WO2016137267A2 - 법랑모세포 배양액을 포함하는 치주질환 치료용 약학 조성물 - Google Patents

법랑모세포 배양액을 포함하는 치주질환 치료용 약학 조성물 Download PDF

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WO2016137267A2
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periodontal
periodontal ligament
differentiation
cells
enamel
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박주철
정한울
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서울대학교 산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
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    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating periodontal disease comprising an enamel cell culture medium, and more particularly, the present invention is effective for enamel cell culture medium that stimulates the movement of periodontal ligament cells and promotes the differentiation and mineralization of chalk cells.
  • Pharmaceutical composition for treating periodontal disease comprising as a component, a method for treating periodontal disease using the pharmaceutical composition, a composition for promoting periodontal ligament and chalkacet differentiation comprising the enamel hair cell culture medium, periodontal ligament and chalkaceous differentiation comprising the composition It relates to a kit for promoting, periodontal ligament differentiation comprising the enamel hair culture medium and a method for differentiating the periodontal ligament using the medium composition.
  • Periodontal tissue is a complex organ consisting of epithelial tissue, soft tissue connective tissue and calcified connective tissue.
  • the structure of the periodontal tissue includes gingiva, periodontal ligament (PDL), cementum and alveolar bone.
  • gingiva gingiva
  • periodontal ligament PDL
  • cementum alveolar bone
  • Gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts are major cellular components of gingival connective tissues, and serve to form and maintain extracellular matrix.
  • gingival fibroblasts are mainly involved in maintaining gingival connective tissue
  • periodontal ligament fibroblasts are involved in the repair and regeneration of adjacent alveolar bone and chalky bodies as well as forming periodontal ligaments.
  • Periodontal disease occurs, clinically, gingival bleeding, swelling, periodontal sac formation, and destruction of alveolar bone cause tooth loss.
  • the causes of periodontal disease include local and systemic factors.
  • As a local factor when the plaque is mechanically accumulated in the periodontal sac, it becomes a habitat for the surrounding bacteria, which gradually become anaerobic, breathable, and gram-positive bacteria. It gradually migrates to negative bacteria, and then proliferates deep into the periodontal sac. At this time, the transition to the anaerobic gram-negative bacteria is gradually expanded, and proliferate deep into the periodontal sac.
  • the toxins and all products of the proliferated anaerobic Gram-negative bacteria directly destroy tissues or stimulate the immune system, thereby causing periodontal tissue destruction and inflammation by various actions from the stimulated immune system.
  • Korean Patent No. 1179476 describes promyelocytic leukemia zinc finger (PLZF) gene, Fk506 binding protein 5 (FKBP5) gene, serum amyloid A1 (highly expressed in mineralization of human periodontal ligament (hPDL) cells).
  • PZF promyelocytic leukemia zinc finger
  • FKBP5 Fk506 binding protein 5
  • hPDL serum amyloid A1
  • SAA1 gene, fatty acid binding protein 4 (FABP4) gene, series A (FAM107A) gene with sequence similarity, CORIN gene, ras-related C3 butolinum toxin substrate 3 (RAC3) gene or prolactin-derived protein ( PIP) genes and low-expressing FNDC1, PTGS2, RSAD2, NPTX1, VCAM1, MX1, IFIT1, CLDN1 or WISP2 genes are disclosed during mineralization of human periodontal ligament (hPDL) cells.
  • FBP4 fatty acid binding protein 4
  • FAM107A series A
  • CORIN gene
  • RAC3 ras-related C3 butolinum toxin substrate 3
  • PIP prolactin-derived protein
  • the ultimate outcome of treating periodontal disease is the restoration of damaged connective tissue and bones. To this end, it is necessary to regenerate or differentiate the periodontal ligaments that support the bones. There is no reported way to do this.
  • the present inventors earnestly researched to develop a method for regenerating or differentiating the periodontal ligament, and as a result of confirming that the enamel blast culture medium can be used to promote periodontal ligament regeneration or differentiation to treat periodontal disease, thereby completing the present invention. It was.
  • One object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for treating periodontal disease, including enamel hair cell culture.
  • Another object of the present invention to provide a method for treating periodontal disease using the pharmaceutical composition.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for promoting periodontal ligament and chalky regeneration or differentiation comprising the enamel hair cell culture.
  • Still another object of the present invention is to provide a kit for promoting or regenerating periodontal ligaments and chalky skin containing the composition.
  • Still another object of the present invention is to provide a media composition for periodontal ligament differentiation comprising an enamel blast culture medium.
  • Still another object of the present invention is to provide a method of differentiating periodontal ligament using the medium composition.
  • the use of the enamel hair cell culture medium of the present invention can not only promote the regeneration or differentiation of the periodontal ligament and the chalky to form the dental tissue, but also inhibit the formation of the periodontal stiffness that induces the degeneration of the dental tissue, periodontal disease It can be widely used in the development of a formulation capable of effective treatment.
  • 1 is a photograph showing the results of the wound treatment analysis to investigate the effect of promoting the migration of PDL cells by PA-CM.
  • Figure 2 is a photograph and graph showing the results of performing a transwell analysis to investigate the effect of promoting the migration of PDL cells by PA-CM. As shown in FIG. 2, when PA-CM was treated compared to the control group, it was confirmed that the migration level of PDL cells increased by about 5 times.
  • Figure 3a is a photograph showing the result of confirming the mineralization level according to the culture time of the chalk cell line according to the treatment of PA-CM.
  • Figure 3b is a graph showing the result of confirming the mRNA level of the Runx2 (Runt-related transcription factor 2) gene expressed in the chalk cell line according to the treatment of PA-CM according to the culture time.
  • Figure 3c is a graph showing the result of confirming the mRNA level of the Osx (Osterix) gene expressed in the chalk cell line according to the treatment of PA-CM according to the culture time.
  • Figure 3d is a graph showing the result of confirming the mRNA level of the OC (Osteocalcin) gene expressed in the chalk cell line according to the treatment of PA-CM according to the culture time.
  • Figure 3e is a graph showing the result of confirming the mRNA level of the Bsp (Bone sialoprotein) gene expressed in the chalk cell line according to the treatment of PA-CM according to the culture time.
  • Figure 3f is a graph showing the result of confirming the mRNA level of the Cap (cementum attachment protein) gene expressed in the chalk cell line according to the treatment of PA-CM according to the culture time.
  • Figure 4 is a diagram showing the site of replanting, CO represents the coronal portion of the implanted root, AP represents the tip portion remaining the periodontal ligament.
  • Figure 5 is a photograph showing the procedure of a series of planting process using the teeth of the mongrel dog.
  • FIG. 6 is a schematic view showing a cross section of a planted dental tissue.
  • FIG. 7 is a micrograph of teeth planted at 4 weeks, A of FIG. 7 represents a positive control group, B represents a negative control group, C and D represent an experimental group, Ab represents an alveolar bone, and De represents an dentin.
  • Ce stands for Cretaceous
  • Pd stands for periodontal ligament
  • nCe (white arrow) stands for newly formed chalky ligament tissue
  • nPd stands for newly formed periodontal ligament-like tissue
  • (*) is surface absorption Indicate the site
  • the black arrow indicates the dental rigid part (alternative absorbing part).
  • a and B represent positive controls
  • C and D represent negative controls
  • E and F represent experimental groups
  • Ab means alveolar bone
  • De represent dentin Ce means chalky
  • Pd means periodontal ligament
  • nPd means newly formed periodontal ligament-like tissue
  • black arrow indicates dental stiffness (alternative absorption).
  • Figure 9 is a micrograph of the teeth planted at 8 weeks, A in Figure 9 represents a positive control group, B represents a negative control group, C and D represents the experimental group, Ab means the alveolar bone, De means dentin Ce stands for Cretaceous, Pd stands for periodontal ligament, nCe (white arrow) stands for newly formed chalky ligament tissue, nPd stands for newly formed periodontal ligament-like tissue, and (*) is surface absorption Indicate the site, and the black arrow indicates the dental rigid part (alternative absorbing part).
  • FIG. 10 is a graph showing a result of comparing the ratio of newly formed periodontal ligament-like tissues, alveolar stiffenings and newly formed chalky bodies contained in the root of the negative control group or the experimental group at 4 weeks after planting. .
  • FIG. 11 is a graph showing a result of comparing the ratio of newly formed periodontal ligament-like tissues, alveolar stiffeners, and newly formed chalky bodies contained in the root of the negative control group or the experimental group at 8 weeks after planting. .
  • the present inventors came to pay attention to enamel hair cells while performing various studies to develop a method for regenerating or differentiating periodontal ligaments.
  • the enamel hair cells form enamel of the tooth, secrete the organic substrate of the enamel, and are also involved in the enamel calcification process, but are known to be cells that are removed from the tooth once the tooth is formed.
  • dental epithelial cells are differentiated into enamel hair cells in the future, which is known to be related to the development of periodontal tissue including periodontal ligaments and chalky cells.
  • the culture obtained by culturing the enamel cells affects the regeneration or differentiation of the periodontal ligaments.
  • the culture of the enamel cells can promote the mobility of the periodontal ligament cells, can promote the differentiation and mineralization of the oculoblast cell line (OCCM-30), through animal experiments, periodontal ligament damaged by periodontal disease It was confirmed that it is possible to promote the regeneration or differentiation of the chalk and the formation of alveolar stiffness which induces the degeneration of teeth.
  • OCCM-30 oculoblast cell line
  • the culture solution of the enamel cells can be used as an active ingredient for the pharmaceutical composition for treating periodontal disease or the composition for promoting periodontal ligament and chalky regeneration or differentiation.
  • the effect of enamel blast culture medium to promote the regeneration or differentiation of periodontal ligament and chalkiness is not known at all, was first identified by the present inventors.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating periodontal disease comprising a culture of enamel cells as one embodiment.
  • preameloblast refers to ectoderm cells that form enamel of the tooth, secrete the organic substrate of enamel, and are also involved in the enamel calcification process.
  • the enamel hair cells are known to secrete organic substrates and minerals at the same time to form enamel, and then exist in a partially inorganicized state, and as the maturity matures, it removes a high content of organic substrate and increases the calcification substrate component. have.
  • the enamel cells are degenerated after enamel formation and are generally not present in teeth in adults, they cannot be involved in the regeneration of damaged teeth when the teeth are damaged.
  • dental epithelial cells that can be differentiated into enamel hair cells, it can be said that some of them exist in the form of junctional epithelium of the gingiva.
  • the term "enamel hair cell culture liquid" of the present invention means a culture supernatant obtained by culturing enamel hair cells.
  • the culture supernatant obtained by culturing the enamel cells contains various substances secreted by culturing the enamel cells, and the enamel hair culture medium promotes the regeneration or differentiation of chalky ligaments as well as the periodontal ligaments lost by periodontal disease. As a result, it may be effective in treating periodontal disease.
  • the enamel hair cell culture solution may be interpreted as a culture supernatant obtained by culturing the enamel hair cells obtained from oral tissues of mammals including humans.
  • periodontal ligament of the present invention, also referred to as the periodontal membrane, means a connective tissue fibrous membrane that binds the chalky and alveolar bone wall of the root in mammals.
  • the periodontal ligament is composed of a bundle of main fibers, which are collagen fibers extending parallel or obliquely to the long axis of the tooth, and a bundle of sharpy fibers, both ends of which are buried in hard tissue in succession. Is stuck on.
  • the periodontal ligament is known to not only buffer the pressure generated when chewing food, but is also rich in blood vessels and nerves, and is involved in nutrition and sense.
  • the periodontal ligament is distinguished from the pulp, wherein the pulp refers to connective tissue including dentin cells and neurovascular vessels that form the dentin, while the periodontal ligament connects the tooth and the jaw bone outside of the tooth. As such, it is fully distinguished in terms of its location, composition and function.
  • cementum ( ⁇ ⁇ ) refers to a thin film of a slightly modified bone covering the roots and other parts of the mammal's teeth.
  • the chalkiness is composed of 50% mineral and 50% moisture-organic, yellow in color and exhibits a lower hardness than dentin or enamel.
  • the chalky liquor includes periodontal ligament fibers that fix the teeth to the alveolar bone. When bacteria are infected with the gums, the chalky degeneration around the teeth occurs, and the dendritic chalky does not adhere to the periodontal ligament fibers that connect the teeth and the alveolar bone. I'm shaking. In order to treat such chalky degeneration, a method of removing the degenerated chalky and promoting the formation of new chalky has been used.
  • gingivitis a disease that damages the periodontal ligament and adjacent tissues by bacterial infection in the gap between the gingiva (gum) and teeth, depending on the degree of the disease It is divided into gingivitis and periodontitis. Inflammation progresses during the development of the periodontal disease, and more tissues are damaged and a periodontal pocket is formed, and as the periodontitis is severe, the depth of the periodontal sac becomes deeper. Is known to cause bone loss.
  • a enamel blast culture medium PA-CM
  • OCCM-30 Differentiation and mineralization of the chalk cell
  • FIGS. 3A to 3F Differentiation and mineralization of the chalk cell
  • the enamel hair cell culture medium can be used as an active ingredient of a composition for promoting the regeneration or differentiation of periodontal ligaments and chalky injuries damaged by periodontal disease or a composition for promoting periodontal ligament and chalky differentiation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in the form of a pharmaceutical composition for treating periodontal disease further comprising a suitable carrier (natural or non-natural carrier), excipient or diluent commonly used in the manufacture of the pharmaceutical composition.
  • a suitable carrier naturally or non-natural carrier
  • excipient or diluent commonly used in the manufacture of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may be used in the form of a sterile injectable solution that can be administered to the site where the periodontal disease is induced, respectively according to a conventional method.
  • carriers, excipients and diluents that can be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, Calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, collagen and the like.
  • suppositories When formulated, it may be prepared using conventional diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, and the like.
  • sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, suppositories, and the like can be included.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the content of the enamel blast culture medium contained in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but may be included in an amount of 0.0001 to 50% by weight, more preferably 0.01 to 20% by weight based on the total weight of the final composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount
  • Sufficient amount means an effective dose level means the severity of the disease, the activity of the drug, the age, weight, health, sex, sensitivity of the patient to the drug, the time of administration of the composition of the invention used, the route of administration and the rate of excretion treatment Period of time, factors including drugs used in combination or coincidental with the compositions of the invention used, and other factors well known in the medical arts.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered alone or in combination with known pharmaceutical compositions for treating periodontal disease. In consideration of all the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be determined by those skilled in the art in consideration of the purpose of use, the degree of addiction of the disease, the age, weight, sex, history, or type of substance used as an active ingredient of the patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at about 0.1 ng to about 100 mg / kg, preferably 1 ng to about 10 mg / kg, per adult, and the frequency of administration of the composition of the present invention is specifically Although not limited, it can be administered once a day or several times in divided doses.
  • the dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the present invention provides a method for treating periodontal disease, comprising administering the pharmaceutical composition to an individual suffering from periodontal disease in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "individual” of the present invention may include without limitation mammals including rats, livestock, and the like, which require treatment of periodontal disease, and may be, for example, mammals other than humans.
  • treatment of the present invention is to administer a pharmaceutical composition comprising the enamel cell culture of the present invention as an active ingredient to an individual in need of treatment of periodontal disease, thereby promoting the regeneration or differentiation of periodontal ligament and chalky, It means any action that causes treatment to be performed or beneficial.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition for treating periodontal disease of the present invention may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited thereto, but may be administered through a route such as oral administration or intraoral injection, as desired.
  • the present invention provides a composition for promoting or regenerating periodontal ligament and chalky skin containing the enamel blast culture medium.
  • the enamel blast culture medium provided by the present invention can not only promote the mobility of the periodontal ligament cells, but also can promote the regeneration or differentiation of the periodontal ligament and chalkacet damaged by the periodontal disease.
  • Silver may be used as an active ingredient of the composition for promoting periodontal ligament and chalky regeneration or differentiation.
  • the present invention provides a kit for promoting or regenerating periodontal ligament and chalky skin containing the composition.
  • the kit of the present invention can be used to regenerate or differentiate the periodontal ligament and chalky tree damaged by the onset of periodontal disease using the composition.
  • the kit provided in the present invention may include a test tube, another appropriate container, a reaction buffer, an injection container, sterile water, etc., in addition to the enamel cell culture.
  • the present invention provides a medium composition for the periodontal ligament differentiation comprising the enamel hair cell culture medium and a method for differentiating the periodontal ligament using the medium composition.
  • the enamel blast culture medium provided by the present invention can promote the regeneration or differentiation of periodontal ligaments and chalky lesions damaged by periodontal disease, so that the enamel blast culture medium is differentiation for differentiating periodontal ligament from periodontal ligament fibroblasts. It can be used as an active ingredient of the medium composition for, and can be used to differentiate the periodontal ligament using the differentiating medium composition.
  • the periodontal ligament differentiation method provided by the present invention comprises the step of inoculating and cultured periodontal ligament fibroblasts in the medium composition for periodontal ligament differentiation.
  • Cretaceous cells are formed from differentiated chalk cells, and the onset of chalky formation begins at the Hertwig's epithelial root sheath (Hertwig epithelial root) site where the root begins to form.
  • HERS is a structure composed of two layers, an inner dental epithelial cell derived from dental epithelial cells and an outer dental epithelial cell. Since the cells are derived from dental follicles and are expected to be differentiated by HERS cell-induced signals, the HERS derived from dental epithelial cells at the site where tooth rooting begins is the tooth follicle cells. HERS is a structure that appears temporarily during development, so it is difficult to use this HERS for chalky regeneration in mature adult teeth.
  • enamel cells are known to differentiate from dental epithelial cells in the crown area. After all, dental epithelial cells, which are the origin of enamel cells, are also the origin of HERS. Therefore, enamel cells can be used instead of HERS for differentiation and chalky regeneration.
  • Example One Enamel hair cell Culture solution ( preameloblast Manufacture of conditioned medium (PA-CM)
  • ABCs (apical bud cells) were isolated from C57BL / 6 mice, and the inoculated ABCs were inoculated into 100-mm collagen coated culture vessels with 7.5 ⁇ 10 5 cells, followed by incubation for 3 days with DMEM differentiation medium. After the incubation was completed, the cells were washed twice with PBS, inoculated again in differentiation medium without FBS and EGF, and cultured for 8 hours to obtain a culture supernatant. The obtained culture supernatant was filtered through a filter having a pore size of 0.2 ⁇ m, concentrated by ammonium sulfate precipitation, and then dialyzed with PBS to prepare an enamel blast culture medium (PA-CM).
  • PA-CM enamel blast culture medium
  • ambush teeth were obtained from 15 adults (18-22 years old), and periodontal ligament fibroblasts were obtained from explants of periodontal ligament tissues isolated therefrom.
  • the obtained periodontal ligament cells were inoculated in DMEM medium containing 10% FBS and antibiotics, and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of the wound treatment analysis to investigate the effect of promoting the migration of PDL cells by PA-CM. As shown in Figure 1, the migration of PDL cells was confirmed to be increased by PA-CM compared to the control.
  • Figure 2 is a photograph and graph showing the results of performing a transwell analysis to investigate the effect of promoting the migration of PDL cells by PA-CM. As shown in FIG. 2, when PA-CM was treated compared to the control group, it was confirmed that the migration level of PDL cells increased by about 5 times.
  • PA-CM promotes the mobility of PDL cells.
  • Example 3-1 Of the chalk cells (OCCM-30) Culture and Differentiation
  • Immortalized blastocyst cell line (OCCM-30) was cultured in DMEM medium containing 10% FBS. In cultured cells without PA-CM treatment (control) or treated conditions (experimental group), 50 ⁇ g / ml ascorbic acid and 10 mM ß-glycerphosphate were treated and cultured for at least 2 weeks to induce cell differentiation. , Mineralized nodules were formed.
  • Example 3-1 After incubating for 0, 4, 7, 10 and 14 days in Example 3-1, 70% ethanol was added to each differentiated celloblast cell line (OCCM-30) differentiated and fixed for 20 minutes, and 1% Alizarin red S was added. Added to stain mineralized nodules (FIG. 3A).
  • Figure 3a is a photograph showing the result of confirming the mineralization level according to the culture time of the chalk cell line according to the treatment of PA-CM.
  • the chalk cell line of the experimental group treated with PA-CM started mineralization on the fourth day of differentiation
  • the chalk cell cell line of the control group not treated with PA-CM started to mineralize on the 7th day of differentiation .
  • Example 3-3 Real time PCR analysis
  • Example 3-1 Trizol reagent was added to each cultured chalk cell cell line (OCCM-30) differentiated by incubating for 0, 4, 7, 10, and 14 days to obtain total RNA, and the total RNA obtained CDNA was synthesized using.
  • Real-time PCR using the synthesized cDNA as a template was performed using an ABI PRISM 7300 sequence detection system using a SYBR GREEN PCR Master Mix, and as a result, a Run-related transcription factor 2 gene, Osx (Osterix).
  • Gene, OC (Osteocalcin) gene, Bsp (Bone sialoprotein) gene and Cap (cementum attachment protein) gene were amplified (Figs. 3b to 3f).
  • GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene was used as an internal control group, and PCR conditions were performed at 94 ° C. for 1 minute, followed by 40 cycles of 95 ° C. 15 seconds and 60 ° C. 34 seconds.
  • Figure 3b is a graph showing the result of confirming the mRNA level of the Runx2 (Runt-related transcription factor 2) gene expressed in the chalk cell line according to the treatment of PA-CM according to the culture time. As shown in FIG. 3B, the expression of Runx2 was increased by about 25-fold at 4 days of differentiation and decreased from 7 days compared to the control group.
  • Runx2 Unt-related transcription factor 2
  • Figure 3c is a graph showing the result of confirming the mRNA level of the Osx (Osterix) gene expressed in the chalk cell line according to the treatment of PA-CM according to the culture time. As shown in Figure 3c, the expression of Osx began on day 4 and maintained until 14 days, it was confirmed that the expression level increased in the experimental group treated with PA-CM compared to the control.
  • Figure 3d is a graph showing the result of confirming the mRNA level of the OC (Osteocalcin) gene expressed in the chalk cell line according to the treatment of PA-CM according to the culture time. As shown in Figure 3d, the expression of OC was started on day 4 and maintained until 14 days, it was confirmed that the expression level increased in the experimental group treated with PA-CM compared to the control.
  • OC Steocalcin
  • Figure 3e is a graph showing the result of confirming the mRNA level of the Bsp (Bone sialoprotein) gene expressed in the chalk cell line according to the treatment of PA-CM according to the culture time. As shown in Figure 3e, the expression of Bsp was started on day 4 and maintained until 14 days, it was confirmed that the expression level increased in the experimental group treated with PA-CM compared to the control.
  • Bsp Bone sialoprotein
  • Figure 3f is a graph showing the result of confirming the mRNA level of the Cap (cementum attachment protein) gene expressed in the chalk cell line according to the treatment of PA-CM according to the culture time. As shown in Figure 3f, the expression of Cap was started on day 4 and maintained until 14 days, it was confirmed that the expression level increased in the experimental group treated with PA-CM compared to the control.
  • Cap cementum attachment protein
  • PA-CM promotes the differentiation and mineralization of chalk cells.
  • Figure 4 is a diagram showing the site of replanting, CO represents the coronal portion of the implanted root, AP represents the tip portion remaining the periodontal ligament.
  • the roots were planted in each alveolar and the coronal portion of the tooth was removed with a carbide burr, and then the top of the root was completely covered with a tubular flap (FIGS. 5 and 6).
  • Figure 5 is a photograph showing the procedure of a series of planting process using the teeth of the mongrel dog
  • Figure 6 is a schematic diagram showing a cross-section of the planted dental tissue
  • N-PDL-T represents a newly formed periodontal ligament-like tissue
  • RR Represents an alternate absorption zone (dental stiffness)
  • NC represents newly formed chalky-like tissue
  • PDL represents a normal periodontal ligament site.
  • the mongrel dogs were sacrificed by administering an excess (90-120 mg / kg) pentobarbital.
  • the tooth parts of the hybrid dog were extracted, fixed with 10% formalin, 5% formic acid was added to remove calcium, molded, embedded in paraffin, and 5 ⁇ m thick tissue sections were obtained.
  • the sections were stained with hematoxylin and eosin and observed using an optical microscope (LEICA DM750, Germany) equipped with a digital camera (LEICA ICC50 camera, Germany), and the connective tissue attached to the surface of the root of the newly formed periodontal ligament-like tissue.
  • FIG. 7 is a micrograph of teeth planted at 4 weeks, A of FIG. 7 represents a positive control group, B represents a negative control group, C and D represent an experimental group, Ab represents an alveolar bone, and De represents an dentin.
  • Ce stands for Cretaceous
  • Pd stands for periodontal ligament
  • nCe (white arrow) stands for newly formed chalky ligament tissue
  • nPd stands for newly formed periodontal ligament-like tissue
  • (*) is surface absorption Indicate the site
  • the black arrow indicates the dental rigid part (alternative absorbing part).
  • a and B represent positive controls
  • C and D represent negative controls
  • E and F represent experimental groups
  • Ab means alveolar bone
  • De represent dentin Ce means chalky
  • Pd means periodontal ligament
  • nPd means newly formed periodontal ligament-like tissue
  • black arrow indicates dental stiffness (alternative absorption).
  • Figure 9 is a micrograph of the teeth planted at 8 weeks, A in Figure 9 represents a positive control group, B represents a negative control group, C and D represents the experimental group, Ab means the alveolar bone, De means dentin Ce stands for Cretaceous, Pd stands for periodontal ligament, nCe (white arrow) stands for newly formed chalky ligament tissue, nPd stands for newly formed periodontal ligament-like tissue, and (*) is surface absorption Indicate the site, and the black arrow indicates the dental rigid part (alternative absorbing part).
  • the root absorbance was observed in all roots, and the periodontal ligament was partially confirmed, and the periodontal ligament was extended to the tip of the root. It was confirmed that it is inserted into the alveolar bone and the newly formed chalky bone. Therefore, it was found that the periodontal ligament was partially regenerated in the positive control group.
  • the experimental group was expanded to cover the entire root of the newly inserted alveolar bone at 8 weeks, and the newly formed periodontal ligament-like tissue was partially formed between the root surface and the new bone.
  • the chalk cell-like cells were arranged along the surface of the new chalky-like tissue, and the newly formed periodontal ligament-like tissue was inserted into the surrounding new bone and new chalky tissue, showing that the periodontal ligament-like tissue had a dense collagen bundle. Confirmed.
  • very few of the dental stiffeners where alternative absorption was performed were identified.
  • the newly formed periodontal ligament-like tissue was confirmed to be composed of rod-shaped cells and microvascular. Therefore, in the experimental group it can be seen that the alveolar bone, periodontal ligament and chalky.
  • FIG. 10 is a graph showing a result of comparing the ratio of newly formed periodontal ligament-like tissues, alveolar stiffenings and newly formed chalky bodies contained in the root of the negative control group or the experimental group at 4 weeks after planting. .
  • the root of the experimental group compared to the root of the negative control group, the newly formed periodontal ligament-like tissue and chalky showed a relatively high level, but it was confirmed that the dental rigid portion shows a relatively low level.
  • FIG. 11 is a graph showing a result of comparing the ratio of newly formed periodontal ligament-like tissues, alveolar stiffeners, and newly formed chalky bodies contained in the root of the negative control group or the experimental group at 8 weeks after planting. .
  • the root of the experimental group compared to the root of the negative control group, the newly formed periodontal ligament-like tissue and chalky showed a relatively high level, but it was confirmed that the dental rigid portion shows a relatively low level.
  • PA-CM can promote the regeneration or differentiation of the periodontal ligament and the chalky contained in the root tissue.

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Abstract

본 발명은 치주인대 세포의 이동을 자극하고, 백악모세포의 분화 및 무기질화를 촉진할 수 있는 법랑모세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 치주질환 치료용 약학 조성물, 상기 약학 조성물을 이용하여 치주질환을 치료하는 방법, 상기 법랑모세포 배양액을 포함하는 치주인대 및 백악질 분화촉진용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 치주인대 및 백악질 분화촉진용 키트, 법랑모세포 배양액을 포함하는 치주인대 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 사용하여 치주인대를 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 법랑모세포 배양액을 이용하면, 치아조직을 형성하는 치주인대와 백악질의 재생 또는 분화를 촉진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 치아조직의 퇴화를 유도하는 치성강직부의 형성을 억제할 수 있으므로, 치주질환을 효과적인 치료할 수 있는 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

법랑모세포 배양액을 포함하는 치주질환 치료용 약학 조성물
본 발명은 법랑모세포 배양액을 포함하는 치주질환 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 치주인대 세포의 이동을 자극하고, 백악모세포의 분화 및 무기질화를 촉진할 수 있는 법랑모세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 치주질환 치료용 약학 조성물, 상기 약학 조성물을 이용하여 치주질환을 치료하는 방법, 상기 법랑모세포 배양액을 포함하는 치주인대 및 백악질 분화촉진용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 치주인대 및 백악질 분화촉진용 키트, 법랑모세포 배양액을 포함하는 치주인대 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 사용하여 치주인대를 분화시키는 방법에 관한 것이다.
치주조직(periodontium)은 상피조직, 연조직성 결합조직 및 석회화된 결합조직으로 구성된 복합기관이다. 치주조직의 구조로는 치은(gingiva), 치주인대(PDL: periodontal ligament), 백악질(cementum) 및 치조골(alveolar bone)이 있다. 치은 섬유아세포(gingival fibroblast)와 치주인대 섬유아세포 (periodontal ligament fibroblast)는 치은연조직성 결합조직의 주요 세포 구성 성분이며, 세포외 기질(extracellular matrix)을 형성하고 이를 유지하는 역할을 한다. 이 중 치은 섬유아세포는 주로 치은 결합조직을 유지하는 데 관여하는 반면, 치주인대 섬유아세포는 그 특유 기능으로 치주인대를 형성할 뿐만 아니라 생체 내에서의 인접 치조골 및 백악질의 수복과 재생에 관여하는 것으로 알려져 있다.
치주질환이 발생하면 임상적으로 치은 출혈과 종창, 치주낭의 형성 및 치조골의 파괴 등으로 치아의 상실을 가져오게 된다. 이러한 치주질환의 원인으로서는 국소적 요인과 전신적 요인이 있는데, 국소적 요인으로 치태가 치주낭 내에 기계적으로 축적되면 주변에 존재하는 세균들의 서식처가 되며 이러한 서식은 점차 호기성, 통기성, 그람 양성 세균에서 혐기성 그람음성 세균으로 점차 이행되며, 치주낭의 심부로 증식되게 된다. 이때 증식된 혐기성 그람음성 세균으로 점차 이행되며, 치주낭의 심부로 증식되게 된다. 이때 증식된 혐기성 그람음성 세균의 독소 및 모든 산물이 직접 조직을 파괴하거나 면역계를 자극하여 자극된 면역계에서부터 여러 가지 작용에 의하여 치주조직파괴와 더불어 염증을 유발하게 된다.
이에 대한 방어기전으로서 다형핵 백혈구의 기능과 면역반응이 전신적인 요인으로서 작용하게 된다. 그러나, 근원적인 인자인 혐기성 그람음성 세균에 대한 항균작용 및 정균작용과 이들 세균의 독성산물을 제거하고 파괴, 소실된 치주조직을 원상 회복시키는 것이 치주질환의 예방 및 치료에 중요한 관건이 되는 것으로 알려져 있다. 치주질환 예방 및 치료제는 1920년대부터 많은 연구가 진행되어 왔으며 특히, 구미 각국에서는 항생제 및 화학요법제를 이용한 치태제거에 주력하여 왔다. 이러한 연구는 치태내에 존재하는 세균 중 치주병인균의 윤곽이 밝혀지고 있는 1970년 이후에 더욱 활발히 개발되어 페놀성 화합물 제제인 리스테린, 4급 암모니움 화합물 제제인 스코푸, 클로르헥시딘 제제인 페리덱스 등이 현재 구미에서 시판되고 있으며, 국내에서도 수입 판매되고 있다. 제제중 리스테린이나 스코푸는 화학요법 제제로 부작용이 경미한 반면 치태 제거 및 항균효과가 월등하지 못한 실정이고, 클로르헥시딘 제제인 페리덱스는 상당히 효과적으로 치태제거 및 항균작용을 보이나 부작용이 심하여 통상 사용하는 0.12% 농도에서도 구강 점막 궤양, 박리성 치은염 유발, 착색 등이 나타나고, 장기간 사용할 시 구강건조증 등의 부작용이 있다고 보고되고 있다. 따라서, 치주질환을 치료하기 위하여는 치주질환의 원인균을 제거하는 과정 뿐만 아니라 치주조직을 재생하는 과정이 함께 수행되어야 할 것으로 예상되고 있다.
이처럼 치주조직을 효과적으로 재생하는 방법을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국등록특허 제1179476호에는 인간치주인대 (hPDL) 세포의 광물화 과정에서 높게 발현되는 전골수구성 백혈병 아연 손가락(PLZF) 유전자, Fk506 결합 단백질 5(FKBP5) 유전자, 혈청 아밀로이드 A1(SAA1) 유전자, 지방산 결합 단백질 4(FABP4) 유전자, 서열 유사성을 갖는 계열 A(FAM107A) 유전자, 코린(CORIN) 유전자, ras-관련 C3 부톨리눔 독소 기질 3(RAC3) 유전자 또는 프로락틴-유도된 단백질(PIP) 유전자 및 인간치주인대 (hPDL) 세포의 광물화 과정에서 낮게 발현되는 FNDC1, PTGS2, RSAD2, NPTX1, VCAM1, MX1, IFIT1, CLDN1 또는 WISP2 유전자가 개시되어 있다.
치주질환을 치료하는 궁극적인 결과는 손상된 결합조직과 뼈를 복원하는 것이므로, 이를 위하여는 뼈를 지지하는 치주인대를 재생시키거나 또는 이를 분화시키는 것이 필요하지만, 아직까지는 치주인대를 직접적으로 재생하거나 분화시킬 수 있는 방법은 보고되어 있지 않다.
본 발명자들은 치주인대를 재생 또는 분화시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 법랑모세포 배양액을 사용하면 치주인대의 재생 또는 분화를 촉진시켜서 치주질환을 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 법랑모세포 배양액을 포함하는 치주질환 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 약학 조성물을 이용하여 치주질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 법랑모세포 배양액을 포함하는 치주인대 및 백악질의 재생 또는 분화촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 치주인대 및 백악질의 재생 또는 분화촉진용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 법랑모세포 배양액을 포함하는 치주인대 분화용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 배지 조성물을 사용하여 치주인대를 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 법랑모세포 배양액을 이용하면, 치아조직을 형성하는 치주인대와 백악질의 재생 또는 분화를 촉진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 치아조직의 퇴화를 유도하는 치성강직부의 형성을 억제할 수 있으므로, 치주질환을 효과적인 치료할 수 있는 제제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 PA-CM에 의한 PDL 세포의 이동촉진 효과를 조사하기 위하여 상처치료 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 PA-CM에 의한 PDL 세포의 이동촉진 효과를 조사하기 위하여 트랜스웰 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 도 2에서 보듯이, 대조군에 비하여 PA-CM이 처리된 경우에는, PDL 세포의 이동수준이 약 5배 증가함을 확인하였다.
도 3a는 PA-CM의 처리여부에 따른 백악모세포 세포주의 무기질화 수준을 배양시간에 따라 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3b는 PA-CM의 처리여부에 따른 백악모세포 세포주에서 발현되는 Runx2(Runt-related transcription factor 2) 유전자의 mRNA 수준을 배양시간에 따라 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3c는 PA-CM의 처리여부에 따른 백악모세포 세포주에서 발현되는 Osx(Osterix) 유전자의 mRNA 수준을 배양시간에 따라 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3d는 PA-CM의 처리여부에 따른 백악모세포 세포주에서 발현되는 OC(Osteocalcin) 유전자의 mRNA 수준을 배양시간에 따라 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3e는 PA-CM의 처리여부에 따른 백악모세포 세포주에서 발현되는 Bsp(Bone sialoprotein) 유전자의 mRNA 수준을 배양시간에 따라 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3f는 PA-CM의 처리여부에 따른 백악모세포 세포주에서 발현되는 Cap(cementum attachment protein) 유전자의 mRNA 수준을 배양시간에 따라 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 재식술 대상부위를 나타내는 다이어그램으로서, CO는 이식된 치근인 관상부를 나타내고, AP는 치주인대가 남아있는 첨단부를 나타낸다.
도 5는 잡종견의 치아를 이용한 일련의 재식과정의 시술단계를 나타내는 사진이다.
도 6은 재식된 치아조직의 단면을 나타내는 개략도이다.
도 7은 4주째 재식된 치아의 미세사진으로서, 도 7의 A는 양성대조군을 나타내고, B는 음성대조군을 나타내며, C 및 D는 실험군을 나타내고, Ab는 치조골을 의미하고, De는 상아질을 의미하며, Ce는 백악질을 의미하고, Pd는 치주인대를 의미하며, nCe(흰색 화살표)는 새로이 형성된 백악질 유사조직을 의미하고, nPd는 새로이 형성된 치주인대 유사조직을 의미하며, (*)는 표면 흡수 부위를 나타내고, 검은색 화살표는 치성강직부(대체 흡수부)를 나타낸다.
도 8은 4주째 재식된 치아의 다른 미세사진으로서, A 및 B는 양성대조군을 나타내고, C 및 D는 음성대조군을 나타내며, E 및 F는 실험군을 나타내고, Ab는 치조골을 의미하고, De는 상아질을 의미하며, Ce는 백악질을 의미하고, Pd는 치주인대를 의미하며, nPd는 새로이 형성된 치주인대 유사조직을 의미하고, 검은색 화살표는 치성강직부(대체 흡수부)를 나타낸다.
도 9는 8주째 재식된 치아의 미세사진으로서, 도 9의 A는 양성대조군을 나타내고, B는 음성대조군을 나타내며, C 및 D는 실험군을 나타내고, Ab는 치조골을 의미하고, De는 상아질을 의미하며, Ce는 백악질을 의미하고, Pd는 치주인대를 의미하며, nCe(흰색 화살표)는 새로이 형성된 백악질 유사조직을 의미하고, nPd는 새로이 형성된 치주인대 유사조직을 의미하며, (*)는 표면 흡수 부위를 나타내고, 검은색 화살표는 치성강직부(대체 흡수부)를 나타낸다.
도 10은 재식후 4주가 경과된 시점에서, 음성대조군 또는 실험군의 치근에 포함된 새로이 형성된 치주인대 유사조직, 대체흡수가 수행된 치성강직부 및 새로이 형성된 백악질의 비율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 재식후 8주가 경과된 시점에서, 음성대조군 또는 실험군의 치근에 포함된 새로이 형성된 치주인대 유사조직, 대체흡수가 수행된 치성강직부 및 새로이 형성된 백악질의 비율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명자들은 치주인대를 재생 또는 분화시킬 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 법랑모세포에 주목하게 되었다. 상기 법랑모세포는 치아의 법랑질을 형성하고, 법랑질의 유기기질을 분비하며, 법랑질 석회화 과정에도 관여하지만, 일단 치아가 형성된 후에는 치아로부터 제거되는 세포로 알려져 있다. 또한 치아의 발생과정에서 치아상피세포(dental epithelial cell)는 장차 법랑모세포로 분화하게 되는데, 이 치아상피세포가 치주인대와 백악질을 포함한 치주조직의 발생과도 관련이 있다고 알려져 있다. 이에, 상기 법랑모세포로부터 유래된 성분이 치주질환에 의하여 손상된 치주인대 및 백악질의 재생 또는 분화를 촉진시킬 수 있을 것으로 가정하고, 상기 법랑모세포를 배양하여 수득한 배양액이 치주인대의 재생 또는 분화에 영향을 미칠 수 있는지를 확인하였다. 그 결과, 상기 법랑모세포의 배양액은 치주인대 세포의 이동성을 촉진시킬 수 있고, 백악모세포세포주(OCCM-30)의 분화 및 무기질화를 촉진시킬 수 있으며, 동물실험을 통하여, 치주질환에 의하여 손상된 치주인대와 백악질의 재생 또는 분화를 촉진시키고, 치아의 퇴화를 유도하는 치성강직부의 형성을 억제할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 상기 법랑모세포의 배양액은 치주질환 치료용 약학 조성물 또는 치주인대 및 백악질의 재생 또는 분화촉진용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다. 상술한 바와 같이, 법랑모세포 배양액이 치주인대 및 백악질의 재생 또는 분화를 촉진시키는 효과는 종래에 전혀 공지되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 법랑모세포의 배양액을 포함하는 치주질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "법랑모세포(preameloblast)"란, 치아의 법랑질을 형성하고, 법랑질의 유기기질을 분비하며, 법랑질 석회화 과정에도 관여하는 외배엽성 세포를 의미한다. 상기 법랑모세포는 법랑질을 형성할 때 유기기질과 무기질을 동시에 분비하여 부분 무기질화된 상태로 존재하다가 성숙해감에 따라 높은 함량의 유기기질을 제거하고 석회화 기질 성분을 높여가는 형태로 법랑질을 석회화 시키는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상기 법랑모세포는 법랑질 형성 후에 퇴화되어 성인에서의 치아에서 일반적으로 존재하지 않기 때문에, 치아가 손상되었을 때 손상된 치아의 재생에 관여할 수 없다. 다만 법랑모세포로 분화될 수 있는 치아상피세포의 경우 치은의 접합상피(junctional epithelium)의 형태로 일부 존재한다고 볼 수 있다.
본 발명의 용어 "법랑모세포 배양액"이란, 법랑모세포를 배양하여 수득한 배양상등액을 의미한다. 상기 법랑모세포를 배양하여 수득한 배양상등액에는 상기 법랑모세포가 배양되면서 분비한 다양한 물질이 포함되어 있어, 상기 법랑모세포 배양액을 이용하면 치주질환에 의하여 손실된 치주인대 뿐만 아니라 백악질의 재생 또는 분화를 촉진시켜서, 결과적으로는 치주질환을 치료하는 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 법랑모세포 배양액은 인간을 포함하는 포유류의 구강조직으로부터 수득한 법랑모세포를 배양하여 수득한 배양상등액으로 해석될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 법랑모세포 배양액으로, 마우스 유래 법랑모세포의 일종인 ABCs(apical bud cells)를 배양하여 수득한 배양상등액을 사용하였다
본 발명의 용어 "치주인대(periodontal ligament, PDL)"란, 치근막이라고도 호칭되며, 포유류에서 치근의 백악질과 치조골벽을 결합하는 결합조직성 섬유막을 의미한다. 상기 치주인대는 치아의 장축에 대해 평행 또는 비스듬히 뻗는 교원섬유인 주섬유와 이것에 연속하여 양끝이 경조직에 묻혀있는 샤피(Sharpey)섬유의 다발로 구성되며, 치주인대를 통하여 치아가 탄성적으로 턱뼈에 고착된다. 상기 치주인대는 음식물을 씹을 때 생기는 압력을 완충할 뿐만 아니라 혈관이나 신경이 풍부하며 영양공급이나 감각에도 관여하는 것으로 알려져 있다.
상기 치주인대는 치수와 구별되는데, 상기 치수는 치아의 내측에 위치하고, 상아질을 형성하는 상아모세포 및 신경혈관을 포함하는 결합조직을 의미하는 반면, 상기 치주인대는 치아의 외부에서 치아와 턱뼈를 연결하는 역할을 수행하므로, 그의 위치, 구성 및 기능면에서 완전히 구별된다.
본 발명의 용어 "백악질(cementum, 白堊質)"이란, 포유동물의 치아 뿌리(치근齒根)와 기타 일부를 덮고 있는 뼈가 약간 변형된 형태의 얇은 막을 의미한다. 상기 백악질은 50%의 무기질 및 50%의 수분-유기질로 구성되고, 노란색을 띠고 있으며 상아질이나 에나멜질보다 낮은 경도를 나타낸다. 상기 백악질은 치아를 치조골에 고정시키는 치주인대 섬유질을 포함하는데, 세균이 잇몸에 감염되면 치아를 둘러싼 백악질의 변성이 일어나고, 변성된 백악질에는 치아와 치조골을 연결해주는 치주인대 섬유질이 달라붙지 못해서 치아가 흔들리게 된다. 이러한 백악질의 변성을 치료하기 위하여는 변성된 백악질을 제거하고 새로운 백악질의 형성을 촉진하는 방법이 사용되고 있다.
본 발명의 용어 "치주질환(periodontal disease)" 이란, 풍치라고도 하며, 치은(잇몸)과 치아 사이의 틈에 박테리아가 감염되어 치주인대와 인접조직을 손상시키는 질환을 의미하는데, 병증의 정도에 따라 치은염과 치주염으로 구분된다. 상기 치주질환의 발병시 염증이 진행되어 더 많은 조직이 손상되면서 치주낭(periodontal pocket)이 형성되고, 치주염이 심할수록 치주낭의 깊이가 깊어지게 되는데, 치주낭이 깊어지면서 치주인대에 염증이 생기게 되고 최종적으로는 골소실이 유발된다고 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 법랑모세포 배양액(preameloblast-conditioned medium, PA-CM)을 제조하고, 이의 효과를 검증한 결과, 치주인대 세포의 이동성을 촉진시킬 수 있고(도 1 및 2), 백악모세포(OCCM-30)의 분화 및 무기질화를 촉진시킬 수 있으며(도 3a 내지 3f), 동물실험을 통하여, 치주질환에 의하여 손상된 치주인대와 백악질의 재생 또는 분화를 촉진시키고, 치아의 퇴화를 유도하는 치성강직부의 형성을 억제할 수 있음(도 7 내지 11)을 확인하였다.
따라서, 상기 법랑모세포 배양액은 치주질환에 의해 손상된 치주인대 및 백악질의 재생 또는 분화를 촉진하는 조성물 또는 치주인대 및 백악질 분화촉진용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 약학 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체(자연적 또는 비자연적 담체), 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 치주질환 치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 치주질환이 유발된 부위에 투여할 수 있는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 콜라겐 등을 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 특히, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 법랑모세포 배양액의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로로 투여하거나 공지된 치주질환 치료용 약학 조성물과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 치주질환이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치주질환 치료방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란 치주질환의 치료가 요구되는 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물 등을 제한 없이 포함할 수 있고, 일 예로서, 인간을 제외한 포유동물이 될 수도 있다.
본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명의 법랑모세포 배양액을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 치주질환의 치료가 요구되는 개체에 투여하여 치주인대 및 백악질의 재생 또는 분화를 촉진함으로써, 치주질환의 치료가 수행되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 치주질환 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 구강내 투여 또는 구강내 주사 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 법랑모세포 배양액을 포함하는 치주인대 및 백악질의 재생 또는 분화촉진용 조성물을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 법랑모세포 배양액은 치주인대 세포의 이동성을 촉진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 치주질환에 의하여 손상된 치주인대와 백악질의 재생 또는 분화를 촉진시킬 수 있으므로, 상기 법랑모세포 배양액은 치주인대 및 백악질의 재생 또는 분화촉진용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 조성물을 포함하는 치주인대 및 백악질의 재생 또는 분화촉진용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 치주질환의 발병에 의하여 손상되는 치주인대 및 백악질을 재생 또는 분화시키는데 사용될 수 있다. 본 발명에 제공하는 키트는 상기 법랑모세포 배양액 외에도 테스트 튜브, 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 주사용기, 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 법랑모세포 배양액을 포함하는 치주인대 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용하여 치주인대를 분화시키는 방법을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 법랑모세포 배양액은 치주질환에 의하여 손상된 치주인대와 백악질의 재생 또는 분화를 촉진시킬 수 있으므로, 상기 법랑모세포 배양액은 치주인대 섬유아세포로부터 치주인대를 분화시키기 위한 분화용 배지 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있고, 상기 분화용 배지 조성물을 사용하여 치주인대를 분화시킬 수 있다.
한편, 본 발명에서 제공하는 치주인대의 분화방법은 상기 치주인대 분화용 배지 조성물에 치주인대 섬유아세포를 접종하고 배양하는 단계를 포함한다.
백악질은 분화된 백악모세포로부터 형성되며, 백악질 형성의 시작은 치근이 형성되기 시작하는 HERS(Hertwig’s epithelial root sheath; Hertwig 상피치근집) 부위로부터 시작된다. HERS는 치아상피세포에서 유래된 내치아상피세포(inner dental epithelial cell)와 외치아상피세포(outer dental epithelial cell)의 두 층으로 구성된 구조물이다. 상기 백악모세포는 치아주머니(dental follicle)로부터 유래된 세포가 HERS세포의 유도신호를 받아 분화된 것으로 예상되기 때문에, 치근형성이 시작되는 부위에서 치아상피세포에서 유래된 HERS는 치아주머니세포를 백악모세포로 분화시킬 수 있는데, HERS는 발생과정 중에 일시적으로 나타나는 구조물이기에 완성된 성인의 치아에서는 이 HERS를 백악질 재생에 이용하기 어렵다. 또한, 법랑모세포는 치관부에서 치아상피세포로부터 분화된다고 알려져 있다. 결국, 법랑모세포의 기원인 치아상피세포는 HERS의 기원이기도 하기 때문에 백악모세포 분화와 백악질 재생에 있어서 HERS대신 법랑모세포를 이용해볼 수가 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 법랑모세포 배양액( preameloblast -conditioned medium, PA-CM)의 제조
C57BL/6 마우스로부터 ABCs(apical bud cells)를 분리하고, 분리된 ABCs를 7.5 x 105 세포수로 100-mm 콜라겐 코팅 배양용기에 접종한 다음, DMEM 분화배지를 가하여 3일 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 상기 세포를 PBS로 2회 세척하고, FBS와 EGF가 포함되지 않은 분화배지에 다시 접종하였으며, 8시간 동안 배양하고 배양상등액을 수득하였다. 상기 수득한 배양상등액을 0.2㎛ 기공크기의 필터로 여과하고, 황산암모늄 침전법으로 농축한 다음, PBS로 투석하여 법랑모세포 배양액(PA-CM)을 제조하였다.
실시예 2: 치주인대 (periodontal ligament, PDL ) 세포의 이동성에 대한 PA-CM의 효과
PDL 세포에서 PA-CM에 의한 세포이동 촉진효과를 조사하기 위하여 상처치료 분석과 트랜스웰 분석을 수행하였다.
실시예 2-1: 상처치료 분석
먼저, 15명의 성인(18 내지 22세)으로부터 매복지치를 수득하고, 이로부터 분리한 치주인대 조직의 외식배양물로부터 치주인대 섬유아세포를 수득하였다. 상기 수득한 치주인대 세포를 10% FBS와 항생제를 포함하는 DMEM 배지에 접종하고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다.
다음으로, 1 × 105 세포수의 PDL 세포를 35mm 배양용기에 접종하고, 포화배양하였다. 멸균 피펫팁으로 각 배양용기의 중앙에 스크래치를 형성하였다. 그런 다음, PBS로 3회 세척하고, BSA(10 ㎍/㎖, 대조군) 또는 PA-CM(10 ㎍/㎖)를 포함하는 배양배지를 가하여 24시간 동안 배양하였으며, 배양이 종료된 후 상기 스크래치 부위로 이동한 세포를 광학현미경으로 관찰하였다(도 1).
도 1은 PA-CM에 의한 PDL 세포의 이동촉진 효과를 조사하기 위하여 상처치료 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다. 도 1에서 보듯이, PDL 세포의 이동은 대조군에 비하여 PA-CM에 의하여 증가됨을 확인하였다.
실시예 2-2: 트랜스웰 분석
Transwell chambers(Costar)의 8-㎛ 공극필터의 상면에 PDL 세포를 1 × 104 세포수/well의 농도로 접종하고, 하면에 PA-CM(10㎍/㎖) 또는 BSA(10㎍/㎖, 대조군)를 처리한 다음, 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 상기 필터의 상면에 남아있는 세포를 기계적으로 제거하고, 하면에 위치한 세포에 4% PFA를 가하여 고정시켰다. 상기 고정된 세포를 헤마톡실린으로 염색하고, 염색된 세포를 계수하였다(도 2).
도 2는 PA-CM에 의한 PDL 세포의 이동촉진 효과를 조사하기 위하여 트랜스웰 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 도 2에서 보듯이, 대조군에 비하여 PA-CM이 처리된 경우에는, PDL 세포의 이동수준이 약 5배 증가함을 확인하였다.
상기 실시예 2-1 및 2-2의 결과로부터, PA-CM이 PDL 세포의 이동성을 촉진시킴을 알 수 있었다.
실시예 3: 백악모세포(OCCM-30)의 분화 및 무기질화에 대한 PA-CM의 효과
실시예 3-1: 백악모세포(OCCM-30)의 배양 및 분화
불멸화된 마우스의 백악모세포 세포주(OCCM-30)를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양된 세포에 PA-CM을 처리하지 않거나(대조군) 또는 처리한 조건(실험군)에서, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산 및 10 mM ß-글리세포포스페이트를 처리하고 2주이상 배양하여 세포분화를 유도하고, 무기질화된 결절을 형성시켰다.
실시예 3-2: Alizarin red S 염색
상기 실시예 3-1에서 0, 4, 7, 10 및 14일 동안 배양하여 분화된 각각의 백악모세포 세포주(OCCM-30)에 70% 에탄올을 가하여 20분 동안 고정시키고, 1% Alizarin red S를 가하여 무기질화된 결절을 염색하였다(도 3a).
도 3a는 PA-CM의 처리여부에 따른 백악모세포 세포주의 무기질화 수준을 배양시간에 따라 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 도 3a에서 보듯이, PA-CM이 처리된 실험군의 백악모세포 세포주는 분화 4일째에 무기질화가 시작된 반면, PA-CM이 처리되지 않은 대조군의 백악모세포 세포주는 분화 7일째에 무기질화가 시작됨을 확인하였다.
실시예 3-3: 실시간 PCR 분석
상기 실시예 3-1에서 0, 4, 7, 10 및 14일 동안 배양하여 분화된 각각의 배양된 백악모세포 세포주(OCCM-30)에 Trizol 시약을 가하여 총 RNA를 수득하고, 상기 수득한 총 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 주형으로 사용한 실시간 PCR을 SYBR GREEN PCR Master Mix를 사용한 ABI PRISM 7300 sequence detection system을 이용하여 수행하고, 그 결과로서 수행하여 Runx2(Runt-related transcription factor 2) 유전자, Osx(Osterix) 유전자, OC(Osteocalcin) 유전자, Bsp(Bone sialoprotein) 유전자 및 Cap(cementum attachment protein) 유전자를 증폭시켰다(도 3b 내지 3f). 이때, 내부대조군으로는 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 사용하였고, PCR 조건은 94℃에서 1분 동안 반응시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 34초 반응을 40회 반복수행하였다.
도 3b는 PA-CM의 처리여부에 따른 백악모세포 세포주에서 발현되는 Runx2(Runt-related transcription factor 2) 유전자의 mRNA 수준을 배양시간에 따라 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3b에서 보듯이, 대조군에 비하여 Runx2의 발현은 분화 4일째에 약 25배 증가하였고 7일째부터 감소함을 확인하였다.
도 3c는 PA-CM의 처리여부에 따른 백악모세포 세포주에서 발현되는 Osx(Osterix) 유전자의 mRNA 수준을 배양시간에 따라 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3c에서 보듯이, Osx의 발현은 4일째에 시작되어 14일까지 유지되었고, 대조군에 비하여 PA-CM을 처리한 실험군에서 발현수준이 증가함을 확인하였다.
도 3d는 PA-CM의 처리여부에 따른 백악모세포 세포주에서 발현되는 OC(Osteocalcin) 유전자의 mRNA 수준을 배양시간에 따라 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3d에서 보듯이, OC의 발현은 4일째에 시작되어 14일까지 유지되었고, 대조군에 비하여 PA-CM을 처리한 실험군에서 발현수준이 증가함을 확인하였다.
도 3e는 PA-CM의 처리여부에 따른 백악모세포 세포주에서 발현되는 Bsp(Bone sialoprotein) 유전자의 mRNA 수준을 배양시간에 따라 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3e에서 보듯이, Bsp의 발현은 4일째에 시작되어 14일까지 유지되었고, 대조군에 비하여 PA-CM을 처리한 실험군에서 발현수준이 증가함을 확인하였다.
도 3f는 PA-CM의 처리여부에 따른 백악모세포 세포주에서 발현되는 Cap(cementum attachment protein) 유전자의 mRNA 수준을 배양시간에 따라 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3f에서 보듯이, Cap의 발현은 4일째에 시작되어 14일까지 유지되었고, 대조군에 비하여 PA-CM을 처리한 실험군에서 발현수준이 증가함을 확인하였다.
상기 실시예 3-2 및 3-3의 결과로부터, PA-CM이 백악모세포의 분화 및 무기질화를 촉진시킴을 알 수 있었다.
실시예 4: 동물실험을 통한 PA-CM의 효과검증
6마리의 잡종견(12 내지 16kg; 6 내지 8주령)에 겔로란을 흡입시켜서 마취시키고, 졸레틸(Zoletil, 5mg/kg)과 자일라진(xylazine, 0.2~0.5mg/kg)을 정맥주사한 다음, 리도카인을 처리하였다(Lidocaine 2% with 1:80,000 epinephrine). 상기 잡종견의 하악골에서 무작위적으로 소구치를 선발하고, 선발된 소구치의 중간을 고속 카바이드 버로 절단한 후, 발치하였다(도 2a). 그런 다음, 약 5mm의 간격으로 근심부 또는 원위부 치근의 관상부에 흠집(notch)을 형성하였다(도 4).
도 4는 재식술 대상부위를 나타내는 다이어그램으로서, CO는 이식된 치근인 관상부를 나타내고, AP는 치주인대가 남아있는 첨단부를 나타낸다.
총 36개의 치근를 발치한 다음, 치주인대가 유지되는 12개 시료(양성대조군), 치주인대와 백악질이 제거된 12개 시료(음성대조군) 및 치주인대와 백악질이 제거되고 PA-CM을 처리한 12개 시료(실험군)으로 분류하였다. 이때, 음성대조군과 실험군에서는 각 흠집사이의 치주인대와 백악질을 그레이시 큐렛으로 제거하였다. 이어, 상기 실험군의 치근을 80 ㎍의 PA-CM을 포함하는 0.08 ㎖ 수용액에 2분 동안 침지하고, 대조군의 치근은 생리식염수에 2분 동안 침지하여 건조를 방지하였다.
상기 치근을 각각의 치조에 재식하고 카바이드 버로 치아의 관상부를 제거한 다음, 상기 치근의 상부를 관상의 플랩으로 완전히 덮었다(도 5 및 6).
도 5는 잡종견의 치아를 이용한 일련의 재식과정의 시술단계를 나타내는 사진이고, 도 6은 재식된 치아조직의 단면을 나타내는 개략도로서, N-PDL-T은 새로이 형성된 치주인대 유사조직을 나타내고, R-R은 대체 흡수 영역(치성강직부)을 나타내며, N-C는 새로이 형성된 백악질 유사조직을 나타내고, PDL은 정상 치주인대 부위를 나타낸다.
재식후, 4주 또는 8주 되는 시점에서, 상기 잡종견에 과량(90-120 mg/kg)의 펜토바비탈을 투여하여 희생시켰다. 상기 잡종견의 치아부위를 적출하고, 10% 포르말린으로 고정시킨 후, 5% 포름산을 가하여 칼슘을 제거하며, 성형하고, 파라핀에 포매한 다음, 5㎛ 두께의 조직절편을 수득하였으며, 상기 수득한 조직절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고, 디지털 카메라(LEICA ICC50 camera, Germany)가 장착된 광학현미경(LEICA DM750, Germany)을 사용하여 관찰하면서, 새로이 형성된 치주인대 유사조직인 치근 표면에 부착된 결합조직의 길이, 치성강직부의 높이, 치근에 새로이 형성된 백악질 유사조직의 길이 등을 측정한 다음, 모든 측정값을 i-SOLUTION Lite® 및 분석프로그램(IMT i-Solution Corporation, Korea, www. IMT-Solution. com)을 사용하여 분석하였다(도 7 내지 9).
도 7은 4주째 재식된 치아의 미세사진으로서, 도 7의 A는 양성대조군을 나타내고, B는 음성대조군을 나타내며, C 및 D는 실험군을 나타내고, Ab는 치조골을 의미하고, De는 상아질을 의미하며, Ce는 백악질을 의미하고, Pd는 치주인대를 의미하며, nCe(흰색 화살표)는 새로이 형성된 백악질 유사조직을 의미하고, nPd는 새로이 형성된 치주인대 유사조직을 의미하며, (*)는 표면 흡수 부위를 나타내고, 검은색 화살표는 치성강직부(대체 흡수부)를 나타낸다.
도 8은 4주째 재식된 치아의 다른 미세사진으로서, A 및 B는 양성대조군을 나타내고, C 및 D는 음성대조군을 나타내며, E 및 F는 실험군을 나타내고, Ab는 치조골을 의미하고, De는 상아질을 의미하며, Ce는 백악질을 의미하고, Pd는 치주인대를 의미하며, nPd는 새로이 형성된 치주인대 유사조직을 의미하고, 검은색 화살표는 치성강직부(대체 흡수부)를 나타낸다.
도 7의 A, 도 8의 A 및 B에서 보듯이, 양성대조군은 4주째에, 정상 치주인대가 관찰되었고, 치근 표면의 일부영역에서, 치근 흡수 및/또는 대체 흡수가 관찰되었으며, 치근 흡수영역에 결합조직이 형성되었고, PDL의 결합조직 섬유는 치근표면과 치조골 사이에서 관찰됨을 확인하였다.
도 7의 B, 도 8의 C 및 D에서 보듯이, 음성대조군은 4주째에, 모든 치근의 치주인대의 주된 부분 및 백악질 결여 영역에서 대체 흡수가 관찰되었고, 치근 표면에 결합조직이 형성되었으며, 치근흡수영역이 제한되었다. 특히, 관상부에서 치성강직부가 관찰되었는데, 상기 치성강직부에서는 치근 표면에서의 대체 흡수와 치근표면에 근접한 개별적인 골형성이 확인되었고, 상기 치근표면은 치조골과 융합된 형태를 나타내었으며, 치주인대의 결합조직 섬유는 치근표면에서 관찰되지 않음을 확인하였다.
도 7의 C, 도 8의 E 및 F에서 보듯이, 실험군은 4주째에, 골 형성이 치조의 골표면을 따라 증가되었고, 새로이 형성된 결합조직은 치근 표면과 새로운 골의 사이에서 부분적으로 관찰되었으며, 골아세포 유사세포 및 백악모세포 유사세포가 각각 새로운 골과 백악질 유사조직에서 관찰되었고, 새로이 형성된 결합조직은 밀집되고 치근 표면에 대하여 수직적으로 배열되고, 상기 조직의 콜라겐 다발은 새로운 백악질에 삽입되어 있음을 확인하였다. 특히, 새로이 형성된 치주인대 유사조직과 백악질이 치근표면에서 확인되었는데, 상기 치주인대 유사조직은 치근의 첨단부에 잔류하는 치주인대로부터 확장된 것으로 예상되었다.
도 9는 8주째 재식된 치아의 미세사진으로서, 도 9의 A는 양성대조군을 나타내고, B는 음성대조군을 나타내며, C 및 D는 실험군을 나타내고, Ab는 치조골을 의미하고, De는 상아질을 의미하며, Ce는 백악질을 의미하고, Pd는 치주인대를 의미하며, nCe(흰색 화살표)는 새로이 형성된 백악질 유사조직을 의미하고, nPd는 새로이 형성된 치주인대 유사조직을 의미하며, (*)는 표면 흡수 부위를 나타내고, 검은색 화살표는 치성강직부(대체 흡수부)를 나타낸다.
도 9의 A에서 보듯이, 양성대조군은 8주째에, 모든 치근에서 치근 흡수가 관찰되었는데, 치주인대는 일부분에서 확인되었고, 상기 치주인대는 치근의 첨단부까지 확장되었으며, 치주인대의 콜라겐 다발은 치조골과 새로이 형성된 백악질에 삽입됨을 확인하였다. 따라서, 양성대조군의 경우에는 치주인대가 일부 재생됨을 알 수 있었다.
도 9의 B에서 보듯이, 음성대조군은 8주째에, 모든 치근의 치주인대의 주된 부분 및 백악질 결여 영역에서 대체 흡수가 관찰되고, 치근표면에 결합조직이 형성되었으며, 치근흡수영역은 극히 제한됨을 확인하였다. 특히, 대체 흡수가 관찰된 부위에서는 치성강직이 형성되어 대부분의 치주인대가 골조직으로 대체되었고, 이러한 골조직은 치근표면과 융합된 형태를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 음성대조군의 경우에는 치주인대가 재생되지 않고, 골조직으로 변화된 치성강직부가 형성됨을 알 수 있었다.
도 9의 C 및 D에서 보듯이, 실험군은 8주째에, 새로이 형성된 치조골이 재삽입된 치아의 치근 전체를 감싸도록 확장되었고, 새로이 형성된 치주인대 유사조직은 치근 표면과 새로운 골사이에 부분적으로 형성되었으며, 백악모세포 유사세포는 새로운 백악질 유사조직의 표면을 따라 배열되었는데, 새로이 형성된 치주인대 유사조직은 주변의 새로운 골과 새로운 백악질에 삽입되었는데, 상기 치주인대 유사조직은 콜라겐 다발이 밀집된 형태를 나타냄을 확인하였다. 그러나, 대체흡수가 수행된 치성강직부는 극히 일부에서 확인되었다. 특히, 새로이 형성된 치주인대 유사조직은 막대형태의 세포와 미세혈관으로 구성된 것으로 확인되었다. 따라서, 실험군의 경우에는 치조골, 치주인대 및 백악질이 재생됨을 알 수 있었다.
상기 재식후 4주가 경과된 시점에서, 음성대조군 또는 실험군의 치근에 포함된 새로이 형성된 치주인대 유사조직, 대체흡수가 수행된 치성강직부 및 새로이 형성된 백악질의 비율을 산출하였다(도 10).
도 10은 재식후 4주가 경과된 시점에서, 음성대조군 또는 실험군의 치근에 포함된 새로이 형성된 치주인대 유사조직, 대체흡수가 수행된 치성강직부 및 새로이 형성된 백악질의 비율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 10에서 보듯이, 음성대조군의 치근에 비하여 실험군의 치근은 새로이 형성된 치주인대 유사조직 및 백악질은 상대적으로 높은 수준을 나타내지만, 치성강직부는 상대적으로 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.
또한, 상기 재식후 8주가 경과된 시점에서, 음성대조군 또는 실험군의 치근에 포함된 새로이 형성된 치주인대 유사조직, 대체흡수가 수행된 치성강직부 및 새로이 형성된 백악질의 비율을 산출하였다(도 11).
도 11은 재식후 8주가 경과된 시점에서, 음성대조군 또는 실험군의 치근에 포함된 새로이 형성된 치주인대 유사조직, 대체흡수가 수행된 치성강직부 및 새로이 형성된 백악질의 비율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 11에서 보듯이, 음성대조군의 치근에 비하여 실험군의 치근은 새로이 형성된 치주인대 유사조직 및 백악질은 상대적으로 높은 수준을 나타내지만, 치성강직부는 상대적으로 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.
상기 도 10 및 11의 결과를 종합하면, PA-CM은 치근조직에 포함된 치주인대와 백악질의 재생 또는 분화를 촉진시킬 수 있음을 알 수 있었다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

Claims (9)

  1. 법랑모세포의 배양액을 포함하는 치주질환 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 법랑모세포의 배양액은 ABCs(apical bud cells)을 배양하여 수득한 배양상등액인 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 법랑모세포의 배양액은 치주인대 및 백악질의 재생 또는 분화를 촉진시키는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 치주질환이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 치주질환 치료방법
  6. 법랑모세포 배양액을 포함하는 치주인대 및 백악질의 재생 또는 분화촉진용 조성물.
  7. 제6항의 조성물을 포함하는 치주인대 및 백악질의 재생 또는 분화촉진용 키트.
  8. 법랑모세포 배양액을 포함하는 치주인대 분화용 배지 조성물.
  9. 제8항의 치주인대 분화용 배지 조성물에 치주인대 섬유아세포를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 치주인대의 분화방법.
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KR101343460B1 (ko) * 2010-12-13 2013-12-19 서울대학교산학협력단 법랑모세포, 애피컬 버드세포 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 함유하는 경조직 형성 및, 상아질 또는 치수조직 재생용 조성물

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