KR100715186B1 - 제니포사이드를 활성 성분으로 함유하는 구강용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 제니포사이드 또는 제니포사이드를 주성분으로 함유하는 분획물을 활성성분으로 함유하는 구강용 조성물에 관한 것이며, 본 발명의 조성물은 만성 박리성 치은염, 치주염, 미란 또는 궤양을 수반하는 구내염 및 설염, 구취제거의 예방과 치료에 탁월한 효과가 있다

제니포사이드, 구강조성물, 만성박리성 치은염, 치두염, 구내염, 설염,구취제거

Description

제니포사이드를 활성 성분으로 함유하는 구강용 조성물{A composition for mouth comprising geniposide as active ingredient.}

도 1은 치자추출물 1차 분리된 챠트이다

도 2는 도1의 III영역의 2차 분리 챠트이다.

도 3은 분리되어 나온 제니포사이드를 TLC 분석이다.

도 4는 제니포사이드 및 다량의 색소는 제거되고 제니포사이드를 주성분으로 함유한 치자추출물의 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus ), 이콜라 이(E.coli), 및 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilus ) 에 대한 항균실험결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 콜라겐을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 제니포사이드를 활성성분으로 함유하는 구강용 조성물에 관한 것이다.

구강 질환을 유발하는 주원인은 치면세균막(일명 프라그)으로서, 그 중에서 도 치면 세균막에 부착된 세균에 의한 것으로써 soft tissue 와 hard tissue의 염증과 상처를 제거해줘야 하기 때문에 물리적인 시술이 주가 되어야하고 약제를 쓴다면 2차 감염과 부종을 예방하기 위해 항생제를 단기간, 길어야 1주일 정도 투여해 왔으며 그 효과 못지 않게 항생제 내성이나 부작용의 영향도 무시 못하기 때문에 이상적인 치료법은 없는 실정이다.

더구나, 치면세균막을 제거하지 아니한 채 장기간 있게되면 구강내 타액중의 칼슘, 마그네슘 및 인 등의 성분과 결합하여 난용성 염을 형성하여 치아와 유사한 경도를 가진 치석이 형성되는데, 이렇게 형성된 치석은 계속 진행되면서 잇몸과 치아의 경계면을 파고들어 양치시 쉽게 출혈을 유발시키고 또한 구강내 세균에 의한 염증을 유발시켜서 치은염 및 치주질환을 발생시킨다. 치은염의 염증증상으로는 치은의 색깔이 붉어지는 발적증상, 부종 및 출혈 등이 나타날 수 있으며, 치은염이 더 진행되면 치주질환을 유발시키게 된다.

즉, 치은염이나 치주염의 예방을 위해 가장 중요시 여겨지는 부분은 개개인이 구강위생을 통해 규칙적으로 치석을 제거하여 미생물로 인해 야기되는 감염증을 줄이고, 이렇게 하여도 치은염이나 치주염이 발생될 경우 항균제로 치료하는 것이다.

여러 항균제들이 치은, 치주염을 치료하기 위해 개발되고 있지만, 이들 중에서 치석을 조절할 수 있는 약물은 거의 없다.

가능성이 있는 약물들로는 식물의 추출물, 금속염, 페놀 그리고 비스비구아나이드류(bisbiguanides) 등이 있다(Lander, P.E. Newcomb, G. M., Seymour, G. J., Powell, R. N. (1986) The antimacrobial and clinlical effects ofa single subgingival irrigation of chlorohexidine in advanced periodontal lesions, J. clin. periodontal. 13: 74-80) 치주질환의 발생을 예방하기 위한 노력으로 치주질환균을 단시간 노출로 사멸시킬 수 있는 클로로헥시딘 글루코네이트 (chlorohexidine gluconate) , 세틸피리디움 클로라이드(cetylpyridium chloride), 생귀나린(sanguinarine) 및 트리클로산(Triclosan)과 같은 항균제가 개발되어 양치약 및 치약과 같은 구강제품에 적용되어 왔으나, 아직까지도 치은염증의 발생은 근본적으로 예방하지 못하고 있는 실정이다.

치주질환 치료에 쓸 이렇다할 약물이 없었던 가운데 70, 80년대에 테트라사이클린계열이 collagenase를 억제함으로써 잇몸조직의 파괴를 막는다는 것이 발견되었다.

미국특허 제 5,308,895호에는 테트라사이클린(Tetracycline)을 함유하는 약효물질이 지속적으로 송달되는 시스템을 개발하여 치주조직을 분해시키는 콜라게네이즈의 효소활성을 억제함으로서 치주질환을 치료할 수 있다는 것을 제시한 바 있다.

유럽 공개 특허 제 528468 A1 호에는 트리클로산(Triclosan)을 함유하는 치약 및 구강청정제를 개발하여 치은염증 유발물질인 프로스타글란딘의 생성을 억제하여 치주질환을 억제시킬 수 있다는 것을 제시하였다.

치주염의 원인은 치태(플라그)와 세균 감염 등 독성물질과 숙주의 감수성 (immune response)에서 인해 병리적인 MMP(matrix metallo proteinase)의 활성화가 촉진되어 잇몸의 주성분인 콜라겐을 분해하기 때문인데 또한 새로운 개념의 잇몸병 치료제로써 기존 항생제 독시사이클린 용량을 저용량으로 줄여 경구투여시 혈중 MIC에 전혀 못 미치게 투여 하여 항생효과가 전혀 없어 박테리아에는 영향을 주지 않으면서 단지 장기간 투여의 경우에도 내성의 문제 없이 장기간 사용으로 치조골을 부식시키는 골 파괴 세포의 기능도 억제하여 잇몸재생효과를 보기위해 치주질환을 치료하는 연구가 활발이 진행중에 있다.

민간에서 널리 쓰이던 충치 원인균 및 치주질환 원인균에 효과를 나타내는 생귀나리아 추출물(미국 특허 4,689,216 호참조), 세이지 및 미진향 등의 추출물(일본특허 소 58-134013호 참조), 죽염을 함유하는 치약조성물(한국 특허 공고제 94-64 호)등의 약용식물의 추출물이 사용되어 왔다. 또 다른 약물들보다 식물의 추출물인 생약제제들은 화학물질을 사용함으로 인해 발생되는 여러 가지 부작용들, 즉 치아변색, 자극감 및 장시간 사용으로 인한 문제점을 최소화할 수있는 우수한 물질로 평가받고 있고, 치은 출혈이나 부종과 같은 치주질환의 증상이 현저히 개선되었다는 보고가 있다(Yankell, L.L., Dolan, M. M., Emling, R.C.(1988) Efficacy of therapeutic agent against gingivitis and periodontal disease. J. Antibact. Antifung. Agensts 11:451-61). 공개특허 특2001-0096063 또한 생약추출물을 유효성분으로 함유하는 발명은 다음과 같은 기술내용이 공지되어 있다.

국내등록특허공보 특0138247호에 의하면 치주잘환의 예방, 치료 및 충치에방에 효과가 있는 조성물로서 황백 및 형개와 치자엑기스로 이루어진 3종의 생약추출물을 함유하는 구강위생증진용 조성물이 개시되어 있다.

국내 등록특허공보 특014983호에는 초두구, 맥문동, 형개, 목단피 및 치자 추출물을 함유하는 구강위생증진용 조성물이 개시되어 있다.

극내등록특허공보 특0121550호에는 포공영 추출물을 단독으로 함유하거나 또는 금은화 추출물, 황금추출물, 치자 추출물, 백두옹 추출물, 갈근추출물 또는 이들 중 2종이상의 혼합물로부터 선택되는 색물추출물과 포공영 추출물을 함유하는 구강용 조성물에 관한 기술이 공지되어 있다.

일본공개특허공보 소55-120,509호에는 감초추출물을 배합한 것 또는 골취보, 측백당, 지유, 연근, 애엽 등의 생악추출물을 배합한 조성물이 공지되어 있으며, 황백 등에서 추출한 베르베린을 적용한 것이 일본공개특허공보 소57-56,415호에 공지되어 있으며, 식물 추출성분인 후라보노등을 함유한 치약조성물이 일본공개특허공보 87-51,613호 및 월견초 종자유를 함유하는 구강위생조성물이 일본공개특허공보 87-268,613호에 개시되어 있다.

일반적으로 치아 및 그 주변조직에 발생되는 중요한 질병은 충치 및 치주질환으로서 주요 발병원인은 프라그(또는 치태)때문인 것으로 알려져 있다.

이 프라그는 치아 및 치은 등의 표면에 형성된 연한 무정형의 침착물로서 그 주성분은 세균과 세균의 대사 산물이다. 주요 대사 산물로는 독소와 세균이 당류를 대사하여 생성되는 유기산을 들 수 있으며, 이러한 독소는 치아표면에 인접한 주위조직에 위해를 일으켜 치주질환을 일으키며 유기산은 치면을 탈회시켜 충치를 발생 시킨다.

프라그의 주요 원인 세균인 스트렙토코커스 뮤탄트, 포도상 구균인 스태필로코커스 아우레우스균을 억제하고 살균하는 물질로서 페니실린, 에리스로마이신, 테트라사이클린, 스피라마이신과 같은 항생제는 생체내 실험이나 생체외 실험에서 효과적이나 내성균의 출현을 유발하는 등 부작용이 크고, 클로로헥시딘과 같은 항균제는 충치형성을 저해하는 효과가 있으나 구강내의 생태계 파괴, 치아착색 등과 같은 부작용이 있는 것으로 알려져 있으며, 또한 프라그를 직접적으로 분해하는 효소들도 사용되어 왔으나 저장중에 효소 활성이 저하하는 등의 안정성 문제가 완전히 해결되지 않고 있는 실정이다.

근래에 들어 이와 같은 문제점을 해결하기 위해 다양한 종의 식물로부터 추출한 물질을 대상으로 많은 연구가 수행되고 있는 추세에 있다.

현대 생명공학의 발달은 20세기 조직이식에서 21세기 조직공학 시대의 문을 열어가고 있다. 신체 장기 일부 질환으로 장기의 결손을 조직공학으로 대치하게 된 것이다. 이 중 가장 임상접근도가 높아 이미 상품화 과정에 있는 것이 피부조직이다. 피부와 유사한 조직학적 형태를 가진 구강조직도 결손 부위를 대치할 조직 공학적 연구가 시도되고 있다. 구강조직의 발생기형으로 인한 결손이나 구강질환으로 인한 외과적 절제로 결손이 생겼을 때 어깨, 팔, 넙적다리 등에서 피부조직을 절제하여 이식을 해주게 된다. 이때 구강뿐 아니라 신체 여러 부위의 결손 및 심한 상처를 남기게 된다.

실험실에서 진피로 이용되는 제 1 형 콜라겐은 더 나아가 화상등의 상처가 있는 피부조직의 재생과도 밀접한 관계가 있으며 또한 치주조직의 재생에 대한 연구는 치주 치료의 궁극적인 목적은 치주 질환에 의하여 상실된 치주 조직의 재생에 있다.

또한 치주질환은 치태내 치주병원균에 의해 생기는 감염성 질환으로 치주조직을 파괴시켜 결국 치아를 상실하게 만든다. 이러한 치주질환을 위한 치주치료로는 크게 resective therapy와 regenerative therapy가 있고 전자에는 치은절제술, 삭제형 치조골외과술, root resection등이 있고 후자에는 치근 활택술, 연조직소파술, 치은박리소파술, 골대체물질 이식술식, GTR 그리고 root conditioning, growth factor를 이용한 술식이 있다. 치주치료의 궁극적인 목적은 치주질환에 의하여 상실된 치주조직의 재생에 있다.

치주조직재생은 치주질환에 의해 상실된 부위에 신부착과 신생골, 신생백악질과 새로운 치주인대섬유가 형성된 치유형태를 말한다.

Melcher등은 1976년 치주수술후 치유부위 치유 양상에는 치은 상피세포, 치은 섬유아 세포, 치조골세포, 치주인대세포의 4가지 종류의 세포들이 관여하며, 치유부위로 먼저 이주된 세포의 성상에 의하여 치유 형태가 결정 된다고 주장 하였다. 여러 연구들을 통해 치주인대세포가 신생 백악질과 신생 결체조직 부착을 형성할수 있는 능력을 갖고 있으며, 치근면에 재접착하여 기능적으로 배열된 교원섬유들을 형성할수 있는 것으로 확인되었다.

본 연구자는 동물 실험을 통해 치자 추출물이 hemostasis와 wound healing에 우수한 효과가 있음을 입증했었다.(특허 출원 2004-0083598)

본 연구자는 치자의 열매가 지혈, 항균 및 진정작용이 있어 한방에서는 구내염을 포함한 각종 염증 및 염증에 의한 출혈등에 사용되고 있는 것에 착안하여 치자추출물에 항염 효과가 있는 세린 프로테아제 억제제 성분을 분리 정제하고 치주조직을 분해시키는 MMPs 중 콜라게네이즈의 효소활성을 억제하며 그람 양성균이면서 포도상 구균인 스태필로코커스 아우레우스, 바실러스 서브틸루스, 그람 음성균인 대장균의 항균력을 갖는 천연 항생제로써 부작용이 없으면서 각종치주 질환 치료 및 예방효과가 있는 사실을 발견하였으며, 이 성분이 공지의 화합물인 다음의 구조식을 가지는 7-하이드록시메틸-1-(3,4,5-트리하이드록시-6-하이드록시메틸-테트라하이드로-핀란-2-일옥시)-1,4a,5,5a-테트라하이드로-사이클로펜타[c]-피란-4-카르복실산메틸에스테르(7-Hydroxymethyl-1-(3,4,5-trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yloxy)-1,4a,5,7a-tetrahydro-cyclopenta[c]pyran-4-carboxylic acid methyl ester) :일반명:제니포사이드)임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들이 분리 정제한 치자 추출물은 제니포사이드로써 제니포사이드를 지표물질 및 주성분으로 한 치자추출물의 구강 용품 개발에 있다. 이물질은 친수성이 강한 물질이며, 열에 안정한 것으로 판명되어 세정이 용이하고 인체에 부작용이 없으며 장기간 실온 저장 및 안정성에 탁월한 효과를 나타내었다.

부작용이 없는 천연물질 유래의 제니포사이드 및 이 제니포사이드를 주성분으로 하는 치자의 분획물이 조직파괴 효소 MMP 억제능, trypsin 억제능, 항균능의 실험 연구 결과를 바탕으로 항염, 항균, 잇몸질환의 파괴억제 및 재생에 탁월한 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성한 것이다.

지금까지는 제니포사이드를 활성성분으로 함유하는 치주염, 미란 또는 궤양을 수반하는 구내염, 설염, 구취제거 등의 예방 및 치료용 조성물은 개발된 바 없다.

옛부터 치아는 오복중의 하나로 꼽아 왔으며, 치아 못지않게 중요한 것이 치아를 감싸고 받쳐주는 잇몸이다. 잇몸질환중에서 치주염은 치태 또는 치주낭에 존 재하는 혐기성 세균들이 원인이 되어 일어나는 감염성 질환이므로 이러한 세균들의 제거는 치주염 예방 및 치료의 기본이 된다.

치자의 열매가 지혈, 항균 및 진정작용이 있어 한방에서는 구내염을 포함한 각종 염증 및 염증에 의한 출혈등에 사용되고 있는 것에 착안하여 염증유래세린프로테아제 억제능 및 세균에 감수성이 크고 치면의 칼슘에 흡착되므로 지속적인 항균작용을 나타낼 수 있으며, 치주낭 형성에 관여하는 조직파괴효소 MMPs중 콜라게나제(collagenase)의 활성을 저해하는 천연물 유래 물질로써 타 항생제가 장기간 사용시 문제가 되는 부작용의 문제를 해결한 치주염의 예방 및 치료에 대한 효능과 실효성이 있는 구강용품을 개발하고자 한다.

따라서, 본 발명에서는 이와 같은 효능을 갖는 세린프로테아제 인히비터 성분을 분리한 치자 추출물을 이용하여 치은염, 치주염을 예방 및 치료할 수 있는 구강용 조성물을 만드는데, 제니포사이드물질을 지표성분으로 하여 항균효과를 발휘할 수 있는 양으로 구강용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 치은염, 구내염, 치주염 관련 치자의 열매가 지혈, 항균 및 진정작용이 있어 한방에서는 구내염을 포함한 각종 염증 및 염증에 의한 출혈등에 사용되고 있는 것에 착안하여 치자추출물에 항염 효과가 있는 세린프로테아제 인히비터 성분을 분리 정제하여 치주조직을 분해 시키는 콜라게네이즈의 효소활성을 억제함으로서 각종치주 질환 치료 및 예방효과가 있는 치자 정제물을 핵심성분으로 이용하여 치은염, 구내염 및 치주염을 예방 및 치료할 수 있는 구강 조성물을 제조하는데 있다.

본 발명은 염증유발 세린 프로테아제 억제능과 조직파괴효소 MMPs 활성억제능 및 항균능이 있는 제니포사이드 및 이 제니포사이드를 지표성분으로 하는 치자 추출물을 주로 함유하는 분획물이 만성 박리성 치은염, 치주염, 미란 또는 궤양을 수반하는 구내염 및 설염, 구취제거를 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 부작용 없는 천연물 유래의 구강용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 치자는 치자나무(Gardenia jasminoides for grandiflora Makino) 또는 동속식물의 성숙한 과일의 추출물을에서 단리한 제니포사이드, 또는 타 식물들로부터 분리한 제니포사이드, 또는 제니포사이드 함유 식물의 추출물에서 분획하여 제니포사이드를 주성분으로 함유하는 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 염증 유발 세린 프로테아제 인히비터와 조직파괴효소 MMPs 활성억제능 및 항균능이 있는 제니포사이드를 주성분으로 함유하는 치자 추출물의 분획물과 분리정제한 제니포사이드는 통상의 약제학적으로 허용되는 부형제나 보조제와 함께 약제학적으로 허용되는 외용제의 제제형태 제형화하여 가글링 및 치약형태로 사용하여 각종 치아 질환의 치료 및 예방효과를 기대 할 수 있다．

또한, 본 발명에 따른 조성물은 향료 성분으로서, 멘톨, 페퍼민트, 스피아민트, 후레쉬민트, 또는 이들의 조합에서 선택된 물질을 함유한다.

본 발명에 사용되는 습윤제는 타제제들과 상용성이 좋고 특유의 자극적인 냄새가 없는 것들이어야 하며, 프로필렌 글리콜, 글리세린, 솔비톨, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 마니톨, 자이리톨 또는 이들의 조합을 사용한다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 계면활성제로서 알파-올레핀 설포네이트(α-OLEFFIN SULFONATE), 소디움 도데실 설페이트(SODIUM DODECYL SULFATE), 소디움 도데실 벤젠 설포네이트(SODIUM DODECYL BENZENE SULFONATE), 폴리옥시 에틸렌 알킬 아릴 에테르(POLYOXYETHYLENE ALKYL ARYL ETHER), 탄소수 11-13를 갖고 EO 5-20몰을 갖는 2차-알코올 에톡실레이트(SECONDARY-ALCOHOL ETHOXYLATE), 탄소수 8-14를 갖고 EO 5-20몰을 갖는 1차-알코올 에톡실레이트(PRIMARY-ALCOHOL ETHOXYLATE), 폴리옥시 에틸렌 알킬 아릴 에테르(POLYOXYETHYLENE ALKYL ARYL ETHER)(여기에서 ALKYL기는 탄소수 8-12를 갖는 직쇠 사슬을 표시하며, ARYL기는 탄소수 6-12의 방향족기를 나타냄), 소디움 디옥틸 설포석시네이트(SODIUM DIOCTYL SULFOSUCCINATE)(상품명 AEROSOL OT 또는 CR-DOC70), 트윈류(TWEEN), 소르비탄 모노 올리에이트(SORBITAN MONO OLEATE(SPAN 80)), 소르비탄 모노라우레이트(SORBITAN MONO LAURATE(SPAN 20)), 글리세린 모노올리에이트(GLYCERIN MONO OLEATE(GMO)), 글리세린 모노 라우레이트(GLYCERIN MONO LAURATE(GML)) 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용하였다.

다음에 실시예 및 실험예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1

치자로부터 제니포사이드 분리정제

1) 건조된 치자 분말 1kg을 증류수 8L 30% 에탄올에 넣고 3일간 상온에서 추출한다.

2) 추출후에 여과하여 추출물을 얻는다. 이 과정은 6회정도 반복하여 잔량의 제니포사이드 함유물질을 추출한다.

3) 추출액을 v/v 동량 초산에틸(ethylacetate)과 분리펀넬(separate funnel)에 방치하여 초산에틸(ethylacetate) 층의 물질을 수득하여 상당량의 치자 색소를 제거한다. 10회 정도 반복하여 잔량의 제니포사이드함유 물질을 얻어낸다,

4) 다량의 색소는 제거되었으면서 제니포사이드함량이 많은 초산에틸(ethylacetate) 층의 수득물을 증류하여 초산에틸을 제거한다. 이때 초산에틸(ethylacetate)위주로 저온에서 농축시키고 에탄올은 날려 보내지 않는 것이 더욱 많은 색소를 제거하는 관건이다.

5) 농축된 성분을 물로 10배 희석한다.

6) 희석된 성분을 6000rpm 30분간 원심분리(centrifuge)하면 다량의 색소가 침전물 로써 가라앉는다.

7) 가라앉은 침전물은 제거하고 상등액(supernatant)을 얻어낸다. 이 물질을 분석해보면 다량의 색소는 제거했으면서 제니포사이드는 풍부한 치자추출물이 된다.(제니포사이드분획물)

8)이 물질에서 더욱더 많은 색소와 여타의 다른 성분을 제거한 제니포사이드 단일 제제를 얻기 위하여 prep용 HPLC를 수행한다.

이렇게 하여 제니포사이드가 주성분인 분획물 및 순수한 제니포사이드를 얻는다. 그 결과는 다음의 표 1 및 도 1, 2 및 3에 나타내었다.

표 1. Prep용 HPLC(reverse C8column)을 사용한 치자추출물중 제니포사이드의 분리

시간(분)	0	15	30	35	40	45
A(%), 5ml/min	0	50	100	100	100	0
(%), 5ml/min	100	50	0	0	0	100

* 조건: 전개용매 A: 메탄올: 물(3:1)/0.1% TFA

전개용매 B : 물/0.1% TFA

도 1 및 2는 제조용(preparative) HPLC를 이용한 제니포사이드 분리과정이며, 도 1은 치자추출물 1차 분리된 챠트이며,

도 2는 도 1의 III영역의 2차분리 챠트이다.

도 3은 분리되어 나온 제니포사이드의 TLC 분석이며, 단일제제임을 확인한 실험이다.

실시예 2

실시예 1에서 건조된 치자분말 1kg을 중류수 8L 30% 메탄올을 넣고 추출한 것을 제외하고는 실시예 1과 같은 공정을 행하여 제니포사이드 및 제니포사이드를 주성분으로 함유하는 분획을 얻었다.

실시예 3

실시예 1에서 건조된 치자분말 1kg을 중류수 8L 30% 부탄올을 넣고 추출한 것을 제외하고는 실시예 1과 같은 공정을 행하여 제니포사이드 및 제니포사이드를 주성분으로 함유하는 분획을 얻었다.

실험예 1

스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus ), 이콜라이(E.coli ), 및 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilus ) 의 균주들을 각각 LB배지에 접종하여 2일간 배양한 후, 초기 600nm OD값을 0.4~0.5의 범위 농도로 희석하여 잘 멸균된 1ml cuvette에 500㎕와 각종농도의 제니포사이드 500㎕를 넣어 시간에 따라 배양하여 OD600nm로써 생장능을 측정하였다.

그 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4는 제니포사이드 및 다량의 색소는 제거되고 제니포사이드를 주성분으로 함유한 여러 가지 치자추출물농도 (E100,200,225,250,275,300,400,500)와 분리정제된 제니포사이드(E29)의 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus ), 이콜라이(E.coli ), 및 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilus ) 에 대한 항균실험결과를 나타낸 그래프이다.

실험예 2

염증유발 세린프로테아제 억제능 실험

1) 트립신 효소 용액(trypsin enzyme solution)은 sigma T8253제품을 10mg을 0.1M Tris 50ml에 녹여 stock으로 만든 후 효소용액(enzyme solution) 100㎕와 0.1M Tris 50㎕, 치자추출물 50㎕를 25℃ 5분간 전배양(pre-incubation)한다.

2) BAPNA기질을 동사의 제품으로 사용하여 10mg을 0.1M Tris 1ml에 녹여 20배 stock으로 만들어 놓은 후 사용시 즉각 1배로 희석하여 희석한 용액을 20㎕ 위 1)번 용액에 반응 시킨 후 OD405nm에서 kinetic을 수행하여 control과 비교하여 억제능을 관찰하였다.

그 결과는 다음의 표 2에 나타내었다.

표 2. 제니포사이드 및 제니포사이즈를 주성분으로 함유하는 분획의 세린프로테아제 억제능의 실험결과

실험예 3

조직파괴효소 MMPs중 콜라게네이트 억제능에 관한 실험

치자 추출물을 세린 프로테아제 IC50 값의 10배, 100배로 희석한 후 피부세포층중 진피세포의 대부분의 차지하는 fibroblast cell에 처리하였다. 본 실험에서 CJ 10-2, 10-3, 10-4이라고 농도를 표현한 이유는 치자를 추출하고 색소를 제거하여 제니포사이드를 주성분으로 함유한 분획의 동결 건조한 고체성분의 세린 프로테아제 IC50은 10-2로 희석했을 때였다. IC50의 10배 100배로 희석한 값이 10-3, 10-4 로 표현한 것이다. 즉 IC50값의 10배, 100배 희석한 농도에서 그 collagen 농도가 아무것도 처리하지 않은 세포에 존재하는 collagen 농도보다 높은 값을 얻게 되었다.

실험과정:

Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit 의 사용(Cat.#MK101 from TAKARA BIO INC.)

1) 사용된 세포(cell)는 정상인 인간 피블로블라스트(normal human fibroblast)로써 배양액은 DMEM with 10% FBS에서 충분히 키운 후 6well plate에 1x105개 cells/well을 심는다.

2) cell을 80%이상 융합(confluent)할 때까지 5% CO2 배양기(incubator), 37℃에서 키운 후 (통상 2일-3일정도 키움), 흡인여과기(aspirator)로 배양액을 제거한다.

3) 시험 물질을 독성이 없는 농도인 IC50 값을 기준으로 10배, 100배로 희석하여 처리한다. 시험물질은 본 발명의 치자 추출물(MMP 인히비터)로써 IC50값, IC50값의 1/10, IC50값의 1/100 농도이며, 이때 시험물질 처리시 FBS는 첨가하지 않고 DMEM 1ml에 여러 가지 농도를 처리하여 피부 세포에 처리한다.

4) 1일 후 세포 상등액(cell supernatant)을 걷어내어 콜라겐 분석(collagen assay)을 실시한다.

5) 콜라겐 분석 키트( collagen assay kit)에 내장되어 있는 sample diluent로 10-2x (IC50값), 10-3x(IC50값의 1/10), 10-4x(IC50값의 1/100)로 sample 처리 농도를 만들어 놓는다.

6) standard의 농도는 0. 40, 80, 160 ng/m로 만들어 놓는다.

7) sample과 standard 100㎕를 monoclonal anti-procollagen type IC peptide(PIP) antibody가 coating된 96well plate에 넣어 2시간동안 37℃에서 incubation시킨다. sample과 standard solution은 5분 내에 반응시킨다.

8) 반응 후 PBS 400㎕로 3번 충분히 washing을 한다.

9) horseradish peroxidase (POD)가 conjugate된 monoclonal antibody 100㎕를 각 well에 1시간동안 37℃에서 incubation시킨다.

10) 반응 후 PBS 400㎕로 4번 충분히 washing을 한다.

11) substrate (hydrogen peroxide와 tetramethylbenzidine)가 들어있는 solution 100㎕를 15분간 실온에서 반응시킨다.

12) Stop solution 1N 황산 100㎕를 넣어 잘 섞어 준다.

13) 450nm에서 OD를 읽는다.

그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 콜라겐을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.프로콜라겐 타입 I C-펩타이드 EIA Kit로 더욱 미세하게 콜라겐량을 측정한 결과 치자 추출물의 IC50값부터 IC50값의 1/10, IC50값의 1/100의 농도를 피부세포에 처리한 것이 무처리군의 피부세포의 콘트롤 레벨 콜라겐량 보다 높게 나타났으며, 이때, 세포 상태는 모두 건강하였다. data에는 나타나 있지 않지만 IC50값보다 높은 농도로 처리한 cell은 모두 죽었다.

이상의 실험결과로부터 본 발명의 조성물은 콜라겐의 생성 효과가 아무것도 처리하지 않은 군보다 높게 나타나 조직파괴효소 MMPs 중 콜라게네이즈억제 효과가 있는 것으로 확인된다.

[Collagen- Ab ] complex assay

Test sample

이상의 실험결과로서 본 발명의 제니포사이드 및 제니포사이드를 주성분으로 함유하는 분획물은 만성 박리성 치은염, 치주염, 미란 또는 궤양을 수반하는 구내염, 설염 및 구취제거의 예방과 치료에 사용될 수 있다.

다음에 제제실시예로 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.(별도의 지시가 없는 한 단위는 중량%이다.)

제제실시예 1

구강청정제

에탄올(90%) 20.0

글리세린(98%) 10.0

폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 공중합체 1.0

제니포사이드 0.01

사카린 나트륨 0.1

레몬 에센스 0.5

정제수 가하여 전체 100.0

실시예 2

의치 세정제

주석산 2.5

탄산수소나트륨 2.5

라우릴황산나트륨 1.0

염화벤잘코니윰 2.0

EDTA 나트륨 5.0

트리폴리인산나트륨 15.0

폴리에틸렌글리콜 2.0

제니포사이드 분획물 0.2

향료 적량

증류수를 가하여 전체 100.0

실시예 3

치약 조성물

탄산 일수소칼슘 40.0

함수알루미나 5.0

2산화티나늄 1.0

제니포사이드 0.1

솔비톨액 30.0

알킬황산나트륨 1.0

사카린 나트륨 0.1

파라옥시안식향산 에틸 0.1

소디움 CMC 1.0

증류수를 가하여 전체 100.0

통상의 치약 조성물의 제조방법으로 제조한다.

실시예 4

껌 베이스 37.5

솔비톨 37.0

제니포사이드 0.5

만니톨 10.0

자일리톨 5.0

글리세린 10.0

레시틴 0.5

이성화당 4.5

향료 적량

통상의 츄잉검의 제조방법으로 제조한다.

이상에서 언급한 바와 같이, 천연물 유래 치자 추출물에서 제니포사이드를 분리정제한 물질과 제니포사이드를 지표성분으로 한 염증 유발 세린프로테아제 억제능으로 인한 구강내 상처치유 효과의 항염 작용과 조직파괴효소 MMP 억제능의 치은염, 치주염 치료에 도움이 되는 콜라겐 생성을 촉진함으로써 각종 구강 질환의 예방 및 치료효과, 치료 보조효과를 기대함과 동시에 그람네가티브 및 그람포지티브한 균에 대한 항균 효과로써 천연 항생제 및 천연 방부제의 역할로써 가글링 제품, 검, 및 치약, 잇몸질환 치료제로써의 상품을 기대할 수 있다.

즉, 구강용 조성물은 세린 프로테아제 인히비션(serine protease inhibition) 역가로써 만성 박리성 치은염, 치주염, 미란 또는 궤양을 수반하는 구내염 및 설염을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있으며, 잇몸의 염증을 감소시켜 줄 뿐만 아니라 잇몸을 튼튼하게 하여 주어 세균 감염으로부터 저항할 수 있는 힘도 길러준다. 또한 입안의 악취발생 방지효과와 발생된 입냄새를 제거하고입안의 상처를 치료하는 효과를 동시에 제공한다.

그러므로, 본 발명에 따른 구강 조성물을 사용하여 양치질을 할 경우, 기존의 잇몸 질환 구강용 조성물과는 달리, 치아입냄새 제거, 치주염 예방 및 치료, 약

한 잇몸을 건강하게 하는 효과, 입안의 상처 치료효과 등을 동시에 얻을 수 있다.

Claims (6)

1. 7-하이드록시메틸-1-(3,4,5-트리하이드록시-6-하이드록시메틸-테트라하이드로-핀란-2-일옥시)-1,4a,5,5a-테트라하이드로-사이클로펜타[c]-피란-4-카르복실산메틸에스테르(7-Hydroxymethyl-1-(3,4,5-trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yloxy)-1,4a,5,7a-tetrahydro-cyclopenta[c]pyran-4-carboxylicacid methyl ester) :일반명:제니포사이드) 또는 제니포사이드를 주성분으로 함유하는 분획물을 활성성분으로 함유하는 만성박리성 치은염, 치주염, 미란 또는 궤양을 수반하는 구내염, 설염 및 구취제거의 예방과 치료용 조성물.
2. 치자를 물과 탄소수 1-4의 저급알칸올의 혼합용매로 추출한 다음, 이 추출액을 초산에틸로 추출하고, 방치하여 초산에틸층을 분리한 다음, 초산에틸을 증류하여 얻어진 농축액에 물을 가하고 침전된 침전물을 제거한 용액을 농축시켜서 얻어진 제니포사이드를 주성분으로 함유하는 분획물.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물이 구강청정제인 조성물.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물이 치약인 조성물.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물이 의치 세정제인 조성물.
6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물이 츄잉검인 조성물.

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