WO2016132736A1 - イリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助する方法 - Google Patents

イリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助する方法 Download PDF

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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for assisting in predicting the risk of occurrence of side effects caused by irinotecan, and a probe or primer for use in single nucleotide polymorphism analysis in such a method.
  • Irinotecan (CPT-11: 1,4'-bipiperidine-1'-carboxylic acid (S) -4,11-diethyl-3,4,12,14-tetrahydro-4-hydroxy-3,14-dioxo-1H- Pyrano [3 ', 4': 6,7] Indolizino [1,2-b] quinolin-9-yl ester (CAS NO: 97682-44-5)) is derived from camptothecin, an antitumor alkaloid derived from canrenboku. It is a synthesized anticancer agent and is known to be useful for treating cancers such as lung cancer and metastatic colorectal cancer. Irinotecan exhibits an excellent anticancer effect by inhibiting the enzyme topoisomerase that promotes DNA replication. However, serious side effects such as leucopenia, neutropenia and diarrhea have been reported.
  • UGT1A1 gene polymorphism (UGT1A1 * 28, UGT1A1 * 6, UGT1A1 * 27, UGT1A1 * 60, etc.), which is one of the genes encoding glucuronosyltransferase (UGT), is detected. Therefore, methods for predicting the side effects of irinotecan have been proposed (see Patent Documents 1 to 4 and Non-Patent Documents 1 and 2), and these methods are used to predict the side effects of irinotecan and use them as indicators for personalized medicine. Has been.
  • kits manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.
  • UGT1A1 * 28 and UGT1A1 * 6 are sold for the purpose of predicting the presence or absence of irinotecan side effects.
  • an object of the present invention is to provide a simple and efficient means for predicting the risk of side effects caused by irinotecan by analyzing single nucleotide polymorphisms in a region encoding a specific gene.
  • a single nucleotide polymorphism in the region encoding the APCDD1L gene, R3HCC1 gene, OR51I2 gene, MKKS gene, EDEM3 gene, or ACOX1 gene, or a single nucleotide polymorphism in linkage disequilibrium or genetic linkage with the single nucleotide polymorphism was completed by finding that the type is a factor that assists in predicting the risk of occurrence of side effects caused by irinotecan, and that the single nucleotide polymorphism and UGT1A gene polymorphism do not link (correlate).
  • the present invention is as follows. (1) a single nucleotide polymorphism in a region encoding APCDD1L gene, R3HCC1 gene, OR51I2 gene, MKKS gene, EDEM3 gene, or ACOX1 gene present on genomic DNA in a biological sample collected from a subject, or Analyze single nucleotide polymorphisms that are in linkage disequilibrium or genetic linkage with single nucleotide polymorphisms, and determine whether the variant type has homo, wild type homo, or hetero A method to determine and assist in predicting the risk of side effects from irinotecan.
  • the single nucleotide polymorphism in the region encoding APCDD1L gene, R3HCC1 gene, OR51I2 gene, MKKS gene, EDEM3 gene, or ACOX1 gene is any of the following (a) to (g) The method according to (1) above.
  • A a nucleotide sequence encoding the APCDD1L gene represented by SEQ ID NO: 1, or a single nucleotide polymorphism present at the 186th base of its complementary sequence
  • B a single nucleotide polymorphism present at the 358th base of the base sequence encoding the R3HCC1 gene shown in SEQ ID NO: 2 or its complementary sequence
  • C a single nucleotide polymorphism present at the 400th base of the base sequence encoding the OR51I2 gene shown in SEQ ID NO: 3 or its complementary sequence
  • D a single nucleotide polymorphism present at the 1549th base of the base sequence encoding the MKKS gene shown in SEQ ID NO: 4
  • E a single nucleotide polymorphism present at the 2459th base of the nucleotide sequence encoding the EDEM3 gene shown in SEQ ID NO: 5
  • F a single nucleotide polymorphis
  • a probe for use in single nucleotide polymorphism analysis according to any one of the following (h) to (n) according to any one of (1) to (4) above: (H) a base sequence encoding the APCDD1L gene shown in SEQ ID NO: 1 or a sequence of 5 to 50 bases including a single nucleotide polymorphism site present at the 186th base of its complementary sequence and stringent conditions
  • a primer comprising an oligonucleotide capable of amplifying at least 5 consecutive bases including a single nucleotide polymorphic site present at the 186th base of the base sequence encoding the APCDD1L gene represented by SEQ ID NO: 1;
  • P a primer comprising an oligonucleotide capable of amplifying at least 5 consecutive bases including a single nucleotide polymorphic site present at the 358th base of the base sequence encoding the R3HCC1 gene represented by SEQ ID NO: 2;
  • Q a primer comprising an oligonucleotide capable of amplifying at least 5 consecutive bases including a single nucleotide polymorphism site present at the 400th base of the base sequence encoding the OR51I2 gene shown in SEQ ID NO: 3;
  • R a primer comprising an oligonucleotide capable of amplifying at least 5 consecutive bases including a single nucleotide polymorphic site present at the 1549th
  • the present invention it is possible to assist in predicting the risk of side effects caused by irinotecan.
  • By predicting side effects in individual patients using such a method it becomes possible to perform treatment with an anticancer agent appropriate for individual cancer patients, so-called personalized medicine.
  • APCDD1L gene, R3HCC1 gene, OR51I2 gene, MKKS gene, EDEM3 gene present on genomic DNA in a biological sample collected from a subject Or whether a single nucleotide polymorphism in the region encoding the ACOX1 gene, or a single nucleotide polymorphism in linkage disequilibrium or genetic linkage with the single nucleotide polymorphism, is analyzed and has a variant type (minor allele) as a homozygote It is not particularly limited as long as it is a method for determining whether it has a wild type (major allele) as a homozygous or heterozygous and assists in predicting the risk of side effects caused by irinotecan, Also included are their salts and their solvates, especially hydrates (eg CAS NO: 136572-09-3).
  • an acid addition salt in which a pharmaceutically acceptable acid is allowed to act is preferably used as an anticancer agent.
  • acid addition salts include salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid; oxalic acid, maleic acid, fumaric acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, acetic acid And salts with organic acids such as p-toluenesulfonic acid and methanesulfonic acid, and particularly hydrochloride (irinotecan hydrochloride; CAS ; NO: 136572-09-3).
  • the biological sample collected from the subject is not particularly limited as long as it contains genomic DNA.
  • Blood and blood-related samples blood, serum, plasma, etc.
  • lymph, sweat, tears, saliva And body fluids such as urine, stool, ascites and cerebrospinal fluid, and crushed cells and extracts of cells, tissues or organs, and blood-related samples are preferable.
  • the extraction means for extracting genomic DNA from a biological sample collected from a subject is not particularly limited, and is preferably a means capable of directly separating, purifying and recovering DNA components from the biological sample.
  • the single nucleotide polymorphism in the region encoding the APCDD1L gene is the nucleotide sequence encoding the APCDD1L gene shown in SEQ ID NO: 1, or its complementary sequence It is preferably a single nucleotide polymorphism existing at the 186th or 238th base, and this single nucleotide polymorphism is the reference number of NCBI SNP database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/).
  • the single nucleotide polymorphism in the region encoding the R3HCC1 gene includes the nucleotide sequence encoding the R3HCC1 gene shown in SEQ ID NO: 2 or a complementary sequence thereof.
  • a single nucleotide polymorphism present at the 358th base is preferred, and this single nucleotide polymorphism is registered as rs2272761 (SEQ ID NO: 9).
  • the single nucleotide polymorphism in the region encoding the OR51I2 gene includes the nucleotide sequence encoding the OR51I2 gene shown in SEQ ID NO: 3 or a complementary sequence thereof.
  • a single nucleotide polymorphism present at the 400th base is preferred, and this single nucleotide polymorphism is registered as rs12577167 (SEQ ID NO: 10).
  • nucleotide sequence encoding the MKKS gene shown in SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence The single nucleotide polymorphism present at the 1549th base is preferred, and such single nucleotide polymorphism is registered as rs1547 (SEQ ID NO: 11).
  • the single nucleotide polymorphism in the region encoding the EDEM3 gene is the nucleotide sequence encoding the EDEM3 gene shown in SEQ ID NO: 5 or a complementary sequence thereof.
  • a single nucleotide polymorphism present at the 2459th base is preferred, and this single nucleotide polymorphism is registered as rs9425343 (SEQ ID NO: 12).
  • nucleotide polymorphism As a single nucleotide polymorphism in the region encoding the ACOX1 gene (NCBI accession number NM_004035.6, updated date, May 5, 2014), the nucleotide sequence encoding the ACOX1 gene shown in SEQ ID NO: 6 or its complementary sequence A single nucleotide polymorphism present at the 936th base is preferred, and this single nucleotide polymorphism is registered as rs1135640 (SEQ ID NO: 13).
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 7 to 13 are shown in Table 1. Each corresponds to a single nucleotide polymorphism site on the genome and a complementary sequence of 25 bases upstream and downstream thereof.
  • the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8, 9, 11, and 13 are the single nucleotide polymorphic sites in NM_153360.1, NM_001136108.1, NM_0188488.3, and NM_025191.3, and the complementary sequences of 25 nucleotides upstream and downstream thereof, respectively. It corresponds to.
  • SEQ ID NO: 7 overlaps with the 347th to 374th complementary strand of the mRNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 (NM — 153360.1), and the remaining 23 bases in which no overlap with SEQ ID NO: 1 is observed ( (Upstream 25 bases to upstream 23 bases of the single nucleotide polymorphism site) correspond to intron sequences and are not found on SEQ ID NO: 1.
  • cytosine (C) or thymine (T) ([C / T]) is Y
  • adenine (A) or guanine ([A / G]) is R
  • a or C ([A / C] ) Is represented by M
  • C or G ([C / G]) by S.
  • the 186th base of the base sequence encoding the APCDD1L gene shown in SEQ ID NO: 1 is A in the wild type and G in the variant type, and 186 of the complementary sequence of the base sequence encoding the APCDD1L gene shown in SEQ ID NO: 1.
  • the second base is T for the wild type and C for the variant type.
  • the 358th base of the base sequence encoding the R3HCC1 gene shown in SEQ ID NO: 2 is G in the wild type and A in the variant type, and 358 of the complementary sequence of the base sequence encoding the R3HCC1 gene shown in SEQ ID NO: 2.
  • the second base is C for the wild type and T for the variant type.
  • the 400th base of the base sequence encoding the OR51I2 gene shown in SEQ ID NO: 3 is A in the wild type and G in the variant type, and is a complementary sequence of the base sequence encoding the OR51I2 gene shown in SEQ ID NO: 3.
  • the 400th base is T in the wild type and C in the variant type.
  • the 1549th base of the base sequence encoding the MKKS gene shown in SEQ ID NO: 4 is C in the wild type and T in the variant type, and 1549 of the complementary sequence of the base sequence encoding the MKKS gene shown in SEQ ID NO: 4.
  • the second base is G for the wild type and A for the variant type.
  • the 2459th base of the base sequence encoding the EDEM3 gene shown in SEQ ID NO: 5 is T in the wild type and G in the variant type, and 2459 of the complementary sequence of the base sequence encoding the EDEM3 gene shown in SEQ ID NO: 5
  • the second base is A for the wild type and C for the variant type.
  • the 238th base of the base sequence encoding the APCDD1L gene shown in SEQ ID NO: 1 is T in the wild type and C in the variant type, and 238 of the complementary sequence of the base sequence encoding the APCDD1L gene shown in SEQ ID NO: 1.
  • the second base is A for the wild type and G for the variant type.
  • the 936th base of the base sequence encoding the ACOX1 gene shown in SEQ ID NO: 6 is C in the wild type and G in the variant type, and 936 of the complementary sequence of the base sequence encoding the ACOX1 gene shown in SEQ ID NO: 6
  • the second base is G for the wild type and C for the variant type.
  • linkage disequilibrium means that in a population of organisms, a non-random correlation is found between alleles or genetic markers (polymorphisms) of a plurality of loci, that is, specific combinations thereof (haplotypes). ) Means a genetic phenomenon that is significantly higher in frequency, and “genetic linkage” means that a particular allele combination is inherited from parent to child without following Mendel's independent laws. It means a genetic phenomenon.
  • the side effects are not particularly limited, and examples include leukopenia, neutropenia, diarrhea, vomiting, general malaise, loss of appetite, hair loss and the like.
  • Preferred examples include leukopenia or neutropenia. be able to.
  • a method for analyzing a single nucleotide polymorphism a known method for analyzing a single nucleotide polymorphism can be used.
  • a real-time PCR method a direct sequencing method, a Taqman (registered trademark) PCR method, an invader ( (Registered trademark) method, Luminex (registered trademark) method, quenching primer / probe (QP) method, MALDI-TOF method, molecular beacon method and the like.
  • a method for detecting hybridization between a nucleic acid fragment obtained by PCR amplification and a pair of probes corresponding to a wild type and a variant type, and in the PCR amplification process By using a probe, a method of detecting a wild type and a variant type can be mentioned.
  • the probe of the present invention used in the method for analyzing a single nucleotide polymorphism comprises an oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with a sequence of 5 to 50 bases including the single nucleotide polymorphism site to be analyzed.
  • any probe may be used, and the base sequence encoding the APCDD1L gene shown in SEQ ID NO: 1, or the single nucleotide polymorphism site present at the 186th base of its complementary sequence, the base encoding the R3HCC1 gene shown in SEQ ID NO: 2 A single nucleotide polymorphism site present at the 358th base of the sequence or its complementary sequence, a base sequence encoding the OR51I2 gene shown in SEQ ID NO: 3, or a single nucleotide polymorphism present at the 400th base of the complementary sequence Site, base sequence encoding MKKS gene shown in SEQ ID NO: 4 or its complementary sequence No.
  • Examples include probes consisting of oligonucleotides that hybridize under stringent conditions with a sequence of 5 to 50 bases, preferably 10 to 40 bases, more preferably 15 to 30 bases including a single nucleotide polymorphic site present. be able to. Further, by using an oligo probe synthesized using an artificial nucleic acid such as Locked Nucleic Acid (LNA) as
  • stringent conditions refer to conditions in which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Specifically, 6 ⁇ SSC (1.5 M NaCl, 0.15 M A solution containing trisodium citrate is 10 ⁇ SSC), a hybrid is formed at 45 ° C. in a solution containing 50% formamide, and then washed with 2 ⁇ SSC at 50 ° C. (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6) and 3 ⁇ SSC / 0.3 ⁇ SDS in a solution at 54 ° C.
  • the conditions (refer the said patent document 2) etc. which wash
  • the probe of the present invention may be used by being fixed on a carrier, and examples of the carrier include a planar substrate and a bead-shaped spherical carrier. Can be mentioned. Moreover, the probe for detecting the wild type and the probe for detecting the variant type may be fixed to the same carrier or different carriers.
  • an oligonucleotide capable of amplifying as a nucleic acid fragment at least 5 consecutive bases containing a single nucleotide polymorphism site to be analyzed using genomic DNA as a template
  • the amplified sequence can be identified by using a pre-labeled primer or using a labeled nucleotide as a substrate for the amplification reaction.
  • the labeling substance is not particularly limited, and examples thereof include a radioisotope, a fluorescent dye, or an organic compound such as digoxigenin (DIG) or biotin.
  • the probe or primer can be obtained by chemically synthesizing with a nucleic acid synthesizer, for example.
  • a nucleic acid synthesizer for example, a DNA synthesizer, a fully automatic nucleic acid synthesizer, or the like can be used.
  • the nucleic acid fragment hybridized to each probe can be measured by detecting the label.
  • the nucleic acid fragment hybridized to the probe can be measured by measuring the fluorescence intensity derived from the fluorescent dye. Specifically, to calculate the ratio of a nucleic acid fragment hybridized to a wild-type detection probe to a nucleic acid fragment hybridized to a variant-type detection probe, detect the label on the wild-type detection probe. And the output value when the label in the probe for detecting the variant type is detected.
  • the intensity value derived from the nucleic acid fragment hybridized to the probe corresponding to the variant type is hybridized to the intensity value derived from the nucleic acid fragment hybridized to the probe corresponding to the variant type and the probe corresponding to the wild type.
  • the judgment value can be calculated by dividing by the average value of intensity values derived from the soy nucleic acid fragment. This determination value approximates a value obtained by normalizing the abundance of the variant type contained in the nucleic acid fragment. Therefore, the single nucleotide polymorphism in the subject is analyzed based on the height of the judgment value, and it is determined whether the variant type has homo, wild type has homo, or has hetero can do.
  • the single nucleotide polymorphism in the subject is analyzed to determine whether the variant type has homo, wild type homo, or hetero Therefore, it is preferable to set two levels of threshold values (threshold value A and threshold value B) in advance.
  • the threshold A and the threshold B have a relationship of (threshold A> threshold B). That is, when the determination value calculated as described above exceeds the threshold A, it is determined that the variant type is homo, and when the determination value is equal to or less than the threshold A and exceeds the threshold B, it is included as hetero. If the determination value is equal to or less than the threshold value B, it can be determined that the wild type is homozygous.
  • threshold A and threshold B are set for the single nucleotide polymorphism described above.
  • the method for setting the threshold A and the threshold B is not particularly limited, but when the determination value is calculated as described above using a sample whose genotype is determined in advance, and the variant type is homo, A method of calculating the probability density as a normal distribution in the case of having a wild type as a homo or a case of having a wild type as a hetero can be mentioned. At this time, the intersection where the probability density overlaps each other (at the position where the magnitude of the probability density interchanges, between each local maximum value) is obtained, and when the above variant type is homo, the wild type is homo If it is, or if it is hetero, the average value is obtained.
  • a threshold when having a variant type as a homo and as a hetero (the average value when having a variant type as a homo and the average value when having a variant type as a hetero ) And the average value of the intersection points.
  • the average value when having a heterotype and having a wild type as a homo the average value when having a heterotype and an average value when having a wild type as a homo ) And the average value of the intersection points.
  • a single nucleotide polymorphism in the region encoding the APCDD1L gene, R3HCC1 gene, OR51I2 gene, MKKS gene, EDEM3 gene, or ACOX1 gene in patients who have and have not had side effects of irinotecan in advance or the single nucleotide Investigate the relationship between polymorphisms and single nucleotide polymorphisms in linkage disequilibrium or genetic linkage.
  • the single nucleotide polymorphism of the target patient is examined and compared with the data of the previously examined patient, thereby assisting in predicting the risk of occurrence of irinotecan side effects in the target patient.
  • the kit for assisting in predicting the risk of occurrence of side effects due to irinotecan of the present invention is not particularly limited as long as it contains the probe of the present invention or the primer of the present invention, and a buffer for analyzing a single nucleotide polymorphism. Liquids, enzymes, and other reagents, and instructions for assisting in predicting that the risk of side effects caused by irinotecan is high may be included.
  • Genomic DNA was prepared based on the sodium iodide method (Wang et al., Nucleic Acids Res 34: 195-201 (2014)) using the peripheral blood of a subject collected in an EDTA-containing tube.
  • the prepared DNA was dissolved in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 mM EDTA ⁇ 2Na and stored at 4 ° C. or ⁇ 20 ° C. until use.
  • Exome analysis using the next-generation sequencer was performed by the following method. First, the concentration of the prepared genomic DNA was quantified from the absorbance using a spectrophotometer (Nanodrop (registered trademark): manufactured by Scrum), and the quality test was performed by agarose gel electrophoresis. Thereafter, the genomic DNA was fragmented to 150 to 200 bp using an acoustic solver (manufactured by Covalis), and the adapter was ligated. Next, the fragmented genomic DNA was amplified by PCR, hybridized with SureSelect (registered trademark) Oligo Capture library (manufactured by Agilent Technologies), recovered with streptavidin magnetic beads, and concentrated.
  • PCR amplification was performed using a primer with an index, and an index was added to obtain a sequence library.
  • the quality of the prepared sequence library was measured using an Agilent 2100 Bioanalyzer (manufactured by Agilent Technologies).
  • the template DNA base sequence was obtained by analyzing the sequence library using HiSeq 2000 (manufactured by Illumina). Clean reads were extracted from the obtained base sequence and mapped to a reference sequence (UCSC hg19: human reference genome) using Burrows-Wheeler Aligner (BWA) (0.7.12).
  • the gene polymorphism is extracted by The Genome Analysis Toolkit (GATK) (3.4-46), and the effect on the amino acid sequence by snpEff (v4.1k)
  • the gene polymorphism estimated to affect the amino acid sequence was extracted based on SnpEff, sorts intolerant from tolerant (SIFT), polymorphism Phenotyping (PolyPhen).
  • SIFT genotyp intolerant from tolerant
  • PolyPhen polymorphism Phenotyping
  • the difference between the control group and the case group was ranked using a standardized difference (d) according to the following formula (I).
  • P T is the percentage of the gene polymorphism alleles in cases (test) group
  • P C is the percentage of the gene polymorphism alleles in the control group.
  • FIGS. 1 The results of exome analysis of each gene visualized with Integrative Genomics Viewer (IGV, manufactured by Broad Institute) software are shown in FIGS.
  • the position of the single nucleotide polymorphism is surrounded by a square, and when the thick line has the wild type as homo, when the dotted line has hetero, the thin line has the variant type as homo Is the case.
  • rs19850576 and rs3946003 FIG. 1
  • rs2272761 and rs2272762 and rs13530 FIG. 2
  • rs1545 and rs1547 FIG. 3
  • rs1135640 and rs3760128, rs7222757, rs7227593, and rs2305913 A complete chain was shown.
  • Genomic DNA 10 ng using TaqMan SNP Assays_Human (Applied Biosystems), LightCycler (registered trademark) 480 Probe Master (Roche Diagnostics), Universal ProbeLibrary (Roche Diagnostics), LightCycler480 System II (RocheDiagnostics) Typing was done. After incubation at 95 ° C for 10 minutes, PCR was performed for 55 cycles for rs1985576, rs2272761, rs9425343, 45 cycles for rs12577167, rs72626554, 45 cycles for rs1135640, 40 cycles for rs1547 (92 ° C 15 seconds per cycle, 60 ° C 60 seconds) And the fluorescence of the PCR product was measured.
  • FIGS. 8 and 9 show the results of analysis by the TaqMan probe method. Since only rs1135640 was analyzed in 74 cases, FIGS. 8 and 9 show the analysis results in 74 cases for all genotyping.
  • the horizontal and vertical axes are the fluorescence values from the fluorescently labeled (FAM and VIC) probes for each allele, and the black circle, dark gray circle, and light gray (dot pattern) circle each have a variant type as homo in the exome analysis. Cases that had been wild-type as homozygous, cases that had wild-type as heterozygous, and white circles were cases in which exome analysis was not performed. 8 and 9, it was confirmed that genotypes could be clearly distinguished by TaqMan probe method, and the results of exome analysis were also reproduced by TaqMan probe method.
  • rs9425343, rs2272761, rs12577167, rs1135640, rs1547, rs7265854, and rs1985576 did not show linkage (correlation) with the UGT1A gene mutation.
  • these single nucleotide polymorphisms complementarily predict the risk of side effects due to irinotecan. It became clear that it can be used in the method of assisting.
  • Single nucleotide polymorphism rs1547, single nucleotide polymorphism rs9425343 encoding the region encoding EDEM3 gene, single nucleotide polymorphism rs11353640 encoding the region encoding ACOX1 gene are analyzed, and variant type is homozygous or wild type is homozygous It was clarified that the risk of occurrence of side effects of irinotecan, which could not be predicted from the conventional UGT1A gene polymorphism, can be accurately assisted by
  • the present invention it is possible to assist in predicting the risk of occurrence of side effects caused by irinotecan, and thus can be used in the medical field.

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Abstract

　特定の遺伝子をコードする領域における一塩基多型を分析することによりイリノテカンによる副作用の発生リスクを予測するための簡便かつ効率的な手段を提供することを課題とする。　被検者から採取された生体試料中のゲノムＤＮＡ上に存在するＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子、Ｒ３ＨＣＣ１遺伝子、ＯＲ５１Ｉ２遺伝子、ＭＫＫＳ遺伝子、ＥＤＥＭ３遺伝子、又はＡＣＯＸ１遺伝子をコードする領域における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡若しくは遺伝的連鎖にある一塩基多型を分析し、一塩基多型としてバリアント型をホモとして有しているか、ヘテロとして有しているか、野生型をホモとして有しているかを判定し、イリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助する。

Description

イリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助する方法
　本発明は、イリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助する方法や、かかる方法における一塩基多型の分析で用いるためのプローブ又はプライマーに関する。
　イリノテカン（CPT-11：1,4'-ビピペリジン-1'-カルボン酸 (S)-4,11-ジエチル-3,4,12,14-テトラヒドロ-4-ヒドロキシ-3,14-ジオキソ-1H-ピラノ[3',4':6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-9-イルエステル（CAS NO:97682-44-5））は、カンレンボク由来の抗腫瘍性アルカロイドであるカンプトテシンから合成された抗癌剤であり、肺癌や転移性大腸癌等の癌を治療するのに有用であることが知られている。イリノテカンは、ＤＮＡ複製を促進する酵素トポイソメラーゼを阻害することにより優れた抗癌作用を示す。しかしながら、白血球減少、好中球減少、下痢等の重篤な副作用が報告されている。
　近年、患者個人に最適な治療方法を計画するオーダーメイド医療、すなわち個別化医療が一部で実用化されている。イリノテカンに関しても、グルクロン酸抱合酵素(UDP-glucuronosyltransferase:UGT)をコードする遺伝子の一つであるＵＧＴ１Ａ１の遺伝子多型（ＵＧＴ１Ａ１＊２８、ＵＧＴ１Ａ１＊６、ＵＧＴ１Ａ１＊２７、ＵＧＴ１Ａ１＊６０等）を検出することで、イリノテカンの副作用を予測する方法（特許文献１～４、非特許文献１、２参照）が提案されており、かかる方法を用いてイリノテカンの副作用を予測し、個別化医療の指標として利用されている。
　また、イリノテカンの副作用の有無を予測することを目的として、ＵＧＴ１Ａ１＊２８、ＵＧＴ１Ａ１＊６を判定するキット（積水メディカル社製）が販売されている。
　しかしながら、ＵＧＴ１Ａ遺伝子多型に基づいて非ハイリスクとされる患者、例えばＵＧＴ１Ａ＊２８、ＵＧＴ１Ａ＊６において、いずれかがバリアント型又はいずれもヘテロ型として有する患者においても、およそ４３％の患者においてイリノテカンによる副作用がみられるのが現状であり、イリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助する新たな方法が求められていた。
国際公開第２００２－０４８４００号パンフレット 特開２０１１－２５０７２６号公報 特開２０１０－００００１８号公報 特開２００８－０７２９１３号公報
Hazama et al., Cancer Science, 104:1662-9(2013) Tsunedomi et al., International Journal of Oncology, 45(4):1381-1390(2014)
　抗癌剤イリノテカンによる癌治療において、個々の患者での副作用の発生リスクの予測を可能として、個々の癌患者に適切な抗癌剤による治療、いわゆる個別化医療が求められている。そこで、本発明の課題は、特定の遺伝子をコードする領域における一塩基多型を分析することによりイリノテカンによる副作用の発生リスクを予測するための簡便かつ効率的な手段を提供することにある。
　臨床情報（イリノテカン副作用発生の有無）及びＵＧＴ１Ａ遺伝子多型情報に基づいて群分けした患者ゲノムを網羅的に解析（エクソーム解析）することによって、ＵＧＴ１Ａ遺伝子多型を原因としない新規のイリノテカンの副作用関連因子の探索を行った。その結果、ＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子、Ｒ３ＨＣＣ１遺伝子、ＯＲ５１Ｉ２遺伝子、ＭＫＫＳ遺伝子、ＥＤＥＭ３遺伝子、又はＡＣＯＸ１遺伝子をコードする領域における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡若しくは遺伝的連鎖にある一塩基多型がイリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助する因子であること、かかる一塩基多型とＵＧＴ１Ａ遺伝子多型とは連鎖（相関）しないことを見いだし、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下に示すとおりのものである。
（１）被検者から採取された生体試料中のゲノムＤＮＡ上に存在するＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子、Ｒ３ＨＣＣ１遺伝子、ＯＲ５１Ｉ２遺伝子、ＭＫＫＳ遺伝子、ＥＤＥＭ３遺伝子、又はＡＣＯＸ１遺伝子をコードする領域における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡若しくは遺伝的連鎖にある一塩基多型を分析し、バリアント型をホモとして有しているか、野生型をホモとして有しているか、又はヘテロとして有しているかを判定し、イリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助する方法。
（２）ＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子、Ｒ３ＨＣＣ１遺伝子、ＯＲ５１Ｉ２遺伝子、ＭＫＫＳ遺伝子、ＥＤＥＭ３遺伝子、又はＡＣＯＸ１遺伝子をコードする領域における一塩基多型が以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかであることを特徴とする上記（１）記載の方法。
（ａ）配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の１８６番目の塩基に存在する一塩基多型；
（ｂ）配列番号２に示されるＲ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の３５８番目の塩基に存在する一塩基多型；
（ｃ）配列番号３に示されるＯＲ５１Ｉ２遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の４００番目の塩基に存在する一塩基多型；
（ｄ）配列番号４に示されるＭＫＫＳ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の１５４９番目の塩基に存在する一塩基多型；
（ｅ）配列番号５に示されるＥＤＥＭ３遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の２４５９番目の塩基に存在する一塩基多型；
（ｆ）配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の２３８番目の塩基に存在する一塩基多型；
（ｇ）配列番号６に示されるＡＣＯＸ１遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の９３６番目の塩基に存在する一塩基多型；
（３）（ａ）、（ｂ）又は（ｄ）に記載の一塩基多型においてバリアント型をホモとして有している場合、又は（ｃ）、（ｅ）～（ｇ）に記載の一塩基多型において野生型をホモとして有している場合にはイリノテカンによる副作用の発生リスクが高いとの予測を補助することを特徴とする上記（２）記載の方法。
（４）副作用が、白血球減少又は好中球減少であることを特徴とする上記（１）～（３）のいずれか記載の方法。
（５）以下の（ｈ）～（ｎ）のいずれかであって、上記（１）～（４）のいずれかに記載の方法における一塩基多型の分析で用いるためのプローブ。
（ｈ）配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の１８６番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
（ｉ）配列番号２に示されるＲ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の３５８番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
（ｊ）配列番号３に示されるＯＲ５１Ｉ２遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の４００番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
（ｋ）配列番号４に示されるＭＫＫＳ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の１５４９番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
（ｌ）配列番号５に示されるＥＤＥＭ３遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の２４５９番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
（ｍ）配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の２３８番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
（ｎ）配列番号６に示されるＡＣＯＸ１遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の９３６番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
（６）以下の（ｏ）～（ｕ）のいずれかであって、上記（１）～（４）のいずれかに記載の方法における一塩基多型の分析で用いるためのプライマー。
（ｏ）配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列の１８６番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
（ｐ）配列番号２に示されるＲ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする塩基配列の３５８番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
（ｑ）配列番号３に示されるＯＲ５１Ｉ２遺伝子をコードする塩基配列の４００番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
（ｒ）配列番号４に示されるＭＫＫＳ遺伝子をコードする塩基配列の１５４９番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
（ｓ）配列番号５に示されるＥＤＥＭ３遺伝子をコードする塩基配列の２４５９番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
（ｔ）配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列の２３８番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
（ｕ）配列番号６に示されるＡＣＯＸ１遺伝子をコードする塩基配列の９３６番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
（７）上記（５）記載のプローブ、又は上記（６）記載のプライマーを含むことを特徴とするイリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助するためのキット。
　本発明によれば、イリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助することが可能となる。かかる方法を用いて個々の患者での副作用を予測することで、個々の癌患者に適切な抗癌剤による治療、いわゆる個別化医療を行うことが可能となる。
ＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする領域のエクソーム解析の結果を示す図である。 Ｒ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする領域のエクソーム解析の結果を示す図である。 ＯＲ５１Ｉ２遺伝子及びＭＫＫＳ遺伝子をコードする領域のエクソーム解析の結果を示す図である。 ＣＳＭＤ２遺伝子及びＥＤＥＭ３遺伝子をコードする領域のエクソーム解析の結果を示す図である。 ＧＡＴＡ２遺伝子をコードする領域のエクソーム解析の結果を示す図である。 ＴＲＩＭ６５遺伝子をコードする領域のエクソーム解析の結果を示す図である。 ＦＢＦ１遺伝子及びＡＣＯＸ１遺伝子をコードする領域のエクソーム解析の結果を示す図である。 ＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ１９８０５７６、Ｒ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ２２７２７６１、ＯＲ５１Ｉ２遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ１２５７７１６７、ＭＫＫＳ遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ１５４７について、ＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅ法により解析した結果を示す図である。 ＥＤＥＭ３遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ９４２５３４３、ＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ７２６５８５４、ＡＣＯＸ１遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ１１３５６４０について、ＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅ法により解析した結果を示す図である。 ｒｓ９４２５３４３、ｒｓ２２７２７６１、ｒｓ１２５７７１６７、ｒｓ１１３５６４０、ｒｓ１５４７、ｒｓ７２６５８５４、ｒｓ１９８０５７６とＵＧＴ１Ａ遺伝子変異における連鎖不平衡解析及びＬＤ解析を行った結果を示す図である。
　本発明におけるイリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助する方法としては、被検者から採取された生体試料中のゲノムＤＮＡ上に存在するＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子、Ｒ３ＨＣＣ１遺伝子、ＯＲ５１Ｉ２遺伝子、ＭＫＫＳ遺伝子、ＥＤＥＭ３遺伝子、又はＡＣＯＸ１遺伝子をコードする領域における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡若しくは遺伝的連鎖にある一塩基多型を分析し、バリアント型（minor allele）をホモとして有しているか、野生型（major allele）をホモとして有しているか、又はヘテロとして有しているかを判定し、イリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助する方法であれば特に制限されず、イリノテカンには、その塩及びそれらの溶媒和物、特に水和物（例えば、CAS NO:136572-09-3）も包含される。イリノテカンの塩としては、薬学的に許容される酸を作用させた酸付加塩が抗癌剤として好ましく用いられる。そのような酸付加塩としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸等の無機酸との塩；シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸等の有機酸との塩が挙げられ、特に塩酸塩（塩酸イリノテカン；CAS NO:136572-09-3）を挙げることができる。
　被検者から採取された生体試料としては、ゲノムＤＮＡを含むものであれば特に制限されず、血液及びこれに由来する血液関連試料（血液、血清及び血漿等）、リンパ液、汗、涙、唾液、尿、糞便、腹水及び髄液等の体液、ならびに細胞、組織又は臓器の破砕物及び抽出液等を挙げることができ、血液関連試料を好適に挙げることができる。
　被検者から採取した生体試料からゲノムＤＮＡを抽出する抽出手段としては、特に限定されず、前記生体試料から直接的にＤＮＡ成分を分離し、精製して回収できる手段であることが好ましい。
　ＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号　ＮＭ＿１５３３６０．１　更新日　２０１４年１月２６日）をコードする領域における一塩基多型としては、配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の１８６番目若しくは２３８番目の塩基に存在する一塩基多型であることが好ましく、かかる一塩基多型はＮＣＢＩ　ＳＮＰ　データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）のリファレンス番号であるｒｓ番号（Reference SNP ID number）により特定でき、それぞれｒｓ１９８０５７６（配列番号７）、ｒｓ７２６５８５４（配列番号８）として登録されている。なお、以下、本発明においては、特定の一塩基多型を、上記ＮＣＢＩ　ＳＮＰ　データベースのｒｓ番号で記載する場合がある。
　Ｒ３ＨＣＣ１遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号　ＮＭ＿００１１３６１０８．１　更新日　２０１４年１月２７日）をコードする領域における一塩基多型としては、配列番号２に示されるＲ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の３５８番目の塩基に存在する一塩基多型であることが好ましく、かかる一塩基多型はｒｓ２２７２７６１（配列番号９）として登録されている。
　ＯＲ５１Ｉ２遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号　ＮＭ＿００１００４７５４．２　更新日　２０１４年５月１６日）をコードする領域における一塩基多型としては、配列番号３に示されるＯＲ５１Ｉ２遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の４００番目の塩基に存在する一塩基多型であることが好ましく、かかる一塩基多型はｒｓ１２５７７１６７（配列番号１０）として登録されている。
　ＭＫＫＳ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号　ＮＭ＿０１８８４８．３　更新日　２０１４年５月５日）をコードする領域における一塩基多型としては、配列番号４に示されるＭＫＫＳ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の１５４９番目の塩基に存在する一塩基多型であることが好ましく、かかる一塩基多型はｒｓ１５４７（配列番号１１）として登録されている。
　ＥＤＥＭ３遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号　ＮＭ＿０２５１９１．３　更新日　２０１４年２月２６日）をコードする領域における一塩基多型としては、配列番号５に示されるＥＤＥＭ３遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の２４５９番目の塩基に存在する一塩基多型であることが好ましく、かかる一塩基多型はｒｓ９４２５３４３（配列番号１２）として登録されている。
　ＡＣＯＸ１遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号　ＮＭ＿００４０３５．６　更新日　２０１４年５月５日）をコードする領域における一塩基多型としては、配列番号６に示されるＡＣＯＸ１遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の９３６番目の塩基に存在する一塩基多型であることが好ましく、かかる一塩基多型はｒｓ１１３５６４０（配列番号１３）として登録されている。
　上記配列番号７～１３の塩基配列を表１に示す。それぞれ、ゲノム上での一塩基多型部位及びその上流及び下流２５塩基の相補配列に相当する。また、配列番号７及び８、９、１１、１３の塩基配列は、それぞれＮＭ＿１５３３６０．１、ＮＭ＿００１１３６１０８．１、ＮＭ＿０１８８４８．３、ＮＭ＿０２５１９１．３における一塩基多型部位及びその上流及び下流２５塩基の相補配列に相当する。なお、配列番号７の配列は、配列番号１に示したｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿１５３３６０．１）の３４７番目から３７４番目の相補鎖と重複し、配列番号１との重複が見られない残りの２３塩基（一塩基多型部位の上流２５塩基から上流２３塩基）はイントロン配列に相当し、配列番号１上にはみられない。また、配列表において、シトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）（［Ｃ／Ｔ］）をＹ、アデニン（Ａ）又はグアニン（［Ａ／Ｇ］）をＲ、Ａ又はＣ（［Ａ／Ｃ］）をＭ、Ｃ又はＧ（［Ｃ／Ｇ］）をＳで表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列の１８６番目の塩基は、野生型ではＡ、バリアント型ではＧであり、配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列の相補配列の１８６番目の塩基は、野生型ではＴ、バリアント型ではＣである。
　配列番号２に示されるＲ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする塩基配列の３５８番目の塩基は、野生型ではＧ、バリアント型ではＡであり、配列番号２に示されるＲ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする塩基配列の相補配列の３５８番目の塩基は、野生型ではＣ、バリアント型ではＴである。
　配列番号３に示されるＯＲ５１Ｉ２遺伝子をコードする塩基配列の４００番目の塩基は、は、野生型ではＡ、バリアント型ではＧであり、配列番号３に示されるＯＲ５１Ｉ２遺伝子をコードする塩基配列の相補配列の４００番目の塩基としては、野生型ではＴ、バリアント型ではＣである。
　配列番号４に示されるＭＫＫＳ遺伝子をコードする塩基配列の１５４９番目の塩基は、野生型ではＣ、バリアント型ではＴであり、配列番号４に示されるＭＫＫＳ遺伝子をコードする塩基配列の相補配列の１５４９番目の塩基は、野生型ではＧ、バリアント型ではＡである。
　配列番号５に示されるＥＤＥＭ３遺伝子をコードする塩基配列の２４５９番目の塩基は、野生型ではＴ、バリアント型ではＧであり、配列番号５に示されるＥＤＥＭ３遺伝子をコードする塩基配列の相補配列の２４５９番目の塩基は、野生型ではＡ、バリアント型ではＣである。
　配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列の２３８番目の塩基は、野生型ではＴ、バリアント型ではＣであり、配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列の相補配列の２３８番目の塩基は、野生型ではＡ、バリアント型ではＧである。
　配列番号６に示されるＡＣＯＸ１遺伝子をコードする塩基配列の９３６番目の塩基は、野生型ではＣ、バリアント型ではＧであり、配列番号６に示されるＡＣＯＸ１遺伝子をコードする塩基配列の相補配列の９３６番目の塩基は、野生型ではＧ、バリアント型ではＣである。
　本発明において、「連鎖不平衡」とは、生物の集団において、複数の遺伝子座の対立遺伝子又は遺伝的マーカー（多型）の間にランダムでない相関が見られる、すなわちそれらの特定の組合せ（ハプロタイプ）の頻度が有意に高くなる集団遺伝学的な現象を意味し、「遺伝的連鎖」とは、特定の対立遺伝子の組合せが、メンデルの独立の法則に従わずに親から子へ一緒に遺伝する遺伝学的現象を意味する。
　本発明において、副作用としては特に制限されないが、白血球減少、好中球減少、下痢、嘔吐、全身倦怠感、食欲不振、脱毛等を挙げることができ、白血球減少又は好中球減少を好適に挙げることができる。
　本発明において、一塩基多型を分析する方法としては、公知の一塩基多型を分析する方法を用いることができ、リアルタイムＰＣＲ法、ダイレクトシーケンシング法、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲ法、インベーダー（登録商標）法、ルミネックス（登録商標）法、クエンチングプライマー／プローブ（QP）法、MALDI-TOF法、分子ビーコン法等を挙げることができる。具体的には、被検者（通常、ヒト被検者をさす）から採取した生体試料のゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応によって測定対象の一塩基多型部位を含む核酸断片を、プライマーを用いてＰＣＲで増幅し、得られた核酸断片と、野生型及びバリアント型に対応する一対のプローブとのハイブリダイゼーションを検出する方法や、上記ＰＣＲ増幅過程において、該一塩基多型部位に特異的なプローブを用いることで、野生型及びバリアント型を検出する方法を挙げることができる。
　上記一塩基多型を分析する方法において用いる本発明のプローブとしては、分析対象の一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブであればよく、配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の１８６番目の塩基に存在する一塩基多型部位、配列番号２に示されるＲ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の３５８番目の塩基に存在する一塩基多型部位、配列番号３に示されるＯＲ５１Ｉ２遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の４００番目の塩基に存在する一塩基多型部位、配列番号４に示されるＭＫＫＳ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の１５４９番目の塩基に存在する一塩基多型部位、配列番号５に示されるＥＤＥＭ３遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の２４５９番目の塩基に存在する一塩基多型部位、配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の２３８番目の塩基に存在する一塩基多型部位、又は配列番号６に示されるＡＣＯＸ１遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の９３６番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基、好ましくは１０～４０塩基、より好ましくは１５塩基～３０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブを挙げることができる。また、プローブとしてLocked Nucleic Acid（ＬＮＡ）等の人工核酸を用いて合成したオリゴプローブを用いることで、短い塩基でも特異的にハイブリダイズするプローブとすることが可能となる。
　本発明において、ストリンジェントな条件下としては、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ　ＮａＣｌ，０．１５Ｍ　クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）や、３×ＳＳＣ／０．３×ＳＤＳを含む溶液中で５４℃にてハイブリッドを形成させた後、洗浄液Ａ（１０×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ溶液）、洗浄液Ｂ（２０×ＳＳＣ）及び洗浄液Ｃ（５×ＳＳＣ）で順次洗浄するような条件（上記特許文献２参照）等を挙げることができる。
　また、本発明のプローブは、担体上に固定して用いてもよく、担体としては、平面状の基板やビーズ状の球状担体を挙げることができ、具体的には、上記特許文献２に記載された担体を挙げることができる。また、野生型を検出するプローブとバリアント型を検出するプローブとを同一の担体に固定してもよいし、異なる担体に固定してもよい。
　上記一塩基多型を分析する方法において用いる本発明のプライマーとしては、ゲノムＤＮＡを鋳型として、分析対象の一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を核酸断片として増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマーであればよく、配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列の１８６番目の塩基に存在する一塩基多型部位、配列番号２に示されるＲ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする塩基配列の３５８番目の塩基に存在する一塩基多型部位、配列番号３に示されるＯＲ５１Ｉ２遺伝子をコードする塩基配列の４００番目の塩基に存在する一塩基多型部位、配列番号４に示されるＭＫＫＳ遺伝子をコードする塩基配列の１５４９番目の塩基に存在する一塩基多型部位、配列番号５に示されるＥＤＥＭ３遺伝子をコードする塩基配列の２４５９番目の塩基に存在する一塩基多型部位、配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列の２３８番目の塩基に存在する一塩基多型部位、又は配列番号６に示されるＡＣＯＸ１遺伝子をコードする塩基配列の９３６番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基、好ましくは１０～５００塩基、より好ましくは２０～２００塩基、さらに好ましくは５０～１００塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを挙げることができる。
　また、分析対象の一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を増幅する際に、あらかじめ標識したプライマーを用いるか、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として用いることで、増幅した配列を識別することが可能となる。標識物質としては特に限定されないが、放射性同位元素、蛍光色素、又はジゴキシゲニン（DIG）やビオチン等の有機化合物等を挙げることができる。
　上記プローブ又はプライマーは、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、ＤＮＡシンセサイザー、全自動核酸合成装置等を使用することができる。
　増幅した核酸断片が標識を有する場合、標識を検出することで各プローブにハイブリダイズした核酸断片を測定することができる。例えば、蛍光色素を標識として使用した場合には、当該蛍光色素に由来する蛍光強度を測定することによって、プローブにハイブリダイズした核酸断片を測定することができる。具体的には、野生型を検出するプローブにハイブリダイズした核酸断片と、バリアント型を検出するプローブにハイブリダイズした核酸断片との比を算出するには、野生型を検出するプローブにおける標識を検出したときの出力値と、バリアント型を検出するプローブにおける標識を検出したときの出力値とから算出することができる。
　より具体的に、バリアント型に対応するプローブにハイブリダイズした核酸断片に由来する強度値を、バリアント型に対応するプローブにハイブリダイズした核酸断片に由来する強度値及び野生型に対応するプローブにハイブリダイズした核酸断片に由来する強度値の平均値で除算することで判定値を算出することができる。この判定値は、核酸断片に含まれるバリアント型の存在量を正規化した値に近似する。よって、当該判定値の高さによって、被検者における一塩基多型を分析しバリアント型をホモとして有しているか、野生型をホモとして有しているか、又はヘテロとして有しているかを判別することができる。
　当該判定値を使用する場合、被検者における一塩基多型を分析してバリアント型をホモとして有しているか、野生型をホモとして有しているか、又はヘテロとして有しているかを判別するため、予め二段階の閾値（閾値Ａ及び閾値Ｂ）を設定することが好ましい。なお、ここで、閾値Ａ及び閾値Ｂは、（閾値Ａ＞閾値Ｂ）の関係を有しているものとする。すなわち、上述のように算出された判定値が閾値Ａを超えるとバリアント型をホモとして有していると判断し、当該判定値が閾値Ａ以下であり閾値Ｂを超えるとヘテロとして有していると判断し、当該判定値が閾値Ｂ以下であると野生型をホモとして有していると判断できる。
　これら閾値Ａ及び閾値Ｂは、上述した一塩基多型について設定する。閾値Ａ及び閾値Ｂの設定方法としては、特に限定されないが、予め遺伝子型が判別している試料を用いて上述のように判定値を算出し、上記バリアント型をホモとして有している場合、野生型をホモとして有している場合、又はヘテロとして有している場合についてそれぞれ確率密度を正規分布として算出する方法を挙げることができる。このとき、確率密度が互いに重なる交点（確率密度の大小が入れ替わる位置で、それぞれの極大値の間）を求め、また、上記バリアント型をホモとして有している場合、野生型をホモとして有している場合、又はヘテロとして有している場合それぞれ平均値を求める。そして、バリアント型をホモとして有している場合とヘテロとして有している場合の閾値としては、（バリアント型をホモとして有している場合の平均値とヘテロとして有している場合の平均値）の平均値と交点の平均値として算出することができる。同様にヘテロとして有している場合と野生型をホモとして有している場合の閾値としては、（ヘテロとして有している場合の平均値と野生型をホモとして有している場合の平均値）の平均値と交点の平均値として算出することができる。
　上記方法でＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子、Ｒ３ＨＣＣ１遺伝子、ＯＲ５１Ｉ２遺伝子、ＭＫＫＳ遺伝子、ＥＤＥＭ３遺伝子、又はＡＣＯＸ１遺伝子をコードする領域における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡若しくは遺伝的連鎖にある一塩基多型を分析し、バリアント型をホモとして有しているか、野生型をホモとして有しているか、又はヘテロとして有しているかを判定することで、イリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助することができる。たとえば、予めイリノテカンの副作用の発生が生じた患者と生じなかった患者におけるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子、Ｒ３ＨＣＣ１遺伝子、ＯＲ５１Ｉ２遺伝子、ＭＫＫＳ遺伝子、ＥＤＥＭ３遺伝子、又はＡＣＯＸ１遺伝子をコードする領域における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡若しくは遺伝的連鎖にある一塩基多型との関係を調べる。次に、対象となる患者の一塩基多型を調べ、予め調べた患者のデータと比較することで、対象となる患者においてイリノテカンの副作用の発生リスクの予測を補助することができる。
　具体的には、上記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）から選ばれる１種以上、好ましくは２種以上、より好ましくは３種の一塩基多型においてバリアント型をホモとして有している場合、及び／又は（ｃ）、（ｅ）～（ｇ）から選ばれる１種以上、好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上、最も好ましくは４種の一塩基多型において野生型をホモとして有している場合には、イリノテカンによる副作用の発生リスクが高いとの予測を補助することができる。逆に、上記（ａ）、（ｂ）、（ｄ）から選ばれる１種以上、好ましくは２種以上、より好ましくは３種の一塩基多型において野生型をホモとして有している場合、及び／又は（ｃ）、（ｅ）～（ｇ）から選ばれる１種以上、好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上、最も好ましくは４種の一塩基多型においてバリアント型をホモとして有している場合には、イリノテカンによる副作用の発生リスクが低いとの予測を補助することができる。
　さらに、上記（ａ）～（ｇ）から選ばれる２種以上、好ましくは３種以上、より好ましくは５種以上、さらに好ましくは７種の一塩基多型において、すべてヘテロとして有している場合、イリノテカンによる副作用の発生リスクが高いとの予測を補助することもできる。
　本発明のイリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助するためのキットとしては、本発明のプローブ又は本発明のプライマーを含んでいれば特に制限されず、さらに一塩基多型を分析するための緩衝液、酵素等の試薬や、イリノテカンによる副作用の発生リスクが高いとの予測を補助するための説明書を含んでもよい。
［イリノテカンの副作用関連因子の探索］
　イリノテカンの重篤な副作用は、ＵＧＴ１Ａ遺伝子に副作用と関連する多型（ＵＧＴ１Ａ１＊６、＊２７、＊２８、ＵＧＴ１Ａ７（３８７Ｔ＞Ｇ、６２２Ｔ＞Ｃ）、ＵＧＴ１Ａ９＊１ｂ、ＵＧＴ１Ａ１＊６０の７ヶ所）を全く持っていない患者においてさえも散見される。そこで、新たなイリノテカンの副作用関連因子の探索を以下の方法で行った。
（解析対象）
　コントロール群として上述の７ヶ所の多型が全て副作用リスクの低い遺伝子型であって、副作用がみられなかった症例群（グループ１：ｎ＝５）、ケース群として上述のＵＧＴ１Ａ遺伝子の７ヶ所の多型が全て副作用リスクの低い遺伝子型であったにもかかわらず副作用（Ｇｒａｄｅ３：白血球減少、好中球減少）がみられた症例群（グループ２：ｎ＝５）、上記７ヶ所のいずれかの多型をヘテロに有し、初回投与時から極めて重篤な副作用（Ｇｒａｄｅ４：白血球減少、好中球減少）がみられた症例群（グループ３：ｎ＝５）の末梢血より調製したゲノムＤＮＡを用いて次世代シーケンサーによるエクソーム解析を行った。なお、いずれの症例群も日本人である。
（ゲノムＤＮＡの調製）
　ゲノムＤＮＡは、ＥＤＴＡ含有チューブに採取した被検者の末梢血を用い、ヨウ化ナトリウム法（Wang et al., Nucleic Acids Res 34:195-201(2014)）に基づいて調製した。調製したＤＮＡは、１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、使用するまで、４℃又は－２０℃で保存した。
（次世代シーケンサーによるエクソーム解析）
　次世代シーケンサーによるエクソーム解析は、次の方法で行った。まず、調製したゲノムＤＮＡを分光光度計（Nanodrop（登録商標）：スクラム社製）を用いて吸光度から濃度を定量し、アガロースゲル電気泳動により品質検定を行った。その後、ゲノムＤＮＡをアコースティックソルビライザー（コバリス社製）を用いて１５０～２００ｂｐに断片化し、アダプターをライゲートした。次いで、断片化したゲノムＤＮＡをＰＣＲで増幅し、SureSelect（登録商標） Oligo Captureライブラリー（アジレント・テクノロジー社製）とハイブリダイゼーションさせ、ストレプトアビジン磁気ビーズにより回収して濃縮した。回収したＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｉｎｄｅｘ付きプライマーを使用してＰＣＲによる増幅を行い、Ｉｎｄｅｘを付加し、シーケンスライブラリーとした。作製されたシーケンスライブラリーの品質をAgilent 2100 Bioanalyzer（アジレント・テクノロジー社製）を用いて測定した。シーケンスライブラリーをHiSeq 2000（イルミナ社製）を用いて解析することで、鋳型ＤＮＡ塩基配列を取得した。得られた塩基配列について、クリーンリードを抽出し、Burrows-Wheeler Aligner（BWA）(0.7.12)を用いて参照配列（UCSC hg19：ヒトリファレンスゲノム）にマッピングした。
　次にエクソーム解析から得られた各検体における各遺伝子多型について、The Genome Analysis Toolkit(GATK)(3.4-46)によって遺伝子多型を抽出し、さらにsnpEff(v4.1k)によってアミノ酸配列への影響等のアノテーションを付与し、アミノ酸配列への影響が推定される遺伝子多型をSnpEff、sorts intolerant from tolerant(SIFT)、polymorphism Phenotyping (PolyPhen)に基づいて抽出した。コントロール群とケース群との違いは次の式（I）による標準化平均値差（d:standardized difference）を用いてランキングを行った。式中、ＰTはケース（テスト）群における該遺伝子多型アレルの割合、ＰCはコントロール群における該遺伝子多型アレルの割合である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　その結果、ＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ３９４６００３、ｒｓ１９８０５７６、ｒｓ７２６５８５４、Ｒ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ２２７２７６１、ｒｓ２２７２７６２、ｒｓ１３５３０、ＯＲ５１Ｉ２遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ１２５７７１６７、ＭＫＫＳ遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ１５４５、ｒｓ１５４７、ＣＳＭＤ２遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ４７４４７４、ＥＤＥＭ３遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ９４２５３４３、ＧＡＴＡ２遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ２３３５０５２、ＴＲＩＭ６５遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ３７６０１２８、ｒｓ７２２２７５５、ｒｓ７２２２７５７、ＦＢＦ１遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ２３０５９１３、又はＡＣＯＸ１遺伝子をコードする領域における一塩基多型ｒｓ１１３５６４０の一塩基多型をイリノテカンの副作用因子の候補として得た。それぞれの遺伝子のエクソーム解析の結果をIntegrative Genomics Viewer (IGV, Broad Institute社製)ソフトウェアにより可視化したものを図１～７に示す。図中、一塩基多型の位置を四角で囲んでおり、太線が野生型をホモとして有している場合、点線がヘテロとして有している場合、細線がバリアント型をホモとして有している場合である。また、本実施例において、ｒｓ１９８０５７６とｒｓ３９４６００３（図１）、ｒｓ２２７２７６１とｒｓ２２７２７６２及びｒｓ１３５３０（図２）、ｒｓ１５４５とｒｓ１５４７（図３）、ｒｓ１１３５６４０とｒｓ３７６０１２８、ｒｓ７２２２７５５、ｒｓ７２２２７５７、及びｒｓ２３０５９１３ （図６、７）は完全連鎖を示した。
［エクソーム解析結果の検証］
（エクソーム解析結果の検証の手法）
　実施例１の結果によって得られたイリノテカンの副作用因子の候補のうち、ＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする領域の一塩基多型ｒｓ１９８０５７６、Ｒ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする領域の一塩基多型ｒｓ２２７２７６１、ＯＲ５１Ｉ２遺伝子をコードする領域の一塩基多型ｒｓ１２５７７１６７、ＭＫＫＳ遺伝子をコードする領域の一塩基多型ｒｓ１５４７、ＥＤＥＭ３遺伝子をコードする領域の一塩基多型ｒｓ９４２５３４３、ＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする領域の一塩基多型ｒｓ７２６５８５４、ＡＣＯＸ１遺伝子をコードする領域の一塩基多型ｒｓ１１３５６４０について、さらにTaqMan（登録商標）probe法により、日本人のイリノテカン投与大腸癌患者７５症例の臨床サンプルにて検証を行った。ゲノムＤＮＡ１０ｎｇにTaqMan SNP Assays_ Human (Applied Biosystems社製) 及びLightCycler（登録商標）480 Probe Master（Roche Diagnostics社製）、Universal ProbeLibrary（Roche Diagnostics社製）、LightCycler480 System II（RocheDiagnostics社製）を用いてジェノタイピングを行った。９５℃１０分間のインキュベーションの後、ＰＣＲをｒｓ１９８０５７６、ｒｓ２２７２７６１、ｒｓ９４２５３４３については５５サイクル、ｒｓ１２５７７１６７、ｒｓ７２６５８５４、ｒｓ１１３５６４０については４５サイクル、ｒｓ１５４７については４０サイクル（１サイクルあたり９２℃１５秒、６０℃６０秒）行い、ＰＣＲ産物の蛍光を測定した。
（結果）
　図８、９に、上記ＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅ法により解析した結果を示す。ｒｓ１１３５６４０のみ７４症例での解析となったことから、図８、９にはすべてのジェノタイピングについて７４症例での解析結果を示す。横軸及び縦軸はそれぞれのアレルに対する蛍光標識（ＦＡＭ及びＶＩＣ）プローブからの蛍光値であり、黒丸、濃灰色丸、薄灰色（ドット柄）丸はそれぞれエクソーム解析においてバリアント型をホモとして有していた症例、野生型をホモとして有していた症例、ヘテロとして有していた症例を表し、白丸はエクソーム解析未実施の症例である。図８、９より、ＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅ法により明瞭にジェノタイプを区別できることが確認され、また、エクソーム解析の結果がＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅ法によっても再現された。
［ＵＧＴ１Ａ遺伝子変異との連鎖］
　実施例２における７４症例について、ｒｓ９４２５３４３、ｒｓ２２７２７６１、ｒｓ１２５７７１６７、ｒｓ１１３５６４０、ｒｓ１５４７、ｒｓ７２６５８５４、ｒｓ１９８０５７６や、ＵＧＴ１Ａ遺伝子変異であるＵＧＴ１Ａ９＊１ｂ、ＵＧＴ１Ａ７［３８７］、ＵＧＴ１Ａ７［６２２］、ＵＧＴ１Ａ１＊６０、ＵＧＴ１Ａ１＊２８、ＵＧＴ１Ａ１＊６又はＵＧＴ１Ａ１＊２７におけるＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅ法及びダイレクトシーケンス法により各ＵＧＴ遺伝子のジェノタイプを決定し、さらに連鎖不平衡解析及びＬＤ解析をＨａｐｌｏｖｉｅｗ４．２ソフトウェアで実施した。結果を図１０に示す。図１０において、数値は相関系数（r2）である。図１０に示すように、ｒｓ９４２５３４３、ｒｓ２２７２７６１、ｒｓ１２５７７１６７、ｒｓ１１３５６４０、ｒｓ１５４７、ｒｓ７２６５８５４、ｒｓ１９８０５７６はＵＧＴ１Ａ遺伝子変異との連鎖（相関）はみられなかった。また、ｒｓ９４２５３４３、ｒｓ２２７２７６１、ｒｓ１２５７７１６７、ｒｓ１１３５６４０、ｒｓ１５４７、ｒｓ７２６５８５４、ｒｓ１９８０５７６間においても連鎖は見られなかったことから、これらの一塩基多型（マーカー部位）は相補的にイリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助する方法に用いることができることが明らかとなった。
　実施例２における７５症例のうち、ＵＧＴ１Ａ１＊６（ホモ）（２症例）、ＵＧＴ１Ａ１＊２８（ホモ）（２症例）、ＵＧＴ１Ａ１＊６（ヘテロ）及び＊２８（ヘテロ）（３症例）を除いた６８症例について、それぞれの変異と副作用（血液毒性：Ｔｏｘｉｃｉｔｙ）の発生頻度との関係を表２に示す。表２におけるＰ値（Ｐ　ｖａｌｕｅ／Ｃ．－Ａ．）はコクラン・アーミテージ傾向検定の結果である。さらに、上記６８症例のうち１症例を除いた６７症例について、フィッシャーの正確確率検定（Fisher’s Exact Test）を行った結果を表３に示す。表３中、Ｏｄｄｓ　ｒａｔｉｏはフィッシャーの正確確率検定により野生型ホモ若しくはバリアント型ホモにおける副作用発生のオッズ比を算出したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表２に示すように、従来のイリノテカン副作用リスクの判定に用いられるＵＧＴ１Ａ遺伝子多型から低副作用リスクと判断される６８症例において、４２．６％の症例（２９症例）ではイリノテカン副作用が観察された。一方、ｒｓ１９８０５７６、ｒｓ２２７２７６１、ｒｓ１５４７、ｒｓ９４２５３４３、ｒｓ１１３５６４０は、ＵＧＴ１Ａ遺伝子多型から低副作用リスクと判断される症例においてイリノテカンの副作用発生頻度との有意な線形傾向がみられた。また、表３より、ｒｓ２２７２７６１において野生型をホモとして有している（G/G）症例は１例も血液毒性を示さないことが明らかとなった。
　次に、実施例２における７５症例のうち、ＵＧＴ１Ａ１＊６（ホモ）（２症例）を除いた７３症例について、それぞれの変異と副作用（血液毒性：Ｔｏｘｉｃｉｔｙ）の発生頻度との関係を表４に示す。表４における（Ｐ　ｖａｌｕｅ／Ｃ．－Ａ．）は表２と同様である。さらに、上記７３症例のうち１症例を除いた７２症例について、フィッシャーの正確確率検定を行った結果を表５に示す。表５中、Ｏｄｄｓ　ｒａｔｉｏは表３と同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表４に示すように、ｒｓ１９８０５７６、ｒｓ２２７２７６１、ｒｓ１１３５６４０に加えてｒｓ１２５７７１６７及びｒｓ７２６５８５４は、ＵＧＴ１Ａ遺伝子多型から高副作用リスクと判断される症例も含めた７３症例において、イリノテカンの副作用発生頻度との有意な線形傾向がみられた。さらに、表５より、ｒｓ７２６５８５４においてバリアント型をホモとして有している（C/C）症例は血液毒性発生オッズ比が０．１であることが明らかとなった。
　したがって、ＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする領域の一塩基多型ｒｓ１９８０５７６、ｒｓ７２６５８５４、Ｒ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする領域の一塩基多型ｒｓ２２７２７６１、ＯＲ５１Ｉ２遺伝子をコードする領域の一塩基多型ｒｓ１２５７７１６７、ＭＫＫＳ遺伝子をコードする領域の一塩基多型ｒｓ１５４７、ＥＤＥＭ３遺伝子をコードする領域の一塩基多型ｒｓ９４２５３４３、ＡＣＯＸ１遺伝子をコードする領域の一塩基多型ｒｓ１１３５６４０を分析し、バリアント型をホモとして有しているか、野生型をホモとして有しているか、ヘテロとして有しているかを判定することで、従来のＵＧＴ１Ａ遺伝子多型からは予測出来なかったイリノテカンの副作用の発生リスクの予測を精度よく補助できることが明らかとなった。
　実施例２における７５症例のうち３症例を除いたイリノテカン投与大腸癌患者（FOLFIRI;７２症例）、及び、イリノテカン非投与大腸癌患者（FOLFOX;４４症例）について、ｒｓ２２７２７６１を解析した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６の結果から、イリノテカンの有無によらず、ｒｓ２２７２７６１において野生型をホモとして有している（G/G）症例は、１例も血液毒性を示さないことが明らかとなった。
　本発明によると、イリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助することが可能となることから、医療分野で利用可能である。

Claims (7)

  1. 被検者から採取された生体試料中のゲノムＤＮＡ上に存在するＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子、Ｒ３ＨＣＣ１遺伝子、ＯＲ５１Ｉ２遺伝子、ＭＫＫＳ遺伝子、ＥＤＥＭ３遺伝子、又はＡＣＯＸ１遺伝子をコードする領域における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡若しくは遺伝的連鎖にある一塩基多型を分析し、バリアント型をホモとして有しているか、野生型をホモとして有しているか、又はヘテロとして有しているかを判定し、イリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助する方法。
  2. ＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子、Ｒ３ＨＣＣ１遺伝子、ＯＲ５１Ｉ２遺伝子、ＭＫＫＳ遺伝子、ＥＤＥＭ３遺伝子、又はＡＣＯＸ１遺伝子をコードする領域における一塩基多型が以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかであることを特徴とする請求項１記載の方法。
    （ａ）配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の１８６番目の塩基に存在する一塩基多型；
    （ｂ）配列番号２に示されるＲ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の３５８番目の塩基に存在する一塩基多型；
    （ｃ）配列番号３に示されるＯＲ５１Ｉ２遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の４００番目の塩基に存在する一塩基多型；
    （ｄ）配列番号４に示されるＭＫＫＳ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の１５４９番目の塩基に存在する一塩基多型；
    （ｅ）配列番号５に示されるＥＤＥＭ３遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の２４５９番目の塩基に存在する一塩基多型；
    （ｆ）配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の２３８番目の塩基に存在する一塩基多型；
    （ｇ）配列番号６に示されるＡＣＯＸ１遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の９３６番目の塩基に存在する一塩基多型；
  3. （ａ）、（ｂ）又は（ｄ）に記載の一塩基多型においてバリアント型をホモとして有している場合、又は（ｃ）、（ｅ）～（ｇ）に記載の一塩基多型において野生型をホモとして有している場合にはイリノテカンによる副作用の発生リスクが高いとの予測を補助することを特徴とする請求項２記載の方法。
  4. 副作用が、白血球減少又は好中球減少であることを特徴とする請求項１～３のいずれか記載の方法。
  5. 以下の（ｈ）～（ｎ）のいずれかであって、請求項１～４のいずれかに記載の方法における一塩基多型の分析で用いるためのプローブ。
    （ｈ）配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の１８６番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
    （ｉ）配列番号２に示されるＲ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の３５８番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
    （ｊ）配列番号３に示されるＯＲ５１Ｉ２遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の４００番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
    （ｋ）配列番号４に示されるＭＫＫＳ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の１５４９番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
    （ｌ）配列番号５に示されるＥＤＥＭ３遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の２４５９番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
    （ｍ）配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の２３８番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
    （ｎ）配列番号６に示されるＡＣＯＸ１遺伝子をコードする塩基配列、又はその相補配列の９３６番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する５～５０塩基の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
  6. 以下の（ｏ）～（ｕ）のいずれかであって、請求項１～４のいずれかに記載の方法における一塩基多型の分析で用いるためのプライマー。
    （ｏ）配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列の１８６番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
    （ｐ）配列番号２に示されるＲ３ＨＣＣ１遺伝子をコードする塩基配列の３５８番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
    （ｑ）配列番号３に示されるＯＲ５１Ｉ２遺伝子をコードする塩基配列の４００番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
    （ｒ）配列番号４に示されるＭＫＫＳ遺伝子をコードする塩基配列の１５４９番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
    （ｓ）配列番号５に示されるＥＤＥＭ３遺伝子をコードする塩基配列の２４５９番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
    （ｔ）配列番号１に示されるＡＰＣＤＤ１Ｌ遺伝子をコードする塩基配列の２３８番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
    （ｕ）配列番号６に示されるＡＣＯＸ１遺伝子をコードする塩基配列の９３６番目の塩基に存在する一塩基多型部位を含む連続する少なくとも５塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマー；
  7. 請求項５記載のプローブ、又は請求項６記載のプライマーを含むことを特徴とするイリノテカンによる副作用の発生リスクの予測を補助するためのキット。
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