WO2016136910A1 - 改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド - Google Patents

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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Definitions

  • the present invention relates to a modified Fab region-binding peptide that binds to the Fab region of IgG and dissociates from the Fab region under milder acidic conditions, an affinity separation matrix having the modified Fab region-binding peptide as a ligand,
  • the present invention relates to a method for producing a Fab region-containing protein using an affinity separation matrix, a DNA encoding the modified Fab region-binding peptide, a vector containing the DNA, and a transformant transformed with the vector.
  • SpA protein A affinity separation matrix
  • Monoclonal antibodies are basically developed as antibody drugs and are produced in large quantities using recombinant cultured cell technology.
  • “Monoclonal antibody” refers to an antibody obtained from a clone derived from a single antibody-producing cell.
  • Most antibody drugs currently on the market are immunoglobulin G (IgG) subclass in terms of molecular structure.
  • antibody drugs comprising antibody derivatives (fragment antibodies) having a molecular structure obtained by fragmenting immunoglobulin have been actively developed, and a plurality of antibody drugs comprising immunoglobulin Fab fragments have been marketed (Non-patent Document 3). ).
  • SpA affinity separation matrix is used for the initial purification step in the antibody drug manufacturing process.
  • SpA is basically a protein that specifically binds to the Fc region of IgG. Therefore, a fragment antibody that does not contain an Fc region cannot be captured using the SpA affinity separation matrix. Therefore, there is a high industrial need for an affinity separation matrix capable of capturing a fragment antibody that does not contain an IgG Fc region from the viewpoint of platformization of an antibody drug purification process.
  • Non-Patent Document 4 A plurality of proteins that bind to other than the Fc region of IgG are already known (Non-Patent Document 4). However, there is no fact that an affinity separation matrix using such a protein as a ligand, as with the SpA affinity separation matrix, is standardly used for industrial purification of antibody drugs.
  • SpG protein G
  • IgG IgG
  • SpG affinity separation matrix product immobilized with SpG as a ligand manufactured by GE Healthcare, product name “Protein-G-Sepharosepha4 Fast Flow”, Patent Document 1). It is known that SpG binds strongly to the Fc region of IgG, but binds to the Fab region even though it is weak (Non-patent Documents 4 and 5).
  • ligands used in such affinity separation matrix products need not only have strong binding to the partner molecule, but also have to dissociate under appropriate conditions so that the partner molecule adsorbed on the matrix can be recovered. is there. Binding between proteins such as SpG and IgGs dissociates under acidic conditions. The interaction between SpG and Fab is surely dissociated at a lower pH, but if the pH is low, the Fab is damaged such as chemical modification or cleavage, so it is preferable to dissociate at a pH as close to neutral as possible.
  • affinity separation matrices for purifying immunoglobulins or fragments thereof have been developed.
  • a neutral solution and an affinity separation matrix are typically contacted to selectively adsorb the immunoglobulin or fragment thereof and wash to remove impurities.
  • the adsorbed immunoglobulin or fragment thereof is then eluted with an acidic eluate.
  • the target compound, immunoglobulin or a fragment thereof may be damaged.
  • the present inventor has found that the Fab binding power of wild-type protein G (SpG) is weaker than the Fc binding power, and it is necessary to enhance the Fab binding power as a ligand of the affinity separation matrix. (Patent Document 2).
  • the pH at which Fab dissociates may be shifted to a stronger acidic side, that is, the acid dissociation pH value may be lower than before mutation introduction. Also turned out.
  • the present invention provides a modified Fab region-binding peptide capable of releasing the Fab region-containing protein with an acidic eluate having a relatively high pH while exhibiting excellent selective adsorption ability for the Fab region of IgG.
  • the purpose is to do.
  • the present invention also includes an affinity separation matrix having the modified Fab region-binding peptide as a ligand, a method for producing a Fab region-containing protein using the affinity separation matrix, a DNA encoding the modified Fab region-binding peptide, Another object is to provide a vector containing DNA and a transformant transformed with the vector.
  • the inventor molecularly designed a variant of the IgG binding domain of SpG, and obtained and obtained the variant from a transformed cell using a protein engineering technique and a genetic engineering technique.
  • a study was conducted to compare the characteristics of the mutants. As a result, it was found that the above problem can be solved by introducing a specific mutation into the IgG binding domain of SpG, and the present invention was completed.
  • the present inventor has identified a site that can influence the acid dissociation pH without greatly impairing the Fab binding force by using the following molecular computational chemistry technique.
  • the crystal structure of the complex of the IgG binding domain of SpG and the Fab region of IgG (Derrick J.P., Wigley DB, J. Mol. Biol., 1994, 243, 906-918) ) was obtained from PDB (Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do, PDB code of the coordinates: 1IGC) and selected as model coordinates for molecular modeling.
  • PDB Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do, PDB code of the coordinates: 1IGC
  • the IgG binding domain in the crystal structure is ⁇ 1 of SpG.
  • positions 17 and 36 of the IgG binding domain of SpG are suitable as mutation sites.
  • the 17th position is located away from the interaction interface of Fab with CH1.
  • the mutation to position 17 may change the stability of the protein complex to the extent that the Fab binding ability is not significantly impaired by the solvent conditions.
  • the 36th position is located at the interface of Fab with CL.
  • the mutation to position 36 is a protein that does not significantly impair the Fab binding force depending on the solvent conditions. The possibility of changing the stability of the complex was suggested.
  • amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 5 it has an amino acid sequence in which one or more amino acid residues selected from the group consisting of positions 17 and 36 are substituted, and A Fab region-binding peptide whose acid dissociation pH is shifted to the neutral side compared to before introduction of substitution; (2) In the amino acid sequence defined in (1) above, an amino acid sequence in which one or several amino acids are further deleted, substituted and / or added in the region excluding the 17th and 36th positions.
  • the one or more substituted amino acid residues selected from the group consisting of positions 17 and 36 in the amino acid sequence defined in (1) above are further mutated in (3) Not)
  • the mutation sites are the sixth, seventh, tenth, thirteenth, fifteenth, eighteenth, nineteenth, 21st, 24th, 28th, 29th, 30th, 31st, 33rd, 35th, 37th, 39th, 40th, 42nd and 47th
  • the modified Fab region binding peptide according to any one of the above [1] to [4], which is one or more sites selected from the group consisting of:
  • a modified Fab region-binding peptide multimer comprising a plurality of domains obtained by linking two or more modified Fab region-binding peptides according to any one of [1] to [6] above.
  • the modified Fab region-binding peptide according to any one of [1] to [6] or the modified Fab region-binding peptide multimer according to [7] is immobilized on a water-insoluble carrier as a ligand.
  • An affinity separation matrix characterized by the above.
  • a method for producing a protein containing a Fab region Contacting the affinity separation matrix according to the above [8] with a liquid sample containing a protein containing a Fab region, and separating the protein containing a Fab region bound to the affinity separation matrix from the affinity separation matrix.
  • the affinity separation matrix obtained by immobilizing the modified Fab region-binding peptide obtained by the present invention on an insoluble carrier exhibits excellent selective adsorption ability for Fab region-containing proteins. On the other hand, they exhibit mutually contradictory properties such as excellent acid dissociation properties.
  • excellent acid dissociation property means an elution peak profile when the Fab region-containing protein is dissociated under a more neutral acidic elution condition and the Fab region-containing protein is eluted under an acidic condition. Indicates a characteristic that is sharper. By making the elution peak of chromatography sharper, it is possible to recover a higher concentration of antibody-containing eluate with a smaller volume of eluate.
  • FIG. 1 shows GB1 # -Cont. It is a figure which shows the preparation methods of the expression plasmid of 1d (sequence number 1).
  • FIG. 2 is a chart of affinity chromatography when various SpG- ⁇ 1 # mutants are added to an aTNF-Fab-immobilized carrier and eluted with a pH gradient.
  • the modified Fab region-binding peptide according to the present invention is one of the following (1) to (3).
  • Modified Fab region binding peptide (1) In the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 5, one or more amino acid residues selected from the group consisting of positions 17 and 36 are substituted A Fab region-binding peptide having an amino acid sequence and whose acid dissociation pH is shifted to the neutral side compared to before introduction of substitution;
  • Modified Fab region-binding peptide (2) In the amino acid sequence defined in (1) above, one or several amino acids in the region excluding the 17th and 36th positions are further deleted, substituted and / or Or a Fab region-binding peptide having an added amino acid sequence, the acid dissociation pH of which is shifted to the neutral side compared to that before mutagenesis;
  • Modified Fab region binding peptide (3) It has an amino acid sequence having 80% or more sequence identity to the amino acid sequence defined in (1) above, and its acid dissociation pH is before mutagenesis.
  • Immunoglobulin is a glycoprotein produced by B cells of lymphocytes and has a function of recognizing and binding molecules such as specific proteins.
  • An immunoglobulin has a function of specifically binding to a specific molecule called an antigen, and a function of detoxifying and removing a factor having an antigen in cooperation with other biomolecules and cells.
  • Immunoglobulin is generally called “antibody”, which is a name that focuses on such a function. All immunoglobulins basically have the same molecular structure, and each has a basic structure of a four-chain “Y” -shaped structure composed of two light chain and heavy chain polypeptides.
  • Immunoglobulin G is a monomeric immunoglobulin and is composed of two heavy chains ( ⁇ chains) and two light chains, and has two antigen-binding sites.
  • the place corresponding to the vertical bar of the lower half of the “Y” of immunoglobulin is called the Fc region, and the “V” of the upper half is called the Fab region.
  • the Fc region has an effector function that induces a reaction after the antibody binds to the antigen, and the Fab region has a function of binding to the antigen.
  • the heavy chain Fab region and the Fc region are connected by a hinge part, and the proteolytic enzyme papain contained in papaya decomposes this hinge part and cleaves it into two Fab regions and one Fc region.
  • the domain near the tip of the “Y” is called a variable region (V region) because various changes in the amino acid sequence are seen so that it can bind to various antigens.
  • the variable region of the light chain is called the VL region, and the variable region of the heavy chain is called the VH region.
  • the Fab region and the Fc region other than the V region are regions with relatively little change, and are called constant regions (C regions).
  • the constant region of the light chain is referred to as the CL region
  • the constant region of the heavy chain is referred to as the CH region.
  • the CH region is further divided into three, CH1 to CH3.
  • the heavy chain Fab region consists of a VH region and CH1, and the heavy chain Fc region consists of CH2 and CH3.
  • the hinge part is located between CH1 and CH2.
  • the binding of SpG- ⁇ to IgG is more specifically the binding of IgG to the CH1 region (CH1 ⁇ ) and CL region, and the binding to CH1 is the main (Non-patent Document 5).
  • the modified Fab region-binding peptide according to the present invention binds to the Fab region of an immunoglobulin.
  • the Fab region-containing protein to which the peptide of the present invention is to be bound is not particularly limited as long as it contains the Fab region, and may be an immunoglobulin molecule containing the Fab region and the Fc region without deficiency. It may be a derivative.
  • the immunoglobulin molecule derivative to which the modified Fab region-binding peptide according to the present invention binds is not particularly limited as long as it is a derivative having a Fab region.
  • a Fab fragment fragmented only in the Fab region of immunoglobulin G a chimeric immunoglobulin G in which a partial domain of human immunoglobulin G is replaced with a domain of immunoglobulin G of another species, and an Fc region Immunoglobulin G obtained by molecular modification of the sugar chain, Fab fragment covalently bound with a drug, and the like.
  • peptide includes all molecules having a polypeptide structure, and includes not only so-called proteins, but also fragments and those in which other peptides are linked by peptide bonds. Shall be.
  • a “domain” is a unit of protein conformation, consisting of a sequence of tens to hundreds of amino acid residues, sufficient to express some physicochemical or biochemical function.
  • a “variant” of a protein or peptide refers to a protein or peptide in which at least one substitution, addition or deletion is introduced at the amino acid level with respect to the sequence of a wild-type protein or peptide.
  • the amino acid of a wild type or a non-mutation type is attached
  • the mutated amino acid is attached
  • T17V a mutation that replaces Thr at position 17 with Val
  • Protein G is a protein derived from the cell wall of Group G Streptococcus sp. SpG has the ability to bind to most mammalian immunoglobulin G (IgG) and binds strongly to the Fc region of IgG and also weakly binds to the Fab region of IgG.
  • IgG immunoglobulin G
  • the functional domain showing SpG IgG binding is called ⁇ domain (SpG- ⁇ ).
  • ⁇ domain The functional domain showing SpG IgG binding
  • B domain The functional domain showing SpG IgG binding
  • C domain The functional domain showing SpG IgG binding
  • Fahnestock et al. J. Bacteriol., 1986167, 870-.
  • the amino acid sequence defined in the modified Fab region binding peptide (1) is basically an amino acid sequence having a structure / function as SpG- ⁇ .
  • an SpG- ⁇ variant having an improved Fab binding force is preferable.
  • an SpG- ⁇ variant having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 5 Further variants of are preferred.
  • the amino acid of the SpG- ⁇ variant shown in SEQ ID NO: 2 with improved Fab binding ability An arrangement is preferred.
  • the present invention can also be applied to wild-type SpG- ⁇ .
  • a group It is preferably an amino acid sequence of ⁇ 1 domain (SpG- ⁇ 1, SEQ ID NO: 3) or ⁇ 2 domain (SpG- ⁇ 2, SEQ ID NO: 4) derived from G strain GX7809.
  • One preferred form of the present invention is, for example, an amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) described in a known patent document (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-88381) as a mutant SpG- ⁇ having excellent thermal stability. It is done.
  • the amino acid sequence corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (C36 peptide) of JP-A-2003-88381.
  • SEQ ID NOs: 1 to 5 the N-terminal / C-terminal amino acid may be modified for experimental reasons.
  • the present invention shifts the acid dissociation pH of a protein containing a Fab region to a neutral side compared to that before mutagenesis by introducing a specific amino acid substitution mutation into any one of SEQ ID NOs: 1 to 5. It is a technology characterized by this.
  • the specific amino acid substitution mutation is a mutation that substitutes one or more amino acid residues selected from the group consisting of positions 17 and 36 with other amino acids.
  • the amino acid sequence before mutation introduction (before substitution introduction) is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence obtained by introducing A17T (back mutation) into the amino acid sequence of this peptide is the amino acid sequence before the substitution introduction.
  • the modified Fab region-binding peptide (1) in the present invention dissociates the Fab region-containing protein under acidic elution conditions at a higher pH, and the Fab region-containing protein becomes acidic as confirmed in the Examples below.
  • the elution peak when eluted under conditions is sharper.
  • the amino acid sequence before substitution introduction of the modified Fab region binding peptide (1) in the present invention is preferably any one of SEQ ID NOs: 1 to 5, more preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is most preferred, but is not limited thereto.
  • the modified Fab region-binding peptide (1) in the present invention has an amino acid sequence in which one or more amino acid residues selected from the group consisting of the 17th and 36th positions are substituted.
  • the 17th position is more preferred as the position to be substituted.
  • position 17 is Thr and position 36 is Asp.
  • the phrase “having a (specific) amino acid sequence” means that the peptide only needs to contain the specified amino acid sequence, and the function of the peptide is maintained. To do.
  • sequences other than the amino acid sequence specified in the peptide include a histidine tag, a linker sequence for immobilization, and a cross-linked structure such as an —SS— bond.
  • positions corresponding to positions 17 and 36 of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 5 on the basis of sequence identity Those skilled in the art can easily do this.
  • the position can be specified using the alignment function of GENETYX (https://www.genetyx.co.jp/), which is genetic information processing software.
  • amino acid that replaces the amino acid after mutation that is, Thr at position 17 and / or Asp at position 36 in the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 5, including substitution to non-protein constituent amino acids and unnatural amino acids, in particular
  • natural amino acids can be suitably used from the viewpoint of genetic engineering production.
  • natural amino acids are classified into neutral amino acids; acidic amino acids of Asp and Glu; basic amino acids of Lys, Arg, and His.
  • Neutral amino acids are classified as aliphatic amino acids; Pro imino acids; Phe, Tyr, Trp aromatic amino acids.
  • Aliphatic amino acids are further classified into Gly; Ala; branched amino acids of Val, Leu and Ile; hydroxy amino acids of Ser and Thr; sulfur-containing amino acids of Cys and Met; and acid amide amino acids of Asn and Gln.
  • Tyr since Tyr has a phenolic hydroxyl group, it may be classified not only as an aromatic amino acid but also as a hydroxy amino acid.
  • natural amino acids can be selected from Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Cys, Met, Pro, Phe and highly hydrophobic nonpolar amino acids; Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr.
  • the amino acid substituted at the 17th position is preferably Ala, Val, Ser, Leu or Ile, more preferably Ala or Val, and even more preferably Val.
  • the amino acid substituted at position 36 is preferably Ala, Val, Thr or Glu, more preferably Ala, Val or Thr, and even more preferably Val. From another point of view, Gly which may destabilize the ⁇ -sheet structure at both the 17th and 36th positions is not preferable.
  • modified Fab region-binding peptide (2) of the present invention one or several amino acid residues are missing in the region excluding the 17th and 36th positions in the amino acid sequence of (1) above.
  • Fab region binding property having an amino acid sequence to which one or more mutations selected from deletion, substitution and addition are added, and whose acid dissociation pH is shifted to the neutral side compared to before the introduction of the mutation It is a peptide.
  • the range of “one to several” means that the modified Fab region-binding peptide having a deletion or the like has high binding to the Fab region of an immunoglobulin. It is not particularly limited as long as it has power.
  • the range of “1 to several” can be, for example, 30 or less, preferably 20 or less, more preferably 10 or less, still more preferably 7 or less, even more preferably 5 or less, especially Preferably, it can be 3 or less, 1 or more, 2 or less, and 1 or so.
  • ⁇ One or several mutation positions are not problematic as long as they are other than the 17th or 36th positions.
  • the 31st, 33rd and 39th positions are preferred as mutation positions.
  • the amino acid types differ between SEQ ID NOs: 3 to 5, positions 6, 7, 19, 24, 28, 29, 31, 31, 35 40th, 42nd and 47th positions are also preferred as mutation positions.
  • examples of the positions for deletion, substitution and / or addition of amino acid residues include the N-terminus and / or C-terminus. These sites are particularly preferred as deletion and / or addition sites.
  • An embodiment of the amino acid sequence to be added includes adding an amino acid sequence containing Lys or Cys useful for immobilizing the peptide to a matrix to the C-terminal side.
  • the position of the amino acid residue after mutagenesis corresponding to the position of the amino acid residue before mutagenesis is the amino acid before and after mutagenesis. It can be easily searched by performing alignment analysis of sequences. Such an alignment analysis technique is widely known to those skilled in the art as described for the modified Fab region-binding peptide (1).
  • the sequence identity is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, further preferably 90% or more, further preferably 95% or more, 98 % Or more is more preferable.
  • the sequence identity is measured using Clustal (http://www.clustal.org/omega/), which is an amino acid sequence multiple alignment program, as described for the modified Fab region binding peptide (1). be able to.
  • one or more substituted amino acid residues selected from the group consisting of positions 17 and 36 in the amino acid sequence defined in (1) above shall not be further mutated in (3). Even when the number of amino acids in the amino acid sequence before mutagenesis is different, when the sequence identity is 80% or more, identifying the position corresponding to position 17 or position 36 of SEQ ID NOs: 1 to 5 is: Those skilled in the art can easily do this.
  • the Fab region-binding peptides (1) to (3) according to the present invention are characterized in that the acid dissociation pH with respect to the Fab region-containing protein is shifted to the neutral side before substitution introduction or before mutation introduction.
  • bonds between peptides are lost due to changes in molecular surface charge or steric structure changes due to denaturation.
  • “Acid dissociation pH” is a pH at which the specific binding is lost and dissociated on the acidic side (pH having a value smaller than 7).
  • the acid dissociation pH is the highest pH value at which the Fab region-containing protein adsorbed on the affinity separation matrix having the Fab region binding peptides (1) to (3) according to the present invention as a ligand can be separated (eluted). It can be said. Therefore, in this specification, acid dissociation pH and acid elution pH are basically synonymous.
  • the acid dissociation pH is “shifted to the neutral side before introduction of the substitution or before the introduction of the mutation” because the pH value required for dissociation of the bond is smaller before the introduction of the substitution or the mutation. It means that it is larger after the introduction of the mutation. That is, after the introduction of substitution or mutation, it means that the bond is dissociated with a weaker acidic solution.
  • the value of acid dissociation pH varies depending on the type of Fab region-containing protein, the type and concentration of the buffer component of the acidic solution, and in the case of an affinity separation matrix, the type and structure of the water-insoluble carrier and the linker immobilization linker. Since it varies depending on the type and structure, it is difficult to clearly indicate the numerical range.
  • the acid dissociation pH before introducing the mutation is about 2.0 to 3.5, but by introducing the mutation according to the present invention, the pH is about 3.0 to 4.5. Although it shifts, it is not limited to this. Elution under these conditions causes little damage to the antibody (GhosehS. Et al., Biotechnology and bioengineering, 2005, 92, 6).
  • the acid dissociation pH is preferably shifted to 0.1 or more neutral side in terms of pH value, and may be shifted to 0.2 or more neutral side in terms of pH value. More preferably, the pH value is more preferably shifted to a neutral side of 0.3 or more, still more preferably the pH value is shifted to a neutral value of 0.4 or more, and the pH value is more preferably 0.5. It is even more preferable to shift to the neutral side.
  • the method for evaluating the acid dissociation pH before and after mutagenesis is not particularly limited as long as it is a technique capable of detecting an interaction between biomolecules.
  • a Biacore system GE Healthcare
  • a method for measuring the acid dissociation pH for example, one peptide or protein to be bound is immobilized on a sensor chip, the other protein solution or peptide solution adjusted to a desired pH is added to the flow path, and the presence or absence of a binding signal is detected. Is detected, and the pH at which the binding signal cannot be detected may be evaluated, but is not limited thereto.
  • a buffer solution having a desired pH may be added, and the change in the binding signal remaining without dissociation on the chip before and after the addition may be evaluated.
  • the temperature is a constant temperature of 20 to 40 ° C.
  • the pH when the binding state is observed is a neutral condition of pH 5 to 8.
  • the buffer component include phosphoric acid, tris, bistris and the like when neutral, and acetic acid, citric acid, glycine and the like when acidic, but are not limited thereto.
  • the NaCl concentration of the buffer solution is not particularly limited, but is preferably about 0 to 0.15M, and particularly preferably 0M when viewing the dissociated state.
  • the Fab region-binding peptide may be immobilized on the chip (solid phase) or on the flow channel addition side (liquid phase). is there.
  • a method for evaluating a chromatographic profile using an affinity separation matrix is also preferable. For example, after fixing one peptide or protein to be bound to a chromatography column and connecting the column to a chromatography apparatus, the other protein solution or peptide solution is added to the column, and the pH is gradually lowered. The pH of the peak top from which the adsorbed protein or peptide is eluted by applying a linear gradient may be evaluated, but is not limited thereto.
  • the temperature, buffer solution, salt concentration and the like at the time of measurement preferably follow the above-mentioned conditions, but are not particularly limited.
  • the components of the binding buffer (buffer A) and the dissociation buffer (buffer B) are preferably the same except for pH.
  • the Fab region binding peptide may be immobilized on the column (solid phase) or may be added and eluted (liquid phase).
  • solid phase solid phase
  • liquid phase liquid phase
  • Protein G is a protein containing two or three immunoglobulin binding domains arranged in tandem.
  • the modified Fab region-binding peptide according to the present invention also includes, as one embodiment, two or more, preferably three or more, more preferably, the modified Fab region-binding peptide that is a monomer or a single domain. It may be a multimer of multiple domains linked by 4 or more, more preferably 5 or more. The upper limit of the number of domains connected is, for example, 10, preferably 8, and more preferably 6.
  • These multimers may be a homopolymer such as a homodimer or homotrimer that is a conjugate of a single modified Fab region-binding peptide, or may be a conjugate of a plurality of types of modified Fab region-binding peptides. It may be a heteropolymer such as a certain heterodimer or heterotrimer.
  • Examples of how the modified Fab region-binding peptide according to the present invention is linked include a method of linking with one or a plurality of amino acid residues, and a method of directly linking without interposing amino acid residues, It is not limited to these methods.
  • the number of amino acid residues to be linked is not particularly limited, but is preferably 1 to 20 residues, more preferably 15 residues or less, still more preferably 10 residues or less, and even more preferably. Is 5 residues or less, and even more preferably 2 residues or less.
  • a sequence linking between ⁇ 1 and ⁇ 2 or between ⁇ 2 and ⁇ 3 of wild-type SpG is used. From another viewpoint, those that do not destabilize the three-dimensional structure of the monomer-modified Fab region binding peptide are preferable.
  • the modified Fab region-binding peptide according to the present invention may be any peptide having the amino acid sequence defined by the modified Fab region-binding peptides (1) to (3). It may be.
  • a modified Fab region-binding peptide obtained by the present invention or a multimer in which two or more of the peptides are linked is used as one component, and the other functions are different.
  • Examples of fusion peptides include, but are not limited to, peptides fused with albumin or GST (glutathione S-transferase).
  • nucleic acid such as a DNA aptamer
  • a drug such as an antibiotic
  • a polymer such as PEG (polyethylene glycol)
  • the modified Fab region-binding peptides (1) to (3) according to the present invention can be retained in a column as an affinity ligand and exhibit excellent Fab binding force.
  • the affinity for the Fab region can be tested by, for example, a biosensor such as a Biacore system using the surface plasmon resonance principle, but is not limited thereto.
  • affinity constant K A
  • dissociation constant K D
  • the affinity constant between the modified Fab region-binding peptide according to the present invention and the Fab region-containing protein is determined by immobilizing the Fab region-containing protein on the sensor chip using, for example, the Biacore system, at a temperature of 25 ° C., and at a pH of 7.4. Under the conditions described above, the modified Fab region-binding peptide according to the present invention can be obtained in an experimental system in which a flow path is added.
  • the affinity constant (K A ) with the Fab region-containing protein is more preferably 1 ⁇ 10 5 M ⁇ 1 or more, preferably 5 ⁇ 10 5 M ⁇ 1 for the peptide having a sequence into which the mutation according to the present invention has been introduced. More preferably, it is more than the above.
  • the affinity constant varies depending on the type of Fab region-containing protein and the number of domains of the Fab region-binding peptide, and is not limited thereto.
  • the present invention encompasses the use of the above-described peptide of the present invention as an affinity ligand characterized by having affinity for immunoglobulins and fragments thereof, particularly Fab regions.
  • an affinity separation matrix characterized in that the ligand is immobilized on a water-insoluble carrier is also included as one embodiment.
  • affinity ligand refers to a substance or function that selectively binds and collects a target molecule from a set of molecules based on the affinity between specific molecules represented by the binding between an antigen and an antibody. It is a term indicating a group, and in the present invention, refers to a peptide that specifically binds to an immunoglobulin.
  • the expression “ligand” is also synonymous with “affinity ligand”.
  • water-insoluble carrier used in the present invention examples include inorganic carriers such as glass beads and silica gel; organic carriers; and organic-organic and organic-inorganic composite carriers obtained by a combination thereof.
  • organic carrier examples include synthetic polymer carriers such as crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene, and polysaccharide carriers such as crystalline cellulose, crosslinked cellulose, crosslinked agarose, and crosslinked dextran.
  • GCL2000 a porous cellulose gel
  • Sephacryl S-1000 in which allyl dextran and methylene bisacrylamide are covalently crosslinked
  • Toyopearl an acrylate carrier
  • Sepharose CL4B an agarose crosslinking carrier
  • Cellufine which is a cellulosic crosslinking carrier.
  • the water-insoluble carrier in the present invention is not limited to these exemplified carriers.
  • the water-insoluble carrier used in the present invention preferably has a large surface area in view of the purpose and method of use of the affinity separation matrix of the present invention, and is preferably a porous material having a large number of pores of an appropriate size.
  • the form of the carrier can be any of beads, monoliths, fibers, membranes (including hollow fibers), and any form can be selected.
  • the ligand may be bound to the carrier by a conventional coupling method using an amino group, a carboxy group or a thiol group present in the ligand.
  • the carrier is activated by reacting the carrier with cyanogen bromide, epichlorohydrin, diglycidyl ether, tosyl chloride, tresyl chloride, hydrazine or sodium periodate, or the surface of the carrier.
  • the immobilization method include addition of a reagent having a plurality of functional groups in the molecule such as glutaraldehyde, condensation, and crosslinking.
  • a spacer molecule composed of a plurality of atoms may be introduced between the ligand and the carrier, or the ligand may be directly immobilized on the carrier. Therefore, the modified Fab region-binding peptide according to the present invention may be chemically modified for immobilization, or an amino acid residue useful for immobilization may be added.
  • amino acids useful for immobilization include amino acids having functional groups useful for immobilization chemical reactions in the side chain, such as Lys containing an amino group in the side chain, and thiol groups in the side chain. Cys containing is mentioned.
  • the essence of the present invention is that the Fab region binding property imparted to a peptide in the present invention is similarly imparted to a matrix in which the peptide is immobilized as a ligand. Even within the scope of the present invention.
  • proteins containing immunoglobulin Fab regions can be separated and purified by affinity column chromatography purification methods.
  • the purification method of the protein containing the Fab region of immunoglobulin G can be achieved by a procedure according to an affinity column chromatography purification method of immunoglobulin, for example, a purification method using an SpA affinity separation matrix (Non-Patent Document). 1). That is, after preparing a buffer containing a protein containing the Fab region of immunoglobulin G (pH is near neutral), the solution is contacted by passing it through an affinity column packed with the affinity separation matrix of the present invention. The protein containing the Fab region of immunoglobulin G is adsorbed.
  • an appropriate amount of pure buffer is passed through the affinity column, and the inside of the column is washed.
  • the protein containing the Fab region of the desired immunoglobulin G is adsorbed to the affinity separation matrix according to the present invention in the column.
  • the affinity separation matrix in which the peptide of the present invention is immobilized as a ligand is excellent in the ability to adsorb and retain a protein containing the Fab region of the target immunoglobulin G from the sample addition step to the matrix washing step.
  • an acidic buffer adjusted to an appropriate pH is passed through the column, and the protein containing the Fab region of the desired immunoglobulin G is eluted to achieve high-purity purification.
  • a substance that promotes dissociation from the matrix may be added to the acidic buffer used for elution.
  • an acidic buffer having a pH closer to the neutral side can be used as an eluent.
  • the acidic buffer to be used preferably has a pH value of 3.0 or more, more preferably 3.1 or more, even more preferably 3.2 or more, and 3.3 or more. Is more preferably, pH 3.4 or higher, even more preferably pH 3.5 or higher, even more preferably pH 3.6 or higher, and further preferably pH 3.7 or higher. More preferably, the pH is 3.8 or more.
  • the upper limit of the acidic buffer to be used is not particularly limited, but the acidic buffer to be used is used when washing at about pH 5.0 by intermediate washing in affinity chromatography or when incubation at about pH 3.8 for virus removal after purification. Is preferably pH 4.5 or less, more preferably pH 4.0 or less.
  • the affinity separation matrix of the present invention can be reused by washing with a suitable strong acid or strong alkaline buffer that does not completely impair the function of the ligand compound or carrier substrate. It is.
  • An appropriate denaturing agent or an organic solvent may be added to the regeneration buffer.
  • the affinity separation matrix of the present invention can be reused by washing with a suitable strong acid or strong alkaline buffer that does not completely impair the function of the ligand compound or carrier substrate. It is.
  • a suitable strong acid or strong alkaline buffer that does not completely impair the function of the ligand compound or carrier substrate. It is.
  • a solution containing an appropriate modifier and an organic solvent can also be used.
  • the present invention also relates to DNA encoding the modified Fab region binding peptide according to the present invention.
  • the DNA encoding the peptide of the present invention may be any DNA as long as the amino acid sequence obtained by translating the base sequence constitutes the peptide of the present invention.
  • Such a base sequence can be obtained by using a commonly used known method, for example, a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as “PCR”) method. It can also be synthesized by a known chemical synthesis method, and can also be obtained from a DNA library.
  • the base sequence may not be the same as the original base sequence as long as the codon may be substituted with a degenerate codon and it encodes the same amino acid when translated.
  • Recombinant DNA having one or more of the nucleotide sequences vectors such as plasmids and phages containing the recombinant DNA, and transformants transformed with vectors having the DNA, and introducing the DNA And a cell-free protein synthesis system using the DNA as a template DNA for transcription.
  • the modified Fab region-binding peptide according to the present invention can be obtained as a fusion peptide with a known protein having an advantage of assisting protein expression or facilitating purification. That is, a microorganism or cell containing at least one recombinant DNA encoding a fusion peptide containing the modified Fab region binding peptide according to the present invention can be obtained.
  • the protein include maltose binding protein (MBP) and glutathione-S-transferase (GST), but are not limited to these proteins.
  • the introduction of site-specific mutations for modifying the DNA encoding the peptide of the present invention can be carried out using recombinant DNA techniques, PCR methods and the like as follows. That is, the introduction of mutations by recombinant DNA technology is performed, for example, when there are appropriate restriction enzyme recognition sequences on both sides of the target site where mutations are desired in the gene encoding the peptide of the present invention.
  • the recognition sequence can be cleaved with the restriction enzyme, and after removing the region containing the site desired to be mutated, the cassette mutation method can be used in which a DNA fragment mutated only at the desired site is inserted by chemical synthesis or the like. .
  • a DNA encoding a multimeric peptide can also be prepared by linking a DNA encoding the monomeric peptide (one domain) of the present invention in series by the intended number.
  • an appropriate restriction enzyme site can be introduced into the DNA sequence, and double-stranded DNA fragmented with the restriction enzyme can be ligated with DNA ligase.
  • restriction enzyme site There may be one type of restriction enzyme site, but a plurality of different types of restriction enzyme sites may be introduced.
  • the sequence identity between the nucleotide sequences of DNA encoding the peptide is 90% or less, preferably 85% or less, more preferably 80% or less, and even more preferably 75% or less.
  • the identity of the base sequence can be determined by a conventional method as in the case of the amino acid sequence.
  • the “expression vector” of the present invention includes a base sequence encoding the aforementioned peptide of the present invention or a partial amino acid sequence thereof, and a promoter operable in a host operably linked to the base sequence.
  • the gene encoding the peptide of the present invention can be obtained by linking or inserting into a suitable vector, and the vector for inserting the gene is not particularly limited as long as it can autonomously replicate in the host.
  • plasmid DNA or phage DNA can be used as a vector.
  • vectors such as pQE vectors (Qiagen), pET vectors (Merck), and pGEX vectors (GE Healthcare Bioscience) may be mentioned.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell.
  • methods for introducing recombinant DNA into a host include a method using calcium ions, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, an Agrobacterium infection method, a particle gun method, and a polyethylene glycol method.
  • examples of a method for expressing the function of the obtained gene in a host include a method for incorporating the gene obtained in the present invention into a genome (chromosome).
  • the host cell is not particularly limited, but for mass production at low cost, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus genus, Staphylococcus genus, Streptococcus genus, Streptomyces genus (Streptomyces), Corynebacterium Bacteria (eubacteria) such as Corynebacterium can be preferably used.
  • the modified Fab region-binding peptide according to the present invention is obtained by culturing the above-mentioned transformant in a medium, and in the culture (including the cell periplasm region) or in the culture solution (extracellular). Can be produced by accumulating and collecting the desired peptide from the culture.
  • the peptide of the present invention is obtained by culturing the above-described transformed cells in a medium to produce a fusion protein containing the peptide of the present invention in the culture (including the cell periplasm region) or in the culture solution (extracellular). It can be produced by accumulating, collecting the fusion peptide from the culture, cleaving the fusion peptide with an appropriate protease, and collecting the desired peptide.
  • the method of culturing the transformant of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for host culture.
  • the medium used for culturing the obtained transformant is not particularly limited as long as it can produce the peptide of the present invention with high efficiency and high yield.
  • carbon sources and nitrogen sources such as glucose, sucrose, glycerol, polypeptone, meat extract, yeast extract, and casamino acid can be used.
  • inorganic salts such as potassium salt, sodium salt, phosphate, magnesium salt, manganese salt, zinc salt and iron salt are added as necessary.
  • an auxotrophic host cell a nutrient substance required for growth may be added. If necessary, antibiotics such as penicillin, erythromycin, chloramphenicol, neomycin may be added.
  • protease inhibitors ie, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamideline, 4- (2-aminoethyl)- Benzenesulfonyl fluoride (AEBSF), Antipain, Chymostatin, Leupeptin, Pepstatin A, Phosphoramidon, Aprotinin, Ethylenediamine etietic or other inhibitors (EDTA)
  • molecular chaperones such as GroEL / ES, Hsp70 / DnaK, Hsp90, Hsp104 / ClpB may be used.
  • Such molecular chaperone is allowed to coexist with the peptide of the present invention by a technique such as co-expression or fusion proteinization.
  • there are techniques such as adding an additive that promotes correct folding to the medium and culturing at a low temperature, but are not limited thereto. .
  • LB medium tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%) or 2 ⁇ YT medium (tryptone 1.6%, yeast extract) 1.0%, NaCl 0.5%) and the like.
  • the culture temperature is, for example, 15 to 42 ° C., preferably 20 to 37 ° C., and aerobically stirred for several hours to several days under aeration and stirring conditions, whereby the peptide of the present invention is cultured in cultured cells (in the periplasm region). Collected) or in a culture solution (extracellular). In some cases, the culture may be performed anaerobically by blocking aeration.
  • the replacement peptide can be recovered.
  • the cells are collected from the culture solution by a method such as centrifugation or filtration, and then the cells are sonicated.
  • the peptide accumulated and produced in the cells can be recovered by crushing by a French press method and / or solubilizing by adding a surfactant or the like.
  • the purification of the peptide according to the present invention can be carried out by affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, gel filtration chromatography or the like alone or in combination. Confirmation that the obtained purified substance is the target protein can be performed by usual methods such as SDS polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequence analysis, Western blotting and the like.
  • the mutant peptide obtained in the following examples is expressed in the form of “domain-introduced mutation”, and the peptide before introducing the substitution mutation is described in the form of “domain-Cont”.
  • the SpG- ⁇ 1 mutant (SpG- ⁇ 1 #) having improved Fab binding ability shown in SEQ ID NO: 1 is “GB1 # -Cont”, and Thr at position 17 is replaced with Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the SpG- ⁇ 1 mutant introduced with the above mutation (T17A) is referred to as “GB1 # -T17A”.
  • the notation of the mutant in which two kinds of mutations are introduced at the same time is written together using a slash.
  • an SpG- ⁇ 1 # mutant introduced with mutations T17A and D36V is represented as “GB1 # -T17A / D36V”.
  • peptides in which a plurality of single domains are linked add “d” to the number linked after the period.
  • a peptide in which two SpG- ⁇ 1 # mutants introduced with mutations T17A and D36V are linked is represented as “GB1 # -T17A / D36V.2d”.
  • Cys residue (C) having a functional group for immobilization is introduced at the C-terminus in order to immobilize a peptide on a water-insoluble substrate, one letter of the amino acid introduced after “d” Give the notation.
  • an SpG- ⁇ 1 # mutant in which two SpG- ⁇ 1 # mutants introduced with mutations T17A and D36V are ligated to give Cys to the C-terminus is denoted as “GB1 # -T17A / D36V.2dC”.
  • Example 1 Preparation of various SpG- ⁇ 1 # mutants (1) Preparation of expression plasmids of various SpG- ⁇ 1 # mutants Preparation of various SpG- ⁇ 1 # mutant expression plasmids was performed in GB1 # -Cont. An expression plasmid of 1d (a peptide before introduction of a substitution mutation as a comparative example) was used as a template plasmid, and a mutation was introduced into it.
  • GB1 # -Cont. Back translation was performed from the amino acid sequence of 1d (SEQ ID NO: 1), and a base sequence (SEQ ID NO: 6) encoding the peptide was designed.
  • the coding DNA was prepared and inserted into an expression plasmid by the method shown in FIG. GB1 # -T17A.
  • a DNA encoding 1d was prepared by linking two types of double-stranded DNAs (f1 and f2) having the same restriction enzyme site, and incorporated into the multicloning site of the expression vector.
  • coding DNA preparation and vector integration were simultaneously performed by three-fragment ligation in which a total of three types of double-stranded DNA, ie, two types of double-stranded DNA and an expression vector, were linked.
  • the method for preparing two types of double-stranded DNA includes two types of single-stranded oligo DNAs (f1-1 / f1-2 or f2-1 / f2-2) containing complementary regions of about 30 bases each other,
  • the target double-stranded DNA was prepared by extension by overlap PCR.
  • the specific experimental operation is as follows.
  • Single-stranded oligo DNA f1-1 (SEQ ID NO: 7) / f1-2 (SEQ ID NO: 8) was synthesized by outsourcing (Sigma Genosys), and overlap PCR was performed using Blend Taq (TOYOBO) as a polymerase. It was.
  • single-stranded oligo DNA f2-1 (SEQ ID NO: 9) / f2-2 (SEQ ID NO: 10) was synthesized by outsourcing, and the double-stranded DNA synthesized and extracted through an overlap PCR reaction was subjected to restriction enzyme Eco52I. And EcoRI (both were Takara Bio).
  • Eco52I restriction enzyme
  • EcoRI both were Takara Bio
  • the above two double-stranded DNAs were subcloned into the BamHI / EcoRI site in the multicloning site of the plasmid vector pGEX-6P-1 (GE Healthcare Bioscience).
  • the ligation reaction in subcloning was performed using Ligation high (TOYOBO) according to the protocol attached to the product.
  • plasmid vector pGEX-6P-1 transformation of competent cells (Takara Bio Inc. “E. coli HB101”) was performed according to the protocol attached to this competent cell product.
  • GST glutathione-S-transferase
  • the base sequence of the coding DNA of the expression plasmid was confirmed using a DNA sequencer (“3130xl3Genetic Analyzer” manufactured by Applied Biosystems). Using the gene analysis kit (Applied Biosystems "BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit”) and the DNA primer for sequencing the plasmid vector pGEX-6P-1 (GE Healthcare Biosciences), the attached protocol A sequencing PCR reaction was performed according to the procedure described above. The sequencing product was purified using a plasmid purification kit Applied Biosystems “BigDye X Terminator Purification Kit” according to the attached protocol, and used for base sequence analysis.
  • DNAs encoding various SpG- ⁇ 1 # mutants were prepared by changing the method between the case of introducing a mutation at position 17 and the case of introducing a mutation at position 36.
  • GB1 # -Cont. Can be inserted into pGEX-6P using a restriction enzyme in a PCR reaction using the 1d expression plasmid as a template and the DNA primers of SEQ ID NOs: 11-12 and pGEX-6P-1 sequencing DNA primer (3 'side) Double stranded DNA was prepared.
  • This PCR reaction was performed using Blend Taq-Plus- (TOYOBO) according to the attached protocol.
  • This double-stranded DNA was cleaved with restriction enzymes BamHI and EcoRI, and ligated at the BamHI / EcoRI site of pGEX-6P-1 in the same manner as described above.
  • An expression plasmid for the SpG- ⁇ 1 # mutant was prepared.
  • the same PCR reaction using the DNA primer of SEQ ID NO: 13 and the DNA primer for pGEX-6P-1 sequencing (3 ′ side) corresponds to f2 in FIG.
  • a double-stranded DNA was prepared. This double-stranded DNA and GB1 # -Cont.
  • the 1d expression plasmid was cleaved with restriction enzymes Eco52I and EcoRI and ligated in the same manner as described above to prepare an expression plasmid for the SpG- ⁇ 1 # mutant in which a mutation was introduced at position 36. Transformation and base sequence analysis were performed in the same manner as described above. Table 1 shows the base sequences of the DNA primers used for making each mutant, the base sequence of the cDNA encoding the mutant, and the amino acid sequence of the mutant.
  • the cells were collected by centrifugation and resuspended in 5 mL of PBS buffer.
  • the cells were disrupted by ultrasonic disruption, centrifuged, and fractionated into a supernatant fraction (cell-free extract) and an insoluble fraction.
  • GST is expressed as a fusion peptide attached to the N-terminus.
  • SDS electrophoresis all of the various cell-free extracts prepared from the respective transformed cell cultures were found to have peptides that were thought to have been induced by IPTG at a molecular weight of about 25,000 or more. I confirmed the band. The molecular weight was almost the same, but the position of the band was different depending on the type of mutant.
  • the GST fusion peptide was roughly purified from each cell-free extract containing the GST fusion peptide by affinity chromatography using a GSTrap FF column (GE Healthcare Bioscience) having affinity for GST.
  • Each cell-free extract is added to the GSTRap FF column, and the column is washed with a standard buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, pH 7.4), followed by an elution buffer ( The target GST fusion peptide was eluted with 50 mM Tris-HCl, 20 mM glutathione, pH 8.0).
  • the sample used for the assay with the GST fused was obtained by replacing the eluate with a standard buffer solution in a concentrated form using Amicon (Merck Millipore), a centrifugal filter unit. The solution was used.
  • the amino acid sequence that can cleave GST with the sequence-specific protease PreScission Protease is between GST and the target peptide.
  • GST cleavage reaction was performed using PreScience Protease according to the attached protocol.
  • the target peptide was purified from the sample used for the assay in the form of cleaved GST by gel filtration chromatography using Superdex 75 10/300 GL column (GE Healthcare Bioscience).
  • each reaction solution was added to a Superdex 75 10/300 GL column equilibrated with a standard buffer, and the target peptide was separated and purified from cleaved GST and PreScission Protease. Note that peptide purification by chromatography using the above columns was all performed using the AKTAprime plus system (GE Healthcare Bioscience).
  • each peptide after GST cleavage obtained in this example has an amino acid sequence in which Gly-Pro-Leu-Gly-Ser derived from the vector pGEX-6P-1 is added to the N-terminal side on the N-terminal side. .
  • Example 2 Evaluation of affinity of various SpG- ⁇ 1 # mutants to aTNF-Fab (1) Preparation of Fab fragment Using humanized monoclonal IgG preparation as a raw material, this was fragmented into Fab fragment and Fc fragment by papain, Only the Fab fragment was separated and purified.
  • an anti-human TNF ⁇ monoclonal IgG (generic name “infliximab”, product name “Remicade”, Mitsubishi Tanabe Seiyaku) formulation was prepared using papain digestion buffer (0.1 M AcOH-AcONa, 2 mM EDTA, 1 mM cysteine, pH 5 5), Papain Agarose from papaya latex papain-immobilized agarose (SIGMA) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for about 8 hours while mixing with a rotator.
  • papain digestion buffer 0.1 M AcOH-AcONa, 2 mM EDTA, 1 mM cysteine, pH 5 5
  • Papain Agarose from papaya latex papain-immobilized agarose SIGMA
  • IgG-Fab is recovered in the flow-through fraction by affinity chromatography using MabSelect SuRe column (GE Healthcare Bioscience). Separated and purified.
  • the separated IgG-Fab solution was purified by gel filtration chromatography using a Superdex 75 10/300 GL column (standard buffer was used for equilibration and separation), and the IgG-Fab solution (aTNF-Fab) was purified.
  • purification of the peptide by chromatography was performed using the AKTAprime plus system.
  • Example 2 (2) Analysis of affinity of Fabs of various SpG- ⁇ 1 # mutants for various SpGs obtained in Example 1 (2) using a biosensor Biacore 3000 (GE Healthcare Bioscience) utilizing surface plasmon resonance -Affinity of ⁇ 1 # mutant with aTNF-Fab was analyzed.
  • the aTNF-Fab obtained in Example 2 (1) was immobilized on a sensor chip, and various peptides were allowed to flow on the chip to detect their interaction.
  • the immobilization of aTNF-Fab on the sensor chip CM5 is performed by an amine coupling method using N-hydroxysuccinimide (NHS) and N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC). And ethanolamine was used for blocking (sensor chips and immobilization reagents were all manufactured by GE Healthcare Biosciences).
  • the aTNF-Fab solution was diluted about 10 times with an immobilization buffer (10 mM AcOH-AcONa, pH 4.5), and immobilized on the sensor chip according to the protocol attached to the Biacore 3000.
  • a reference cell serving as a negative control was prepared in which another flow cell on the chip was activated by EDC / NHS and then blocked with ethanolamine without any immobilization reaction.
  • Various SpG- ⁇ 1 # mutants are 0.01, 0.1 using running buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, 0.005% P-20, pH 7.4).
  • a protein solution having a concentration adjusted to 1 or 10 ⁇ M was added to the sensor chip at a flow rate of 40 ⁇ L / min for 1 minute.
  • a binding reaction curve at the time of addition (binding phase, 1 minute) and after the end of addition (dissociation phase, 1 minute) was observed in order.
  • binding reaction curve binding reaction curve obtained by subtracting the binding reaction curve of the reference cell
  • GB1 # -Cont The analysis results are shown in Table 2 together with various binding parameters of 1d.
  • the mutants into which the mutations T17A, T17V, and D36V were introduced were compared with the affinity constant K A for SpG- ⁇ 1 # (GB1 # -Cont. 1d) before a mutation was introduced to aTNF-Fab. It showed lower K a value each. However, the numerical value was 5 ⁇ 10 5 (1 / M) or more, and no significant decrease in bonding strength of 1/10 or less was observed.
  • the Fab binding force only needs to be able to hold the partner molecule as a ligand in the column, and if the binding force is too strong, it may work against elution, so if it is 5 ⁇ 10 5 (1 / M) or more, It seems to function without problems.
  • Example 3 Evaluation of Acid Dissociation pH of Various SpG- ⁇ 1 # Variants aTNF-Fab (1) Preparation of Fab Fragment Immobilization Support Commercially available coupling column for ligand immobilization having a functional group for coupling as an amino group was used to prepare an affinity separation matrix in which the aTNF-Fab obtained in Example 2 was immobilized.
  • a water-insoluble substrate 1 mL of a commercially available prepacked column (“Hitrap NHS activated HP” manufactured by GE Healthcare Bioscience) was used. Since this column is based on cross-linked agarose and has already been introduced with an active group for immobilizing a peptide ligand having a functional group for coupling as an amino group, the ligand was immobilized according to the product manual. The operation of flowing 2 mL of 1 mM HCl cooled in an ice bath at a flow rate of 1 mL / min was performed three times to remove isopropanol in the column.
  • FIG. 2 shows a chromatographic chart in which the various SpG- ⁇ 1 # mutants are superposed in such a manner that they can be compared with SpG- ⁇ 1 # before introduction of the mutation of Comparative Example 3.
  • Comparative Example 2 GB1 # -Cont. Evaluation of affinity of 1d to aTNF-Fab GB1 # -Cont. Regarding 1d, the affinity with aTNF-Fab prepared in Example 2 (1) was analyzed in the same manner as in Example 2 (2). The analysis results are also shown in Table 2 above.
  • Comparative Example 3 GB1 # -Cont. Evaluation of acid dissociation pH of 1d aTNF-Fab GB1 # -Cont. Regarding 1d, the acid dissociation pH was analyzed in the same manner as in Example 3 (2) using the aTNF-Fab immobilized carrier prepared in Example 3 (1). The analysis results are also shown in Table 3 above.

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Abstract

　本発明は、ＩｇＧのＦａｂ領域に対して優れた選択的吸着能を示す一方で、比較的高いｐＨの酸性溶出液により当該Ｆａｂ領域含有タンパク質を放出可能な改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドを提供することを目的とする。また、本発明は、当該改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドをリガンドとして有するアフィニティー分離マトリックス、当該アフィニティー分離マトリックスを用いるＦａｂ領域含有タンパク質の製造方法、当該改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。特定の位置にアミノ酸置換変異を有するプロテインＧ変異体を利用することによって、上記課題を解決する。

Description

改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド
　本発明は、ＩｇＧのＦａｂ領域に結合し、且つ、よりマイルドな酸性条件でＦａｂ領域と解離する改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド、当該改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドをリガンドとして有するアフィニティー分離マトリックス、当該アフィニティー分離マトリックスを用いるＦａｂ領域含有タンパク質の製造方法、当該改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体に関するものである。
　タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度で精製（キャプチャリング）するために利用される、プロテインＡアフィニティー分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と省略する場合がある）が挙げられる（非特許文献１，２）。
　抗体医薬として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術などを用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。また、免疫グロブリンを断片化した分子構造を有する抗体誘導体（断片抗体）からなる抗体医薬も盛んに臨床開発されており、免疫グロブリンのＦａｂ断片からなる抗体医薬が複数上市された（非特許文献３）。
　抗体医薬製造工程における初期精製工程には、先述のＳｐＡアフィニティー分離マトリックスが利用されている。しかし、ＳｐＡは基本的にＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質である。よって、Ｆｃ領域を含まない断片抗体は、ＳｐＡアフィニティー分離マトリックスを利用したキャプチャリングができない。従って、抗体医薬精製プロセスのプラットフォーム化の観点から、ＩｇＧのＦｃ領域を含まない断片抗体をキャプチャリング可能なアフィニティー分離マトリックスに対する産業的なニーズは高い。
　ＩｇＧのＦｃ領域以外に結合するタンパク質はすでに複数知られている（非特許文献４）。しかし、そのようなタンパク質をリガンドとしたアフィニティー分離マトリックスが、ＳｐＡアフィニティー分離マトリックスと同様に、抗体医薬の精製に標準的に産業利用されているという事実はない。
　例えば、グループＧの連鎖球菌（Streptococcus sp.）より見出されたプロテインＧと呼ばれるタンパク質（以下、プロテインＧを「ＳｐＧ」と略記する場合がある）は、ＩｇＧに結合する性質を有し、このＳｐＧをリガンドとして固定化したＳｐＧアフィニティー分離マトリックス製品もある（ＧＥヘルスケア社製，製品名「Protein-G Sepharose 4 Fast Flow」，特許文献１）。ＳｐＧはＩｇＧのＦｃ領域に強く結合するが、Ｆａｂ領域にも弱いながら結合することが分かっている（非特許文献４，５）。しかし、ＳｐＧのＦａｂ領域への結合力は弱いので、ＳｐＧアフィニティー分離マトリックス製品は、Ｆｃ領域を含まずＦａｂ領域のみを含む断片抗体の保持性能は低いといえる。そこで、ＳｐＧに変異を導入することでＦａｂ領域への結合力を向上する取組みがなされている（特許文献２，非特許文献６）。
　一方、このようなアフィニティー分離マトリックス製品に使われるリガンドは、相手分子への結合が強い必要があるだけでなく、該マトリックスに吸着した相手分子が回収できるよう適切な条件で結合が解離する必要がある。ＳｐＧのようなタンパク質とＩｇＧ類との結合は酸性条件下で解離する。ＳｐＧとＦａｂとの相互作用は、ｐＨが低い方が確実に解離するが、ｐＨが低いとＦａｂに化学修飾や切断などといったダメージがあるため、なるべく中性に近いｐＨで解離することが好ましい。例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）の側鎖のｐＫａはｐＨ６付近であるので、ＳｐＧに対してＨｉｓに置換する変異を導入し、Ｆｃと解離するｐＨがやや中性側にシフトした例（特許文献３，非特許文献７）や、Ｆａｂとの解離するｐＨがやや中性側にシフトした例（非特許文献６）がある。但し、アフィニティー分離マトリックスを用いたクロマト操作では、ＨｉｓのｐＫａより中性側のｐＨ５程度で中間洗浄することもあるため、変異する部位および変異するアミノ酸の種類に関する研究は今後も必要と考えられる。
特表昭６３－５０３０３２号公報 特開２００９－１９５１８４号公報 特開２００９－２９７０１８号公報
Hober S．ら，J．Chromatogr．B，2007，848巻，40-47頁 Shukla A．A．ら，Trends Biotechnol．，2010，28巻，253-261頁 Nelson　A．N．ら，Nat．Biotechnol．，2009，27巻，331-337頁 Bouvet　P．J．ら，Int．J．Immunopharmac．，1994，16巻，419-424頁 Derrick　J．P．ら，Nature，1992，359巻，752-754頁 Bailey　L．J．ら，J．Immunol．Methods，2014，415巻，24-30頁 Watanabe　H．ら，J．Biol．Chem．，2009，284巻，12373-12383頁
　上述したように、免疫グロブリンまたはその断片を精製するためのアフィニティー分離マトリックスは種々開発されている。アフィニティー分離マトリックスにより免疫グロブリンまたはその断片を精製するには、一般的に、中性の溶液とアフィニティー分離マトリックスとを接触させて免疫グロブリンまたはその断片を選択的に吸着させ、洗浄して不純物を除去し、次いで酸性の溶出液により吸着された免疫グロブリンまたはその断片を溶出する。この際、純度の高い目的化合物を得るには、選択的吸着力の高いアフィニティー分離マトリックスを用い、洗浄を十分に行う必要がある。そして、目的化合物を高い回収率で得るために、選択的吸着を確実に解離できる酸性ｐＨで溶出する必要がある。しかし、強い酸性条件下では、目的化合物である免疫グロブリンまたはその断片がダメージを受けるおそれがあった。
　本発明者は、過去の検討より、野生型のプロテインＧ（ＳｐＧ）のＦａｂ結合力が、Ｆｃ結合力に比較すると弱く、アフィニティー分離マトリックスのリガンドとしてＦａｂ結合力を強化する必要があることを見出していた（特許文献２）。しかし、変異によってＳｐＧのＦａｂ結合力を強化することで、変異導入前に比較して、Ｆａｂが解離するｐＨがより強い酸性側にシフトする、即ち、酸解離ｐＨ値が低下する場合があることも判明した。
　そこで本発明は、ＩｇＧのＦａｂ領域に対して優れた選択的吸着能を示す一方で、比較的高いｐＨの酸性溶出液により当該Ｆａｂ領域含有タンパク質を放出可能な改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドを提供することを目的とする。また、本発明は、当該改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドをリガンドとして有するアフィニティー分離マトリックス、当該アフィニティー分離マトリックスを用いるＦａｂ領域含有タンパク質の製造方法、当該改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために、ＳｐＧのＩｇＧ結合ドメインの変異体を分子設計し、タンパク質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて該変異体を形質転換細胞から取得し、取得した該変異体の特性を比較検討する検討を行った。その結果、ＳｐＧのＩｇＧ結合性ドメインに特定の変異を導入することにより上記課題を解決できることを見出して、本発明を完成した。
　具体的には、本発明者は、以下のような分子計算化学の手法を用いて、Ｆａｂ結合力を大きく損なうことなく、酸解離ｐＨに影響を与え得る部位を特定した。
　即ち、ＳｐＧのＩｇＧ結合性ドメインとＩｇＧのＦａｂ領域の複合体の結晶構造（Derrick　J．P．，Wigley　D．B．著，J．Mol．Biol．，1994年，243巻，906-918頁）の構造座標をＰＤＢ（Protein Data Bank，http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do，当該座標のＰＤＢコード：1IGC）より入手し、分子モデリングの雛形座標として選択した。次に、Swiss-PDBViewer（Guex　N．ら，Electrophoresis，1997年，18巻，2714-2723頁）などの三次元グラフィックス・プログラムを用いて、当該結晶構造中のＩｇＧ結合性ドメインがＳｐＧのβ１ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）に適合するよう分子モデリングを行い、比較対象用のモデリング構造とした。次に、ＳｐＧのＩｇＧ結合性ドメインに変異を導入した様々なアミノ酸配列に関しても同様の作業を行った。タンパク質の安定性については、構造エネルギーによって議論することが可能である（Ａ．Ｒ．リーチ著，「分子モデリング概説」，２００４年，第１１章）。分子モデリング構造（主鎖のフレームワーク）を利用すれば、分子力場法を利用した分子シミュレーション計算（エネルギー極小化計算）によって、ＳｐＧのＩｇＧ結合性ドメインとＩｇＧのＦａｂ領域の複合体の構造エネルギーが計算できる。従って、変異導入前後の各々のモデリング構造の構造エネルギーを比較することで、タンパク質複合体の安定性を指標に、変異が与える影響を評価することができる。具体的には、プログラムＳｈｒｉｋｅ（特開２００１－１８４３８１号公報）を用い、溶媒の誘電率に係るパラメータを変えたいくつかのエネルギー極小化計算（力場パラメータ：CHARMM，主鎖α炭素位置束縛：0.01 kcal/A）の計算結果を比較することによって評価した。
　その結果、ＳｐＧのＩｇＧ結合ドメインの第１７位および第３６位が変異部位として適切であることを見出した。第１７位は、ＦａｂのＣＨ１との相互作用界面からは離れたところに位置する。驚くべきことに、第１７位への変異は、溶媒条件によって、Ｆａｂ結合力を極端に損なわない程度に、タンパク質複合体の安定性を変える可能性が示唆された。また、第３６位は、ＦａｂのＣＬとの相互作用界面に位置する。その相互作用界面面積はＣＨ１との相互作用界面に比較するとかなり狭いにもかかわらず、驚くべきことに、第３６位への変異は、溶媒条件によって、Ｆａｂ結合力を極端に損なわない程度にタンパク質複合体の安定性を変える可能性が示唆された。
　その結果として完成した本発明を以下に示す。
　［１］　下記（１）～（３）の何れかの改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド。
　（１）　配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列において、第１７位および第３６位からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが置換導入前に比べて中性側にシフトしているＦａｂ領域結合性ペプチド；
　（２）　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第１７位および第３６位を除く領域中で１個または数個のアミノ酸がさらに欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するＦａｂ領域結合性ペプチドであり、且つ、その酸解離ｐＨが変異導入前に比べて中性側にシフトしているＦａｂ領域結合性ペプチド；
　（３）　上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが変異導入前に比べて中性側にシフトしているＦａｂ領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１７位および第３６位からなる群より選択される１以上の置換アミノ酸残基は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
　［２］　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１７位のアミノ酸残基が置換されている上記［１］に記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド。
　［３］　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１７位がＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、ＬｅｕまたはＩｌｅに置換されている上記［１］または［２］に記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド。
　［４］　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第３６位がＡｌａ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＧｌｕに置換されている上記［１］～［３］のいずれかに記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド。
　［５］　上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記変異の部位が、第６位、第７位、第１０位、第１３位、第１５位、第１８位、第１９位、第２１位、第２４位、第２８位、第２９位、第３０位、第３１位、第３３位、第３５位、第３７位、第３９位、第４０位、第４２位および第４７位からなる群より選択される１以上の部位である上記［１］～［４］のいずれかに記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド。
　［６］　上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記変異の部位がＮ末端および／またはＣ末端である上記［１］～［５］のいずれかに記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド。
　［７］　上記［１］～［６］のいずれかに記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有することを特徴とする改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド多量体。
　［８］　上記［１］～［６］のいずれかに記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドまたは上記［７］に記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。
　［９］　Ｆａｂ領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
　上記［８］に記載のアフィニティー分離マトリックスと、Ｆａｂ領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程と
　アフィニティー分離マトリックスに結合したＦａｂ領域を含むタンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
　［１０］　上記［１］～［６］のいずれかに記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
　［１１］　上記［１０］に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
　［１２］　上記［１１］に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
　本発明によって得られた改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドを不溶性担体に固定化したアフィニティー分離マトリックスは、Ｆａｂ領域含有タンパク質に対して優れた選択的吸着能を示す。その一方で、優れた酸解離特性という互いに相反する特性を示す。ここでの「優れた酸解離特性」とは、より中性側の酸性溶出条件でＦａｂ領域含有タンパク質が解離され、且つ、Ｆａｂ領域含有タンパク質を酸性条件下で溶出させたときの溶出ピーク・プロファイルがよりシャープであるといった特性を指す。クロマトグラフィーの溶出ピークがよりシャープになることで、より少ない容量の溶出液でより高濃度の抗体含有溶出液を回収可能とすることができる。
図１は、ＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄ（配列番号１）の発現プラスミドの作製方法を示す図である。 図２は、各種ＳｐＧ－β１＃変異体をａＴＮＦ－Ｆａｂ固定化担体に添加し、ｐＨ勾配にて溶出した際のアフィニティークロマトグラフィーのチャートである。
　本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドは、下記（１）～（３）の何れかのものである。
　改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）：　配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列において、第１７位および第３６位からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが置換導入前に比べて中性側にシフトしているＦａｂ領域結合性ペプチド；
　改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド（２）：　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第１７位および第３６位を除く領域中で１または数個のアミノ酸がさらに欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するＦａｂ領域結合性ペプチドであり、且つ、その酸解離ｐＨが変異導入前に比べて中性側にシフトしているＦａｂ領域結合性ペプチド；
　改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド（３）：　上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしているＦａｂ領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１７位および第３６位からなる群より選択される１以上の置換アミノ酸残基は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
　「免疫グロブリン（ＩｇＧ）」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、抗原と呼ばれる特定の分子に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、それぞれ２本ずつの軽鎖と重鎖のポリペプチドから構成されている４本鎖“Ｙ”字型構造を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）には、λ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
　免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分のドメインは、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１～ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。ＳｐＧ－βのＩｇＧへの結合は、より詳細には、ＩｇＧのＣＨ１領域（ＣＨ１γ）とＣＬ領域への結合であり、特にＣＨ１への結合が主要である（非特許文献５）。
　本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドは、免疫グロブリンのＦａｂ領域に結合する。本発明ペプチドが結合すべきＦａｂ領域含有タンパク質は、Ｆａｂ領域を含むものであれば特に制限されず、Ｆａｂ領域とＦｃ領域を不足なく含有する免疫グロブリン分子であってもよいし、免疫グロブリン分子の誘導体であってもよい。本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドが結合する免疫グロブリン分子誘導体は、Ｆａｂ領域を有する誘導体であれば特に制限されない。例えば、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域のみに断片化されたＦａｂフラグメント、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、薬剤を共有結合したＦａｂ断片などを挙げることができる。
　本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。タンパク質やペプチドの「変異体」は、野生型のタンパク質やペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の置換、付加または欠失が導入されたタンパク質またはペプチドをいう。アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型または非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、１７位のＴｈｒをＶａｌに置換する変異は、Ｔ１７Ｖと記載する。
　「プロテインＧ（ＳｐＧ）」は、グループＧの連鎖球菌（Streptococcus sp.）の細胞壁に由来するタンパク質である。ＳｐＧは、ほとんどの哺乳類の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と結合する能力を有しており、ＩｇＧのＦｃ領域に強く結合し、ＩｇＧのＦａｂ領域にも弱く結合する。
　ＳｐＧのＩｇＧ結合性を示す機能ドメインは、βドメイン（ＳｐＧ－β）と呼ばれる。なお、β（Ｂ）ドメインと呼ぶ場合と、Ｃドメインと呼ぶ場合の２通りがあり（Akerstrom et al．，J．Biol．Chem．，1987，28，13388-，Fig．5参照）、本明細書では、Fahnestockらの定義に従ってβドメインと呼ぶ（Fahnestock et al．，J．Bacteriol．，1986167，870-）。
　上記改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）に規定されるアミノ酸配列は、基本的にＳｐＧ－βとしての構造・機能を有するアミノ酸配列である。上記改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）としては、Ｆａｂ結合力が向上したＳｐＧ－β変異体が好ましく、例えば、配列番号１～５のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するＳｐＧ－β変異体のさらなる変異体が好ましい。
　本発明における好適な形態の１つとして、上記（１）に規定される配列番号１～５のアミノ酸配列のうち、配列番号２で示される、Ｆａｂ結合力が向上したＳｐＧ－β変異体のアミノ酸配列が好ましい。また、野生型ＳｐＧ－βに本発明を適用することも可能であり、本発明における好適な形態の１つとして、上記（１）に規定される配列番号１～５のアミノ酸配列のうち、グループＧの連鎖球菌のＧＸ７８０９株由来のβ１ドメイン（ＳｐＧ－β１，配列番号３）またはβ２ドメイン（ＳｐＧ－β２，配列番号４）のアミノ酸配列であることが好ましい。本発明における好適な形態の１つとして、熱安定性に優れた変異型ＳｐＧ－βとして、例えば、公知特許文献（特開２００３－８８３８１号公報）に記載のアミノ酸配列（配列番号５）が挙げられる。なお、当該アミノ酸配列は、特開２００３－８８３８１号公報の配列番号８のアミノ酸配列（Ｃ３６ペプチド）に該当する。なお、配列番号１～５に関しては、実験上の理由からＮ末端／Ｃ末端のアミノ酸に改変を加えている場合がある。
　本発明は、配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列に特定のアミノ酸置換変異を導入することによって、Ｆａｂ領域を含むタンパク質の酸解離ｐＨを、変異導入前に比べて中性側にシフトさせることを特徴とする技術である。本発明のＦａｂ領域結合性ペプチド（１）において、特定のアミノ酸置換変異とは、第１７位および第３６位からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換する変異のことであり、変異導入前（置換導入前）のアミノ酸配列とは、配列番号１のアミノ酸配列である。例えば、上記（１）に記載の置換がＴ１７Ａのみであった場合、このペプチドのアミノ酸配列にＡ１７Ｔ（復帰変異）を導入したアミノ酸配列が、置換導入前のアミノ酸配列である。
　本発明における改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）は、後記の実施例において確かめられている通り、より高ｐＨの酸性溶出条件でＦａｂ領域含有タンパク質を解離し、且つ、Ｆａｂ領域含有タンパク質を酸性条件下で溶出させたときの溶出ピークがよりシャープである。
　本発明における改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）の置換導入前のアミノ酸配列としては、配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列が好ましく、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列がより好ましく、配列番号１のアミノ酸配列が最も好ましいが、これらに限定はされない。
　本発明における改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）は、上述の第１７位および第３６位からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を有する。置換される位置としては、第１７位がより好ましい。例えば、配列番号１～５のアミノ酸配列において、第１７位はＴｈｒ、第３６位はＡｓｐである。
　本発明においてペプチドが「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、そのペプチドのアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、そのペプチドの機能が維持されていることを意味する。ペプチドにおいて特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、－Ｓ－Ｓ－結合などの架橋構造などが挙げられる。
　例えばＮ末端にペプチドが付加されたような場合であっても、配列同一性を基準に、配列番号１～５のアミノ酸配列の第１７位および第３６位に相当する位置を同定することは、当業者であれば容易に可能である。例えば、遺伝情報処理ソフトウエアであるＧＥＮＥＴＹＸ（https://www.genetyx.co.jp/）のアラインメント機能を使って位置を特定することが可能である。
　変異後のアミノ酸、即ち配列番号１～５のアミノ酸配列における第１７位のＴｈｒおよび／または第３６位のＡｓｐに置き換わるアミノ酸の種類は、非タンパク質構成アミノ酸や非天然アミノ酸への置換を含め、特に限定されるものではないが、遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸を好適に用いることができる。さらに、天然型アミノ酸は、中性アミノ酸；ＡｓｐとＧｌｕの酸性アミノ酸；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性アミノ酸に分類される。中性アミノ酸は、脂肪族アミノ酸；Ｐｒｏのイミノ酸；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐの芳香族アミノ酸に分類される。脂肪族アミノ酸は、さらに、Ｇｌｙ；Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの分枝アミノ酸；Ｓｅｒ、Ｔｈｒのヒドロキシアミノ酸；Ｃｙｓ、Ｍｅｔの含硫アミノ酸；Ａｓｎ、Ｇｌｎの酸アミドアミノ酸に分類される。また、Ｔｙｒはフェノール性水酸基を有することから、芳香族アミノ酸のみでなくヒドロキシアミノ酸に分類してもよい。さらに、別の観点からは、天然アミノ酸を、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅの疎水性の高い非極性アミノ酸；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒの中性の極性アミノ酸；Ａｓｐ、Ｇｌｕの酸性の極性アミノ酸；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性の極性アミノ酸に分類することもできる。また、酸性条件でプロトネーションする官能基を側鎖に有するアミノ酸であるＨｉｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕを好適に用いることもできる。
　第１７位に置換するアミノ酸としては、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、ＬｅｕまたはＩｌｅが好ましく、ＡｌａまたはＶａｌがより好ましく、Ｖａｌがさらにより好ましい。第３６位で置換するアミノ酸としては、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＧｌｕが好ましく、Ａｌａ、ＶａｌまたはＴｈｒがより好ましく、Ｖａｌがよりさらに好ましい。また、別の観点からは、第１７位と第３６位の両位置において、βシート構造を不安定化する可能性のあるＧｌｙは好ましくない。
　本発明における改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド（２）は、上記（１）のアミノ酸配列において、上記第１７位および第３６位を除く領域中で、１個または数個のアミノ酸残基が、欠失、置換および付加から選択される１以上の変異を付与されたアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが当該変異の導入前に比べて中性側にシフトしているＦａｂ領域結合性ペプチドである。
　本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド（２）に関し、「１個から数個」の範囲とは、欠失などを有する改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドが免疫グロブリンのＦａｂ領域への高い結合力を有する限り特に限定されるものではない。上記「１個から数個」の範囲は、例えば３０個以下とすることができ、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは７個以下、一層好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下、１個以上または２個以下、１個程度であることができる。
　１個または数個の変異位置は、第１７位または第３６位以外であれば、どの部位でも問題ない。例えば、配列番号１～３の間でアミノ酸の種類が異なる部位である、第１０位、第１３位、第１５位、第１８位、第１９位、第２１位、第２８位、第３０位、第３１位、第３３位および第３９位が変異位置として好ましい。また、配列番号３～５の間でアミノ酸の種類が異なる部位である、第６位、第７位、第１９位、第２４位、第２８位、第２９位、第３１位、第３５位、第４０位、第４２位および第４７位も変異位置として好ましい。
　さらに、アミノ酸残基の欠失、置換および／または付加の位置としては、例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端を挙げることができる。これら部位は、特に欠失および／または付加の部位として好ましい。付加するアミノ酸配列の実施形態としては、該ペプチドをマトリックスに固定化する際に有用な、ＬｙｓやＣｙｓを含むアミノ酸配列をＣ末端側に付加することが挙げられる。
　なお、上記の欠失や付加が加わってアミノ酸数が変化した場合であっても、変異導入前におけるアミノ酸残基の位置に対応する変異導入後におけるアミノ酸残基の位置は、変異導入前後のアミノ酸配列のアライメント解析を行えば容易に検索可能である。このようなアライメント解析の手法は、改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）に関して説明したとおり、当業者に広く知られている。
　本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド（３）に関し、配列同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９８％以上がさらに好ましい。上記配列同一性は、改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）に関して説明したとおり、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）などを使って測定することができる。
　但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１７位および第３６位からなる群より選択される１以上の置換アミノ酸残基は、（３）においてさらに変異しないものとする。変異導入前のアミノ酸配列のアミノ酸数が異なる場合においても、配列同一性が８０％以上である場合に、配列番号１～５の第１７位または第３６位に相当する位置を同定することは、当業者であれば容易に可能である。
　本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（１）～（３）は、Ｆａｂ領域含有タンパク質に対する酸解離ｐＨが、置換導入前または変異導入前に比べて中性側にシフトすることを特徴とする。一般的に、強酸条件下や強塩基条件下では、分子表面電荷の変化や変性による立体構造の変化が要因となって、ペプチド間の結合は失われる。「酸解離ｐＨ」とは、酸性側（値が７より小さいｐＨ）でその特異的結合が失われ解離するｐＨのことである。酸解離ｐＨは、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（１）～（３）をリガンドとするアフィニティー分離マトリックスに吸着したＦａｂ領域含有タンパク質を分離（溶出）することが可能な、最も高いｐＨ値ということができる。よって、本明細書においては、酸解離ｐＨと酸溶出ｐＨは、基本的には同義である。酸解離ｐＨが「置換導入前または変異導入前に比べて中性側にシフトする」というのは、結合の解離に必要なｐＨの数値が、置換または変異の導入前の方が小さく、置換または変異の導入後の方が大きいということを意味する。即ち、置換または変異の導入後の方が、より弱い酸性溶液で結合が解離するということを意味する。
　酸解離ｐＨの数値は、Ｆａｂ領域含有タンパク質の種類、酸性溶液のバッファー成分の種類や濃度などによっても変わり、アフィニティー分離マトリックスの場合には、水不溶性担体の種類・構造やリガンド固定化用リンカーの種類・構造によっても変わるので、一義的に数値の範囲で示すのは難しい。一般的には、変異を導入する前の酸解離ｐＨは２．０以上３．５以下程度であるのが、本発明に係る変異を導入することによって、ｐＨ３．０以上４．５以下程度にシフトするが、これには限定されない。この条件下で溶出すると、抗体へのダメージが小さい（Ghose S．ら，Biotechnology and bioengineering，2005年，92巻，6号）。本発明に係る変異を導入することによって、酸解離ｐＨは、ｐＨ値にして０．１以上中性側にシフトすることが好ましく、ｐＨ値にして０．２以上中性側にシフトすることがより好ましく、ｐＨ値にして０．３以上中性側にシフトすることがさらにより好ましく、ｐＨ値にして０．４以上中性側にシフトすることがさらにより好ましく、ｐＨ値にして０．５以上中性側にシフトすることがさらにより好ましい。
　変異導入前後の酸解離ｐＨを評価する方法は、生体分子間相互作用を検出できる手法であれば特に限定はされないが、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社）などのバイオセンサーによって試験することができる。酸解離ｐＨの測定方法としては、例えば、結合する一方のペプチドまたはタンパク質をセンサーチップに固定化し、所望のｐＨに調整したもう一方のタンパク質溶液またはペプチド溶液を流路に添加し、結合シグナルの有無を検出し、結合シグナルが検出できなくなるｐＨを評価すればよいが、これに限定されない。別の方法としては、ペプチド溶液またはタンパク質溶液を添加した後に、所望のｐＨの緩衝液を添加し、添加した前後でのチップ上で解離せずに残った結合シグナルの変化を評価してもよい。測定条件としては、温度は２０～４０℃の一定温度にし、結合状態を見るときのｐＨはｐＨ５～８の中性条件にすることが好ましい。緩衝液の成分としては、中性の場合には、リン酸、トリス、ビストリスなどが挙げられ、酸性の場合には、酢酸、クエン酸、グリシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液のＮａＣｌ濃度は、特に限定はされないが、０～０．１５Ｍ程度が好ましく、特に解離状態を見るときは０Ｍが好ましい。この評価においては、変異導入前後の違いを比較するために、変異以外の条件を全て揃えることが重要である。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを用いた評価では、Ｆａｂ領域結合性ペプチドを、チップに固定化する側（固相）としてもよいし、流路添加する側（液相）としても、どちらでも評価は可能である。例えば、Ｆａｂ領域結合性ペプチドをチップに固定化する量を揃えるのが難しい場合には、流路添加する際の濃度を揃えてＦａｂ領域結合性ペプチドを流路添加する方が好ましい。
　酸解離ｐＨを評価する方法として、アフィニティー分離マトリックスを用いて、クロマトグラフィー・プロファイルを評価する方法も好ましい。例えば、結合する一方のペプチドまたはタンパク質をクロマトグラフィー用カラムに固定化し、そのカラムをクロマトグラフィー装置に接続した後で、もう一方のタンパク質溶液またはペプチド溶液をそのカラムに添加し、ｐＨを徐々に下げる直線勾配をかけて吸着したタンパク質またはペプチドが溶出したピークトップのｐＨを評価すればよいが、これに限定されない。測定時の温度、緩衝液、塩濃度などは上述の条件に従うのが好ましいが、特に限定されない。例えば、鮮明なｐＨ直線勾配を得る為に、結合用緩衝液（緩衝液Ａ）と解離用緩衝液（緩衝液Ｂ）の成分はｐＨ以外同一とすることが好ましい。この評価においても、変異導入前後の違いを比較するために、変異以外の条件を全て揃えることが重要である。この評価系においても、Ｆａｂ領域結合性ペプチドを、カラムに固定化する側（固相）としてもよいし、添加して溶出する側（液相）としても、どちらでも評価は可能である。例えば、Ｆａｂ領域結合性ペプチドをカラムに固定化する量を揃えるのが難しい場合には、カラムに添加する際の濃度を揃えてＦａｂ領域結合性ペプチドを添加し、得られたクロマトグラフィー・プロファイルを重ねて比較する方が好ましい。
　プロテインＧは、免疫グロブリン結合性ドメインを２個または３個タンデムに並んだ形で含むタンパク質である。本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドも、実施形態の１つとして、単量体または単ドメインである当該改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限は、例えば１０個、好ましくは８個、より好ましくは６個である。これらの多量体は、単一の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドの連結体であるホモダイマーやホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、複数種類の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマーやヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
　本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドの連結のされ方としては、１個または複数個のアミノ酸残基で連結する方法、および、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは１残基以上２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下であり、さらにより好ましくは５残基以下であり、さらにより好ましくは２残基以下である。好ましくは、野生型ＳｐＧのβ１とβ２の間、または、β２とβ３の間を連結している配列を利用するのがよい。また、別の観点からは、単量体改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドの３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
　また、本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドは、改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）～（３）で規定するアミノ酸配列を有するものであればよく、他のペプチドや化合物などが結合していてもよいものとする。例えば、本発明の実施形態の１つとして、本発明により得られる改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド、または、当該ペプチドが２個以上連結された多量体が、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドが挙げられる。融合ペプチドの例としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたペプチドの有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
　本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）～（３）は、アフィニティー・リガンドとしてカラムに保持可能であり、優れたＦａｂ結合力を示す。Ｆａｂ領域に対する親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステムなどのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。
　結合パラメータとしては、例えば、親和定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田ら著，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。親和定数は、結合速度定数（ｋon）を解離速度定数（ｋoff）で除した値である（ＫA＝ｋon／ｋoff）。
　本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドとＦａｂ領域含有タンパク質との親和定数は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにＦａｂ領域含有タンパク質を固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドを流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係る変異を導入した配列を有するペプチドについて、Ｆａｂ領域含有タンパク質との親和定数（ＫA）が、１×１０5Ｍ-1以上であることがより好ましく、５×１０5Ｍ-1以上であることがよりさらに好ましい。しかし、親和定数は、Ｆａｂ領域含有タンパク質の種類や、Ｆａｂ領域結合性ペプチドのドメイン数によっても変わるので、これに限定されない。
　本発明は、上記の本発明ペプチドを、免疫グロブリンやその断片、特にＦａｂ領域に親和性を有することを特徴とするアフィニティーリガンドとして利用することも、実施形態の１つとして包含する。同様に、当該リガンドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするアフィニティー分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。ここで「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に結合して捕集する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同義である。
　本発明で用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；有機担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機－有機、有機－無機などの複合担体などが挙げられる。有機担体としては、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子担体や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類担体を挙げることができる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
　また、本発明に用いる水不溶性担体は、本発明のアフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
　リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシ基またはチオール基を利用した従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
　また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与したＦａｂ領域結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
　本発明のアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのＦａｂ領域を含むタンパク質をアフィニティーカラム・クロマトグラフィー精製法により分離精製することが可能となる。これらの免疫グロブリンＧのＦａｂ領域を含むタンパク質の精製法は、免疫グロブリンのアフィニティーカラム・クロマトグラフィー精製法、例えばＳｐＡアフィニティー分離マトリックスを利用した精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。即ち、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域を含むタンパク質を含有する緩衝液を調製（ｐＨは中性付近）した後、当該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させるなどして接触させ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域を含むタンパク質を吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の免疫グロブリンＧのＦａｂ領域を含むタンパク質は、カラム内の本発明に係るアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明ペプチドをリガンドとして固定化したアフィニティー分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とする免疫グロブリンＧのＦａｂ領域を含むタンパク質を吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望の免疫グロブリンＧのＦａｂ領域を含むタンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。溶出に用いる酸性緩衝液には、マトリックスからの解離を促進する物質を添加してもよい。
　特に、本発明のアフィニティー分離マトリックスでは、より中性側に近いｐＨの酸性緩衝液を溶出液として用いることが可能である。用いる酸性緩衝液としては、ｐＨ値がｐＨ３．０以上であることが好ましく、ｐＨ３．１以上であることがより好ましく、ｐＨ３．２以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．３以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．４以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．５以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．６以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．７以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．８以上であることがさらにより好ましい。用いる酸性緩衝液の上限は特に無いが、アフィニティークロマトグラフィーにおける中間洗浄でｐＨ５．０程度で洗浄する場合や、精製後にウイルス除去のためにｐＨ３．８程度でインキュベーションする場合においては、用いる酸性緩衝液はｐＨ４．５以下であることが好ましく、ｐＨ４．０以下であることがより好ましい。
　本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性または強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。上記の再生用緩衝液には、適当な変性剤や有機溶剤を配合してもよい。
　本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性または強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。当該洗浄液としては、適当な変性剤や有機溶剤を含む溶液も使用できる。
　本発明は、本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドをコードするＤＮＡにも関する。本発明ペプチドをコードするＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が本発明ペプチドを構成するものであればいかなるものでもよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、「ＰＣＲ」と略記する）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。当該塩基配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、当該組換えＤＮＡを含むプラスミドおよびファージなどのベクター、さらには、当該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換体、当該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、および、当該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることができる。
　また、本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。即ち、本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドを含む融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物または細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。
　本発明のペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法などを用いて行うことができる。即ち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成などによって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
　また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および－鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。また、本発明の単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法に関して、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。
　本発明の「発現ベクター」は、前述した本発明ペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、本発明ペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。
　本発明の形質転換体は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
　本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドは、前記した形質転換体を培地で培養し、培養体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）または培養液中（細胞外）に本発明のペプチドを生成蓄積させ、該培養物から所望のペプチドを採取することにより製造することができる。また、本発明ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）または培養液中（細胞外）に、本発明ペプチドを含む融合タンパク質を生成蓄積させ、当該培養物から当該融合ペプチドを採取し、当該融合ペプチドを適切なプロテアーゼによって切断し、所望のペプチドを採取することにより製造することができる。
　本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、本発明ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することができる。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩などの無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
　さらに、形質転換体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、即ち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
　さらに、本発明に係る改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい。かかる分子シャペロンは、例えば、共発現または融合タンパク質化などの手法で、本発明のペプチドと共存させる。なお、本発明ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える手法や低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
　大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）、または、２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％，酵母エキス１．０％，ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。また、培養温度は、例えば１５～４２℃、好ましくは２０～３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間～数日培養することにより、本発明ペプチドを培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）または培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。
　本発明に係るペプチドの精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のタンパク質であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
　本願は、２０１５年２月２６日に出願された日本国特許出願第２０１５－３６４２４号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１５年２月２６日に出願された日本国特許出願第２０１５－３６４２４号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　以下の実施例で取得した変異ペプチドは「ドメイン－導入した変異」の形で表記し、置換変異導入前のペプチドは、「ドメイン－Ｃｏｎｔ」の形で表記する。例えば、配列番号１で示されるＦａｂ結合力が向上したＳｐＧ－β１変異体（ＳｐＧ－β１＃）は「ＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ」、配列番号１のアミノ酸配列に対し第１７位のＴｈｒをＡｌａに置換した変異（Ｔ１７Ａ）を導入したＳｐＧ－β１変異体は「ＧＢ１＃－Ｔ１７Ａ」と表記する。２種類の変異を同時に導入した変異体の表記については、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｔ１７ＡおよびＤ３６Ｖを導入したＳｐＧ－β１＃変異体は、「ＧＢ１＃－Ｔ１７Ａ／Ｄ３６Ｖ」と表記する。
　また、単ドメインを複数連結したペプチドについては、ピリオドに続けて連結した数に「ｄ」をつけて併記する。例えば、変異Ｔ１７ＡおよびＤ３６Ｖを導入したＳｐＧ－β１＃変異体を２連結したペプチドは、「ＧＢ１＃－Ｔ１７Ａ／Ｄ３６Ｖ．２ｄ」と表記する。さらに、例えば、水不溶性基材にペプチドを固定化するために、Ｃ末端に固定化用官能基を有するＣｙｓ残基（Ｃ）を導入した場合、「ｄ」の後ろに導入したアミノ酸の１文字表記を付与する。例えば、変異Ｔ１７ＡおよびＤ３６Ｖを導入したＳｐＧ－β１＃変異体を２連結してＣ末端にＣｙｓを付与したＳｐＧ－β１＃変異体は、「ＧＢ１＃－Ｔ１７Ａ／Ｄ３６Ｖ．２ｄＣ」と表記する。
　実施例１：各種ＳｐＧ－β１＃変異体の調製
　（１）　各種ＳｐＧ－β１＃変異体の発現プラスミド調製
　各種ＳｐＧ－β１＃変異体発現プラスミドの調製は、ＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄ（比較例となる置換変異導入前のペプチド）の発現プラスミドを鋳型プラスミドとして、それに変異を導入することによって調製した。
　最初に、ＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄ（配列番号１）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号６）を設計した。次に、図１に示す方法によって、コードＤＮＡの調製および発現用プラスミドへの挿入を行った。ＧＢ１＃－Ｔ１７Ａ．１ｄをコードするＤＮＡは、同じ制限酵素サイトを有する２種の二本鎖ＤＮＡ（ｆ１とｆ２）を連結する形で調製し、発現ベクターのマルチクローニングサイトに組み込んだ。実際には、２種の二本鎖ＤＮＡと発現ベクターの計３種の二本鎖ＤＮＡを連結する３断片ライゲーションによって、コードＤＮＡ調製とベクター組込みを同時に実施した。２種の二本鎖ＤＮＡの調製方法は、互いに３０塩基程度の相補領域を含む２種の一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ１－１／ｆ１－２、または、ｆ２－１／ｆ２－２）を、オーバーラップＰＣＲによって伸長し、目的の二本鎖ＤＮＡを調製した。具体的な実験操作については、次の通りとなる。一本鎖オリゴＤＮＡｆ１－１（配列番号７）／ｆ１－２（配列番号８）を外注によって合成し（シグマジェノシス社）、ポリメラーゼとしてＢｌｅｎｄ　Ｔａｑ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏ５２Ｉ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。同様に、一本鎖オリゴＤＮＡｆ２－１（配列番号９）／ｆ２－２（配列番号１０）を外注によって合成し、オーバーラップＰＣＲ反応を経て、合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素Ｅｃｏ５２ＩとＥｃｏＲＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。
　上記プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１を用いて、コンピテント細胞（タカラバイオ社「大腸菌ＨＢ１０１」）の形質転換を、本コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。上記プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１を用いれば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と略記する）が融合したＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄを産生することができる。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社製「3130xl Genetic Analyzer」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Applied Biosystems社製「BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit」）と、プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１のシークエンシング用ＤＮＡプライマー（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キットApplied Biosystems社製「BigDye XTerminator Purification Kit」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。
　各種ＳｐＧ－β１＃変異体をコードするＤＮＡに関しては、第１７位に変異を導入する場合と第３６位に変異を導入する場合とにおいて、方法を変えて調製した。第１７位に変異を導入する場合には、上記ＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄ発現プラスミドを鋳型とし、配列番号１１～１２のＤＮＡプライマーとｐＧＥＸ－６Ｐ－１シークエンシング用ＤＮＡプライマー（３’側）を用いたＰＣＲ反応にて、制限酵素を用いてｐＧＥＸ－６Ｐに挿入可能な二本鎖ＤＮＡを調製した。このＰＣＲ反応は、Ｂｌｅｎｄ　Ｔａｑ　－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、添付のプロトコルに従い行った。この二本鎖ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩにて切断し、上述と同様の手法にて、ｐＧＥＸ－６Ｐ－１のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトでライゲーションすることで、第１７位に変異が導入された各種ＳｐＧ－β１＃変異体の発現プラスミドを調製した。第３６位に変異を導入する場合には、配列番号１３のＤＮＡプライマーとｐＧＥＸ－６Ｐ－１シークエンシング用ＤＮＡプライマー（３’側）を用いた同様のＰＣＲ反応にて、図１のｆ２に相当する二本鎖ＤＮＡを調製した。この二本鎖ＤＮＡおよびＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄ発現プラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２ＩとＥｃｏＲＩで切断し、上述と同様の手法にて、ライゲーションすることで、第３６位に変異が導入されたＳｐＧ－β１＃変異体の発現プラスミドを調製した。形質転換、塩基配列解析に関しては、上記と同様の手法にて実施した。各々の変異体を作るときに使用したＤＮＡプライマーの塩基配列、変異体をコードするｃＤＮＡの塩基配列、および、変異体のアミノ酸配列の配列番号を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（２）　各種ＳｐＧ－β１＃変異体の調製
　上記（１）で得られた、各種ＳｐＧ－β１＃変異体遺伝子を導入した各形質転換細胞を、アンピシリン含有２×ＹＴ培地にて、３７℃で終夜培養した。これらの培養液を、１００倍量程度のアンピシリン含有２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で約１時間、その後２５℃で約１時間培養した後で、終濃度０．１ｍＭになるようイソプロピル１－チオ－β－Ｄ－ガラクシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに２５℃にて約１８時間培養した。
　培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動により分析したところ、各々の形質転換細胞培養液から調製した各種無細胞抽出液のすべてについて、分子量約２５，０００以上の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられるペプチドのバンドを確認した。なお、分子量はほぼ同様であるが、変異体の種類によってバンドの位置は違った。
　ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ　ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ　ＦＦカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。後の実施例で、ＧＳＴを融合したままでアッセイに利用したサンプルは、この溶出液を遠心式フィルターユニットであるアミコン（メルクミリポア社）を用いて、濃縮した形で標準緩衝液に置換したペプチド溶液を用いた。
　ｐＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターのマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、配列特異的プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）でＧＳＴを切断することが可能なアミノ酸配列が、ＧＳＴと目的ペプチドの間に導入される。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅを用いて、添付プロトコルに従いＧＳＴ切断反応を行った。このようにＧＳＴを切断した形でアッセイに利用したサンプルから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて、目的のペプチドを精製した。標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のペプチドを、切断したＧＳＴやＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅから分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィーによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。また、本実施例で得られるＧＳＴ切断後の各々のペプチドは、Ｎ末端側にベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１由来のＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－ＳｅｒがＮ末端側に付加されたアミノ酸配列を有する。
　実施例２：各種ＳｐＧ－β１＃変異体のａＴＮＦ－Ｆａｂへの親和性評価
　（１）　Ｆａｂフラグメントの調製
　ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤を原料として、これをパパインによって、ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントに断片化し、Ｆａｂフラグメントのみを分離精製した。具体的には、抗ヒトＴＮＦαモノクローナルＩｇＧ（一般名「インフリキシマブ」，製品名「レミケード」，田辺三菱製薬）製剤を、パパイン消化用緩衝液（０．１Ｍ　ＡｃＯＨ－ＡｃＯＮａ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ，１ｍＭシステイン，ｐＨ５．５）に溶解し、Ｐａｐａｉｎ　Ａｇａｒｏｓｅ　ｆｒｏｍ　ｐａｐａｙａ　ｌａｔｅｘパパイン固定化アガロース（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、ローテーターで混和させながら、３７℃で約８時間インキュベートした。パパイン固定化アガロースから分離した反応溶液（ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントが混在）から、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、素通り画分でＩｇＧ－Ｆａｂを回収することで分離精製した。分取したＩｇＧ－Ｆａｂ溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラム（平衡化および分離には標準緩衝液を使用）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて精製し、ＩｇＧ－Ｆａｂ溶液（ａＴＮＦ－Ｆａｂ）を得た。なお、実施例１と同様に、クロマトグラフィーによるペプチド精製は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステムを利用して実施した。
　（２）　各種ＳｐＧ－β１＃変異体のＦａｂに対する親和性の解析
　表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、実施例１（２）で取得した各種ＳｐＧ－β１＃変異体の、ａＴＮＦ－Ｆａｂとの親和性を解析した。本実施例では、実施例２（１）で取得したａＴＮＦ－Ｆａｂをセンサーチップに固定化し、各種ペプチドをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ａＴＮＦ－ＦａｂのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）。ａＴＮＦ－Ｆａｂ溶液は、固定化用緩衝液（１０ｍＭ　ＡｃＯＨ－ＡｃＯＮａ，ｐＨ４．５）を用いて１０倍程度に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ　３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後、何も固定化反応させずに、エタノールアミンでブロックした、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。各種ＳｐＧ－β１＃変異体は、ランニング緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．００５％　Ｐ－２０，ｐＨ７．４）を用いて、０．０１、０．１、１または１０μＭに濃度を調整したタンパク質溶液を流速４０μＬ／ｍｉｎで１分間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相，１分）、および添加終了後（解離相，１分）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、約２０ｍＭ　ＮａＯＨを添加して洗浄した。得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ａＴＮＦ－Ｆａｂに対する親和定数（ＫA＝ｋon／ｋoff）を算出した。比較例２で測定したＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄの各種結合パラメータと共に、解析結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示す結果のとおり、Ｔ１７Ａ、Ｔ１７ＶおよびＤ３６Ｖの変異を導入した変異体は、変異導入前のＳｐＧ－β１＃（ＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄ）のａＴＮＦ－Ｆａｂに対する親和定数ＫAと比較して低いＫA値を示した。しかし、その数値は５×１０5（１／Ｍ）以上であり、１／１０以下の大幅な結合力低下は見られなかった。Ｆａｂ結合力は、リガンドとして相手分子をカラムに保持できればよく、結合力が強過ぎると溶出には不利に働く可能性もあるので、５×１０5（１／Ｍ）以上であれば、リガンドとして問題なく機能すると考えられる。
　実施例３：　各種ＳｐＧ－β１＃変異体のａＴＮＦ－Ｆａｂの酸解離ｐＨの評価
　（１）Ｆａｂフラグメント固定化担体の調製
　カップリング目的官能基をアミノ基とする市販のリガンド固定化用カップリングカラムを利用して、実施例２で得られたａＴＮＦ－Ｆａｂを固定化したアフィニティー分離マトリックスを作製した。
　水不溶性基材として、市販のプレパックカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社製「Hitrap NHS activated HP」）１ｍＬを使用した。このカラムは、架橋アガロースをベースとし、カップリング目的官能基をアミノ基とするペプチド性リガンド固定化用の活性基が導入済みなので、製品マニュアルに従ってリガンドを固定化した。氷浴で冷やした１ｍＭ　ＨＣｌを、流速１ｍＬ／ｍｉｎで２ｍＬ分流す操作を３回行い、カラム中のイソプロパノールを除去した。
　その後すぐに、カップリング緩衝液（０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ3，０．５Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．３）でａＴＮＦ－Ｆａｂを１ｍｇ／ｍＬに希釈した溶液を同じ流速で１ｍＬ添加し、カラムの上下に栓をして２５℃で３０分間静置することで、取得したリガンドをカラムに固定化した。
　その後開栓し、カップリング緩衝液を同じ流速で３ｍＬ流して、未反応ａＴＮＦ－Ｆａｂを回収した。その後、ブロッキング用緩衝液（０．５Ｍエタノールアミン，０．５Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．３）を２ｍＬ流す操作を３回実施し、洗浄用緩衝液（０．１Ｍ酢酸，０．５Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ４．０）を２ｍＬ流す操作を３回実施した。ブロッキング用緩衝液と洗浄用緩衝液を流す一連の操作は交互に３回ずつ行った。最後に標準緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を２ｍＬ流してアフィニティー分離カラムの作製を完了した。
　（２）　Ｆａｂフラグメント固定化担体を用いたクロマトグラフィー実験
　実施例１（２）で調製した各種ＳｐＧ－β１＃変異体を、実施例３（１）で調製したａＴＮＦ－Ｆａｂ固定化カラムを利用したアフィニティー精製クロマトグラフィーにより、各種ＳｐＧ－β１＃変異体の溶出ピークトップにおけるｐＨ（酸解離ｐＨ）を解析した。具体的には、クロマトシステムとしては、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステムを利用し、イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ　クエン酸－クエン酸Ｎａ，ｐＨ５．５）にて平衡化したカラムに、約０．１ｍｇ／ｍＬに調整した各種ＳｐＧ－β１＃変異体のタンパク質溶液を０．１ｍＬ添加し、ｐＨ５．５からｐＨ２．５へのｐＨ直線勾配にて溶出させた。より具体的には、イオン交換緩衝液Ａとイオン交換緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　ＡｃＯＨ－ＡｃＯＮａ，１Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ２．５）を利用しており、カラムに２０カラムボリューム分の緩衝液を通液する際に、緩衝液Ｂの濃度を０％から１００％に直線的に上げていく工程にて、溶出位置から酸解離ｐＨを評価した。各々の溶出位置（ピークトップ）におけるｐＨ値を、比較例３の結果も併せて表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　また、各種ＳｐＧ－β１＃変異体に関し、比較例３の変異導入前のＳｐＧ－β１＃との比較もできる形で重ね合わせたクロマトグラフィーのチャートを図２に示す。
　表３と図２に示した結果のとおり、本発明で得られた各種ＳｐＧ－β１＃変異体（ＧＢ１＃－Ｔ１７Ａ．１ｄ，ＧＢ１＃－Ｔ１７Ｖ．１ｄ，およびＧＢ１＃－Ｄ３６Ｖ．１ｄ）が、変異を導入していないＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄよりも早く溶出した。これは、より中性側に近いｐＨで各種ＳｐＧ－β１＃変異体が溶出されることを示している。即ち、本発明のペプチドは、Ｆａｂ領域含有タンパク質と解離するｐＨがより中性側に改変されたことが示されたといえる。また、この実験系においては、ｐＨ５．５ではＦａｂとの結合が担体に保持される程度に強いことを示唆する結果であり、本発明で得られたペプチドをリガンドとするアフィニティー分離マトリックスでは、この程度のｐＨで中間洗浄することが可能であると考えられる。
　比較例１：　ＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄ（ＳｐＧ－β１＃）の調製
　実施例１にて調製したＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄの発現プラスミドを用いて、実施例１と同様の手法にて形質転換細胞を調製し、培養と精製を経て、ＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄの溶液を調製した。
　比較例２：　ＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄのａＴＮＦ－Ｆａｂへの親和性評価
　比較例１で調製したＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄに関し、実施例２（１）で調製したａＴＮＦ－Ｆａｂとの親和性を、実施例２（２）と同様の手法にて解析した。その解析結果を、上記の表２に併せて示した。
　比較例３：　ＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄのａＴＮＦ－Ｆａｂの酸解離ｐＨ評価
　比較例１で調製したＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ．１ｄに関し、実施例３（１）で調製したａＴＮＦ－Ｆａｂ固定化担体を用いて、実施例３（２）と同様の手法にて酸解離ｐＨを解析した。その解析結果を、上記の表３に併せて示した。

Claims (12)

  1. 　下記（１）～（３）の何れかの改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド。
    　（１）　配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列において、第１７位および第３６位からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが置換導入前に比べて中性側にシフトしているＦａｂ領域結合性ペプチド；
    　（２）　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第１７位および第３６位を除く領域中で１個または数個のアミノ酸がさらに欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するＦａｂ領域結合性ペプチドであり、且つ、その酸解離ｐＨが変異導入前に比べて中性側にシフトしているＦａｂ領域結合性ペプチド；
    　（３）　上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが変異導入前に比べて中性側にシフトしているＦａｂ領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１７位および第３６位からなる群より選択される１以上の置換アミノ酸残基は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
  2. 　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１７位のアミノ酸残基が置換されている請求項１に記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド。
  3. 　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１７位がＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、ＬｅｕまたはＩｌｅに置換されている請求項１または２に記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド。
  4. 　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第３６位がＡｌａ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＧｌｕに置換されている請求項１～３のいずれかに記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド。
  5. 　上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記変異の部位が、第６位、第７位、第１０位、第１３位、第１５位、第１８位、第１９位、第２１位、第２４位、第２８位、第２９位、第３０位、第３１位、第３３位、第３５位、第３７位、第３９位、第４０位、第４２位および第４７位からなる群より選択される１以上の部位である請求項１～４のいずれかに記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド。
  6. 　上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記変異の部位がＮ末端および／またはＣ末端である請求項１～５のいずれかに記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド。
  7. 　請求項１～６のいずれかに記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有することを特徴とする改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド多量体。
  8. 　請求項１～６のいずれかに記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドまたは請求項７に記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。
  9. 　Ｆａｂ領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
    　請求項８に記載のアフィニティー分離マトリックスと、Ｆａｂ領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程と
    　アフィニティー分離マトリックスに結合したＦａｂ領域を含むタンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
  10. 　請求項１～６のいずれかに記載の改変型Ｆａｂ領域結合性ペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
  11. 　請求項１０に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
  12. 　請求項１１に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
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