WO2016130041A1 - Способ создания персонализированного ген-активированного имплантата для регенерации костной ткани - Google Patents

Способ создания персонализированного ген-активированного имплантата для регенерации костной ткани Download PDF

Info

Publication number
WO2016130041A1
WO2016130041A1 PCT/RU2015/000667 RU2015000667W WO2016130041A1 WO 2016130041 A1 WO2016130041 A1 WO 2016130041A1 RU 2015000667 W RU2015000667 W RU 2015000667W WO 2016130041 A1 WO2016130041 A1 WO 2016130041A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bone
gene
activated
personalized
carrier
Prior art date
Application number
PCT/RU2015/000667
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Роман Вадимович ДЕЕВ
Артур Александрович ИСАЕВ
Илья Ядигерович БОЗО
Владимир Сергеевич КОМЛЕВ
Алексей Юрьевич ДРОБЫШЕВ
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен"
Priority to BR112016027050-9A priority Critical patent/BR112016027050B1/pt
Priority to CN201580024656.XA priority patent/CN106488771B/zh
Priority to ES15882179T priority patent/ES2714782T3/es
Priority to EP15882179.3A priority patent/EP3130342B1/en
Priority to MX2016016081A priority patent/MX2016016081A/es
Priority to JP2016560916A priority patent/JP6631924B2/ja
Priority to EA201600607A priority patent/EA033357B1/ru
Priority to CA2946389A priority patent/CA2946389A1/en
Publication of WO2016130041A1 publication Critical patent/WO2016130041A1/ru
Priority to US15/480,698 priority patent/US11406739B2/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/28—Bones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y70/00—Materials specially adapted for additive manufacturing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y80/00—Products made by additive manufacturing

Definitions

  • Bone grafting with autografts involves application
  • bone autografts are the “gold standard” of bone substitute materials, their use is limited, not always effective, and is associated with a high frequency of complications.
  • One of the key drawbacks of their use and one of the reasons for their lack of effectiveness is the inability to accurately model them in shape and size of the replaced bone defect.
  • the tight contact of any osteoplastic material over the entire surface of a bone defect or region of bone atrophy and complete immobilization are the primary canons of bone grafting [1].
  • In conditions where autologous transplantation is not feasible or has proven to be doctors who are ineffective are forced to use distraction osteogenesis, prosthetics, or completely refuse this type of treatment, which significantly worsens the quality of life of patients.
  • osteoplastic materials such as xeno- and allogeneic bone matrices of various processing options, calcium phosphate ceramics, bio-metals, organic acid polymers, as well as synthetic analogues or natural components of the bone matrix organic and mineral substances.
  • they all have only osteoconductive effect, since they do not contain biologically active components.
  • they are used only to replace bone defects of small size (volume), since they can only optimize reparative osteogenesis, but do not provide its induction [7].
  • Products of this group in the form of personalized blocks to replace extended and (or) volume bone defects in clinical practice are practically not used.
  • osteoplastic materials which can be divided into those containing growth factors (proteins), living cells, or gene constructs (nucleic acids). Osteoplastic materials with growth factors have a moderate osteoinductive effect, due to which they are able to activate reparative osteogenesis. However, growth factors are short-lived and short-distant, quickly disintegrate under conditions of inflammation in the surgical wound, and therefore the overall effectiveness of the products was insufficient to replace large-volume bone defects. In this regard, studies in which three-dimensional printing technologies were used to create osteoplastic materials of a given size and shape with growth factors are few, and in all of them the products were created in small size (about 1 cm 3 ). And even in this case, the results were far from optimal [8].
  • Examples of another, more effective approach relate to the development of personalized tissue-engineered bone grafts.
  • Using various technologies for creating carriers of a given size and shape researchers make personalized matrices, which are then combined with a living cell.
  • carriers of a given size and shape are endowed with osteogenicity and, theoretically, are able to provide a pronounced induction of reparative osteogenesis.
  • the realization by living cells, which are part of a personalized bone graft, of their therapeutic potential is limited by the need for oxygenation.
  • With small sizes of such products up to 1 cm 3 )
  • their effectiveness in comparison with the above categories of materials is shown in numerous studies. But when replacing extended (volumetric) bone defects, even with perfect modeling of the shape and size of the carrier for a renewable defect, an effective result cannot be achieved, since the cells inevitably die without adequate blood supply.
  • the closest analogue of the claimed invention are gene-activated osteoplastic materials consisting of a carrier and nucleic acids - gene constructs encoding growth factors [9].
  • Gene-activated osteoplastic material is a carrier-nucleic acid complex, the components of which are combined by various methods: due to the technology of chemical bonding [7], the use of auxiliary substances (for example, 5 gel biopolymers) [1 1], direct incorporation of nucleic acids acids in the composition of the carriers at the stage of matrix synthesis, etc.
  • Such products have an osteoinductive effect, are not limited by the need for oxygenation, since they do not contain living cells.
  • the severity of their osteoinductive effect and, as a result, the effectiveness of their use in the replacement of bone defects, according to many researchers are lower than in the case of tissue-engineered bone grafts. The reason is the low efficiency of transfection of the cells of the recipient bed with gene constructs, as well as the use of the “therapeutic power” of one-
  • Fig. 1 Scheme of a personalized gene-activated material designed to replace a defect in the roof of a rabbit skull: A - top view, B - sectional view through the center in the frontal plane.
  • Fig. 2. Manufactured personalized gene-activated material designed to replace a defect in the roof of a rabbit skull.
  • Fig. 3 Personalized gene-activated material that replaces a bone defect; 6.5 months after implantation: 1 - implant, 2 - bone regenerate. A - computed tomography, 3D reconstruction, B - histological micropreparation (staining: hematoxylin, eosin).
  • Fig. 4 Personalized material, not activated by gene constructs, replacing a bone defect; 6.5 months after implantation: 1 - implant, 2 - bone regenerate. Histological micropreparation (staining: hematoxylin, eosin).
  • Fig. 5 Scheme of a personalized gene-activated material with fixing elements, designed to replace an extended defect in the bones of the leg of the rabbit.
  • FIG. 6 A personalized gene-activated implant fixed in a bone defect using a reconstructive miniplate and miniscrews.
  • Fig. 7 Personalized gene-activated material with fixing elements that replaced the bone defect; 3 months after implantation: 1 - implant, 2 - bone regenerate. Histological micropreparation (staining: hematoxylin, eosin).
  • the essence of the product we developed and the technology for its creation is to manufacture a personalized matrix from biocompatible and bioresorbable materials and to combine it with a biologically active component - gene constructs.
  • a key aspect of the invention that distinguishes it from the closest analogue [9] is the use of three-dimensional printing technologies with the creation of a personalized product that is exact in shape and size to the recipient bed - the area of a bone defect or atrophy of bone tissue.
  • the product is made in such a way that after implantation in the area of the recipient bed, the diastasis between the introduced material and the bone walls does not exceed 1 mm throughout.
  • the achievement of personalized parameters is ensured by the use of three-dimensional printing technologies.
  • An additional component of the product can be a fixing structure (reconstructive plates, screws, mini-plates, mini-screws, knitting needles, rods, etc.), which is included in the composition of the material even at the stage of its manufacture.
  • a fixing structure reconstructive plates, screws, mini-plates, mini-screws, knitting needles, rods, etc.
  • the presence of this component is mandatory in cases when a bioresorbable material with insufficient strength characteristics making it impossible to securely fix it in the recipient bed using standard methods (metal structures, etc.) as a carrier for gene structures is used.
  • the technology for creating personalized gene-activated materials developed by us includes the following steps, the sequence of which can be changed: 1. Determination of the exact shape and size of a bone defect or area of bone atrophy. For this purpose, methods of radiation diagnostics, such as computed tomography, radiography, etc. can be used.
  • the first stage relates to the planning of morphometric parameters of the manufactured product and requires the use of the same research methods that are used in the planning of surgical intervention.
  • the most optimal option is computed tomography, which is an integral part of the diagnosis of skeletal bone pathology and provides data for planning bone reconstructive surgery.
  • the data obtained during standard computed tomography can be used to simulate the shape and size of a bone defect and, accordingly, the shape and size of a personalized gene-activated implant in specialized software (for example, 3D Slicer, NHI, USA).
  • a master file is generated for the 3D printer or any other device capable of manufacturing a three-dimensional implant with the specified parameters from the necessary bioresorbable material.
  • a master file is generated for the 3D printer or any other device capable of manufacturing a three-dimensional implant with the specified parameters from the necessary bioresorbable material.
  • calcium phosphates, hydroxyapatite, collagen, bio-metals, polymers of organic acids and others, including combinations thereof, can be the most optimal materials for the manufacture of the carrier.
  • Aggregate the state and physical properties of bioresorbable materials selected to create personalized gene-activated implants can be any, which affects only a specific version of the technology of three-dimensional printing.
  • Three-dimensional printing of the carrier matrix can be implemented in two fundamentally different ways. The first is to directly print media from the selected material. The second involves printing form-forming elements (from acceptable materials) with their subsequent use as forms for “casting” (synthesis) of the matrix of the carrier of a given shape and size.
  • a critical step in creating a personalized gene-activated material is the combination of a carrier matrix and gene constructs (for example, plasmid DNA).
  • a carrier matrix for example, plasmid DNA
  • gene constructs for example, plasmid DNA
  • the carrier is made of liquid (gel, sol, solution) or temporarily in the liquid phase material, then the gene constructs can be introduced into it before or during three-dimensional printing. If solid material is used (e.g. as
  • gene constructs can be added as part of any gel material containing them.
  • the simplest and most practicable way in most cases is to combine the manufactured personalized carrier material with the gene structures after three-dimensional printing. For this gene
  • 25 structures in various concentrations in the form of a solution or as a part of a gel can be incubated under various conditions (temperature, exposure time, mechanical stress) with a “printed” carrier matrix.
  • the gene constructs are combined with the carrier before or at the stage of its three-dimensional printing, then it is preferable to perform three-dimensional printing in in sterile conditions - clean rooms of classes A or B. If the gene structures are combined with the carrier after its manufacture, then three-dimensional printing can be performed in rooms of any class with subsequent sterilization of the resulting personalized carrier matrix and combined with the gene structures in sterile conditions.
  • the successful result we obtained is related to the fact that the gene constructs of the gene-activated material of standard shape and size after implantation in the zone of an extended (volume) bone defect do not have direct contact with the cells of the recipient bed and do not reach the target cells. Moreover, the presence of diastasis between bone walls and gene-activated material of more than 1 mm causes the destruction of a greater number of released gene structures by blood convolution and inflammatory exudate, performing this space, and their rapid elimination. At the same time, the migration of resident cells is not active enough due to the loose adherence of the product to the walls of the bone defect. As a result, taking into account the already low efficiency of transfection of cells with gene constructs, especially in the case of plasmid DNA, nucleic acids do not enter cells in an amount sufficient to provide a therapeutic effect.
  • the personalized gene-activated material has a tight fit with all surfaces of the recipient bed with a 5 “free space” of less than 1 mm. This creates the conditions, on the one hand, for faster and more massive migration of cells into the structure of the product, and on the other, to reduce the distance that gene structures travel on the way to target cells. The reduction of this distance, due to the lack of space between the gene-activated material and the walls of the bone defect, ensures the preservation of more gene structures, which is extremely important for the implementation of the therapeutic effect.
  • the carrier material is fragile, fragile.
  • fixation elements into the personalized gene-activated osteoplastic material even at the stage of carrier manufacturing.
  • This can be implemented in two ways. The first consists in introducing a special core of metal or durable bioresorbable material into the interior of the fabricated matrix, which may contain holes for fixing elements (screws, mini-screws, microscrews, pins, knitting needles, etc.). At the same time, from the side from which the fixation of the product is planned, channels are formed in the carrier being manufactured, leading to the core (or core openings, if any).
  • the second technological option consists in positioning the external locking system (for example, mini-plates with mini-screws) in a predetermined position and manufacturing a carrier of a given shape and size already on the fixing elements.
  • the activated material may contain either internal (core), or external (in particular, mini-screws or mini-plates with mini-screws) fixation elements.
  • the fixation elements should be selected.
  • a three-dimensional bone model with an area of defect, atrophy, or pathological process can initially be made, the correction of which will entail the formation of a defect.
  • This model should be delivered to the doctor planning the volume of surgical treatment.
  • the doctor reproduces the planned manipulations (resection of the bone fragment, refreshment of the walls of the bone defect, etc.) and imposes fixation elements on the model - structures made of metals or durable bioresorbable materials, which will be used to immobilize bone fragments and a personal gene-activated implant.
  • a model with fixation elements fixed to it in the correct position is used to calculate the morphometric parameters of a personalized gene-activated implant and its manufacture.
  • the bone defect should be of maximum size, while allowing reliable fixation of the block without the use of metal structures in the field of implantation. Based on these criteria We have developed an experimental model of a cranial defect in rabbit bones with a diameter of 20 mm.
  • the 3D Slicer program (NHI, USA) performed manual segmentation of the planned bone defect, the center of which was located in the projection of the sagittal suture at the same distance from the frontoparietal and parieto-occipital sutures.
  • a three-dimensional printing of an octacalcium phosphate block was performed.
  • the block had the appearance of a convex disk, 1, 3 mm thick, 20 mm in diameter and contained 17 perforations for decompression of the brain after replacement of the skull roof (Fig. 1, Fig. 2).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • a personalized gene-activated implant was manufactured (Fig. 5).
  • form-forming elements were made in which the metal-fixing products (miniplate and miniscrews) were positioned.
  • a matrix carrier of tricalcium phosphate was synthesized, which exactly corresponds to the form parameters and contains fixing elements.
  • the implant was combined with gene constructs (plasmid dna with vegf and sdf genes (encodes stromal cell growth factor)) according to the above protocol.
  • the obtained personalized gene-activated product with “built-in” fixing elements was implanted into the defect of the bones of the leg of the rabbit, exactly corresponding to the parameters of the product (Fig. 6).
  • the method we developed for creating personalized gene-activated material and its technological options allow us to manufacture medical devices that are effective for replacing bone defects, including long (bulk) ones.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к созданию остеопластических материалов, эффективных в замещении протяженных (объемных) костных дефектов. Разработанный способ изготовления таких медицинских изделий включает применение технологий трехмерной печати биорезиорбируемых матриксов-носителе и их и активации генными конструкциями. Полученные таким способом медицинские изделия могут составить эффективную альтернативу костным аутотрансплантатам.

Description

Способ создания персонализированного ген-активированного им плантата для регенерации костной ткани
Описание
Предшествующий уровень техники
5 Проблема лечения пациентов с костными дефектами или атрофией костей высоко актуальна в практике травматологии и ортопедии, хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии [1-3]. Для устранения костных дефектов малого размера существует множество вариантов остеопластических материалов, доступны методы их оптимизации ю за счет смешивания с аутокосными фрагментами; плазмой, обогащенной тромбоцитами; плазмой, обогащенной факторами роста, и т.д. [1].
Однако особую актуальность и социальную значимость имеет нерешенная проблема эффективного лечения пациентов с протяженными и (или) объемными костными дефектами (более 1 см3), которые обусловлены
15 врожденными деформациями и аномалиями развития, травмами, воспалительными заболеваниями, онкологической патологией и первыми этапами их хирургического лечения. В этих клинических ситуациях, когда в значительной степени нарушена или полностью утрачена функция кости как органа, в условиях выраженной остеогенной недостаточности
20 восстановление целостности кости с использованием коммерчески доступных остеопластических материалов невозможно. В этих случаях может быть эффективной лишь костная аутотрансплантация (свободная или на сосудистой ножке) - «золотой стандарт» костной пластики [4, 5],
Костная пластика аутотрансплантатами сопряжена с нанесением
25 дополнительной травмы, расширением или созданием нового операционного поля, значительным повышением времени выполнения операции и вероятности осложнений. Кроме того, выполнение костной аутотрансплантации с микрососудистой техникой реализуемо только высококвалифицированными кадрами в условиях хорошо оснащенных зо специализированных медицинских учреждений, обладающих необходимым оборудованием не только для выполнения таких операций, но и для контроля состоятельности сосудистых анастомозов, своевременного выполнения реваскуляризирующих вмешательств. При этом, несмотря на все сложности, затраченные силы и средства, всегда сохраняется вероятность тромбоза сосудистого анастомоза с потерей аутотрансплантата [6].
Даже в условиях абсолютных показаний для аутокостной пластики, приживления трансплантата и его полной интеграции в области реципиентного ложа, результаты лечения, в том числе долгосрочные, не всегда успешны. Это обусловлено, во-первых, высокой степенью последующей биорезорбции трансплантированного материала (до 40%). Во, вторых, во многих случаях, когда костный дефект или область атрофии костной ткани имеют сложные формы, при использовании в качестве аутотрансплантатов любого из доступных источников - малоберцовая кость, ребро, лопатка, кости черепа - не удается смоделировать трансплантат точно под форму замещаемого дефекта, т.е. таким образом, чтобы диастаз между поверхностью введенного материала и стенками костного дефекта на всем протяжении не превышал 1 мм. Это обусловливает недостаточную консолидацию трансплантированных материалов в зоне реципиентного ложа, а также возникновение послеоперационных деформаций костей или избыточную биорезорбцию аутотрансплантата.
Таким образом, несмотря на то, что костные аутотрансплантаты являются «золотым стандартом» костнозамещающих материалов, их применение ограниченно, не всегда эффективно, сопряжено с высокой частотой осложнений. Одним из ключевых недостатков их использования и одной из причин недостаточной эффективности является невозможность их точного моделирования по форме и размерам замещаемого костного дефекта. При этом плотный контакт любого остеопластического материала по всей поверхности костного дефекта или области атрофии кости и полная иммобилизация являются первостепенными канонами костной пластики [1]. В условиях, когда аутокостная трансплантация невыполнима или оказалась неэффективной врачи вынуждены использовать -дистракционный остеогенез, протезирование или вообще отказываться от такого вида лечения, что значительно ухудшает качество жизни пациентов.
В этой связи, высоко актуальны разработки новых, более эффективных остеопластических материалов, которые способны заменить или как минимум стать сопоставимой по эффективности альтернативой применению аутокостных трансплантатов, в том числе на сосудистой ножке. Согласно результатам наших исследований, данная проблема может быть решена путем создания ген-активированных пористых биосовместимых и биодеградируемых материалов, отличающихся точным соответствием по форме и размерам костным дефектам, для восполнения которых они были изготовлены с применением технологий трехмерной печати.
Уровень техники
Известны многочисленные варианты ординарных остеопластических материалов, такие как ксено- и аллогенные костные матриксы различных вариантов обработки, кальцийфосфатная керамика, биоситаллы, полимеры органических кислот, а также синтетические аналоги или натуральные компоненты органического и минерального веществ костного матрикса. Однако все они обладают лишь остеокондуктивным действием, так как не содержат биологически активных компонентов. В этой связи, применяются только для замещения костных дефектов малого размера (объема), поскольку способны лишь оптимизировать репаративный остеогенез, но не обеспечивают его индукции [7]. Изделия указанной группы в виде персонализированных блоков для замещения протяженных и (или) объемных костных дефектов в клинической практике практически не применяются.
Другую категорию представляют собой активировнные остеопластические материалы, которые могут быть разделены на содержащие факторы роста (белки), живые клетки или генные конструкции (нуклеиновые кислоты). Остеопластические материалы с факторами роста обладают умеренным остеоиндуцирующим действие, за счет которого способны активировать репаративный остеогенез. Однако факторы роста являются короткождивущими и коротко дистантными, быстро распадаются в условиях воспаления в операционной ране, в связи с чем общая эффективность изделий оказалась недостаточна для замещения костных дефектов большого объема. В этой связи, исследования, в которых использовались технологии трехмерной печати для создания остеопластических материалов заданного размера и формы с факторами роста, немногочисленны, и во всех из них изделия создавались малого размера (около 1 см3). И даже в этом случае результаты были далеки от оптимальных [8].
Примеры другого, более эффективного подхода, связаны с разработкой персонализированных тканеинженерных костных графтов. С использованием различных технологий создания носителей заданного размера и формы исследователи изготавливают персонализированные матриксы, которые затем совмещают с живыми клетка. Таким образом, носители заданных размеров и формы наделяются остеогенностью и теоретически, способны обеспечить выраженную индукуцию репаративного остеогенеза. Однако реализация живыми клетками, входящими в состав персонализированного костного графта, своего терапевтического потенциала ограничена потребностью в оксигенации. Иными словами, при малых размерах таких изделий (до 1 см3) их эффективность по сравнению с вышеуказанными категориями материалов показана в многочисленных исследованиях. Но при замещении протяженных (объемных) костных дефектов, даже при идеальном моделировании формы и размеров носителя под восполняемый дефект, эффективного результата достичь не удается, так как клетки неизбежно гибнут без адекватного кровоснабжения.
Ближайшим аналогом заявленного изобретения являются ген- активированные остеопластические материалы, состоящие из носителя и нуклеиновых кислот - генных конструкций, кодирующих факторы роста [9]. Ген-активированный остеопластический материал представляет собой комплекс «носитель - нуклеиновая кислота», компоненты которого объединены различными методами: за счет технологий «химического связывания» [7], использования вспомогательных веществ (например, 5 гелевых биополимеров) [1 1], непосредственного включения нуклеиновых кислот в состав носителей на этапе синтеза матрикса и т.д.
Такие изделия обладаю остеоиндуктивным действием, не ограничены потребностью в оксигенации, поскольку не содержат живых клеток. Однако выраженность их остеоиндуктивного действия и, как результат, ю эффективность использования в замещении костных дефектов, по мнению многих исследователей, ниже, чем в случае тканеинженерных костных графтов. Причиной является низкая эффективность трансфекции клеток реципиентного ложа генными конструкциями, а также использование для индукции восстановительного процесса «терапевтической силы» одного-
15 двух факторов, кодируемых генными конструкциями, тогда как клетки тканеинженерных материалов обладают более широким механизмом действия.
В связи с неэффективностью указанных технологических подходов многие исследовательские группы пошли по пути усложнения изделий,
20 создавая остеопластические материалы, содержащие комплексные, сложные носители, комбинации биологически активных компонентов: генные конструкции и клетки, клетки и факторы роста, факторы роста и генные конструкции, и даже факторы роста, генные конструкции и клетки в едином изделии. Однако создание таких материалов отличается чрезмерной
25 стоимостью, а их эффективность в замещении протяженных костных дефектов остается недостаточной.
Перечень иллюстраций:
Рис. 1. Схема персонализированного ген-активированного материала, предназначенного для замещения дефекта крыши черепа кролика: А - вид зо сверху, Б - вид на разрезе через центр во фронтальной плоскости. Рис. 2. Изготовленный персонализированный ген-активированный материала, предназначенный для замещения дефекта крыши черепа кролика.
Рис. 3. Персонализированный ген-активированный материал, заместивший костный дефект; 6,5 мес. после имплантации: 1 - имплантат, 2 - костный регенерат. А - компьютерная томография, ЗО-реконструкция, Б - гистологический микропрепарат (окраска: гематоксилин, эозин).
Рис. 4. Персонализированный материал, не активированный генными конструкциями, заместивший костный дефект; 6,5 мес. после имплантации: 1 - имплантат, 2 - костный регенерат. Гистологический микропрепарат (окраска: гематоксилин, эозин).
Рис. 5. Схема персонализированного ген-активированного материала с фиксирующими элементами, предназначенного для замещения протяженного дефекта костей голени кролика.
Рис. 6. Персонализированный ген-активированный имплантат, фиксированный в костном дефекте с помощью реконструктивной минипластины и минивинтов.
Рис. 7. Персонализированный ген-активированный материал с фиксирующими элементами, заместивший костный дефект; 3 мес. после имплантации: 1 - имплантат, 2 - костный регенерат. Гистологический микропрепарат (окраска: гематоксилин, эозин).
Подробное описание изобретения
Учитывая опыт других исследователей и известный уровень техники, логично было предположить, что материалы, как ординарные, так и активированные, содержащие либо факторы роста, либо клетки, либо генные конструкции, не могут быть эффективны для пластики протяженных (объемных) костных дефектов в виду вышеуказанных особенностей механизма действия изделий и недостаточной эффективности при замещении дефектов малого или среднего размера. Однако наша исследовательская группа, вопреки распространенному мнению и трендам в разработках (связанным с усложнением остеопластических материалов и многокомпонентностью), пошла по иному пути - по пути совмещения хирургических и биомедицинских разработок с целью получения оптимального результата.
Суть разработанного нами изделия и технологии его создания состоит в изготовлении персонализированного матрикса из биосовместимых и биорезорбируемых материалов и совмещению его с биологически активным компонентом - генными конструкциями. Ключевым аспектом изобретения, отличающим его от ближайшего аналога [9] является применение технологий трехмерной печати с созданием персонализированного изделия, точное соответствующего по форме и размерам реципиентному ложу - области костного дефекта или атрофии костной ткани. Иными словами, изделие изготовлено таким образом, чтобы после имплантации в область реципиентного ложа диастаз между введенным материалом и костными стенками не превышал 1 мм на всем протяжении. Достижение персонализированных параметров обеспечивается применением технологий трехмерной печати. Дополнительным компонентом изделия может является фиксирующая конструкция (реконструктивные пластины, винты, минипластины, минивинты, спицы, стержни и пр.), которая включается в состав материала еще на этапе его изготовления. Наличие данного компонента является обязательным в случаях, когда в качестве носителя для генных конструкций выбран биорезорбируемый материал с недостаточными прочностными характеристиками, делающими невозможной надежную фиксацию его в реципиентном ложе стандартными методами (металлоконструкциями и пр.).
Технология создания персонализированных ген-активированных материалов, разработанная нами, включает следующие этапы, последовательность которых может быть изменена: 1. Определение точной формы и размеров костного дефекта или области атрофии кости. С этой целью могут использоваться методы лучевой диагностики, такие как компьютерная томография, рентгенография и др.
2. Изготовление персонализированного носителя - заданных формы и размеров - из биорезорбируемых материалов с использованием любых методов трехмерной печати, включая стереолитографию, фотополимеризацию и др.
3. Совмещение носителя с генными конструкциями на этапе изготовления персонализированного носителя, либо после его изготовления.
Первый этап относится к планированию морфометрических параметров изготавливаемого изделия и требует применения тех же методов исследования, которые используются в ходе планирования оперативного вмешательства. Наиболее оптимальный вариант - компьютерная томография, которая является неотъемлемой частью диагностики патологии костей скелета и предоставляет данные для планирования костных реконструктивно-восстановительных операций. Полученные в ходе выполнения стандартной компьютерной томографии данные могут быть использованы для моделирования формы и размеров костного дефекта и, соответственно, формы и размеров персонализированного ген- активированного имплантата - в специализированном программном обеспечении (например, «3D Slicer», NHI, США).
На основе полученных морфометрических данных формируется мастер-файл для ЗО-принтера или любого другого аппарата, способного изготовить трехмерный имплантат с заданными параметрами из необходимого биорезорбируемого материала. Учитывая специфику морфофункциональной организации и регенерации костной ткани, наиболее оптимальными материалами для изготовления носителя могут служить фосфаты кальция, гидроксиапатит, коллаген, биоситаллы, полимеры органических кислот и другие, в том числе их комбинации. Агрегатное состояние и физические свойства биорезорбируемых материалов, выбранных для создания персонализированных ген-активированных имплантатов, могут быть любыми, что влияет только на конкретный вариант технологии трехмерной печати.
5 Трехмерная печать матрикса-носителя может быть реализована двумя принципиально различными способами. Первый состоит в непосредственной печати носителя из выбранного материала. Второй предполагает печать формообразующих элементов (из приемлемых материалов) с последующим их использованием в качестве форм для «отливки» (синтеза) матрикса- ю носителя заданных формы и размеров.
Критически значимым этапом создания персонализированного ген- активированного материала является совмещение матрикса-носителя и генных конструкций (например, плазмидной ДНК). Эта часть технологии также может быть реализована несколькими способами, отчасти
15 определяющимися природой биорезорбируемого материала, выбранного для создания матрикса-носителя. Если носитель изготавливается из жидкого (гель, золь, раствор) или временно находящегося в жидкой фазе материала, то генные конструкции могут быть внесены в него перед или во время трехмерной печати. Если используется твердый материал (например, в виде
20 гранул), то перед или во время его трехмерной печати генные конструкции могут быть добавлены в составе содержащего их любого гелевого материала. Наиболее простым и реализуемым в большинстве случаев способом является совмещение изготовленного персонализированного материкса-носителя с генными конструкциями уже после трехмерной печати. Для этого генные
25 конструкции в различных концентрациях в виде раствора или в составе геля могут быть инкубированы при различных условиях (температура, время экспозиции, механическое воздействие) с «напечатанным» матриксом- носителем.
Если генные конструкции совмещаются с носителем перед или на этапе зо его трехмерной печати, то предпочтительно выполнение трехмерной печати в стерильных условиях - чистых помещениях классов А или Б. Если же генные конструкции совмещаются с носителем после его изготовления, то трехмерная печать может быть выполнена в помещениях любого класса с последующими стерилизацией полученного персонализированного матрикса-носителя и совмещением с генными конструкциями в стерильных условиях.
Неожиданным стал тот факт, что, согласно результатам проведенных нами исследований, частично описанных в примерах, именно персонализированный ген-активированный материал, созданный с применением технологии трехмерной печати, позволяет достичь оптимальных результатов даже в случае замещения протяженных (объемных) костных дефектов. Иными словами, именно конгруэнтность и плотное прилежание ген-активированного материала ко всем поверхностям реципиентного ложа обеспечивает его эффективность. При этом аналогичный материал без генных конструкций неэффективен, а неперсонализированный ген-активированный имплантат - изделие унифицированных размеров и формы - недостаточно эффективен.
Вероятно, полученный нами успешный результат связан с тем фактом, что генные конструкции ген-активированного материала стандартных формы и размеров после имплантации в зону протяженного (объемного) костного дефекта не имеют непосредственного контакта с клетками реципиентного ложа, не достигают клеток-мишеней. Более того, наличие диастаза между костными стенками и ген-активированным материалом более 1 мм обусловливает разрушение большего количества высвобождающихся генных конструкций кровяным свертком и воспалительным экссудатом, выполняющими это пространство, и их быструю элиминацию. При этом миграция резидентных клеток недостаточно активна в виду неплотного прилежания изделия к стенкам костного дефекта. В итоге, усчитывая и без того низкую эффективность трансфекции клеток генными конструкциями, особенно в случае плазмидной ДНК, нуклеиновые кислоты не поступают в клетки в количестве, достаточном для обеспечения терапевтического эффекта.
Напротив персонализированный ген-активированный материал имеет плотное сопряжение со всеми поверхностям реципиентного ложа с 5 величиной «свободного пространства» менее 1 мм. Это создает условия, с одной стороны, для более быстрой и массовой миграции клеток в структуру изделия, а с другой, для сокращения дистанции, которую преодолевают генные конструкции на пути к клеткам-мишеням. Сокращение этой дистанции, в виду отсутствия пространства между ген-активированным ю материалом и стенками костного дефекта, обеспечивает сохранение большего количества генных конструкций, что крайне значимо для реализации терапевтического эффекта.
Таким образом, критическая значимость полного соответствия формы и размеров изделия параметрам реципиентного ложа именно в случае ген-
15 активированного материала имеет определяющее значение для реализации терапевтического эффекта изделия. Установление данного факта стало своего рода открытием, которое позволило нам разработать остеопластические материалы, эффективные для замещения протяженных и объемных (от 1 см3) костных дефектов. Однако детальные механизмы
20 выявленной эффективности именно персонализированных ген- активированных материалов требуют дальнейших исследований и детализации.
Отчасти, решив проблему восполнения протяженных и объемных костных дефектов в аспекте биомедицинских методов, мы столкнулись с
25 другой проблемой - хирургической. Суть ее состоит в том, что для реализации своего остеоиндуктивного действия ген-активированный материал должен не только плотно прилежать ко всем поверхностям реципиентного ложа непосредственно после имплантации, но и сохранять такое положения все время до полной интеграции с окружающей костной зо тканью. Иными словами, персонализированный остеопластический материал должен быть прочно фиксирован в зоне реципиентного ложа, иначе неизбежны его смещения, с появлением пространств между изделием и поверхностью реципиентного ложа, столь критичных для реализации биологического действия, подвижностью и даже выпадением. Данная проблема легко решаема в случаях, когда носитель состоит из механически прочного материала, в который могут быть вкручены или вставлены элементы фиксации (винты, минивинты, микровинты, пины, винты) непосредственно в момент операции без деструкции изделия. Однако, зачастую, в том числе в ряде наших исследований, материал носителя является хрупким, непрочным. Такими являются, в частности, пористые матриксы из фосфатов кальция. Фиксация таких материалов непосредственно в ходе операции крайне затруднительна или просто невозможна - при введении фиксирующих элементов изделие неизбежно ломается.
В этой связи, нами были разработаны дополнительные этапы технологии и варианты персонализированных ген-активированных материалов, носители которых не обладают прочными механическими свойствами. Суть решения состоит в том, чтобы в персонализированный ген- активированный остеопластический материал еще на этапе изготовления носителя внедрить элементы фиксации. Это может быть реализовано двумя вариантами. Первый состоит во введении во внутреннюю часть изготавливаемого матрикса специального сердечника из металла или прочного биорезорбируемого материала, который может содержать отверстия под фиксирующие элементы (винты, минивинты, микровинты, пины, спицы и т.п.). При этом со стороны, с которой планируется выполнение фиксации изделия, формируются каналы в изготавливаемом носителе, ведущие к сердечнику (или отверстиям сердечника в случае их наличия). Второй технологический вариант состоит в позиционировании внешней фиксирующей системы (например, минипластины с минивинтами) в заданном положении и изготовлении носителя заданных формы и размеров уже на фиксирующих элементах. В результате, персонализированный ген- активированный материал может содержать либо внутренние (сердечник), либо внешние (в частности, минивинты или минипластина с минивинтами) элементы фиксации.
Важно, что уже в ходе первого этапа создания персонализированного ген-активированного имплантата с учетом планирующегося врачом объема оперативного вмешательства на костях скелета, должны быть выбраны элементы фиксации. Для этого изначально может быть изготовлена трехмерная модель кости с областью дефекта, атрофии или патологического процесса, коррекция которого повлечет за собой формирование дефекта. Данная модель должна быть доставлена врачу, планирующему объем оперативного лечения. Врач воспроизводит планирующиеся манипуляции (резекция фрагмента кости, освежение стенок костного дефекта и т.д.) и накладывает на модель элементы фиксации - конструкции из металлов или прочных биорезорбируемых материалов, которыми будет выполнена иммобилизация костных фрагментов и персонализированного ген- активированного имплантата. Модель с закрепленными на ней в правильном положении элементами фиксации используется для расчетов морфометрических параметров персонализированного ген-активированного имплантата и его изготовления.
Примеры
1. Персонализированный ген-активированный материал без
«встроенных» фиксирующих элементов.
Прежде, чем переходить к созданию одного из вариантов персонализированного ген-активированного материала без элементов фиксации по разработанному нами способу, было необходимо определиться с адекватной биологической моделью костного дефекта критических размеров. В выборе модели для нашего исследования мы руководствовались следующими критериями: костный дефект должен быть максимальных размеров, при этом позволять надежно фиксировать блок без использования металлоконструкций в области имплантации. С учетом указанных критериев нами была разработана экспериментальная модель краниального дефекта костей кролика диаметром 20 мм. Бором выполнялась остеотомия крыши черепа с формированием костного дефекта диаметром 20 мм без повреждения твердой мозговой оболочки и сохранением в проекциях 1 , 5, 7 и 1 1 часов фрагментов внутренней кортикальной пластинки шириной по 1 мм, выступающих к центру дефекта на 1 мм. Сохранение этих костных фрагментов в указанных позициях в качестве опорных пунктов в сочетании с размерами костного дефекта стало отличительной особенностью модели. Такая модель позволяла оптимально иммобилизировать персонализированный ген-активированный имплантат в пределах костного дефекта без использования дополнительных методов фиксации.
До выполнения операции была выполнена мультиспиральная компьютерная томография черепа кролика. В программе «3D Slicer», (NHI, США) выполнялась ручная сегментация планирующегося костного дефекта, центр которого располагался в проекции сагиттального шва на одинаковом расстоянии от лобно-теменного и теменно-затылочного швов. С учетом рассчитанных морфометрических параметров спланированного костного дефекта, была выполнена трехмерная печать блока из октакальциевого фосфата. Блок имел вид выпуклого диска, толщиной 1 ,3 мм, диаметром 20 мм и содержал 17 перфораций для декомпрессии головного мозга после замещения крыши черепа (рис. 1 , рис. 2).
Совмещение полученного в ходе трехмерной печати матрикса- носителя с генной конструкцией (плазмидная ДНК с геном, кодирующим сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF)) было выполнено по разработанному ранее лабораторному протоколу, основанном на химическом связывании нуклеиновых кислот с ионами кальция носителя:
1) отмывка матрикса-носителя (инкубирование в 0,5 М фосфатного буфера в объеме 5 мл при температуре 37°С при постоянном встряхивании в течение 12 ч.); 2) уравновешивание (обработка 10 мМ фосфатного буфера в объеме 1 мл при температуре 37°С при постоянном встряхивании, 3 раза по 10 мин.);
3) высушивание матрикса-носителя (инкубирование при температуре 37°С до полного высыхания - 3 ч.).
4) нанесение генных конструкций (инкубирование с раствором плазмидной ДНК в ЮмМ фосфатном буфере в концентрации 1 мкг/мкл при температуре 37°С и постоянном встряхивании в течение 12 ч.).
5) отмывка изделия от несвязавщейся плазмидной ДНК (обработка 5 мМ раствором фосфата в объеме 5 мл 3 раза);
6) высушивание (инкубирование при температуре 37°С до полного высыхания - 3 ч.).
Через 6,5 мес. после имплантации персонализированного ген- активированного изделия целостность крыши черепа кролика была полностью восстановлена. Имплантат не резорбировался, однако периферические его участки были полностью интегрированы с окружающей костной тканью. Более того, костный регенерат протяженностью 3-6 мм формировался по внутренней и наружной поверхностям персонализированного ген-активированного изделия. Как по данным компьютерной томографии, так и гистологического исследования новообразованная костная ткань плотно прилежала к имплантату, между ними не формировалась соединительно-тканная прослойка или капсула (рис. 3).
В отсутствии ген-активированных конструкций объем новообразованной костной ткани был значительно меньшим, костный регенерат, исходящий с периферии не превышал 1-2 мм (рис. 4).
2. Персонализированный ген-активированный материал со
«встроенными» фиксирующими элементами.
Для исследования указанного варианта персонализированного ген- активированного материала нами была разработана другая модель: дефект костей голени кролика, длиной 36 мм со ступенчатыми краями проксимального и дистального костных фрагментов.
С применение разработанного способа был изготовлен персонализированный ген-активированный имплантат (рис. 5).
На первом этапе с помощью трехмерной печати были изготовлены формообразующие элементы, в которых позиционированы фиксирующие изделие металлоконструкции (минипластина и минивинты). С использованием полученной формы синтезирован матрикс-носитель из трикальция фосфата, точно соответствующий параметрам формы и содержащий фиксирующие элементы. Выполнено совмещение имплантата с генными конструкциями (плазмидная днк с генами vegf и sdf (кодирует фактор роста стромальных клеток)) по вышеуказанному протоколу. Полученное персонализированное ген-активированное изделие со «встроенными» фиксирующими элементами имплантировано в дефект костей голени кролика, точно соответствующий параметрам изделия (рис. 6).
Через 3 мес. опороспособность конечности была полностью восстановлена. Имплантат не резорбировался к данному сроку, однако его периферические участки прочно интегрировались с костным регенератом (рис. 7).
Таким образом, разработанный нами способ создания персонализированного ген-активированного материала и его технологические варианты позволяют изготовить медицинские изделия, эффективные для замещения костных дефектов, в том числе протяженных (объемных).
Список ссылочной литературы:
1. Кулаков Л. А., Робустова Т.Г., Неробеев Л.И., редакторы.
Хирургическая стоматология и челюстно-лицевая хирургия. Национальное руководство. Москва: «ГЭОТАР-Медиа», 2010; 928 с.
2. Pipitone PS, Rehman S. Management of traumatic bone loss in the lower extremity. Orthop Clin North Am. 2014 Oct;45(4):469-82. Tevlin R, McArdle A, Atashroo D, Walmsley GG, Senarath-Yapa K, Zielins ER, Paik KJ, Longaker MT, Wan DC. Biomaterials for craniofacial bone engineering. J Dent Res. 2014 Dec;93(l 2): 1 187-95
Al-Nawas B, Schiegnitz E. Augmentation procedures using bone substitute materials or autogenous bone - a systematic review and meta-analysis. Eur J
Oral Implantol. 2014 Summer; 7 Suppl 2:S219-34.
Nkenke E, Neukam FW. Autogenous bone harvesting and grafting in advanced jaw resorption: morbidity, resorption and implant survival. Eur J Oral Implantol. 2014 Summer;7 Suppl 2:S203-17.
Han Z, Li J, Li H, Su M, Qin L. Single versus dual venous anastomoses of the free fibula osteocutaneous flap in mandibular reconstruction: A retrospective study. Microsurgery. 2013 Sep 3. doi: 10.1002/micr.22176. [Epub ahead of print].
Деев P.B., Дробышев А.Ю., Бозо И.Я. и др. Создание и оценка биологического действия ген-активированного остеопластического материала, несущего ген VEGF человека. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2013; VIII (3): 78-85.
Strobel LA, Rath SN, Maier AK et al. Induction of bone formation in biphasic calcium phosphate scaffolds by bone morphogenetic protein-2 andprimaryosteoblasts.J Tissue Eng Regen Med. 2014 Mar;8(3): 176-85. Гоулдстейн C.A. Способы переноса генов in vivo для заживления ран. Патент JN*°2170104 ОТ 10.07.2001
Wegman F., Bijenhof A., Schuijff L. et al. Osteogenic differentiation as a result of BMP-2 plasmid DNA based gene therapy in vitro and in vivo. Eur. Cell Mater. 201 1; 21 : 230-42.

Claims

Формула изобретения
1. Способ получения персонализированного ген-активированного имплантата для замещения костных дефектов у млекопитающего, включающий проведение компьютерной томографии области костной пластики, моделирование на основании данных компьютерной томографии костного дефекта, трехмерную печать формы для изготовления биосовместимого носителя или самого биосовместимого носителя, отличающийся тем, что биосовместимый носитель активируют нуклеиновыми кислотами и получают персонализированный ген- активированный имплантат.
2. Способ по п.1 , отличающийся тем, что при изготовлении биосовместимого носителя в его состав включают элементы для последующей фиксации изделия в зоне имплантации: пластины, минипластины, винты, минивинты, пины, спицы, стержни и их аналоги из металлов и биорезорбируемых материалов.
3. Персонализированный ген-активированный имплантат, для замещения костных дефектов у млекопитающего, изготовленный способом по п.1.
4. Способ лечения костных дефектов или атрофии костной ткани млекопитающего, предусматривающий имплантацию в костную ткань персонализированного ген-активированного имплантата по п.З.
PCT/RU2015/000667 2015-02-10 2015-10-13 Способ создания персонализированного ген-активированного имплантата для регенерации костной ткани WO2016130041A1 (ru)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BR112016027050-9A BR112016027050B1 (pt) 2015-02-10 2015-10-13 implante ativado por gene personalizado, seu método de construção e uso de ácidos nucleicos
CN201580024656.XA CN106488771B (zh) 2015-02-10 2015-10-13 用于再生骨组织的个性化基因活化植入物的生成方法
ES15882179T ES2714782T3 (es) 2015-02-10 2015-10-13 Procedimiento para crear un implante personalizado que se activa por genes para regenerar tejido óseo
EP15882179.3A EP3130342B1 (en) 2015-02-10 2015-10-13 Method for creating a personalized gene-activated implant for regenerating bone tissue
MX2016016081A MX2016016081A (es) 2015-02-10 2015-10-13 Metodo para construir un implante activado por gen personalizado para la reparacion del tejido de hueso.
JP2016560916A JP6631924B2 (ja) 2015-02-10 2015-10-13 骨組織修復のための個別適合型遺伝子活性化インプラントの構築法
EA201600607A EA033357B1 (ru) 2015-02-10 2015-10-13 Способ создания персонализированного ген-активированного имплантата для регенерации костной ткани
CA2946389A CA2946389A1 (en) 2015-02-10 2015-10-13 Method for constructing a personalized gene-activated implant for bone tissue repair
US15/480,698 US11406739B2 (en) 2015-02-10 2017-04-06 Method for creating a personalized gene-activated implant for regenerating bone tissue

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015104291/15A RU2597786C2 (ru) 2015-02-10 2015-02-10 Способ создания персонализированного ген-активированного имплантата для регенерации костной ткани
RU2015104291 2015-02-10

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US15/480,698 Continuation US11406739B2 (en) 2015-02-10 2017-04-06 Method for creating a personalized gene-activated implant for regenerating bone tissue

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016130041A1 true WO2016130041A1 (ru) 2016-08-18

Family

ID=56614923

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2015/000667 WO2016130041A1 (ru) 2015-02-10 2015-10-13 Способ создания персонализированного ген-активированного имплантата для регенерации костной ткани

Country Status (11)

Country Link
US (1) US11406739B2 (ru)
EP (1) EP3130342B1 (ru)
JP (1) JP6631924B2 (ru)
CN (1) CN106488771B (ru)
BR (1) BR112016027050B1 (ru)
CA (1) CA2946389A1 (ru)
EA (1) EA033357B1 (ru)
ES (1) ES2714782T3 (ru)
MX (1) MX2016016081A (ru)
RU (1) RU2597786C2 (ru)
WO (1) WO2016130041A1 (ru)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018230675A1 (ja) * 2017-06-16 2018-12-20 国立大学法人九州大学 第八リン酸カルシウム成形体の製造方法
RU2688699C1 (ru) * 2018-01-22 2019-05-22 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СтГМУ Минздрава России) Способ планирования операции синус-лифтинг
RU2683852C1 (ru) * 2018-01-22 2019-04-02 Общество с ограниченной ответственностью "Северо-Кавказское медицинское малое инновационное предприятие" Способ расчета объема костнозамещающего материала при планировании операции направленной регенерации костной ткани
RU2696204C1 (ru) * 2018-04-26 2019-07-31 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СтГМУ Минздрава России) Способ расчёта площади барьерных и каркасных мембран при планировании направленной регенерации костной ткани
RU2726398C2 (ru) * 2018-08-08 2020-07-13 Федеральное государственное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр "Кристаллография и фотоника" Российской академии наук" (ФНИЦ "Кристаллография и фотоника" РАН) Способ изготовления имплантата позвонка анатомической формы из костного материала, совместимого с иммунной системой больного
US11090412B2 (en) 2018-12-21 2021-08-17 Zavation Medical Products Llc Bone repair composition and kit
RU2766978C1 (ru) * 2021-01-13 2022-03-16 Общество с ограниченной ответственностью "Медлайн Компани" Многокомпонентный остеогенный трансплантат для хирургического устранения врождённых и приобретённых дефектов кости челюстей
RU2764373C1 (ru) * 2021-03-29 2022-01-17 Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования "Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА) Способ применения ген-активированного материала при несращениях длинных костей
CN116271222B (zh) * 2023-03-28 2023-12-01 广东医科大学 一种骨组织工程支架及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140011162A1 (en) * 2012-07-06 2014-01-09 Peter John Zegarelli Oral appliance for delivery of medicaments and\or other substances

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5962427A (en) 1994-02-18 1999-10-05 The Regent Of The University Of Michigan In vivo gene transfer methods for wound healing
US8882847B2 (en) * 2001-05-25 2014-11-11 Conformis, Inc. Patient selectable knee joint arthroplasty devices
US7427602B1 (en) * 1998-05-13 2008-09-23 The Regents Of The University Of Michigan Sustained DNA delivery from structural matrices
CA2345982A1 (en) * 1998-10-12 2000-04-20 Jill K. Sherwood Composites for tissue regeneration and methods of manufacture thereof
US6294187B1 (en) * 1999-02-23 2001-09-25 Osteotech, Inc. Load-bearing osteoimplant, method for its manufacture and method of repairing bone using same
AU2008262331B2 (en) * 2007-06-07 2013-10-17 Wake Forest University Health Sciences Inkjet gene printing
US8979534B2 (en) * 2009-06-17 2015-03-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tooth scaffolds
RU2519326C2 (ru) * 2011-12-29 2014-06-10 Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения
US9925299B2 (en) * 2012-10-26 2018-03-27 Tufts University Silk-based fabrication techniques to prepare high strength calcium phosphate ceramic scaffolds
WO2015002707A1 (en) * 2013-05-28 2015-01-08 The Johns Hopkins University Bone regeneration using stromal vascular fraction. platelet-derived growth factor-rich hydrogel, three dimensional printed poly-epsilon-caprolactone scaffolds

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140011162A1 (en) * 2012-07-06 2014-01-09 Peter John Zegarelli Oral appliance for delivery of medicaments and\or other substances

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOZO I.IA. ET AL.: "Lokalnaia gennaia terapiia v kostnoi rekonstruktsii.", MATERIALY 1-GO NATSIONALNOGO KONGRESSA PO REGENERATIVNOI MEDITSINE., 4 December 2013 (2013-12-04), pages 30, XP008182774, Retrieved from the Internet <URL:http://www.mediexpo.ru/fileadmin/user_upload/content/pdf/thesis/the sis_nkrm13.pdf> *
BRONSHTEIN D.A. ET AL.: "Klinicheskie parametry osteo- i miagkotkannoi integratsii dentalnykh implantatov pri raznykh sposobakh fiksatsii pokryvnogo proteza.", MATERIALY 1-GO NATSIONALNOGO KONGRESSA PO REGENERATIVNOI MEDITSINE., 4 December 2013 (2013-12-04), pages 37, XP008182775, Retrieved from the Internet <URL:http://www.mediexpo.ru/fileadmin/user_upload/content/ pdf/thesis/thesis_nkrm13.pdf> *
See also references of EP3130342A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2946389A1 (en) 2016-08-18
EP3130342A4 (en) 2017-04-12
CN106488771B (zh) 2019-12-17
CN106488771A (zh) 2017-03-08
JP2018505701A (ja) 2018-03-01
US20170209626A1 (en) 2017-07-27
MX2016016081A (es) 2017-03-10
EP3130342B1 (en) 2018-12-12
RU2597786C2 (ru) 2016-09-20
JP6631924B2 (ja) 2020-01-15
EA033357B1 (ru) 2019-10-31
ES2714782T3 (es) 2019-05-30
EP3130342A1 (en) 2017-02-15
BR112016027050B1 (pt) 2021-01-19
RU2015104291A (ru) 2016-08-27
BR112016027050A2 (pt) 2019-11-12
US11406739B2 (en) 2022-08-09
EA201600607A1 (ru) 2016-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2597786C2 (ru) Способ создания персонализированного ген-активированного имплантата для регенерации костной ткани
Bouler et al. Biphasic calcium phosphate ceramics for bone reconstruction: A review of biological response
Henkel et al. Bone regeneration based on tissue engineering conceptions—a 21st century perspective
Komlev et al. 3D printing of octacalcium phosphate bone substitutes
Bajada et al. Successful treatment of refractory tibial nonunion using calcium sulphate and bone marrow stromal cell implantation
JP5792633B2 (ja) モネタイトと他の生物活性カルシウムの複合物及びシリコン化合物に基づく骨再生材料
Henkel et al. Scaffold-guided bone regeneration in large volume tibial segmental defects
Paré et al. Tailored three-dimensionally printed triply periodic calcium phosphate implants: a preclinical study for craniofacial bone repair
Leng et al. Material-based therapy for bone nonunion
Bongio et al. Preclinical evaluation of injectable bone substitute materials
Shibahara et al. Honeycomb scaffold-guided bone reconstruction of critical-sized defects in rabbit ulnar shafts
Rath et al. Hyaluronan-based heparin-incorporated hydrogels for generation of axially vascularized bioartificial bone tissues: in vitro and in vivo evaluation in a PLDLLA–TCP–PCL-composite system
Bozo et al. 3D printed gene-activated octacalcium phosphate implants for large bone defects engineering
You et al. Fabrication and osteogenesis of a porous nanohydroxyapatite/polyamide scaffold with an anisotropic architecture
Salam et al. Paediatric cranioplasty: a review
Choi et al. Development and evaluation of tetrapod-shaped granular artificial bones
Zheng et al. Biphasic mineralized collagen-based composite scaffold for cranial bone regeneration in developing sheep
Jin et al. Whitlockite promotes bone healing in rabbit ilium defect model
Kudoh et al. Reconstruction of rabbit mandibular bone defects using carbonate apatite honeycomb blocks with an interconnected porous structure
Matheus et al. The state of 3D Printing of bioengineered customized maxillofacial bone scaffolds: a narrative review
Kharkova et al. Three-dimensional TCP scaffolds enriched with Erythropoietin for stimulation of vascularization and bone formation.
Guastaldi et al. Maxillofacial reconstruction: From Autogenous bone grafts to bone tissue engineering
Henkel Bone tissue engineering in two preclinical ovine animal models
Müller et al. Clinical application of three-dimensional printing and tissue engineering for maxillofacial reconstruction. A Review of Reported Cases
Gupta et al. Usage of additive manufacturing in customised bone tissue-engineering scaffold

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201600607

Country of ref document: EA

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015882179

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015882179

Country of ref document: EP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15882179

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016560916

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2946389

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2016/016081

Country of ref document: MX

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112016027050

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112016027050

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20161118