счет замены последовательности AU-rich элемента, представленной AUUUA, на другие варианты и их комбинации, ограниченные следующими: AUGUA, AUAUA, GUGUG, AGGGA, GAGAG [5]. Однако указанная последовательность дестабилизирующего элемента в 3'UTR характерна далеко не для всех генов (описана большинством исследователей для G-CSF), а, с другой стороны, ею не исчерпывается перечень дестабилизирующих элементов, в связи с чем продление жизни мРНК может быль нивелировано.
Другими авторами разработана специальная последовательность 3'UTR гена эритропоэтина, обеспечивающая пролонгированную продукцию трансгена, входящего в состав плазмидной ДНК. Последовательность строго конкретизирована и имеет длину 100 нуклеотидов [6].
Описаны также способы элиминации специфических последовательностей 3'UTR, ответственных за связывание с различными микроРНК, индуцирующими деградацию мРНК [7].
Однако большинство предлагаемых изменений последовательности 3'UTR относятся к протяженным делециям или заменам, что неизбежно сопряжено с риском возникновения негативных эффектов на метаболизм мРНК. Кроме того, предлагаемые решения крайне зависимы от кодирующей области гена, поэтому одни неприменимы, другие недостаточно эффективны для гена vegf и продления жизни продукта его транскрипции.
Стоящие же перед нами задачи сводились к необходимости увеличить продукцию VEGF таргетными клетками (на примере клеток человека линии HEK293, мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, фибробластов человека и пр.), в которые проникла плазмидная ДНК, за счет увеличения продолжительности жизни специфической мРНК указанного гена с помощью оптимизиции его 3'UTR.
VEGF и его биологическая роль.
VEGF - семейство биологически активных белков, впервые выделенных J. Folkman с соавт. в 1971 [8], которые считаются одними из основных ауто- и паракринных факторов регуляции васкуло-, ангио(VEGF-А, В; PIGF) и лимфогенеза (VEGF-C, D); вырабатываются клетками всех тканей организма, включая эпителиальные.
В постнатальном периоде развития человека наибольшее влияние на формирование кровеносных сосудов оказывает VEGF-A (изоформы 121, 145, 148, 165, 183, 189, 206) [9]. Обнаружены три типа рецепторов VEGF. 1 и 2 тип вовлечены в ангиогенез, 3 - в образование лимфатических сосудов. При этом рецептор 1 типа обладает большей афинностью к VEGF, однако его тиразинкиназная активность гораздо ниже, чем у рецептора 2 типа, что расценивается как один из регуляторных механизмов, предотвращающих избыточную активность VEGF. Соответственно, именно через рецептор 2 типа в норме реализуются эффекты VEGF [10, 11]. После взаимодействия VEGF со специфическим рецептором 2 типа происходит аутофосфорилирование его внутриклеточных тирозиновых сайтов (Y951, 1054, 1059, 1175, 1214) киназных и карбокситерминального доменов [11], которые, в свою очередь, активируют ряд внутриклеточных белков, таких как фосфолипазы Су, Св3, адаптерные белки SRK, NCK, SHB, SCK и др., являющиеся первыми звеньями сложных каскадов трансдукции сигналов, изменяющих морфофункциональное состояние клеток-мишеней (главным образом, эндотелиальных). В частности, фосфолипаза Су гидролизирует мембранный фосфолипид PIP2 с образованием диацилглицерола и инозитол-1,4,5-трифосфата, увеличивающего внутриклеточное содержание кальция, которые вместе активируют протеинкиназу С, которая, в свою очередь, запускает последовательную активацию сигнального пути RAS-ERK, приводящего к индукции митоза. В результате повышается пролиферативная активность эндотелиальных клеток [10]. Фосфолипаза Св3 участвует в полимеризации актина и формировании стресс-фибрилл, обеспечивающих миграцию и двигательную активность клеток, в целом [12]. Через активацию сигнального пути фосфоинозитид-3-киназа - протеинкиназа В (PI3K/AKT) VEGF блокирует апоптоз, ингибируя каспазы 3, 7 и 9, тем самым повышая выживаемость клеток. Кроме того, ось PI3K/AKT с помощью ионов кальция моду
- 2 039395 лирует работу эндотелиальной NO-синтазы, что сопровождается увеличением продукции NO и повышением проницаемости сосудов, что является необходимым звеном в ангиогенезе (фиг. 3) [13, 14]. Таким образом, VEGF через специфический рецептор 2 типа индуцирует активацию, миграцию, пролиферацию и дифференцировку эндотелиоцитов и их клеток-предшественниц, повышение выживаемости клеток, что в сочетании с модуляцией межклеточных взаимодействий и повышением проницаемости сосудов служит необходимыми условиями формирования капилляроподобных структур с последующим ремоделированием в зрелые сосуды [10-16].
Учитывая роль VEGF как ключевого ангиогенного фактора, различные варианты кодирующего его гена используются для создания генных конструкций, показанных для лечения пациентов с заболеваниями сердечно-сосудистой системы ишемического генеза [17, 18]. Кроме того, неспецифический ангиогенный эффект таких геннотерапевтических препаратов может оказать положительное влияние при других патологических состояниях, требующих активации репаративного процесса: травмы периферических нервов [19], синдром диабетической стопы [20], боковой амиотрофический склероз [21], повреждения костей скелета [22, 23] и др.
Что касается костной ткани, то как в случае первичного, так и вторичного остеогистогенеза именно сосуды, прорастающие в рыхлую волокнистую соединительную или хрящевую ткани, создают необходимые условия для дифференцировки резидентных клеток в остеобластическом направлении, а также для миграции камбиальных резервов (периваскулярно и с кровотоком). Помимо опосредованного через ангиогенез влияния VEGF оказывает и прямое стимулирующее действие на клетки остеобластического дифферона, которые не только продуцируют VEGF [24], но и экспрессируют его рецепторы 1 и 2 типов как в эмбриогенезе [25], так и в постнатальном периоде развития [26]. Показано, что под воздействием VEGF пролиферация камбиальных клеток костной ткани значительно увеличивается (до 70%), а также активируется миграция остеогенных клеток по градиенту концентрации VEGF [27-29].
В последние годы помимо канонического - рецепторного - механизма действия VEGF появились данные о принципиально ином механизме, который обозначают как интракринный. Подтверждением этому стали результаты исследований, продемонстрировавших, что прогениторные клетки, коммитированные в остеобластическом направлении (экспрессирующие Osx), синтезируют VEGF не только на экспорт, но и для обеспечения собственной дифференцировки в остеобластическом направлении [30].
Таким образом, VEGF обладает широким спектром действия на клетки эндотелиальной и мезенхимальных клеточных линий. Основной его биологический эффект связан с индукцией формирования кровеносных и лимфатических сосудов, однако, по всей видимости, для VEGF характерны и другие механизмы прямого действия на клетки различных дифферонов через рецепторные и интракринные механизмы.
В этой связи генная конструкция ДНК с геном vegf, характеризующаяся увеличенным временем жизни мРНК трансгена vegf в клетке млекопитающего, стала бы эффективным инструментом в разработке лекарственных препаратов и ген-активированных медицинских изделий, предназначенных не только для лечения пациентов с заболеваниями сердечно-сосудистой системы, но и другой патологией, при которой локальное повышение уровня VEGF в affected. area обеспечило бы усиление репаративного процесса.
Перечень чертежей
Фиг. 1 - динамика продукции (накопления) мРНК культурами клеток, трансфицированными различными вариантами генных конструкций: 1 - Seq#1 (исходная генная конструкция), 2 - Seq#2, 3 - Seq#3, 4 - Seq#4, 5 - Seq#5, 6 - Seq#6, 7 - Seq#7, 8 - Seq#8, 9 - Seq#9, 10 - Seq#10, 11 - Seq#11.
Фиг. 2 - динамика продукции (накопления) мРНК гена vegf трансфицированной культурой клеток: А - исходная генная конструкция (Seq#1); В - оптимизированная генная конструкция Seq#11. Результаты представлены как кратное увеличение по сравнению с уровнем продукции мРНК эндогенного VEGF.
Фиг. 3 - динамика продукции мРНК гена vegf трансфицированной культурой клеток: А - эндогенная продукция (культура нетрансфицированных клеток); В - исходная генная конструкция (Seq#1); С - оптимизированная генная конструкция Seq#11.
Фиг. 4 - белок VEGF, выделенный из клеточных культур, трансфицированных генными конструкциями, 4 сут. после трансфекции: А - оптимизированной генной конструкцией Seq#11; В - исходной генной конструкцией (Seq#11); С - контроль, культура нетрансфицированных клеток. Вестерн-блоттинг, нормализация по β-актину.
Фиг. 5 - изменение уровня кровотока в ишемизированной конечности на разных сроках наблюдения: - Non ChLI control, - ChLI non treated, - Water for injection, -Seq#11 (200 мкг x 1 и 14 д), - Seq#11 (100 мкг x 14 д).
Фиг. 6 - ишемизированная мышца через 35 сут. после операции и введения: А - воды для инъекций, В - Seq#11 (200 мкг x 1 и 14 д).
Фиг. 7 - CD34+-cells/muscle fibers ratio. 1 - non ChLI control; 2 - ChLI non treated; 3 - water for injection; 4 - Seq#11 (100 мкг x 14 д).
Фиг. 8 - дефекты теменных костей кроликов, 30 сут. после имплантации остеопластических мате- 3 039395 риалов: А - кальциевый фосфат с плазмидной ДНК Seq#11, В - кальциевый фосфат без плазмидной ДНК.
Фиг. 9 - карта оптимизированной последовательности Seq#11.
Краткое описание настоящего изобретения
С использованием методов сайт-направленного мутагенеза и количественного ПЦР анализа молекул РНК в клетке нами были проанализированы конструкции, несущие различные изменения последовательности нуклеотидов 3'UTR терапевтического гена vegf, по сравнению с исходной генной конструкцией (Seq#1, разработана нами ранее). Примеры влияния некоторых изменений приведены в табл. 1. Как видно из приведенных данных, некоторые изменения нуклеотидной последовательности (делеции или замены) сказывались на продолжительности жизни положительным образом (например делеция С 1079), другие не оказывали никакого влияния (например, делеция С 1100) или приводили к уменьшению жизни мРНК (например, делеция С 1090). При этом разница в продолжительности жизни мРНК гена vegf в клетке в крайних случаях (делеция С 1079 - увеличение; делеция С 1090 - уменьшение) составляла в среднем более 6 ч при средней жизни мРНК 6 ч.
На втором этапе исследования все изменения, оказывающие положительное влияние, были использованы для создания ряда вариантов генных конструкций, несущих от четырех до десяти положительных мутаций в различных комбинациях, т.е. отличающихся последовательностью нуклеотидов на отрезке 1070-1600 (Seq#2-11).
На основании полученных данных нами была выбрана и синтезирована оригинальная 3'UTR концевая часть гена vegf, которая в совокупности с кодирующей частью гена обеспечивала увеличение продолжительности жизни транскипта гена на 70% (Seq#11), в которую были сведены некоторые мутации, оказавшие в совокупности наибольшее положительное влияние, а именно делеция С 1079, делеция Т 1111, замена А на С 1144, делеция А 1148, делеция С 1155, делеция А 1173, делеция С 1185, замена G на С 1536.
Полученный вариант генетической конструкции характеризуется максимальным временем жизни мРНК и, соответственно, наибольшей общей продукцией белка VEGF, превышающей таковую, характерную для исходной генных конструкций (Seq#1).
На основе разработанной оптимизированной генной конструкции и адъювантов, обеспечивающих криопротекцию, стабилизацию рН и получение изотонического раствора для инъекций, были созданы фармацевтические композиции, обладающие выраженной ангиогенной активностью.
Разработанные фармацевтические композиции предназначены для применения в случае заболеваний и патологических состояний, в лечении которых требуется стимуляция ангиогенеза (ишемия тканей) или репаративной регенерации тканей, которая может быть осуществлена через активацию ангиогенеза (восстановление целостности периферических нервов, костей скелета и др.).
Для производства разработанных фармацевтических композиций создан бактериальный (Е.colli) штамм-продуцент генной конструкции Seq#11, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов в соответствии с Будапештским Договором по международному депонированию микроорганизмов с целью патентования. Номер депонирования штамма VKM B-2967D. Справку о Международном депонировании штамма прилагаем.
Подробное описание настоящего изобретения
Сайт-направленный мутагенез 3'UTR гена vegf был выполнен с использованием QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, США), согласно инструкции производителя.
В результате сайт-направленного мутагенеза исходной плазмидной ДНК (Seq#1) нами были получены различные варианты изменений в 3'UTR гена vegf. Полученные варианты плазмидной ДНК с геном vegf, отличающиеся последовательностью 3'UTR, были использованы для трансфекции клеток линии HEK293 с последующим определением динамики накопления продукта экспрессии генной конструкции мРНК гена vegf.
- 4 039395
Таблица 1
Примеры некоторых проведенных изменений нуклеотидной последовательности и их влияние на продолжительность жизни мРНК
| Позиция* | Изменение | Исходный нуклеотид | Скорректированный нуклеотид | Влияние на время жизни мРНК |
| 1071 | делеция | С | - | увеличение |
| 1079 | делеция | С | - | увеличение |
| 1090 | делеция | С | - | уменьшение |
| 1100 | делеция | с | - | нет влияния |
| 1111 | делеция | т | - | увеличение |
| 1113 | замена | G | с | нет влияния |
| 1144 | замена | А | с | увеличение |
| 1146 | делеция | G | - | уменьшение |
| 1148 | делеция | А | - | увеличение |
| 1150 | делеция | С | - | нет влияния |
| 1155 | делеция | С | - | увеличение |
| 1158 | делеция | С | - | уменьшение |
| 1173 | делеция | А | - | увеличение |
| 1175 | делеция | С | - | уменьшение |
| 1183 | делеция | G | - | увеличение |
| 1184 | делеция | С | - | уменьшение |
| 1185 | делеция | С | - | увеличение |
| 1187 | замена | А | С | нет влияния |
| 1536 | замена | G | С | увеличение |
* Примечание: нумерация нуклеотидов приведена по исходной эталонной последовательности генной конструкции Seq#1.
Для этого клетки HEK293 в количестве 2х105 помещали в лунки 6-луночного планшета с культуральной средой DMEM/F-12 с добавлением 10% FBS. После прикрепления клеток в культуральную среду вносили 10 мкг одного из полученных вариантов плазмидной ДНК (в 100 мкл воды для инъекций). В качестве негативного контроля использовали 100 мкл воды для инъекций без плазмидной ДНК, что позволяло оценить уровень продукции мРНК эндогенного vegf. Для определения уровня экспрессии гена vegf методом РТ-ПЦР из клеток через 6, 12, 24, 36 и 48 ч после трансфекции выделяли общую РНК на колонках с помощью набора PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen, США), согласно инструкции производителя. Кратко, осажденные клетки тщательно лизировали в объеме 350 мкл лизирующего буфера в присутствии 1% β-меркаптоэтанола. Добавляли равный объем 70% этанола, вортексировали и переносили на колонки. Центрифугировали 1 мин при 12,4 тыс. об/мин. Сливали отцентрифугированную жидкость. Добавляли на мембрану 600 мкл промывочного раствора 1, центрифугировали 15 с при 12,4 тыс. об/мин, убирали жидкость. Добавляли на мембрану 500 мкл промывочного раствора 2, центрифугировали при тех же условиях, убирали жидкость. Повторяли отмывку с промывочным раствором 2. Переносили колонки в новые пробирки и центрифугировали 1 мин при 12,4 тыс. об/мин. Переносили колонки в пробирки для сбора РНК. Непосредственно на мембрану вносили 15 мкл воды, без РНКаз, инкубировали 1 мин при комнатной температуре, центрифугировали 90 с при 12,4 тыс. об/мин. До дальнейшего применения пробы хранились при температуре -80°С. Далее проводили синтез первой цепи кДНК с помощью реактивов компании Promega (США). Уровень экспрессии таргетных генов (в моль) определяли по сравнению с экспрессией гена домашнего хозяйства β-актина с помощью набора для проведения ПЦР в реальном времени в присутствии SYBR Green I и референсного красителя ROX (Синтол, Россия) На фиг. 1 приведен пример одной из нуклеотидных замен, обеспечивающих увеличение жизни мРНК.
Постановка реакции обратной транскрипции:
1) на льду к 10 мкл РНК добавляли 2,5 мкл Random Hexamer, инкубировали 5 мин при 70°С;
2) убирали лед;
3) осаждали капли;
4) приготавливали смесь для каждого образца:
мкл буфера для обратной транскриптазы MMLV 5X 1,25 дНТП,
1, 25 RNase Inhibitor, мкл MMLV транскриптазы, мкл Н2О;
5) добавляли по 12,5 мкл смеси в каждую пробирку, инкубировали 1 ч при 37°С;
6) останавливали реакции инкубацией при 75° С в течение 5 мин.
- 5 039395
Все образцы кДНК хранились при температуре -80°С.
Для выполнении ПЦР в реальном времени использовали прямые и обратные праймеры к vegf и βactin (табл. 2). Реакционную смесь для ПЦР в реальном времени в присутствии SYBR Green I применяли согласно инструкции производителя. Измерения проводили на приборе CFX90 Touch Real-time PCR Detection System.
Таблица 2
Праймеры для выполнения ПЦР
| Ген | Прямой праймер | Обратный праймер |
| VEGF | ACATTGTTGGAAGAAGCAGCC С | AGGAAGGTCAACCACTCACACA |
| β-actin | CGCCCCAGGCACCAGGGC | GGCTGGGGTGTTGAAGGT |
В результате проведенных исследований были выявлены мутации, положительно влияющие на время жизни мРНК (делеция С 1071, делеция С 1079, делеция Т 1111, замена А на С 1144, делеция А 1148, делеция С 1155, делеция А 1173, делеция G 1183, делеция С 1185, замена G на С 1536 и др.). Указанные изменения в различных комбинациях из 4-10 мутаций были сведены в синтетические конструкты, включающие кодирующую часть гена vegf и 3'UTR, оптимизированные по отношению к гену vegf. Основные из полученных вариантов представлены Seq#2-11. Чтобы выбрать наиболее оптимальный вариант из разработанных генных конструкций, было выполнено сравнительное исследование, в ходе которого определяли динамику накопления мРНК трансфицированными клетками с помощью ПЦР-РТ, как указано выше. Результаты основных десяти генных конструкций в виде кратности увеличения концентрации мРНК на сроках 24 и 48 ч после трансфекции представлены на фиг. 1.
Как следует из графика, в некоторых случаях комбинации нескольких мутаций, каждая из которых в отдельности оказывала положительное влияние на время жизни мРНК, не сопровождались значимым увеличением накопления мРНК, по сравнению с исходной генной конструкцией (Seq#1). Среди генных конструкций, характеризовавшихся увеличением времени жизни мРНК, отсутствие снижения концентрации определялось только в случае Seq#11, тогда как в остальных случаях уровень мРНК снижался через 48 ч после трансфекции по сравнению с показателем на сроке 24 ч. В этой связи именно данная генная конструкция была выбрана как наиболее оптимальная и подвергнута дальнейшим сравнительным исследованиям.
На фиг. 2 приведен результат ПЦР-РТ конструкции Seq#11 в сравнении с неоптимизированной последовательностью Seq#1. На приведенном графике видно, что уже через 12 ч уровень мРНК гена VEGF оптимизированной конструкции превышал значение параметра в контроле, где для трансфекции была использована исходная плазмидная ДНК. Важно, что динамика прироста концентрации мРНК в обеих группах совпадала с пиком на отметке в 24 ч после трансфекции. Однако только в случае исходной генной конструкции наблюдалось постепенное снижение уровня мРНК, обусловленное быстрой биодеградацией молекул, тогда как в случае оптимизированной конструкции (Seq#11) определялась фаза плато длительностью не менее 6 ч с последующим плавным снижением концентрации мРНК. При этом на крайней временной точке разница между группами по данному показателю составила 190%.
Разработанная плазмидная ДНК, несущая ген vegf, была исследована in vitro для количественной оценки продукции белка VEGF клетками HEK273. При этом концентрация терапевтического белка определялась в культуральной среде с помощью ELISA через 6, 12, 24, 48, 72 и 96 ч после трансфекции клеток. Оказалось, что накопленная концентрация терапевтического белка в культуральной среде клеток, трансфицированных генной конструкцией, значительно превышала значение параметра в контроле, в том числе в группах с альтернативными вариантами разработанных генных конструкций, характеризовавшихся неоптимальной последовательностью 3'UTR гена vegf и стандартным временем жизни мРНК трансгена (фиг. 3). Важно, что максимальный прирост концентрации VEGF в культуральной среде обеих групп трансфицированных клеток (увеличение в 2,3-2,4 раза) наблюдался через 36 ч после начала эксперимента, что соответствовало данным ПЦР-РТ с пиковой концентрацией мРНК генных конструкций на временной точке 24 ч. В дальнейшем, если концентрация белка VEGF в среде трансфицированных оптимизированной генной конструкцией клеток продолжала нарастать высокими темпами, то в группе с исходной плазмидной ДНК прирост существенно замедлялся, незначительно превышая прирост в контрольной группе (культура без трансфекции).
Определение накопленной концентрации белка VEGF в культуральной среде позволяет судить о динамике его продукции клетками и количественном приросте на каждом контрольном сроке, однако не позволяет оценить внутриклеточную концентрацию белка на каждой из временных точек. При этом особенно важным в комплексной оценке времени жизни мРНК генных конструкций является определение уровня белка VEGF в клетках на крайних сроках наблюдения. В этой связи клетки после 4 сут. культивирования были подвергнуты Вестерн-блоттинг анализу по стандартной методике с использованием антител к белку VEGF. Концентрация белка оказалась наибольшей в лизате клеток, трансфицированных оптимизированной генной конструкцией Seq#11 (фиг. 4). При этом уровень белка в случае клеток, трансфицированных исходной конструкцией, на данном сроке наблюдения незначительно превышал эндогенную концентрацию (контроль).
- 6 039395
Более того, кондиционированная среда клеток, трансфицированных оптимизированными генными конструкциями, характеризовалась статистически значимо большей ангиогеннной активностью, определенной в стандартном тесте HUVEC tube formation assay.
Сопоставляя результаты проведенных исследований, можно заключить, что мРНК оптимизированной генной конструкции (Seq#11) характеризовалась большим временем жизни, что привело к более длительной продукции высоких концентраций терапевтического белка VEGF вплоть до крайних сроков наблюдения. Исходная же генная конструкция характеризовалась меньшей стабильностью мРНК, коротким и менее выраженным биологическим эффектом.
Таким образом, основной технический результат настоящего изобретения состоит в увеличении общей продукции терапевтического белка за счет увеличения времени жизни мРНК, достигнутой посредством выявления оптимальных изменений последовательности 3'UTR гена vegf. Неожиданным стал тот факт, что замена всего одного нуклеотида в целевой области оказала столь выраженный эффект на продолжительность жизни мРНК и, соответственно, продукцию терапевтического белка. Во всех известных работах в данной области исследователи выполняли другие изменения, с вовлечением гораздо большего количества нуклеотидов. Учитывая недостаточную изученность функционального предназначения каждого сайта в 3'UTR мРНК, наиболее благоприятными с точки зрения безопасности и нивелирования влияния на другие аспекты метаболизма мРНК являются именно минимальные, точечные изменения, в случае, если они позволяют добиться нужного эффекта. Важно отметить, что длина последовательности 3'UTR гена vegf составляет не менее 250 нуклеотидов, следовательно, общее количество только единичных, точечных мутаций в виде замены одного нуклеотида на другой составляет не менее 750. Принимая во внимание другие возможные варианты изменений (делеции, дупликации, инсерции), а также с учетом задействования более одного сайта, количество вариантов генных конструкций, отличающихся 3'UTR гена vegf, составляет сотни тысяч. Таким образом, выявление нескольких вариантов изменений последовательности, приводящих к увеличению продолжительности жизним мРНК без негативного влияния на другие аспекты ее функционирования равносильно выигрышу в лотерею.
Учитывая опыт в разработке геннотерапевтических препаратов нами были созданы фармацевтические композиции на основе разработанных оптимизированных генных конструкций и фармакологически приемлемых вспомогательных веществ, представленных по меньшей мере одним криопротектантом, обладающим свойствами наполнителя, и стабилизатором рН, в эффективных количествах обеспечивающих получение изотонического раствора плазмидной ДНК для инъекций.
Состав фармацевтической композиции, обеспечивающий сохранение свойств оптимизированной плазмидной ДНК, представляет собой:
плазмидная ДНК от 0,1 до 10 мг/мл, предпочтительно от 0,5 до 4 мг/мл, наболее предпочтительно от 0,8 до 1,2 мг/мл, глюкоза (декстроза) от 200 до 400 мМ, предпочтительно от 250 до 350 мМ, наболее предпочтительно от 280 до з2о мМ, фосфат натрия (смесь тризамещенного, двузамещенного и однозамещенного фосфатов натрия) в концентрации от 3 до 30 мМ, предпочтительно от 5 до 20 мМ, наболее предпочтительно от 8 до 12 мМ, рН раствора от 7,0 до 9,0, предпочтительно от 7,2 до 8,5, наиболее предпочтительно от 7,4 до 8,2.
Состав одного из вариантов фармацевтической композиции следующий:
плазмидная ДНК по Seq#11 - 1,2 мг;
декстрозы моногидрат - 60 мг;
натрия гидрофосфата додекагидрат - 3,94 мг;
натрия дигидрофосфата дигидрат - 0,16 мг.
Данный вариант были использован в исследованиях, описанных в примерах.
Разработанные генные конструкции и фармацевтические композиции на их основе были исследованы in vivo в экспериментальных моделях, воспроизводящих основные патофизиологические и патоморфологические симптомы, характерные для заболеваний, являющихся известными показаниями к применению плазмидной ДНК с геном vegf.
Пример 1. Модель хронической ишемии нижних конечностей.
Исследование было выполнено на иммунодефицитных мышах (n=90), которым для моделирования хронической ишемии нижней конечности (ХИНК) выполнялось пересечение правой бедренной артерии в паховой области. Введение фармацевтической композиции на основе плазмидной ДНК по Seq#11 выполнялось в двух вариантах: 100 мкг однократно на 14-е сут. и по 200 мкг двукратно на 1-е и 14-е сут. - в проксимальный и дистальный участок послеоперационной раны. Контролем служили три группы животных: здоровые, оперированные но без введения каких-либо веществ; оперированные с введением воды для инъекций. Животных выводили из эксперимента через 7, 21, 35 сут. после операции, конечности подвергали гистологическому исследованию с определением количества сосудов и отношения числа эндотелиоцитов к мышечным волокнам. На сроках 1, 7, 14, 21, 28 и 35 сут. выполняли лазерную сканирующую доплерометрию для определения уровня кровотока (blood flow perfusion rate) в ишемизированной и здоровой конечности.
Оказалось, что независимо от дозы и режима введения уровень кровотока в ишемизированной ко- 7 039395 нечности увеличивался только в экспериментальных группах через 7 сут. после введения разработанного геннотерапевтического препарата. Уровень кровотока увеличивался, достигая к крайнему сроку наблюдения значений, близких к параметру здоровых животных. В контрольных группах оперированных животных уровень кровотока оставался на низком уровне без положительной динамики (фиг. 5).
Функциональные результаты были подтверждены данными гистологического исследования. В экспериментальных группах было выявлено большее количество сосудов (фиг. 6), а также большее отношение CD34+-клеток (эндотелиоцитов) к мышечным волокнам (фиг. 7).
Пример 2. Модель костного дефекта критического размера.
Разработанная генная конструкция по Seq#11 была объединена с матриксом из кальциевого фосфата по ранее разработанному протоколу.
1. Подготовка носителя:
а) отмывка (инкубирование в 0,5М фосфатного буфера в объеме 1 мл при температуре 37°С при постоянном встряхивании в течение 12 ч);
б) уравновешивание (обработка 10 мМ фосфатного буфера в объеме 1 мл при температуре 37°С при постоянном встряхивании, 3 раза по 10 мин);
в) высушивание (инкубирование при температуре 37°С до полного высыхания - 3 ч).
2. Нанесение нуклеиновой кислоты (инкубирование с раствором плазмидной ДНК по Seq#11 в 10 мМ фосфатном буфере в концентрации 1 мкг/мкл при температуре 37°С и постоянном встряхивании в течение 12 ч).
3. Обработка полученного комплекса носитель-генная конструкция:
а) отмывка (обработка 5 мМ раствором фосфата в объеме 1 мл 3 раза);
б) высушивание (инкубирование при температуре 37°С до полного высыхания - 3 ч).
Полученный ген-активированный костный графт был исследован в ортотопических условиях. Исследование было выполнено на кроликах породы Шиншилла (n=15). Каждому животному выполнялись два одинаковых симметричных полнослойных дефекта обеих теменных костей, диаметром по 10 мм, которые являются критическими для кроликов, так как естественный восстановительный процесс, без каких-либо оптимизирующих влияний не завершается полной консолидацией. В дефекты правых теменных костей имплантировали ген-активированный остеопластический материал (экспериментальная группа), состоящий из кальциевого фосфата и плазмидной ДНК Seq#11, в дефекты левых теменных костей - носитель без плазмидной ДНК (контрольная группа). Животных выводили из эксперимента через 30, 60 и 90 сут., результаты оценивали с использованием компьютерной томографии и гистологических методов.
В связи с исходно высокой плотностью выбранного носителя (около 1800 HU) и длительностью его биорезорбции (более 6 мес.) объективно оценить признаки репаративного остеогенеза в сравнительном аспекте не удалось. Однако по данным гистологического исследования только в случае применения генактивированного остеопластического материала признаки остеогенеза наблюдались уже через 30 сут. после операции в центральной части дефекта (фиг. 8).
Как видно на фиг. 8, гранулы материла, расположенные в центральной части дефекта, выполненного рыхлой волокнистой соединительной тканью, являлись источником репаративного остеогенеза, тогда как в контроле кальциевый фосфат без плазмидной ДНК был окружен только рыхлой волокнистой соединительной тканью без признаков образования костной ткани. Полученные данные свидетельствуют о том, что введение плазмидной ДНК Seq#11 в область костного дефекта критических размеров привело к выраженной индукции репаративного остеогенеза, что может быть обусловлено как опосредованным через ангиогенез действием, так и прямым влиянием VEGF на клетки мезенхимальной линии.
Таким образом, представленные выше примеры иллюстрируют тот факт, что разработанная оптимизированная генная конструкция и фармацевтическая композиция на ее основе обладают выраженной ангиогенной активностью, что позволяет рассчитывать на эффективность ее использования в лечении ишемических заболеваний сердечно-сосудистой системы. Кроме того, оптимизированная генная конструкция с геном vegf может оказаться эффективной в лечении других патологических состояний, требующих активации репаративного процесса, таких как повреждения кожи и опорно-двигательного аппарата, травмы периферических нервов, синдром диабетической стопы, боковой амиотрофический склероз.
- 8 039395
Литература.
. Gene therapy clinical trials worldwide, http://www.abedia.com/wiley/years.php.
. Grigorian A.S., Schevchenko K.G. Some possible molecular mechanisms of VEGF encoding plasmids functioning. Cell. Tanspl. Tiss. Engin. 2011. VI (3): 24-8.
. Baboo S., Cook P.R. Dark matter worlds of unstable RNA and protein. Nucleus 2014; 5(4): 281-6.
. Vislovukh A., Vargas T.R., Polesskaya A. et al. Role of 3'-untranslated region translational control in cancer development, diagnostics and treatment. World J. Biol. Chem. 2014; 5(1): 40-57.
. Malter J. Method to increase regulatory molecule production. US patent №5,587,300; 24.12.1996.
. Sytkowski A.J., Grodberg J. Erythropoietin DNA having modified 5’ and 3’ sequences and its use to prepare EPO therapeutics. US patent №6,153,407; 28.11.2000 . Mauro V.P., Chappell S.A., Zhou W. et al. Reengineering mRNA primary structure for enhanced protein production. US patent application №2012/0053333 Al; 01.03.2012.
. Folkman J., Merler E., Abernathy C. et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. J. Exp. Med. 1971; 133(2): 275-88.
. Goel H.L., Mercurio A.M. VEGF targets the tumour cell. Nat. Rev. Cancer. 2013; 13(12): 871-82.
lO .Koch S., Claesson-Welsh L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2012; 2(7): a006502.
.Matsumoto T., Bohman S., Dixelius J. et al. VEGF receptor-2 Y951 signaling and a role for the adapter molecule TSAd in tumor angiogenesis. EMBO J. 2005; 24(13): 2342-53.
.Bhattacharya R., Kwon J., Li X. et al. Distinct role of PLCbeta3 in VEGF-mediated directional migration and vascular sprouting. J. Cell Sci. 2009; 122(Pt 7): 1025-34.
.Coultas L., Chawengsaksophak K., Rossant J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature 2005; 438(7070): 937-45.
.Olsson A.K., Dimberg A., Kreuger J. et al. VEGF receptor signalling - in control of vascular function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006; 7(5): 359-71.
.Ma X.N., Li Q.P., Feng Z.C. Research progress in cytokines and signaling pathways for promoting pulmonary angiogenesis and vascular development. Zhongguo Dang Dai Er KeZaZhi. 2013; 15(9): 800-5.
.Арутюнян И.В., Кананыхина Е.Ю., Макаров A.B. Роль рецепторов VEGF-A165 в ангиогенезе. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2013; VIII(l): 128.
.Cherviakov lu.A., Staroverov I.N., Nersesian E.G. et al. The opportunities for genic therapy of chronic obliterating diseases of lower limbs arteries. Khirurgiia (Mosk). 2014; (4): 40-5.
.Willyard C. Limb-saving medicines sought to prevent amputation. Nature Medicine 2012; 18(3): 328.
.Hillenbrand M., Holzbach T., Matiasek K. et al. Vascular endothelial growth factor gene therapy improves nerve regeneration in a model of obstetric brachial plexus palsy. Neurol Res. 2015; 37(3): 197-203.
.Kessler JA. Vascular endothelial growth factor gene transfer for diabetic polyneuropathy.Ann Neurol. 2009; 65(4): 362-4.
.Zavalishin LA., Bochkov N.P., Suslina Z.A. et al. Gene therapy of amyotrophic lateral sclerosis.Bynn Exp Biol Med. 2008; 145(4): 483-6.
.Zhao D.M., Yang J.F., Wu S.Q. et al. Effect of vascular endothelial growth factor 165 gene transfection on repair of bone defect: experiment with rabbits. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2007; 87(25): 1778-82.
.Geiger F., Bertram H., Berger I. et al. Vascular endothelial growth factor gene-activated matrix (VEGF165-GAM) enhances osteogenesis and angiogenesis in large segmental bone defects. J. Bone Miner. Res. 2005; 20(11): 2028-35.
.Neve A., Cantatore F.P., Corrado A. et al. In vitro and in vivo angiogenic activity of osteoarthritic and osteoporotic osteoblasts is modulated by VEGF and vitamin D3 treatment. Regul. Pept. 2013; 184: 81-4.
.Marini M., Sarchielli E., Тосе M. et al. Expression and localization of VEGF receptors in human fetal skeletal tissues. Histol. Histopathol. 2012; 27(12): 1579-87.
.Tombran-Tink J., Barnstable C.J. Osteoblasts and osteoclasts express PEDF, VEGF-A
- 9 039395 isoforms, and VEGF receptors: possible mediators of angiogenesis and matrix remodeling in the bone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 316(2): 573-9.
.Mayr-Wohlfart U., Waltenberger J., Hausser H. et al. Vascular endothelial growth factor stimulates chemotactic migration of primary human osteoblasts. Bone 2002; 30(3): 4727.
.D' Alimonte I., Nargi E., Mastrangelo F. et al. Vascular endothelial growth factor enhances in vitro proliferation and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells. J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 2011; 25(1): 57-69.
.Yang Y.Q., Tan Y.Y, Wong R. et al. The role of vascular endothelial growth factor in ossification. Int. J. Oral Sci. 2012; 4(2): 64-8.
3O .Berendsen A.D., Olsen B.R. How vascular endothelial growth factor-A (VEGF) regulates differentiation of mesenchymal stem cells. J. Histochem. Cytochem. 2014; 62(2): 103-8.
Claims (7)
1. Способ получения генной конструкции, характеризующейся увеличенным временем жизни мРНК трансгена vegf в клетке млекопитающего, согласно которому указанную клетку трансфицируют генной конструкцией, в которой 3'-некодирующая область гена vegf модифицирована посредством одной или нескольких точечных делеций гуанина либо аденина и/или замен гуанина либо аденина на цитозин, затем определяют время жизни мРНК для каждой совокупности точечных модификаций, данные анализируют и выбирают генную конструкцию, содержащую 3'-некодирующую область с совокупностью точечных модификаций, показавшую наилучший результат по увеличению жизни мРНК.
2. Способ по п.1, где 3'-некодирующая область мРНК является некодирующей областью гена, выбранного из vegf121, vegf145, vegf165, vegf185.
3. Плазмидная ДНК, полученная способом по п.1, в которой 3'-некодирующая область гена vegf, выбранного из изоформ 121, 145, 165, 185, модифицирована посредством одной или нескольких точечных делеций гуанина либо аденина и/или замен гуанина либо аденина на цитозин.
4. Плазмидная ДНК гена vegf165, представленная последовательностью Seq#11, полученная способом по п.1, отличающаяся тем, что содержит следующие модификации относительно Seq#1: делецию С1079, делецию Т1111, замену А1144С, делецию А1148, делецию С1155, делецию А1173, делецию А1185, замену G1536C.
5. мРНК, содержащая 3'-некодирующую область, соответствующую плазмидной ДНК по п.4.
6. Фармацевтическая композиция для регенерации соединительной, мышечной, нервной тканей, включающая плазмидную ДНК по п.4 или 5 и по меньшей мере один криопротектор и стабилизатор рН.
7. Применение плазмидной ДНК по п.5 в регенерации соединительной, нервной, мышечной, костной тканей.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015119768A RU2612497C2 (ru) | 2015-05-26 | 2015-05-26 | Оптимизированная нуклеотидная последовательность и фармацевтическая композиция на ее основе с пролонгированной экспрессией трансгена vegf |
| PCT/RU2015/000852 WO2016190774A1 (ru) | 2015-05-26 | 2015-12-07 | Оптимизированная нуклеотидная последовательность и фармацевтическая композиция на ее основе с пролонгированной экспрессией трансгена vegf |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201700456A1 EA201700456A1 (ru) | 2018-06-29 |
| EA039395B1 true EA039395B1 (ru) | 2022-01-21 |
Family
ID=57392933
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201700456A EA039395B1 (ru) | 2015-05-26 | 2015-12-07 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННОЙ КОНСТРУКЦИИ И ПЛАЗМИДНАЯ ДНК С УВЕЛИЧЕННЫМ ВРЕМЕНЕМ ЖИЗНИ мРНК ТРАНСГЕНА VEGF В КЛЕТКЕ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО, ПЛАЗМИДНАЯ ДНК ГЕНА VEGF165, мРНК, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9896493B2 (ru) |
| EP (1) | EP3305901B1 (ru) |
| CN (1) | CN107614687B (ru) |
| AU (1) | AU2015396177B2 (ru) |
| BR (1) | BR112017023058B1 (ru) |
| CA (1) | CA2985608C (ru) |
| EA (1) | EA039395B1 (ru) |
| MX (1) | MX2017013206A (ru) |
| RU (1) | RU2612497C2 (ru) |
| WO (1) | WO2016190774A1 (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114908089B (zh) * | 2021-02-08 | 2024-03-15 | 上海细胞治疗集团有限公司 | 3’utr的构建方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5587300A (en) * | 1994-04-26 | 1996-12-24 | Wisconsin Ulumni Research Foundation | Method to increase regulatory molecule production |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6153407A (en) | 1992-07-28 | 2000-11-28 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics |
| AU742365B2 (en) | 1997-03-14 | 2002-01-03 | Selective Genetics, Inc. | Adenoviral vectors with modified tropism |
| US6627436B2 (en) | 1997-10-31 | 2003-09-30 | Stratagene | Vector for gene expression in prokaryotic and eukaryotic systems |
| BR9908754A (pt) | 1998-03-13 | 2000-11-28 | American Home Prod | Composições liofilizada e lìquida de polinucleotìdeo e farmacêutica, processos para tratar um paciente mamìfero e para preparar uma composição liofilizada de polinucleotìdeo, produto liofilizado de polinucleotìdeo, e, processo para liofilizar uma composição de polinucleotìdeo |
| US7598079B2 (en) * | 1998-12-24 | 2009-10-06 | Novation Pharmaceuticals, Inc. | Assay for identifying compounds which affect stability of mRNA |
| AU5646300A (en) | 1999-02-10 | 2000-08-29 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Methods of stimulating angiogenesis |
| US7087411B2 (en) | 1999-06-08 | 2006-08-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Fusion protein capable of binding VEGF |
| US7288521B2 (en) | 2000-04-06 | 2007-10-30 | Franco Wayne P | Growth factor therapy mobilization of stem cells into the peripheral blood |
| CN1351055A (zh) | 2000-10-26 | 2002-05-29 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人的血管内皮生长因子165受体(vegf－165r)10.67和编码这种多肽的多核苷酸 |
| CA2451311A1 (en) * | 2001-06-20 | 2003-01-03 | Ludwig Institute For Cancer Research | Stimulation of vascularization with vegf-b |
| US7981863B2 (en) | 2001-09-19 | 2011-07-19 | Neuronova Ab | Treatment of Parkinson's disease with PDGF |
| CN100431611C (zh) | 2002-07-04 | 2008-11-12 | 朱静亚 | 多肽－脂质体与人血管内皮生长因子基因重组质粒复合物及用途 |
| WO2004050126A2 (en) | 2002-12-02 | 2004-06-17 | Anges Mg, Inc. | Compositions for treating or preventing angiogenesis-dependent symptoms |
| EP1791945A1 (en) | 2004-09-17 | 2007-06-06 | Centelion | Stable liquid formulations of plasmid dna |
| RU2297848C2 (ru) | 2005-05-11 | 2007-04-27 | Александр Веньяминович Иткес | Генно-инженерная конструкция vegf-ибмед (vegf-ibmed) |
| ES2338400B1 (es) | 2008-05-06 | 2011-09-14 | David Benet Ferrus | Conjunto de moleculas antiangiogenicas y su uso. |
| JP5735927B2 (ja) | 2009-02-24 | 2015-06-17 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | タンパク質生産の増強のためのｍＲＮＡの一次構造の再操作 |
| US8367350B2 (en) | 2009-04-29 | 2013-02-05 | Morehouse School Of Medicine | Compositions and methods for diagnosis, prognosis and management of malaria |
| RU2431669C2 (ru) * | 2009-06-23 | 2011-10-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина" | Способ получения лекарственного препарата генетически модифицированных клеток |
| RU2542385C2 (ru) * | 2012-08-31 | 2015-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" | Способ получения фармацевтической композиции для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, фармацевтическая композиция, полученная этим способом, и способ лечения ишемии тканей и/или органов человека |
-
2015
- 2015-05-26 RU RU2015119768A patent/RU2612497C2/ru active
- 2015-12-07 CN CN201580080399.1A patent/CN107614687B/zh active Active
- 2015-12-07 AU AU2015396177A patent/AU2015396177B2/en active Active
- 2015-12-07 EA EA201700456A patent/EA039395B1/ru unknown
- 2015-12-07 WO PCT/RU2015/000852 patent/WO2016190774A1/ru active Application Filing
- 2015-12-07 CA CA2985608A patent/CA2985608C/en active Active
- 2015-12-07 BR BR112017023058-5A patent/BR112017023058B1/pt active IP Right Grant
- 2015-12-07 EP EP15893474.5A patent/EP3305901B1/en active Active
- 2015-12-07 MX MX2017013206A patent/MX2017013206A/es unknown
-
2016
- 2016-03-15 US US15/070,239 patent/US9896493B2/en active Active
-
2017
- 2017-11-21 US US15/819,157 patent/US10040837B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5587300A (en) * | 1994-04-26 | 1996-12-24 | Wisconsin Ulumni Research Foundation | Method to increase regulatory molecule production |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SHVALB P.G. et al. "Effektivnost i bezopasnost primeneniya preparata "Neovaskulgen" v kompleksnoi terapii patsientov s khronicheskoi ishemiei nizhnikh konechnostei (IIb-III faza klinicheskikh ispytanii), Kletochnaya transplantologiya i tkanevaya inzheneriya, 2011, Vol. VI, № 3, p. 76-83 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3305901A1 (en) | 2018-04-11 |
| RU2015119768A (ru) | 2016-12-20 |
| EA201700456A1 (ru) | 2018-06-29 |
| CN107614687B (zh) | 2021-05-28 |
| CA2985608A1 (en) | 2016-12-01 |
| CN107614687A (zh) | 2018-01-19 |
| CA2985608C (en) | 2021-06-15 |
| EP3305901B1 (en) | 2020-09-30 |
| US20180086800A1 (en) | 2018-03-29 |
| MX2017013206A (es) | 2018-02-15 |
| BR112017023058A2 (pt) | 2018-10-16 |
| RU2612497C2 (ru) | 2017-03-09 |
| US20160347803A1 (en) | 2016-12-01 |
| US10040837B2 (en) | 2018-08-07 |
| EP3305901A4 (en) | 2018-10-24 |
| AU2015396177B2 (en) | 2019-02-28 |
| AU2015396177A1 (en) | 2017-11-02 |
| US9896493B2 (en) | 2018-02-20 |
| WO2016190774A1 (ru) | 2016-12-01 |
| BR112017023058B1 (pt) | 2024-03-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kim et al. | Osteogenesis induced by a bone forming peptide from the prodomain region of BMP-7 | |
| Wang et al. | MiR-206 regulates neural cells proliferation and apoptosis via Otx2 | |
| Chen et al. | miR‐136‐3p targets PTEN to regulate vascularization and bone formation and ameliorates alcohol‐induced osteopenia | |
| Carnac et al. | Myostatin: biology and clinical relevance | |
| KR20090089462A (ko) | 병적 혈관형성 및 혈관 투과성을 치료하기 위한 조성물 및 방법 | |
| Liu et al. | A novel transgenic murine model with persistently brittle bones simulating osteogenesis imperfecta type I | |
| Lal et al. | Troponin I-Interacting Protein Kinase–A Novel Cardiac-Specific Kinase, Emerging as a Molecular Target for the Treatment of Cardiac Disease– | |
| Yang et al. | Collagen type V a2 (COL5A2) is decreased in steroid-induced necrosis of the femoral head | |
| JPWO2011111824A1 (ja) | マイクロｒｎａを用いた心筋細胞の増殖方法 | |
| US8153589B2 (en) | JNK3 as a target for the treatment of angiogenesis-related diseases | |
| JP5794559B2 (ja) | 間葉系細胞の分化を調節するための薬剤及びその利用 | |
| US20090233854A1 (en) | Novel application of apelin | |
| RU2612497C2 (ru) | Оптимизированная нуклеотидная последовательность и фармацевтическая композиция на ее основе с пролонгированной экспрессией трансгена vegf | |
| Sagnol et al. | Epithelial Splicing Regulatory Protein 1 (ESRP1) is a new regulator of stomach smooth muscle development and plasticity | |
| US20030220249A1 (en) | Factors for angiogenesis, vasculogenesis, cartilage formation, bone formation, and methods of use thereof | |
| Liu et al. | Osteochondrogenesis by TGF-β3, BMP-2 and noggin growth factor combinations in an ex vivo muscle tissue model: Temporal function changes affecting tissue morphogenesis | |
| Nagamine et al. | XRASGRP2 expression during early development of Xenopus embryos | |
| Lung et al. | Global wnt inhibition with a porcupine inhibitor decreases established trabecular bone in a mouse model of fibrous dysplasia | |
| KR101671100B1 (ko) | 대사성 질환 예방 또는 치료용 조성물 | |
| Joshi et al. | RGS4 controls airway hyperresponsiveness through GAP-independent mechanisms | |
| JP2024046128A (ja) | 骨形成促進剤 | |
| JP2024055041A (ja) | Ｓｏｃｅ異常症を治療又は予防するための医薬組成物 | |
| KR20240072367A (ko) | Pdgf 유래 신규 펩타이드 및 이의 용도 | |
| KR20120004097A (ko) | Ｖｅｇｆｒ―３을 포함하는 허혈질환의 예방 또는 치료용 조성물 | |
| CN111701021A (zh) | Nipa2作为药物靶点在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物中的应用 |