JP2005508312A - Mdr1に基づいた癌治療の改善のための手段および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、本発明に従ってのポリヌクレオチドを含む対立遺伝子を含む遺伝子型を有する患者における、結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、および膵臓癌の治療用医薬組成物を製造するための、カンプトテシン系薬剤、例えばイリノテカン(CPT−11)またはその誘導体の使用に関する。好ましくは、当該ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの欠失、付加、および/または置換により、対応する野生型対立遺伝子と比較しての変異型対立遺伝子の発現に変化をきたす、または対応する野生型対立遺伝子にコードされたポリペプチドと比較しての、変異型対立遺伝子にコードされたポリペプチドの活性に変化をきたすものとする。最後に本発明は、結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、または膵臓癌の患者のための適切な治療を選択する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
イリノテカンは、東洋の樹木から得られる細胞毒性アルカロイドのカンプトテシン(CPT)の半合成類似体であるが、このカンレンボクのカンプトテシン(Camptotheca acuminata Camptothecins)は、DNAの一方の鎖の可逆的な切断を誘導することによりDNA鎖のねじれを解消する酵素であるトポイソメラーゼIを特異的に阻害することによる抗新生物形成活性を示す[D'Arpa,et al.,1989, Biochim Biophys Acta 989: 163-77, Horwitz, et al., 1973, Cancer Res 33: 2834-6]。イリノテカンおよびその活性代謝物SN−38はトポイソメラーゼI−DNA複合体に結合し、これらの一方の鎖の再連結を妨げる[Kawato, et al., 1991, Cancer Res 51: 4187-91]。イリノテカンは、親油性代謝物SN−38(7−エチル−10−ヒドロキシカンプトテシン)の水溶性プロドラッグとして作用し、このSN−38は、カンプトテシン部分とジピペリジノ側鎖の間のカルバメート結合のカルボキシルエステラーゼを介した開裂により、イリノテカンから生成される[Tsuji, et al., 1991, J Pharmacobiodyn 14:341-9]。カルボキシルエステラーゼ−2は、薬理学的濃度でこの加水分解に関与する主要な酵素である[Humerickhouse, et al., 2000, Cancer Res 60: 1189-92]。トポイソメラーゼの阻害およびイリノテカンの関与する1本鎖の切断は、主にSN−38に起因する[Kawato, et al., 1991, Cancer Res 51: 4187-91]。イリノテカンの投与は、げっ歯目由来の癌および様々な組織のタイプのヒトの癌の異種移植を行ったマウスにおいて、抗腫瘍活性が得られた[Furuta, et al., 1988, 癌と化学療法 15: 2757-60, Giovanella, et al., 1989, Science 246: 1046-8, Giovanella, et al., 1991, Casncer Res 51: 3052-5, Hawkins, 1992, Oncology (Huntingt) 6: 17-23, Kunimoto, et al., 1987, Cancer Res 47: 5944-7]。
【0003】
イリノテカンはまた、CYP3A4およびCYP3A5により酸化される[Hazz, et al., 1998, Drug Metab Dispos 26: 769-74, Kuhn, 1998,Oncology(Huntingt)12: 39-42, Santos, et al., 2000, Clin Cancer Res 6: 2012-20, Rivory, et al., 1996, Cancer Res 56: 3689-94]。SN−38の主要な排泄経路はグルクロン酸との抱合により、対応するグルクロニド(SN−38G)を形成することである[Atsumi, et al., 1991, Xenobiotica 21: 1159-69]。SN−38Gは腸内ミクロフローラにより脱抱合され、SN−38を生成することが報告されている[Kaneda, et al., 1990, Cancer Res 50: 1715-20]。SN−38のグルクロン酸化はUGT1A1およびUGT1A7により仲介される[Lyer, et al., 1998, J Clin Invest 101: 847-54, Ciotti, et al., 1999, Biochem Biophys Res Commun 260: 199-202]。質量平衡の研究は総投与量の64%が大便中に排泄されることを示し、胆汁排泄の重要な役割を立証した[Slatter, et al., 2000, Drug Metab Dispos 28: 423-33]。P糖タンパク質もまたイリノテカンの排泄にかかわっている[Chu, et al., 1998, Cancer Res 58: 5137-43, Chu, et al.,1999, Drug Metab Dispos 27: 440-1, Chu, et al., 1999, J Pharmacol Exp Ther 288: 735-41, Mattern, et al., 1993, Oncol Res 5: 467-74, Hoki, et al., 1997, Cancer Chemother Pharmacol 40: 433-8, Sugiyama, et al., 1998, Cancer Chemother Pharmacol 42: S44-9]が、多剤耐性タンパク質1(MRP1)がイリノテカンおよびその代謝物の主要な輸送体であり[Kuhn, 1998, Oncology (Huntingt) 12: 39-42, Chen, et al., 1999, Mol Pharmacol 55: 921-8, Chu, et al., 1997, Cancer Res 57: 1934-8, Chu, et al., 1997, J Pharmacol Exp Ther 281: 304-14]、これらの胆汁排泄を促進しているが、その際にこれらが副作用の原因となることを、複数の研究が示唆している。
【0004】
カンプトテシンに対する細胞の耐性、およびしたがってイリノテカンについての治療応答は、細胞内のカルボキシルエステラーゼの活性およびトポイソメラーゼIの切断活性に関連していた[van Ark-Otte, et al., 1998, Br J Cancer 77: 2171-6, Guichard, et al., 1999, Br J Cancer 80: 364-70]。
【0005】
このようなカンプトテシン系薬剤、例えばイリノテカン、の使用は、その副作用が致死的であると証明され得る悪心、嘔吐、腹痛、および下痢を含む、明らかに投与依存性の骨髄抑制および消化管毒性により限定される。イリノテカン治療の投与を限定する主な毒性は下痢であるが、これは患者の88%までに起こり、SN−38の胆汁排泄から二次的に起こる、腸内のSN−38の蓄積に依存し[van Ark-Otte, et al., 1998, Br J Cancer 77: 2171-6, Guichard, et al., 1999, Br J Cancer 80: 364-70, Araki, et al., 1993, Jpn J Cancer Res 84: 697-702]、その程度はSN−38のグルクロン酸化により決定される[Gupta, et al., 1994, Cancer Res 54: 3723-5, Gupta et al., 1997, J Clin Oncol 15: 1502-10]。骨髄抑制は、イリノテカンおよびSN−38双方の濃度−時間曲線における面積との相関が認められた[Sasaki, et al., 1995, Jpn J Cancer Res 86: 101-10]。
【0006】
1997年に5−フルオロウラシル治療に難治性の転移性結腸直腸癌の患者に対してイリノテカンが承認されたにもかかわらず、治療の有益性は明確ではない。最近の結腸直腸癌に関する2000名以上の患者を含む2つの大規模臨床試験は、治療の最初の60日間以内にイリノテカンの毒性に関する死亡率がほぼ3倍に増加したため、National Institute of Cancer(NCI)により中止せざるをえなかった。死亡原因は下痢および嘔吐による脱水、ならびに好中球減少による敗血症であった[2001, arznei-telegramm 32:58]。イリノテカンは癌そのものに対しては有効であることが証明されたが、短期間の毒性のためすべての患者が長期的な生存による有益性を得ることはできなかった。したがってイリノテカンの毒性を最も受けやすいと思われるこれらの患者を同定することが、強く望まれる。
【0007】
現在、他の抗新生物薬と併用して、最初にイリノテカンを60から125mg/m2の標準的な用量で3から4週毎に投与するコースを数回行い、続いての用量は個々の患者の治療への耐性に基づいて25から50mg/m2の増量を調整する、というおおかたの治療計画に従って患者の治療を行っている。イリノテカンの関与する毒性からの回復のため、治療を1から2週間遅らせることがあるが、患者が回復しない場合には治療を中止しなければならない。ただし耐えられない毒性を発症しない場合には、患者が臨床的な有益性を得られている限り、さらなるコースによる治療を確定はできないが継続する。応答率は腫瘍のタイプにより10%未満からほぼ90%までと様々である。しかし治療への応答を評価し、代わりの治療を考慮するには少なくとも6から8週かかる。したがってその患者にとって適正な用量を見出すのは長たらしく、時間がかかり、そして、生命を脅かす副作用のリスクを負うこととなる。治療からの有益性の得られない患者がこのリスクを不必要に負う可能性もあり、加えてこれらの患者が彼らに適した治療を受ける前に貴重な時間が浪費されることになる。
【0008】
さらに、多くの化学治療剤で観察されるように、治療に対して細胞の耐性が出現するリスクは、化学治療薬、例えばイリノテカンを至適以下で細胞を暴露することで増加する。
胆汁排泄(例えばMRPおよびP糖タンパク質)の阻害剤およびUGT1A1の誘導物質により薬物動態学的に修飾することが、カプトテシンの関与する毒性の低減手段として示唆された[Gupta, et al., 1996, Cancer Res 56: 1309-14, Gupta, et al., 1997, Cancer Chemother Pharmacol 39: 440-4]。シクロスポリンAおよびフェノバルビタルと併用してのイリノテカンの臨床試験の予備データは、カンプトテシンの関与する下痢を抑えることに関してある程度期待できる結果を示す[Ratain, 2000, Clin Cancer Res 6: 3393-4]が、薬剤、例えばシクロスポリンAおよびフェノバルビタルとの併用治療は、有害作用および薬剤相互作用のさらなるリスクを負うことにもなる。
【0009】
SN−38およびSN−38G双方の薬物動態は患者間に大きなばらつきがある[Canal, et al., 1996, J Clin Oncol 14: 2688-95]が、これはイリノテカンの代謝経路における患者間の相違によると思われる[Rivory, et al., 1997, Clin Cancer Res 3: 1261-6]。さらに重症のイリノテカンの毒性が、ギルバート症候群の患者で報告された[Wasserman, et al., 1997, Ann Oncol 8: 1049-51]。その結果、UGT1A1活性の低い患者はイリノテカンの毒性に対するリスクが高いという、イリノテカンの代謝についての遺伝的素因が示唆された[Iyer, et al., 1998, J Clin Invest 101: 847-54, Ando, et al., 1998, Ann Oncol 9: 845-7]。UGT1A1プロモーターにおける共通の多型[Monaghan et al., 1996, Lancet 347: 578-81]がin vitroのSN−38のグルクロン酸化と相関しており[Iyer, et al., 1999, Clin Pharmacol Ther 65:576-82]、その臨床使用の可能性が症例コントロール試験から示唆された[Ando, et al., 2000, Cancer Res 60: 6921-6]。しかしイリノテカンの関与する毒性がUGT1A1の遺伝型によって予測できたのは、影響を受けた患者のうちの少数(<15%)にすぎなかった。
【0010】
結論として、カンプトテシンに基づく治療の治療効能および安全性を有意に改善し、治療に起因する致死性を回避し、不必要な耐性の出現を回避し、有害作用および治療の遅れによる入院費用を削減することが切望されてきた。しかしイリノテカンの毒性を軽減する、または治療効能を改善するための納得できるメカニズムは現在解明されていない。
【0011】
したがって本発明の根底にある技術的な問題は、結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、および膵臓癌の効率的な治療のための改善された手段および方法を提供することであり、それにより前述の有害な副作用を避けることができる。本発明の根底にある技術的な問題は、本請求項に特徴を示した態様により解決する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0012】
したがって本発明は、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む対立遺伝子を含むゲノムを有する被験者における、癌、特に結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、および膵臓癌の治療用医薬組成物を製造するための、イリノテカンまたはその誘導体の使用に関し、その群は:
(a)SEQ.ID NO:337、338、341、342、345、346、349、350、353、354、357、358、361、362、365、366、369、370、373、374、377、378、381、382、385、386、389、390、393、394、397、398、401、402、405、406、409、410、413、414、417、418、421、422、425、426、429、430、433、434、437、438、441、442、445、446、449、450、453、454、457、458、461、462、465、466、469、470、473、474、477、478、481、482、485、486、489、490、493、494、497、498、501、502、505、506、509、510、513、514、517、518、521、522、525、526、636、637、640および/または641のいずれか一つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)SEQ.ID NO:606、608、610、612、618、620、622、624、および/または628のいずれか一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)多剤耐性1(MDR1)遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の140837、141529、141590、145984、171404、171456、171466、171511、171512、174901、175068、175074、175142、175180、139015、139064、139119、139177、139276、140118、140216、140490、140568、140576、140595、140727、139479、139619、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の84701、83946、83973、84032、84074、84119、77811、78170、73252、70200、70204、70237、70253、70371、65241、50537、43263、43162、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の101、308、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の137、176の位置に対応する位置に、少なくとも1つのヌクレオチドの置換または欠失を有する、ポリヌクレオチド;
(d)MDR1遺伝子とハイブリダイズることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の83946、70200、70237、65241、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の101、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の141529、174901、139177、140118、140568、140727、139479の位置に対応する位置にAを有する、MDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の308、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の84701、83973、84074、84119、78170、70204、70253、70371、50537、43162、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の137または176、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の145984、171466、175068、175074、139064、139276、140576の位置に対応する位置にTを有する、MDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の140837、171404、171456、171511、171512、139119、140490、139619、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の43263の位置に対応する位置にCを有する、MDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の84032、77811、73252、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の141590、175142、175180、139015、140216、140595の位置に対応する位置にGを有する、ポリヌクレオチド;
(e)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、当該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の21、103、168、400、893、999、1001、1107および/または1141の位置に対応する位置にアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド;
(f)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、当該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の21の位置に対応する位置でAsnからAspに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の103の位置に対応する位置でPheからLeuに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の168の位置に対応する位置でValからIleに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の400の位置に対応する位置でSerからAsnに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の893の位置に対応する位置でAlaからSerに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の999の位置に対応する位置でAlaからThrに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の1001の位置に対応する位置でAlaからThrに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の1107の位置に対応する位置でGlnからProに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の1141の位置に対応する位置でSerからThrへのアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド;
である。
【0013】
“イリノテカンまたはその誘導体”という用語は本発明にしたがって使用する場合、好ましくは以下の一般構造式を特徴とする物質、
【0014】
【化1】
【0015】
さらに米国特許US05106742号、US05340817号、US05364858号、US05401747号、US05468754号、US05559235号、およびUS05663177号に記載されている物質をいう。さらにまた“イリノテカンまたはその誘導体”という用語は、カンプトテシンの類似体および誘導体を含む。利用可能なカンプトテシン誘導体のタイプおよび範囲は当該技術分野の業者に周知であり、例えば以下の多数の書籍に記載されている[Hawkins, 1992, Oncology (Huntingt) 6:17-23, Burris, et al., 1994, Hematol Oncol Clin North Am 8: 333-35, Slichenmyer, et al., 1993, J Natl Cancer Inst 85: 271-91, Slichenmyer, et al., 1994, Cancer Chmother Pharmacol 34: S53-7]。活性なカンプトテシン類似体の特定の例は、6員環カンプトテシン類似体、9−ニトロ−カンプトテシン、9位または10位がアミノ基、ハロゲンまたはヒドロキシル基で置換されている20S抱合体(20S configuration)を含むカンプトテシン類似体、7位で置換されている水溶性カンプトテシン、9位で置換されているカンプトテシン、E環が修飾されているカンプトテシン、例えば(RS)−20−デオキシアミノ−7−エチル−10−メトキシカンプトテシン、および10位で置換されているカンプトテシン類似体である[Emerson, et al., 1995, Cancer Res 55: 603-9, Ejima, et al., 1992, Chem Pharm Bull (Tokyo) 40: 683-8, Sugimori, et al., 1994, J Med Chem 37: 3033-9, Wall, et al., 1993, J Med Chem 36: 2689-700, Wani, et al., 1980, J Med Chem 23: 554-60, Kingsbury, et al., 1991, J Med Chem 34: 98-107]。類似の治療活性を有する、他の様々なカンプトテシン類似体が記載されている[Hawkins, 1992, Oncology (Huntingt) 6: 17-23, Burris and Fields, 1994, Hematol Oncol Clin North Am 8: 333-55, Slichenmyer, et al., 1993, J Natl Cancer Inst 85: 271-91, Slichenmyer, et al., 1994, Cancer Chemother Pharmacol 34: S53-7]。カンプトテシン類似体を合成する適切な方法が記載されている[Emerson, et al., 1995, Cancer Res 55: 603-9, Ejima, et al., 1992, Chem Pharm Bull (Tokyo) 40: 683-8, Sugimori, et al., 1994, J Med Chem 37: 3033-9, Wall, et al., 1993, J Med Chem 36: 2689-700, Wani, et al., 1980, J Med Chem 23: 554-60, Kingsbury et al., 1991, J Med Chem 34: 98-107, Sugasawa, et al., 1976, J Med Chem 19: 675-9]。
【0016】
当該物質は記載されているように、例えば 結腸直腸癌、非小細胞肺癌および小細胞肺癌、食道癌、腎細胞癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、扁平上皮細胞癌、白血病およびリンパ腫において、治療上有用であることが知られている[Kawato, et al., 1991, Cancer Res 51: 4187-91, Furuta, et al., 1988, 癌と化学療法15: 2757-60, Hawkins, 1992, Oncology (Huntingt) 6: 17-23, Slichenmyer, et al., 1993, J Natl Cancer Inst 85: 271-91, Slichenmyer, et al., 1994, Cancer Chemother Pharmacol 34: S53-7, Tsuruo, et al., 1988, Cancer Chemother Pharmacol 21: 71-4, Wiseman, et al., 1996, Drugs 52: 606-23, Gottlieb, et al., 1970, Cancer Chemother Rep 54: 461-70, Negoro, et al., 1991, J Natl Cancer Inst 83: 1164-8, Rowinsky, et al., 1994, Cancer Res 54: 427-36]。あらゆる化学的修飾の方法で得ることのできるこれらの物質の誘導体もまた本発明の使用に含まれるが、その場合該誘導体は本発明の使用に関して等しく十分に治療に適するものとする。本発明の物質の誘導体が本発明の使用に等しく十分に治療に適するかどうかを決定するため、当該技術分野の周知の生物学的アッセイを行うことができる。このようなアッセイは例えば以下に記載されている[Kawato, et al., 1991, Cancer Res 51: 4187-91, Furuta, et al., 1988, 癌と化学療法15: 2757-60, Giovanella et al., 1989, Science 246: 1046-8, Giovanella et al., 1991, Cancer Res 51: 3052-5, Kunimoto, et al., 1987, Cancer Res 47: 5944-7, Mattern, et al., 1993, Oncol Res 5: 467-74, Tsuruo, et al., 1988, Cancer Chemother Pharmacol 21: 71-4, Burris, et al., 1992, J Natl Cancer Inst 84: 1816-20, Friedman, et al., 1994, Cancer Chemother Pharmacol 34: 171-4]。
【0017】
上の文献に記載されているいずれの化合物も本発明に使用してもよいことを企図する。
イリノテカンは特に結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、および膵臓癌の治療に十分に適することが示された。したがって、最も好ましくは本発明により使用する物質はイリノテカンである。
【0018】
“医薬組成物”という用語は本明細書で使用する場合、本発明の物質および所望により1つまたはそれ以上の医薬的に受容可能な担体を含む。本発明の物質は医薬的に受容可能な塩として処方してもよい。受容可能な塩は酢酸塩、メチルエステル、HCl塩、硫酸塩、塩化物などを含む。医薬組成物は、薬剤投与に従来より使用するあらゆる経路で、例えば経口、局所、非経口、または吸入により使い勝手よく投与することができる。物質は、従来の方法により標準的な医薬担体を薬剤に組み合わせて製造する、従来の剤形で投与することができる。これらの製法には、所望の調製物に適するように成分を混合、粒状化および圧縮または溶解することを伴ってもよい。医薬的に受容可能な担体または希釈剤の形および性質は、組み合わせる活性成分の量、投与経路、およびその他の周知の様々な変数により指定されることは理解されるだろう。担体(複数)は処方物の他の成分と共存でき、そのレシピエントに有害ではないという意味において“受容可能”でなければならない。使用する医薬的担体は、例えば固体または液体のいずれかであってもよい。固体の担体の例は、ラクトース、石膏、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。液体の担体の例は、リン酸緩衝化生理食塩水、シロップ、油、例えばピーナッツ油およびオリーブ油、水、エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、殺菌溶液などがある。同様に担体または希釈剤は、当該技術分野の周知の徐放剤、例えばグリセリルモノステアラート、グリセリルジステアラートを単独でまたはワックスと共に含むことができる。本発明による物質は様々な方法で投与して所望の効果を得ることができる。当該物質は、単独でまたは医薬調製物として処方してのいずれかで、治療を行う被験者に経口、局所、非経口または吸入のいずれかにより投与することができる。さらにこの物質は他の物質と共通の医薬組成物中に、または別々の医薬組成物としてのいずれかで、併用して投与することができる。
【0019】
希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を与えないように選択する。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理学的食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、およびハンクス液がある。加えて医薬組成物または処方物はまた、他の担体、アジュバント、または非毒性の治療作用のない免疫原性のない安定剤などを含んでもよい。治療上有効な用量は、症状または状態を改善する本発明による物質の量をいう。このような化合物の治療効能および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な医薬的な方法により、例えばED50(母集団の50%において治療上有効な用量)およびLD50(母集団の50%において致死的な用量)を決定することができる。治療効果および毒性の影響との間の用量の比率が治療係数であるが、これはLD50/ED50の比率として表わすことができる。
【0020】
投与計画は担当医および他の臨床的因子により決定されることになる;好ましくは先の述べた方法のいずれか一つにしたがって決定する。医学分野で周知のように、いずれの一患者に対する投与量も、患者の身長体重、対表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与時間および経路、全身の健康状態、および併用する他の薬剤を含む、多くの因子に依存する。経過は定期的な評価によりモニターすることができる。
【0021】
典型的な用量は例えば5から100mgの範囲とすることができるが、この例示した範囲以下または以上の用量は特に前述の因子を考慮して推定する。一般に医薬組成物の規定の投与としての計画は、1μgから10mgユニット/日の範囲とすべきである。投与計画が持続注入の場合、これもまた各々1分あたり1μgから10mgユニット/kg体重の範囲とすべきである。経過は定期的な評価によりモニターすることができる。しかし被験者および投与方法によって、物質の投与量を約1mg/m2体表面積から約500mg/m2体表面積の広い範囲で、通常20から200mg/m2体表面積の範囲で変えてもよい。
【0022】
当該明細書で述べた医薬組成物および医薬処方物は、本発明の使用にしたがって少なくとも1回投与する。しかし該医薬組成物および医薬処方物は1回以上、例えば隔週ごとに週1回から、何週間も回数を限定せずに投与してもよい。
【0023】
本発明による物質の特定の処方物は医薬分野の周知の方法で調製し、通常、本明細書で述べた少なくとも1つの活性物質を、医薬的に受容可能な担体または希釈剤と混合して、あるいは会合して含む。このような処方物を作るため、活性物質(複数)は通常、担体と混合する、または希釈剤で希釈する、またはカプセル、プラスチック容器(sachet)、カシュー、紙もしくは他の適切な容器もしくはビヒクルに封入もしくはカプセル化するものとする。担体は、活性成分のためのビヒクル、添加剤または媒質とする固体、半固体、ゲルベース、または液体素材とすることができる。このような適切な担体は上述の物質および当該技術分野の周知の他の物質を含み、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania を参照することができる。処方物は、錠剤、カプセル、座剤、溶液、懸濁液などの形を含む投与法に合わせることができる。
【0024】
投与についての推奨は、誤った薬剤を誤った患者に誤った用量で処方する事を避ける情報を添えて、対象とする患者群により処方者が用量を調整できるように、製品にラベル表示して示すものとする。
【0025】
“治療する”という用語は、治療を行った被験者または疾患の母集団における、疾患の症状の軽減、すなわち症状の沈静または該症状の進行阻止を意味する。疾患のこのような軽減は、疾患に伴う臨床症状の程度(例えば腫瘍サイズ)によりモニターすることができる。本発明は治療する患者の100%に有効とはできないが、統計的に有意な患者数(p値が0.05未満)を治療する上で有効である。このような被験者数が有意かどうかは、統計学の検定、例えばスチューデントのt検定、カイ二乗検定、MannおよびWhitneyによるU検定、Kruskal-Wallis検定(H検定)、Jonckheere-Terpstra検定またはWilcoxon検定により決定することができる。
【0026】
本発明は、米国特許US05106742号、US05340817号、US05364858号、US05401747号、US05468754号、US05559235号、およびUS05663177号における医薬組成物に関連して記載されたすべての態様もまた包含する。
【0027】
“結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、および膵臓癌”という用語は、癌に関連する疾患および制御不全を含む。本発明の使用に含まれる好ましい疾患は、結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、および膵臓癌である。このような疾患および制御不全は当該技術分野で周知であり、付随する症状は、例えばStedmanのような標準的な教科書に記載されている。
【0028】
“被験者”という用語は本発明の意味において使用される場合、動物、好ましくは当明細書で後に特定する動物、およびヒトを含む。
“変異型対立遺伝子”という用語は当明細書で使用する場合、MDR1遺伝子に対応する当明細書で以下に述べるポリヌクレオチドの1つまたはそれ以上を含むポリヌクレオチドをいう。個々の被験者はMDR1遺伝子の少なくとも2つの対立遺伝子を保有しており、この場合該対立遺伝子は区別できることもあるし全く等しいこともある。本発明の使用に従って変異型対立遺伝子は、当明細書で以下に特定するポリヌクレオチドの少なくとも1つまたはそれ以上を含む。該ポリヌクレオチドは、変異型対立遺伝子の制御または機能に共同的影響を与え得る。好ましくは本発明の使用に従っての変異型対立遺伝子は当明細書で特定するポリヌクレオチドの少なくとも2つを含む。
【0029】
本発明の内容において“ポリヌクレオチド”または“ポリペプチド”という用語は、本発明の使用に従って特定するポリヌクレオチドまたはポリペプチドの様々な変異型をいう。このような変異型は、当明細書で特定するポリヌクレオチドまたはポリペプチドの参照または野生型の配列、ならびに、構造または組成においてそれらと異なる変異型を含む。ポリヌクレオチドの参照または野生型の配列はGenbankのアクセション番号:GI:8850235、GI:11118740、GI:10281451、GI:11177452、GI:10281451、GI:6706037、U91318、GI:7209451、AC026452、AC003026、U91318、AF022830、GI:7209451、AC026452、AC003026、AC025277、AF022828、AF022829、AF022831、U07050、AC003026、AC002457、AC005068、M29432、M29445、およびGI:11225259、またはポリペプチドに関してはアクセション番号(Pid No):G8850236、G2828206、G2506118、およびG12644118である。構造または組成の差は通常、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換(複数)、付加(複数)および/または欠失(複数)により起こる。
【0030】
好ましくは、本発明の使用に従って述べたこのようなヌクレオチドの置換(複数)、付加(複数)または欠失(複数)により、対応するポリペプチドのアミノ酸の1つまたはそれ以上に変化をきたす。変異型ポリヌクレオチドはまた、当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのフラグメントも含む。このポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに前述のそのフラグメントは、例えば不十分な薬剤の取り込みおよび/または薬剤の取り込みの変化を含む、MDR1の機能不全または制御不全を伴うものとして特徴付けられる。
【0031】
本発明は、WO9957322、WO0109083、またはUS5786344におけるポリヌクレオチドに関連して記載されたすべての態様もまた包含する。
“ハイブリダイズする”という用語は当明細書で使用する場合、MDR1の機能不全または制御不全に関連する上述のポリヌクレオチドまたはその一部とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドをいう:したがってこのようなハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、前記の機能不全および制御不全にも関連する。好ましくは、MDR1の機能不全または制御不全に関連する上述のポリヌクレオチドまたはその一部とハイブダイズすることのできる該ポリヌクレオチドは、MDR1の機能不全または制御不全に関連するポリヌクレオチドまたはその一部と、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも95%、または少なくとも100%等しい。したがって、該ポリヌクレオチドはRNA調製またはDNA調製のノーザンブロットまたはサザンブロットの分析において各々プローブとして有用であってもよく、またはその各サイズによってPCR分析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用することができる。例えば電気泳動移動度シフト解析(EMSA)によるDNAとタンパク質との相互作用の解析に有用なハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、本発明の使用に従って含まれる。好ましくはこのようなハイブダイズするポリヌクレオチドは、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも15ヌクレオチド残基の長さを含むが、一方プローブとして使用するハイブダイズするポリヌクレオチドは、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも200、または最も好ましくは少なくとも500ヌクレオチド残基の長さを含む。
【0032】
核酸分子を用いたハイブリダイゼーションの実験を行う方法は当該技術分野で周知であり、すなわち当該技術分野の業者は、本発明に従ってどのようなハイブリダイゼーションの条件を使用しなければならないかを理解している。このようなハイブリダイゼーションの条件は標準的な教科書、例えばMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.に記述されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、MDR1の機能不全または制御不全に関連する上記ポリヌクレオチドまたはその一部とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチド、すなわち関係のないポリヌクレオチド、例えば本発明のMDR1ポリペプチドとは異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとはクロスハイブリダイズしないポリヌクレオチドが、本発明の使用に従って好ましい。
【0033】
さらに被験者が当明細書で先に述べたポリヌクレオチドを有するかどうかを決定する方法は、当該技術分野で周知である。このような方法を行うため、該被験者からの生物学的素材、例えば単離細胞または単離組織、を含むサンプルを採取することが必要となるだろう。さらに当該技術分野で公知の方法として、例えばPCRに基づく技術、RFLPに基づく技術、DNAシーケンシングに基づく技術、ハイブリダイゼーション技術、一本鎖立体構造多型(SSCP)法、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)、ミスマッチ切断部の検出、ヘテロ二本鎖の解析、質量分析法に基づく技術、HPLCに基づく技術、プライマーの伸長に基づく技術、および5’ヌクレアーゼアッセイに基づく技術を含むことができる。先に特定したポリヌクレオチドが1つまたはそれ以上存在するかどうかを決定するために使用する好ましい便利な方法は、被験者から血液細胞を単離し、これら血液細胞から単離したゲノムDNAについてPCRに基づくアッセイを行うことであり、それによりPCRを用いて、当明細書で先に特定した該ポリヌクレオチドまたはその一部の存在の有無を決定することができる。このような方法は以下におよび実施例においてより詳細に記載する。
【0034】
“対応する”という用語は当明細書で使用する場合、位置は、先のヌクレオチドおよびアミノ酸の各番号によって決定されるだけではないことを意味する。1つまたはそれ以上のヌクレオチド(複数)の欠失、置換、または付加を含んでもよい、本発明の使用にしたがって与えられたヌクレオチドおよびアミノ酸の位置は、遺伝子またはポリペプチドの他の場所でのヌクレオチドまたはアミノ酸の欠失または付加によって変わり得る。したがって本発明に従っての“対応する位置”では、ヌクレオチドまたはアミノ酸は指示された位置とは異なるかもしれないが、同様の周囲のヌクレオチドまたはアミノ酸を有していると理解されなければならない。ヌクレオチドまたはアミノ酸の交換、欠失、または付加を含み得る当該ヌクレオチドまたはアミノ酸もまた、“対応する位置”という用語に含まれる。当該ヌクレオチドまたはアミノ酸は、例えばそれらの周囲と共に遺伝子の発現の制御、対応するRNAの安定性またはRNAの編集に関与し、ならびに機能的ドメインまたは本発明のタンパク質のモチーフをコード化し得る配列を形成してもよい。
【0035】
例えば“17970から17970(17970 to 17970)の位置”により、当該ポリヌクレオチドの対応する野生型バージョンの17970の位置と17970の位置との間で欠失した、1つまたはそれ以上の欠失ヌクレオチドを当該ポリヌクレオチドを含むことを意味する。同じ様式で表わした先の態様で述べた他のすべての位置の番号についても、同様なことが必要に応じて変更を加えて適用される。
【0036】
例えば“1222/1223の位置”により、当該ポリヌクレオチドの対応する野生型のバージョンの1222および1223の位置の間に挿入された、1つまたはそれ以上の付加されたヌクレオチドを当該ポリヌクレオチドが含むことを意味する。同じ様式、すなわち2つの連続する番号をスラッシュ(/)で分離して表す、先の態様で述べた他のすべての位置の番号についても、同様なことが必要に応じて変更を加えて適用される。
【0037】
本発明に従って、MDR1遺伝子における遺伝子の多様性の形および母集団の分布、すなわちMDR1遺伝子の異なる対立遺伝子について、多数の異なる個体からのヒトの当該遺伝子の関連領域を配列分析することにより、分析を行った。MDR1遺伝子を含む、個人のすべての遺伝子の遺伝的性質をつかさどる各個体のゲノムDNAは、個人の血液サンプルから容易に精製できることは、周知の事実である。次にこれらのそれぞれのDNAサンプルを、血液サンプルを提供した個体に存在するMDR1遺伝子の対立遺伝子の配列組成の分析に使用する。配列分析は、当該遺伝子の関連領域のPCR増幅、続いてPCR産物の精製を行い、その後確立された方法(例えばABI dyetermibator cycle sequencing)による自動的なDNAシーケンシングを行った。
【0038】
ヒトの血液のゲノムDNAからのPCR産物を直接DNAシーケンシングすることにより、その人のMDR1遺伝子の遺伝子型を決定し、新たな変異型を同定する試みにおいて、考慮しなければならない1つの重要なパラメータは、ヒトは各々、各常染色体の遺伝子の2つの遺伝子のコピー(二倍性)を(通常、異常な例外はほとんどなく)保有している、という事実である。このため、ホモ接合体配列のバリエーションだけでなくヘテロ接合体のバリエーションもまた明確に同定することができるように、配列の評価には細心の注意を払わなければならない。MDR1遺伝子の多型(ホモ接合体およびヘテロ接合体)の同定および特徴づけにおける様々なステップの詳細は、以下の実施例に記載する。
【0039】
過去20年にわたり遺伝的な異質性は、薬物反応の多様性の有意な原因としてますます認識されるようになってきた。多数の科学論文(Meyer, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 (1997), 269-296 および West, J. Clin. Phamacol. 37 (1997), 635-648)は、一部の薬剤が一部の患者には他の患者よりよく効いたり、あるいは非常に有毒とさえなり得る、そして患者の薬剤への反応におけるこのような多様性は分子レベルで相関させることができることを、明確に示した。この“ファーマコジェノミクス”の概念は、患者の薬剤への反応と遺伝的特性との相関に注目するものである(Marshall, Nature Biotchnology, 15 (1997), 954-957; Marshall, Nature Biotchnology, 15 (1997), 1249-1252)。薬剤治療に関する母集団の可変性というこの背景において、特定の薬剤に副作用を示さずに反応することのできる患者の同定および選別の有用な手段として、ファーマコジェノミクスが提案された。この同定/選択は、例えば患者の血液中の白血球からのDNAの遺伝子型の決定による遺伝子多型の分子診断および疾患の特徴付けに基づいて行うことができる(Bertz, Clin. Pharmacokinet. 32 (1997), 210-256; Engel, J. Chromatogra. B. Biomed. Appl. 678 (1996), 93-103)。健康管理の設立者(the founders of health care)、例えば米国の健康維持機関(health maintenance organizations)および欧州の多くの国々の政府の保健機関(govament public health services)にとってこのファーマコジェノミクスのアプローチは、健康管理の改善、ならびに不必要な薬剤の開発、有効でない薬剤および薬剤投与による副作用に起因する健康管理にかかわるコストの削減の双方の解決法となり得る。
【0040】
本発明の変異型遺伝子における変異は、単独でまたは組み合わされてのアミノ酸の欠失(複数)、挿入(複数)および特に置換(複数)をきたす。もちろん野生型遺伝子または他の変異型にこのような変異を遺伝子工学的に作成することもできる。当該遺伝子のDNA塩基配列にこのような修飾を導入する方法は、当該技術分野の業者によく知られている;例えばSambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.を参照のこと。
【0041】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が一部変更されたもの (alternations)の性質を調べるには、例えばインターネットから入手できるBRASMOLを利用してもよい。さらに折りたたみ(folding)のシミュレーションおよびコンピューターによる構造モチーフの再デザインは、他の適当なコンピュータープログラムを用いて行うことができる(Oiszewski, Protein 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679)。コンピューターは、詳細なタンパク質モデルのコンフォメーション分析およびエネルギーの分析についても利用することができる(Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45)。これらの分析は、薬剤の代謝、結合、阻害、治療作用の仲介および/または輸送について、特定の変異の影響を同定するために用いることができる。さらに本発明の使用で特定したポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの構造の変化の知識に基づいて、より効率的に代謝、修飾、輸送、排泄、および/または結合され得る、先に述べた物質の誘導体をデザインし合成することができる。それにより、本発明のポリヌクレオチドの1つまたはそれ以上の存在を特徴とする遺伝子型を有する被験者における、結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、および膵臓癌の治療に、より効率的な薬剤またはプロドラッグを、当明細書で述べた物質に基づいてデザインすることができる。
【0042】
通常、本発明の使用に従って述べたポリヌクレオチドにコードされるタンパク質のアミノ酸配列における、このようなアミノ酸の欠失、付加または置換は、1つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失、またはそれらを組み合わせることによる。好ましくは前記のヌクレオチドの置換、挿入、または欠失により、以下のアミノ酸配列の置換をきたし得るものとする、すなわちMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の21の位置に対応する位置でAsnからAspに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の103の位置に対応する位置でPheからLeuに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の168の位置に対応する位置でValからIleに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の400の位置に対応する位置でSerからAsnに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の893の位置に対応する位置でAlaからSerに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の999の位置に対応する位置でAlaからThrに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の1001の位置に対応する位置でAlaからThrに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の1107の位置に対応する位置でGlnからProに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の1141の位置に対応する位置でSerからThrへの置換である。当明細書に述べた使用に従っていうポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドは、本発明に従って述べた変異により変化した生物学的特性を有する。このような特性の変化の例は、ポリペプチドの安定性またはポリペプチドの量であり、そのことが以下のような変化に至る影響を及ぼすと考えられる。例えば薬剤代謝の変化、または薬剤輸送の変化、または基質の特異性の変化、または例えば薬剤代謝の不十分さもしくは薬剤代謝能の完全な喪失もしくは薬剤代謝能の増強を特徴とする触媒活性の変化、または例えば薬剤輸送の不十分さもしくは薬剤輸送能の完全な喪失を特徴とする輸送活性の変化、または例えば薬剤作用の変化、もしくは輸送の阻害もしくは誘導の変化を特徴とする基質の結合の変化、または例えばシグナル伝達経路の活性化の変化、もしくはタンパク質もしくは酵素の機能の変化を特徴とする受容体もしくは他の標的分子への結合の変化が挙げられる。これらの特性の変化が、本発明の使用に従って治療する被験者の上述の物質への薬理学的反応の障害を引き起こす。さらに、当明細書で特定した変異型対立遺伝子によりコードされたポリペプチドの特性のこのような変化により、該物質が被験者にとって危険もしくは有毒となる、または有害な副作用の原因となる物質の誘導体に至るように、該物質が化学的に修飾されてもよい。
【0043】
本発明に従って検出されたMDR1遺伝子の変異を、表1および2に列記する。当該技術分野の業者には明らかなように、当明細書で先に特定したポリヌクレオチドの遺伝子の知識を用いて、患者の遺伝子型の正確な信頼できる特徴づけを行うことができる。
【0044】
好都合なことに、イリノテカンまたはその誘導体に基づいた治療基準は、前記の遺伝子の知識を考慮するとより効率的に適用することができる。被験者の遺伝子の構成の知識により当該物質の有害な副作用を避けることができ、有効な有害でない投与量を個別に計算することができる。さらに前述の内容に従って、投与した薬剤が通常とは異なる影響を引き起こす場合には被験者の個々の遺伝子の構成の知識に基づいて、適切な個別の治療をデザインすることができる。このテーラーメイド治療はまた、治療への耐性の発生を避けるためにも適するだろう。該耐性は様々な化学治療薬剤による癌の化学治療における1つの大きな問題であり、その事実は当該技術分野で周知である。したがって本発明の使用は、当明細書で先に述べた物質の適当な投与量および/または適当な誘導体で、被験者を個別に治療することが可能となるため、当該物質の治療で所望される公知の効果に基づいた治療への適用の改善を提供する。それにより有害な、危険なまたは有毒な影響を効率的に避けることができる。さらに本発明の使用は、当明細書で先に述べた物質の治療が最も有益となりそうな被験者を薬剤治療を開始する前に同定し、このような被験者のみに当該物質による適当な投与量および/または適当な誘導体で治療することが可能となるため、当該物質の治療で所望される公知の効果に基づいた治療の適用の改善を提供できる。それにより、該物質による治療に反応しない被験者(無効患者)への不必要なおよび有害となり得る治療、ならびに至適以下の薬剤投与による薬剤耐性の出現を避けることができる。
【0045】
本発明の使用の好ましい態様において、当該変異型対立遺伝子は以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む:
(a)SEQ.ID NO:345、417または636のいずれか一つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)SEQ.ID NO:612または618のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)MDR1遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の101、MDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の176、またはMDR1遺伝子(アクセション番号:GI:10122135)の88883の位置に対応する位置に置換を有する、ポリヌクレオチド;
(d)MDR1遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の101、もしくはMDR1遺伝子(アクセション番号:GI:10122135)の88883の位置に対応する位置にAを有する、またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の176、もしくはMDR1遺伝子(アクセション番号:GI:10122135)の88883の位置に対応する位置にTを有する、ポリヌクレオチド;
(e)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の400または893の位置に対応する位置にアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド;および
(f)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、、該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の400の位置に対応する位置でSerからAsnに、または893の位置に対応する位置でAlaからSerへのアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド。
【0046】
より好ましくは当該変異型対立遺伝子が以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む:
(a)SEQ.ID NO:417または636の核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)SEQ.ID NO:618のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)MDR1遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の176、MDR1遺伝子(アクセション番号:GI:10122135)の88883の位置に対応する位置に置換を有する、ポリヌクレオチド;
(d)MDR1遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の176、またはMDR1遺伝子(アクセション番号:GI:10122135)の88883の位置に対応する位置にTを有する、ポリヌクレオチド;
(e)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の893の位置に対応する位置にアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド;および
(f)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の893の位置に対応する位置でAlaからSerへのアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド。
【0047】
最も好ましくは当該変異型対立遺伝子が以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む:
(a)SEQ.ID NO:417の核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)MDR1遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の176の位置に対応する位置に置換を有する、ポリヌクレオチド;および
(c)MDR1遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の176の位置に対応する位置にTを有する、ポリヌクレオチド。
【0048】
本発明に従って、MDR1に対応する変異型対立遺伝子が、イリノテカンまたはその誘導体の投与に対する当該被験者の薬理学的反応を変化させることが、驚くべきことに発見された。本発明に従って発見されたように、イリノテカンまたはその誘導体に基づく薬剤の薬物動態および被験者の薬理学的反応は、主にMDR1遺伝子によりコードされるポリペプチドにより支配されている。したがって本発明に従って適用される治療基準の予測可能性および/または有効性を高めるために、当明細書で述べた変異型対立遺伝子の存在の有無についての被験者の遺伝子の構成が決定されなければならず、その知識に基づいて、治療上最も有効となるそして本発明による物質に起因する有毒または有害な副作用を回避する、個別の治療を展開することができる。
【0049】
本発明はまた以下を含む、結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、および膵臓癌を治療する方法に関する:
(a)当明細書で述べたポリヌクレオチドを含む変異型対立遺伝子の存在の有無を決定すること;および
(b)イリノテカンの治療上有効な投与量を被験者に投与すること。
【0050】
本発明の使用に従って使用する定義は、必要に応じて変更を加えて上記方法に適用される。さらに本発明の使用に従って述べたすべての態様は、本発明の方法に必要に応じて変更を加えて適用することができる。さらに当該技術分野の業者が過度の負担なくその知識および従来技術、例えば本明細書を通して述べた文献類に基づいて行うことのできる、前記方法のあらゆるさらなる開発もまた、本発明の方法に包含される。
【0051】
本発明の使用の好ましい態様において、当該ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの欠失、付加および/または置換により、対応する野生型の対立遺伝子と比較しての、変異型対立遺伝子の発現に変化をきたす。先に述べたように、本発明の使用にしたがって述べた対立遺伝子は、MDR1遺伝子に対応する。遺伝子がアミノ酸配列をコードする構造エレメントならびに同遺伝子の発現の制御に関与する制御エレメントを含むことは、当該技術分野で周知である。構造エレメントは、アミノ酸配列をコードすることができるか、またはアミノ酸配列はコードしていないがそれでも例えば同RNAの安定性または同RNAの核外への搬出を制御することにより、同RNAの機能に関連することができるかのいずれかである、エキソンにより表される。
【0052】
遺伝子の制御エレメントはプロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメントを含むことができ、その双方とも遺伝子発現の転写のコントロールに関与することができる。プロモーターが遺伝子の構造エレメントの上流に見出されることは、当該技術分野で非常によく知られている。しかしエンハンサーエレメントのような制御エレメントは遺伝子の遺伝子座全体に分散して見出され得る。制御エレメントは、例えばイントロン中に、すなわち遺伝子のエキソンを分離するゲノムDNA領域中に含まれ得る。プロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメントは、該プロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメントを含む遺伝子の制御に関与するポリペプチドを、引き付けたり結合したりすることのできるポリヌクレオチド断片に対応する。例えば該遺伝子の制御に関与するポリペプチドには、いわゆる転写因子を含む。
【0053】
前記イントロンは、正しい遺伝子の発現に必要なさらなる制御エレメントを含み得る。イントロンは通常遺伝子のエキソンと共に転写され、その結果エキソンとイントロンの双方の配列を含む前駆体(nascent)RNAの転写産物が得られる。RNA配列にコードされたイントロンは、RNAスプライシングとして知られる過程により通常切り取られる。しかしこのような過程もまた、転写産物RNA上に存在する制御配列を必要とし、その制御配列はイントロンがコードする。
【0054】
加えて転写のコントロールおよび正しいRNAのプロセシングおよび/または安定性のコントロールにおけるこれらの機能のほかに、遺伝子の制御エレメントはまた、遺伝子座の遺伝的安定性のコントロールにも関与し得る。このようなエレメントは、例えば組み替え事象をコントロールしたり、または染色体上のDNAの一定の構造もしくはDNAの配置を維持したりする。
【0055】
したがって一塩基多型は、先に述べたようなアミノ酸配列をコードする遺伝子の対立遺伝子のエキソンにおいて、同様に先に述べた過程に関与する制御領域においても起こり得る。本発明の使用に従って述べたポリヌクレオチドに含まれる多型は、MDR1遺伝子の転写の増加または低下、遺伝子の転写産物RNAの安定性、および一次転写産物RNAのプロセシングの変化、を含むメカニズムを介してMDR1タンパク質の発現レベルに影響を与え得る。
【0056】
野生型の対応する発現と比較した場合の、変異型対立遺伝子の発現の変化を決定する方法は、当該技術分野で周知であり、特に当明細書で先に述べた方法、例えばPCRに基づく技術、RFLPに基づく技術、DNA配列決定に基づく技術、ハイブリダイゼーション技術、一本鎖立体構造多型(SSCP)法、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)、ミスマッチ切断部の検出、ヘテロ二本鎖解析、質量分析に基づく技術、HPLCに基づく技術、プライマーの伸長に基づく技術、および5’ヌクレアーゼアッセイに基づく技術を含む。野生型および変異型の対立遺伝子の各発現レベルを決定するためのこのような方法を行う前に、被験者からの生物学的素材、例えば単離細胞または単離組織を含むサンプルを採取する必要があるだろう。本発明の使用に従っての発現の変化は、野生型対立遺伝子の発現が変異型対立遺伝子の発現と有意に異なることを意味する。有意差は、標準的な統計学的方法、例えばスチューデントのt検定、カイ二乗検定、MannおよびWhitneyによるU検定により決定することができる。さらに当業者は、これらの方法および当該技術分野に公知の他の統計学的方法を、各自過度の負担なく適用することができる。
【0057】
本発明の使用のより好ましい態様において、このような発現の変化は発現の低下または増加である。
本発明に従って述べた対立遺伝子の発現が、対応する野生型の対立遺伝子と比較して増加しているかまたは減少しているかを決定するため、公知の方法、例えばPCRに基づく技術、RFLPに基づく技術、DNA配列決定に基づく技術、ハイブリダイゼーション技術、一本鎖立体構造多型(SSCP)法、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)、ミスマッチ切断部の検出、ヘテロ二本鎖解析、質量分析に基づく技術、HPLCに基づく技術、プライマーの伸長に基づく技術、および5’ヌクレアーゼアッセイに基づく技術を適応することができる。上述のように、本発明の使用において述べた変異型対立遺伝子の発現レベルを決定するために、該被験者からの細胞または組織を含むサンプルを採取する必要があるだろう。発現の低下または増加は、これらのアッセイにおける野生型対立遺伝子に対する変異型対立遺伝子の発現レベルの有意差をその特徴とする。変異型対立遺伝子の発現が検出できない場合もまた、発現の低下に含める。
【0058】
本発明の使用のさらに好ましい態様において、当該ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの欠失、付加、および/または置換により、対応する野生型対立遺伝子にコードされたポリペプチドと比較しての、変異型対立遺伝子にコードされたポリペプチドの活性に変化をきたす。先に述べたように、MDR1遺伝子のコード領域に対応する、当明細書で特定したこれらのポリヌクレオチドを含む変異型対立遺伝子は、該変異型対立遺伝子にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与える。したがってこの変異型ポリペプチドは、これらの対応する野生型のポリペプチドと比較した場合、生物学的および/または免疫学的特性の変化を示す。本発明の使用に従っての好ましい変異型ポリペプチドは、生物学的活性の変化、すなわち触媒活性の低下、増加もしくは完全な喪失に至る酵素機能の変化、または輸送活性の低下、増加もしくは完全な喪失にいたる輸送機能の変化、またはシグナル伝達経路の活性化の変化、もしくは輸送体もしくは酵素機能の阻害の変化に至る受容体もしくは他の薬剤の標的への結合の変化を示すものである。野生型および変異型のポリペプチドの各活性を決定するための前記の方法を行う前に、該被験者から生物学的素材、例えば単離細胞または単離組織を含むサンプルを採取する必要があるだろう。対応する野生型のポリペプチドと比較して、変異型のポリペプチドの活性または発現レベルの変化があるかどうかは、当該技術分野で周知の標準的な技術により決定することができる。このような標準的な技術はMDR1に関する、例えばELISAに基づくアッセイ、RIAに基づくアッセイ、HPLCに基づくアッセイ、質量分析に基づくアッセイ、ウェスタンブロット解析、または当該技術分野で公知のアッセイ、および以下に記載されているアッセイ [Hitzl, et al., 2001, Pharmacogenetics 11: 293-8; Hoffmeyer, 2000 #77; van Helvoort, 1996 #115; Schumacher, 1997 #116; Cordon-Cardo, 1990 #117; Hafkemeyer, 1998 #118]を含むことができる。
【0059】
本発明の使用に従っての活性の変化は、野生型ポリペプチドの活性が変異型ポリペプチドとは有意に異なることを意味する。有意差は、当明細書で先に述べた標準的な統計学的方法により決定することができる。
【0060】
最も好ましくは前記の活性の変化は、活性の低下または増加である。
発現の増加または低下について述べたように、活性の低下または増加は、当明細書で述べたアッセイにおける野生型ポリペプチドに対する変異型ポリペプチドの活性の有意差を特徴とする。変異型対立遺伝子の活性が検出できない場合もまた、活性の低下に包含する。
【0061】
さらに、本発明のさらなる好ましい態様において、前記被験者は動物である。
上述のように本発明の使用に従っての被験者は、動物を包含する。“動物”という用語は当明細書で使用する場合すべての動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳類に属する動物を包含する。さらにこの動物は、先に述べたポリヌクレオチドの1つまたはそれ以上を該動物のゲノムに組み入れるために、遺伝子導入および相同的組み換えを含む周知の技術により遺伝子操作することができる。遺伝子操作した動物を含む該動物を、当明細書で述べた物質またはその誘導体、好ましくはイリノテカンに基づいた薬剤またはプロドラッグの薬理学的効果を研究するために使用することができる。
【0062】
上述の内容に従って、最も好ましくは前記動物はマウスまたはラットである。
Giovanella, et al., 1991, Cancer Res 51: 3052-5, Kunimoto, et al.,1987, Cancer Res 47: 5944-7, Kaneda, et al., 1990, Cancer Res 50: 1715-20 に詳細に記載されているように、該動物は、本発明の使用に従って述べた物質または誘導体の薬理学的特性を評価するために特に適している。
【0063】
好ましくは前記マウスは機能的なMDR1を欠損するものとする。機能的なMDR1を欠損する該マウスを作成する方法は、当該技術分野で周知である。例えば該マウスは、Schinkel, 1998, Int J Clin Pharmacol Ther 36: 9-13, Schinkel, et al., 2000, Pharmacogentics 10: 583-90 においてMDR1について記載されているように、相同組み換えにより作成することができるだろう。
【0064】
さらに本発明の使用のより好ましいもう1つの態様において、前記被験者はヒトである。
特に本発明は上記から明らかなようにヒトに適用することができる。本発明の使用は、結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、および膵臓癌の患者において治療を行うまたは副作用を防ぐために適用するものとする。上記物質またはその誘導体の薬理学的効果は、ヒトについて十分に述べられている。しかし従来の治療は、患者の個別の遺伝子の構成を考慮していない。民族による母集団は異なる遺伝的背景を有し、そのことがまた変異型対立遺伝子の機能または制御にも影響を及ぼす可能性があり、それにより本発明に従って薬剤またはプロドラッグの主成分として使用する物質または誘導体に対する患者の薬理学的反応は異なってくる。
【0065】
前述の観点においてこのようなヒトは、アフリカ系の母集団から細心の注意を払って選択するが、この母集団は白人または日本人(約50%)に比してMDR1のより高発現の対立遺伝子(アクセション番号M29445のMDR1遺伝子の137の位置に対応する位置にヌクレオチドCを有する)をより高頻度(約80%)に示し、そのためイリノテカンの毒性をより受けやすい(母集団の頻度のデータは以下から入手 [Cascorbi, et al., 2001, Clin Pharmacol Ther 69: 169-74, Ameyaw, et al., 2001, Pharmacogenetics 11: 217-21, Ito, et al., 2001, Pharmacogenetics 11: 175-84])。
【0066】
本発明はまた、癌、特に結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、および膵臓癌の患者に対する適切な治療を選択するための方法にも関するが、その際前記方法は以下を含む:
(a)被験者から得たサンプル中の該被験者のゲノムについて、先に述べた変異型対立遺伝子の存在の有無を決定すること;および
(b)(a)で得られた結果に基づいて、該被験者のための適切な治療を選択すること。
【0067】
先に示した用語の定義および説明を、必要に応じて変更を加えて先の方法に適用する。
“適切な治療”という用語は当明細書で使用する場合、本発明による物質を選択し、該物質を一定の投与量で被験者に投与し、その際該物質および該投与量を、本発明の使用に従って述べた変異型対立遺伝子の存在の有無の知識に基づいて選択することを意味する。該物質および該物質の該投与量は、一方ではそれらが結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、および膵臓癌の治療または予防に最も効率的となるよう、他方ではそれらが有毒または有害な副作用の原因とならないように選択する。
【0068】
上記から明らかなように適切な治療を選択するための必要前提条件は、本発明の使用に従って述べた変異型対立遺伝子の存在の有無に関する知識である。したがって本発明の方法は、該被験者から得たサンプル中の該変異型対立遺伝子の存在の有無を決定することを包含する。被験者から得るサンプルは、該変異型対立遺伝子の存在の有無の決定に適する生物学的素材、例えば単離細胞または単離組織を含む。本発明の方法の変異型対立遺伝子の存在の有無の決定するための方法は、当明細書で先に述べた方法を含む。
【0069】
本発明の方法によって、結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、および膵臓癌の被験者、好ましくはヒトのための適切な治療を効率的に選択することが可能となる。したがって誤った薬剤投与に基づいた患者への誤った治療およびその結果、例えば癌治療に対する耐性の出現およびその後の健康管理コストの増大を効率的に回避することができる。さらに高リスクの患者を最初の投与前に治療から除外することができ、および/または薬剤治療の開始前に個人の遺伝子の構成により投与量を調整することができる。また、上述の輸送体(例えばMDR1)の遺伝子の阻害剤を、遺伝的に定義されたサブ母集団の患者に適用することができる。このように有害作用を避けることができ、時間を浪費せず、高価な薬剤モニタリングに基づく用量調査をすることなく、より早く最適用量レベルを得ることができる。このことが医療コストおよび疾患の間接的コスト(例えば患者の入院時間の短縮および入院頻度の減少)の削減が可能とする。
【0070】
以下の項目もまた本発明に包含される。先に行った定義および説明を、請求項を特徴付けるために使用する用語に必要に応じて変更して適用する。
1.以下を含む癌の患者を治療するためにイリノテカンを使用する方法:
(a)患者が、癌組織中にMDR1遺伝子の1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子を有するかどうかを決定すること;
(b)1つまたはそれ以上の該変異型対立遺伝子を有する患者において、該変異型対立遺伝子を有する患者を治療するのに十分な量のイリノテカン、すなわちMDR1遺伝子中の患者の対立遺伝子に関係なく投与する量と比較して、増量または減量した量を同患者に投与すること。
【0071】
2.癌が結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、または膵臓癌である、項目1の方法。
3.以下を含む項目2の方法:
(a)1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が、患者におけるMDR1遺伝子産生物の低い量の発現という結果をもたらすため、毒性を回避するためにその患者に投与するイリノテカンの量を減量すること;または
(b)1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が、患者におけるMDR1遺伝子産生物の高い量の発現という結果をもたらすため、薬効を高めるためにその患者に投与するイリノテカンの量を増量すること。
【0072】
4.1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子がMDR1遺伝子のプロモーター領域にある、項目3の方法。
5.1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子がMDR1遺伝子のコード領域にある、項目3の方法。
【0073】
6.1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子がMDR1遺伝子のプロモーター領域またはコード領域のいずれにもない、項目3の方法。
7.1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子がMDR1遺伝子のプロモーター領域およびコード領域の双方にある、項目3の方法。
8.1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、項目3の方法:
(a)SEQ.ID NO:337、338、341、342、345、346、349、350、353、354、357、358、361、362、365、366、369、370、373、374、377、378、381、382、385、386、389、390、393、394、397、398、401、402、405、406、409、410、413、414、417、418、421、422、425、426、429、430、433、434、437、438、441、442、445、446、449、450、453、454、457、458、461、462、465、466、469、470、473、474、477、478、481、482、485、486、489、490、493、494、497、498、501、502、505、506、509、510、513、514、517、518、521、522、525、526、636、637、640および/または641のいずれか一つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)SEQ.ID NO:606、608、610、612、618、620、622、624、および/または628のいずれか一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)多剤耐性1(MDR1)遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の140837、141529、141590、145984、171404、171456、171466、171511、171512、174901、175068、175074、175142、175180、139015、139064、139119、139177、139276、140118、140216、140490、140568、140576、140595、140727、139479、139619、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の84701、83946、83973、84032、84074、84119、77811、78170、73252、70200、70204、70237、70253、70371、65241、50537、43263、43162、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の101、308、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の137、176の位置に対応する位置に、少なくとも1つのヌクレオチドの置換または欠失を有する、ポリヌクレオチド;
(d)MDR1遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の83946、70200、70237、65241、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の101、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の141529、174901、139177、140118、140568、140727、139479の位置に対応する位置にAを有する、MDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の308、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の84701、83973、84074、84119、78170、70204、70253、70371、50537、43162、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の137または176、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の145984、171466、175068、175074、139064、139276、140576の位置に対応する位置にTを有する、MDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の140837、171404、171456、171511、171512、139119、140490、139619、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の43263の位置に対応する位置にCを有する、MDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の84032、77811、73252、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の141590、175142、175180、139015、140216、140595の位置に対応する位置にGを有する、ポリヌクレオチド;
(e)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の21、103、168、400、893、999、1001、1107および/または1141の位置に対応する位置にアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド;
(f)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の21の位置に対応する位置でAsnからAspに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の103の位置に対応する位置でPheからLeuに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の168の位置に対応する位置でValからIleに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の400の位置に対応する位置でSerからAsnに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の893の位置に対応する位置でAlaからSerに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の999の位置に対応する位置でAlaからThrに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の1001の位置に対応する位置でAlaからThrに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の1107の位置に対応する位置でGlnからProに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の1141の位置に対応する位置でSerからThrへのアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド。
【0074】
9.1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、項目8の方法:
(a)SEQ.ID NO:345、417または636のいずれか一つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)SEQ.ID NO:612または618のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)MDR1遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、当該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の101、MDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の176、またはMDR1遺伝子(アクセション番号:GI:10122135)の88883の位置に対応する位置に置換を有する、ポリヌクレオチド;
(d)MDR1遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、当該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の101、もしくはMDR1遺伝子(アクセション番号:GI:10122135)の88883の位置に対応する位置にAを有する、またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の176、もしくはMDR1遺伝子(アクセション番号:GI:10122135)の88883の位置に対応する位置にTを有する、ポリヌクレオチド;
(e)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の400または893の位置に対応する位置にアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド;
(f)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の400の位置に対応する位置でSerからAsnに、または893の位置に対応する位置でAlaからSerへのアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド。
【0075】
10.1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が、患者におけるMDR1遺伝子産生物の低い量の発現という結果をもたらすため、その患者に投与するイリノテカンの量を減量する、項目8の方法。
【0076】
11.1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が、患者におけるMDR1遺伝子産生物の高い量の発現という結果をもたらすため、その患者に投与するイリノテカンの量を増量する、項目8の方法。
【0077】
12.1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が、患者におけるMDR1遺伝子産生物の低い量の発現という結果をもたらすため、その患者に投与するイリノテカンの量を減量する、項目9の方法。
【0078】
13.1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が、患者におけるMDR1遺伝子産生物の高い量の発現という結果をもたらすため、その患者に投与するイリノテカンの量を増量する、項目9の方法。
【0079】
14.患者が1つまたはそれ以上のMDR1遺伝子の変異型対立遺伝子を有するかどうかを決定することを含む、同患者が、イリノテカンによる治療に対して有毒な反応をするリスクがあるかどうかを決定する方法。
【0080】
15.患者にイリノテカンを減量して投与することをさらに含む、項目14の方法。
16.以下を含む、癌の患者にイリノテカンを投与するための最適な投与計画を決定する方法:
(a)患者がMDR1遺伝子の1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子を有するかどうかを決定すること;
(b)1つまたはそれ以上の該変異型対立遺伝子を有する患者において、MDR1遺伝子中の同患者の対立遺伝子に関係なくイリノテカンを投与する場合の同患者のピークの量と比較して、同患者のイリノテカンのピークの量を低減させるように投与計画を変更すること。
【0081】
17.MDR1遺伝子産生物の発現レベルが一般的な母集団の場合より低く、そのためイリノテカンへの高い感受性を示すような、MDR1遺伝子の1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子を有する患者において、イリノテカンを減量して同患者に投与することを含む、癌の治療法。
【0082】
18.MDR1遺伝子産生物の発現レベルが一般的な母集団の場合より高く、そのためイリノテカンに対する耐性または耐性素因を示すような、MDR1遺伝子の1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子を有する患者において、イリノテカンを増量して同患者に投与することを含む癌の治療法。
【0083】
19.耐性または耐性素因を示す変異型対立遺伝子を有する患者を、MDR1阻害剤を用いて治療する項目18の方法。
20.MDR1阻害剤を以下からなる群から選択する項目19の方法:GF120918、LY335979、XR 9576、XR 9051、フラボノイド類(例えばアピゲニン、ゲニスチン、ナリンギン、ケルセチン、フラボン、フラボノン、フラボピリドール)、ベルガモチン、クラリスロマイシン、ケトコナゾール、レゼルピン、1,9−ジデオキシフォルスコリン、アジドピン、ジメチル−b−シクロデキストリン、イベルメクチン、SDZ PSC 833、SDZ 280−446、B669、B−859−35(R鏡像異性体)およびその主な代謝物、MS−209(キノロン誘導体)、PAK−104p、アミロリド、アミトリプチリン、アトルバスタチン、オーレオバシジンおよび類似体、ベリリウムフルオリド(BeFx)、カルモジュリン阻害剤、クロロキン、クロロプロマジン、クロファジミン、クレモホールEL、ジルチアゼム、ベラパミル、ニフェジピン、ベプリジル、ニカルジピン、ニグルジピン(niguldipine)、ニトレンジピン、トリフルオペラジン、フェロジピン、バリノマイシン、ジピリダモール、エリスロマイシン、フルオロキノロン類:フレロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、ノルフロキサシン、グリベンクラミド類および類似体、グルコナート塩類、グラミシジン、ヒドロコルチゾン、イトラコナゾール、リドカイン、ホスファチジルコリン、プリスチナマイシンIa、プロパフェノン、プロパノロール、タリノロール、ピリジン類似体、ケルセチン4’−b−グルコシド、キニーネおよびキニジン、キナクリン、シンコニン、リトナビル、サクイナビル、ネルフィナビル、タモキシフェンおよび代謝物、タキソイド(テトラサイクリックタキソピン(Tetracyclic taxopine)Cおよび誘導体)、テルフェナジン。
【0084】
21.癌細胞内のMDR1遺伝子産生物の発現レベルの変化をアッセイすることにより治療中に患者をモニターし、それによりMDR1遺伝子産生物の発現レベルの増加を、同患者へのイリノテカンの投与量を増量することで補うことをさらに含む、項目17の方法。
【0085】
22.イリノテカンの有効量を患者に内部的に投与することを含む、同患者における癌の治療方法であって、治療計画を同患者のMDR1遺伝子の遺伝子型に基づいて修飾する前記方法。
【0086】
23.以下を含む癌の患者の母集団の治療法:
(a)患者がMDR1遺伝子の1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子を有するかどうかを、患者ごとにその患者について決定すること;
(b)1つまたはそれ以上の該変異型対立遺伝子を有する患者において、該変異型対立遺伝子を有する患者を治療するのに十分な量のイリノテカン、すなわちMDR1遺伝子中の患者の対立遺伝子に関係なく投与する量と比較して、増量または減量した量を同患者に投与すること。
【0087】
24.患者がMDR1遺伝子の1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子を有するかどうかを決定することを含む、癌の患者におけるイリノテカンへの感受性を予測する方法であって、該対立遺伝子が、癌細胞が少量または多量かのMDR1タンパク質を発現することを示すことから、低発現はイリノテカンへの高い感受性を、そして高発現はイリノテカンへの耐性または耐性素因を示すことを予測する該方法。
【0088】
25.耐性または耐性素因を示す遺伝子型を有する患者に、MDR1阻害剤を投与することをさらに含む、項目24の方法。
26.MDR1阻害剤を以下からなる群から選択する項目25の方法:GF120918、LY335979、XR 9576、XR 9051、フラボノイド類(例えばアピゲニン、ゲニスチン、ナリンギン、ケルセチン、フラボン、フラボノン、フラボピリドール)、ベルガモチン、クラリスロマイシン、ケトコナゾール、レゼルピン、1,9−ジデオキシフォルスコリン、アジドピン、ジメチル−b−シクロデキストリン、イベルメクチン、SDZ PSC 833、SDZ 280−446、B669、B−859−35(R鏡像異性体)およびその主な代謝物、MS−209(キノロン誘導体)、PAK−104p、アミロリド、アミトリプチリン、アトルバスタチン、オーレオバシジンおよび類似体、ベリリウムフルオリド(BeFx)、カルモジュリン阻害剤、クロロキン、クロロプロマジン、クロファジミン、クレモホールEL、ジルチアゼム、ベラパミル、ニフェジピン、ベプリジル、ニカルジピン、ニグルジピン、ニトレンジピン、トリフルオペラジン、フェロジピン、バリノマイシン、ジピリダモール、エリスロマイシン、フルオロキノロン類:フレロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、ノルフロキサシン、グリベンクラミド類および類似体、グルコナート塩類、グラミシジン、ヒドロコルチゾン、イトラコナゾール、リドカイン、ホスファチジルコリン、プリスチナマイシンIa、プロパフェノン、プロパノロール、タリノロール、ピリジン類似体、ケルセチン4’−b−グルコシド、キニーネおよびキニジン、キナクリン、シンコニン、リトナビル、サクイナビル、ネルフィナビル、タモキシフェンおよび代謝物、タキソイド(テトラサイクリックタキソピンCおよび誘導体)、テルフェナジン。
【0089】
27.耐性または耐性素因を示す遺伝子型を有する患者を、癌細胞内のMDR1遺伝子産生物の発現レベルの変化をアッセイすることにより治療中にモニターし、その結果イリノテカンへの感受性の最新の予測を決定することができる、項目25の方法。
【0090】
先に本明細書で述べたように発現の低下は、機能的な遺伝子産生物をコードする転写物の量の減少に加えて、活性のないまたは有意に活性の低い遺伝子産生物をコードする転写物の量が、正常または増加していることさえあることもまた含む。
【0091】
“MDR1遺伝子中の患者の対立遺伝子に関係なく投与する量と比較して”により、遺伝子型に関係なく薬剤を必要とする患者に一律に投与する標準的な用量を意味する。このような一般的な患者の母集団は、正常な遺伝子型、すなわち野生型の遺伝子型を有するものとみなされている。
【0092】
さらに本発明は、MDR1タンパク質の発現特性またはタンパク質レベルとして後述する、タンパク質の特性または該タンパク質の活性レベルとして後述する、活性特性として後述する、MDR1の発現レベルを決定することを含む、治療の改善および/または修飾のための方法を包含する。
【0093】
“発現レベル”という用語は本発明の内容において述べる場合、ハウスキーピング遺伝子、例えばPLA2の転写物の量と相対してのMDR1遺伝子の検出可能な転写物の量を意味する。転写物の量は、ノーザン分析法、RNアーゼプロテクション法、Taq-Man分析を含むPCRの基づく技術を含む、標準的な分子生物学的技術により決定することができる。好ましくはこの決定は付記した実施例4または5に述べるように行うことができる。“発現特性”という用語は、前述の遺伝子のパネルの発現レベルを決定して、その発現レベルを参照とするスタンダードと比較することを意味する。参照のスタンダードとして好ましくは転写物は、被験者の細胞または組織のゲノム中に各遺伝子の前述の野生型対立遺伝子を有する、同被験者の細胞または組織より得る。
【0094】
“タンパク質レベル”という用語は、ハウスキーピング遺伝子、例えばPLA2にコードされたタンパク質の量と相対してのMDR1の検出可能な量をいう。タンパク質の量は標準的な生化学的技術、例えばウェスタン分析、ELISA、RIA、または当該技術分野に知られている他の抗体を基準とする技術により、決定することができる。
【0095】
“タンパク質の特性”という用語は、前述のタンパク質のパネルのタンパク質レベルを決定して、そのタンパク質レベルを参照のスタンダードと比較することを意味する。参照のスタンダードとして好ましくはタンパク質は、被験者の細胞または組織のゲノム中に各遺伝子の前述の野生型対立遺伝子を有する同被験者の細胞または組織より得る。
【0096】
“活性レベル”という用語は、本発明で開示したこれらの遺伝子に対応する野生型対立遺伝子にコードされたタンパク質の活性と相対しての、同遺伝子の変異型対立遺伝子にコードされたMDR1の検出可能な生物学的活性を意味する。前述のタンパク質の生物学的なアッセイは当該技術分野で周知であり、Hitzl et al., 2001, Pharmacogenetics 11: 293-8 に記載されている。参照のスタンダードとして好ましいタンパク質は、被験者の細胞または組織のゲノム中に各遺伝子の前述の野生型の対立遺伝子を有する被験者の細胞または組織より得る。
【0097】
好ましくは前述の方法は以下のステップ、すなわち(i)腫瘍治療の特定の段階中に患者から腫瘍サンプルを採取すること;および(ii)MDR1に関する発現特性、タンパク質の特性または活性の特性を決定すること、を含む。発現特性に基づいて、適切な参照のスタンダードと比較してのタンパク質の特性を、臨床医は効率的に治療に適用することができる。このことは特に投与量の調整および/またはMDR1阻害剤の投与を含む調整を包含する。好ましくは該阻害剤は以下のMDR1阻害剤の群から選択する:GF120918、LY335979、XR 9576、XR 9051、フラボノイド類(例えばアピゲニン、ゲニスチン、ナリンギン、ケルセチン、フラボン、フラボノン、フラボピリドール)、ベルガモチン、クラリスロマイシン、ケトコナゾール、レゼルピン、1,9−ジデオキシフォルスコリン、アジドピン、ジメチル−b−シクロデキストリン、イベルメクチン、SDZ PSC 833、SDZ 280−446、B669、B−859−35(R鏡像異性体)およびその主な代謝物、MS−209(キノロン誘導体)、PAK−104p、アミロリド、アミトリプチリン、アトルバスタチン、オーレオバシジンおよび類似体、ベリリウムフルオリド(BeFx)、カルモジュリン阻害剤、クロロキン、クロロプロマジン、クロファジミン、クレモホールEL、ジルチアゼム、ベラパミル、ニフェジピン、ベプリジル、ニカルジピン、ニグルジピン、ニトレンジピン、トリフルオペラジン、フェロジピン、バリノマイシン、ジピリダモール、エリスロマイシン、フルオロキノロン類:フレロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、ノルフロキサシン、グリベンクラミド類および類似体、グルコナート塩類、グラミシジン、ヒドロコルチゾン、イトラコナゾール、リドカイン、ホスファチジルコリン、プリスチナマイシンIa、プロパフェノン、プロパノロール、タリノロール、ピリジン類似体、ケルセチン4’−b−グルコシド、キニーネおよびキニジン、キナクリン、シンコニン、リトナビル、サクイナビル、ネルフィナビル、タモキシフェンおよび代謝物、タキソイド(テトラサイクリックタキソピンCおよび誘導体)、テルフェナジン( HYPERLINK "http://bigfoot.med.unc.edu/watkinsLab/intesinfo.htm" http://bigfoot.med.unc.edu/watkinsLab/intesinfo.htm. Paul Watkins, University of North Carolina)。
【0098】
阻害剤という用語は当明細書で使用する場合、競合阻害剤および非競合阻害剤を含む。好ましくは競合阻害剤は基質、例えば(GF120918、LY335979、XR 9576、XR 9051、フラボノイド類)である。好ましくは非競合阻害剤は基質、例えば(SDZ PSC 833、SDZ 280−446、B669、B−859−35、ベラパミル、MS−209、PAK−104p)である。
【0099】
最後に本発明は、本発明の内容で述べた薬剤に対する耐性を患者が持つようになるかどうかを決定する方法を包含する。該方法は以下のステップ、すなわち(i)腫瘍治療の特定の段階中に患者から腫瘍サンプルを採取すること;および(ii)MDR1の発現レベルを決定すること、を含む。各遺伝子の発現は実施例4および5に述べるように、または上述のように決定することができる。該発現特性の評価に基づいて、臨床医はより効率的に治療を適合させることができる。このことは特に投与量の調整および/または先に述べたようにMDR1阻害剤の投与を含む調整を包含する。
【0100】
当明細書に引用した各文献(あらゆる製造の明細書、指示書などを含む)を、参照として当明細書に援用する。
配列番号(SEQ.ID NO.)により本出願で述べた核酸配列およびアミノ酸配列を、以下の表1および2に列記する。多型のヌクレオチドの位置の表示について、以下の代用文字を核酸配列中で使用する:R、GまたはA;Y、TまたはC;M、AまたはC;K、GまたはT;S、GまたはC;W、AまたはTとする。
【0101】
アミノ酸配列は1文字のコードで示す。多型のアミノ酸の位置の文字Xは、修飾されたアミノ酸またはその対応する野生型アミノ酸(アクセション番号参照のこと)を表す。
さらにGenBankアクセション番号を参照して当明細書で述べたすべての核酸およびアミノ酸について、以下の図4から29に示す。
【0102】
【表1−1】
【0103】
【表1−2】
【0104】
【表1−3】
【0105】
【表1−4】
【0106】
【表1−5】
【0107】
【表1−6】
【0108】
【表1−7】
【0109】
【表1−8】
【0110】
【表1−9】
【0111】
【表1−10】
【0112】
【表1−11】
【0113】
【表1−12】
【0114】
【表1−13】
【0115】
【表1−14】
【0116】
【表1−15】
【0117】
【表1−16】
【0118】
【表2−1】
【0119】
【表2−2】
【0120】
【表2−3】
【0121】
【表2−4】
【0122】
【表2−5】
【0123】
本発明を以下の生物学的実施例を参照として説明するが、これらは単に説明のためであり、本発明の範囲を限定する意図はない。
【実施例】
【0124】
実施例1:MDR1遺伝子(アクセション番号M29445)の176の位置に対応する位置でのCからTへの置換による表現型への影響
MDR1遺伝子(アクセション番号M29445)の176の位置に対応する位置でのCからTへの1つのヌクレオチドの置換は、MDR1エキソン26 SNP C3435Tとも言うが、その腸内P−糖タンパク質(PGP)の発現における影響を調べるため、21名からの生検サンプルおよび十二指腸細胞標本をDr. Margarete Fischer-Bosch-Institute for Clnical Pharmacology(シュトゥットガルト)にて、定量的免疫組織化学法およびウェスタンブロット法により調べた。結果を図1に示す。T対立遺伝子(MDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の176の位置に対応する位置に1つのTを有する)のホモ接合体のキャリヤーは、C対立遺伝子(MDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の176の位置に対応する位置にCを有する)のホモ接合体のキャリヤーに比して、有意に高いPGPレベルを示した。ヘテロ接合体の遺伝子型の人は中程度のPGP発現レベルを示した。
【0125】
さらにジゴキシンの腸内摂取に関する薬物動態学におけるMDR1の遺伝子型の影響を、ベルリンのUniversity Medical Center, Chariteの臨床試験において調べた。ジゴキシンの経口投与後の14名の健常被験者において、定常状態でのジゴキシンの血中レベル最大値(Cmax)は、MDR1 3435C>T遺伝子型との相関を示した。図2は、T対立遺伝子のホモ接合体のボランティアは、C/C遺伝子型のボランティアより統計学的に有意に低いジゴキシンレベルを示し(p=0.006、Mann Whitney U 検定)、ジゴキシンの薬物動態にこの多型の影響を反映することを示している。
【0126】
実施例2:MRP1多型とMRP1発現との相関およびMRP1基質による治療中の副作用
MRP1遺伝子の機能的な多型は、結果的にMRP1基質薬剤の血漿レベルおよび/または細胞内濃度に変化をきたす輸送活性に影響を与える。このような薬剤レベルの増加は副作用をもたらす可能性があるが、他方レベルが低下すると、至適治療薬剤レベル以下となり治療が無効になり得る。MRP1多型は、MRP1基質薬剤で治療した患者における、薬剤由来の有害作用の発症および治療効能との相関を示した。ケースコントロール試験において、MRP1のSNPの頻度分布を健常なコントロール群に対して、シスプラチンに伴う腎毒性の患者群および抗癌剤に起因する腎毒性および肝毒性の患者群との間で比較した。さらにMRP1のmRNAレベルのわかっているサンプルを、MRP1遺伝子型についてスクリーニングした。抗癌治療中に腎毒性および肝毒性を示した患者群の結果を、1つのMRP1のSNPについて以下の表に列記する:
【0127】
【表3−1】
【0128】
コントロールのサンプルとは反対に、A対立遺伝子(アクセション番号AC025277のMRP1遺伝子の150727の位置に一致する位置でのGからAへの置換)は、健常なコントロールと比較して薬剤に関連する腎臓および肝臓の副作用のある患者に統計的に有意に高く存在しており(p=0.044、カイ二乗検定)、したがってこれらの副作用の予測の可能性が示唆された。
【0129】
さらにリファンピシン投与前および投与後のMRP1遺伝子型とmRNA発現との関連を、2つのMRP1 SNP、すなわち95T>C(SEQ.ID NO.209、210、211および212、アクセション番号AF022831のMRP1遺伝子の95の位置に対応する位置でのTからCへのヌクレオチドの置換)および259A>G(SEQ.ID NO.277、278、279および280、アクセション番号AF022831のMRP1遺伝子の259の位置に対応する位置でのAからGへのヌクレオチドの置換)について検出した。これらのSNPはリンクして1つの対立遺伝子型を形成する。図3に示すように2つの独立した実験(リファンピシンの誘発のある場合およびない場合)において、この変異型対立遺伝子(MRP1変異型、アクセション番号AF022831のMRP1遺伝子の95の位置がC、および259の位置がG)は、MRP1のmRNAの発現低下に、そして野生型対立遺伝子(MRP1野生型、アクセション番号AF022831のMRP1遺伝子の95の位置がT、および259の位置がA)はMRP1の発現増加に統計的に有意に相関する。
【0130】
MRP1のmRNAの含有量の差は、MRP1遺伝子型に関する個人差に基づいており、これらのSNPを分析することでMRP1発現レベルに関する高度な診断および予後の評価が得られ、MRP1基質の薬剤の治療結果および有害作用を予測することができる。
【0131】
実施例3:投与量の算出
イリノテカンの治療効能および有害作用は、親化合物および活性代謝物(例えばSN−38)の血漿レベルおよび細胞内濃度、CYP3A5およびUG1A1の関連する代謝にコントロールされる過程、およびMRP1およびMDR1の関連する輸送過程に依存する[Atsumi, et al., 1991, Xenobiotica 21: 1159-69, Iyer, et al., 1998, J Clin Invest 101: 847-54, Ciotti, et al., 1999, Biochem Biophy Res Commun 260: 199-202, Santos, et al., 2000, Clin Cancer Res 6: 2012-20, Kuhn, 1998, Oncology (Huntingt) 12: 39-42, Chen, et al., 1999, Mol Pharmacol 55: 921-8, Chu, et al., 1997, Cancer Res 57: 1934-8, Chu, et al., 1997, J Pharmacol Exp Ther 281: 304-14; Chu, et al., 1998, Cancer Res 58: 5137-43, Chu, et al., 1999, Drug Metab Dispos 27: 440-1, Chu, et al., 1999, J Pharmacol Exp Ther 288: 735-41, Mattern, et al., 1993, Oncol Res 5: 467-74, Hoki, et al., 1997, Cancer Chemother Pharmacol 40: 433-8, Sugiyama, et al., 1998, Cancer Chemother Pharmacol 42: S44-9]。例えばMRP1は細胞の解毒システムの一部としてグルクロノシルトランスファラーゼに近接して作用し、グルクロン酸抱合体、例えばSN−38Gを輸送することが知られている[Koenig et al., 1999, Biochim Biophys Acta 1461: 377-394, Kerb et al., 2001, Pharmacogenomics 2: 51-64]。例えばSN−38Gが細胞から胆汁中へのどの程度搬出されるかが、グルクロン酸抱合体の形成速度に大いに影響を与える。SN−38の効率的な解毒には、UGT1A1による抱合およびグルクロニドの搬出の双方の過程が必要である。
【0132】
CYP3A5遺伝子(アクセション番号GI:10281451)の47518T>C(SEQ.ID NO.137、138、139および140)および9736A>G(SEQ.ID NO.149、150、151、152)のヌクレオチドの置換、ならびにCYP3A5遺伝子(アクセション番号GI:11177452)の145601T>G(SEQ.ID NO.141、142、143、144)および145929A>G(SEQ.ID NO.145、146、147および148)のヌクレオチドの置換はCYP3A5の高発現に関連する対立遺伝子を形成し、そのためイリノテカンのより高い代謝の不活性化を伴う。この対立遺伝子を有する人は代謝能の高い群(EM)であり、そのため残りの代謝能の遅い群(PM)とは反対に、イリノテカンの毒性を受けにくい。高発現に関連する1つの対立遺伝子と低発現に関連する1つの対立遺伝子を伴う人は、代謝能の中程度の群(IM)とみなされる。
【0133】
MDR1遺伝子(アクセション番号29445)の176C>Tヌクレオチド置換(SEQ.ID NO.217、218、219および220)はPGP低発現に関連する薬剤の低排出を伴い、MRP1遺伝子(アクセション番号AF022831)の95T>C(SEQ.ID NO.209、210、211および212)ならびに259A>G(SEQ.ID NO.277、278、279および280)のヌクレオチド置換はmRNAの低発現を伴い、MRP1遺伝子(アクセション番号M29445)の150727G>Aヌクレオチド置換(SEQ.ID NO.217、218、219および220)はPGP低発現に関連する薬剤の低排出を伴い、そしてMRP1遺伝子(アクセション番号AC025277)の150727G>Aヌクレオチド置換(SEQ.ID NO.217、218、219および220)は有害作用を伴う。したがって輸送体の低発現に関連する対立遺伝子を保有する個体は、細胞を毒性化合物から浄化する能力が劣る。輸送および代謝の双方が遺伝子と用量との依存の仕方に影響を及ぼす。各輸送タンパク質の低発現に関連する対立遺伝子の数により、各遺伝子について輸送能の高い群(ET)、輸送能の中程度の群(IT)または輸送能の低い群(PT)のいずれかに各個体を分類することができる。
【0134】
イリノテカンによる治療の開始前の遺伝子検査により、患者のMDR1およびMRP1に関する輸送能を予測することができる。有害作用に対する各個体のリスクはPMおよび/またはPT対立遺伝子の数に依存する。CYP3A5およびUGT1A1のPMに関連する対立遺伝子、およびMDR1およびMRP1のPTに関連する対立遺伝子を有する人は、イリノテカンの毒性を受けるリスクが最も高い。
【0135】
この知識に基づいて、CYP2D6、CYP2C9およびCYP2C19の基質の薬剤に関してBrockmoller ら(2000, Pharmacogenomics 1:125)により示されたように、最初の投与前に初回の用量を調整することができる。
【0136】
用量の調整はスコアによるシステムを用いて行うことができる。PMまたはPTに関連する各対立遺伝子について一定のスコアを割り付ける、例えばスコア2はUGT1A1のPM対立遺伝子226A(SEQ.ID NO.9、10、11、12、540、541)および701A(SEQ.ID NO.25,26、27、28、554、555)に割り付け、スコア1はCYP3A5のPMに関連する対立遺伝子(47523Tプラス35649Aプラス145601Tプラス145929A、47523Tプラス35649Gプラス145601Gプラス145929G、および47523Cプラス35649Aプラス145601Tプラス145929A)、MDR1低発現の対立遺伝子176T(SEQ.ID NO.417、418、419および420)、MRP1低発現の対立遺伝子150727A(SEQ.ID NO.217、218、219および220)ならびに259G(SEQ.ID NO.277、278、279および280)、MRP1の対立遺伝子15072A(SEQ.ID NO.217、218、219および220)に割り付ける。遺伝子型の分類の後スコアを合計し、イリノテカン投与量を合計値により調整する。各スコアの1点が10%の用量の減量に対応する、すなわちスコア1は10%、スコア2は20%、スコア3は30%などの用量の減量に対応する。
【0137】
実施例4:培養条件および生物学的アッセイ
ヒトの上皮性子宮頸癌細胞株KB3−1およびその2つのサブクローン(KB3−1(MDR1+++)およびKB3−1(MDR1+++、CYP3A5))、ならびに膀胱癌細胞株RT112およびそのサブクローン(RT112(MDR1+、UGT1A1))を3.7g/lのNaHCO3、4.5g/lのD−グルコース、1.028g/lのN−アセチル−L−アラニル−L−グルタミンを含み、そして10%ウシ胎仔(血清)、1mMピルビン酸Naおよび1%非必須アミノ酸を補ったダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で培養した。ヒト結腸癌細胞株LS174Tは、L−グルタミン、ピロドキシン塩酸塩およびフェノールレッド不含25mMヘペスバッファーを含み、そして10%ウシ胎仔(血清)、1mMピルビン酸Naおよび1%非必須アミノ酸を補ったダルベッコ変法イーグル培地中で培養した。すべての細胞は、加湿雰囲気下での5%CO2下37℃でインキュベーションした。
【0138】
薬剤
イリノテカン(CPT−11)およびその活性代謝物SN−38はPharmaciaより入手した。ストック溶液の調製のため物質をメタノール中に溶かして、CPT−11は10mg/mlおよびSN−38は1mg/mlとし、遮光して4℃で保存した。より低濃度の希釈液はPBSおよび細胞培養培地にて調製した。R−ベラパミルはSIGMAより入手し、DMSO中に50mg/mlとなるように溶かし、さらにPBSで希釈した。
【0139】
薬剤による細胞の処理
細胞を処理前24時間に96穴培養プレートに植えつけた。異なる成長速度に合わせて、KB3−1細胞およびRT112細胞は細胞数700/穴、RT112(MDR1+、UGT1A1)は細胞数1000/穴、ならびにKB3−1(MDR1+++)およびKB3−1(MDR1+++、CYP3A5)は細胞数1200/穴として植えつけた。LS174Tは細胞数1.0×104/穴として植えつけた。細胞を培養培地で新たに調整した一連の希釈液、すなわちCPT−11は0、0.5、1、2.5、5、7.5、10、25、50、75、100および200μg/ml、ならびにSN−38は0、0.1、0.25、0.5、1、5、10、25、50、75、100および200ng/mlとした希釈液で処理した。4穴を等しい薬剤の希釈液で処理した。加湿した5%CO2雰囲気下37℃で3日間インキュベーションした。
【0140】
MDR1阻害の実験に関してはR−ベラパミルを最終濃度10μ/mlとなるように各薬剤希釈液の2穴に加えた。
細胞毒性のアッセイ
市販の入手可能なMTSアッセイシステム(Promega, Madison, USA)を使用して、製品の指示書に従って増殖阻害および細胞死を決定した。薬剤添加後3日に、MTS/PMSを合わせた溶液20μlを96穴培養プレートの各穴に加えた。このプレートを加湿した5%CO2雰囲気下37℃で少なくとも45分間インキュベーションし、492nmでの吸光度を測定した。各プレートの未処理のコントロール細胞の吸光度を100%増殖として設定し、残りの薬剤処理した細胞の成長を計算した。培養プレート上の未処理細胞を、増殖および生存の影響を受けていないコントロールとした。
細胞増殖の50%阻害に影響を与えた薬剤の濃度をIC50と定義した。
【0141】
RNAの調製およびcDNAの合成
これらの実験で使用した各細胞のバッチからメッセンジャーRNAを、細胞溶菌液よりオリゴdT磁気ビーズ(μMACS mRNA単離キット;Miltenyl Biotech)にて製品の指示書に従って単離した。各細胞株の250ngのmRNAを、Superscript II逆転写酵素(Gibco BRL)による20μlのcDNA合成反応に用いた。このcDNAの希釈液を転写特異的増幅反応の鋳型とした。
【0142】
PCRプライマーおよび反応条件
PCRは表3に示したように、0.5ユニットのTaqポリメラーゼ(Qiagen)、200μMのヌクレオチド混合物、5μlのcDNA鋳型希釈液および0.2μMの遺伝子特異的プライマーを含む25μl反応液にて設定した。すべての反応はサイクル数のみ異なる(表)、同一の増幅条件下で行った、すなわち94℃での2分間の予備変性、続いて増幅のため:94℃での45秒間の変性、62℃での45秒間のアニーリング、および72℃での45秒間の伸張とし、より長い2分の伸張を必要とするUGT1A1だけは例外とした。
【0143】
【表3−2】
【0144】
実施例5:イリノテカンの代謝に関与する遺伝子の発現
ヒト膀胱癌細胞株RT112、そのザブクローンRT112(MDR1、UGT1A1)、ヒト上皮性子宮頸癌細胞株KB3−1および2つのサブクローンのKB3−1(MDR+++)およびKB3−1(MDR+++、CYP3A5)、ならびに直腸癌細胞株LS174T(ATCC CL−188)からメッセンジャーRNAを単離した。これらのmRNAをcDNAに逆転写し、転写特異的増幅反応の鋳型として、イリノテカンの転写および代謝に関与する遺伝子(MDR1、MRP1、UGT1A、UGT1A1、CYP3A4、CYP3A5)の発現レベルを決定するのに適用した。ハウスキーピング遺伝子のホスホリパーゼA2(PLA2)の増幅を、反応中の対比すべきcDNA量のコントロールとして使用した。
【0145】
図29の増幅反応は、癌細胞株のRT112、KB3−1およびLS174Tは各々MDR1を発現しないかまたは非常に低発現であることを示している。RT112(MDR1、UGT1A1)はRT112のサブクローンであるが、Seemannら(Urol Res 1995; 22: 353-360)が記載したように細胞毒性薬剤への耐性用として選択され、中程度のMDR1の発現増加を特徴とする。薬剤耐性サブクローンのKB3−1(MDR1+++)およびKB3−1(MDR1+++、CYP3A5)も、MDR1基質への暴露によりオリジナルのKB3−1細胞株から同様に誘導された。これらのサブクローンは高度に増加したMDR1の発現をを特徴とする。これらはオリジナルのKB3−1細胞の20倍以上の転写を示し、非常に高いMDR1活性を含む。MRP1はすべての細胞株で同レベルの発現をする。UGT1A酵素の転写物は、RT112細胞、RT112(MDR1、UGT1A1)細胞、およびLS174T細胞のみで行われる。UGT1A1はRT112ではわずかしか発現せず、RT112(MDR1、UGT1A1)ではより強く、LS174T細胞では最も高い発現を示す。CYP3A4はLS174Tでのみ非常に少量検出されただけであった。RT112細胞、RT112(MDR1、UGT1A1)およびLS174Tは、CYP3A5の機能的に不活性なスプライスバリアントおよび機能的に活性な転写物とのヘテロ接合体の発現を示す。反対にKB3−1細胞およびKB3−1(MDR1+++)細胞は、活性なCYP3A5転写のみを有し、KB3−1(MDR1+++、CYP3A5)細胞は活性なCYP3A5転写の最も高い発現を示し、後者が最も高いCYP3A5活性を有することを含む結果であった。
【0146】
実施例6:MDR1活性およびCYP3A5活性のないまたは低い直腸癌および他の上皮性癌細胞株は、CPT−11およびSN−38への感受性がある。
直腸癌細胞株LS174T、子宮頸癌細胞株KB3−1、および膀胱癌細胞株RT112を、処理前24時間に96穴の培養プレートに植え付けた。各細胞を4穴ずつ、CPT−11およびSN−38の一連の希釈液にてインキュベーションし、上述のように分析した。図30は、CPT−11およびSN−38の処理で、3種類すべての上皮性癌細胞株が増殖を停止し死滅することを示している。CPT−11の50%阻害(IC50)に至る濃度は、LS174T細胞では1.5μg/ml、RT112細胞では2.5μg/ml、KB3−1細胞では5μg/mlであった。CPT−11の活性代謝物であるSN−38は、103分の1の濃度で同程度の増殖阻害および細胞死を引き起こすため、CPT−11の1000倍の効能を示す。SN−38のIC50は、LS174T細胞では5ng/ml、RT112細胞では4ng/ml、KB3−1細胞では25ng/mlであった。
【0147】
これらの結果は、3種類すべての上皮性癌細胞株が異なる組織由来ではあるが、CPT−11およびSN−38処理に対して類似の感受性があることを示す。この結果はまた、MDR1を発現しないまたは低発現する癌細胞(図29)は、CPT−11およびSN−38により効率的に死滅させることができることも示している(図30)。
【0148】
実施例7:MDR1活性はCPT−11およびSN−38に対する癌細胞の耐性に相関する
KB3−1、ならびにMDR1を強く発現するそのサブクローンのKB3−1(MDR1+++)およびKB3−1(MDR1+++、CYP3A5)の細胞を、処理前24時間に96穴培地に植え付けた。各細胞株を4穴ずつ、CPT−11およびSN−38の一連の希釈液にてインキュベーションし、上述のように処理した。MDR1高発現のKB3−1サブクローン(KB3−1(MDR1+++)およびKB3−1(MDR1+++、CYP3A5))(図29)の阻害曲線(図31)は、MDR1低発現のKB3−1細胞株(KB3−1)に比して、CPT−11およびSN−38に対する有意に高い耐性を示す。CPT−11についてのIC50はKB3−1細胞の5μg/mlからKB3−1(MDR1+++)細胞の85μg/mlおよびKB3−1(MDR1+++、CYP3A5)細胞の200μg/mlに、17倍から40倍の増加を示した。SN−38のIC50はKB3−1の25ng/mlからKB3−1(MDR1+++)の200ng/mlおよびKB3−1(MDR1+++、CYP3A5)の200ng/mlより多くに、少なくとも8倍増加した。
【0149】
CPT−11およびSN−38はMDR1の基質であり、したがってMDR1活性により細胞から排出される。MDR1の発現レベルは、CPT−11およびSN−38に対する腫瘍細胞の感受性と負の相関を示す。その結果、MDR1を高発現する表現型の細胞を死滅させるには、ずっと高濃度のCPT−11が必要となる。
【0150】
実施例8:UGT1A1活性はSN−38への感受性には相関するが、CPT−11への相関はない
CPT−11およびSN−38への感受性を、RT112細胞およびそのサブクローンのRT112(MDR1、UGT1A1)間で比較した。各細胞株を4穴ずつ、CPT−11およびSN−38の一連の希釈液にてインキュベーションし、上述のように処理した。
【0151】
CPT−11への感受性の差は図32Aに示したようにわずかしかなかった。CPT−11に対するRT112(MDR1、UGT1A1)細胞のIC50は4μg/mlで、RT112細胞(IC50は2.5μg/ml)に比して2倍の高値であった。MDR1を発現しないRT112細胞とは反対に、RT112(MDR1、UGT1A1)細胞は中程度の量のMDR1を発現し、このことからCPT−11への感受性のわずかではあるが有意な増加を説明することができる。SN−38による処理後、RT112細胞(IC50は4ng/ml)およびRT112(MDR1、UGT1A1)細胞(IC50は75ng/ml)間にはずっと明確な差が認められる(図32B)。RT112(MDR1、UGT1A1)細胞株の19倍高い耐性は、RT112細胞に比してRT112(MDR1、UGT1A1)ではより高レベルで発現する、UGT1A1のさらなる解毒効果により説明することができる(図29)。SN−38とは反対にCPT−11はUGT類により代謝されない。そのためCPT−11に関連する毒性はUGT1A1の発現による影響を受けず、RT112(MDR1、UGT1A1)細胞におけるUGT類の耐性増強能は、SN−38投与によってのみ検出されることになる。
【0152】
実施例9:MDR1の阻害は、MDR1高発現の癌細胞ではCPT−11およびSN−38に対する感受性増強剤となるが、MDR1低発現の癌細胞では有効ではない
特異的阻害剤のR−ベラパミルを用いてMDR1機能を遮断した後、KB3−1細胞ならびにそのサブクローンのKB3−1(MDR1+++)およびKB3−1(MDR1+++、CYP3A5)の、CPT−11およびSN−38に対する感受性を評価した。各細胞株を4穴ずつ、CPT−11およびSN−38の一連の希釈液にてインキュベーションし、上述のように分析した。2穴をさらにMDR1阻害剤のR−ベラパミルで処理した。図33は、R−ベラパミルの添加はMDR1低発現のKB3−1細胞の、CPT−11およびSN−38への感受性にはわずかしか効果がないことを示す(CPT−11およびSN−38の各IC50は、R−ベラパミルを加えた場合の4.5μg/mlおよび15ng/mlに対して、R−ベラパミルを加えない場合には5μg/mlおよび25ng/ml)。反対にMDR1発現細胞のKB3−1(MDR1+++)およびKB3−1(MDR1+++、CYP3A5)のCPT−11およびSN−38に対する感受性は、R−ベラパミルによるMDR1輸送機能の阻害後、8倍および10倍高くなった。CPT−11に関するKB3−1(MDR1+++、)細胞のIC50は、R−ベラパミルを加えない場合の85μg/mlから、加えた場合の10μg/mlに減少し、KB3−1(MDR1+++、CYP3A5)細胞ではR−ベラパミルを加えない場合の200μg/mlから、加えた場合の25μg/mlにまで減少した。SN−38処理中のMDR1阻害効果は、これらのMDR1高発現細胞においてはさらに強く、R−ベラパミルはMDR1による輸送を完全に遮断し、MDR1高発現細胞がKB3−1細胞と同程度の感受性になる。
【0153】
これらの結果は、MDR1活性はCPT−11およびSN−38に対する癌細胞の耐性に関連し、MDR1を阻害することが細胞の感受性を高め、その結果癌細胞をより低濃度の薬剤でより効率的に死滅させることを示している。
【0154】
実施例10:CYP3A5活性はCPT−11への耐性に影響を与える
KB3−1(MDR1+++)細胞およびKB3−1(MDR1+++、CYP3A5)細胞はそのCYP3A5の量により異なる(図29)。各細胞株を4穴ずつ、CPT−11、SN−38の一連の希釈液にてインキュベーションし、上述のように分析した。2穴をさらにMDR1阻害剤R−ベラパミルで処理した。
【0155】
MDR1の活性は、CPT―11およびSN−38に対する細胞の感受性の主な決定要素であるため、これらのMDR1高発現細胞株におけるMDR1活性を特異的なMDR1阻害剤であるR−ベラパミルを過剰に用いて完全に遮断し、MDR1の介入を排除してCPT−11およびSN−38に関するCYP3A5の効果を分析した。
【0156】
CYP3A5高発現細胞株のKB3−1(MDR1+++、CYP3A5)は、CPT−11に対して10μg/mlのIC50を示すKB3−1(MDR1+++)に比して、25μg/mlのIC50という2.5倍の耐性を示す(図34)。SN−38に対する感受性については、これら2つの細胞株間の差は認められなかった。
【0157】
これらの実験は、SN−38とは反対にCPT−11への耐性においてCYP3A5の発現の有意な効果を示している。CYP3A5の活性はSN−38の毒性に影響されなかったという事実は、SN−38とは違ってCPT−11はCYP3A5に代謝されるため、CYP3A5の効果をさらに確かなものとしている。
【0158】
実施例11:MDR1遺伝子型の決定は、遺伝子型に基づいた予測および薬剤耐性のモニターによりイリノテカンの治療効能を改善する
イリノテカンの治療効能および有害作用は、親化合物および活性代謝物(例えばSN−38)の血漿レベルおよび腫瘍細胞内濃度に依存する。MDR1遺伝子は、イリノテカンのPGP依存性の膜の貫通をコントロールしており[Luo et al., Drug Metab Dispos 2002, 30: 763-770; Jansen et al., Br J Cancer 1998, 77: 359-65; Chu et al., J Pharmacol Exp Ther 1999; 288, 735-41; Sugiyama et al., Cancer Chemother Pharmacol 1998, 42 Suppl: S44-9]、そのためイリノテカンの全身での利用可能性および細胞内蓄積に関する重要な決定要素である。MDR1遺伝子(アクセション番号M29445)の176C>Tヌクレオチドの置換(SEQ.ID NO.217、218、219および220)は、PGP低発現に関連する薬剤の低排出を伴い、この置換を保有する患者は、以下の2つの理由からイリノテカン治療により反応しやすくなる、すなわち:1)腸嚢胞中のPGP量がより低いため、より多くのイリノテカンが腸のバリヤーを通過して体内に入ることができ、より多くのイリノテカンがその作用部位である腫瘍に到達する理由となる、2)腫瘍細胞膜中のより低い量のPGPのため、より多くのイリノテカンが腫瘍細胞内に貫通することができ、その細胞毒性効果を奏功させることができる。現在使用されているイリノテカンの標準的な用量は、化学治療の1回目のサイクルで非常にわずかな薬剤耐性腫瘍細胞しか生き残らせずに、ほとんどの腫瘍細胞を非常に効率的に死滅させることができ、有害作用にも耐えられるものである。薬剤耐性のメカニズムは別として、これらの患者では生き残る細胞数が非常に少ないため、イリノテカン治療にもはや反応しない薬剤耐性腫瘍が出現することはない。
【0159】
高発現MDR1遺伝子型(MDR1遺伝子、アクセション番号:M29445の176の位置がヌクレオチドC)の患者は、イリノテカン治療に反応しにくい。薬剤耐性腫瘍の出現を予防するために腫瘍細胞を十分に効率的に死滅させるには、より高用量が必要となる。しかしイリノテカンの投与量の増加は、耐えられない有害作用(例えば下痢、好中球減少、または血栓塞栓症の併発)の発症のため限定される。その代わりにPGP阻害剤を加えることにより、イリノテカン治療の効能を改善することができる。PGP阻害剤はMDR1高発現の患者において、MDR1低発現の患者と同じ位効率的にイリノテカンの細胞毒性が効くように、イリノテカンを腫瘍細胞内に濃縮できるようにするという方法で、効率的にPGP機能を遮断する。その結果、遺伝子型ではMDR1高発現の患者が、表現型ではMDR1低発現の患者に匹敵するようになる。
【0160】
MDR1遺伝子の低発現対立遺伝子または高発現対立遺伝子の数により、各個人を輸送能の高い群(ET、2つの高発現対立遺伝子)、輸送能の中程度の群(IT、1つの高発現対立遺伝子、1つの低発現対立遺伝子)または輸送能の低い群(PT、2つの低発現対立遺伝子)のいずれかを有するとして分類することができる。イリノテカンによる治療の開始前に遺伝子検査を行うことにより、患者をET、IT、またはPTとして分類することができ、患者のMDR1に関連する輸送能を予測することができる。不十分な抗癌治療となる個体のリスクは、MDR1高発現対立遺伝子の数に伴って増加する。ET遺伝子型の個体はイリノテカンに十分に反応しないリスクが最も高く、薬剤耐性腫瘍の出現するリスクが最も高い。ETの患者はイリノテカンに加えてPGP阻害剤で治療し、有害作用および化学治療に関連する薬剤耐性の出現をより頻繁にモニターされるべきである。さらに薬剤耐性腫瘍の出現するリスクの高いこれらの患者は、化学治療の各サイクルの間に腫瘍の生検を行い、その後の薬剤耐性に関する個体の腫瘍細胞の特性を知ることが特に有益となり得る。
【図面の簡単な説明】
【0161】
【図1】図1は、21名のボランティアにおける、ウェスタンブロット分析により決定された、エキソン26SNPと腸内MDR1発現との相関を示す。ボックスプロットは、MDR1遺伝子(GenBank アクセッション番号M29445)の176の位置に対応する位置でのMDR1 3435C>T遺伝子型により集合した(clustered)、MDR1発現の分布を示す。T対立遺伝子はp−糖タンパク質の低発現に関連していた。
【図2】図2は、定常状態でのジゴキシンの血漿レベルのピークを検討する臨床試験に参加した14名の健常なボランティアにおける、MDR1 3435C>T遺伝子型とジゴキシン摂取との相関を示す[Johne et al., 1999, Clin, Pharmacol. Ther 66: 338-345]。ジゴキシンレベルの最大値は、T対立遺伝子およびC対立遺伝子の各ホモ接合体の2群間で、統計的に有意な差が認められた(p=0.006、Mann Whitney U検定)。
【図3】図3は、2つの独立した実験、すなわちリファピシン投与前および投与後の実験から抽出された、健常なボランティアからの十二指腸生検中のMRP1のmRNA含有量と、遺伝子型(野生型/野生型:1、野生型/変異型および変異型/変異型:2)の相関を表す。リファピシンによる治療はMRP1のmRNAの発現には影響しなかった(p<0.001、ペアt検定)。MRP1遺伝子型の、MRP1のmRNAのレベルとの強い関連傾向が認められた(p=0.086、Kruskal-Wallis 検定)。
【図4】図4は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図5】図5は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図6】図6は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図7】図7は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図8】図8は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図9】図9は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図10】図10は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図11】図11は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図12】図12は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図13】図13は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図14】図14は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図15】図15は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図16】図16は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図17】図17は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図18】図18は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図19】図19は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図20】図20は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図21】図21は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図22】図22は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図23】図23は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図24】図24は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図25】図25は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図26】図26は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図27】図27は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図28】図28は、当明細書で述べた核酸およびアミノ酸の配列を示す。
【図29】図29は、癌細胞株におけるイリノテカン代謝に関連する遺伝子の発現特性を示す。この半定量RT−PCRは、増幅産物の右に示した遺伝子の転写物の量を示している。PCR産物はアガロース電気泳動で分析し、臭化エチジウムにて染色した。各断片のサイズは左に塩基対(bp)で示した。
【図30】図30は、上皮性癌細胞株LS174T(直腸)、KB3−1(子宮頸部)、RT112(膀胱)による、CPT−11(A)およびSN−38(B)に関する成長阻害曲線を示す。CPT−11の濃度は0から200μg/ml、およびSN−38の濃度は0から200ng/mlの範囲とした。細胞は3日間処理した。各濃度のデータは少なくとも3穴の平均値である。
【図31】図31は、上皮性子宮頸癌細胞株KB3−1、ならびに多量のMDR1を発現する2つのサブクローンのKB3−1(MDR1)およびKB3−1(MDR1、CYP3A5)による、CPT−11(A)およびSN−38(B)に関する増殖阻害曲線を示す。CPT−11の濃度は0から200μg/ml、およびSN−38の濃度は0から200ng/mlの範囲とした。細胞は3日間処理した。各濃度のデータは少なくとも3穴の平均値および標準偏差である。
【図32】図32は、膀胱癌細胞株RT112、ならびにMDR1およびより多量のUGT1A1を発現するそのサブクローンのRT112(MDR1、UGT1A1)による、CPT−11(A)およびSN−38(B)に関する成長阻害曲線を示す。CPT−11の濃度は0から200μg/ml、およびSN−38の濃度は0から200ng/mlの範囲とした。細胞は3日間処理した。各濃度のデータは少なくとも3穴の平均値および標準偏差である。
【図33】図33は、R−ベラパミルによるMDR1の阻害を伴う、CPT−11(A)およびSN−38(B)に関する成長阻害曲線を示す。上皮性子宮頸癌細胞株KB3−1、ならびにMDR1を高発現する2つのサブクローンのKB3−1(MDR1)およびKB3−1(MDR1、CYP3A5)について、薬剤感受性におけるR−ベラパミルによるMDR1阻害の影響を検討した。CPT−11の濃度は0から200μg/ml、およびSN−38の濃度は0から200ng/mlの範囲とし、R−ベラパミルを最終濃度10μg/mlとなるように加えた(+V)。細胞は3日間処理した。各濃度のデータは2穴の平均値である。
【図34】図34は、R−ベラパミルによるMDR1の阻害を伴う、CPT−11(A)およびSN−38(B)に関する成長阻害曲線を示す。薬剤耐性細胞におけるMDR1の影響を回避するため、R−ベラパミルにて並行して処理した。CYP3A5発現の異なるKB3−1(MDR1)およびKB3−1(MDR1、CYP3A5)について、MDR1阻害後に残存する耐性を調べた。CPT−11の濃度は0から200μg/ml、およびSN−38の濃度は0から200ng/mlの範囲とし、R−ベラパミルを最終濃度10μg/mlとなるように加えた(+V)。細胞は3日間処理した。各濃度のデータは2穴の平均値である。
Claims (37)
- 癌の患者を治療するためにイリノテカンを使用する方法であって、以下の内容:
(a)患者が、癌組織中にMDR1遺伝子の1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子を有するかどうかを決定すること;
(b)1つまたはそれ以上の該変異型対立遺伝子を有する患者において、該変異型対立遺伝子を有する患者を治療するのに十分な量のイリノテカン、すなわちMDR1遺伝子中の患者の対立遺伝子に関係なく投与する量と比較して、増量または減量した量を同患者に投与すること;
を含む、前記方法。 - 癌が結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、または膵臓癌である、請求項1に記載の方法。
- 以下の内容:
(a)1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が、患者におけるMDR1遺伝子産生物の低い量の発現という結果をもたらすため、毒性を回避するためにその患者に投与するイリノテカンの量を減量すること;または
(b)1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が、患者におけるMDR1遺伝子産生物の高い量の発現という結果をもたらすため、薬効を高めるためにその患者に投与するイリノテカンの量を増量すること;
を含む、請求項2に記載の方法。 - 1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子がMDR1遺伝子のプロモーター領域にある、請求項3に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子がMDR1遺伝子のコード領域にある、請求項3に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子がMDR1遺伝子のプロモーター領域またはコード領域のいずれにもない、請求項3に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子がMDR1遺伝子のプロモーター領域およびコード領域の双方にある、請求項3に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む請求項3に記載の方法であって、その群が:
(a)SEQ.ID NO:337、338、341、342、345、346、349、350、353、354、357、358、361、362、365、366、369、370、373、374、377、378、381、382、385、386、389、390、393、394、397、398、401、402、405、406、409、410、413、414、417、418、421、422、425、426、429、430、433、434、437、438、441、442、445、446、449、450、453、454、457、458、461、462、465、466、469、470、473、474、477、478、481、482、485、486、489、490、493、494、497、498、501、502、505、506、509、510、513、514、517、518、521、522、525、526、636、637、640および/または641のいずれか一つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)SEQ.ID NO:606、608、610、612、618、620、622、624、および/または628のいずれか一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)多剤耐性1(MDR1)遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の140837、141529、141590、145984、171404、171456、171466、171511、171512、174901、175068、175074、175142、175180、139015、139064、139119、139177、139276、140118、140216、140490、140568、140576、140595、140727、139479、139619、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の84701、83946、83973、84032、84074、84119、77811、78170、73252、70200、70204、70237、70253、70371、65241、50537、43263、43162、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の101、308、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の137、176の位置に対応する位置に、少なくとも1つのヌクレオチドの置換または欠失を有する、ポリヌクレオチド;
(d)MDR1遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の83946、70200、70237、65241、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の101、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の141529、174901、139177、140118、140568、140727、139479の位置に対応する位置にAを有する、MDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の308、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の84701、83973、84074、84119、78170、70204、70253、70371、50537、43162、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の137または176、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の145984、171466、175068、175074、139064、139276、140576の位置に対応する位置にTを有する、MDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の140837、171404、171456、171511、171512、139119、140490、139619、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の43263の位置に対応する位置にCを有する、MDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の84032、77811、73252、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の141590、175142、175180、139015、140216、140595の位置に対応する位置にGを有する、ポリヌクレオチド;
(e)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の21、103、168、400、893、999、1001、1107および/または1141の位置に対応する位置にアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド;
(f)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の21の位置に対応する位置でAsnからAspに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の103の位置に対応する位置でPheからLeuに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の168の位置に対応する位置でValからIleに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の400の位置に対応する位置でSerからAsnに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の893の位置に対応する位置でAlaからSerに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の999の位置に対応する位置でAlaからThrに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の1001の位置に対応する位置でAlaからThrに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の1107の位置に対応する位置でGlnからProに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の1141の位置に対応する位置でSerからThrへのアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド;
である、前記方法。 - 1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む請求項8に記載の方法であって、その群が:
(a)SEQ.ID NO:345、417または636のいずれか一つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)SEQ.ID NO:612または618のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)MDR1遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の101、MDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の176、またはMDR1遺伝子(アクセション番号:GI:10122135)の88883の位置に対応する位置に置換を有する、ポリヌクレオチド;
(d)MDR1遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の101、もしくはMDR1遺伝子(アクセション番号:GI:10122135)の88883の位置に対応する位置にAを有する、またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の176、もしくはMDR1遺伝子(アクセション番号:GI:10122135)の88883の位置に対応する位置にTを有する、ポリヌクレオチド;
(e)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の400または893の位置に対応する位置にアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド;
(f)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の400の位置に対応する位置でSerからAsnに、または893の位置に対応する位置でAlaからSerへのアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド;
である、前記方法。 - 1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が、患者におけるMDR1遺伝子産生物の低い量の発現という結果をもたらすため、その患者に投与するイリノテカンの量を減量する、請求項8に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が、患者におけるMDR1遺伝子産生物の高い量の発現という結果をもたらすため、その患者に投与するイリノテカンの量を増量する、請求項8に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が、患者におけるMDR1遺伝子産生物の低い量の発現という結果をもたらすため、その患者に投与するイリノテカンの量を減量する、請求項9に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子が、患者におけるMDR1遺伝子産生物の高い量の発現という結果をもたらすため、その患者に投与するイリノテカンの量を増量する、請求項9に記載の方法。
- 患者がMDR1遺伝子の1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子を有するかどうかを決定することを含む、患者がイリノテカンによる治療に対して有毒な反応についてのリスクがあるかどうかを決定する方法。
- 患者にイリノテカンを減量して投与することをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 以下の内容:
(a)患者がMDR1遺伝子の1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子を有するかどうかを決定すること;
(b)1つまたはそれ以上の該変異型対立遺伝子を有する患者において、MDR1遺伝子中の同患者の対立遺伝子に関係なくイリノテカンを投与する場合の同患者のピークの量と比較して、同患者のイリノテカンのピークの量を低下させるように投与計画を変更すること;
を含む、癌の患者にイリノテカンを投与するための最適な投与計画を決定する方法。 - MDR1遺伝子産生物の発現レベルが一般的な母集団の場合より低く、そのためイリノテカンへの高い感受性を示すような、MDR1遺伝子の1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子を有する患者において、イリノテカンを減量して同患者に投与することを含む、癌の治療法。
- MDR1遺伝子産生物の発現レベルが一般的な母集団の場合より高く、そのためイリノテカンへの耐性または耐性素因を示すような、MDR1遺伝子の1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子を有する患者において、イリノテカンを増量して同患者に投与することを含む、癌の治療法。
- 耐性または耐性素因を示す変異型対立遺伝子を有する患者を、MDR1阻害剤を用いて治療する請求項18に記載の方法。
- MDR1阻害剤が以下の:
GF120918、LY335979、XR 9576、XR 9051、フラボノイド類(例えばアピゲニン、ゲニスチン、ナリンギン、ケルセチン、フラボン、フラボノン、フラボピリドール)、ベルガモチン、クラリスロマイシン、ケトコナゾール、レゼルピン、1,9−ジデオキシフォルスコリン、アジドピン、ジメチル−b−シクロデキストリン、イベルメクチン、SDZ PSC 833、SDZ 280−446、B669、B−859−35(R鏡像異性体)およびその主な代謝物、MS−209(キノロン誘導体)、PAK−104p、アミロリド、アミトリプチリン、アトルバスタチン、オーレオバシジンおよび類似体、ベリリウムフルオリド(BeFx)、カルモジュリン阻害剤、クロロキン、クロロプロマジン、クロファジミン、クレモホールEL、ジルチアゼム、ベラパミル、ニフェジピン、ベプリジル、ニカルジピン、ニグルジピン、ニトレンジピン、トリフルオペラジン、フェロジピン、バリノマイシン、ジピリダモール、エリスロマイシン、フルオロキノロン類:フレロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、ノルフロキサシン、グリベンクラミド類および類似体、グルコナート塩類、グラミシジン、ヒドロコルチゾン、イトラコナゾール、リドカイン、ホスファチジルコリン、プリスチナマイシンIa、プロパフェノン、プロパノロール、タリノロール、ピリジン類似体、ケルセチン4’−b−グルコシド、キニーネおよびキニジン、キナクリン、シンコニン、リトナビル、サクイナビル、ネルフィナビル、タモキシフェンおよび代謝物、タキソイド(テトラサイクリックタキソピンCおよび誘導体)、テルフェナジン、
からなる群から選択される、請求項19の方法。 - 癌細胞内のMDR1遺伝子産生物の発現レベルの変化をアッセイすることにより治療中に患者をモニターし、それによりMDR1遺伝子産生物の発現レベルの増加を、同患者へのイリノテカンの投与量を増量することで補うことをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- イリノテカンの有効量を患者に内部的に投与することを含む、同患者における癌の治療方法であって、治療計画を同患者のMDR1遺伝子の遺伝子型に基づいて修飾する前記方法。
- 以下の内容:
(a)患者がMDR1遺伝子の1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子を有するかどうかを、患者ごとにその患者について決定すること;
(b)1つまたはそれ以上の該変異型対立遺伝子を有する患者において、該変異型対立遺伝子を有する患者を治療するのに十分な量のイリノテカン、すなわちMDR1遺伝子中の患者の対立遺伝子に関係なく投与する量と比較して、増量または減量した量を同患者に投与すること;
を含む癌の患者の母集団の治療方法。 - 患者がMDR1遺伝子の1つまたはそれ以上の変異型対立遺伝子を有するかどうかを決定することを含む、癌の患者におけるイリノテカンへの感受性を予測する方法であって、該対立遺伝子が癌細胞が低い量または高い量のMDR1タンパク質を発現することを示し、それにより低発現はイリノテカンへの高い感受性を、および高発現はイリノテカンへの耐性または耐性素因を示す、前記方法。
- 耐性または耐性素因を示す遺伝子型を有する患者に、MDR1阻害剤を投与することをさらに含む、請求項24に記載の方法。
- MDR1阻害剤が以下:
GF120918、LY335979、XR 9576、XR 9051、フラボノイド類(例えばアピゲニン、ゲニスチン、ナリンギン、ケルセチン、フラボン、フラボノン、フラボピリドール)、ベルガモチン、クラリスロマイシン、ケトコナゾール、レゼルピン、1,9−ジデオキシフォルスコリン、アジドピン、ジメチル−b−シクロデキストリン、イベルメクチン、SDZ PSC 833、SDZ 280−446、B669、B−859−35(R鏡像異性体)およびその主な代謝物、MS−209(キノロン誘導体)、PAK−104p、アミロリド、アミトリプチリン、アトルバスタチン、オーレオバシジンおよび類似体、ベリリウムフルオリド(BeFx)、カルモジュリン阻害剤、クロロキン、クロロプロマジン、クロファジミン、クレモホールEL、ジルチアゼム、ベラパミル、ニフェジピン、ベプリジル、ニカルジピン、ニグルジピン、ニトレンジピン、トリフルオペラジン、フェロジピン、バリノマイシン、ジピリダモール、エリスロマイシン、フルオロキノロン類、フレロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、ノルフロキサシン、グリベンクラミド類および類似体、グルコナート塩類、グラミシジン、ヒドロコルチゾン、イトラコナゾール、リドカイン、ホスファチジルコリン、プリスチナマイシンIa、プロパフェノン、プロパノロール、タリノロール、ピリジン類似体、ケルセチン4’−b−グルコシド、キニーネおよびキニジン、キナクリン、シンコニン、リトナビル、サクイナビル、ネルフィナビル、タモキシフェンおよび代謝物、タキソイド(テトラサイクリックタキソピンCおよび誘導体)、テルフェナジン、
からなる群から選択される、請求項25に記載の方法。 - 耐性または耐性素因を示す遺伝子型を有する患者を、癌細胞内のMDR1遺伝子産生物の発現レベルの変化をアッセイすることにより治療中にモニターし、その結果イリノテカンへの感受性の最新の予測を決定してもよい、請求項25に記載の方法。
- 以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む第1の対立遺伝子を含むゲノムを有する被験者における、結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、および膵臓癌の治療用医薬組成物を製造するための、イリノテカンまたはその誘導体の使用であって、その群が:
(a)SEQ.ID NO:337、338、341、342、345、346、349、350、353、354、357、358、361、362、365、366、369、370、373、374、377、378、381、382、385、386、389、390、393、394、397、398、401、402、405、406、409、410、413、414、417、418、421、422、425、426、429、430、433、434、437、438、441、442、445、446、449、450、453、454、457、458、461、462、465、466、469、470、473、474、477、478、481、482、485、486、489、490、493、494、497、498、501、502、505、506、509、510、513、514、517、518、521、522、525および/または526のいずれか一つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)SEQ.ID NO:606、608、610、612、618、620、622、624、および/または628のいずれか一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)多剤耐性1(MDR1)遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の140837、141529、141590、145984、171404、171456、171466、171511、171512、174901、175068、175074、175142、175180、139015、139064、139119、139177、139276、140118、140216、140490、140568、140576、140595、140727、139479、139619、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の84701、83946、83973、84032、84074、84119、77811、78170、73252、70200、70204、70237、70253、70371、43263、43162、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の101、308、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の137、176の位置に対応する位置に、少なくとも1つのヌクレオチドの置換または欠失を有する、ポリヌクレオチド;
(d)MDR1遺伝子とハイブリダイズすることのできるポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドがMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の83946、70200、70237、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の101、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の141530、174901、139177、140118、140568、140727、139479の位置に対応する位置にAを有する、MDR1遺伝子(アクセション番号:M29432)の308、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の84701、83973、84074、84119、78170、70204、70253、70371、43162、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:M29445)の137または176、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の145984、171466、175068、175074、139064、139276、140576の位置に対応する位置にTを有する、MDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の140827、171404、171456、171511、171512、139119、140490、139619、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の84032、77811、73252の位置に対応する位置にCを有する、MDR1遺伝子(アクセション番号:AC005068)の43263、および/またはMDR1遺伝子(アクセション番号:AC002457)の141590、175142、175180、139015、140216、140595の位置に対応する位置にGを有する、ポリヌクレオチド;
(e)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の21、103、168、400、893、999、1001、1107および/または1141の位置に対応する位置にアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド;
(f)MDR1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリペプチドが、MDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の21の位置に対応する位置でAsnからAspに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の103の位置に対応する位置でPheからLeuに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の168の位置に対応する位置でValからIleに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の400の位置に対応する位置でSerからAsnに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の893の位置に対応する位置でAlaからSerに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の999の位置に対応する位置でAlaからThrに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の1001の位置に対応する位置でAlaからThrに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の1107の位置に対応する位置でGlnからProに、または/およびMDR1ポリペプチド(アクセション番号:G2506118)の1141の位置に対応する位置でSerからThrへのアミノ酸の置換を含む、ポリヌクレオチド;
である、前記方法。 - 前記ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの欠失、付加、および/または置換により、対応する野生型対立遺伝子と比較しての変異型対立遺伝子の発現に変化をきたす、請求項28のいずれか1項に記載の使用。
- 前記の発現の変化が発現の低下または増加である、請求項29に記載の使用。
- 前記ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの欠失、付加、および/または置換により、対応する野生型対立遺伝子にコードされたポリペプチドと比較しての、変異型対立遺伝子にコードされたポリペプチドの活性に変化をきたす、請求項28から30のいずれか1項に記載の使用。
- 前記の活性の変化が活性の低下または増加である、請求項31に記載の使用。
- 前記被験者が動物である請求項28から32のいずれか1項に記載の使用。
- 前記被験者がマウスである請求項33に記載の使用。
- 前記被験者がヒトである請求項28から32のいずれか1項に記載の使用。
- 前記ヒトがアフリカ系またはアジア系である請求項35に記載の使用。
- 結腸直腸癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、悪性神経膠腫、卵巣癌、および膵臓癌の被験者に対して適切な治療を選択するための方法であって、以下の内容:
(a)該被験者から得たサンプルの被験者のゲノムについて、請求項1から5のいずれか1項で特定した変異型対立遺伝子の存在の有無を決定すること;および
(b)(a)で得られた結果に基づいて該被験者のための適切な治療を選択すること;
を含む、前記方法。
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