WO2016104486A1 - Ｔ細胞集団の改変方法 - Google Patents

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治夫 杉山
文博 藤木
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a method for regulating the differentiation of immune cells, particularly T cells, and modifying the T cell population.
  • Immunotherapy generally refers to a method of treating a disease by activating a patient's immune system by various methods or introducing immune cells activated outside the patient's body into the patient's body.
  • various methods such as immune cell therapy, peptide vaccine therapy, cytokine therapy, and antibody therapy have been developed so far.
  • Patent Documents 1 to 4 and Non-Patent Document 1 In recent years, by stimulating immune cells (particularly antigen-presenting cells and T cells) with a partial peptide derived from the oncogene product WT1 (WT1 peptide), induction of tumor-specific cytotoxic T cells (CTL) and helper T It has been found that cell activation can be achieved (Patent Documents 1 to 4 and Non-Patent Document 1), and research toward practical use as a cancer immunotherapy with a WT1 peptide vaccine is underway.
  • WT1 peptide oncogene product WT1
  • CTL tumor-specific cytotoxic T cells
  • helper T It has been found that cell activation can be achieved (Patent Documents 1 to 4 and Non-Patent Document 1), and research toward practical use as a cancer immunotherapy with a WT1 peptide vaccine is underway.
  • immunotherapy may not be sufficiently effective, and development of a method for enhancing the effect of immunotherapy is desired.
  • An object of the present invention is to provide a substance and a method capable of modifying the immunity state in a subject and enhancing the effect of immunotherapy.
  • the present inventors have found that by modulating the retinoid metabolic pathway or retinoic acid signaling system, the proportion of memory T cells in the T cell population can be increased and the immune response in the subject can be enhanced, and the present invention has been completed. I let you.
  • the present invention (1) A method for increasing the proportion of memory T cells in a T cell population, comprising the step of adding a regulator of a retinoid metabolic pathway and / or a regulator of a retinoic acid signaling system to the T cell population (hereinafter referred to as “the present invention”).
  • method for increasing the proportion of memory T cells (2) The method according to (1), wherein the modulator is an inhibitor of a retinoid metabolic pathway and / or an inhibitor of a retinoic acid signaling system; (3) The inhibitor is retinol to retinal conversion, retinal to retinoic acid conversion, ⁇ -carotene to retinal conversion, ⁇ -carotene to ⁇ -apocarotenal, or ⁇ -apocarotenal to retinal and retinoin
  • the method according to (2) which inhibits conversion to an acid;
  • the inhibitor suppresses the expression of a gene encoding an enzyme selected from the group consisting of retinol dehydrogenase, retinal oxidase, retinal dehydrogenase, ⁇ -carotene-15,15′-monooxygenase 1 and ⁇ -carotene oxygenase 2.
  • RNA molecule is a nucleic acid molecule that generates the RNA molecule, a vector containing the nucleic acid molecule, a compound that inhibits the action of the enzyme, or a dominant negative mutant protein of the enzyme.
  • the inhibitor is an RNA molecule that suppresses the expression of a gene encoding retinol dehydrogenase, and the RNA molecule is selected from the group consisting of siRNA, shRNA, miRNA, stRNA, and antisense RNA.
  • T cell population creation method of the present invention T cell population creation method of the present invention
  • T cell population prepared by the method of (13) hereinafter also referred to as “T cell population of the present invention”
  • a kit for the prevention and / or treatment of cancer or infectious disease comprising a regulator of an acid signal transduction system (hereinafter also referred to as “the kit for preventing / treating cancer / infection of the present invention”);
  • a regulator of a retinoid metabolic pathway and / or a regulator of a retinoic acid signaling system for increasing the proportion of memory T cells in a T cell population;
  • the infectious disease of the present invention A method for preventing and / or treating an infectious disease (hereinafter referred to as “the infectious disease of the present invention”, comprising administering an effective amount of a retinoid metabolic pathway modulator and / or a retinoic acid signaling system modulator to a subject. Also referred to as “prophylaxis / treatment method”); (22) A method for enhancing immunity of a subject (hereinafter referred to as “the immunity enhancing method of the present invention”) comprising administering an effective amount of a regulator of a retinoid metabolic pathway and / or a regulator of a retinoic acid signaling system to a subject.
  • a regulator of a retinoid metabolic pathway and / or a regulator of a retinoic acid signaling system in the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of cancer or infection; and (24) cancer or infection
  • a cancer antigen, a pathogen of the infectious disease or an antigen of the pathogen, or immune cells stimulated or activated by these antigens or pathogens in the manufacture of a medicament for prevention and / or treatment
  • a combination of a regulator of a retinoid metabolic pathway and / or a regulator of a retinoic acid signaling system, I will provide a.
  • the regulator of the retinoid metabolic pathway and / or the regulator of the retinoic acid signaling system used in the present invention can enhance the immune response to an antigen in a subject through an increase in the proportion of memory T cells in the T cell population. Therefore, the method for increasing the proportion of memory T cells of the present invention, the prevention / treatment adjuvant for cancer / infection, the cancer immunotherapy adjuvant, the immunity enhancing agent, the T cell population preparation method, and the T cell population prepared by the method,
  • the cancer / infection prevention / treatment kit can be used for prevention / treatment of various diseases including cancer and infection. Moreover, the effect of this immunotherapy can be heightened by combining these with immunotherapy for various diseases including cancer and infectious diseases.
  • FIG. 3 shows the effect of retinoic acid and RAR antagonist on the percentage of memory T cells.
  • FIG. 3 shows the effect of retinoic acid and RAR antagonist on T cell population remodeling in mice.
  • FIG. 5 shows the effect of retinoic acid and RAR antagonist on the percentage of WT1 332 specific memory T cells and the proliferative capacity.
  • FIG. 5 shows the effect of retinoic acid and RAR antagonist on the proportion of memory T cells and the T cell proliferative capacity in the T cell population reconstituted from effector T cells.
  • FIG. 5 shows the outline of the anti-tumor immunity induction experiment using a human WT1 peptide and a RAR antagonist.
  • the vertical axis of the CD62L expression level graph is the mean fluorescence intensity (MFI). It is a figure which shows the increase in the frequency of the memory T cell by various RAR antagonists.
  • the vertical axis of the CD62L expression level graph is the mean fluorescence intensity (MFI). It is a figure which shows enhancement of the cytotoxic activity of CD4 ⁇ +> T cell by a RAR antagonist.
  • the E / T ratio represents the ratio of the number of CD4 + T cells to the number of target cells. It is a figure which shows the result of the Western analysis which detects RDH10 protein contained in the microsome fraction of a cell.
  • FIG. 5 shows the effect of RDH10 inhibitors on the frequency of memory T cells in vitro.
  • FIG. 5 shows the effect of RDH10 inhibitors on the frequency of memory T cells in vitro.
  • FIG. 3 shows the effect of RDH10 inhibitors on the frequency of memory T cells in vivo.
  • FIG. 3 shows the effect of RDH10 inhibitors on the frequency of memory T cells in vivo.
  • T cells differentiate from undifferentiated naive T cells into subsets of T cells with various functions.
  • those that play a major role in the immune response are CD4 positive T cells (helper T cells) and CD8 positive T cells (killer T cells).
  • Both CD4 positive T cells and CD8 positive T cells can be classified into memory cells (central memory cells and effector memory cells) and effector cells (effector cells and terminal effector cells) according to the stage of differentiation.
  • positive CD antigen expression is represented by “ + ” and negative is represented by “ ⁇ ”.
  • CD4 positive T cells are represented as CD4 + T cells.
  • T cell subsets can be determined by identifying surface antigens expressed by cells, cytokines produced, interferons, and the like.
  • CD4 + T cells and CD8 + T cells are expressed by central memory cells (CD127 + , CD62L + ), effector memory cells (CD127 + , CD62L ⁇ ), effector cells (CD127 ⁇ , and CD62L + ) by the expression of the surface antigens CD127 and CD62L.
  • CD62L + ) or terminal effector cells CD127 ⁇ , CD62L ⁇ ).
  • Stimulated T cells differentiate in the order of central memory cells, effector memory cells, effector cells, and terminal effector cells (FIG. 1).
  • central memory cells have the highest proliferation ability and the highest IL-2 production.
  • IL-2 production decreases, IFN- ⁇ production increases, and apoptosis tends to occur.
  • the characteristics of the memory T cell include that it is difficult to cause apoptosis and has a strong proliferation ability.
  • increasing the proportion of memory T cells in the T cell population by the method of the present invention contributes to achieving stronger immunity.
  • the regulator of the retinoid metabolic pathway and / or the regulator of the retinoic acid signaling system used in the method for increasing the proportion of memory T cells of the present invention may be an inhibitor of the retinoid metabolic pathway or an inhibitor of the retinoic acid signaling system. Further, it may be a promoter of the metabolic pathway or a promoter of the signal transduction system. In one preferred embodiment, the modulator is an inhibitor of a retinoid metabolic pathway or an inhibitor of a retinoic acid signaling system. In another preferred embodiment, the modulator is a promoter of the retinoic acid signaling system. Two or more of these regulators may be used in combination.
  • the addition of the regulator of the retinoid metabolic pathway and / or the regulator of the retinoic acid signaling system to the T cell population may be performed in vitro or may be performed in vivo.
  • An example of in vitro addition is the addition of the regulator to the medium in which the T cell population is cultured.
  • An example of in vivo addition is injecting the modulator into a subject's body.
  • Inhibitor of Retinoid Metabolic Pathway Increasing the proportion of memory T cells in the T cell population by the method of increasing the proportion of memory T cells of the present invention can suppress the differentiation of naive T cells or memory T cells into effector T cells, and / or It can be achieved through the induction of memory T cells (particularly central memory T cells) from effector (or terminal effector) T cells.
  • the method for increasing the proportion of memory T cells of the present invention increases the proportion of memory T cells, particularly central memory T cells, in a T cell population by inhibiting the retinoid metabolic pathway.
  • inhibition of the retinoid metabolic pathway means any reaction in the metabolic pathway in which retinoic acid is produced from vitamin A (retinoid) or provitamin A (retinoid precursor) such as retinol and ⁇ -carotene. It refers to inhibiting.
  • the inhibitor of the retinoid metabolic pathway is a reaction that converts retinol to retinal, a reaction that converts retinal to retinoic acid, a reaction that converts ⁇ -carotene to retinal, ⁇ -apocarotenal to ⁇ -carotene One or more of the reaction to convert to ⁇ -apocarotenal and the reaction to convert ⁇ -apocarotenal to retinal and retinoic acid.
  • the inhibitor of the retinoid metabolic pathway is an enzyme that catalyzes any reaction in the retinoid metabolic pathway (hereinafter also referred to as “retinoid metabolic enzyme”), such as retinol dehydrogenase, retinal oxidase, retinal. It inhibits the expression or action of dehydrogenase, ⁇ -carotene-15,15′-monooxygenase 1 (BCMO1), ⁇ -carotene oxygenase 2 (BCO2) and the like.
  • retinoid metabolic enzyme such as retinol dehydrogenase, retinal oxidase, retinal. It inhibits the expression or action of dehydrogenase, ⁇ -carotene-15,15′-monooxygenase 1 (BCMO1), ⁇ -carotene oxygenase 2 (BCO2) and the like.
  • the inhibitor of retinoid metabolic pathway is an inhibitor of retinol dehydrogenase, more preferably retinol dehydrogenase 10 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (the sequence of DNA encoding the enzyme is shown as SEQ ID NO: 2). ) Or homologue inhibitors thereof.
  • the homologue of retinol dehydrogenase 10 is an amino acid sequence having sequence identity of 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 1 or several, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, A protein consisting of an amino acid sequence deleted, inserted and / or added.
  • the inhibitor of the retinoid metabolic pathway is any of an RNA molecule that suppresses expression of a gene encoding the retinoid metabolic enzyme, a nucleic acid molecule that generates the RNA molecule, and a vector that includes the nucleic acid molecule. It is.
  • RNA molecule that suppresses the expression of a gene encoding a retinoid metabolic enzyme usually targets mRNA encoding the retinoid metabolic enzyme and suppresses the production of the metabolic enzyme by inducing degradation of the mRNA or inhibiting translation.
  • RNA molecules include siRNA, shRNA, miRNA, stRNA and antisense RNA. Examples of preferred RNA molecules are siRNA and shRNA.
  • the retinoid metabolizing enzyme for which gene expression is to be suppressed is retinol dehydrogenase, particularly retinol dehydrogenase 10.
  • the RNA molecule that suppresses the expression of the gene encoding retinol dehydrogenase has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more or 98% or more with the sequence. It targets mRNA transcribed from a DNA comprising a nucleotide sequence having the same sequence identity as described above, and suppresses the production of retinol dehydrogenase 10.
  • the RNA molecule is a siRNA or shRNA in which the sense strand of the double-stranded portion consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and the antisense strand of the double-stranded portion consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, Particularly shRNA.
  • the nucleic acid molecule that generates the RNA molecule means a nucleic acid molecule that directly or indirectly generates the RNA molecule, such as a DNA construct or a recombinant retroviral RNA containing a nucleotide sequence corresponding to the RNA molecule. It is done.
  • directly means, for example, a case where a target RNA molecule is produced by transcription from DNA or processing of a precursor RNA (splicing, editing, etc.), while “indirect” means For example, it means that DNA is produced by reverse transcription from RNA, and then the target RNA molecule is produced by transcription from the DNA.
  • the vector containing the nucleic acid molecule may be an “expression vector” that provides transient expression (production) of the target RNA molecule, and stable expression (production of the target RNA molecule by integrating the DNA sequence into the chromosome). It is also possible to use a “transformation vector”. Examples of the types of vectors that can be used in the present invention include plasmid vectors, DNA virus vectors, RNA virus vectors, and the like, but are not limited thereto as long as they are vectors that can be used in animal cells, such as human cells.
  • RNA construct comprising the desired RNA molecule and the nucleotide sequence of the promoter
  • a DNA construct corresponding to the RNA construct is generated by reverse transcription, and the DNA construct is It is integrated into the chromosome and the desired RNA molecule is transcribed from the integrated DNA construct.
  • the compound that inhibits the action of the retinoid metabolic enzyme may be a low molecular compound or a high molecular compound.
  • the polymer compound include an antibody that binds to a retinoid-metabolizing enzyme, an antigen-binding fragment thereof (Fab, F (ab ′) 2 and the like), ScFv, and the like.
  • a low molecular weight compound that inhibits the action of a retinoid-metabolizing enzyme can be obtained by a known method in the art, such as screening from a compound library using the inhibitory action on the activity of the enzyme as an index.
  • Antibodies that bind to retinoid-metabolizing enzymes, antigen-binding fragments thereof, ScFv, and the like can also be obtained by methods known in the art such as animal immunization and phage display using enzymes as antigens.
  • the compound that inhibits the action of retinoid metabolizing enzyme is a compound that inhibits the action of retinol dehydrogenase, preferably a compound that inhibits the action of retinol dehydrogenase 10 (SEQ ID NO: 1) (hereinafter referred to as “RDH10 inhibitor”). ").
  • RDH10 inhibitor is a compound having a structure represented by the following formula (I) or a salt thereof: [Wherein R is H or CH 3 ; Z is HO— or HOOC—Y—COO—, Y is —CH 2 CH 2 —, —CH ⁇ CH— or a phenylene group].
  • Z in formula (I) is HOOC—Y—COO—. More preferably, Y is —CH ⁇ CH— or a phenylene group.
  • Examples of the salt of the compound represented by the formula (I) include sodium salt and potassium salt, and sodium salt is preferable.
  • the RDH10 inhibitor is RDHI-001, RDHI-002, RDHI-003, RDHI-004, RDHI-005, RDHI-006, RDHI-007, RDHI-008, RDHI-009, RDHI-010 and RDHI- One or more compounds selected from the group consisting of 011. More preferably, the RDH10 inhibitor is one or more compounds selected from the group consisting of RDHI-001, RDHI-002, RDHI-003 and RDHI-004. More preferably, the RDH10 inhibitor is one or more compounds selected from the group consisting of RDHI-001, RDHI-002 and RDHI-003. RDHI-001 to RDHI-011 are compounds represented by the following formulae, respectively.
  • a dominant negative mutant protein of a retinoid metabolic enzyme can also be used as an inhibitor of a retinoid metabolic pathway.
  • the dominant negative mutant protein can be obtained, for example, by preparing a mutant protein of a retinoid metabolizing enzyme and selecting a protein that has a binding ability to a substrate but does not have an original catalytic action.
  • by analyzing the functional site of the enzyme it is possible to improve the efficiency of the production and selection process of the desired mutant protein.
  • the promoter or inhibitor of the retinoid metabolic pathway can also be obtained by a so-called SBDD (Structure-Based Drug Design) technique.
  • SBDD Structure-Based Drug Design
  • a retinoid metabolizing enzyme such as retinol dehydrogenase 10 is purified, crystallized, a three-dimensional structure is determined by X-ray analysis, a compound that binds to the retinoid metabolizing enzyme is designed based on the three-dimensional structure, and the activity of the compound is determined.
  • SBDD Structure-Based Drug Design
  • Retinoic acid signal transduction system and its inhibitor retinoic acid signal transduction system means that retinoic acid (hereinafter also referred to as “RA”) binds to a retinoic acid receptor (hereinafter also referred to as “RAR”) in the nucleus of a cell.
  • a signal transmission system for example, transcriptional regulation of a gene having a retinoic acid responsive element.
  • the method for increasing the proportion of memory T cells of the present invention increases the proportion of memory T cells, particularly central memory T cells, in the T cell population by inhibiting such signal transduction system.
  • the method for increasing the proportion of memory T cells of the present invention increases the proportion of CD4 positive memory T cells in the T cell population by inhibiting the retinoic acid signaling system.
  • Inhibitors of the retinoic acid signaling system include retinoic acid receptor antagonists, dominant negative mutant proteins of retinoic acid receptors, RNA molecules that suppress the expression of genes encoding retinoic acid receptors, and the production of such RNA molecules Examples thereof include a nucleic acid molecule and a vector containing the nucleic acid molecule.
  • the inhibitor is a retinoic acid receptor antagonist.
  • Retinoic acid receptor antagonists include compounds such as LE540, LE135, LE550, BMS195614, MM11253, AGN194310, Ro41-5253, AGN193109, CD2665, BMS493, and the like, or binding of retinoic acid and retinoic acid receptor And the like, and the like.
  • the retinoic acid receptor antagonist is one or more compounds selected from the group consisting of LE540, LE135, BMS195614 and MM11253 and analogs and derivatives thereof.
  • LE540, LE135, LE550, BMS195614, MM11253, AGN194310, Ro41-5253, AGN193109, CD2665, and BMS493 are represented by the following equations, respectively.
  • Compounds other than the above that act as retinoic acid receptor antagonists can be obtained by methods known in the art, such as screening from a library of compounds having a structure similar to retinoic acid or LE540.
  • a dominant negative mutant protein of a retinoic acid receptor can be used as an inhibitor of a retinoic acid signal transduction system.
  • the dominant negative mutant protein can be obtained, for example, by preparing a mutant protein of a retinoic acid receptor and selecting a protein that has a binding ability to retinoic acid but does not generate a signal.
  • by analyzing the functional site of the receptor it is possible to improve the efficiency of the production and selection process of the desired mutant protein.
  • an RNA molecule that suppresses the expression of a gene encoding a retinoic acid receptor can be used as an inhibitor of the retinoic acid signaling system.
  • An RNA molecule that suppresses RAR gene expression usually targets mRNA encoding RAR, and suppresses RAR production by inducing degradation of the mRNA or inhibiting translation. Examples of such RNA molecules include siRNA, shRNA, miRNA, stRNA, and antisense RNA. Examples of preferred RNA molecules are siRNA and shRNA.
  • RAR ⁇ three subtypes of RAR ⁇ , RAR ⁇ , and RAR ⁇ are known as retinoic acid receptors, and a plurality of isoforms (variants) have been reported for each.
  • NP_000955, NP_001019980 and NP_001138774 for RAR ⁇ , NP_000956 and NP_057236 for RAR ⁇ , NP_000957, NP_001036193, NP_001230661, NP_001230659, and NP_001230660 for RAR ⁇ both NCBI's Biotechnology Isoforms composed of sequences are known, and in the present specification, DNA sequences encoding these isoforms are shown as SEQ ID NOs: 5 to 14, respectively.
  • the RNA molecule that suppresses the expression of the RAR gene has a nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 5 to 14 or the sequence and 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more or It targets mRNA transcribed from DNA consisting of nucleotide sequences having a sequence identity of 98% or more, and suppresses the production of one or more of RAR ⁇ , RAR ⁇ and RAR ⁇ .
  • nucleic acid molecule that generates (directly or indirectly) an RNA molecule that suppresses the expression of the RAR gene and a “vector” that includes the nucleic acid molecule
  • gene encoding a retinoid metabolizing enzyme This is the same as described above for the nucleic acid molecule that produces the “RNA molecule that suppresses the expression of” and the vector containing the nucleic acid molecule.
  • the method for increasing the proportion of memory T cells of the present invention increases the proportion of memory T cells in the T cell population by promoting the retinoic acid signaling system. .
  • the method for increasing the proportion of memory T cells of the present invention comprises adding a promoter for the retinoic acid signaling system to a T cell population containing naive T cells, whereby the memory T cells in the T cell population are added. The ratio is increased.
  • the proportion of naive T cells in the T cell population to which the retinoic acid signaling system promoter is added is preferably 20% or more, such as 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70 % Or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more.
  • the T cell population to which the retinoic acid signaling system promoter is added may be composed of only naive T cells.
  • the promoter for the retinoic acid signal transduction system examples include retinoic acid receptor agonists, nucleic acid molecules having a nucleotide sequence encoding retinoic acid receptors, and the like, preferably retinoic acid receptor agonists.
  • the retinoic acid receptor agonist is retinoic acid, especially all-trans retinoic acid (ATRA).
  • the retinoic acid receptor agonist is one or more compounds selected from the group consisting of all-trans retinoic acid (ATRA), LE511, AM580, AC55649 and CD437 and analogs and derivatives thereof. All-trans retinoic acid (ATRA), LE511, AM580, AC55649 and CD437 are each represented by the following formula.
  • a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence encoding a retinoic acid receptor can be obtained by using a technique known in the art such as an expression vector in order to promote the retinoic acid signal transduction system by overexpressing the retinoic acid receptor, for example. It can be introduced into T cells.
  • the cancer / infection prevention / treatment adjuvant of the present invention comprises a regulator of a retinoid metabolic pathway and / or a regulator of a retinoic acid signaling system as an active ingredient. Regulation (inhibition or promotion) of the metabolic pathway or signal transduction system increases the proportion of memory T cells in the T cell population.
  • the cancer / infection prevention / treatment adjuvant of the present invention increases the therapeutic effect of cancer by immunotherapy, particularly immunotherapy using a cancer antigen peptide.
  • Cancer antigen peptides used for cancer immunotherapy include, but are not limited to, various WT1 peptides such as human WT1 332 (described in SEQ ID NO: 15, International Publication No. 2012/046730, etc.), MAGE-A4 278-299 (sequence) No. 16), survivin 97-111 (SEQ ID NO: 17), and mutant peptides having activity equivalent to them.
  • regulators of retinoid metabolic pathways or retinoic acid signaling systems are also effective as adjuvants in the prevention (eg, vaccines) and treatment (eg, immunotherapy) of infectious diseases.
  • inhibitors of the retinoic acid signaling system can enhance the cytotoxic activity of CD4 + T cells. Therefore, inhibitors of the retinoic acid signaling system are effective as adjuvants in the treatment of cancer or infectious diseases, particularly in the immunotherapy of cancer or infectious diseases.
  • the cancer to which the cancer / infection prevention / treatment adjuvant of the present invention is applied is not particularly limited, and includes carcinoma, sarcoma, hematopoietic tumor and the like.
  • the adjuvant is applied to various cancers or tumors that express the WT1 gene, for example, hematopoietic tumors such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, and gastric cancer, Solid tumors or solid tumors such as colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, and brain tumor.
  • hematopoietic tumors such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, and gastric cancer
  • Solid tumors or solid tumors such as colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer,
  • the infectious disease to which the cancer / infectious disease prevention / treatment adjuvant of the present invention is applied is not particularly limited. This is because the regulator of the retinoid metabolic pathway and / or the regulator of the retinoic acid signaling system provides strong immunity regardless of the type of infection through an increase in the number of T cells and an increase in the proportion of memory T cells. Because.
  • the application target of the adjuvant may be an infection caused by bacteria, viruses, protozoa, and the like.
  • the modulator can be used as an active ingredient of an immunity enhancing agent that non-specifically improves the immunity of a subject.
  • the preventive / therapeutic adjuvant, cancer immunotherapy adjuvant and immunity enhancing agent of the present invention in addition to the active ingredient regulator of retinoid metabolic pathway and / or regulator of retinoic acid signaling system,
  • it may contain a carrier, an excipient and the like.
  • the method for administering the cancer / infection preventive / treatment adjuvant, cancer immunotherapy adjuvant, and immunity enhancing agent of the present invention can be appropriately selected according to conditions such as the type of disease, the state of the subject, and the target site. it can. Examples of the method include, but are not limited to, intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration, nasal administration, and oral administration.
  • the amount of the above-mentioned active ingredient, the dosage form of the adjuvant and potentiator, the frequency of administration, etc. contained in the preventive / therapeutic adjuvant, cancer immunotherapy adjuvant and immunity enhancing agent of the present invention are determined according to the disease. It can be appropriately selected according to conditions such as the type, the state of the target, and the target site.
  • the method for preparing a T cell population according to the present invention is a method for culturing T cells usually used by adding a regulator of a retinoid metabolic pathway and / or a regulator of a retinoic acid signal transduction system to a T cell population.
  • a T cell population with an increased proportion of memory T cells compared to the method is obtained.
  • addition of a regulator of a retinoid metabolic pathway and / or a regulator of a retinoic acid signaling system to a T cell population can be performed in vitro or in vivo, but is preferably performed in vitro.
  • An example of in vitro addition is the addition of the regulator to the medium in which the T cell population is cultured.
  • Examples of in vivo addition include administering the modulator into the body of a subject.
  • the T cell population produced by the T cell population production method of the present invention is used for the prevention and / or treatment of various diseases, preferably cancer or infectious diseases, particularly in the immunotherapy of cancer or infectious diseases. Can be used to increase the effect of.
  • the cancer / infection prevention / treatment method and cancer / infection prevention / treatment kit of the present invention comprises a regulator of a retinoid metabolic pathway and / or a regulator of a retinoic acid signaling system, a cancer or It is used in combination with other active ingredients in the prevention and / or treatment of infectious diseases, in particular immunotherapy of cancer or infectious diseases.
  • active ingredients include cancer antigens, pathogens of infectious diseases, antigens of the pathogens, immune cells stimulated or activated by these antigens or pathogens, and the like.
  • the cancer antigen refers to a surface antigen (so-called tumor-specific antigen) that is specifically expressed in cancer cells or tumor cells and a partial peptide of the antigen.
  • a WT1 protein that is a product of the oncogene WT1
  • a partial peptide of the protein WT1 peptides such as certain WT1 332 .
  • pathogens for infectious diseases include bacteria, fungi, viruses, protozoa, and the like.
  • antigens of pathogens include proteins expressed on the surface of bacteria, fungi, viruses and the like, glycoproteins and sugar chains, and cell walls of bacteria or fungi and constituents thereof (lipopolysaccharide, etc.).
  • immune cells stimulated or activated by antigens or pathogens include antigen-presenting cells (for example, dendritic cells, macrophages and B cells), T cells activated by the antigen-presenting cells, and the like.
  • the preventive / therapeutic adjuvant, cancer immunotherapy adjuvant and immunity enhancing agent of the present invention can be used for the prevention and / or treatment of various diseases, preferably cancer or infectious diseases, particularly immunity of cancer or infectious diseases.
  • diseases preferably cancer or infectious diseases, particularly immunity of cancer or infectious diseases.
  • the active ingredient include the above-described cancer antigens, pathogens of infectious diseases, antigens of the pathogens, immune cells stimulated or activated by these antigens or pathogens, and the like.
  • Memory T cell ratio increasing method of the present invention cancer / infection prevention / treatment adjuvant, cancer immunotherapy adjuvant, immunity enhancing agent, cancer / infection prevention / treatment kit, cancer / infection prevention /
  • the subject to which the treatment method, infection prevention / treatment method and immunity enhancement method can be applied is not particularly limited as long as it is an animal having an immune system, particularly an acquired immune system, that is, a vertebrate. Examples of such subjects include humans, mice, rats, dogs, cats, rabbits, horses, cows, sheep, pigs, goats, monkeys, chimpanzees and the like. In one preferred embodiment, such subject is a human.
  • an effective amount of a regulator of a retinoid metabolic pathway and / or a regulator of a retinoic acid signaling system to be administered to a subject As well as cancer antigens, pathogens of infectious diseases or antigens of the pathogens, or immune cells stimulated or activated by these antigens or pathogens, depending on conditions such as the type of disease, the condition of the subject, the target site, etc. In addition, it can be appropriately determined using methods well known to those skilled in the art (including various non-clinical and / or clinical trials).
  • Cancer antigens that can be used in the method for preventing / treating cancer / infectious diseases, the method for preventing / treating infectious diseases and the method for enhancing immunity of the present invention, pathogens of infectious diseases or antigens of the pathogens, stimulated or activated by these antigens or pathogens Examples of the immune cells thus produced are as described above.
  • the cancer / infection prevention / treatment adjuvant, cancer immunotherapy adjuvant, immunity enhancing agent, T cell population preparation method, cancer / infection prevention / treatment kit, cancer / infection prevention of the present invention / Methods of treatment, prevention / treatment of infectious diseases, and methods of enhancing immunity also include inhibitors of various retinoid metabolic pathways, inhibitors of retinoic acid signal transduction system, and retinoin described with respect to “method of increasing the proportion of memory T cells”
  • An accelerator for an acid signaling system can be used as a regulator of a retinoid metabolic pathway or a retinoic acid signaling system.
  • Example 1 Repression of Retinol Dehydrogenase 10 Expression by shRNA A construct for expressing shRNA (RDH10 target shRNA) consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 18 targeting retinol dehydrogenase 10 was introduced into human CD4 + CD45RO + T cells. Specifically, using a lentiviral vector system, co-transfecting a packaging cell (293T cell line) with a vector in which a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 was incorporated at the cloning site, and a packaging vector, The produced recombinant virus was infected with human CD4 + CD45RO + T cells.
  • Human CD4 + CD45RO + T cells were subjected to the above-mentioned RDH10 target shRNA (sh # 10-2, SEQ ID NO: 18) using a lentiviral vector, and shRNA targeting luciferase as a control (sh-luc, SEQ ID NO: 20).
  • RDH10 target shRNA sh # 10-2, SEQ ID NO: 18
  • shRNA targeting luciferase as a control
  • TDH cells highly expressing RDH10 were prepared by introducing a lentiviral vector incorporating the RDH10 gene into human CD4 + CD45RO + T cells. These cells were cultured for one week with various concentrations of retinol (all-trans type) in the presence of anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody and IL-2, and IFN- ⁇ was measured by intracellular cytokine assay along with cell number measurement.
  • the frequency of cells produced was examined. The results are shown in FIG.
  • the presence of retinol increased the number of cells and IFN- ⁇ producing cells in a retinol concentration dependent manner.
  • the rate of increase was suppressed by suppressing the expression of RDH10 and enhanced by overexpression.
  • Example 2 T cell population in retinol dehydrogenase 10 knockout mice
  • Retinol dehydrogenase 10 (hereinafter also referred to as RDH10) gene on the chromosome was replaced with the construct A shown in FIG. Created.
  • a mouse having the flox allele thus obtained and a transgenic mouse expressing Cre recombinase were crossed to obtain a knockout mouse having a gene structure (C in FIG. 5) from which exon 2 of RDH10 was removed.
  • CD4 + T cells were isolated from spleen cells of RDH10 conditional knockout mice (flox / flox cre) and control mice (flox / flox) prepared as described above using a cell sorter.
  • the separated CD4 + T cells were activated and expanded with anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody and IL-2, and then placed in a 10 cm culture dish with 3 ⁇ 10 7 cells each, and labeled with 3 H All-trans-retinol was added at a concentration of 1 ⁇ M. After culturing at 37 ° C. for 4 hours, the cells were collected, and intracellular retinoids were extracted using hexane.
  • T cell subsets were identified using CD44 and CD62L expression as indicators.
  • RDH10 flox / flox mice and RDH10 flox / wt mice have high expression of CD62L in both the CD4 + T cell population and the CD8 + T cell population. Increased in proportion (FIG. 7).
  • T cells CD8 + T cells expressing only OT-I TCR
  • wild type mice having only CD45.2 C57BL / 6J
  • the recombinant Listeria monocytogenes (LM-OVA) expressing the OVA peptide recognized by the OT-I TCR was infected with 1 ⁇ 10 4 CFU. Over time, the change in the ratio of the transferred T cells and the phenotype were observed. The spleen and lymph nodes were removed and analyzed.
  • L-OVA Listeria monocytogenes
  • RDH10 conditional knockout mouse-derived T cells (CD45.1 + CD45.2 +) transferred from the spleen and lymph nodes of mice that had passed 30 days or more after infection in the memory phase, and Control mouse-derived T cells (CD45.1 + CD45.2 ⁇ ) were separated using a FACS sorter and transferred to separate wild-type mice, 1 ⁇ 10 4 each.
  • LM-OVA was infected with 1 ⁇ 10 6 CFU (secondary infection), and after 5 days, the number of Listeria monocytogenes present in the spleen and liver and the number of transferred T cells were analyzed. An outline of the above test is shown in FIG.
  • T cells derived from RDH10 knockout mice have stronger proliferation ability and stronger elimination ability of Listeria monocytogenes than T cells derived from control mice (FIG. 16). From the above results, it was confirmed that the T cells of RDH10 knockout mice produced more memory T cells and qualitatively had a high memory function (FIG. 17).
  • Example 3 Differentiation promotion and differentiation suppression of T cells
  • retinoic acid Stimulating human CD4 + CD45RO + T cells by various methods (IL-2, anti-CD3 / CD28 antibody, anti-CD3 / CD28 antibody and IL-2) And cultured in the presence of DMSO (control) or all-trans retinoic acid (note that all retinoic acids used in the following examples are all-trans retinoic acid).
  • DMSO control
  • all-trans retinoic acid note that all retinoic acids used in the following examples are all-trans retinoic acid.
  • Memory T cells have multipotency and self-renewal ability. Due to this self-replicating ability, a cell population containing a large amount of memory T cells can maintain memory T cells at high frequency even when division and proliferation are repeated. Therefore, the T cell population cultured in the presence of the RAR antagonist contains a large amount of memory T cells.
  • Example 4 Increased Memory T Cell Proportion with RAR Antagonists
  • Human WT1 332- specific TCR transgenic CD4 + T cells were stimulated with human WT1 332 and cultured in the presence of DMSO (control), retinoic acid or RAR antagonist (LE540).
  • DMSO control
  • T cell population cultured in the presence of a RAR antagonist was restimulated and cultured with PBMC pulsed with human WT1 332 (T cells: 30,000 cells / well, PBMC: 100,000 cells / well, IL- 2: None), and showed higher proliferation ability than cells cultured in the presence of DMSO or retinoic acid (FIG. 24).
  • Example 5 Induction of memory T cells by RAR antagonist Method: Terminal effector fractions contained in single cell derived human WT1 332- specific CD4 + T cell clones were stimulated with dendritic cells pulsed with human WT1 332 and treated with DMSO (control), retinoic acid or RAR antagonist (LE540). Cultured for 7 days in the presence. Cells were then labeled with CFSE, restimulated with dendritic cells pulsed with human WT1 332 , and further cultured in the presence of DMSO (control), retinoic acid or RAR antagonist (LE540). After 4 or 6 days of culture, FACS analysis and 3 H thymidine incorporation assay (cell proliferation assay) were performed. The test flow is shown in FIG.
  • Example 6 Effect of RAR antagonists in cancer immunotherapy Methods: Tumor cells expressing both WT1 protein and luciferase were implanted subcutaneously in the ventral side of NOD / Shi-scid, IL-2R ⁇ null mice (NOG mice). Three days after transplantation, 10 6 human WT1 332- specific CD4 + T cells (GFP positive) were injected intravenously (day 0). Eight hours after the intravenous injection, DMSO (control), retinoic acid or LE540 was administered intraperitoneally. One day after intravenous injection, CD3 + T cells were removed and 2 ⁇ 10 6 human peripheral blood mononuclear cells pulsed with human WT1 332 peptide were injected intravenously (Day 1).
  • luciferin which is a substrate for luciferase
  • the test flow is shown in FIG.
  • FIG. 29 shows mouse survival curves and tumor mass measurement results (21 days).
  • the survival time was shorter than that of the control.
  • the survival time was extended as compared with the control.
  • the size of the tumor was significantly smaller than that in the DMSO group and the retinoic acid group (evaluated by how many times it increased from the 0th day).
  • Example 7 Modulation of T cell population differentiation by various RAR agonists and antagonists Methods: Human CD4 + CD45RO + T cells were stimulated with anti-CD3 / CD28 antibody and IL-2 and cultured for 8 days in the presence of various RAR agonists (FIG. 30) or RAR antagonists (FIG. 31) using DMSO as a control.
  • Example 8 Enhancement of cytotoxic activity by RAR antagonists Methods: CD4 + T cells (WT1 332- specific CD4 + T cells) expressing a HLA-DPB1 * 05 : 01 (DP5) -restricted WT1 332- specific TCR using a lentiviral vector were transformed into all-trans retinoic acid (ATRA) Stimulated and cultured with peripheral blood mononuclear cells pulsed with WT1 332 in the presence of RAR antagonist (LE540) or DMSO as a control.
  • ATRA all-trans retinoic acid
  • leukemia cell line TF1 expressing WT1 but not having HLA-DPB1 * 05 : 01 TF1 is HLA-DPB1 * 02 : 01 and DPB1 * 04 : 01 positive
  • HLA-DPB1 * The cytotoxic activity of WT1 332- specific CD4 + T cells cultured under the above three conditions was measured using TF1 expressing 05:01 (designated as TF1-DP5) as a target cell.
  • Example 9 Small molecule inhibitor of retinol dehydrogenase 10
  • Detection of RDH10 protein 293T cells (1 ⁇ 10 6 ), 293T cells introduced with RDH10 gene (1 ⁇ 10 6 ), and activated human CD4 + T cells (1 ⁇ 10 6 ) 7 was washed thoroughly with PBS and then suspended in 600 ⁇ l of 0.25 M sucrose / 0.1 M Na phosphate buffer (pH 7.4). The cell suspension was homogenized and centrifuged at 10,000 g for 10 minutes at 4 ° C., and then the supernatant was centrifuged at 100,000 g for 1 hour at 4 ° C. to obtain a microsomal fraction.
  • the microsomal fraction was suspended in 20 ⁇ l of 0.1 M Na phosphate buffer (pH 7.4) and used for Western blotting.
  • the RDH10 protein contained in the microsomal fraction was separated by SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane, blocked, and then anti-RDH10 antibody (ab87586) as the primary antibody and anti-rabbit IgG-HRP antibody as the secondary antibody And detected using Luminata Forte Western HRP Substrate (Millipore).
  • Luminata Forte Western HRP Substrate Luminata Forte Western HRP Substrate (Millipore).
  • all-trans-retinal was not produced from all-trans-retinol in the 293T cell line-derived microsome, whereas all-trans-retinal was produced in the RDH10 gene-introduced 293T cell line-derived microsome (FIG. 34).
  • RDH10 inhibitor (RDHI-001 to 011) dissolved in DMSO was added to each tube to a final concentration of 20 ⁇ M, and the same amount of DMSO was added to the control tube. The mixture was reacted at 37 ° C. for 15 minutes, 200 ⁇ l of methanol was added, and then retinoid was extracted using hexane and concentrated. The concentrated retinoid was dissolved in 150 ⁇ l of acetonitrile and then separated using HPLC, and the substrate (all-trans retinol) and the product (all-trans retinal) were detected by detecting ultraviolet light absorption at a wavelength of 350 nm.
  • FIG. 36 shows the influence of the RDH10 inhibitor concentration on the frequency of memory T cells.
  • Amplification of memory T cells by RDH10 inhibitor in vivo Recombinant Listeria monocytogenes (LM-OVA) expressing OVA protein was introduced into tail vein of BDH mice in the RDH10 inhibitor administration group and corn oil administration control group Then, 1 ⁇ 10 5 cfu (colony forming unit) was infected, and RDH10 inhibitor (200 ⁇ g / day) was continuously administered from the day before infection (day ⁇ 1) to 7 days after infection (day 7). Blood was collected from the tail vein over time (days 5, 7, 10 and 14 after infection), and OVA-specific CD8 + T cells contained in peripheral blood were analyzed by the tetramer method. An outline of such a test is shown in FIG. As a result of the analysis, it was shown that administration of an RDH10 inhibitor (RDHI-001 to 003) increased the frequency of memory type (CD62L + CD127 + ) OVA-specific CD8 + T cells (FIGS. 39 and 40). .
  • RDH10 inhibitor RDHI-001 to
  • Example 10 Effect of retinol dehydrogenase 10 inhibitor in cancer immunotherapy Methods: 2 ⁇ 10 6 EG7 tumor cells (EL4 cells expressing OVA protein) were transplanted subcutaneously into the abdomen of B6 mice (day 0). On day 5 after transplantation, mice were irradiated with radiation (3 Gy) to increase the survival rate of transplanted cells, and then 2 ⁇ 10 5 OT-ICD8 + T cells (OVA-specific CD8 + T cells) were intravenously administered. Injected. Then, at 6 days, 8 days and 10 days after transplantation, 100 ⁇ g / mouse of RDH10 inhibitor (RDHI-001, RDHI-002, or RDHI-003) was intravenously injected.
  • RDH10 inhibitor RDHI-001, RDHI-002, or RDHI-003
  • DMSO DMSO 50 ⁇ l + PBS 150 ⁇ l / mouse
  • RDH inhibitor solvent an RDH inhibitor solvent
  • Tumor volume was measured using a caliper for measuring the major axis, minor axis, and height, and using the calculation formula of major axis ⁇ minor axis ⁇ height ⁇ 2 over time.
  • the flow of the experiment is shown in FIG.
  • OT-ICD8 + T cells were not transferred to the tumor-transplanted mice, and only the RDH10 inhibitor (RDHI-001, RDHI-002, or RDHI-003) was obtained 5 days before, 0 days, and 7 days after the transplantation.
  • 100 ⁇ g / mouse was injected intraperitoneally.
  • corn oil 100 ⁇ g / 100 ⁇ l / mouse
  • Tumor volume was measured over time as described above. The flow of the experiment is shown in FIG.
  • FIG. 43 shows the measurement results of the tumor volume over time in mice.
  • RDH10 inhibitor RDHI-001, RDHI-002, and RDHI-003 all inhibited tumor growth.
  • administration of these inhibitors significantly increased the number of transferred OT-ICD8 + T cells (OVA-specific CD8 + T cells) in the peripheral blood of mice.
  • OT-ICD8 + T cells were not transferred and administration of only the inhibitor was not observed, the tumor growth inhibitory effect was not observed (FIG. 44). Therefore, it is considered that the tumor growth inhibitory effect of the RDH10 inhibitor occurs through the amplification of OT-ICD8 + T cells.
  • a method for increasing the proportion of memory T cells in a T cell population using a regulator of a retinoid metabolic pathway and / or a regulator of a retinoic acid signal transduction system prevention of cancer or infectious disease containing the regulator, and
  • a therapeutic adjuvant, an immunity enhancing agent containing the modulator, and the like are provided.

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Abstract

　レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤をＴ細胞集団に添加する工程を含む、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させる方法を提供する。

Description

Ｔ細胞集団の改変方法
　本発明は、免疫細胞、特にＴ細胞の分化を調節し、Ｔ細胞の集団を改変する方法に関する。
　免疫療法とは、一般に、患者の免疫系を種々の方法によって活性化すること、あるいは患者の体外で活性化された免疫細胞を患者の体内に導入すること等により、疾患を治療する方法をいう。免疫療法としては、免疫細胞療法、ペプチドワクチン療法、サイトカイン療法、抗体療法等、様々な方法がこれまでに開発されている。
　近年、癌遺伝子産物ＷＴ１由来の部分ペプチド（ＷＴ１ペプチド）を用いて免疫細胞（特に抗原提示細胞やＴ細胞）を刺激することにより、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導やヘルパーＴ細胞の活性化を達成し得ることが見出され（特許文献１～４および非特許文献１）、ＷＴ１ペプチドワクチンによる癌免疫療法として実用化に向けた研究が進められている。
　しかし、上記ＷＴ１ペプチドワクチンのように臨床試験において有効性が示されている免疫療法は数少ない。また、免疫療法は患者における免疫の状態（免疫抑制、免疫細胞の分化ステージおよび活性）によっては効果が十分に得られない場合もあり、免疫療法の効果を高める方法の開発が望まれている。
国際公開２００３／１０６６８２号公報 国際公開２００５／０９５５９８号公報 国際公開２００７／０９７３５８号公報 国際公開２０１２／０４６７３０号公報
Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb;51(2):99-107
　本発明は、対象における免疫の状態を改変し、免疫療法の効果を増強することができる物質および方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、レチノイド代謝経路またはレチノイン酸シグナル伝達系を調節することにより、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させ、対象における免疫応答を増強し得ることを見出し、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は、
（１）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤をＴ細胞集団に添加する工程を含む、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させる方法（以下、「本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法」とも称する）；
（２）調節剤が、レチノイド代謝経路の阻害剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤である、（１）に記載の方法；
（３）阻害剤が、レチノールのレチナールへの変換、レチナールのレチノイン酸への変換、β-カロテンのレチナールへの変換、β-カロテンのβ-アポカロテナールへの変換、またはβ-アポカロテナールのレチナールおよびレチノイン酸への変換を阻害するものである、（２）に記載の方法；
（４）阻害剤が、レチノールデヒドロゲナーゼ、レチナールオキシダーゼ、レチナールデヒドロゲナーゼ、β-カロテン-15,15'-モノオキシゲナーゼ１およびβ-カロテンオキシゲナーゼ２からなる群より選択される酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を生じさせる核酸分子、該核酸分子を含むベクター、該酵素の作用を阻害する化合物、または該酵素のドミナントネガティブ変異体タンパク質である、（２）または（３）に記載の方法；
（５）阻害剤が、レチノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子であり、該ＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなる群より選択されるものである、（４）に記載の方法；
（６）阻害剤が、レチノールデヒドロゲナーゼの作用を阻害する化合物である、（４）に記載の方法；
（７）阻害剤が、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイン酸受容体のドミナントネガティブ変異体タンパク質、レチノイン酸受容体をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を生じさせる核酸分子、または該核酸分子を含むベクターである、（２）に記載の方法；
（８）調節剤が、レチノイン酸シグナル伝達系の促進剤である、（１）に記載の方法；
（９）促進剤が、レチノイン酸受容体アゴニストである、（８）に記載の方法；
（１０）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む、癌または感染症の予防および／または治療の補助剤（以下、「本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤」とも称する）；
（１１）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む、癌の免疫療法の補助剤（以下、「本発明の癌免疫療法補助剤」とも称する）；
（１２）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む免疫力増強剤（以下、「本発明の免疫力増強剤」とも称する）；
（１３）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤をＴ細胞集団に添加することにより、該Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させる工程を含む、Ｔ細胞集団の作成方法（以下、「本発明のＴ細胞集団作成方法」とも称する）；
（１４）（１３）の方法によって作成されるＴ細胞集団（以下、「本発明のＴ細胞集団」とも称する）；
（１５）（ａ）癌抗原、該感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、またはこれらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞、および（ｂ）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む、癌または感染症の予防および／または治療のためのキット（以下、「本発明の癌／感染症の予防／治療用キット」とも称する）；
（１６）Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させるための、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤；
（１７）癌または感染症の予防および／または治療における使用のための、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤；
（１８）癌の免疫療法における使用のための、（１７）に記載の調節剤；
（１９）（ａ）癌抗原、該感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、またはこれらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞、および（ｂ）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む、癌または感染症の予防および／または治療における使用のための組合せ；
（２０）癌または感染症の予防および／または治療方法であって、有効量の癌抗原、該感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、またはこれらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞と、有効量のレチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤とを対象に投与することを含む方法（以下、「本発明の癌／感染症の予防／治療方法」とも称する）；
（２１）有効量のレチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を対象に投与することを含む、感染症の予防および／または治療方法（以下、「本発明の感染症予防／治療方法」とも称する）；
（２２）有効量のレチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を対象に投与することを含む、対象の免疫力増強方法（以下、「本発明の免疫力増強方法」とも称する）；
（２３）癌または感染症の予防および／または治療のための医薬の製造における、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤の使用； ならびに
（２４）癌または感染症の予防および／または治療のための医薬の製造における、（ａ）癌抗原、該感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、またはこれらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞、および（ｂ）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤の併用、
を提供する。
　本発明において用いるレチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤は、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合の増大を介して、対象における抗原に対する免疫応答を増強し得る。したがって、本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法、癌／感染症の予防／治療補助剤、癌免疫療法補助剤、免疫力増強剤、Ｔ細胞集団作成方法および該方法により作成されるＴ細胞集団、ならびに癌／感染症の予防／治療用キットは、癌および感染症を含む種々の疾患の予防／治療のために用いることができる。また、これらを癌および感染症を含む種々の疾患に対する免疫療法と組み合わせることにより、該免疫療法の効果を高めることができる。
Ｔ細胞の分化の概略を示す図である。 ｓｈＲＮＡを用いるレチノールデヒドロゲナーゼ１０発現抑制の、Ｔ細胞集団の構成に対する影響を示す図である。 レチノールデヒドロゲナーゼ１０の発現抑制および高発現による、Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能に対する影響を示す図である。グラフはコントロール（ＤＭＳＯ）に対する変化率で示した。ｍｏｃｋはコントロールベクターを表す。 ＲＤＨ１０高発現によるレチノイド代謝への影響を示す図である。横軸はＨＰＬＣ分画のフラクション番号である。 ＲＤＨ１０ノックアウトマウスの作成に用いたコンストラクトを示す図である。 ＲＤＨ１０遺伝子のノックアウトによるレチノイド代謝への影響を示す図である。横軸はＨＰＬＣ分画のフラクション番号である。「ｆ／ｆ」はコントロールマウス、「ｆ／ｆ ｃｒｅ」はＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウスを表す。 ＲＤＨ１０ノックアウトマウスにおけるメモリーＴ細胞の増加を示す図である。 ＲＤＨ１０ノックアウトマウスにおけるメモリーＴ細胞の増加を示す図である。 ＲＤＨ１０ノックアウトマウスにおけるＴ細胞表面分子およびその転写因子の発現を示す図である。 ＲＤＨ１０ノックアウトマウスにおけるリンパ器官の細胞数を示す図である。 ＲＤＨ１０ノックアウトマウスにおけるＴ細胞数を示す図である。 リステリア菌感染症モデルを用いたＲＤＨ１０欠損Ｔ細胞の機能解析とメモリーＴ細胞形成の評価試験の概略を示す図である。「ｆ／ｆ ｃｒｅ」はＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス、「ｆ／ｆ」はコントロールマウスを表す。 リステリア菌感染症モデルにおける、移入したＴ細胞の比率を示す図である。「ｆ／ｆ ｃｒｅ」はＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス由来Ｔ細胞、「ｆ／ｆ」はコントロールマウス由来Ｔ細胞を表す。 リステリア菌感染症モデルにおける、移入したＴ細胞のフェノタイプを示す図である。「ｆ／ｆ ｃｒｅ」はＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス由来Ｔ細胞、「ｆ／ｆ」はコントロールマウス由来Ｔ細胞を表す。右下の図においては、塗りつぶし無しの山がＲＤＨ１０ノックアウトマウス由来Ｔ細胞、塗りつぶし有りの山がコントロールマウス由来Ｔ細胞を表す。 リステリア菌感染症モデルにおける、移入したＴ細胞のフェノタイプを示す図である。「ｆ／ｆ ｃｒｅ」はＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス由来Ｔ細胞、「ｆ／ｆ」はコントロールマウス由来Ｔ細胞を表す。 リステリア菌感染症モデルにおける、移入したＴ細胞の増殖能とリステリア菌排除能を示す図である。「ｆ／ｆ ｃｒｅ」はＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス由来Ｔ細胞を移入したマウス、「ｆ／ｆ」はコントロールマウス由来Ｔ細胞を移入したマウスを表す。 リステリア菌感染症モデルにおいて評価した、ＲＤＨ１０遺伝子ノックアウトの効果を模式的に示す図である。 ビタミンＡ欠乏状態におけるＲＤＨ１０欠損の影響を示す図である。「ｆ／ｆ ｃｒｅ」はＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス、「ｆ／ｆ」はコントロールマウスを表す。 レチノイン酸によるＴ細胞の分化促進を示す図である。 Ｔ細胞のアポトーシス感受性に対するレチノイン酸およびＲＡＲアンタゴニストの影響を示す図である。 Ｔ細胞の分裂能および増殖能に対するレチノイン酸およびＲＡＲアンタゴニストの影響を示す図である。 メモリーＴ細胞の割合に対するレチノイン酸およびＲＡＲアンタゴニストの影響を示す図である。 マウスにおけるＴ細胞集団の再構築に対するレチノイン酸およびＲＡＲアンタゴニストの影響を示す図である。 ＷＴ１３３２特異的メモリーＴ細胞の割合および増殖能に対するレチノイン酸およびＲＡＲアンタゴニストの影響を示す図である。 エフェクターＴ細胞からのメモリーＴ細胞の誘導実験の概略を示す図である。 エフェクターＴ細胞に対するレチノイン酸およびＲＡＲアンタゴニストの影響を示す図である。 エフェクターＴ細胞から再形成されたＴ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合およびＴ細胞の増殖能に対する、レチノイン酸およびＲＡＲアンタゴニストの影響を示す図である。 ヒトＷＴ１ペプチドおよびＲＡＲアンタゴニストを用いる抗腫瘍免疫誘導実験の概略を示す図である。 ヒトＷＴ１ペプチドおよびＲＡＲアンタゴニストを用いる抗腫瘍免疫誘導実験の結果を示す図である。 各種ＲＡＲアゴニストによるメモリーＴ細胞の頻度の減少を示す図である。ＣＤ６２Ｌ発現量のグラフの縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ）である。 各種ＲＡＲアンタゴニストによるメモリーＴ細胞の頻度の増加を示す図である。ＣＤ６２Ｌ発現量のグラフの縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ）である。 ＲＡＲアンタゴニストによるＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害活性の増強を示す図である。Ｅ／Ｔ比は、標的細胞数に対するＣＤ４＋Ｔ細胞数の比率を表す。 細胞のミクロソーム画分に含まれるＲＤＨ１０タンパク質を検出するウェスタン解析の結果を示す図である。 ＲＤＨ１０の酵素活性の測定結果を示す図である。 ＲＤＨ１０の酵素活性に対する低分子阻害剤の影響を示す図である。 インビトロでのメモリーＴ細胞の頻度に対するＲＤＨ１０阻害剤の影響を示す図である。 インビトロでのメモリーＴ細胞の頻度に対するＲＤＨ１０阻害剤の影響を示す図である。 組換えリステリア感染マウスに対するＲＤＨ１０阻害剤投与試験の概略を示す図である。 インビボでのメモリーＴ細胞の頻度に対するＲＤＨ１０阻害剤の影響を示す図である。 インビボでのメモリーＴ細胞の頻度に対するＲＤＨ１０阻害剤の影響を示す図である。 ＲＤＨ１０阻害剤を用いる抗腫瘍免疫誘導実験の概略を示す図である。 ＲＤＨ１０阻害剤のみを用いる腫瘍増殖抑制実験の概略を示す図である。 ＲＤＨ１０阻害剤を用いる抗腫瘍免疫誘導実験の結果を示す図である。 ＲＤＨ１０阻害剤のみを用いる腫瘍増殖抑制実験の結果を示す図である。
　Ｔ細胞は、未分化な状態のナイーブＴ細胞から、様々な機能をもったＴ細胞のサブセットへと分化する。分化したＴ細胞のうち、免疫応答において大きな役割を果たすものがＣＤ４陽性Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）およびＣＤ８陽性Ｔ細胞（キラーＴ細胞）である。ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞のいずれも、分化の段階によってメモリー細胞（セントラルメモリー細胞およびエフェクターメモリー細胞）およびエフェクター細胞（エフェクター細胞およびターミナルエフェクター細胞）に分類することができる。なお、本明細書において、ＣＤ抗原発現の陽性を「＋」、陰性を「－」の記号で表す。例えば、ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞と表す。
　これらのＴ細胞サブセットは、細胞が発現する表面抗原、産生するサイトカインやインターフェロン等を同定することにより決定できる。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、表面抗原ＣＤ１２７およびＣＤ６２Ｌの発現によって、セントラルメモリー細胞（ＣＤ１２７＋、ＣＤ６２Ｌ＋）、エフェクターメモリー細胞（ＣＤ１２７＋、ＣＤ６２Ｌ－）、エフェクター細胞（ＣＤ１２７－、ＣＤ６２Ｌ＋）またはターミナルエフェクター細胞（ＣＤ１２７－、ＣＤ６２Ｌ－）のいずれかに分類することができる。刺激されたＴ細胞は、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞、エフェクター細胞、ターミナルエフェクター細胞の順に分化する（図１）。これらの細胞のうち、セントラルメモリー細胞は最も高い増殖能を有し、最もＩＬ－２産生量が多い。ターミナルエフェクター細胞に向かって分化が進むにつれてＩＬ－２産生量が減少し、ＩＦＮ－γ産生量が増加し、かつ、アポトーシスを起こしやすくなる。メモリーＴ細胞の特徴として、アポトーシスを起こしにくいこと、および強い増殖能を有することが挙げられる。したがって、本発明の方法によるＴ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合の増大は、より強い免疫の達成に寄与する。
　本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法において用いるレチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤は、レチノイド代謝経路の阻害剤またはレチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤であってもよく、該代謝経路の促進剤または該シグナル伝達系の促進剤であってもよい。一つの好ましい態様において、該調節剤は、レチノイド代謝経路の阻害剤またはレチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤である。別の好ましい態様において、該調節剤はレチノイン酸シグナル伝達系の促進剤である。これらの調節剤を２種以上組み合わせて用いてもよい。
　レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤のＴ細胞集団への添加は、インビトロで行われるものであってもよく、インビボで行われるものであってもよい。インビトロにおける添加の例としては、Ｔ細胞集団を培養している培地へ該調節剤を添加することが挙げられる。インビボにおける添加の例としては、対象の体内へ該調節剤を注入することが挙げられる。
レチノイド代謝経路の阻害剤
　本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法による、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合の増大は、ナイーブＴ細胞もしくはメモリーＴ細胞からエフェクターＴ細胞への分化の抑制、および／またはエフェクター（もしくはターミナルエフェクター）Ｔ細胞からのメモリーＴ細胞（特にセントラルメモリーＴ細胞）の誘導を介して達成されるものであり得る。
　一つの態様において、本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法は、レチノイド代謝経路を阻害することにより、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞、特にセントラルメモリーＴ細胞の割合を増大させるものである。本明細書において、レチノイド代謝経路の阻害とは、レチノールやβ-カロテン等のビタミンＡ（レチノイド）またはプロビタミンＡ（レチノイド前駆体）からレチノイン酸が生成される代謝経路中のいずれかの反応を阻害することをいう。本発明の一つの態様において、レチノイド代謝経路の阻害剤は、レチノールをレチナールへ変換する反応、レチナールをレチノイン酸へ変換する反応、β-カロテンをレチナールへ変換する反応、β-カロテンをβ-アポカロテナールへ変換する反応、およびβ-アポカロテナールをレチナールおよびレチノイン酸へ変換する反応のいずれか１つ以上を阻害するものである。
　本発明の一つの態様において、レチノイド代謝経路の阻害剤は、レチノイド代謝経路中のいずれかの反応を触媒する酵素（以下、「レチノイド代謝酵素」とも称する）、例えば、レチノールデヒドロゲナーゼ、レチナールオキシダーゼ、レチナールデヒドロゲナーゼ、β-カロテン-15,15'-モノオキシゲナーゼ1（BCMO1）、β-カロテンオキシゲナーゼ2（BCO2）等の発現または作用を阻害するものである。一つの好ましい態様において、レチノイド代謝経路の阻害剤はレチノールデヒドロゲナーゼの阻害剤であり、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列からなるレチノールデヒドロゲナーゼ１０（該酵素をコードするＤＮＡの配列を配列番号２として示す）またはそのホモログの阻害剤である。ここで、レチノールデヒドロゲナーゼ１０のホモログとは、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいは配列番号１のアミノ酸配列において１個または数個、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。
　本発明の一つの態様において、レチノイド代謝経路の阻害剤は、上記レチノイド代謝酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を生じさせる核酸分子、および該核酸分子を含むベクターのいずれかである。
　レチノイド代謝酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子は、通常、レチノイド代謝酵素をコードするｍＲＮＡを標的とし、該ｍＲＮＡの分解誘導または翻訳阻害等によって該代謝酵素の産生を抑制するものである。かかるＲＮＡ分子としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ等が挙げられる。好ましいＲＮＡ分子の例は、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡである。一つの態様において、遺伝子発現の抑制対象となるレチノイド代謝酵素は、レチノールデヒドロゲナーゼであり、特にレチノールデヒドロゲナーゼ１０である。一つの好ましい態様において、レチノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子は、配列番号２のヌクレオチド配列または該配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは９８％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡから転写されるｍＲＮＡを標的とし、レチノールデヒドロゲナーゼ１０の産生を抑制するものである。一つの好ましい態様において、該ＲＮＡ分子は、２本鎖部分のセンス鎖が配列番号３のヌクレオチド配列からなり、該２本鎖部分のアンチセンス鎖が配列番号４のヌクレオチド配列からなるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、特にｓｈＲＮＡである。
　上記ＲＮＡ分子を生じさせる核酸分子とは、該ＲＮＡ分子を直接的または間接的に生じさせる核酸分子を意味し、例えば該ＲＮＡ分子に対応するヌクレオチド配列を含むＤＮＡコンストラクトや組換えレトロウイルスＲＮＡが挙げられる。ここにいう「直接的」とは、例えばＤＮＡからの転写、または前駆体ＲＮＡのプロセシング（スプライシングやエディティング等）によって目的のＲＮＡ分子が生じる場合等を意味し、一方「間接的」とは、例えばＲＮＡからの逆転写によりＤＮＡが生じ、次いで該ＤＮＡからの転写によって目的のＲＮＡ分子が生じる場合等を意味する。
　上記核酸分子を含むベクターは、目的のＲＮＡ分子の一過性発現（生産）をもたらす「発現ベクター」であってもよく、ＤＮＡ配列の染色体への組み込みによって目的のＲＮＡ分子の安定的発現（生産）をもたらす「形質転換ベクター」であってもよい。本発明において用い得るベクターの種類としては、プラスミドベクター、ＤＮＡウイルスベクター、ＲＮＡウイルスベクター等が挙げられるが、動物細胞、例えばヒト細胞において使用可能なベクターである限り、これらに限定されない。例えば、所望のＲＮＡ分子およびプロモーターのヌクレオチド配列を含むＲＮＡコンストラクトを包含するレトロウイルスベクターを細胞に感染させると、該ＲＮＡコンストラクトに対応するＤＮＡコンストラクトが逆転写によって生成され、該ＤＮＡコンストラクトが該細胞の染色体中に組み込まれ、該組み込まれたＤＮＡコンストラクトから該所望のＲＮＡ分子が転写される。
　レチノイド代謝酵素の作用を阻害する化合物は、低分子化合物であってもよく、高分子化合物であってもよい。該高分子化合物としては、例えば、レチノイド代謝酵素に結合する抗体およびその抗原結合性断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等）ならびにＳｃＦｖ等が挙げられる。レチノイド代謝酵素の作用を阻害する低分子化合物は、例えば該酵素の活性に対する阻害作用を指標とした化合物ライブラリーからのスクリーニング等、当該技術分野における公知の方法によって取得することができる。レチノイド代謝酵素に結合する抗体、その抗原結合性断片、ＳｃＦｖ等もまた、酵素を抗原として用いる動物免疫やファージディスプレイ等、当該技術分野における公知の方法によって取得することができる。
　一つの態様において、レチノイド代謝酵素の作用を阻害する化合物は、レチノールデヒドロゲナーゼの作用を阻害する化合物であり、好ましくはレチノールデヒドロゲナーゼ１０（配列番号１）の作用を阻害する化合物（以下、「ＲＤＨ１０阻害剤」とも称する）である。一つの態様において、ＲＤＨ１０阻害剤は、以下の式（Ｉ）で表される構造を有する化合物またはその塩である：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 ［式中、ＲはＨまたはＣＨ３であり、
ＺはＨＯ－またはＨＯＯＣ－Ｙ－ＣＯＯ－であり、
Ｙは－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ＝ＣＨ－またはフェニレン基である］。
　好ましい態様において、式（Ｉ）中のＺはＨＯＯＣ－Ｙ－ＣＯＯ－である。より好ましくは、Ｙは－ＣＨ＝ＣＨ－またはフェニレン基である。
　また、式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられ、ナトリウム塩が好ましい。
　好ましくは、ＲＤＨ１０阻害剤は、ＲＤＨＩ－００１、ＲＤＨＩ－００２、ＲＤＨＩ－００３、ＲＤＨＩ－００４、ＲＤＨＩ－００５、ＲＤＨＩ－００６、ＲＤＨＩ－００７、ＲＤＨＩ－００８、ＲＤＨＩ－００９、ＲＤＨＩ－０１０およびＲＤＨＩ－０１１からなる群より選択される１種以上の化合物である。
　より好ましくは、ＲＤＨ１０阻害剤は、ＲＤＨＩ－００１、ＲＤＨＩ－００２、ＲＤＨＩ－００３およびＲＤＨＩ－００４からなる群より選択される１種以上の化合物である。
　さらに好ましくは、ＲＤＨ１０阻害剤は、ＲＤＨＩ－００１、ＲＤＨＩ－００２およびＲＤＨＩ－００３からなる群より選択される１種以上の化合物である。
　ＲＤＨＩ－００１～ＲＤＨＩ－０１１は、それぞれ以下の式で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　本発明において、レチノイド代謝酵素のドミナントネガティブ変異体タンパク質を、レチノイド代謝経路の阻害剤として用いることもできる。該ドミナントネガティブ変異体タンパク質は、例えば、レチノイド代謝酵素の変異体タンパク質を作成し、基質との結合能を有するが本来の触媒作用を有さないものを選択すること等により取得可能である。また、酵素の機能部位を解析することにより、所望の変異体タンパク質の作成および選択工程を効率化することができる。
　レチノイド代謝経路の促進剤または阻害剤は、いわゆるＳＢＤＤ（Structure-Based Drug Design）の手法によって取得することもできる。例えば、レチノールデヒドロゲナーゼ１０等のレチノイド代謝酵素を精製し、結晶化し、Ｘ線解析により立体構造を決定し、その立体構造に基づいて該レチノイド代謝酵素に結合する化合物をデザインし、該化合物の活性を試験することによって、レチノイド代謝経路の促進剤または阻害剤として機能する化合物を同定することができる。
レチノイン酸シグナル伝達系およびその阻害剤
　レチノイン酸シグナル伝達系とは、レチノイン酸（以下、「ＲＡ」とも称する）が、細胞の核内のレチノイン酸受容体（以下、「ＲＡＲ」とも称する）と結合することにより生じるシグナル（例えば、レチノイン酸応答配列を有する遺伝子の転写調節等）の伝達系をいう。一つの態様において、本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法は、かかるシグナル伝達系を阻害することにより、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞、特にセントラルメモリーＴ細胞の割合を増大させるものである。一つの好ましい態様において、本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法は、レチノイン酸シグナル伝達系を阻害することにより、Ｔ細胞集団におけるＣＤ４陽性メモリーＴ細胞の割合を増大させるものである。
　レチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤としては、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイン酸受容体のドミナントネガティブ変異体タンパク質、レチノイン酸受容体をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を生じさせる核酸分子、および該核酸分子を含むベクター等が挙げられる。一つの好ましい態様において、該阻害剤はレチノイン酸受容体アンタゴニストである。
　レチノイン酸受容体アンタゴニストとしては、ＬＥ５４０、ＬＥ１３５、ＬＥ５５０、ＢＭＳ１９５６１４、ＭＭ１１２５３、ＡＧＮ１９４３１０、Ｒｏ４１－５２５３、ＡＧＮ１９３１０９、ＣＤ２６６５、ＢＭＳ４９３等の化合物およびそれらの類似体もしくは誘導体、ならびにレチノイン酸とレチノイン酸受容体の結合を遮断する抗体等が挙げられる。一つの好ましい態様において、レチノイン酸受容体アンタゴニストは、ＬＥ５４０、ＬＥ１３５、ＢＭＳ１９５６１４およびＭＭ１１２５３ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群より選択される１種以上の化合物である。ＬＥ５４０、ＬＥ１３５、ＬＥ５５０、ＢＭＳ１９５６１４、ＭＭ１１２５３、ＡＧＮ１９４３１０、Ｒｏ４１－５２５３、ＡＧＮ１９３１０９、ＣＤ２６６５およびＢＭＳ４９３は、それぞれ以下の式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　レチノイン酸受容体アンタゴニストとして作用する上記以外の化合物は、レチノイン酸やＬＥ５４０等と類似の構造を有する化合物のライブラリーからのスクリーニング等、当該技術分野における公知の方法によって取得することができる。
　本発明において、レチノイン酸受容体のドミナントネガティブ変異体タンパク質を、レチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤として用いることもできる。該ドミナントネガティブ変異体タンパク質は、例えば、レチノイン酸受容体の変異体タンパク質を作成し、レチノイン酸との結合能を有するが、シグナルを生じさせないものを選択すること等により取得することができる。また、受容体の機能部位を解析することにより、所望の変異体タンパク質の作成および選択工程を効率化することができる。
　本発明の別の態様において、レチノイン酸受容体をコードする遺伝子（ＲＡＲ遺伝子）の発現を抑制するＲＮＡ分子を、レチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤として用いることができる。ＲＡＲ遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子は、通常、ＲＡＲをコードするｍＲＮＡを標的とし、該ｍＲＮＡの分解誘導または翻訳阻害等によってＲＡＲの産生を抑制するものである。かかるＲＮＡ分子の種類としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ等が挙げられる。好ましいＲＮＡ分子の例は、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡである。
　例えばヒトにおいては、レチノイン酸受容体としてＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲγの３種のサブタイプが知られており、それぞれについて複数のアイソフォーム（バリアント）が報告されている。例えば、ＲＡＲαについてはＮＰ＿０００９５５、ＮＰ＿００１０１９９８０およびＮＰ＿００１１３８７７４、ＲＡＲβについてはＮＰ＿０００９５６およびＮＰ＿０５７２３６、ＲＡＲγについてはＮＰ＿０００９５７、ＮＰ＿００１０３６１９３、ＮＰ＿００１２３０６６１、ＮＰ＿００１２３０６５９およびＮＰ＿００１２３０６６０（いずれもＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のアクセッション番号で示す）のアミノ酸配列からなるアイソフォームが知られており、本明細書においては、これらのアイソフォームをコードするＤＮＡの配列をそれぞれ配列番号５～１４として示す。したがって、一つの好ましい態様において、ＲＡＲ遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子は、配列番号５～１４のいずれかのヌクレオチド配列または該配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上もしくは９８％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡから転写されるｍＲＮＡを標的とし、ＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲγのうち１種以上の産生を抑制するものである。
　また、ＲＡＲ遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子を（直接的または間接的に）生じさせる「核酸分子」および該核酸分子を含む「ベクター」の定義および例示については、「レチノイド代謝酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子」を生じさせる核酸分子および該核酸分子を含むベクターについて上述した内容と同様である。
レチノイン酸シグナル伝達系の促進剤
　一つの態様において、本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法は、レチノイン酸シグナル伝達系を促進することにより、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させるものである。例えば、ナイーブＴ細胞にレチノイン酸シグナル伝達系の促進剤を作用させることにより、効率的に該Ｔ細胞を分化させ、メモリーＴ細胞を増加させることができる。したがって、一つの態様において、本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法は、レチノイン酸シグナル伝達系の促進剤を、ナイーブＴ細胞を含むＴ細胞集団に添加することにより、該Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させるものである。かかる態様において、レチノイン酸シグナル伝達系の促進剤を添加するＴ細胞集団におけるナイーブＴ細胞の割合は、好ましくは２０％以上、例えば３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上である。レチノイン酸シグナル伝達系の促進剤を添加するＴ細胞集団は、ナイーブＴ細胞のみからなるものであってもよい。
　レチノイン酸シグナル伝達系の促進剤としては、レチノイン酸受容体アゴニスト、レチノイン酸受容体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子等が挙げられ、好ましくはレチノイン酸受容体アゴニストである。一つの好ましい態様において、レチノイン酸受容体アゴニストは、レチノイン酸、特にオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）である。別の好ましい態様において、レチノイン酸受容体アゴニストは、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ＬＥ５１１、ＡＭ５８０、ＡＣ５５６４９およびＣＤ４３７ならびにそれらの類似体および誘導体からなる群より選択される１種以上の化合物である。オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ＬＥ５１１、ＡＭ５８０、ＡＣ５５６４９およびＣＤ４３７は、それぞれ以下の式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　レチノイン酸受容体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子は、例えばレチノイン酸受容体を過剰発現させてレチノイン酸シグナル伝達系を促進するために、発現ベクター等の当該技術分野において公知の手法を用いてＴ細胞に導入することができる。
癌／感染症の予防／治療補助剤
　本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤は、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を有効成分として含むものである。該代謝経路またはシグナル伝達系の調節（阻害または促進）により、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合が増大する。一つの好ましい態様において、本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤は、免疫療法、特に癌抗原ペプチドを用いる免疫療法による癌の治療効果を増大させるものである。癌免疫療法に用いる癌抗原ペプチドとしては、これらに限定されないが、各種のＷＴ１ペプチド、例えばヒトＷＴ１３３２（配列番号１５、国際公開２０１２／０４６７３０号等に記載）、ＭＡＧＥ－Ａ４２７８－２９９（配列番号１６）、サバイビン９７－１１１（配列番号１７）、ならびにそれらと同等の活性を有する変異ペプチド等が挙げられる。
　また、レチノイド代謝経路またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節（阻害または促進）は、メモリーＴ細胞の割合の増大のみならず、Ｔ細胞の数自体の増加をももたらす。したがって、レチノイド代謝経路またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤は、感染症の予防（例えばワクチン）および治療（例えば免疫療法）における補助剤としても有効である。
　また、レチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤（例えばＲＡＲアンタゴニスト）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を増強させ得る。したがって、レチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤は、癌または感染症の治療、特に癌または感染症の免疫療法における補助剤として有効である。
　本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤の適用対象となる癌は、特に限定されず、癌腫、肉腫、造血器腫瘍等を含む。一つの好ましい態様において、該補助剤の適用対象は、ＷＴ１遺伝子を発現する各種の癌ないし腫瘍、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、ならびに胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、脳腫瘍などの固形癌ないし固形腫瘍である。
　本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤の適用対象となる感染症は、特に限定されない。これは、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤により、Ｔ細胞数の増加とメモリーＴ細胞割合の増大を介して、感染症の種類を問わず強い免疫がもたらされるためである。一つの態様において、該補助剤の適用対象は、細菌、ウイルス、原生動物等による感染症であり得る。
免疫力増強剤
　上述の通り、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤は、メモリーＴ細胞の割合の増大およびＴ細胞の数自体の増加をもたらす。したがって、該調節剤は、非特異的に対象の免疫力を向上させる免疫力増強剤の有効成分として用いることができる。
　本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤、癌免疫療法補助剤および免疫力増強剤は、有効成分であるレチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤以外に、例えば、担体、賦形剤などを含んでいてもよい。本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤、癌免疫療法補助剤および免疫力増強剤の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法としては、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤、癌免疫療法補助剤および免疫力増強剤に含まれる上記有効成分の量、該補助剤および増強剤の剤形、投与回数などは、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。
Ｔ細胞集団の作成方法
　本発明のＴ細胞集団作成方法は、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤をＴ細胞集団へ添加することにより、通常用いられるＴ細胞の培養法と比較してメモリーＴ細胞の割合が増大したＴ細胞集団を得るものである。該方法において、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤のＴ細胞集団への添加は、インビトロまたはインビボで行い得るものであるが、好ましくはインビトロで行われるものである。インビトロにおける添加の例としては、Ｔ細胞集団を培養している培地へ該調節剤を添加することが挙げられる。インビボにおける添加の例としては、対象の体内へ該調節剤を投与することが挙げられる。
　本発明のＴ細胞集団作成方法によって作成されるＴ細胞集団は、種々の疾患、好ましくは癌または感染症の予防および／または治療、特に癌または感染症の免疫療法において、該予防および／または治療の効果を増大させるために使用することができる。
治療方法およびキット
　本発明の癌／感染症の予防／治療方法および癌／感染症の予防／治療用キットは、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤と、癌または感染症の予防および／または治療、特に癌または感染症の免疫療法における他の有効成分とを併用するものである。かかる有効成分としては、例えば、癌抗原、感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、これらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞等が挙げられる。
　癌抗原とは、癌細胞または腫瘍細胞特異的に発現する表面抗原（いわゆる腫瘍特異抗原）および該抗原の部分ペプチドを意味し、例えば癌遺伝子ＷＴ１の産物であるＷＴ１タンパク質、該タンパク質の部分ペプチドであるＷＴ１３３２等のＷＴ１ペプチドが挙げられる。感染症の病原体としては、細菌、真菌、ウイルス、原生動物等が挙げられる。病原体の抗原としては、細菌、真菌、ウイルス等の表面に発現するタンパク質、糖タンパク質および糖鎖等、ならびに細菌または真菌の細胞壁およびその構成成分（リポ多糖など）が挙げられる。抗原もしくは病原体により刺激または活性化される免疫細胞としては、抗原提示細胞（例えば樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞）、および該抗原提示細胞によって活性化されるＴ細胞等が挙げられる。
　本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤、癌免疫療法補助剤および免疫力増強剤は、種々の疾患、好ましくは癌または感染症の予防および／または治療、特に癌または感染症の免疫療法における有効成分と併用し得る。かかる有効成分としては、上記した癌抗原、感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、これらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞等が挙げられる。
　本発明のメモリーＴ細胞割合増大方法、癌／感染症の予防／治療補助剤、癌免疫療法補助剤、免疫力増強剤、癌／感染症の予防／治療用キット、癌／感染症の予防／治療方法、感染症予防／治療方法および免疫力増強方法を適用し得る対象は、免疫系、特に獲得免疫系を有する動物、即ち脊椎動物であれば特に限定されない。かかる対象としては、例えばヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジー等が挙げられる。一つの好ましい態様において、かかる対象はヒトである。
　本発明の癌／感染症の予防／治療方法、感染症予防／治療方法および免疫力増強方法において、対象に投与するレチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤の有効量、ならびに癌抗原、感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、またはこれらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞の有効量は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて、また、当業者に周知の方法（各種の非臨床および／または臨床試験を含む）を用いて、適宜決定することができる。本発明の癌／感染症の予防／治療方法、感染症予防／治療方法および免疫力増強方法において用い得る癌抗原、感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、これらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞の例は、上述した通りである。
　なお、本発明の癌／感染症の予防／治療補助剤、癌免疫療法補助剤、免疫力増強剤、Ｔ細胞集団作成方法、癌／感染症の予防／治療用キット、癌／感染症の予防／治療方法、感染症予防／治療方法、および免疫力増強方法においても、「メモリーＴ細胞割合増大方法」に関して記載した各種のレチノイド代謝経路の阻害剤、レチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤、およびレチノイン酸シグナル伝達系の促進剤を、レチノイド代謝経路またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤として用いることができる。
　以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
実施例１
ｓｈＲＮＡによるレチノールデヒドロゲナーゼ１０の発現抑制
　レチノールデヒドロゲナーゼ１０を標的とする、配列番号１８に示す配列からなるｓｈＲＮＡ（ＲＤＨ１０標的ｓｈＲＮＡ）を発現させるためのコンストラクトを、ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞に導入した。具体的には、レンチウイルスベクターのシステムを用い、クローニングサイトに配列番号１９のヌクレオチド配列からなるＤＮＡを組み込んだベクターと、パッケージングベクターとをパッケージング細胞（２９３Ｔ細胞株）に共トランスフェクトし、生成された組換えウイルスをヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞に感染させた。染色体へのｓｈＲＮＡ発現コンストラクトの組み込みは、ｓｈＲＮＡ発現コンストラクトの下流に存在するＧＦＰの発現をレポーターとして確認した。かかる方法によりＲＤＨ１０標的ｓｈＲＮＡを発現させたＴ細胞集団においては、対照ｓｈＲＮＡ（配列番号２０）を同様の方法で発現させたＴ細胞集団と比較して、ターミナルエフェクター細胞（ＣＤ１２７－、ＣＤ６２Ｌ－）の割合が減少し、セントラルメモリー細胞（ＣＤ１２７＋、ＣＤ６２Ｌ＋）の割合が増大した（図２）。
　ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞に、レンチウイルスベクターを用いて上記のＲＤＨ１０標的ｓｈＲＮＡ（ｓｈ＃１０－２、配列番号１８）や、コントロールとしてルシフェラーゼを標的としたｓｈＲＮＡ（ｓｈ－ｌｕｃ、配列番号２０）を導入した。また、同様に、ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞にＲＤＨ１０遺伝子を組み込んだレンチウイルスベクターを導入することによりＲＤＨ１０高発現Ｔ細胞を作製した。
　これらの細胞を抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体およびＩＬ－２の存在下で、様々な濃度のレチノール（オールトランス型）とともに一週間培養し、細胞数の測定と共に細胞内サイトカインアッセイでＩＦＮ－γを産生する細胞の頻度を調べた。結果を図３に示す。
　レチノールの存在により、レチノール濃度依存的に細胞数およびＩＦＮ－γ産生細胞が増加した。一方、ＲＤＨ１０の発現抑制によって、それらの増加率が抑えられ、また過剰発現によって増強された。
　上述のＲＤＨ１０高発現Ｔ細胞（図４において＃１０と表記）およびコントロールベクター導入Ｔ細胞（図４においてｍｏｃｋと表記）をそれぞれ５×１０７個ずつ培養液とともに１０ｃｍの培養皿に入れ、３Ｈで標識されたオールトランスレチノールを１μＭの濃度で添加した。４時間、３７℃で培養したのち、細胞を回収し、ヘキサンを用いて細胞内のレチノイドを抽出した。抽出に用いたヘキサンを乾燥遠心により取り除いた後、濃縮されたレチノイドをアセトニトリルに溶解しＨＰＬＣを用いて分画を行い、各フラクションに含まれる３Ｈを液体シンチレーションカウンターで測定した。また、予め、標準サンプル（オールトランスレチノールおよびオールトランスレチナール）をＨＰＬＣで分離し、各標準サンプルがどのフラクションに分離されるか決定した。ＨＰＬＣの溶媒はアセトニトリル：５０ｍＭ酢酸アンモニウム＝７５：２５、分離カラムは Ｓｙｈｅｒｇｉ ４ｕ Ｈｙｄｒｏ－ＲＰ ８０Ａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を用いた。流速は１．５ｍｌ／分で行い、１分間毎のフラクションを作製した。結果を図４に示す。
　ＲＤＨ１０高発現Ｔ細胞では、オールトランスレチノールからオールトランスレチナールへの変換が促進されていた。
実施例２
レチノールデヒドロゲナーゼ１０ノックアウトマウスにおけるＴ細胞集団
（１）コンディショナルノックアウトマウスの作成
　ターゲティングベクターを用い、染色体上のレチノールデヒドロゲナーゼ１０（以下、ＲＤＨ１０とも称する）遺伝子が図５に示すコンストラクトＡで置換されたマウスを作成した。該マウスを、Ｆｌｐリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスと交配することにより、ＬａｃＺおよびｎｅｏ遺伝子が除去された遺伝子構造（図５のＢ：以下において、かかる構造を「ｆｌｏｘアレル」と称する）を有するマウスを作成した。こうして得られたｆｌｏｘアレルを有するマウスと、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスとを交配することにより、ＲＤＨ１０のエキソン２が除去された遺伝子構造（図５のＣ）を有するノックアウトマウスを得た。
（２）ノックアウトマウスにおけるレチノイド代謝
　上記の通りに作成したＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ　ｃｒｅ）およびコントロールマウス（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）の脾細胞よりセルソーターを用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。分離したＣＤ４＋Ｔ細胞は抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体およびＩＬ－２を用いて活性化および増殖させた後、それぞれ３×１０７個ずつ培養液とともに１０ｃｍの培養皿に入れ、３Ｈで標識されたオールトランスレチノールを１μＭの濃度で添加した。４時間、３７℃で培養したのち、細胞を回収し、ヘキサンを用いて細胞内のレチノイドを抽出した。抽出に用いたヘキサンを乾燥遠心により取り除いた後、濃縮されたレチノイドをアセトニトリルに溶解しＨＰＬＣを用いて分画を行い、各フラクションに含まれる３Ｈを液体シンチレーションカウンターで測定した。また、予め、標準サンプル（オールトランスレチノールおよびオールトランスレチナール）をＨＰＬＣで分離し、各標準サンプルがどのフラクションに分離されるか決定した。ＨＰＬＣの溶媒はアセトニトリル：５０ｍＭ酢酸アンモニウム＝７５：２５、分離カラムは Ｓｙｈｅｒｇｉ ４ｕ Ｈｙｄｒｏ－ＲＰ ８０Ａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を用いた。流速は１．５ｍｌ／分で行い、１分間毎のフラクションを作製した。結果を図６に示す。
　ＲＤＨ１０ノックアウトマウスでは、コントロールマウスと比較してオールトランスレチノールからオールトランスレチナールへの変換が抑制されていた。
（３）ノックアウトマウスにおけるＴ細胞サブセットの同定
　ＲＤＨ１０遺伝子座に関し野生型ホモ（ｗｔ／ｗｔ）、ｆｌｏｘアレル／野生型へテロ（ｆｌｏｘ／ｗｔ）またはｆｌｏｘアレルホモ（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）の遺伝子型を有するノックアウトマウスにＣｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスを交配して得られたマウス（以下、検定用マウスとも称する）において、ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌの発現を指標としてＴ細胞サブセットを同定した。その結果、ＲＤＨ１０ ｗｔ／ｗｔマウスに比して、ＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスおよびＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｗｔマウスでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の双方において、ＣＤ６２Ｌの発現が高いメモリー型Ｔ細胞の割合が増大していた（図７）。
（４）ノックアウトマウスにおけるメモリーＴ細胞の増加
　６－８週齢のＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス（ｆ／ｆ　ｃｒｅ）とコントロールマウス（ｆ／ｆ）の末梢リンパ節に存在するＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ６２ＬおよびＣＤ１２７発現をフローサイトメトリーで解析した。結果を図８に示す。ＲＤＨ１０ノックアウトマウスではＣＤ６２ＬおよびＣＤ１２７の発現が高く、メモリー型Ｔ細胞の割合が増大していることが示された。
（５）Ｔ細胞表面分子およびその転写因子の発現
　上記検定用マウスにおいてＴ細胞表面分子およびその転写因子の発現を調べたところ、ＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスでは、ＲＤＨ１０ ｗｔ／ｗｔマウスおよびＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｗｔマウスと比較して、メモリー型Ｔ細胞に特徴的な細胞表面分子（ＣＤ６２Ｌ（Ｓｅｌｌ）、Ｓ１ｐ１（Ｅｄｇ１）、Ｃｃｒ７、ＩＬ７ｒａ）およびその発現に関連する転写因子（Ｋｌｆ２、Ｆｏｘｏ１、Ｆｏｘｏ３、Ｅｔｓ１、Ｓｐ１、Ｉｒｆ１）の発現が高かった（図９）。
（６）リンパ器官の細胞数および該リンパ器官におけるＴ細胞数
　上記検定用マウスにおいてリンパ器官の細胞数および該リンパ器官におけるＴ細胞数を調べたところ、ＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスおよびＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｗｔマウスでは、ＲＤＨ１０ ｗｔ／ｗｔマウスと比較して、一次リンパ器官（胸腺）および二次リンパ器官（リンパ節、脾臓）の細胞数が増加しており、リンパ球の増殖が促進されていることが示唆された（図１０）。また、ＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスおよびＲＤＨ１０ ｆｌｏｘ／ｗｔマウスでは、ＲＤＨ１０ ｗｔ／ｗｔマウスと比較して、リンパ節および脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数およびＣＤ８＋Ｔ細胞数がともに増加していた（図１１）。
（７）リステリア菌感染症モデルを用いたＲＤＨ１０欠損Ｔ細胞の機能解析とメモリーＴ細胞形成の評価
［方法］
　ＯＴ－Ｉ ＴＣＲ遺伝子が導入され（トランスジェニック）、かつＲａｇ１遺伝子がノックアウトされたマウスから、ＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ　ｃｒｅ）、およびコントロールマウス（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）を作製した。また、両者のＴ細胞を区別するために、マーカー分子であるＣＤ４５．１およびＣＤ４５．２の２つの分子マーカーをＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウスに持たせた。一方、コントロールマウスにはＣＤ４５．１のみを持たせた。これらのマウスからＴ細胞（ＯＴ－Ｉ ＴＣＲのみを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞）を得て、１×１０４個ずつ１：１の比率で混合した後、ＣＤ４５．２のみを持つ野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）に尾静脈より投与した。
　翌日、ＯＴ－Ｉ ＴＣＲが認識するＯＶＡペプチドを発現する組換えリステリアモノサイトゲネス（ＬＭ－ＯＶＡ）を１×１０４ＣＦＵ感染させ、経時的に、移入したＴ細胞の比率の変化およびフェノタイプを脾臓およびリンパ節を摘出し解析した。
　また、メモリーＴ細胞の機能を評価するために、メモリー期である感染後３０日以上経ったマウスの脾臓およびリンパ節より、移入したＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス由来Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２＋）およびコントロールマウス由来Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２－）をＦＡＣＳソーターを用いて分離し、それぞれ１×１０４個ずつ別々の野生型マウスに移入した。翌日、ＬＭ－ＯＶＡを１×１０６ＣＦＵ感染させ（二次感染）、その５日後に脾臓および肝臓に存在するリステリア菌数と移入したＴ細胞の細胞数を解析した。
　上記の試験の概略を図１２に示す。
［結果］
　ＬＭ－ＯＶＡ感染後における、移入したＴ細胞の比率の変化およびフェノタイプを図１３～図１５に示す。脾臓およびリンパ節のいずれにおいても、コントロールマウス由来Ｔ細胞よりも、ＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス由来Ｔ細胞の比率が高かった（図１３）。また、ＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス由来Ｔ細胞では、コントロールマウス由来Ｔ細胞と比較して、メモリーＴ細胞（ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ１２７＋細胞）およびメモリー前駆エフェクター細胞（ＭＰＥＣ）（ＫＬＲＧ１＋ ＣＤ１２７＋細胞）の割合が高かった（図１４および１５）。
　二次感染後において、ＲＤＨ１０ノックアウトマウス由来のＴ細胞は、コントロールマウス由来のＴ細胞と比較して、強い増殖能と強いリステリア菌排除能を有していることが示された（図１６）。
　以上の結果から、ＲＤＨ１０ノックアウトマウスのＴ細胞は、メモリーＴ細胞をより多く産生し、かつ質的にもメモリー機能が高いことが確認された（図１７）。
（８）ビタミンＡ欠乏状態におけるＲＤＨ１０欠損の影響
　ＲＤＨ１０欠損Ｔ細胞のＣＤ６２Ｌ発現亢進が、ＲＤＨ１０によるビタミンＡ（レチノール）の代謝欠失が原因かどうかを解析するために、ＲＤＨ１０コンディショナルノックアウトマウス（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ　ｃｒｅ）およびコントロールマウス（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）にビタミンＡ欠乏食を４週間与えた。その後、リンパ節（腋窩＋鼠径）、腸間膜リンパ節、および脾臓のＴ細胞のＣＤ６２ＬおよびＣＤ１２７発現をフローサイトメトリーで解析した。結果を図１８に示す。ビタミンＡ欠乏状態ではＲＤＨ１０欠損Ｔ細胞におけるＣＤ６２ＬおよびＣＤ１２７の発現上昇は認められないことから、ＲＤＨ１０がビタミンＡの代謝を介してこれらの分子の発現を調節していることが明らかとなった。
実施例３
Ｔ細胞の分化促進および分化抑制
（１）レチノイン酸による分化促進
　ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を様々な方法（ＩＬ－２、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体およびＩＬ－２）で刺激し、ＤＭＳＯ（対照）またはオールトランスレチノイン酸の存在下で培養した（なお、以下の実施例において使用したレチノイン酸はすべてオールトランスレチノイン酸である）。その結果、レチノイン酸存在下で培養した細胞集団において、セントラルメモリー細胞（グラフ右上）の割合が減少し、ターミナルエフェクター細胞（グラフ左下）の割合が増加した（図１９）。かかる結果は、レチノイン酸によってセントラルメモリー細胞からエフェクターメモリー細胞、エフェクター細胞、ターミナルエフェクター細胞への分化が促進されることを示す。
（２）アポトーシス耐性
　ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）の存在下で８日間培養したヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を抗Ｆａｓ抗体（７Ｃ１１）で刺激し、アポトーシス細胞および生細胞の割合を調査解析した。その結果、レチノイン酸でＴ細胞の分化を促進させることにより、アポトーシス細胞が増加し、生細胞が減少した。一方、ＲＡＲアンタゴニストで分化を抑制すると、アポトーシス細胞が減少し、生細胞が増加した（図２０）。
（３）メモリーＴ細胞の分裂能および増殖能
　抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激し、ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）の存在下で８日間培養したヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体およびＩＬ－２、またはＩＬ－７で再刺激および培養し、分裂能および増殖能を評価した。分裂能の評価にはＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ(商標) Ｖｉｏｌｅｔ細胞増殖キット（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いた。その結果、レチノイン酸でＴ細胞の分化を促進させると分裂能および増殖能が共に低下する一方、ＲＡＲアンタゴニストで分化を抑制すると、分裂能および増殖能が共に増加することが判明した（図２１）。
（４）メモリーＴ細胞集団形成能
　抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激し、ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）の存在下で８日間培養したヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体およびＩＬ－２、またはＩＬ－７で７日間再刺激および培養し、Ｔ細胞サブセットを同定した。その結果、ＲＡＲアンタゴニストの存在下で培養したＴ細胞集団からは再びメモリーＴ細胞が高頻度に出現した一方、ＤＭＳＯおよびレチノイン酸存在下の培養においてはメモリーＴ細胞の出現頻度は低かった（図２２）。
　メモリーＴ細胞は多分化能と自己複製能を有している。この自己複製能により、メモリーＴ細胞が多く含まれる細胞集団は、分裂・増殖を繰り返しても、メモリーＴ細胞を高頻度に維持できる。そのため、ＲＡＲアンタゴニスト存在下で培養したＴ細胞集団は、メモリーＴ細胞を多く含むものとなる。
（５）マウス体内における再構築能
　抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激し、ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）の存在下で８日間培養したヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を、Ｔ細胞を除去したヒトＰＢＭＣと共に、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を欠損した免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）の体内に移入し、４週間後に脾臓におけるＴ細胞を解析した。その結果、ＲＡＲアンタゴニストの存在下で培養したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、免疫不全マウス体内での増殖能が高く、未分化であることが示された（図２３）。
実施例４
ＲＡＲアンタゴニストによるメモリーＴ細胞割合の増大
　ヒトＷＴ１３３２特異的ＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ヒトＷＴ１３３２で刺激し、ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）の存在下で培養した。その結果、ＲＡＲアンタゴニストの存在下で培養するとメモリー型ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が増大することが示された（図２４）。また、ＲＡＲアンタゴニストの存在下で培養されたＴ細胞集団を、ヒトＷＴ１３３２でパルスしたＰＢＭＣを用いて再刺激および培養したところ（Ｔ細胞：30,000細胞/ウェル、ＰＢＭＣ:100,000細胞/ウェル、ＩＬ－２:なし）、ＤＭＳＯまたはレチノイン酸存在下で培養した細胞よりも増殖能が高いことが示された（図２４）。
実施例５
ＲＡＲアンタゴニストによるメモリーＴ細胞の誘導
方法：
　単一細胞由来ヒトＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンに含まれるターミナルエフェクター分画を、ヒトＷＴ１３３２でパルスした樹状細胞で刺激し、ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）の存在下で７日間培養した。次いで、細胞をＣＦＳＥで標識し、ヒトＷＴ１３３２でパルスした樹状細胞で再刺激し、ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）の存在下でさらに培養した。４日または６日間の培養の後、ＦＡＣＳ解析および３Ｈチミジン取り込みアッセイ（細胞増殖アッセイ）を行った。試験の流れを図２５に示す。
結果：
　ターミナルエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞を１０μＭのＬＥ５４０の存在下で培養したところ、再度セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞が誘導された（図２６）。また、再刺激後の評価においても、ＬＥ５４０の存在下での培養により、分裂能および増殖能の高いメモリーＴ細胞が生じることが確認された（図２７）。
実施例６
癌免疫療法におけるＲＡＲアンタゴニストの効果
方法：
　ＷＴ１タンパク質およびルシフェラーゼを共に発現する腫瘍細胞を、ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌマウス（ＮＯＧマウス）の腹側皮下に移植した。移植の３日後、１０６個のヒトＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＧＦＰ陽性）を静脈注射した（０日目）。該静脈注射の８時間後に、ＤＭＳＯ（対照）、レチノイン酸またはＬＥ５４０を腹腔内に投与した。静脈注射の１日後に、ＣＤ３＋Ｔ細胞を除去し、ヒトＷＴ１３３２ペプチドをパルスしたヒト末梢血単核球２×１０６個を静脈注射した（１日目）。その後、生存期間を観察すると共に、毎週、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを投与し、ルシフェラーゼによって誘導される発光の強度を体外から測定することにより、腫瘍量を測定した。試験の流れを図２８に示す。
結果：
　マウスの生存曲線および腫瘍量の測定結果（２１日目）を図２９に示す。レチノイン酸投与群においては、対照よりも生存期間が短縮された。一方、ＬＥ５４０投与群では、対照よりも生存期間が延長された。また、ＬＥ５４０投与群では、ＤＭＳＯ群およびレチノイン酸群と比較して、有意に腫瘍のサイズが小さかった（０日目から何倍になったかで評価した）。かかる結果は、ＷＴ１ペプチド等の癌抗原ペプチド、癌抗原ペプチド特異的Ｔ細胞、または癌抗原ペプチドをパルスした抗原提示細胞等の投与による抗腫瘍効果が、ＲＡＲアンタゴニストの投与によって増強されることを実証するものである。
実施例７
種々のＲＡＲアゴニストおよびアンタゴニストによるＴ細胞集団の分化調節
方法：
　ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体およびＩＬ－２で刺激し、ＤＭＳＯを対照として、様々なＲＡＲアゴニスト（図３０）もしくはＲＡＲアンタゴニスト（図３１）存在下で８日間培養した。
結果：
　オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ならびにそれぞれＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲγの選択的アゴニストであるＡＭ５８０、ＡＣ５５６４９およびＣＤ４３７の存在下で培養した細胞集団のいずれにおいても、メモリーＴ細胞に特徴的な細胞表面分子であるＣＤ６２Ｌの発現が低下し、メモリーＴ細胞（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ１２７＋細胞）の割合が減少した（図３０）。
　一方、ＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲγの共通のアンタゴニストであるＬＥ５４０、ならびにそれぞれＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲγの選択的アンタゴニストであるＢＭＳ１９５６１４、ＬＥ１３５およびＭＭ１１２５３の存在下で培養した細胞集団のいずれにおいても、ＣＤ６２Ｌの発現が増加し、メモリーＴ細胞（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ１２７＋細胞）の割合が増大した（図３１）。
実施例８
ＲＡＲアンタゴニストによる細胞傷害活性の増強
方法：
　レンチウイルスベクターを用いてＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１（ＤＰ５）拘束性ＷＴ１３３２特異的ＴＣＲを発現させたＣＤ４＋Ｔ細胞（ＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞）を、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ＲＡＲアンタゴニスト（ＬＥ５４０）または対照としてのＤＭＳＯの存在下で、ＷＴ１３３２をパルスした末梢血単核球を用いて刺激し、培養した。培養開始から１１日後に、ＷＴ１を発現するがＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１を持たない白血病細胞株ＴＦ１（ＴＦ１はＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０２：０１およびＤＰＢ１＊０４：０１陽性）と、ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０５：０１を発現させたＴＦ１（ＴＦ１－ＤＰ５と表記）を標的細胞として、上記の３条件で培養したＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を測定した。
結果：
　ＴＦ１およびＴＦ１－ＤＰ５のいずれの標的細胞に関しても、ＲＡＲアンタゴニスト存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞の培養により、該ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害活性が増強された（図３２）。
実施例９
レチノールデヒドロゲナーゼ１０の低分子阻害剤
（１）ＲＤＨ１０タンパク質の検出
　２９３Ｔ細胞（１×１０６）、ＲＤＨ１０遺伝子を導入した２９３Ｔ細胞（１×１０６）、および活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０７）をＰＢＳでよく洗浄した後、６００μｌの０．２５Ｍスクロース・０．１Ｍリン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．４）に懸濁させた。細胞懸濁液をホモジナイズし、１０，０００ｇ、１０分、４℃の条件で遠心した後、上清を１００，０００ｇ、１時間、４℃の条件で遠心することでミクロソーム画分を得た。ミクロソーム画分は２０μｌの０．１Ｍリン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．４）に懸濁しウェスタンブロットに用いた。
　ミクロソーム画分に含まれるＲＤＨ１０タンパクは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した後、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、ブロッキングを行ったのち、一次抗体として抗ＲＤＨ１０抗体（ａｂ８７５８６）、二次抗体として抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ抗体と反応させ、Luminata Forte Western HRP Substrate（ミリポア社製）を用いて検出した。
　その結果、ＲＤＨ１０遺伝子導入２９３Ｔ細胞と活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のミクロソーム画分にＲＤＨ１０タンパクが含まれていることが確認できた（図３３）。
（２）ＲＤＨ１０の酵素活性の測定
　Reaction buffer（９０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）、４０ｍＭ ＫＣｌ）にオールトランスレチノール、ＢＳＡおよび補酵素としてＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）をそれぞれ終濃度１０μＭ、１０μＭおよび１ｍＭになるように加えた。この混合液を２００μｌずつシリコナイズドチューブに取り、２９３Ｔ細胞およびＲＤＨ１０発現２９３Ｔ細胞から分離したミクロソーム画分を１０μｌずつ別々のチューブに加え、３７℃で１５分間反応させた。反応を停止させるためにメタノールを２００μｌ加えたのち、ヘキサンを用いてレチノイドを抽出し、濃縮した。濃縮したレチノイドを１５０μｌのアセトニトリルに溶解後、ＨＰＬＣを用いて分離し、波長３５０ｎｍの紫外光吸収を検出することで、基質（オールトランスレチノール）と生成物（オールトランスレチナール）を検出した。また、予め、標準サンプル（オールトランスレチノールおよびオールトランスレチナール）をＨＰＬＣで分離し、各標準サンプルの保持時間を決定した。ＨＰＬＣの溶媒はアセトニトリル：５０ｍＭ酢酸アンモニウム＝７５：２５、分離カラムは Ｓｙｈｅｒｇｉ　４ｕ　Ｈｙｄｒｏ－ＲＰ　８０Ａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を用いた。流速は２．０ｍｌ／分で行った。
　その結果、２９３Ｔ細胞株由来ミクロソームではオールトランスレチノールからオールトランスレチナールが生成されなかったのに対し、ＲＤＨ１０遺伝子導入２９３Ｔ細胞株由来ミクロソームでは、オールトランスレチナールが生成された（図３４）。
（３）低分子阻害剤によるＲＤＨ１０の酵素活性の阻害
　Reaction buffer（９０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）、４０ｍＭ ＫＣｌ）にオールトランスレチノール、ＢＳＡおよび補酵素としてＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）をそれぞれ終濃度１０μＭ、１０μＭおよび１ｍＭになるように加えた。この混合液を２００μｌずつシリコナイズドチューブに取り、ＲＤＨ１０発現２９３Ｔ細胞から分離したミクロソーム画分を１０μｌずつ別々のチューブに加えた。それぞれのチューブにＤＭＳＯに溶解したＲＤＨ１０阻害剤（ＲＤＨＩ－００１～０１１）を終濃度２０μＭになるように添加し、また、コントロールのチューブにはＤＭＳＯを同量添加した。３７℃で１５分間反応させ、メタノールを２００μｌ加えたのち、ヘキサンを用いてレチノイドを抽出し、濃縮した。濃縮したレチノイドを１５０μｌのアセトニトリルに溶解後、ＨＰＬＣを用いて分離し、波長３５０ｎｍの紫外光吸収を検出することで、基質（オールトランスレチノール）と生成物（オールトランスレチナール）を検出した。また、予め、標準サンプル（オールトランスレチノールおよびオールトランスレチナール）をＨＰＬＣで分離し、各標準サンプルの保持時間を決定した。ＨＰＬＣの溶媒はアセトニトリル：５０ｍＭ 酢酸アンモニウム＝７５：２５、分離カラムは Ｓｙｈｅｒｇｉ　４ｕ　Ｈｙｄｒｏ－ＲＰ　８０Ａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を用いた。流速は２．０ｍｌ／分で行った。
　酵素活性は、反応していない基質（オールトランスレチノール）の波形面積に対する生成物（オールトランスレチナール）の波形面積として求め、コントロールにおける酵素活性に対する相対値をグラフにまとめた（図３５）。
（４）インビトロでのＲＤＨ１０阻害剤によるメモリーＴ細胞の増幅
　ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞（１×１０５／ウェル）を、抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍｌ）およびＩＬ－２（２０ ＩＵ／ｍｌ）の存在下で、ＤＭＳＯ（対照）またはＲＤＨ１０阻害剤（１０μＭ）と共に８日間培養した後、ＦＡＣＳ解析によりメモリーＴ細胞の頻度を求めた。
　その結果、ＲＤＨ１０阻害剤（ＲＤＨＩ－００１～００４）の存在下での培養により、メモリーＴ細胞（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ１２７＋）の頻度が増大することが示された（図３６）。また、メモリーＴ細胞の頻度に対するＲＤＨ１０阻害剤濃度の影響を図３７に示す。
（５）インビボでのＲＤＨ１０阻害剤によるメモリーＴ細胞の増幅
　ＲＤＨ１０阻害剤投与群およびコーン油投与コントロール群のＢ６マウスに、ＯＶＡタンパクを発現する組換えリステリアモノサイトゲネス（ＬＭ－ＯＶＡ）を尾静脈より１×１０５ｃｆｕ（コロニー形成単位）感染させ、ＲＤＨ１０阻害剤（２００μｇ／日）を感染の前日（ｄａｙ －１）から感染後７日目（ｄａｙ ７）まで連続投与した。経時的（感染後５、７、１０および１４日目）に尾静脈より採血し、末梢血に含まれるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をテトラマー法で解析した。かかる試験の概略を図３８に示す。
　解析の結果、ＲＤＨ１０阻害剤（ＲＤＨＩ－００１～００３）の投与により、メモリー型（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ１２７＋）のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が増大することが示された（図３９および４０）。
実施例１０
癌免疫療法におけるレチノールデヒドロゲナーゼ１０阻害剤の効果
方法：
　ＥＧ７腫瘍細胞（ＯＶＡタンパクを発現しているＥＬ４細胞）２×１０６個を皮下注射により、Ｂ６マウスの腹部の皮下に移植した（０日目）。移植後５日目に、移植細胞の生着率を上げるためにマウスに放射線（３Ｇｙ）を照射した後、ＯＴ－ＩＣＤ８＋Ｔ細胞（ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）２×１０５個を静脈注射した。次いで、移植後６日目、８日目および１０日目に、ＲＤＨ１０阻害剤（ＲＤＨＩ－００１、ＲＤＨＩ－００２、またはＲＤＨＩ－００３）１００μｇ／マウスを静脈注射した。コントロールとして、ＲＤＨ阻害剤の溶剤であるＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ ５０μｌ+ＰＢＳ １５０μｌ／マウス）を静脈注射した。腫瘍体積をノギスを用いて長径、短径および高さを測定し、長径×短径×高さ÷２の計算式を用いて継時的に測定した。実験の流れを図４１に示す。
　また、上記の腫瘍移植マウスに、ＯＴ－ＩＣＤ８＋Ｔ細胞を移入せず、移植の５日前、０日目および７日後に、ＲＤＨ１０阻害剤のみ（ＲＤＨＩ－００１、ＲＤＨＩ－００２、またはＲＤＨＩ－００３）１００μｇ／マウスを腹腔内注射した。コントロールとして、コーン油（１００μｇ／１００μｌ／マウス）を腹腔内注射した。上記と同様に、腫瘍体積を経時的に測定した。実験の流れを図４２に示す。
結果：
　マウスの経時的腫瘍体積の測定結果を図４３に示す。ＲＤＨ１０阻害剤　ＲＤＨＩ－００１、ＲＤＨＩ－００２、ＲＤＨＩ－００３の３種類とも、腫瘍の増殖を抑制した。実施例９（５）では、これらの阻害剤の投与で、移入したＯＴ－ＩＣＤ８＋Ｔ細胞（ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）がマウス末梢血で著増していた。一方、ＯＴ－ＩＣＤ８＋Ｔ細胞を移入せず、阻害剤のみの投与では、腫瘍増殖抑制効果は見られなかった（図４４）。よって、ＲＤＨ１０阻害剤による腫瘍増殖抑制効果は、ＯＴ－ＩＣＤ８＋Ｔ細胞の増幅を介して起こるものと考えられる。
　本発明により、レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を用いてＴ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させる方法、該調節剤を含む癌または感染症の予防および／または治療補助剤、該調節剤を含む免疫力増強剤等が提供される。これらは、医薬品等の分野、例えば、癌および感染症を含む種々の疾患の予防および／または治療のための医薬の開発および製造、ならびに該疾患の治療方法、特に免疫療法の開発等の分野において利用可能である。

Claims (15)

  1. 　レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤をＴ細胞集団に添加する工程を含む、Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させる方法。
  2. 　調節剤が、レチノイド代謝経路の阻害剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の阻害剤である、請求項１に記載の方法。
  3. 　阻害剤が、レチノールのレチナールへの変換、レチナールのレチノイン酸への変換、β-カロテンのレチナールへの変換、β-カロテンのβ-アポカロテナールへの変換、またはβ-アポカロテナールのレチナールおよびレチノイン酸への変換を阻害するものである、請求項２に記載の方法。
  4. 　阻害剤が、レチノールデヒドロゲナーゼ、レチナールオキシダーゼ、レチナールデヒドロゲナーゼ、β-カロテン-15,15'-モノオキシゲナーゼ１およびβ-カロテンオキシゲナーゼ２からなる群より選択される酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を生じさせる核酸分子、該核酸分子を含むベクター、該酵素の作用を阻害する化合物、または該酵素のドミナントネガティブ変異体タンパク質である、請求項２または３に記載の方法。
  5. 　阻害剤が、レチノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子であり、該ＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなる群より選択されるものである、請求項４に記載の方法。
  6. 　阻害剤が、レチノールデヒドロゲナーゼの作用を阻害する化合物である、請求項４に記載の方法。
  7. 　阻害剤が、レチノイン酸受容体アンタゴニスト、レチノイン酸受容体のドミナントネガティブ変異体タンパク質、レチノイン酸受容体をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を生じさせる核酸分子、または該核酸分子を含むベクターである、請求項２に記載の方法。
  8. 　調節剤が、レチノイン酸シグナル伝達系の促進剤である、請求項１に記載の方法。
  9. 　促進剤が、レチノイン酸受容体アゴニストである、請求項８に記載の方法。
  10. 　レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む、癌または感染症の予防および／または治療の補助剤。
  11. 　レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む、癌の免疫療法の補助剤。
  12. 　レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤を含む免疫力増強剤。
  13. 　レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤をＴ細胞集団に添加することにより、該Ｔ細胞集団におけるメモリーＴ細胞の割合を増大させる工程を含む、Ｔ細胞集団の作成方法。
  14. 　請求項１３の方法によって作成されるＴ細胞集団。
  15. 　（ａ）癌抗原、該感染症の病原体もしくは該病原体の抗原、またはこれらの抗原もしくは病原体により刺激または活性化された免疫細胞、および
    　（ｂ）レチノイド代謝経路の調節剤および／またはレチノイン酸シグナル伝達系の調節剤
    を含む、癌または感染症の予防および／または治療のためのキット。
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