JP2004506691A - 増殖亢進性障害の治療 - Google Patents
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Abstract
Description
(技術分野)
本発明は乾癬および癌を含む患者における細胞の増殖亢進に関わる疾患の治療に関する。本発明はまた光老化に関わる症状の治療または軽減にも関する。
【0002】
(背景技術)
乾癬、魚鱗癬、癌および皮膚ウィルス感染症を含む多くの疾患が細胞の増殖亢進に関わっている。乾癬はケラチノサイトの増殖亢進と分化障害を特徴とする慢性の炎症性疾患である。現在、乾癬の症状は、患者へのレチノイドの局所投与を含む多くの方法において治療されている。尋常性挫瘡および光老化のような他の疾患もまたレチノイド療法に応答し、別のレチノイド媒介機序が関与していると考えられている。
【0003】
レチノイドは癌の発症の治療および予防(例えば前骨髄球白血病の治療および腎臓移植患者における皮膚悪性疾患の発症の予防)の双方のために用いられている。
【0004】
現在のレチノイド治療は標的遺伝子を転写可能に調節しているビタミンAのカルボン酸誘導体(特にレチン酸、即ち内因的に活性な化合物)の作用に基づいている。レチン酸およびレチノイドへの曝露により細胞周期から離脱した細胞の増殖、および、恐らくは300を超える標的遺伝子のレチン酸誘発転写への応答としての分化が起こる。これは正常な細胞の運命の再プログラミングを示す「強制的」分化であり、指令的分化と考えることができる。レチノイドを用いた治療は乾癬、腫瘍の抑制において、および、光老化の症状の緩解において効果的であることがわかっている。
【0005】
しかしながら、レチノイド治療の有利な作用にも関わらず、その有利性は潜在的に重篤な副作用、例えば肝毒性、高脂血症、骨成長の抑制、皮膚刺激、光過敏症、脱毛症および催奇性のために限定的なものである(Kemmett and Hunter,1988,Hospital Update,March 1988,pp1301−1313)。これらの作用は治療応答を達成するために必要である薬理学的用量に関連している。今日まで、代替レチノイドおよびレチノイドを使用する方法の研究では、皮膚に対する副作用が極僅かに減少したのみである。
【0006】
従って本発明の目的はレチノイドの投与の副作用を回避する増殖亢進性障害および光老化に関わる疾患の治療方法を提供することである。
【0007】
(発明の開示)
本発明は、疾患を有する、または影響を受けている患者の細胞をレチノイドの薬理学的用量に曝露することなく、増殖亢進性細胞に対するレチノイドの望ましい生理学的作用、即ち増殖低減および/または分化増進、並びに光老化の作用を退行させる作用を模倣することが可能であるという予測できなかった発見に基づいている。このような薬理学的用量は後に記載する。
【0008】
本発明者等は、レチノイド治療のこのような生理学的作用が増殖亢進性細胞または光老化に罹患している細胞においてレチン酸の内因性の濃度を低減することにより達成されることを発見した。細胞におけるレチン酸の内因性濃度を低減することは、種々の方法、例えばレチノールを細胞に輸送するレチノール結合蛋白受容体(RBPr)の活性をブロックすることにより達成してよい。このようなブロッキングは患者にレチノール結合蛋白受容体の拮抗剤を投与することにより行なわれる。上記した拮抗剤は好ましくはレチノール結合蛋白とのレチノール結合蛋白受容体の相互作用を抑制することのできる薬剤を含む。拮抗剤はレチノール結合蛋白受容体およびレチノール結合蛋白の何れか一方、または、両方に結合することにより相互作用を抑制する。更に、レチン酸の生合成に関与する経路における酵素的に触媒された反応の何れかの抑制もまた細胞内のレチン酸の濃度を低減するために使用してよい。
【0009】
本発明の1つの特徴によれば、本発明者等は、増殖亢進性障害または光老化に罹患している患者の治療方法を提供し、該方法は、患者の細胞におけるレチン酸(RA)の内因性の濃度または活性を低下させることを含む。本発明の別の特徴および好ましい実施形態は独立および従属請求項並びに詳細な説明に記載する通りである。
【0010】
(発明を実施するための最良の形態)
本発明はレチン酸の薬理学的濃度への曝露をモチルことなくレチノイドの生理学的作用を模倣することにより、疾患組織の増殖亢進性細胞における増殖を低減し、および/または、分化を強制するための新しい方法に基づいている。本発明者等は、細胞内のレチン酸の内因性濃度を低減することは、同様に増殖も低減することを発見した。従って本発明の方法は一般的に、患者の細胞内のレチン酸の内因性濃度を低下させることに依存している。
【0011】
即ち、本発明者等は、細胞にとり込まれる予定の全身循環中のレチノールの細胞内蓄積に関与するレチノール結合蛋白受容体の活性をブロックすることは増殖を低減させることを発見した。加えて、レチノール結合蛋白受容体の活性をブロックすることは患者の細胞内の光老化の作用も低減する。即ち、1つの実施形態において、治療は例えばレチノール結合蛋白受容体の拮抗剤を患者に投与することにより、レチノール結合蛋白の取り込みを低減することで行われる。
【0012】
レチノール結合蛋白受容体は生理活性化合物であるレチン酸に変換されるレチノールの取り込みに関与している。従って、レチン酸の生合成を抑制すると、細胞は低減された増殖を示すのである。従って別の実施形態においては、レチン酸の内因性濃度が低減される。
【0013】
レチノールの取り込みまたはレチン酸の合成の低減を目標とすること以上の他の方法は、その作用が細胞内のレチン酸の内因性濃度を低減することである限り使用してよい。このような方法はレチン酸の合成を最終的にもたらす機序の如何なるエレメントの発現、活性または分解のモジュレーションも包含する。即ち、レチノール結合蛋白受容体の発現は例えば、レチノール結合蛋白受容体をコードするmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるか、または、このようなmRNAの転写のダウンレギュレーションによるか、または、mRNAの輸送、プロセシング、分解等のモジュレーションにより、ダウンレギュレートしてよい。レチノール結合蛋白受容体mRNAからのレチノール結合蛋白受容体の翻訳はまた、この蛋白の発現をダウンレギュレートすることにより調節してもよい。このようなダウンレギュレーションまたはモジュレーションは、例えば、転写または翻訳の抑制剤の使用により、当該技術で知られている方法を使用してよい。同様に、如何なるレチン酸合成酵素の発現、活性または分解は内因性レチン酸濃度の低減を達成するために調節してよい。
【0014】
2種以上の抑制剤の組み合わせ、例えばレチノール結合蛋白受容体をブロックすることとレチン酸合成酵素を阻害することの組み合わせを用いてよい。即ち、レチノール取り込みの抑制剤はレチノールデヒドロゲナーゼの阻害剤と共に、または、レチナールデヒドロゲナーゼの阻害剤と共に、または両者とともに投与してよい。更に、レチノールデヒドロゲナーゼの阻害剤はレチナールデヒドロゲナーゼノ阻害剤と組み合わせて使用してよい。このような複合療法は同時投与、逐次投与、例えばローテーション投与により行なってよい。
【0015】
本明細書に記載した方法および組成物は、内因性のレチン酸の濃度を、典型的にはその種における生理学的濃度程度、またはそれより低値にまで低減することにより機能する。一方、本明細書に記載した疾患の治療は典型的にはより高用量を用いてよい、遥かに高い用量のレチノイドを用いている場合が多い。本発明者等は今回、同じ治療作用がレチノイドのこのような薬理学的用量を投与することなく達成できることを発見した。
【0016】
「薬理学的用量」(または「用量」または「薬理学的範囲」や「薬理学的濃度」のような関連の形態)という用語は、従来のレチノイド療法において現在使用されているレチノイドの用量を意味する。このような用量は典型的には一日当たりキログラム体重当たりミリグラム数の範囲である。例えばイソトレチノイン(ロアキュタン)の経口用量はkg当たり1mgであり、体重70kgの人間では経口用量は4ヶ月間一日当たり70mgを一回となる。別の例として、アシトレチン(ネオチガソン)の用量は一日当たり25mgから50mgである。即ち、「薬理学的用量」とは、経口投与する場合は、一日当たりkg体重当たり0.1mgから1mgの用量と考えてよい。局所投与する場合は、局所用製剤中の全てのトランスレチン酸のようなレチノイドは、典型的には一日当たり一回0.025%の製剤で0.2gを投与する。従来の薬理学的用量を投与していた細胞中のレチン酸の濃度は典型的にはマイクロモル範囲であり、典型的には1.3から2.1マイクロモルであった(Formelli等、British Journal of Cancer 76:1655−1660,1997)。しかしながら、「薬理学的用量」とは1から2.5マイクロモル、または、0.5〜3マイクロモル、好ましくは、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5または5マイクロモルを指すと考えられる。
【0017】
一方、本発明の方法および組成物はレチン酸の内因性濃度を低減することに依存し、そして、薬理学的用量範囲より遥かに低いレチン酸の濃度に対して機能する。従って典型的には本明細書に記載した方法および組成物は、例えば、マイクロモル濃度未満、好ましくは、1.3マイクロモル濃度未満、最も好ましくはナノモル(1ナノモルから999ナノモル、好ましくは、900ナノモル未満、より好ましくは、800、700、600、500、400、300、200、100、50ナノモルまたはこれより低濃度)で、或いはサブナノモル濃度のレチン酸において機能する。
【0018】
好ましくは、内因性のレチン酸の濃度は本明細書に記載した方法により10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%またはこれ以上、低減される。
【0019】
方法によれば、レチン酸の濃度は本明細書に記載した治療や作用が奏効するためにはスイッチポイント付近で変動する。最も好ましくは、内因性レチン酸の濃度は「スイッチポイント」付近またはこれより低値にまで低減される。
【0020】
「スイッチポイント」とはその近辺での何れかの方向(即ち増大または減少)へのレチン酸の濃度の変化が細胞の分化または増殖の運命を変化させるような、細胞内におけるレチン酸の濃度である。スイッチポイントより高値のレチン酸の濃度は細胞に増殖を起こさせ、スイッチポイントより低値のレチン酸の濃度は細胞に分化を起こさせる。従ってスイッチポイントは、如何なる細胞または細胞型またはこの基準に従った疾患状態においても、当該技術で既知の、そして本明細書に記載した方法により測定してよい。
【0021】
正常な未罹患の細胞では、スイッチポイントは典型的には生理学的なレチン酸の濃度またはその近辺であり、上記のように、これは従来の薬理学的治療において使用されているレチン酸の濃度よりも低値である。正常細胞における生理学的なレチン酸濃度は約4×10−9モルから1×10−8モル(即ち、約4から10ナノモル)であり、従って、この範囲はスイッチポイントに対する作用可能領域としてとらえてよい。
【0022】
本発明の高度に好ましい実施形態においては、レチン酸の内因性濃度は10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%またはこれ以上、スイッチポイントよりも低減される。即ち、1つの実施形態において、方法および組成物は、該当する細胞、例えば、罹患細胞または罹患した個体の細胞内の内因性レチン酸濃度を約10ナノモル未満、好ましくは約4ナノモル未満、より好ましくは約1ナノモル未満、最も好ましくは約750ピコモル未満、約500ピコモル未満、約50ピコモル未満または約1ピコモル未満にまで低減することに依存している。
【0023】
好ましくは、内因性レチン酸の濃度は、スイッチポイント未満まで低減されるが、細胞死を回避できる程度の高濃度には維持される。
【0024】
内因性または細胞内のレチン酸濃度は当該技術で知られている種々の方法により試験してよい。例えば内因性核酸濃度は、レチン酸に対する抗体を用いて細胞を染色すること、そして、顕微鏡または蛍光活性細胞選別法により蛍光濃度を定量することにより測定してよい。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)またはガスクロマトグラフィーによる直接の分析も使用してよい。レチン酸濃度はまたレチン酸応答エレメント(RPE)に連結したlacZ発現βガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子を含むレポーター構築物の発現を試験することにより測定してもよい。このようなレチノイド感受性レポーター構築物の構築およびレポーター遺伝子活性を調べる試験は当該技術で知られており、そして例えばMendelsohn等のDevelopment 113:723−734,1991およびRossant等のGenes and Development 5: 1333−1344,1991に開示されている。
【0025】
本発明の方法および組成物の主な利点は細胞増殖の低減であるが、増殖亢進性細胞または光老化細胞の治療は付加的な利点として分化を誘導する。
【0026】
本発明の方法および組成物は乾癬および癌を含む種々の増殖亢進性障害の治療のために有用である。特に、本発明の方法および組成物は乾癬の治療に特に有用である。本発明はまた光老化または光損傷の症状の治療または軽減において有用である。しかしながら、皮膚増殖亢進性障害(後に詳述する)に罹患している患者の細胞、光老化または光損傷細胞、並びに癌細胞は、相互に多くの性質を共有している。例えば、紫外線照射に曝露された患者の細胞は光老化の症状を呈し、更にこれらの細胞は曝露の結果として基底細胞癌または扁平上皮癌のような種々の癌腫に進行する場合がある。
【0027】
一般的に、本明細書に記載した方法および組成物は増殖と分化との間に不均衡がある何らかの疾患に罹患している患者の症状を治療または軽減するために使用してよい。即ち、細胞の分化または増殖の運命を調節する正常な制御機能に障害がある如何なる症状等も治療してよい。このような疾患は、典型的には、通常であれば(即ち発達の段階または組織の型に応じて)増殖しないかしないはずであるような、または、相当する正常細胞または組織の型が分化した状態にある場合に分化することができないような、細胞または組織の型の増殖が関与している。特定の実施形態においては、方法および組成物は増殖亢進性障害、特に皮膚が罹患する増殖亢進性障害の治療等のために特に適している。光老化、新生物形成および癌もまた治療に適しており、その他の疾患および症状は以下に開示する通りである。
【0028】
本発明の方法は増殖亢進性細胞の増殖、好ましくはインビボの増殖の低減をもたらす。より好ましくは、細胞の集団の増殖は未投与の同様の集団と比較して90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%またははこれ未満にまで低減される。より好ましくは、増殖は0%まで低減され、即ち、細胞は完全に分裂を停止する。
【0029】
増殖の低減を調べる好ましい方法は、有糸分裂指数の測定による。「有糸分裂指数」とは、本明細書においては、有糸分裂および/または細胞分裂を起こしているある集団における細胞の比率を指すものとする。その他の試験、例えば細胞周期の時間の測定も可能である。
【0030】
本明細書においては、「増殖」という用語は組織の生育をもたらす細胞の分裂を意味するものとする。増殖性の細胞は活動的に分裂しており、DNA複製、有糸分裂、細胞分裂等のような細胞周期の過程を行なう。増殖を調べる種々の方法が知られており、例えば放射性ヌクレオチドトリホスフェート、トリチル化チミジン、ブロモデオキシウリジンなどで標識して有糸分裂中の細胞を可視的に調べることにより複製中の細胞を検出することができる。増殖はまた、Ki−67のようなマーか−の発現によるか、または、種々の条件下の培養細胞の直接の計数により細胞数の増大を調べることによっても試験してよい。
【0031】
「増殖亢進」とは、発達と機能のある段階において、細胞型の推測される増殖と比較した場合の増大した増殖を意味する。用語は、例えば応答が予測される刺激に応答した、集団内の細胞の一過性に増大した増殖は含まないものとする。例えば、組織が傷害を受け、組織の欠陥を修復するため、または死滅細胞の代替となるためにより多くの細胞が必要とされる場合に、組織中の細胞は増大した増殖を示すことが知られている。即ち、「増殖亢進」とは疾患またはその他の異常な状態における増大した増殖、例えば癌および乾癬の場合の増大した増殖を指すことを特に意図している。
【0032】
本発明の高度に好ましい実施形態においては、本発明者等の方法は投与した細胞の集団の一部または全てにおいて起こる細胞の分化をもたらす。未投与細胞集団と比較した場合に、好ましくは増殖亢進性細胞集団の10%以上が、本発明の投与後に分化を示す。より好ましくは、この比率は20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%またはこれ以上である。最も好ましくは、細胞集団の90%、95%または100%が分化を起こす。
【0033】
「分化」とは組織の非特殊の細胞が特定の機能のために特殊化される過程を指す。細胞の分化は例えば形態学的に、または、当該技術で既知の分化細胞方に特異的な蛋白マーカーの発現を試験することによるなど、種々の方法で試験してよい。例えばK1およびK10ケラチンは表皮ケラチノサイトの末端分化に関与するマーカーであり、細胞の分化が起こっている場合に発現が増大する。K1およびK10のほかに、例えばK5、K14、K16およびK17のようなたのケラチンのサブタイプも種々の分化段階に対するマーカーとして使用してよい。他の非ケラチンマーカー、例えばEGF受容体およびβ−1インテグリンもまた細胞分化のマーカーとして使用してよい。
【0034】
本発明者等は、細胞内部のレチン酸の濃度を低下することは、細胞にその正常な細胞運命を達成させる許容性の分化をトリガーすることを発見した。レチン酸の生理学的濃度は細胞の増殖と分化の両方を可能とするのに対し、極めて低い、または、薬理学的な濃度は細胞の分化をもたらす。従って、レチノール結合蛋白受容体(RBPr)を拮抗すること、および/または、レチン酸の合成を抑制することは、増殖亢進が疾患の病理生理学的な成分である何れかの疾患の治療の根拠として使用できる。即ち、本明細書に記載した方法はレチノイドの投与により治療できる何れかの疾患、即ち、レチノイド感受性障害の治療のために使用してよい。このようなレチノイド感受性障害は、典型的には、当該技術においては、患者細胞内部に生理学的濃度より高値のレチノイドが存在するように、患者にレチノイドを投与することにより治療される。このような障害の例は当該技術で知られており、乾癬、挫瘡、光老化、癌、急性前骨髄球白血病、乾癬、角化障害、例えば魚鱗線および角皮症、硬皮症、白斑、湿疹、尋常性挫瘡およびしゅさ性挫瘡、扁平苔癬、皮膚エリテマトーデス、前悪性症状、例えばメラノサイト性母斑、脊髄形成異常症候群等が包含される。
【0035】
本明細書に記載した方法により治療するのに適する別の種類の疾患は、応答エレメントの幾つかのクラス、例えばレチン酸受容体応答エレメント(RARE)、ビタミンD応答エレメント(VDRE)、パーオキシソーム増殖物質活性化受容体応答エレメント(PPAR)および甲状腺ホルモン受容体(TRE)応答エレメントおよびパーオキシソーム増殖物質活性化応答エレメント(PPAR)の何れかからの遺伝子の発現が関与する疾患を含む。その他の応答エレメントとしては、ニワトリ卵白アルブミン上流転写因子(COUP−FF)応答エレメントおよびapoAI調節蛋白−1(ARP−1)応答エレメントが包含される。即ち、本明細書に記載した方法はRARE応答遺伝子、VDRE応答遺伝子またはPPAR応答遺伝子またはTR応答遺伝子の異所性、過剰またはその他の異常な発現を特徴とする疾患に罹患した患者の症状を治療または軽減するために適している。レチノイド関与レチノイドX受容体はレチン酸受容体、ビタミンD受容体、甲状腺ホルモン受容体およびパーオキシソーム増殖物質活性化受容体と2量体を形成し、RXR2量体はこれらのホルモンのこのシグナリング機能のマーカーとして使用してよい。
【0036】
開示した原理によれば、細胞内の内因性レチン酸濃度をモジュレートすると細胞の増殖/分化の運命がシフトする。特に本発明者等は、RA濃度を低下させると増殖の停止、および/または、分化の開始が起こることを発見した。即ち、本発明の方法は一般的に、本明細書に記載した癌、腫瘍および他の皮膚増殖亢進性疾患を含む増殖と分化との間の不均衡を特徴とする如何なる疾患に罹患した患者の症状を治療または軽減するのにも適している。増殖と分化の間の不均衡とは、有糸分裂に関わる組織内の細胞の集団がその組織にとって正常である水準を超えて増大すること、または、有糸分裂に関わる組織内の細胞の集団がその組織にとって正常である水準よりも低値にまで減少すること、またはその双方を指す。不均衡を検出して試験する他の方法は本明細書の別の個所に記載する。
【0037】
本発明の実施においては、特段の記載が無い限り、当業者にとって可能な範囲内の化学、分子生物学、微生物学、組み換えDNAおよび免疫学の従来の方法を使用する。このような方法は文献に記載されている。例えばJ.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition,Books 1 −3,Cold Spring Harbor Laboratory Press; B.Roe,J.Crabtree,and A.Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques,John Wiley & Sons; J.M.Polak and James O’D. McGee,1990,In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M.J.Gait (Editor),1984,Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach,Irl Press;およびD.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Pressが参照される。これらの一般的テキストは参照として本明細書に組み込まれる。
【0038】
内因性レチン酸濃度の低減
1つの特徴において本発明は、増殖亢進性細胞が使用できるビタミンAの生理学的量、言いかえれば細胞に対するレチン酸の内因性濃度を低減することは、その最終的分化をもたらすことがわかったという事実に基づいている。
【0039】
図1はレチン酸の漸増濃度に対する、休止状態の増殖、分化または死滅(壊死をもたらす細胞毒性)により測定した、典型的な「正常(即ち罹患していない)」細胞の応答を示している。同様の応答が増殖亢進性細胞においても示される。本明細書の別の個所でより詳述する通り、細胞内のレチン酸の濃度はレチノールの取り込みに依存している。レチノールが細胞内にとり込まれる経路の1つはレチノールに結合してレチノール結合蛋白複合体からこれを取り込むレチノール結合蛋白受容体によるものである。細胞内のレチン酸の濃度はまた、本明細書の別の個所でより詳述する通り、レチン酸の整合性経路の活性に依存している。
【0040】
図1のC点はレチン酸の生理学的濃度より高い濃度を示す。この領域は乾癬および癌並びに光老化のような増殖亢進性障害のための現在の薬理学的治療を示している。初期の僅かなレチン酸濃度の上昇はそれ以上の細胞の増殖を誘発する。このあと、より高値のレチン酸濃度が急速に細胞毒性を誘発し、細胞死をもたらす。増殖と細胞毒性との間の遷移点は細胞の表現型が異所性レチン酸誘発遺伝子転写調節により本質的に攪乱された領域を定義している。この変化した表現型が現在の治療根拠である。端縁部の相違と恐らくは無作為な分布はこのレチノイド療法に関わっている毒性学的特徴を説明している。従って、レチン酸の薬理学的濃度を使用することは、薬理学的な治療濃度領域が毒性閾値に近接していることにより明らかにされるとおり、副作用による制約を受けている。
【0041】
一方、図1のB点はレチン酸の生理学的濃度を示している。この領域では細胞はビタミンAシグナル(即ちレチン酸)をプロセシングし、それが増殖状態に留まるべきか分化すべきかを決定するための根拠とする。本発明者等は細胞の分化を開始させるものはビタミンAシグナリングの低下であることを発見した。レチン酸の生理学的濃度は有意な細胞毒性とは関わっていないと考えられる。
【0042】
A点はレチン酸の生理学的濃度より低値の濃度を示している。このような濃度はビタミンA欠乏症(VAD)に関わっている。1つの特徴において本発明は、増殖を低減して細胞分化を増強するために、生理学的濃度より低値までレチン酸の内因性濃度を低下させること、並びにレチン酸シグナルを完全に枯渇させることを含む。
【0043】
図1でわかるように、その前後で増殖/分化の運命を切り換えることができる細胞内レチン酸濃度が存在する。この濃度は図1において「スイッチポイント」として示されている。スイッチポイントより高いレチン酸濃度では細胞は増殖を起こし、このスイッチポイントより低い濃度では細胞は分化を起こす。スイッチポイント濃度は、必然性はないものの、該当細胞のレチン酸の生理学的濃度とほぼ等しい。
【0044】
本発明の好ましい実施形態の方法は、特定の細胞のスイッチポイントより低値まで増殖亢進性細胞内のレチン酸の内因性または細胞内濃度を低減することにより、それが増殖を低減または停止し、そして場合によっては分化を起こすことができるようにすることに基づいている。好ましくは、レチン酸の内因性濃度は増殖を低減または停止させる程度、即ちスイッチポイント直下まで低下させるのみである。しかしながら上記した通り、細胞内のレチン酸濃度を更に低減して(即ちスイッチポイントより低値まで、例えばレチン酸のが完全な枯渇まで)上記目的を達成してもよい。
【0045】
このスイッチポイントは毒性を起こすレチン酸の濃度の近傍ではない。したがって、本発明の方法は細胞毒性および細胞死の副作用を有すると予測されない点において好都合である。
【0046】
細胞内のレチン酸濃度は当該技術で知られている種々の方法、例えばPappas RS,Newcombe ME. And Ong DE,Biology of Reproduction 48:235−247,1993に記載のとおり、試料のHPLCにより試験してよい。
【0047】
レチノイド類
本発明の1つの特徴によれば、有利な治療効果は細胞内の内因性レチン酸濃度を低減することにより達成される。本発明の方法は細胞の増殖亢進または光老化に関わる疾患の治療のために用いてよい。これらの疾患は従来は高濃度のレチノイドの投与によい治療されている。更に、本発明者等の方法はレチノイド感受性疾患に離間した患者の症状を治療または軽減するために適しており、そのようなレチノイド感受性疾患はレチノイドを投与することにより治療できる疾患である。このようなレチノイド感受性疾患は、患者に生理学的濃度より高い濃度のレチノイドを投与することにより治療されるか、その症状が軽減される障害である。
【0048】
上記した方法は好ましくは患者の細胞内のレチノール結合蛋白受容体の活性を抑制すること、および/または、患者の細胞内のレチン酸の生合成を抑制することを含む。
【0049】
「レチノイド」とはHead−to−tailの状態で連結されたイソプレノイド単位4個からなる化合物のクラスである。全てのレチノイドは形式的には炭素炭素2重結合5個および非環状部分の末端における官能基を含む単環の親化合物から誘導される。更に、例えばアロテノイドのようなレチン酸様活性を有する数種の合成化合物が最近開発されており、「レチノイド」という用語に包含される。本明細書においては、「レチノイド」という用語はビタミンA活性を有する天然の化合物、合成の類縁体、およびその種々の代謝産物を指す。
【0050】
多くのレチノイドが例えば読者が更に詳細な知識を得られるSporn,Roberts and Goodmanの2巻からなるThe Retinoids(Academic Press,N.Y.,1984)に記載されるとおり、同定されている。レチノイドの例としては、レチノール、酢酸レチニール、ヘキサデカン酸レチニール、α−レチニル、4,14−レトロレチノール、デオキシレチノール、アンヒドロレチノール、3,4−ジデヒドロレチノール、15,15−ジメhシルレチノール、レチニルメチルエーテル、リン酸レチニル、リン酸レチニルマンノシル、チオ酢酸レチノール、レチナール(レチンアルデヒド)、3,4−ジデヒドロレチナール、レチニリデンアセチルアセトン、レチニリデン−1,3−シクロペンタジオン、レチナールオキシム、レチンアルデヒドアセチルヒドラゾン、レチン酸、4−ヒドロキシレチン酸、4−オキソレチン酸、5,6−ジヒドロレチン酸、5,6−エポキシレチン酸、5,8−エポキシレチン酸、レチン酸の開鎖型C20類縁体(即ち、all−E−3,7,11,15−テトラメチル−2,4,6,8,10,12,14−ヘキサデカヘプタン酸)、7,8−ジデヒドロレチン酸、7,8−ジヒドロレチン酸、「Acid](E,E)−3−メチル−5−(2,6,6−トリメチル−2−シクロヘキセン−1−イル)−2,4−ペンタジ酸、「C17Acid」((E,E,E)−5−メチル−7−(2,6,6−トリメチル−1−シクロヘキセン−1−イル)−2,4,6−ヘパトリエン酸、「C22Acid」(14’−アポ−γ,psi−カロテン酸)、レチン酸エステル(例えばメチルエステル、エチルエステル等)、レチン酸エチルアミド、レチン酸2−ヒドロキシエチルアミド、メチルレチノン、「C18ケトン」6−メチル−8−(2,6,6−トリメチル−1−シクロヘキセン−1−イル)−3,5,7−オクタトリエン(ocatrien)−2−オン)等が挙げられる。
【0051】
「レチン酸」という用語はトレチノイン、ビタミンA酸およびビタミンA1酸、およびレチン酸の生物学的活性を有する誘導体として知られている化合物を含む。
【0052】
本明細書においては、「レチノール」という用語は、ビタミンAとしても知られている化合物(2E,4E,6E,8E)−3,7−ジメチル−9−(2,6,6−トリメチルシクロヘキサン−1−エン−1−イル)ノナ−2,4,6,8−テトラエン−1−オール、ビタミンAアルコール、ビタミンA1、ビタミンA1アルコール、アキセロフトールまたはアキセロールを含むものとする。用語には更に、レチノールの生物学的活性を定性的に示すレチノイド、並びに、レチノールの活性を有する上記化合物の如何なる誘導体も包含するものとする。
【0053】
これらの用語は、IUPAC−IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)版の1981 Recommendations on the Nomenclature of Retionidsに従った定義も参照できる。読者等は、G.P.Moss (Arch. Biochem. Biophys.,1983,224,728−731; Eur.J.Biochem.,1982,129,1−5; J.Biol. Chem.,1983,258,5329−5333; Pure Appl. Chem.,1983,55,721−726; Biochemical Nomenclature and Related Documents,2nd edition,Portland Press,1992,p.247−251)、および、http://www.chem.qmw.ac.uk/iupac/misc/ret.htmlを参照することができる。
【0054】
身体によるビタミンA(レチノール)の要求性は十分な食餌による摂取により満足されるべきである。ビタミンAは2種の供給源から、即ち、第1には動物性脂肪中のレチニルエステルとして、そして第2には植物原料中のβ−カロテンとして得られる。β−カロテンはカロテノイドとして知られる分子ファミリーの一員である。β−カロテンはまたビタミンAのプロビタミンA型とも称される。
【0055】
摂取されたβ−カロテンはβ−カロテンジオキシゲナーぜにより腸管内で分解される。レチナールは腸内のNADPH要求性酵素であるレチンアルデヒド還元酵素により還元されてレチノールになる。レチノールはエステル化されて主にパルミチン酸トなり、カイロミクロンを介して血中に供給される。カイロミクロン残渣の肝による取りこみにより残存物箱の臓器に供給され、肝細胞または星状細胞内で脂質エステルとして保存される。肝から肝外の組織へのレチノールの輸送は、加水分解されたレチノールがレチノール結合蛋白(RBP)に結合することにより起こる。次いで、レチノール−レチノール結合蛋白複合体がゴルジ内の細胞表面にまで輸送され、分泌される。
【0056】
次に、レチノールに結合したレチノール結合蛋白は標的臓器上の細胞表面受容体、特にレチノールの細胞取りこみを調節しているレチノール結合蛋白受容体に対して相互作用を示す。細胞レチノール結合蛋白(CRBP)は細胞により取りこまれた如何なるレチノールとも結合できる。CEBPは、レチノールをその生物活性代謝産物であるレチン酸(RA)に変換するレチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼのような酸化酵素にまでレチノールを輸送する。
【0057】
レチン酸合成の第1の律速的なステップではレチノールデヒドロゲナーゼによるレチノールからレチナールへの酸化が行なわれる。即ち、ミクロソーム短鎖レチノールデヒドロゲナーゼ(RDH)酵素のファミリーはレチノールからレチナールへの酸化を触媒することがわかっている。このような酵素にはRoDH1、RoDH2、RoDH3、RoDH4、CRAD1、CRAD2、RDH5およびretSDR1が包含される。これらの酵素の基質嗜好性および発現ドメインは多様であり、ヒト皮膚内で最も生理学的に存在していると考えらえる酵素はRoDH4(GenBank受託番号AF086735; Juruokovski等、1999.,Mol. Genet. Metab. 67(1),62−73,1999)である。シトゾル性の中鎖アルコールデヒドロゲナーゼノファミリー、即ちADH1、ADH2およびADH4もまたレチノールからレチナールへの酸化にとって重要であることが示唆されている。
【0058】
RAが生成されるための最終ステップはALDH1、ALDH6、RALDH2およびALDH−tを含むレチナール出発物質の調製(RalDH)と呼ばれるシトゾル性酵素のファミリー煮より媒介される。ヒト皮膚中で最も可能性が高い生理学的酵素はRALDH2である。2種のRalDHがRA合成のために生理学的に重要であることがわかっている(RalDH1およびRalDH2):Haselbeck等、Distinct functions for Aldh1 and Raldh2 in the Control of Ligand Production for Embryonic Retinoid Signaling Pathways(胚レチノイドシグナリング経路のためのリガンド生成の制御におけるAldh1およびRaldh2に対する異なる機能)。Developmental Genetics 25:353−364,1999。RDHと同様、RalDHの基質嗜好性と発現ドメインも多様である(Neiderreither等)。胚レチン酸合成は早期のマウスの着床後発生に必須である(Nature genetics 21:444−448,1999)。
【0059】
上記した酵素の受託番号はRoDH4(XM006765)、ADH1(XM052368)、ADH2(M32657)、ADH4(XM052361)、ALDH1(NM000689)、ALDH6(U07919)、RALDH1(XM030472)、RALDH2(NM003888)、RDH5(XM006732)およびretSDR1(AF061741)である。
【0060】
細胞内ではレチノールおよびレチン酸の両方が特異的受容体蛋白、即ちレチン酸受容体(RAR)およびレチノイドX受容体(RXR)に結合している。結合の後、受容体−ビタミン複合体は生育および分化に関与している数種の遺伝子における特異的配列と相互作用し、これらの遺伝子の発現に影響する。即ち、RARおよびRXRは遺伝子内のレチン酸応答エレメント(RARE)と層後さ王するヘテロダイマーを形成し、その転写をモジュレートする。
【0061】
レチン酸生合成の抑制
本発明の1つの特徴によれば、細胞内の内因性レチン酸濃度はレチン酸の整合性を妨害することにより低減される。即ち、生来のレチノイド代謝経路を内因性レチノイド濃度低減および本明細書に記載した有利な作用を達成する手段として標的設定する。内因性レチン酸濃度の低減は例えば何れかのレチン酸合成酵素の阻害によりレチン酸合成を抑制することにより達成してよい。典型的には、本発明者等は、レチノールデヒドロゲナーゼおよび/またはレチナールデヒドロゲナーゼの阻害剤はレチン酸の利用性を低下させ、そして細胞の増殖と分化の間の均衡に影響する遺伝子の発現を変化させることを開示する。
【0062】
生合成経路の何れかのステップはレチノールからレチナールへの酸化、レチナールからレチン酸への酸化並びに上流および下流のステップを含む抑制を目的としたものである。好ましくは、全RBPからのレチノールの細胞取りこみのような上流のステップを抑制する。更に、肝におけるレチノール結合蛋白の合成または肝からのレチノールの移出もまた抑制できる。内因性レチン酸濃度の低減はまたレチン酸の分解の調節により行なってもよい。例えば、CYP26のようなレチン酸を分解する代謝酵素をアップレギュレートすることによりレチン酸濃度を低減してもよい。
【0063】
レチン酸の受容体、例えば核受容体への結合は、例えばRAR/RXRの特異的拮抗剤の使用により標的設定されると考えられる。このようなRAR/RXR拮抗剤はWO94/14777,Yoshimura等、J,Med,Chem.38:3163−3173(1995)、Kaneko等、Med.Chem.Res.1:220−225(1991); Apfel等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7129−7133,Augusty 1992,Cell Biology; Eckhardt等、Toxicology Letters 70:299−308(1994); Keidel等、Molecular and Cellular Biology 14:287−298(1994);およびEyrolles等,J.Med.Chem.37:1508−1517(1994)に記載されている。これらのステップの何れも単独で、または相互に組み合わせて標的設定してよい。
【0064】
好ましい実施形態においてはレチン酸合成酵素の活性を拮抗するか阻害する。この表現は、レチン酸の生成または合成、または、レチン酸濃度の上昇を直接または間接的にもたらす如何なる経路に関与する如何なる酵素も指すものとする。
【0065】
如何なるレチノイド生合成ステップの拮抗剤または抑制剤の何れの物質も使用してよい。これにはレチン酸の生合成に関与する酵素に対する抗体、並びに競合的または非競合的な阻害剤が包含される。即ち、酵素の活性を妨害するような態様でレチノイドの合成経路における酵素の活性部位(或いは、実際は酵素の何らかの別の部分、好ましくは活性部位の近傍)に結合する分子を本発明の目的のために使用してよい。分子は小型の分子であって良く、または、ペプチド、例えば酵素に対するレチン酸のような天然の基質のフラグメントであってもよい。更に、分子はCRBPIまたはIIの酵素との相互作用を妨害することのできるペプチドであってもよい。このような分子の使用により、酵素の活性部位と相互作用または妨害することなく基質の供給を抑制できる。
【0066】
分子は酵素の知られた阻害剤であるか、または、当該技術で既知の手段により、例えば、酵素活性を妨害する化合物を求めて分子ライブラリ(例えばコンビナトリアルライブラリ)を検索することにより、同定してよい。
【0067】
更に、酵素機能破壊の他の手段、例えばアンチセンス核酸、例えばアンチセンスDNA、RNAまたはPNA(蛋白−核酸)を用いてもよい。レチノイド合成活性拮抗の他の手段は以下の「拮抗剤」に関する記述のセクションから得られる。
【0068】
レチノールデヒドロゲナーゼノ知られた阻害剤としては、カルベノキソロン、フェニラルシンおよびシトラールが挙げられる。短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ特異的阻害剤並びに中さアルコールデヒドロゲナーゼ特異的阻害剤の両方を使用してよい。これらの例は以下に記載する通りである。
【0069】
カルベノキソロンは0.5mM インビトロミクロソームにおいて使用され、このことはCloning & characterization of retinol dehydrogenase transcripts expressed in human keratinocytes (ヒトケラチノサイト中に発現されるレチノールデヒドロゲナーゼ転写産物のクローニングおよび特性化),Jurukovski V.,Markova N.G.,Karaman−Jurukovska N.,Randolph R.K.,Su J.,Napoli J.L.,Simon M. Mol Gen. Met. 67:62−73,1999に記載されている。55μMのIC50値がBoerman M.H.,Napoli J.L.により確立されており、Characterization of a microsomal retinol dehydrogenase: a short−chain alcohol dehydrogenase with integral and peripheral membrane forms that interact with holo−CRBP(type 1)(ミクロソームレチノールデヒドロゲナーゼノ特性化:全CRBP(1型)と相互作用する組込み型および周辺膜型の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ),Biochemistry 34:7027−37,1995を参照できる。
【0070】
フェニラルシンオキシドはBoerman M.H.,Napoli J.LのCharacterization of a microsomal retinol dehydrogenase: a short−chain alcohol dehydrogenase with integral and peripheral membrane forms that interact with holo−CRBP(type 1)(ミクロソームレチノールデヒドロゲナーゼノ特性化:全CRBP(1型)と相互作用する組込み型および周辺膜型の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ),Biochemistry 34:7027−37,1995の記載によれば5μMのIC50値を有している。
【0071】
シトラール(3,7−ジメチル−2,6−オクタジエナール)は20μMで使用され、このことはGough W.H.,VanOoteghem.,Sint T.,Kedishvili YのcDNA cloning and characterization of a new human microsomal NAD+−dependent dehydrogenase that oxidizes all−trans−retinol and 3α−hydroxysteroids (全てのトランスレチノールおよび3αーヒドロキシステロイドを酸化する新しいヒトミクロソームNDA+依存性デヒドロゲナーゼノcDNAクローニングおよび特性化),JBC 273:19778−85,1998に記載されている。シトラールは皮膚に対して局所投与する場合は11μMの濃度で使用され、このことはConnor M.J.,Smit M.H.のTerminal−group oxidation of retionl by mouse epidermis. Inhibition in vitro and in vivo(マウス表皮によるレチノールの末端基酸化、インビトロおよびインビボの抑制),Biochemical Journal 244:489−92,1987に記載されている。
【0072】
4−メチルピラゾールは0.2mMで使用して良く、このことはBaum等のFomepizole treatment of ethylene glycol poisoning in an infant(幼児におけるエチレングリコール中毒のフォメピゾール治療),Pedriatics 106:1489−1491,2000に記載されている。
【0073】
レチナールデヒドロゲナーゼの知られた阻害剤はシトラールおよびジスルフラムを含む。
【0074】
ジスルフラムは全マウス胚培養物中10−5Mで使用されており、このことはAntoniのThe role of retinoic acid during the early development of the vertebrate limb(脊椎動物の四肢の早期の発生の間のレチン酸の役割),M.Phil University of Sheffield,August 2000に記載されている。これは全てのレチナールデヒドロゲナーゼを阻害し、発生試験においてレチン酸合成防止するために使用されている(Stratford T.,Horton C.,Maden M.)。レチン酸はニワトリ四肢の出芽における発芽後成長の開始に必要である(Current Biology 6:1124−33,1996)。Xavier−Neto等のA retinoic acid−inducible transgenic marker of sino−atrial development in the mouse heart (マウス心臓における洞房発生のレチン酸誘導性トランスジェニックマーカー),Development 126:2677−2687,1999では、DMEM中1.33mgジスルフィラム/ gをe6.5で妊娠雌性マウスに皮下注射している。
【0075】
シトラールはRalDHIに対しては1μMのIC50、そしてRalDHIIに対しては12μmのIC50を有しており、このことはPenzes P.,Wang X.,Napoli J.L.のEnzymatic characterization of retinal dehydrogenase type 1 expressed in Escherichia coli(E.coli中で発現されるレチナールデヒドロゲナーゼ1型の酵素的特性化),Biochemica et Biophysica Acta.1342:175−81,1997; Chen H.,Juchau M.R.のBiotransformaiton of all−trans−retinal,13−cis−retinal,and 9−cis−retinal catalyzed by conceptual cytosol and microsomes(概念的シトゾルおよびミクロソームにより触媒される全トランスレチナール、13−シス−レチナールおよび9−シス−レチナールの生体内変換),Biochemical Pharmacology 53:877−85,1997に記載されている。
【0076】
当該技術で知られている他の適当な酵素阻害剤も使用してよい。
【0077】
レチノール結合蛋白および受容体
本発明の1つの特徴によれば、有利な治療効果は、細胞内の内因性レチン酸濃度を低減することにより、レチノール結合蛋白受容体をブロッキングすることにより、特にこの受容体によるレチノール結合蛋白の取り込みをブロッキングすることにより達成される。
【0078】
本明細書においては、「レチノール結合蛋白」とはレチノールの結合することができる蛋白を指し、特に、これは上記したレチノールの蛋白担体を指す。レチノール結合蛋白はまた「血漿中レチノール結合蛋白」としても知られている。特に用語は哺乳類レチノール結合蛋白、より好ましくはヒトレチノール結合蛋白をさすものとする。レチノール結合蛋白の例はGenBankデータベース由来の以下のものである。
【0079】
【0080】
高度に好ましい実施形態においては、レチノール結合蛋白はGenBank受託番号P02753(GI:132404)を有するヒトレチノール結合蛋白である。
【0081】
レチノール結合蛋白の研究はGoodman,Sporn等,The Retinols: 41−88 (Academic Press,1984)およびBlaner,1989,Endocrine Rev. 10 308−316(1989)に記載されている。レチノール結合蛋白は十分特性化された21KDaの蛋白であり、一次構造および三次構造の両方が知られている(Newcomer等、EMBO J3:1451−1454(1984); Rask等、FEBS Letters 104:55−58(1980))。
【0082】
レチノール結合蛋白は構造的にはリポカリンと称される小型の疎水性化合物の輸送に関わる多くの細胞外蛋白に関連している(Pervaiz等、FASEB J1:209−214(1987); Flower,1996,Biochem J.318 1−14(1996))。蛋白のリポカリン群のよく知られた構成員にはβ−ラクトグロブリン(Godovach−Zimmerman等、Hoppe−Seyler Biological Chemistry 366:431−434(1985))、アポリポ蛋白D(Drayna等、J.Biol.Chem.261:16535−16539(1986))、嗅覚結合蛋白(Lee等、Science 235:1053−1056(1987))および蛋白HC(Lopez等、Biochem.&Biophys. Res. Comm. 103:919−925(1981))が包含される。
【0083】
「レチノール結合蛋白受容体」とは上記のようにレチノール結合蛋白に結合することができる受容体を指す。
【0084】
ウシレチノール結合蛋白受容体のクローニングおよび配列決定についてはUS5,573,939号(受託番号I28766)および5,679,772号、並びにBavik等、1993,J.Biol.Chem.,268(27):20540−6(GenBank受託番号X66277)に開示されている。これらの文書はレチノール結合蛋白受容体に対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体の製造も記載している。
【0085】
Nicoletti等、1995,Hum.Mol.Genet.4(4),641−649はヒトレチノール結合蛋白受容体遺伝子(GenBank受託番号NM_000329)のクローニングと特性化を記載している。遺伝子はウシと98.7%の同一性を有する網膜色素上皮由来の61kDaの蛋白RPE65をコードしている。
【0086】
レチノール結合蛋白受容体のラット相同体はManes等,1998,FEBS Lett.423(2),133−137に記載されている。この文書はまたRT−PCRを用いたラットRPE65mRNAの発現パターンも記載している。配列はGenBank受託番号AF035673で寄託されている。
【0087】
レチノール結合蛋白受容体の組織分布はSmeland等、1995,Biochem J,305(Pt2):419−24.000に開示されている。ヒトレチノール結合蛋白受容体の単離はSivaprasadarao等、1994,Biochem J302 (Pt1):245−51に記載されている。Bavik等,1991,Journal Of Biological Chemistry/266:14978−14985はレチノール結合蛋白受容体活性の試験を記載している。ポリ(エチレングリコール)を用いた125I−レチノール結合蛋白−受容体複合体の優先的沈殿を用いたレチノール結合蛋白受容体の活性試験はSivaprasadarao等、1994(前出)に記載されている。
【0088】
好ましくは、レチノール結合蛋白受容体はケラチノサイト中に発現される哺乳類レチノール結合蛋白受容体である。このような受容体を同定しクローニングする方法は本明細書に記載されている。より好ましくは、哺乳類レチノール結合蛋白受容体は受託番号I28766、X66277、MN_000329、I28766(GI1819542)、X66277(GI563)またはNM_000329(GI4506590)を有する受容体の相同体である。
【0089】
核受容体および応答エレメント
本発明者等は、核受容体応答エレメント調節遺伝子の異所性、過剰またはその他の異常な発現を特徴とする、またはそれに関わる疾患に罹患した患者の症状を治療または軽減する方法を記載する。
【0090】
核受容体にはグルココルチコイド(GR)、アンドロゲン(AR)、鉱質コルチコイド(MR)、プロゲスチン(PR),エストロゲン(ER)、甲状腺ホルモン(TR)、ビタミンD(VDR)、レチノイド(RARおよびRXR)、パーオキシソーム(XPARおよびPPAR)およびイコサノイド(IR)に対する受容体が含まれる。従って核受容体応答エレメントは、レチン酸受容体応答エレメント(RARE)、ビタミンD応答エレメント(VDRE)、甲状腺ホルモン受容体応答エレメントまたはパーオキシソーム増殖活性化受容体(PPAR)応答エレメントが包含される。他の応答エレメントとしてはニワトリ卵白アルブミン上流転写因子(COUP−FF)応答エレメントおよびapoAI調節蛋白−1(ARP−1)応答エレメントが包含される。即ち、本明細書に記載した方法は本明細書の他の個所に記載したと下り、患者の細胞内のレチン酸(RA)の内因性の濃度または活性を低減することを含む。
【0091】
好ましくは、核受容体はレチノイドX受容体(RXR)とのヘテロダイマーとしてその同族体応答エレメントと相互作用するものである。即ち、好ましくは、核受容体は、好ましくはレチノイドX受容体とヘテロダイマーを形成し、AGGTCA結合部位2個が直列して配置されている応答エレメントを認識することのできるものである。好ましくは、結合および認識は応答エレメントに連結した遺伝子の遺伝子発現のモジュレーションを誘発することができる。応答エレメントは遺伝子の制御領域のいずれか、例えば、上流制御領域において、プロモーターまたはエンハンサーといったものであり得る。複合体による標的の選択は、結合部位間のスペーシングが同一性エレメントとして機能することを必要とする。
【0092】
従って、何れかの核受容体応答エレメント、好ましくは、上記した通り同定される核応答エレメントまたは受容体からの異所性発現、過剰発現または異常発現を特徴とするか、これに関わる何れかの疾患は本明細書に記載した方法および組成物により治療(または症状または状態の軽減)するのに適している。
【0093】
核受容体はホルモンまたはビタミンのような生理学的に該当する小型の分子に特異的に結合する蛋白のスーパーファミリーを構成する。核受容体への分子の結合の結果、核受容体は細胞がDNAを転写する能力を変化させ、即ち、核受容体はDNAの転写をモジュレートするが、それらは転写非依存性の作用を有してよい。組込み型膜受容体および膜結合型受容体とは異なり、核受容体は真核細胞の細胞質または核内の何れかに留まる。即ち、核受容体は細胞内の可溶性リガンド調節転写因子のクラスを含む。
【0094】
核受容体にはグルココルチコイド(GR)、アンドロゲン(AR)、鉱質コルチコイド(MR)、プロゲスチン(PR),エストロゲン(ER)、甲状腺ホルモン(TR)、ビタミンD(VDR)、レチノイド(RARおよびRXR)、パーオキシソーム(XPARおよびPPAR)およびイコサノイド(IR)に対する受容体が含まれる。いわゆる「オーファン受容体」もまた、それらがステロイドや甲状腺受容体のような古典的な核受容体に構造的に相同であることから、核受容体スーパーファミリーの一部である。
【0095】
一般的に、核受容体は高い親和性で生理学的に該当する小型の分子に特異的に結合し、そして、見かけのKd値は、核受容体/リガンド対に応じて、一般的に0.01nMから20nMの範囲である。
【0096】
核受容体スーパーファミリーの蛋白はかなりの領域のアミノ酸相同性を示す。核受容体ファミリーの構成員は三つのモジュールドメイン、即ち、1)可変アミノ末端ドメイン;2)高度に保存されたDNA結合ドメイン(DBD);および3)保存度のより低いカルボキシ末端リガンド結合ドメイン(LBD)からなる全体的な構造上のモチーフを示す。
【0097】
核受容体は種々のイソフォームで存在できる。例えば、サブファミリーの構成員は、例外もあるが、通常は単一の遺伝子によりコードされる受容体1個を有する。例えば、異なるAUGコドンからの交互開始により同じmRNAから翻訳される2種のPRイソフォームAおよびBが存在する。GR型は2種あり、その一方はリガンドに結合しない。甲状腺受容体は通常は遺伝子2種(アルファおよびベータ)によりコードされる幾つかの受容体を有するが、RAR、RXRおよびPPARの受容体は遺伝子3種(アルファ、ベータおよびガンマ)によりコードされる。交互RNAスプライシングもイソフォームを形成させる。
【0098】
核受容体応答エレメントは発現が核受容体により調節されている上流領域(プロモーターまたはエンハンサー)に存在する保存された配列である。このような応答エレメントは当該技術で知られており、その例は後に開示する。それらは実験的試験、相同性検索により、または、MOTIFプログラムのようなコンピュータープログラムを用いた該当遺伝子の上流配列の比較により同定してよい。このような応答エレメントを含む遺伝子の発現は特定の核受容体によりモジュレートされていると考えられる。本明細書に記載する方法はこのような核受容体応答エレメントが媒介するか関与している遺伝子の異常、異所性または過剰な発現に関わる疾患の治療に適している。このような疾患は、当該技術で既知の方法により、例えば罹患細胞の生化学的試験により、または、連結試験等により同定してよい。
【0099】
レチン酸応答エレメント
レチノイドは広範な種類の哺乳類細胞においてDNAの転写に影響する。レチノイドが転写活性に対するその作用を発揮する場合、細胞内レチノイド受容体が介在し、これは、へテロダイマーとして機能的リガンドと複合体を形成した場合には、特異的なレチノイド応答エレメントに結合し、そしてその後転写をモジュレートする。
【0100】
レチン酸の遺伝子転写に対する作用はレチン酸受容体(RAR)およびレチノイドX受容体(RXR)により媒介されることができる。Leed,M.等、Cell 53:377−395(1992); Mangelsdorf,D.J.等、Genes Dev. 6:329−344(1992)。RARは高い親和性でレチン酸(RA)に結合することがわかっているが、RXRは見かけ上はこのリガンドに対して親和性を有さない。Mangelsdorf,D.J.等、Nature 345:224−229(1990)。しかしながら、9−シスRAは高い親和性でRXR−αに結合できることがわかっている。Levin,A.A.等、Nature 355:359−361(1992); Heyman,R.A.等、Cell 68:397−406(1992)。
【0101】
RARおよびRXRは標的DNAの結合において高い水準の協同性を有することが解かっている。例えば、RARとRXRのヘテロダイマーは5ヌクレオチドのスペーサー配列(DR−5)により隔てられている6ヌクレオチドの直接リピート配列2個を有するDNA応答エレメントに結合し、そして転写活性を強力に刺激する(Kliewer等、1992,Nature 355:446−449)。
【0102】
レチン酸応答エレメント(RARE)の例は配列AGGTCA[5bpスペーサー]AGGTCAである。レチン酸応答エレメントの別の例は配列AGGTCA[2bpスペーサー]AGGTCAを有するDR−2RAREである。
【0103】
RXR−TRおよびRXR−RARヘテロダイマーは関連する応答エレメント(異なるスペーサーを有する)、すなわち、DR−4およびDR−5部位とそれぞれ結合することが解かった(Perlman等、1993,Genes Develop. 7:1400−1422;およびKurokawa等、1993,Genes Develop.,7:1423−1435参照)。更にまたRXR−RARヘテロダイマーは2ヌクレオチドのスペーサー配列により隔てられた6ヌクレオチドの直接リピート配列2個を有する関連DNA応答エレメント(DR−2)に結合することもわかった(Rhodes等、1993,Genes Develop. 7:913−932)。
【0104】
プロモーターがレチン酸応答エレメントを有する遺伝子のリストを付録Aに示す。このような遺伝子の発現はRAREによりモジュレートされる。このような遺伝子の過剰、異所性または他の異常な発現を特徴とするか、これに関わる疾患には、乾癬、挫瘡、光老化、急性前骨髄球白血病、乾癬、角化障害、例えば魚鱗線および角皮症、尋常性挫瘡およびしゅさ性挫瘡、扁平苔癬、皮膚エリテマトーデス、前悪性症状、例えばメラノサイト性母斑、脊髄形成異常症候群が包含される。このような疾患、およびその他のものは本明細書に記載の方法で治療するのに適している。
【0105】
ビタミンD応答エレメント
コンセンサスビタミンD応答エレメント(VDRE)は以下の配列、即ち、GGGTGA NNG GGGGCAを有する。別の例のビタミンD応答エレメントは配列AGGTCA[3bpスペーサー]AGGTCAである。
【0106】
プロモーターがビタミンD応答エレメントを有する遺伝子のリストを付録Aに示す。このような遺伝子の発現はVDREによりモジュレートされる。このような遺伝子の過剰、異所性または他の異常な発現を特徴とするか、これらに関わる疾患には、乾癬および他の疾患が包含され、そして本明細書に記載の方法により治療するのに適している。
【0107】
パーオキシソーム増殖物質活性化受容体(PPAR)応答エレメント
肝実質細胞中のパーオキシソームはパーオキシソーム増殖物質(PP)と称される構造的に多様な非突然変異性の化合物に応答して増殖する。三種のPPAR置換基タイプが種々の臓器において特異的な役割を有する。
【0108】
パーオキシソームの増殖の誘導は脂質の代謝および脂肪細胞の分化に関わる遺伝子の発現を調節する転写因子の群の一員であるPP活性化受容体アルファ(PPARアルファ)により媒介される。核受容体のこのファミリーの三種のアイソタイプ、即ち、PPARアルファ、PPARガンマおよびPPARデルタ(hNUC1またはベータとも称する)は個別の遺伝子の産物であることが解かっている。PPARアルファは肝で主に発現され、脂肪酸の代謝において重要な役割を演じる。PPARガンマは脂肪細胞中で主に発現される。PPARデルタは小腸、心臓および脂肪組織のような脂質代謝臓器において高濃度の発現を示す。これらの核受容体に対するリガンドである天然および合成の分子(抗高脂血症剤および糖尿病薬)はPPARの転写活性を制御する。PPARアルファはPP誘発多形質発現性応答の原因となるが、PPARガンマは脂肪生成と分化に関与していると考えられ、しかし、PPARガンマに関わる事象にはパーオキシソームおよびパーオキシソームの増殖は直接関与していない。
【0109】
PPARは9−シスレチン酸受容体(RXR)とヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子プロモーター上のPP応答エレメント(PPPE)に結合して誘導性転写活性を開始させる。複合体は調節された遺伝子のエンハンサー部位内の直接リピート−1応答エレメントと称される配列に結合し、リガンドとコアクティベーターの結合時に転写を活性化させる。
【0110】
PPへの組織および種の応答は薬物動態、PPARアイソタイプの相対的遍在性、標的遺伝子の上流領域におけるPPREの性質、PPARヘテロダイマー化の相手のレチノイドX受容体に対する核転写因子間の競合または妨害、および、PPARのリガンド依存性転写に対するコアクティベーターおよびコリプレッサーのモジュレート役割に応じて変動する。
【0111】
ステロイド受容体コアクティベーター−1(SRC−1)およびPPAR結合蛋白(PBP)はPPARコアクティベーターであることが解かっている。SRC−1およびPBPは共に核受容体へのコアクティベーターの結合のために必要かつ十分であるLXXLLシグネチャーモチーフを含んでいる。
【0112】
パーオキシソーム増殖物質活性化受容体(PPAR)応答エレメントは配列AGGTCA[1bpスペーサー]AGGTCAを有し、シクロオキシゲナーゼ(COX2)、シトゾル性ホスホリパーゼA2(CPLA2)、ミトコンドリア脂肪酸ベータ酸化酵素、ABCA1、ARE6、ARE7、GLUT2を含む遺伝子の発現の調節に関与している。PPAR応答エレメント媒介遺伝子の異常、異所性または過剰発現に関わる疾患の例は、アテローム性動脈硬化症、慢性関節リューマチ、炎症性腸疾患、肥満、高血圧、糖尿病、高脂血症、大腸癌である。
【0113】
甲状腺応答エレメント
甲状腺応答エレメントはコンセンサス配列5’−AGGTCA[4bpスペーサー]AGGTCA−3’を有し、コネキシン43、分極亢進活性化環状ヌクレオチドゲートチャンネル遺伝子(HCN2)、C/EBPアルファ、プロホルモン転換酵素(PC1)および(PC2)、プルキンエ細胞蛋白(Pcp−2)、カルビンジン、ミオ−イノシトールトリホスフェート(IP−3)受容体、ニューロトロフィン−3(NT−3)、神経生育因子(NGF)、脳由来好中球因子(BDNF)、ニューロトロフィン4/5、レーリン、神経細胞付着分子(NCAM)、テナシンーC、Srg1、ヘアレス、BCL−2、ミエリン塩基性蛋白(MBP)、プロ−アルファ(I)コラーゲン、未結合蛋白3(UCP3)、髄質甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(TRH)、ベータアミロイド前駆体蛋白(APP)、脂肪酸シンターゼプロモーター、リンゴ酸酵素、ステロイド受容体コアクティベーター−1(SRC−1)、ナトリウム、カリウムアデノシントリホスフェートアルファ3、アポリポ蛋白CIIおよびリポカリン型プロスタグランジンDシンターゼ(ベータ痕跡)等を含む種々の遺伝子の発現の調節に関与している。
【0114】
甲状腺応答エレメント応答遺伝子の異所性、過剰発現または異常発現に関わる疾患は、本明細書に記載した方法と組成物で治療されるが、これらには、甲状腺機能亢進症(正常値より高値のチロキシン)または甲状腺機能低下症(正常値より低値のチロキシン)の関わる如何なる疾患またはその顕在化状態も含むものとする。
【0115】
甲状腺機能亢進の顕在化状態(および甲状腺機能低下に関わる疾患)は興奮、不安、体重減少、下痢、頻脈および月経障害を含む。甲状腺機能低下症の顕在化状態(および甲状腺機能低下に関わる疾患)は痴呆症、鬱病、低温非忍容性、肥満、脱毛症、乾燥肌/湿疹、嗜眠症、徐脈/心ブロック、血液学的症状、例えば貧血、代謝低下、脂質代謝変化、便秘、グルコース非忍容性、および、月経攪乱を含む。これらの各々は本明細書に記載した方法および組成物により治療または軽減されるのに適している。
【0116】
甲状腺ホルモンシグナリングにより調節されるその他の機能/疾患には、心臓ペースメーキング、ホルモンのホメオスタシス、脳の発達、心筋の線維症、熱発生、自律神経性内臓機能およびアルツハイマー病が包含される。
【0117】
本明細書に記載した方法および組成物で治療される疾患にはCOUP−TR(ニワトリ卵白アルブミン上流プロモーター転写因子II)を含む他の応答エレメントについて過剰発現、異所性発現または異常発現の関与するものを含む。COUP−TRからのこのような発現の関わる疾患には、若年I型糖尿病後期発症(MODY1)が包含され、この応答エレメントの制御下にある遺伝子には幹細胞核因子1が包含される。ニワトリ卵白アルブミン上流プロモーター転写因子II応答エレメントは配列AGGTCA[1bpスペーサー]AGGTCAを有する。
【0118】
標的設定してよい他の核受容体は応答エレメントARP−1であり、これはCOUP−TR応答エレメントと同様または同一の配列を有する。ARP−1からの発現の関わる疾患には、閉塞性冠動脈疾患(CAD)が包含され、そして、その発現がこの応答エレメントに調節されている遺伝子にはアポリポ蛋白A1(apo A1)が包含される。
【0119】
拮抗剤
本発明の方法および組成物は、例えば、蛋白−受容体結合を妨害する薬剤を使用することにより、レチノール結合蛋白受容体の活性をブロックして増殖亢進性細胞の増殖を低減することに基づいている。このような薬剤は受容体機能の拮抗剤であってよい。更に、細胞内でのレチン酸の合成(前述)はレチン酸生合成に関与する酵素の適当な阻害剤または拮抗剤により抑制してよい。一般的に、細胞内のレチン酸の内因性濃度を低減することができる如何なる拮抗剤も本明細書に記載した使用に適している。
【0120】
「拮抗剤」という用語は、当該技術においては、一般的に、受容体に結合して生来のリガンドの作用を抑制する化合物を指す。しかしながら本明細書においては、この用語は受容体または酵素の活性を抑制するが必ずしもそれと結合するわけではない如何なる薬剤も広範に指すものとする。従って、酵素の受容体の発現、または、受容体または酵素の活性のモジュレーターの発現に影響する薬剤を含む。抑制される特異的活性は、リガンドの結合および/またはリガンドの取りこみのために、または、場合によっては酵素活性のために必要な如何なる活性であってもよい。レチノール結合蛋白受容体の拮抗剤は前記したとおり、レチノール結合蛋白の結合および/またはレチノールの取りこみ能力(好ましくはレチノール−レチノール結合蛋白受容体複合体の形態で)に影響する能力を有する。同様に、レチン酸合成酵素の拮抗剤はその酵素の酵素活性、即ち、レチノールデヒドロゲナーゼによるレチノールからレチナールへの変換またはレチナールデヒドロゲナーゼによるレチナールからレチン酸への変換、に影響する能力を有する。しかしながら一般的には本明細書に記載した方法において使用するのに適する拮抗剤はレチン酸の内因性濃度を低減することが究極的に可能であるものでなければならない。
【0121】
拮抗剤は受容体または酵素の結合部位1つ以上に結合して競合する。しかしながら、拮抗剤は結合部位または活性部位に直接結合する必要はなく、その結合が酵素または受容体と基質またはリガンドとの間の相互作用をブロックする限り、例えば隣接する蛋白や細胞上または細胞ないの他の実体に結合してよい。
【0122】
レチノール結合蛋白受容体の拮抗剤は未複合体化レチノール結合蛋白、または受容体に結合することができるそのフラグメントを含む。更に、生来、またはペプチド合成により生成されたレチノール結合蛋白受容体の全体またはフラグメントを用いてレチノール結合蛋白−レチノール複合体上の結合部位に対してレチノール結合蛋白受容体と競合させてよい。同様にレチン酸合成酵素の阻害剤は酵素に結合し、その活性を抑制することが可能なその基質のフラグメントを包含してよい。これに代えて、或いはこれに加えて、受容体蛋白、レチノール結合蛋白または他の蛋白に、例えば細胞表面上で結合することのできる免疫グロブリンも、それがレチノール結合蛋白に結合するレチノール結合蛋白受容体の能力および/またはレチノールの取りこみを妨害する限り、使用してよい。免疫グロブリンはモノクローナルまたはポリクローナル抗体であってよい。レチン酸合成に対抗する免疫グロブリン、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用してその活性を抑制してよい。
【0123】
拮抗剤はまた結合相互作用を妨害することのできるペプチドまたは他の小型分子を含む。拮抗剤の他の例は後に詳述するが、当業者には明らかである。
【0124】
例えば、Melhus等、Biochem Biophys Res Commun,210(1):105−12に記載の抗体をレチノール結合蛋白受容体拮抗剤として使用してよい。この文献はヒトレチノール結合蛋白に対するモノクローナル抗体(mAb)の生成と受容体結合を妨害するその能力の特性化を記載している。保存された領域2箇所に対するMabはレチノール結合蛋白受容体へのレチノール結合蛋白の結合を効果的にブロックした。ブロッキングmAbの1つはレチノール結合ポケットのエントランスループに相当する合成ペプチド(アミノ酸残基60〜70)に対して反応性を示している。
【0125】
レチノール−レチノール結合蛋白複合体に結合してこれを細胞内に輸送するレチノール結合蛋白受容体の能力をブロックすることはまた、増殖亢進性細胞中のレチノール結合蛋白受容体の発現濃度を低減することによっても達成される。例えば、細胞をアンチセンス化合物、例えば、後に上述する通り、レチノール結合蛋白受容体mRNAに対して特異的な配列を有するオリゴヌクレオチドで処理してよい。同様に、レチン酸合成酵素の活性は、アンチセンス化合物等を用いることにより酵素の発現を低減することによりブロックしてもよい。
【0126】
本明細書においては、一般的に、「拮抗剤」という用語は特に限定しないがある原子または分子のような薬剤を包含し、そしてその分子は無機または有機のものであって良く、生物学的なエフェクター分子、および/または、生物学的なエフェクター分子、蛋白、ポリペプチド、ペプチド、核酸、ペプチド核酸(PNA)、ウィルス、ウィルス様粒子、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドの合成類縁体、リボヌクレオチドの合成類縁体、修飾ヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、アミノ酸、アミノ酸類縁体、修飾アミノ酸、修飾アミノ酸類縁体、ステロイド、プロテオグリカン、脂質、脂肪酸または炭水化物であってよい。物質は溶液または懸濁液(例えば、結晶性、コロイド性または他の粒状形態)であってよい。薬剤は単量体、2量体、オリゴマー等の形態、またはその他、複合体であってよい。
【0127】
「拮抗剤」および「薬剤」という用語は、蛋白、ポリペプチドまたはペプチドを含むものとし、限定しないが例えば、構造蛋白、酵素、サイトカイン(例えばインターフェロンおよび/またはインターロイキン)、抗生物質、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはその作用性の部分、例えばFvフラグメント、ここでその抗体またはその部分は天然、合成またはヒト化されていてよいもの、ペプチドホルモン、受容体、シグナリング分子または他の蛋白;前記した核酸、限定しないが例えばオリゴヌクレオチドまたは修飾されたオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、cDNA、ゲノムDNA、人工または天然の染色体(例えば酵母人工染色体)またはその部分、RNA、例えばmRNA、tRNA、rRNAまたはリボチーム、またはペプチド核酸(PNA);ウィルスまたはウィルス様粒子;修飾されているか未修飾のヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはその合成の類縁体;非ペプチド(例えばステロイド)ホルモン;プロテオグリカン;脂質;または炭水化物を含む。小型の分子、例えば無機および有機の物質でポリペプチドの活性部位に結合してこれを占有することにより正常な生物学的活性が生じないように、基質が接触不可能な触媒部位を形成するものもまた包含される。小型分子の例は小型ペプチドまたはペプチド様分子であるが、これらに限定されない。
【0128】
拮抗剤または薬剤はレチノール結合蛋白受容体またはレチン酸合成酵素を分解するプロテアーゼであってよい。プロテアーゼの例としては、アミノペプチダ−ゼM、カルボキシペプチダーゼP、カルボキシペプチダーゼY、カスパーゼ1、4、5、カスパーゼ2、3、7、カスパーゼ6、8、9、キモトリプシン、因子Xa、ペプシン、TEV、トロンビン、トリプシン等である。
【0129】
試験
本発明はまたレチノール結合蛋白受容体の拮抗剤を同定するための化合物のスクリーニング法を提供する。候補化合物は種々の原料、例えば細胞、細胞非含有調製物、化学物質ライブラリ、ペプチドおよび遺伝子のライブラリ、および天然産物の混合物から同定される。この様にして同定された拮抗剤または阻害剤は、可能である場合はレチノール結合蛋白受容体の天然または修飾された基質、リガンド、受容体、酵素などであってよく;またはそれらの構造的または機能的な摸倣物であってよい(Coligan等、Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)参照)。
【0130】
スクリーニング法は単に、候補化合物に直接または間接的に会合している標識を用いて、レチノール結合蛋白受容体への、または、レチノール結合蛋白受容体またはその融合蛋白を担持している細胞または膜への候補化合物の結合を測定するものであってよい。或いは、スクリーニング方法は標識された競合物質を用いた競合試験を含んでいてよい。更に、これらのスクリーニング方法は、受容体を担持する細胞にとって適切である検出系を用いて、レチノール結合蛋白受容体の活性化または抑制により生じるシグナルを候補化合物が与えるかどうかを調べる試験であってよい。
【0131】
例えば、レチノール結合蛋白受容体を発現する細胞または膜調製物を対象としている化合物に接触させる。次に、レチノール結合蛋白受容体との相互作用の後に、応答、即ち細胞の増殖をもたらす化合物の能力を測定する。結合するが応答を示さない化合物は、その化合物を拮抗剤として同定している。拮抗剤化合物はまた結合して逆の応答をもたらす、言いかえれば、増殖の低下および場合によっては分化の促進をもたらすものである。
【0132】
活性化の抑制剤は一般的に既知アゴニスト(本明細書では、レチノールーレチノール結合蛋白複合体)の存在下に試験し、そして候補化合物の存在によるアゴニストによる活性化への作用を観察する。レチノール結合蛋白受容体の活性の抑制を候補化合物がもたらすかどうかを試験することによりアゴニストまたは抑制剤の非存在下に、逆アゴニストまたは抑制剤を探すスクリーニング法においては構成的に活性なポリペプチドを使用してよい。更に、スクリーニング法は単に、レチノール結合蛋白受容体を含有する溶液と候補化合物を混合して混合物を調製し、レチノール結合蛋白に結合するその能力が低減されたかどうかを調べるステップを含んでよい。Fc部分およびレチノール結合蛋白受容体から形成されたもののような融合蛋白もまた、レチノール結合蛋白受容体機能について拮抗剤を同定するための高スループットのスクリーニング試験のために用いてよい(D.Bennett等、J.Mol.Recognition,8:52−58(1995);およびK.Johanson等、J.Biol.Chem.,270(16):9459−9471(1995)参照)。
【0133】
本発明はまたレチノール結合蛋白とレチノール結合蛋白受容体の間の相互作用を抑制することのできる化合物を同定するための方法を提供する。方法はレチノール結合蛋白の存在下に候補化合物にレチノール結合蛋白受容体を接触させること、および、受容体に結合しているレチノール結合蛋白の濃度が低減されているかどうか調べることを含む。レチノール結合蛋白に結合できるレチノール結合蛋白受容体のフラグメントも使用してよい。
【0134】
細胞内のレチン酸の内因性濃度を低下させることのできる化合物に関する試験もまた提供される。このような試験は、レチノール−レチノール結合蛋白複合体の存在下に候補化合物にレチノール結合蛋白受容体を発現する細胞を接触させること、および、外細胞中のレチン酸の濃度が接触の結果として低下したかどうかを調べることを含む。
【0135】
本発明は更に内因性レチン酸濃度を低減することのできる化合物を同定する方法を提供する。方法は候補化合物に細胞を接触させること、および、細胞内のレチン酸濃度が低減したかどうかを調べることを含む。更に、化合物にレチノールデヒドロゲナーゼを発現する細胞を曝露すること、および、細胞内のレチナールの濃度が低減したかどうかを調べることを含む方法を用いてレチノールデヒドロゲナーゼの阻害剤を同定してよい。化合物にレチナールデヒドロゲナーゼを発現する細胞を曝露すること、および、細胞内のレチン酸の濃度が低減したかどうかを調べることを含む方法を用いてレチナールデヒドロゲナーゼの阻害剤を同定してよい。
【0136】
試験およびスクリーニングの方法は、例えばライブラリの形態の、多くの候補化合物を使用してよい。コンビナトリアルなライブラリもまた使用してよい。ライブラリ、標的酵素等を例えば当該技術で既知のアレーの形態で固相上に固定化してよい。
【0137】
「コンビナトリアルなライブラリ」という用語は、本明細書においては、無作為に選択されたサブユニットからなる化学物質の複数の種の収集物である。レチノール結合蛋白受容体に結合するか、レチノール結合蛋白受容体に拮抗するか、または細胞内の内因性レチン酸濃度を低減することのできるリガンドまたは分子があるかどうか、コンビナトリアルなライブラリをスクリーニングしてよい。
【0138】
化学物質の種々のコンビナトリアルなライブラリが現在使用可能であり、例えば、蛋白分解および非蛋白分解性の酵素に対して活性なライブラリ、G蛋白結合受容体(GPCR)のアゴニストおよび拮抗剤のライブラリ、非GPCR標的(例えばインテグリングリン、イオンチャンネル、ドメイン相互作用、核受容体、および転写因子)に対して活性なライブラリ、および、全細胞癌および抗感染標的のライブラリが挙げられる。コンビナトリアルなライブラリ、とりわけその効性および使用に関する総括的な説明は、Dolle and Nelson (1999),Journal of Combinatorial Chemistry,Vol.1,No.4,235−282に記載されている。
【0139】
化学物質のコンビナトリアルなライブラリ、その製造および使用に関するその他の参考文献は、URL http://www.netsci.org/Science/Combichem/から入手可能であり、例えば、Eli Lillyの1部門であるSphinx PharmaceuticalsのMichael R.Paviaの分子多様性の化学的発生(1995発表);コンビナトリアル化学:将来のための戦略−MDM Informaiton Systemsはそのプロジェクトライブライの役割が多様性ライブラリの管理において役割を有することを論じており(1995年7月発表);糸口の発見とSARの旨適化における固相コンビナトリアル化学,Adnan M.M.Mjalli and Barry E. Toyonaga,Ontogen Corporation (1995年発表);構造的指向性のある非ペプチドライブラリからの非ペプチドブラジキニン受容体拮抗剤、Sarvajit Chakravarty,Babu J. Mavunkel,Robin Andy,Donald J.Kyle*,Scios Nova Inc.(1995年7月発表);薬物団多様性を用いたコンビナトリアル化学ライブラリデザイン、Keith Davies and Clive Briant,Chemical Design Ltd. (1995年7月発表);コンビナトリアル合成実験のためのデータベースシステム−Craig James and David Weininger,Daylight Chemical Information Systems,Inc.(1995年7月発表);コンビナトリアル化学のための情報管理アーキテクチャー、Keith Davies and Catherine White,Chemical Design Ltd.(1995年7月発表);化学的多様性を目標にした新しいソフトウエアツール、R.S.Pearlman,テキサス大学薬学部分子グラフィックス論理的モデリング研究室(1996年6/7月発表);薬剤の発見における新しい戦略により得られるコンピュータ化学の機会:見解、Yvonne Connolly Martin,Abbott Laboratoriesのコンピューター支援分子設計プロジェクト(1996年6/7月発表);ルイスビル大学におけるコンビナトリアル化学および分子多様性コース:説明、Arno F.Spatola、ルイスビル大学化学部(1996年6/7月発表);化学的に発生されたスクリーニングライブラリ:現在と生来、Michael R.Pavia,Eli Lillyの1部門であるSphinx Pharmaceuticals(1996年6/7月発表); 薬剤多様性プロセスへの炭水化物分子多様性の導入のための化学的戦略、Michael J.Sofia,Transcell Technologies Inc. (1996年6/7月発表);コンビナトリアル化学のためのデータ管理、Maryjo Zaborowski,Chiron Corporation and Sheila H.DeWitt,Warner−Lambert Companyの部門であるParke−Davis Pharmaceutical Research(1995年11月発表);およびバイオ産業におけるR&Dに対する高スループット有機合成の影響、John P.Devlin (1996年三月発表)を参照できる。
【0140】
コンビナトリアルな化学における技術は新しい医薬品の糸口の作成のための近代的方法のうちでも広く許容されてきている(Gallop,M.A.等、1994,J.Med. Chem. 37:1233−1251; Gordon,E.M.等、1994,J.Med.Chem.37:1385−1401)。使用における1つのコンビナトリアルな方法は固相支持体の各粒子上の異なるこうぞを含むライブラリの合成、可溶性受容体のライブラリとの相互作用、大分子標的と相互作用する「ビーズ」の同定、および、同定された「ビーズ」により担持される構造の決定を含む戦略に基づいている(Lam,K.S.等、1991,Nature 354:82−84)。この方法の代替法は固相からの化合物の所定分量の逐次的遊離、その後の溶液中の活性の測定、活性化合物が遊離する粒子の同定、および、直接の配列決定によるその構造の解明(Salmon,S.E.等、1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11708−11712)であるか、または、そのコードを読み取る(Kerr,J.M.等、1993,J.Am.Chem.Soc.115:2529−2531; Nikolaiev,V.等、1993,Pept. Res.6:161−170; Ohlmeyer,M.H.J.等、1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10922−10926)ことにより行なう。
【0141】
可溶性の無作為なコンビナトリアルライブラリはFurkaが最初に記載したペプチドの等モル混合物の作成のための単純な原理を用いることにより合成してよい(Furka,A.等、1988,Xth International Symposium on Medicinal Chemistry,Budapest 1988; Furka,A.等、1988,14th International Congress of Biochemistry,Prague 1988; Furka,A.等、1999,Int. J. Peptide Protein Res. 37:487−493)。反復スクリーニングのための可溶性ライブラリの構築もまた報告されている(Houghten,R.A。等、1991,Nature 354:84−86)。K.S.Lamは不溶性の無作為コンビナトリアルライブラリを用いた新しい予測を超えた強力な方法を開示している。Lamは各支持体が均一な分子構造の被験化合物を有するように固相支持体上に無作為のコンビナトリアルなライブラリを合成し、固相結合プロトコルにより支持体から被験化合物を予め除去することなくライブラリをスクリーニングしている(Lam,K.S.等、1991,Nature 354:82−84)。
【0142】
即ち、候補となるリガンド、分子、阻害剤または拮抗剤のライブラリは合成のコンビナトリアルなライブラリ(例えばコンビナトリアル化学物質ライブラリ)、細胞抽出液、体液(例えば尿、血液、涙液、汗または唾液)または合成または天然産物のその他の混合物(例えば小型分子または培養混合物のライブラリ)であってよい。
【0143】
候補リガンドのライブラリ、候補リガンド、分子、阻害剤または拮抗剤は、例えばアミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、蛋白、またはペプチドまたは蛋白のフラグメント(例えばアンチセンスDNA;RNA;またはペプチド核酸、PNA);アプタマー;または炭水化物または多糖類を含む。ライブラリの各構成員は単独であるか、または混合体の一部であることができる(例えば圧縮ライブラリ)。ライブラリは精製された化合物を含んで良く、または「ダーティー」(即ち多大な量の不純物を含む)であることができる。
【0144】
市販のライブラリ(例えばAffymetrix,ArQule,Neose Technologies,Sarco,Ciddco,Oxford Asymmetry,Maybridge,Aldrich,Panlabs,Pharmacopoeia,SigmaまたはTripose)もまた本明細書に記載の方法とともに使用してよい。
【0145】
上記したライブラリのほかに、ダイバーシティーファイルと称される特殊ライブラリを用いて新しい方法の特異性、信頼性または再現性を評価してよい。ダイバーシティーファイルは、ある試験において非特異的検出を与える可能性のある化合物の多くのクラスの代表である多数の化合物(例えば1000以上の小型分子)を含んでいる。ダイバーシティーファイルは市販されており、或いは、上記したベンダーから入手可能な個々の化合物から組み立てることもできる。
【0146】
免疫グロブリン
免疫グロブリン分子は最も広い意味において免疫グロブリンスーパーファミリー、即ち、ベータシート2個および通常は保存されたジスルフィド結合を含む抗体分子に特徴的な免疫グロブリン折込部を含むポリペプチドのファミリーの構成員である。免疫グロブリンスーパーファミリーの構成員は、免疫系における広範な役割(例えば抗体、T細胞受容体分子等)、細胞付着への関与(例えばICAM分子)および細胞内シグナリング(例えば受容体分子、例えばPDGF受容体)を含むインビボの細胞および非細胞の相互作用の多くの特徴に関わっている。
【0147】
従って本発明の方法は受容体のそのリガンド、レチノール−レチノール結合蛋白との相互作用を妨害するために標的に結合することが可能な如何なる免疫グロブリンスーパーファミリー分子、並びに、レチン酸合成酵素およびその基質の相互作用を妨害するために標的に結合することができるものを使用する。免疫グロブリンから誘導されるペプチドまたはフラグメントも使用してよい。
【0148】
抗体は、本明細書においては、完全な抗体または選択された標的に結合することができる抗体のフラグメント、例えばFv、ScFv、Fab’およびF(ab’)2、モノクローナルおよびポリクローナルの抗体、意図的に作成された抗体、例えばキメラ、CDR−グラフトおよびヒト化された抗体、およびファージディスプレーまたは代替法により作成された人工的に選択された抗体を指す。小型のフラグメント、例えばFvおよびScFvは、そのサイズが小さいこと、および、その結果組として織分布性が優れているため、診断および治療用途において好都合な特性を有している。好ましくは、抗体は一重鎖抗体またはscFvである。
【0149】
抗体は毒素または標識のようなエフェクター蛋白を有する変性抗体であってよい。標識抗体の使用によりインビボの抗体の分布を画像化することができる。このような標識は、患者体内で容易に可視化される放射性標識または放射能非透過性標識、例えば金属粒子であってよい。更に、それらは患者から採取した組織試料において可視化される蛍光標識(例えば本明細書に記載したもの)またはたの標識であってよい。エフェクター基を有する抗体は当該技術で既知の如何なる会合手段と連結させてもよい。
【0150】
抗体は動物の血清から得て良く、或いは、モノクローナル抗体またはそのフラグメントの場合は、細胞培養により作成してよい。組み換えDNA技術をもちいることにより、細菌、コウボ、昆虫、または好ましくは哺乳類の細胞の培養物中で、確立された操作法に従って、抗体を作成してよい。選択される細胞培養系は好ましくは抗体産物を分泌する。
【0151】
インビトロのハイブリドーマ細胞または哺乳類宿主細胞の増幅は、適する培地中で行ない、そのような培地は、場合によっては哺乳類血清、例えばウシ胎児血清、または微量元素および生育持続補助剤、例えばフィーダー細胞、例えば正常マウス腹腔浸出細胞、脾細胞、骨髄マクロファージ、2−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポ蛋白、オレイン酸等を添加した、慣用的に使用されている標準的な培地、例えば、ダルベッコの変性イーグル培地(DMEM)またはRPMI1640培地である。細菌細胞またはコウボ細胞である宿主細胞の増幅は同じく、当該技術で既知の適当な培地、例えば細菌の場合はLB培地、NZCYM、NZYM、NZM、Terrific Broth、SOB、SOC、2xYTまたはM9最小培地、コウボの場合はYPD培地、YEPD、最小培地または完全最小ドロップアウト培地中で行なう。
【0152】
蛋白の発現のために宿主細胞として昆虫細胞を使用することは、クローニングおよび発現の過程が比較的容易であり迅速である点において好都合である。加えて、細菌やコウボの発現と比較して、正確におりこまれた生物学的に活性のある蛋白が得られる可能性が高い。昆虫細胞は血清含有培地と比較してより安価で安全である血清非含有培地中で培養してよい。組み換えバキュロウィルスは、当該技術で知られるとおり、発現ベクター、および、多くの鱗翅類細胞系統、特にSpodoptera frugiperda Sf9であってよい宿主細胞系統をトランスフェクトするために用いる構築物として使用してよい。昆虫宿主細胞における組み換え蛋白の発現の研究はAltmann等(1999),Glycoconj. J.1999,16,109−23およびKost and Condreay (1999),Curr. Opin. Biotechnol.,10,428−33に記載されている。
【0153】
インビトロの生産は比較的純粋な抗体の調製物を与え、所望の抗体を大量に得るためのスケールアップが可能である。細菌細胞、コウボ、昆虫および哺乳類細胞の培養技術は当該技術で知られており、例えばエアリフト反応基中または連続攪拌反応期中の均質懸濁培養、または、例えば中空糸、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ上またはセラミックカートリッジ中の固定化または捕獲化細胞培養を含む。
【0154】
大量の所望の抗体はインビボで哺乳類細胞を増幅することにより得ることができる。この目的のためには、所望の抗体を生産するハイブリドーマ細胞を組織適合性のある哺乳類に注入し、抗体産生腫瘍を生育させる。場合によっては、動物を炭化水素、特にプリスタン(テトラメチルペンタデカン)のような鉱物油でプライミングした後に、注入を行なう。1週間から3週間後、抗体をこれらの哺乳類の体液から単離する。例えば、Balb/cマウスの抗体産生脾細胞との適当なミエローマ細部の融合により得られるハイブリドーマ細胞、または、所望の抗体を生産するハイブリドーマ細胞系統Sp2/0由来のトランスフェクト細胞を場合によってはプリスタンを前投与したBalb/c系統に腹腔内注射し、1週間から2週間後、楼物から腹水を回収する。
【0155】
上記した、およびその他の技術は、例えば、Kohler and Milstein,(1975),Nature 256:495−497; US4,376,110; Harlow and Lane,Antibodies: a laboratory Manual,(1988),Cold Spring Harborに記載さており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。組み換え抗体分子の調製のための技術は、上記した参考文献、および、例えばEP0623679;EP0368684およびEP0436597に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【0156】
好ましくは、イムノブロッティングにより、酵素免疫試験、例えばサンドイッチ試験またはドット試験により、またはラジオイムノアッセイにより、所望の標的を発現している細胞の免疫蛍光染色を行なうことにより、細胞培養上澄みに所望の抗体があるかどうかスクリーニングする。特に、Bavik等、1995,Experimental Cell Research 216:358−362において使用されている試験法を用いてよい。この文献はレチノール結合蛋白受容体−レチノール結合蛋白受容体結合試験において妨害があるかどうかをスクリーニングすることによるレチノール結合蛋白受容体に対抗するモノクローナル抗体p142の単離を開示している。
【0157】
抗体の単離のためには、培養上澄み中または腹水中の免疫グロブリンを例えば硫酸アンモニウムを用いた析出、ポリエチレングリコールのような吸湿性物質に対する透析、選択膜を通した濾過等により濃縮してよい。必要な場合、および/または望ましい場合は、抗体を慣用的なクロマトグラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、DEAEセルロース上のクロマトグラフィーおよび/または免疫アフィニティークロマトグラフィー、例えば標的を含有する蛋白を用いた、または、プロテインAを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、精製する。
【0158】
前述した操作法に従って生成される抗体は定法に従って、細胞からの核酸の単離によりクローニングしてよい。好都合には、抗体の核酸可変ドメインを単離してscFvのような抗体フラグメントを構築するために用いてよい。
【0159】
従って本発明は好ましくは抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖化編ドメインをコードするインサートを含む組み換え核酸を使用する。定義によれば、このような核酸はコード一重鎖核酸、該コード核酸およびそれに相補的な核酸からなる二重鎖核酸、またはこれらの相補(一重鎖)核酸自体を含む。
【0160】
更にまた抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインをコードする核酸は天然の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインをコードする真正の配列またはその突然変異体を有する酵素的または化学的に合成された核酸であることができる。真正の配列の突然変異体はアミノ酸1つ以上が欠失しているか他のアミノ酸1つ以上と交換されている上記した抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインをコードする核酸である。好ましくは、該修飾は抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインのCDRの外部にある。このような突然変異核酸はまた、同じアミノ酸をコードする新しいコドンを有する他のヌクレオチドでヌクレオチド1つ以上が置きかえられたサイレントな突然変異体であることを意図している。このような突然変異配列はまた縮重配列である。縮重配列は、遺伝子コードの意味の範囲内において、最初にコードされていたアミノ酸配列の変化をもたらすことなく他のヌクレオチドで未制限数のヌクレオチドが置きかえられるように縮重されている。このような縮重配列が有用である理由は、それらが種々の制限部位を有するため、および/または、重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインの旨適な発現が得られるように特定の宿主、特にコウボ、細菌または哺乳類細胞により好まれる特定のコドンの発生頻度を有するためである。
【0161】
突然変異体という用語は当該技術で既知の方法に従ってDNAのインビトロまたはインビボ突然変異誘発により得られるDNA突然変異体を含む。
【0162】
組み換えDNA技術を用いて本発明の抗体を改良してよい。即ち、キメラ抗体を構築することにより診断または治療用途におけるその免疫原性を低下させることができる。更に、免疫原性はCDRグラフティングによる抗体のヒト化(欧州特許出願0239400(Winter))および、場合によっては、フレームワーク修飾(国際特許出願WO90/07861(Protein Design Labs)により参照されるとおり、EP0239400)により最小限にすることができる。
【0163】
従って本発明はまたヒト定常ドメインγ、例えばγ1、γ2、γ3またはγ4、好ましくはγ1またはγ4、に融合した抗体の重鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組み換え核酸を使用する。同様に本発明はヒト定常ドメインκまたはλ、好ましくはκに融合した抗体の軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組み換えDNAにも関する。
【0164】
より好ましくは、本発明はCDRグラフト抗体を使用し、これは、好ましくはCDグラフト軽鎖および重鎖の可変ドメインのみである。好都合な事に、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、場合によっては、宿主細胞内の抗体のプロセシングを容易にするシグナル配列および/または抗体の精製を容易にするペプチドをコードするDNAおよび/または切断部位および/またはペプチドスペーサーおよび/またはエフェクター分子を有するスペーサー基を介して結合している。このような抗体はscFvとして知られている。
【0165】
抗体は更に抗体の人工のレパートリーを生産するような抗体の突然変異誘発により発生させてよい。この技術により後に詳述する通り、抗体のライブラリの作成が可能となり、抗体のライブラリは市販もされている。従って、本発明は免疫グロブリンの人工のレパートリー、好ましくは人工のScFvレパートリーを免疫グロブリン原料として好都合に使用する。
【0166】
単離された、またはクローニングされた抗体は他の分子に結合して良く、例えば当該技術において知られたプロトコルを用いた化学カップリングによる核酸または蛋白会合手段であってよい(例えばHarlow and Lane,Antibodies: A Laboratory Manual,(1988),Cold Spring Harbor and Maniatis,T.,Fritsch,E.F. and Sambrook,J.(1991),Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor,New York,Cold Spring Harbor Laboratory Pressが参照される)。
【0167】
免疫グロブリンは細胞内の環境において抗原に結合する能力があるものを選択してよい。このような「イントラボディー」は例えば抗体または抗体フラグメントの細胞内発現により設計してよい(Cochet等、(1998),Cancer Res 58,1170−6)。更に、哺乳類細胞内部で結合能力を有する抗体を選択するためのインビボの2ハイブリッド系のような、抗原に細胞内で結合することのできる抗体を直接同定する選択方法を使用してよい。このような方法は、英国特許出願9905510.5および国際特許出願PCT/GB00/00876に記載されている。
【0168】
アンチセンス化合物
上記のように、拮抗剤は該当細胞内部のレチン酸の内因性濃度を低減することができるアンチセンスRNAおよびアンチセンスDNAを含むアンチセンス化合物1つ以上を有する。即ち、内因性レチン酸濃度が低減されるように増殖亢進性細胞中でレチノール結合蛋白受容体の、または、何れかのレチン酸合成酵素の発現の濃度を低下することができる拮抗剤が包含される。好ましくは、アンチセンス化合物はレチノール結合蛋白受容体またはレチン酸合成酵素、例えばレチノールデヒドロゲナーゼまたはレチナールデヒドロゲナーゼのmRNAに相補的な配列を含む。
【0169】
好ましくは、アンチセンス化合物はオリゴマーのアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。アンチセンス化合物は好ましくは、レチノール結合蛋白受容体またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)をコードする核酸1つ以上と特異的にハイブリダイズする。本明細書においては、「レチノール結合蛋白受容体をコードする核酸」とは、レチノール結合蛋白受容体をコードするDNA、そのようなDNAから転写されたRNA(前mRNAおよびmRNAを含む)、およびこのようなRNAから誘導されたcDNAを含むものとする。同様に、「レチン酸合成酵素をコードする核酸」という用語はレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)をコードするDNA、そのようなDNAから転写されたRNA(前mRNAおよびmRNAを含む)、およびこのようなRNAから誘導されたcDNAを含むものとする。
【0170】
オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは核酸の正常な機能を妨害する。標的核酸の機能がそれに特異的にハイブリダイズする化合物によりこのようにモジュレートされることを一般的に「アンチセンス」と称する。妨害されるべきDNAの機能には、複製および転写が包含される。妨害されるべきRNAの機能には全ての生存機能、例えば蛋白翻訳部位へのRNAの転位、RNAからの蛋白の翻訳、mRNA種1つ以上を生じるRNAのスプライシング、および、RNAに関わるまたはこれにより促進される触媒活性が包含される。標的核酸の機能のこのような妨害の全体的影響は、レチノール結合蛋白受容体またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)の発現のモジュレーションである。本発明の文脈においては、「モジュレーション」とは遺伝子の発現の増大(促進)または減少(抑制)の何れかを指す。例えばレチノール結合蛋白受容体またはレチン酸合成酵素活性の抑制剤、または、レチノール結合蛋白受容体または酵素の発現の抑制剤をコードする遺伝子の発現が増大されてよい。しかしながら、好ましくは、発現の抑制、特にレチノール結合蛋白受容体またはレチン酸合成酵素の発現の抑制が遺伝子発現のモジュレーションの好ましい形態であり、mRNAが好ましい標的である。
【0171】
アンチセンス構築物はUS6,100,090(Monia等)およびNeckers等、1992,Crit Rev Oncog 3(1−2):175−231に記載されており、その開示内容は特に参照により本発明に組み込まれる。
【0172】
皮膚増殖亢進性障害
本発明の方法および組成物により治療されてよい皮膚増殖亢進性障害には、乾癬、尋常性挫瘡、しゅさ性挫瘡、光線性角化症(日光性角化症、インシトゥの扁平上皮細胞癌)、魚鱗癬、角化亢進症、Darrier症のような角化障害、掌蹠角皮症、毛孔性紅色ひこう疹、表皮母斑様症候群、変異性紅斑角皮症、表皮剥離性角質増殖症、非水疱性魚鱗癬様紅皮症、皮膚エリテマトーデスおよび扁平苔癬性乾癬が包含される。
【0173】
本発明によれば、皮膚増殖亢進性障害、例えば上記した障害に伴う症状の何れかを示している患者を、レチノール結合蛋白受容体またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)の活性を低減するブロッキング剤または拮抗剤で治療する。これに代えて、またはこれに加えて、罹患した患者の増殖亢進性細胞内の内因性レチン酸濃度を低減する。このような治療により罹患細胞の増殖が低減する。ブロッキング剤等はそのまま、または、後に詳述する医薬組成物の形態で患者に適用してよい。皮膚増殖亢進性障害を有する宿主の治療効果は、剥離および紅斑の改善、幹部のサイズの減少のような他覚的基準、並びに、掻痒の停止などの自覚的基準により評価してよい。
【0174】
特に本発明の組成物および方法は乾癬の症状の治療または軽減に適している。乾癬は銀白色の鱗屑で被覆された炎症を有する膨潤した皮膚疾患として顕在化する。乾癬の特徴としては、膿様の水疱(膿疱性乾癬)、重度の皮膚脱落(紅斑製乾癬)、ドロップ様斑点(液状乾癬)および平滑炎症患部(逆乾癬)が挙げられる。
【0175】
乾癬の原因は、それが遺伝的要素を有する自己免疫性の皮膚障害であることは解かっているもの、現在でも不明である。三人に一人が乾癬の家族歴を報告しているが、遺伝のパターンはない。しかしながら、明らかな障害の家族歴がない小児が乾癬を発症する例が多い。個人が実際に乾癬を発症するかどうかは「トリガー因子」に依存しており、これには全身感染症、例えば連鎖球菌喉、皮膚傷害(Koebner現象)、ワクチン接種、特定の薬剤使用、および筋肉注射または経口ステロイド療法が包含される。何らかのものが乾癬を発症する個体の遺伝的傾向をトリガーすると、次に免疫系が過剰な皮膚細胞の増殖をトリガーすると考えられている。
【0176】
皮膚細胞は2つの可能なプログラム、即ち、正常な生育または創傷の治癒に従う。正常な生育のパターンにおいては、皮膚細胞は表皮基底層において創生され、その後、表皮を経由して、皮膚の最外層である表皮角質層に至る。この正常な過程は細胞の誕生から脂肪まで約28日を要する。皮膚に創傷が生じると、創傷治癒プログラム(再生成熟化)がトリガーされ、ここでは細胞はより速い速度で生産され、血流が増大し、局在した炎症が生じる。患部の乾癬は交互の生育プログラムにおける細胞生育を特徴とする。皮膚細胞(ケラチノサイト)は正常生育プログラムから再生成熟化に切り替わり、細胞が創生され、そして2日から4日間もの短期間に表面まで押出され、そして皮膚は十分急速に細胞を排除することができない。過度の皮膚細胞は確立され、増大し、鱗状に変形して形成される。通常患部を被覆している白色の鱗屑(「プラーク」)は死んだ皮膚細胞よりなり、患部の発赤は急速に分裂する皮膚細胞の領域への増大した血流供給によるものである。
【0177】
乾癬は2種の生物学的特質により特徴付けられる皮膚の遺伝的に明確化された障害である。第1に、加速された不完全な分化に関連した深部表皮の増殖亢進がある。第2に、表皮と真皮の両方の顕著な炎症があり、そこにはTリンパ球が集積しており、場合によっては好中球の微小膿瘍が形成される。乾癬の多くの病理学的特徴は、皮膚表面0.2mm以内で生じる表脾細胞の増大した増殖を伴った表皮ケラチノサイトの生育と成熟の変化に起因している。乾癬の病因の伝統的な研究は増大した増殖と表皮の過形成に着目していた。正常な皮膚においては、細胞が基底層から移動して顆粒層を経由する時間は4週間から5週間である。乾癬の患部においては、その時間は細胞周期の短縮化、増殖可能な細胞の絶対数の増大、および、実際に分裂している細胞の比率の増加により、7倍から10倍減少する。乾癬患者の臨床的には関係のない皮膚においても、かなり程度は低いものの、増殖亢進現象が認められる。
【0178】
乾癬の共通した形態である尋常性乾癬は肥厚した銀色の鱗屑に被覆された明確な境界を有する紅斑性のプラークを特徴とする。特徴的な所見は、皮膚外傷の部位において新しい乾癬患部が生じる同形反応(Koebner現象)である。
【0179】
患部はしばしば四肢の伸筋側に局在し、爪および頭皮が共通して関わっている。より頻度の低い形態としては、連鎖球菌による咽頭炎の後に発症する疾患の形態である液状乾癬、そして、手掌または踵または全身に分布する直径2mmから5mmである場合が多い多くの無菌的膿疱を特徴とする膿疱製乾癬が挙げられる。
【0180】
本発明者等の方法および組成物はまた挫瘡の治療にもて記している。挫瘡は多数の患者集団が罹患しており、通常は顔面に局在する一般的な炎症性の皮膚障害である。幸いなことに疾患は通常は消失し、発症と緩解との間の数ヶ月または数年の時間間隔のうちに、治癒は得られないものの、治療は大部分の患者において疾患を十分抑制する。
【0181】
重度の疾患を有する小数の挫瘡患者は高用量の経口テトラサイクリン、ダプソン、プレドニゾン、女性の場合はエストロゲンの使用を含む集中的治療処置に殆ど或いは全く応答しない。多くの場合において、これらの薬剤は中等度の抑制効果しかもたらさないのに対し、これらの薬剤の副作用はそれらの有用性を大きく制限している。結節嚢胞性の挫瘡を有する患者は顔面、しばしば背部や胸部にも生じる大型の炎症性の化膿性の結節に罹患している。その外観に加えて、患部は軟質でしばしば化膿性の滲出および出血を伴っている。外観を損なう焼痂はしばしば不可避である。
【0182】
挫瘡の治療ではレチノイド類の局所および全身投与を行なう。オールトランスレチン酸(トレチノイン)の局所適用が行われ、特に面ぽうまたは黒色面ぽうに対しては、一部では効を奏しているが、この症状は治療を中止すると再発する場合が多い。
【0183】
乾癬患者の治療の効果を確立するために用いる目的の方法は目視モニタリングによる、そして写真を用いたプラークの緩解を含む。目視評点はPASI(乾癬面積重症度指数)評点を用いて行なう(Fredericksson,AJ,Peterssonn BC,Dermatologies 157:238−244(1978)参照)。
【0184】
新生物および癌
本発明の方法および組成物は増殖亢進性癌細胞の増殖の抑制および場合によっては形質転換表現型の逆行のために用いてよい。
【0185】
レチノイドは発癌物質の活性化、生育因子、血管形成、コラゲナーゼ生成に影響し、そして宿主の免疫応答を変化させることを含む、幾つかの機序により腫瘍の発生と生育に影響することが実験的にわかっている(Gollnick 1997,Retinoids 13,6−12)。インビトロのレチン酸はヒト急性骨髄性白血病、神経芽細胞種、奇形癌、黒色腫およびラット横紋筋肉腫細胞を含む数種の腫瘍細胞系統の分化を誘導し、および/またはそのクローン増殖を抑制することがわかっている(Smith等、1992,Journal of Clinical Oncology Vol.10,839−864)。レチン酸誘発分化に最も応答する細胞は前骨髄球白血病細胞である(Smith等、1992,Journal of Clinical Oncology Vol.10,839−864)。合成経口レチノイドであるイソトレチノイン、エトレチネートおよびアセトレチンおよび局所投与用イソトレチノインおよびレチン酸はコントロールされた臨床治験において前悪性および一部の悪性非黒色細胞性の皮膚癌の消散をもたらすことがわかっている(Gollnick 1997,Retionids 13,6−12; Kraemer等、1988,N Engl J Med,318,1633−7)。エトレチネートおよびアシトレチンは小型基底細胞癌(BCC)の生育を低減し、新しいBCC患部の形成を防止することがGorlin−Goltz症候群患者においてわかっている(Goldberg等、1989,J Am Acad Dermatol 21,144−5)。経口および局所用のレチノイド類は前癌性の光線性角化症およびボーエノイド角化症の発症個所数を低減および/または進行を防止することがわかっており(Meyskens等、1986,J Am Acad Dermatol 15,822−5; Moriarty等、1982,Lancet 1,364−5)、樹立された扁平上皮細胞癌を治療する(Levine等、1989,Arch Dermatol 125,1225−30)ことがわかっている。TRA(全トランスレチン酸)の局所適用は片側試験において異形成母斑の消散をもたらした(Meyskens等、1986,J Am Acad Dermatol,15,822−5)。
【0186】
レチノイド治療に最も応答する血液学的悪性疾患は急性前骨髄球白血病(APL)であり、この場合、レチノイドは骨髄形成不全の期間を伴うことなく完全な軽快を誘発することができる(Stone等、1988,Blood 71,690−696; Wallace,1989,Am J Hematol 31,266−268)。切開した頭部および頸部の扁平上皮細胞癌を有する患者においては、経口レチノイドはプラセボ投与群で24%であった第2上皮細胞腫瘍の発生を4%にまで低減したことがわかっている(Smith等、1992,Journal of Clinical Oncology Vol.10,839−864)。進行した頸部扁平上皮細胞癌の退行はレチン酸とIFN−アルファの組み合わせにより誘発できている(Lippman等、1992,J Natl Cancer Inst 81,241−245)。レチノイドはまた乳癌、前立腺癌および膀胱癌を含む他の固体癌の動物モデルにおいても有効であることがわかっている(Smith等、1992,Journal of Clinical Oncolog. Vol.10,839−864; Whelan,1999,Eur Urol 35,424−428)。しかしながら、既存のレチノイド療法は複数のシグナリング経路から生じるかなりの毒性により限界がある(Singh and Lippman,1998,Oncology 12,1643−1659)。
【0187】
レチノイドの最も効果的な使用は確立された疾患の治療よりはむしろ腫瘍の予防であるが(Bollag and Holdener,1992,Annals of Oncology 3,513−526; Kemmett and Hunter,1988,Hospital Update,March 1988,pp1301−1313; Shi−Yong and Lotan,1988,Drugs of the Future 23,621−634)、我々の方法および組成物は予防と治療の両方に使用してよい。
【0188】
即ち、上記した症状の何れかは本明細書に記載の方法および組成物により治療または軽減される。特に、本明細書に記載した方法および組成物は、レチノイド療法による治療が成功した、または成功しなかった如何なる腫瘍、癌等の治療のために有用である。方法および組成物はまた、前悪性症状を治療するため、即ちそれらが真に悪性となるのを防止するために有用である。内因性レチン酸濃度の低減は血管形成を抑制し、従って、このような低減は腫瘍の拡大を防止するのに有用である。特に、内因性レチン酸濃度のこのような低減は、好ましくはレチノール結合蛋白および/またはレチノールの取りこみを防止するような態様でレチノール結合蛋白受容体を拮抗することにより達成してよい。内因性レチン酸濃度の低減はまた例えば本明細書に記載する通りレチン酸合成酵素を阻害することによりレチン酸の合成を抑制または防止することにより達成してよい。腫瘍の特定の例はメラノサイト母斑および脊髄形成異常症候群を含む。
【0189】
本発明の方法は癌のような増殖亢進性障害に罹患した患者に抗新生物剤を投与することを含む。これは病理学的または非病理学的な増殖亢進性細胞を、レチノール結合蛋白受容体拮抗剤またはレチン酸合成酵素拮抗剤を含む内因性レチン酸濃度を低減することのできる薬剤の有効量と接触させることにより増殖亢進性細胞の増殖を低減するステップを含む。1つの例はレチノール結合蛋白受容体の対する抗体の使用である。
【0190】
本発明の方法は培養中の細胞に対し、例えばインビトロまたはエクスビボで行なうことができ、または、動物対象中に存在する細胞に対して、例えばインビボ治療プロトコルの一部として行うことができる。治療方法はヒトまたは他の動物対症に対して実施できる。「抗新生物剤」おおび「抗増殖剤」という用語は本明細書においては互換に使用され、そして増殖亢進性細胞の増殖を抑制する、例えば新生物の発生または進行を抑制する機能的特性を有する薬剤を含む。
【0191】
例えばレチノール結合蛋白受容体の活性をブロックすることによるか、またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)を阻害する事により内因性レチン酸濃度を低減することのできる如何なる薬剤も本発明の方法および組成物において使用してよい。好ましくは、そのような薬剤の治療有効抗新生物量、即ち、患者に単回または複数回投与する事により新生物細胞の生育を抑制する際に、またはそのような治療がない場合に予測されるものよりも長くそのような新生物細胞を有する患者の生存性を延長する際に有効である薬剤の量を使用する。本明細書においては、新生物の「生育を抑制する」とは、その生育および転移を遅延、中断、停止または終止させる事を含み、必ずしも新生物の生育を完全に排除することを指さない。薬剤はまた予防有効抗新生物量で、即ち、患者に単回または複数回投与する事により新生物疾患状態の発症を防止または遅延させる際に有効な量で予防薬として使用してよい。本発明の方法および組成物で治療される特定の癌は、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌および形成不全母斑、悪性黒色腫を含む。光老化した細胞並びに多くの皮膚増殖性障害は前悪性癌細胞の特性の多くを示し、そして本発明はまたそのような細胞の治療においても有用に使用される。
【0192】
「新生物」という用語の一般的な医学上の意味は、正常な生育の制御に対する応答性の消失として生じる「新しい細胞の生育」、例えば新生物細胞の生育を指す。「過形成」とは異常に速い速度の生育を示す細胞を指す。しかしながら、本明細書においては、新生物と過形成という用語はそれらの文脈が示すとおり互換に使用され、一般的に異常な細胞の生育速度を有する細胞を指す。新生物および過形成は良性、前悪性または悪性の何れかであってよい「腫瘍」を含む。
【0193】
本発明のレチノール結合蛋白受容体拮抗剤を含む薬剤はまずインビトロでその新生物細胞の増殖に対する抑制作用について試験してよい。使用できる細胞系統の例は形質転換細胞、例えばヒト前骨髄性白血病細部系統HL−60、およびヒト骨髄性白血病U−937細胞系統である(Abe E等、(1981),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4990−4994; Song L.N. and Cheng T.(1992),Biochem Pharmacol 43:2292−2295; Zhou J.Y.等、(1989),Blood 74:82−93; 米国特許5,401,733,5,087,619号)。或いは、このような薬剤の抗腫瘍作用は、当該技術で知られており、参照により本明細書に組み込まれるBouillon,R等,(1995) Endocrine Reviews 16(2):233(Table E)に総括されている種々の動物モデルを用いてインビボで試験することができる。例えば、SLマウスがMI骨髄性白血病のモデルとして当該技術では通常使用されており(Honma等、(1983),Cell Biol. 80:201−204; Kasukabe T.等、(1978),Cancer Res. 47:567−572);乳癌の試験は例えばヒトMX1(ER)に対するヌードマウスモデルにおいて実施でき(Abe J.等、(1991),Endocrinology 129:832−837);他の癌、例えば結腸癌、黒色腫、骨肉腫は例えば文献記載のヌードマウスモデルにおいて特性化できる(Eisman J.A.等、(1987),Cancer Res. 47:21−25; Kawaura A.等、(1990),Cancer Lett 55:149−152; Belleli A.(1992),Carcinogenesis 13:2293−2298; Tsuchiya H.等、(1993),J.Orthopaed Res.11:122−130)。
【0194】
特定の実施形態においては薬剤または拮抗剤は従来の癌の化学療法との複合療法において使用できる。従来の腫瘍治療方法には放射線照射、薬剤またはその組み合わせが包含される。放射線照射のほかに、以下の薬剤、即ち、ビンクリスチン、プレドニソン、メトトレキセート、メルカプトプリン、シクロホスファミドおよびシタラビンが通常は相互に組み合わせられて急性腫瘍の治療に使用される場合が多い。慢性の白血病の場合は、例えばブスルファン、メルフェランおよびクロラムブシルを組み合わせて使用できる。従来の抗癌剤の全ては高い毒性を有し、治療中の患者を非常に苦しめる。徹底的な治療は、全ての癌細胞が破壊されない限り残った細胞が増殖して再発をもたらすという前提に基づいている。
【0195】
要件となる方法は種々の臓器系、例えば、肺、胸部、リンパ、胃腸および泌尿生殖器管の悪性疾患、並びに大部分の結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および/または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸癌および食道癌のような悪性疾患を含む腺癌の治療において有用であることができる。
【0196】
「癌」という用語は、当該技術で認識されている通りであり、上皮または内分泌組織の悪性疾患、例えば、呼吸器系癌、胃腸系癌、泌尿生殖系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系ガンおよび黒色腫を指す。例示できる癌は頸部、肺、前立腺、胸部、東部および頚部、結腸および卵巣の組織から形成されるものを含む。用語はまた例えば癌性および肉腫性の組織からなる悪性腫瘍を含む癌肉腫も包含する。「腺癌」とは腺組織由来の癌または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成しているものを指す。
【0197】
「肉腫」という用語は当該技術で認識されている通りであり、間葉誘導の悪性腫瘍を指す。
【0198】
レチノール結合蛋白受容体活性をブロックすることによるか、またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)を阻害することにより内因性レチン酸濃度を低減させることが形質転換細胞の増殖の低減をもたらすという一般的理論に従って、本発明の方法により治療できる固体腫瘍の例は、肉腫と癌を包含し、その限定しない例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜種、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管ガン、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウイルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮細胞癌、神経膠癌、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫が挙げられる。
【0199】
拮抗剤の治療有効抗新生物量または予防有効抗新生物量の決定は医師または獣医師(「担当医師」)により、当業者の知るとおり、知られた方法の使用により、そして同様の状況下に得られた結果を観察することにより、容易に行なうことができる。用量は担当医師の決定した患者の必要性、治療すべき症状の重症度、および、使用する特定の化合物により変動してよい。治療有効抗新生物量または用量および予防有効抗新生物量または用量の決定に際しては、多くの要因を担当医師が考慮し、それには例えば関与する特定の過形成/新生物細胞;特定の薬剤の薬力学的特性およびその投与様式と経路;所望の治療経過;哺乳類の種;その体格、齢および全身状態;関与する特定の疾患;疾患の関与の程度または重症度;患者個体の応答性;投与する特定の化合物;投与様式;投与する製剤の生体利用性の特性;選択された用法;併用薬の種類(即ち使用する薬剤と他の同時投与治療薬との間の相互作用);およびその他の関連状況が挙げられる。例えば米国特許5,427,916号は患者個体における抗新生物療法の有効性を予測する方法を開示しており、本発明の治療プロトコルと組み合わせて使用することのできる特定の方法を説明している。
【0200】
治療は化合物の旨適用量より低い小用量にて開始できる。その後所定の状況下で旨適作用が得られるまで少量ずつ用量を増量する。好都合には、一日当たる総用量を分割して所望によりその日に渡って少量ずつ投与してよい。動物、例えばイヌ、げっ歯類、における腫瘍の予防または治療のために有効であることがわかっている化合物はヒトにおける腫瘍の治療にも有用である。ヒトの腫瘍の治療に関わる当業者は、ヒトへの化合物の投与の用量と経路を動物実験の結果に基づき知ることができる。一般的に、ヒトにおける用量および投与経路は動物の場合と同様であると予測される。用量に関するそれ以上の検討事項は後に詳述する。
【0201】
過形成/新生物性の疾患状態の予防的治療が必要な患者の認定は当業者に既知である。要件となる方法により治療できる新生物性疾患状態を発症する危険性のある患者の認定方法は医学分野で知られているとおりであり、例えば特定の疾患状態の発症の家族歴、および、対象患者におけるそのような疾患状態の発症に関わる危険因子の存在が上げられる。本発明はまた本発明の方法の使用を行なうか、またはその臨床的決定を明確化するために使用できるその他の予後徴候試験もまた含んでよい。当該技術の医師はそのような候補患者を例えば臨床試験、身体検査および病歴/家族歴に基づいて容易に発見することができる。
【202】
光老化
紫外線に対する長期間の曝露の結果として皮膚の構造的および機能的な要素が変化することは総括して光損傷、皮膚日射病または光老化と称される。
【0203】
正常な皮膚の平滑で弾力性のある性質は表皮により与えられる水分保持バリア性 (Cork,1997,J.Dermatol. Treat 8,S7−S13)、真皮における構造フィブリル蛋白、コラーゲンおよびエラスチンによる支援により維持されている。紫外線への長期間の曝露は皮膚の巨視的および微視的な変化をもたらし、これは光老化と称される(Gilchrest,1992,Br. J. Dermatol 127,Suupl 41,14−20)。光老化または光損傷皮膚の臨床徴候は、微細および粗放な皺、色素変化、加齢斑紋(光線性黒子)、弛緩、肌荒れ、蒼白、斑性色素亢進、毛細血管拡張症(顕著な微小血管)および幾つかの良性、前悪性および悪性の新生物を含む。これらはクオリティーオブライフの特定の特徴に対し大きな影響を持つ場合がある(Gupta&Gupta,1996,Journal of Dermatological Treatment; Griffiths等、1993; Griffiths,1992,7−261−264)。組織学的には、表皮は初期は肥厚化し、後の段階では萎縮し、ケラチノサイトの非定型性および形成不全が伴う。皮膚弾力線維症およびメラノサイト活性亢進も観察される。形成不全性および新生物形成性の変化、例えば光線角化症および基底細胞および扁平上皮細胞の癌もまた光損傷皮膚の究極的特徴である。真皮では非組織的塊内で肥厚化して崩壊する多数の弾力線維が増大しコラーゲンが減少する。皮膚の血管は拡張し蛇行している(Fisher等、1996,Nature 379,335−339)。
【0204】
幾つかの2重盲検臨床治験に撚れば、0.05%トレチノインは光老化の臨床的および組織学的な兆候を低減することができた(Olsen等、1992,J.Am.Acad. Dermatol. 26.,215−224; Weinstein等、1991,Arch Dermatol 127,659−65)。トレチノイン適用後、表皮は肥厚化し、そして奇異な形状の核を有する不規則な大きさ、形状および染色のある細胞はより健康な外観のケラチノサイトと入れ替わる(Kligman and Graham,1993,J.Dermatol. Treat. 4,113−117; Kligman and Leyden,1993,Skin Pharmacol 6,78−82)。このような変化はより正常な分化パターンへのケラチノサイトの「プッシング」の結果である(Marks,1996)。この仮説を裏付ける様に、レチノイドは前悪性の光線性角化症の急速な消散をもたらしている(Gilchrest,1992,Br J Dermatol 127 Suppl 41,14−20; Moriarty等、1982,Lancet 1,364−5)。
【0205】
加齢は非可逆であると考えられているが、過去10年間に行なわれた研究によればある局所用化合物および外科的処置が加齢による皮膚損傷を改善できることがわかった(Griffiths等、1995,Archives of Dermatology 131,1037−1044; Roger & Fuleihan,1995,Face lift and adjunctive procedures in the treatment of photodamaged skin. In Photodamage. Gilchrest BA編,1995; Blackwell Science,259−285; Pierard等、1996,Maturitas 23,273−277; Pierard等、1997,Dermatology 194,398−401)。薬剤療法には酸スクリーン剤、レチノイド、抗酸化剤、例えばビタミンCおよびEおよびベータカロテン、アルファヒドロキシ酸およびエストロゲンからなる(Humphreys等、1996,Journal of American Academy of Dermatology 34,638−644; Thibault等、1998,Dermatology Surgery 24,573−577; Weiss等、1988,JAMA 259,527−532)。種々の局所用の処方および非処方薬剤が光損傷皮膚の改善のために広範に入手できるが、その薬効は明らかではない。局所レチン酸投与により真皮においてコラーゲンの合成が増大し、皺が消失している(Griffith等、1993,New England Journal of Medicine 329,530−535; Kligman,1987,J Invest Dermatol 88,12s−17s; Kligman等、1984,Connect Tissue Res 12,139−50)。レチン酸の適用はまたUV照射により生じた屈曲した弾性線維に代わり線状の弾性線維の定着がもたらされる(Tsukahara等、1999,Br J Dermatol 140,1048−1053)。
【0206】
従って、局所および経口レチノイドの光老化皮膚に対する作用にはケラチノサイトおよび腺維芽細胞の分化プログラムの変更が関与していると考えられる。現在光老化の治療および予防におけるレチノイドの使用は主に催奇性および皮膚刺激性というその副作用のために制限されている。腺維芽細胞の培養を用いてレチン酸がコラーゲンおよびエラスチンのインビトロの生産亢進をもたらすことが明らかにされている(Tajima等、1997,J Dermatol Sci 15,166−7)。インビトロのケラチノサイトの分化/増殖に対するレチン酸の作用はケラチン生産を定量することにより検討されている(Fuchs and Green,1981,Cell 25,617−25; Kim等、1984,Proc. Natl. Acad. Sci.81,4280−4284)。
【0207】
本発明の方法および組成物は患者における光老化の治療のためまたはその症状の軽減のために使用してよい。本発明者等は、光老化に罹患した患者の細胞内のレチン酸の内因性濃度を低減することにより光損傷または光老化皮膚の組織学的および臨床的改善が得られることを発見した。更に、これらの改善はレチノール結合蛋白受容体の活性をブロックする薬剤(「ブロッキング剤」)および/またはレチノール結合蛋白受容体拮抗剤またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)の阻害剤の投与により達成してもよい。
【0208】
即ち、ブロッキング剤および/または拮抗剤は皮膚に局所適用された場合、日光への曝露により生じた皮膚の損傷を緩解し遅延させるように光損傷にかかわる症状を退行させる。日光への曝露により生じた損傷とは、早期老化、弾力線維症および皺、または前述した他の症状を含む。この損傷は高齢者においてより顕著である。ブロッキング剤および/または拮抗剤を光損傷にかかわる症状を退行させるのに有効な量で皮膚に局所適用することにより、皮膚の修復の加速が可能となり、より平滑で若若しい外観の皮膚を増強するのである。ブロッキング剤および/または拮抗剤は光損傷に罹患した、または、治療が望まれる皮膚の部分または領域に適用しなければならない。本発明によるブロッキング剤および/または拮抗剤の使用は抗老化および抗皺形成の作用を与え、また、日光損傷皮膚の修復も増強する。
【0209】
ブロッキング剤および/または拮抗剤は本発明に従って、明細書に記載した従来の局所用組成物中でヒト皮膚に適用できる。このような組成物は身体の皮膚、特に顔、足、腕および手にブロッキング剤および/または拮抗剤を適用するために利用できる。ブロッキング剤および/または拮抗剤の局所適用の好ましい方法は、弾力線維症が開始されより顕著になる患者33歳から55歳で開始した場合に最良の作用をもたらす。
【0210】
その後、この組成物を連続的に患者に適用することにより日光曝露に関わる作用および傷害を低減することができる。一般的に患者が約30歳に達した時点で治療を開始し、その一生涯を通じて治療を継続し、これにより弾性線維症の作用を低減しそれ以上の光損傷の進行を防止するのが好ましい。
【0211】
ブロッキング剤および/または拮抗剤は本発明に従って、如何なる従来の適当な局所用製剤中において、即ち、如何なる適当な局所用担体と共に、明細書に更に詳述するとおり、投与することができる。従って、ブロッキング剤および/または拮抗剤は本発明に従って如何なる適当な局所用組成物中において、例えばクリーム、軟膏、石鹸、溶液、ローション、乳液、シャンプー等において投与することができる。一般的に最も有効な結果を得るためには、これらの局所用組成物はブロッキング剤および/または拮抗剤を総組成物の約0.01%から約0.1重量%含有し、組成物の約0.1%から約0.01重量%が特に好ましい。所望により、弾性線維症の性質および範囲に応じて、より高濃度も使用してよい。
【0212】
組成物を調製する際には、ブロッキング剤および/または拮抗剤が安定である如何なる従来の非毒性の皮膚科学的に許容される基剤または担体を利用することもできる。本発明において使用するのに好ましい組成物はヒトの皮膚に局所適用されて化粧品作用を示す化粧品活性成分を含有できる従来の化粧品組成物である。本組成物中に利用できる従来の化粧品活性物質には、サンスクリーン剤、浸透促進剤、湿潤剤、界面活性剤、エモリエント剤、着色料、コンディショナー、殺菌剤、収斂剤、洗剤等が包含される。本発明の局所用組成物は所望により適当なサンスクリーン剤を含有できる。如何なる従来のサンスクリーン在も本発明に従って利用できるブロッキング剤および/または拮抗剤を含有する製剤を調製する際に利用できる。
【0213】
ブロッキング剤および/または拮抗剤を含有するこのような局所用組成物は局所用組成物を調製する際に一般的に使用される従来の賦形剤および添加剤の何れも含有できる。従来の添加剤または賦形剤のうち、本発明の化粧品組成物の調製に利用できるものは、保存料、濃厚化剤、香料等である。更に、従来の抗酸化剤、例えばブチル化ヒドロキシアニソール(BHA),アスコルビルパルミテート、没食子酸プロピル、クエン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、エトキシキン、トコフェロール等もこれらの組成物に配合できる。このような局所用組成物はこれらの組成物中で一般的に使用されている局所適用用の従来の許容される担体を含有できる。このような組成物は一般的に使用されている濃厚化剤、湿潤剤、乳化剤および粘度安定化剤を含有してよい。更に、これらの組成物は化粧品組成物の調製において従来用いられているフレーバー剤、着色料および香料を含有できる。組成物に含有されるその他の成分は本明細書の別の個所に記載するとおりである。
【0214】
ブロッキング剤および/または拮抗剤を含有する局所用組成物は皮膚に適用することができ、そして、好ましくは皮膚に一日一回適用する。皮膚に平滑でより若若しい外観を付与するために弾力線維症の逆行を達成するためには、局所用組成物は好ましくは6ヶ月の期間適用しなければならない。その後、ブロッキング剤および/または拮抗剤を含有する組成物を持続的に適用することにより、より若若しいより平滑な皮膚を維持しなければならない。このような調製物は担当医師の決定に従って患者の必要に応じて適用できる。いかなる場合も、本組成物の患者への適用の特定の用法は、典型的には個体の年齢、体重および皮膚の状態により変化する。
【0215】
UVB照射ヘアレスマウスは皮膚の光線性弾力線維症の好都合なモデルであることがわかっている(Kligman等、J. Invest. Dermatol.78:181(1982)。Johnston等のJ,Invest.Dermatol.82:587(1984)の報告によれば、実際の日光への曝露をシミュレーションした低線量のUVBの照射によりデスモシン含有量に基づいて測定した皮膚エラスチンが顕著に増大した。エラスチンの酸加水分解により単離されるこのアミノ酸の量は皮膚中に存在するエラスチント比例している(Uitto等、Lab. Invest. 49:1216(1973)。局所レチン酸による照射マウスの治療は、以前の弾力線維症真皮が未照射組織の外観を有するように、皮膚の組織学的特徴を正常化したことがわかった(Kligman等、Conn. Tissue Res.12:139 (1984),Kligman米国特許4,603,146,1986年7月)。従って、このモデルを用いて日光尊称皮膚の修復における化合物の薬効を調べることができる。
【0216】
ヒトに対する治療効果の評価は、医療の専門家により通常知られており許容されている如何なる方法により行なってもよい。これには例えば光老化の症状の医師による自覚的評価が包含される。皮膚の皺や肌荒れを対象となる領域、例えば顔面皮膚の目じりの皺の部分へのシリコンキャストの光学的側面計を用いて測定してよい。顔面および手の皺のような皮膚の臨床的測定も行ってよい。更に、皮膚厚みの他覚的測定をパルスAスキャン超音波装置を用いて行なってよい。光老化を評価するこれらの方法および他の方法はCraven等、1996,J.Derm. Treatment 7,Supplement 2,S23−S27に記載されている。
【0217】
その他の適応症
本発明の方法および組成物は、皮膚増殖亢進性障害、癌および光老化以外の他の病気、症状および疾患を治療するためにも有用である。
【0218】
本明細書に記載した方法および組成物により治療または軽減される他の適応症は如何なるウィルス疾患も包含する。レチノイドはレチノールの抗ウィルス作用を有することがわかっており、一部の皮膚ウィルス性疾患、例えばヒトパピロ−マウィルス(HPV)誘発疣贅はレチノイド応答性である。HPVゲノムはレチノイド応答エレメントを含んでいることがわかっており、従って本明細書に記載した方法および組成物はHPVを含む何れかのウィルス性疾患、レンチウィルス感染症、サイトメガロウィルス、エプスタイン−バーウィルス、(BZLF1)、アデノウィルス、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)、単純ヘルペスウィルス(HSV)、または肝炎ウィルス(例えばB型肝炎ウィルスまたはC型肝炎ウィルス)の感染症の治療に使用してよい。
【0219】
例えば記載した方法および組成物は肥大性およびケロイド性の瘢痕を含む術後瘢痕の治療のために使用できる。更に、方法および組成物はメラニン生成の促進のため、および、色素沈着の調節のために使用してよい。更に、内因性のレチン酸の濃度の低減を用いて表皮バリア機能を調節してよい。
【0220】
更にまた本明細書に記載した方法および組成物により治療される特定の症状、疾患等はレチノイドの治療上の投与の副作用であるか、それに相当するものである。即ち、現在のレチノイド療法では、多くの望ましくない副作用をもたらす薬理学的濃度のレチノイドを患者に経口または局所投与している。このような副作用はレチノイド療法とは無関係にそれ自体の症状として顕在化する場合がある。
【0221】
本発明者等は例えばRBPrを拮抗してレチノールの取りこみを低減する事により本明細書に記載したとおり内因性レチン酸濃度を低減することでこのような症状を治療または軽減できることを発見した。
【0222】
即ち、経口レチノイドは骨の生育を抑制することがわかっている。患者における内因性のレチン酸濃度の低減を用いて骨生育を積極的に変化させてよい。従って、本明細書に開示した方法および組成物は、骨の生育が抑制されている如何なる症状における骨の生育を増強するための治療法として使用しても良い。このような症状の例としては骨折の修復および骨粗鬆症の治療である。
【0223】
更にまたレチノイドの投与(例えば経口)は高脂血症をもたらす場合がある。内因性レチン酸濃度を低減させることにより、高濃度の脂質が存在する如何なる症状においても脂質濃度を低下させてよい。レチノイドの投与はまた肝毒性をもたらすが、本明細書に開示した方法および組成物は、例えば肝硬変または肝炎の感染後の肝修復手段として使用してよい。内因性レチン酸濃度の低減は、皮膚の刺激の治療、予防または退行のために用いて良く、これはレチノイドは例えば局所投与されると皮膚刺激を誘発することがわかっているためである。本明細書に記載した方法および組成物は、種々の原因により生じる脱毛症の治療または退行に用いてよく、これは、経口レチノイドは脱毛症を誘発することがわかっているためである。内因性レチン酸濃度の低減は生殖性の増強のために、または不妊治療薬として使用して良く、これは経口レチノイドは精子形成性および卵子着床を妨害し、生殖性を低下させることがわかっているためである。
【0224】
更に、挫瘡の治療に経口レチノイド(例えばイソレチナン)を投与するとうつ病および自殺を誘発することが報告されている。従って、本明細書に記載した方法および組成物は場合によっては他の知られた抗欝剤と組み合わせて鬱病の治療に使用してよい。例えば、季節性感情障害をこの方法で治療してよい。アテローム性動脈硬化症のような他の症状、並びに血管形成の抑制の関わる症状もまたレチノイドの作用である。
【0225】
医薬組成物
本発明はまた細胞内レチン酸濃度を低減させる薬剤1つ以上を含有する医薬組成物に関する。これらは例えばレチノール結合蛋白受容体の活性をブロックする(「ブロッキング剤」)ことにより作用して良く、レチノール結合蛋白受容体拮抗剤を含む。更に、レチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)の活性を抑制することにより、同じ作用を達成してよい。
【0226】
ブロッキング剤または薬剤を含有する組成物は単独で投与することも可能であるが、医薬製剤として活性成分を調製することが好ましい。組成物はブロッキング剤、または、レチノール結合蛋白受容体拮抗剤、何れかのレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)の阻害剤、構造的に関連する化合物、またはその酸性塩を含む。本発明の医薬製剤は有効量のブロッキング剤またはレチノール結合蛋白受容体拮抗剤等とともに医薬適合性の担体1つ以上を含有する。「有効量」とは細胞内レチン酸濃度を低減するのに、好ましくは、細胞に増殖を停止させ、場合によっては分化を開始させるのに、最も好ましくは皮膚増殖疾患、癌または光老化の症状少なくとも1つを緩解するのに十分な量である。有効量は治療または軽減すべき特定の疾患または症状、並びに患者の年齢および体重を含む他の要因、疾患等の状態の進行状況、患者の全身状態、症状の重症度、および、レチノール結合蛋白受容体拮抗剤または他の拮抗剤またはブロッキング剤を単独で投与するか他の治療薬と組み合わせて投与するか等により、変動する。
【0227】
医薬組成物は1つより多い阻害剤または拮抗剤を含有してよい。例えば、阻害剤2種以上の組み合わせを使用してよい。即ち、例えば、レチノール結合蛋白受容体のブロッキングとレチン酸合成酵素の阻害の組み合わせ医薬組成物中に処方してよい。即ち、レチノール取りこみ抑制剤をレチノールデヒドロゲナーゼの阻害剤、または、レチナールデヒドロゲナーゼノ阻害剤、または双方とともに製剤してよい。更に、レチノールデヒドロゲナーゼノ阻害剤をレチナールデヒドロゲナーゼノ阻害剤と組み合わせて含有させてもよい。医薬組成物は同時、逐次、例えば、ローテーションにより投与してよい。
【0228】
適当な医薬適合性の担体は当該技術でよく知られており、医薬製剤の所望の投与形態と様式により変化する。例えば、それらには希釈剤または賦形剤、例えば充填剤、結合剤、水和剤、錠剤崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤等が包含される。典型的には、単体は固体、液体、または、気化性の担体またはこれらの組み合わせである。各担体は製剤中の他の成分と適合しているという意味において「許容される」物であることが必要であり、患者に対して有害であってはならない。担体は宿主に投与した際に副反応(例えば免疫応答)を示さない生物学的に許容されるものでなければならない。
【0229】
本発明の医薬組成物は局所および経口投与に適するものを包含し、罹患組織が主に皮膚または表皮(例えば感染および他の表皮増殖亢進性障害、光老化、皮膚癌等)である場合は局所用製剤が好ましい。局所用製剤は組成物を治療すべき皮膚表面への直接接触により外用にて適用する医薬品形態を含む。局所適用用の従来の医薬品形態には、浸積剤、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スティック、スプレー、エアロゾル、バスオイル、溶液等が包含される。局所治療は種々のベヒクルにより供給して良く、ベヒクルの選択は重要であり、一般的に急性または慢性の疾患を治療するかどうかに関わっている。例えば、急性の皮膚増殖疾患は一般的に水性の乾燥製剤で治療するのに対し、慢性の皮膚増殖疾患は水和製剤で治療する。浸積剤は急性の湿潤発疹を乾燥する最も容易な方法である。ローション(水中粉末懸濁液)および溶液(溶媒中に溶解した薬剤)は毛髪があり間擦疹のある領域に対して理想的である。軟膏または油中水型乳液は最も効果的な水和剤であり、乾燥した鱗屑を有する発疹に適切であるが、油っぽく患部によっては望ましくない場合がある。これらは適宜、特にレチノール結合蛋白受容体拮抗剤またはブロッキング剤またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)阻害剤の組成物の患部への浸透を促進することが望ましい場合は、包帯と組み合わせて適用できる。クリームおよび水中油型乳液およびゲル剤は吸収されやすく、化粧品的には最も患者に許容されやすいものである(Guzzo等、Goodman & Gilman’s Pharmacological Basis of Therapeutics,9th Ed.,p.1593−15950 (1996))。クリーム製剤は一般的にワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、鉱物油、グリセリン、イソプロピルパルミテート、グリセリルステアレート、セテアリルアルコール、トコフェリルアセテート、イソプロピルミリステート、ラノリンアルコール、シメチコン、カルボメン、メチルクロロイソチアゾリノン、メチルイソチアゾリノン、シクロメチコンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース並びにこれらの混合物のような成分を含有する。
【0230】
局所適用用のその他の製剤には、シャンプー、石鹸、シェイクローション等、特に頭皮のような下にある皮膚上に残差を残すように処方されたものが包含される(Arndt等、Dermatology In Greneral Medicine 2:2838 (1993))。
【0231】
一般的に、レチノール結合蛋白受容体拮抗剤またはブロッキング剤またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)阻害剤組成物の局所用製剤中の濃度は組成物の約0.5〜50重量%、好ましくは約1%から30%、より好ましくは、約2%から約20%、最も好ましくは約5%から10%の量である。使用する濃度は初期は範囲の上側であることができ、投与が継続するにつれて濃度を低下させるか、製剤の適用頻度を少なくしてよい。局所適用はしばしば一日2回行なう。しかしながら、より高用量を一日一回適用するか、またはより頻度を上げて少量づつを適用してよい。角質層は貯留場所として機能し、長時間に渡る生存皮膚層への薬剤の緩徐な浸透を可能とする。
【0232】
局所適用においては、所望の薬理学的作用を得るためには十分な量のブロッキング剤またはレチノール結合蛋白受容体拮抗剤またはブロッキング剤またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)阻害剤が患者の皮膚に浸透しなければならない。一般的には薬剤の皮膚への吸収は薬剤の性質、ベヒクルの挙動および皮膚の関数であると考えられている。三つの主な変数が吸収速度または異なる局所用薬剤または異なるベヒクル中の同じ薬剤のフラックスの相違;ベヒクル中の薬剤尾濃度、角質層とベヒクルとの間の薬剤の分配係数および角質層への薬剤の拡散係数を決定する。治療が有効であるためには、薬剤は皮膚のバリア機能を担っている角質層を通過しなければならない。一般的に、高いインビトロの皮膚浸透性を示す局所用製剤はインビボで有効である。Ostrenga等(J.Pharm. Sci.,60:1175−1179(1971)によれば、局所適用したステロイドのインビボの薬効はインビトロの皮膚採取されたヒト皮膚へのステロイドの浸透速度と比例している。
【0233】
皮膚科学的に許容され、ブロッキング剤またはレチノール結合蛋白受容体拮抗剤またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)の阻害剤と適合する皮膚浸透増強剤を製剤に配合する事により表皮のケラチノサイトへの皮膚表面からの活性化合物の浸透を増大させることができる。皮膚への活性化合物の吸収を増大させる皮膚増強剤は効果的な治療のために必要とされるブロッキング剤またはレチノール結合蛋白受容体拮抗剤等の量を提言し、そして、より長時間持続する製剤の作用をもたらす。皮膚浸透促進剤は当該技術でよく知られている。例えば、ジメチルスルホキシド(米国特許3,711,602号);オレイン酸、1,2−ブタンジオール界面活性剤(Cooper,J.Pharm. Sci.,73:1153−1156(1984));エタノールとオレイン酸またはオレイルアルコールの組み合わせ(EP267,617),2−1,3−ヘキサンジオール(WO87/03490);デシルメチルスルホキシドおよびAzone (Hadgraft,Eur.J.Drug.Metab.Pharmacokinet,21:165−173(1996));アルコール、スルホキシド、脂肪酸、エステル、Azone、ピロリドン、尿素およびポリオール類(Kalbitz等、Pharmazie,51:619−637(1996));テルペン類、例えば1,8−シネオール、メントン、リモネンおよびネロリドール(Yamane,J.Pharmacy & Pharmocology,47:978−989(1995)); AzoneおよびTranscutol(Harrison等、Pharmaceutical Res. 13:542−546(1996));およびオレイン酸、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール(Singh等,Pharmazie,51:741−744(1996))が活性成分の皮膚浸透性を改善させることがわかっている。
【0234】
ブロッキング剤またはレチノール結合蛋白受容体拮抗剤またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)阻害剤組成物の浸透性の水準は当該技術でよく知られた方法で測定することができる。例えば、活性化合物を放射標識し、その後、皮膚により吸収された放射標識化合物の量を測定することにより、当業者は被験化合物の皮膚浸透性を測定する幾つかの方法の何れかを用いて吸収された組成物の量を測定することができる。皮膚浸透性試験に関する参考文献はW.G.and G.S.Hawkinsの「バイオ医学研究におけるブタ」中の「経皮浸透性測定のための動物モデルとしての離乳ヨークシャーブタ」 (M.E.Tumbleson,Ed.)Plenum,New York,1986および Hawkins,G.S. の「膚吸収方法」おける「インビトロ皮膚浸透性測定の実施方法」B.W.Kemppainen and W G Reifenrath,Eds.,CRC Press,Boca Raton,1990,pp.67−80;およびW.G.Reifenrath,Cosmetics & Toiletries,110:3−9(1995)。
【0235】
一部の適用においては、当該技術で既知の製剤、例えば重合体を持ち手ブロッキング剤またはレチノール結合蛋白受容体拮抗剤またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)阻害剤組成物の長時間作用形態を投与することが好ましい。レチノール結合蛋白受容体拮抗剤またはブロッキング剤またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)の阻害剤を当該技術で既知の方法に従って皮膚パッチ (Junginger,H.E.,Acta Pharmaceutica Nordica 4:117(1992); Thacharodi等、Biomaterials 16:145−148(1995); Niedner R.,Hautarzt 39:761−766(1988))または包帯に配合する事により、治療すべき領域への薬剤の供給を増大させることができる。
【0236】
場合によっては、本発明の局所用製剤は別の賦形剤、例えば保存料、例えばメチルパラベン、ベンジルアルコール、ソルビン酸または第4アンモニウム化合物;安定化剤、例えばEDTA、抗酸化剤、例えばブチル化ヒドロキシトルエンまたはブチル化ヒドロキシアニソール、および緩衝剤、例えばクエン酸塩またはリン酸塩を含有できる。
【0237】
医薬組成物は錠剤、カプセルまたは溶液の形態の経口用製剤として投与できる。経口用製剤の有効量を、増殖性疾患、癌または光老化などが軽減するまで、1日1回から3回投与する。レチノール結合蛋白受容体拮抗剤またはブロッキング剤またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)の阻害剤の有効量は患者の年齢、体重および症状に応じて変化する。一般的に、ブロッキング剤またはレチノール結合蛋白受容体拮抗剤またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)の阻害剤の一日当たり経口用量は1200mg未満、100mgより高用量である。好ましい一日当たり経口用量は約300〜600mgである。経口用製剤は好都合には単回投与形態で与えられ、製薬分野で既知のいかなる方法で調製してもよい。組成物は適当な医薬適合性の担体と共に如何なる所望の剤型に製剤してもよい。典型的な単回投与形態は、錠剤、丸薬、粉末、溶液、懸濁液、乳液、顆粒、カプセル、座剤を含む。一般的に、製剤はブロッキング剤またはレチノール結合蛋白受容体拮抗剤またはレチン酸合成酵素(レチノールデヒドロゲナーゼおよびレチナールデヒドロゲナーゼを含む)の阻害剤の組成物を液体担体または微細分割固体担体または両方と、必要に応じて成型しながら、均質緊密に混合することにより調製する。活性成分は液体、粉末、錠剤またはカプセルの形態で種々の基剤物質に配合して皮膚増殖性疾患を治療する活性成分の有効量を得ることができる。
【0238】
本発明において使用するのに適する他の治療薬は、目的のために有効である何れかの適合性のある薬剤、または、製剤に補助的である薬剤である。例えば、本発明の製剤による治療は他の治療、例えばコルチコステロイド、カルシポトリン、コールタール製剤による局所投与、メトトレキセート、レチノイド、シクロスポリンAの全身投与、および、光化学療法と組み合わせることができる。複合療法は急性および重度の皮膚増殖性疾患の治療のために特に重要である。複合療法で用いる製剤は、複合作用が得られるように、他の薬剤と同時または逐次的に投与してよい。
【0239】
本発明の別の特徴
本発明の別の特徴を以下に番号を付したパラグラフにおいて記載し、本発明はこれらの特徴を含むものとする。
【0240】
パラグラフ1 増殖亢進性障害または光老化に罹患した患者の治療方法であって、レチノール結合蛋白受容体(RBPr)の拮抗剤を患者に投与することを含む上記方法。
【0241】
パラグラフ2 増殖亢進性障害または光老化に罹患した患者の治療方法であって、患者の細胞中のレチノール結合蛋白受容体(RBPr)の活性をブロックすることを含む上記方法。
【0242】
パラグラフ3 増殖亢進性障害または光老化に罹患した患者の治療方法であって、患者の細胞中のレチン酸(RA)の内因性濃度を低下させることを含む上記方法。
【0243】
パラグラフ4 パラグラフ2または3に記載の方法であって、レチノール結合蛋白受容体(RBPr)の拮抗剤を患者に投与することを含む上記方法。
【0244】
パラグラフ5 パラグラフ2、3または4に記載の方法であって、レチン酸の内因性濃度が増殖亢進性細胞または外患者の光老化に罹患した細胞中で低下される上記方法。
【0245】
パラグラフ6 パラグラフ2から5の何れかに記載の方法であって、細胞中のレチン酸の内因性濃度が細胞増殖が低減するか消失する程度まで低減される上記方法。
【0246】
パラグラフ7 増殖亢進性障害または光老化に罹患した患者の治療の方法において使用するためのレチノール結合蛋白受容体拮抗剤。
【0247】
パラグラフ8 患者における増殖亢進性障害または光老化を治療する方法において使用するための細胞におけるレチン酸の内因性濃度を低下させることができる薬剤。
【0248】
パラグラフ9 レチノール結合蛋白受容体(RBPr)の拮抗剤であるパラグラフ8に記載の薬剤。
【0249】
パラグラフ10 パラグラフ1または4に記載の方法または免疫グロブリンであるパラグラフ7、8または9に記載の薬剤または拮抗剤。
【0250】
パラグラフ11 薬剤がレチノール結合蛋白受容体に結合することができる抗体であるパラグラフ1または4に記載の方法またはパラグラフ7〜10の何れかに記載の薬剤または拮抗剤。
【0251】
パラグラフ12 薬剤がレチノール結合蛋白の受容体結合領域由来の配列を有するペプチドであるパラグラフ1または4に記載の方法またはパラグラフ7、8または9に記載の薬剤または拮抗剤。
【0252】
パラグラフ13 ペプチドがレチノール結合蛋白のK29−Q38、G59−A71およびM88−D102およびペプチドG59−A71およびM88−D102からなるヘテロダイマーから選択される配列を有するパラグラフ12に記載の方法、薬剤または拮抗剤。
【0253】
パラグラフ14 パラグラフ1から4に記載の方法またはレチノール結合蛋白受容体の発現を抑制することのできるアンチセンス化合物であるパラグラフ7、8または9に記載の薬剤または拮抗剤。
【0254】
パラグラフ15 アンチセンスRNAまたはアンチセンスDNAであるパラグラフ14に記載の方法、薬剤または拮抗剤。
【0255】
パラグラフ16 アンチセンス分子がオリゴヌクレオチドであるパラグラフ14または15に記載の方法、薬剤または拮抗剤。
【0256】
パラグラフ17 増殖亢進性障害が乾癬、尋常性挫瘡または癌である前記パラグラフの何れかに記載の方法、薬剤または拮抗剤。
【0257】
パラグラフ18 レチノール結合蛋白受容体の拮抗剤を同定するための方法であって、候補化合物にレチノール結合蛋白受容体を発現する細胞を接触させること、および、該細胞内のレチン酸の濃度が該接触の結果として低下したかどうかを調べること、を含む上記方法。
【0258】
パラグラフ19 細胞内のレチン酸の内因性濃度を低下させることのできる化合物を同定するための方法であって、候補化合物にレチノール結合蛋白受容体を発現する細胞を接触させること、および、該細胞内のレチン酸の濃度が該接触の結果として低下したかどうかを調べること、を含む上記方法。
【0259】
パラグラフ20 レチノール結合蛋白とレチノール結合蛋白受容体との間の相互作用を抑制することができる化合物を同定するための方法であって、レチノール結合蛋白の存在下、候補化合物にレチノール結合蛋白受容体、または、レチノール結合蛋白に結合することのできるそのフラグメントを接触させること、および、受容体に結合しているレチノール結合蛋白の濃度が低下したかどうか調べることを含む上記方法。
【0260】
パラグラフ21 増殖亢進性細胞の増殖を低減する方法であって、細胞のレチノール結合蛋白受容体の活性をブロッキングすることを含む上記方法。
【0261】
パラグラフ22 前記パラグラフの何れかに記載の方法であって、レチノール結合蛋白受容体の拮抗剤に細胞を接触させるステップ、を更に含む上記方法。
【0262】
パラグラフ23 該細胞中のレチン酸の内因性濃度が低下される前記パラグラフの何れかに記載の方法。
【0263】
パラグラフ24 増殖亢進性細胞を分化させる方法であって、細胞のレチノール結合蛋白受容体の活性をブロックすることを含む上記方法。
【0264】
パラグラフ25 レチノイド感受性傷害に罹患した患者の症状を治療または軽減する方法であって、レチノイド感受性傷害がレチノイドの投与により治療できる障害であり、患者の細胞内のレチノール結合蛋白受容体の活性をブロックすることを含む上記方法。
【0265】
パラグラフ26 レチノイド感受性傷害が患者にレチノイドの生理学的濃度より高い濃度を投与することにより治療されるか、その症状が軽減される障害である、パラグラフ25に記載の方法。
【0266】
パラグラフ27 医薬適合性の担体または希釈剤と共にレチノール結合蛋白受容体拮抗剤の治療有効量を含有する、増殖亢進性障害または光老化に罹患した患者の治療に適する医薬組成物。
【0267】
パラグラフ28 パラグラフ18、19または20に記載の方法により同定される化合物または拮抗剤。
【0268】
(実施例)
実施例1.ヒトケラチノサイトおよび乾癬プラークにおけるレチノール結合蛋白受容体蛋白の合成
抗ヒトレチノール結合蛋白受容体ペプチド抗体を以下に記載のとおり発生させる。ヒトにおいて発現されたレチノール結合蛋白受容体に相当するcDNA(GenBank受託番号NM_000329)を9アミノ酸ペプチドの設計のための基本として用いる。ペプチドは以下の配列:VNGATAHPHを有する。
【0269】
ペプチドはシェフィールド大学の中心施設で合成し、キーホールリンペットへモシアニン(KLH)に結合させ、認可された操作法によりウサギ2匹において抗血清を作成する。本質的にBavik等Mechanisms of Development 1997:69,p.155−167に記載の製造元(Amersham−Pharmacia)により推奨されるとおり活性化セファロースB上に固定化したレチノール結合蛋白受容体ペプチドを用いてウサギ抗血清から抗体を精製する。レチン酸合成酵素に対する抗体を選択し、前述した2ハイブリッド試験により細胞内結合能力があるかどうか調べた。
【0270】
ペプチドはレチノール結合蛋白受容体に特異的である。レチノール結合蛋白受容体を認識する精製された抗体の能力は、SDS−PAGEおよび抗体を用いた蛋白ブロットにより、本質的にBavik等Mechanisms of Development 1997:69,p.155−167に記載のとおり、ケラチノサイトの蛋白含有量の分析により評価する。
【0271】
レチノール結合蛋白受容体の細胞特異的分布は、Wardlaw等のBiology of Reproduction 1997:56,p.125−132に記載の標準的な免疫組織化学的方法を用いて分析する。レチノールデヒドロゲナーゼ(RoDH)に対する抗体を用いてこれらの蛋白を局在化させる。発現パターンは図2および3に示すとおりである。
【0272】
図2は正常皮膚におけるレチノール結合蛋白受容体(RBPr)およびレチノールデヒドロゲナーゼ(RoDH)の同時局在化を示す。即ち図2はレチン酸シグナルの発生に関与している蛋白は正常皮膚の有棘層の表面辺縁部と顆粒層の境界部に共に存在していることを免疫組織化学的局在化を用いて示している。
【0273】
図3は乾癬プラークにおけるレチノール結合蛋白受容体(RBPr)およびレチノールデヒドロゲナーゼ(RoDH)の同時局在化を示す。即ち、図3はレチン酸シグナルのは性に関与している蛋白が乾癬プラーク中に共に存在している事を免疫組織化学的局在化を用いて示している。
【0274】
実施例2:レチノール結合蛋白受容体に対するモノクローナル抗体
モノクローナル抗体は本質的にBavik等、Experimental Cell Research 1995:216,p.358−362に記載のプロトコルを用いてレチノール結合蛋白受容体に対して発生させる。抗体は眼に認められるヒトレチノール結合蛋白受容体(Nicoletti等,1995,Hum. Mol. Genet. 4(4),641−649)に対して、並びに、後に記載するとおりクローニングしたケラチノサイト特異的レチノール結合蛋白受容体に対して発生させる。
【0275】
マウスモノクローナル抗ウシレチノール結合蛋白受容体抗体(P142)は上記Bavik等の記載に従って作成する。この抗体はウシRPEミクロソーム中でレチノール結合蛋白受容体に対する反応性を示す。詳細なプロトコルは上記Bavik等により示されており、プロトコルの要旨は以下に記載するとおりである。
【0276】
RPEミクロソームを凍結ヒト眼から単離し、本質的にBavik等、Experimental Cell Research 1995:216,p.358−36に記載のとおりBALB/Cマウスの手掌免疫化のために用いる。リンパ説を単離し、ホモゲナイズし、P3X63−Ag.653ミエローマ細胞と融合させる。ハイブリドーマを分散させ、96ウェルプレートで培養する。後に記載するとおり、正しい特異性のIgを含有するウェル中の細胞をサブクローニングし、特異性を評価し、凍結保存する。
【0277】
この方法により生産されたモノクローナル抗体はBavik等、Experimental Cell Research 1995:216,p.358−362に記載のプロトコルを用いて試験したところウシRPEミクロソームへの標識レチノール結合蛋白の結合を特異的にブロックすることができる。それらはまたクローニングされたヒトケラチノサイトレチノール結合蛋白受容体cDNAのインビトロの転写により合成される標識されたレチノール結合蛋白受容体蛋白を特異的に免疫沈降させることができる。無関係の対照Igは両方の試験ともに陰性である(Bavik等,1995)。
【0278】
ケラチノサイト特異的レチノール結合蛋白受容体に対するモノクローナル抗体を作成するために、精製された受容体をBALB/Cマウスに注入し、抗体を上記した通り単離する。
【0279】
実施例3.増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの培養を含むプロトコル
増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの培養のために用いる方法は本質的にはBavik等、Experimental Cell Research 1995:216,p.358−362に記載の正常ヒト表皮ケラチノサイトの培養のためのものと同様である。採用したプロトコルの要旨を以下に記載する。
【0280】
材料
ケラチノサイト生育培地(KGM):血清非含有培地(Clonetics,Promocell,Gibco)に以下のものを加えたもの、即ち、低Ca2+のウシ下垂体抽出液(0.03−0.5mM);PBSA(PBS Ca2+ & Mg2+非含有);EDTA(0.5%);トリプシン(1:250、0.2&0.6%);低温保存アンプル;遠沈管、50ml;ペトリ皿、微生物試験等級、100ml;外科用メス、曲型鉗子;ヨウ素10%(Betadine)。
【0281】
全トランスレチノール(ROL)、レチン酸(RA)、CaCl2ジスルフィラム、カルベノキソロンおよびシトラールはSigma Chemical Co.から購入する。RBPはドナー血清から精製する(Peterson,P.A.(1971),J.Biol. Chem.246,34−43)。
【0282】
抗体
モノクローナル抗体P142は文献記載の方法によりRPEミクロソームから調製する(Bavik,C.O.,Peterson,P.A.,Eriksson,U.(1995),Exp.Cell.Res.216,358−362)。対照IgMはシェフィールド大学のAntibody Resource Centreで作成される。
【0283】
ケラチン1DNAプローブの生成
ヒトK1cDNAの配列(1046−1630)はプライマー5’−GCATCATTGCTGAGGTCAAGGC−3’および3’−CACCTCCAGAACCATAGC−5’を用いてPCR(Pfu ポリメラーゼ35サイクル)により増幅した。この配列をPCR−Script Amp Cloning Kit (Stratagene)を用いてJM109細胞(Promega)にクローニングし、そして細胞をLBブロス中でスケールアップした。プラスミドDNAをHiSpeed Plasmid Midi Kit(QIAGEN)を用いてJM109細胞から抽出した。プローブ配列はBamH1およびSacII制限酵素(Promega)をもちいて切り出した。DNAを1.5%アガロースゲル上で泳動し、切り出し、QIAexII Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いて精製した。
【0284】
増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの培養プロトコル
生検試料は乾癬患者から入手する。慢性のプラーク乾癬を有する患者の皮膚をインフォームドコンセントのもとに入手する。南シエフィールド地区倫理委員会から予め倫理的認可を得ておく。生検試料は40歳から60歳の乾癬患者の下背部から採取する。
【0285】
表皮の分離
皮下組織および一部の真皮をはさみで除去し、皮膚を1×2cm片にメスで切る分ける。PBSAで2回から5回組織を洗浄する。皮膚試料を4℃で一夜(または37℃で20分から30分間)PBSA(pH7.4)中の0.6%トリプシン上で浮遊させる。
【0286】
表皮の分離は慎重にモニタリングする。表皮の最初の脱着が皮膚試料の切断端部にて見とめられた時点でその試料片を100mMのペトリ皿に入れる(真皮側を下側にする)。完全培地(血清含有)5mlで灌流する。ピンセットを用いて表皮を剥離し、これを、完全培地(KGM)20mlの入った50mLの遠沈管中に採取する。穏やかにピペッティングして100μmメッシュのナイロンガーゼを通して篩い分けすることにより表皮細胞からケラチノサイトを分離する。単離した表皮細胞を100Gで10分間遠心分離することによりKGM中で2回洗浄し、細胞の総数を計数する。
【0287】
代替法は以下に示す通りであり、これは正常ヒトケラチノサイトに対して使用して良い。
【0288】
皮膚片をBetadine溶液(10%ヨウ素)中で30分間十分洗浄し、その後、PBS中で2×10分洗浄する。メスを用いて皮下組織と真皮を除去した後、皮膚を5×10mm片に切り分ける。皮膚片をPBS中で5回洗浄した後、4℃で18時間Dispase(II等級、2.4U/ml,Boehringer Mannheim)中でインキュベートする。
【0289】
次に皮膚片を真皮側を下にして100mlのペトリ皿に入れ、KSFM5mlで灌流する。ピンセットで表皮を剥離し、37℃で10分間1xTrypsin/EDTA溶液10ML中でインキュベートし、その後KSFM10mlを添加する。移送ピペットから吸引吐出することにより試料を機械的に攪拌する。得られた細胞懸濁液をKSFMで洗浄しながら細胞ストレーナー(Becton Dickinson)を用いて篩い分けする。次に単離した表皮細胞を10分間100gで遠心分離することによりKSFM中で2回洗浄する。細胞は以下の通り播種する。
【0290】
一次培養
細胞を25cm2の細胞培養フラスコ中、2500個/cm2の密度でKGM培地中に37℃で播種する。培地を48時間毎に交換し、全面培養となるまで継代する。
【0291】
正常ヒトケラチノサイトについては、以下の操作法を用いてよい。
【0292】
一次培養物をK−SFM 25cm2細胞培養フラスコ中、3500個/cm2の密度で播種した。播種の翌日およびその後は一日おきに培地を交換(フラスコ当たり5ml)した。70%から80%全面培養に達した時点で、新しい25cm2フラスコ中3500個/cm2の密度で播種することにより細胞を継代した。継代培養物が全面培養に達した当日、培地を被験投与剤を含有する培地に交換した。
【0293】
細胞を4日間培養し、細胞回収時まで一日おきに被験培地を交換した。
【0294】
RNA抽出および分析
RNAの抽出はRNeasyキット(QIAGEN)を用いて製造元の取扱説明書に従って行なう。各投与につきRNA20μgを1.2%アガロース(1.8%ホルムアルデヒド)ゲル上で分離し、キャピラリー移送によりナイロン膜(Zeta プローブ GT膜、BioRad)上に移送した。RNAをUV交差結合により膜に固定する。分化マーカーK1およびK10に対するDNAプローブ(50ng)を製造元の取扱説明書に従ってPrime−It RmT Primerラベリングキット(Stratagene)を用いて[α−32P]dCTPで標識する。未取り込みのヌクレオチドはMicrospin G25カラム(Pharmacia Biotech)を通して溶離することにより除去する。ブロットを65℃で30分間0.25Mリン酸ナトリウム(pH7.2)/7%SDS中で湿潤させる。新しいハイブリダイゼーション溶液を放射標識プローブとともに添加し、ブロットを65℃で一夜ハイブリダイズする。
【0295】
ブロットを0.25Mリン酸ナトリウム(pH7.2)、7%SDS中で2×5分間、次いで、20mMリン酸ナトリウム(pH7.2)、5%SDS中で2×5分間、65℃で洗浄する。シグナルと非特異的バックグラウンドとの間に明確な区別が可能となるまで洗浄ステップを反復する。ブロットを24時間X線フィルムに露光した後に現像する。
【0296】
増殖試験(コールター細胞計数器)
細胞播種および分析:購入した二次培養物または一次培養物(ドナー皮膚由来)をK−SFM 25cm2細胞培養フラスコ中、3500個/cm2の密度で播種する。播種の翌日およびその後は一日おきに培地を交換(フラスコ当たり5ml)っする。70%から80%全面培養に達した時点で、各ウェルがK−SFM500μlを含有する24穴細胞培養プレート中ウェル当たり3500個を播種することにより継代する。1つのウェルプレートを各投与につき播種する。細胞を定着させるために1日を設けた後、細胞を被験培地(ウェル当たり500μl)に移しかえた。添加する保存溶液は前と同様とする。被験投与は以下の通り実施する。
【0297】
培地は一日おきに交換する。細胞はトリプシン処理により回収する。トリプシン/EDTA500μLを回収すべき各ウェルに添加し、吸引除去する。ウェルプレートは37℃で5分から6分間インキュベートする。PBS500μlをウェルに添加し、細胞を再懸濁する。細胞懸濁液をコールターカウンター「Accuvette」中のIsoton溶液20mlに添加し、細胞を計数する。各回収時につき、各投与当たり3ウェルの細胞を計数し、各ウェル当たり3回計数した。
【0298】
細胞数は以下の通り計算する。コールターカウンターは試料20mlから500μlを取り出す(1/40)。細胞数に40をかけてカップ中の細胞数とし、これは1ウェル中の総細胞数と等しい(生存性試験のために約10%を使用するため、概算値である)。
【0299】
正常ヒト表皮ケラチノサイトに対して用いる方法は本質的には乾癬ケラチノサイトに対するものと同様である。正常皮膚は腹部手術や整形手術のような手術処置により廃棄された皮膚より入手する。正常成人ヒト表皮ケラチノサイト(NHEK)は手術を受けた患者より入手する(倫理的認可はトレントマルチセンター研究倫理委員会MREC/98/4/018)。生検試料は例えば包皮、成人組織から得てよい。患者からの廃棄組織のこのような使用についてはインフォームドコンセントを得る。
【0300】
実施例4.抗体を用いた増殖亢進性乾癬ケラチノサイトにおけるレチノール結合蛋白受容体活性のブロッキング
増殖亢進性乾癬ケラチノサイトは2μMヒトレチノール結合蛋白の存在または非存在下に血清非含有培地中、上記した通り培養する。全面培養となった後、細胞を1mg/mlモノクローナルIgまたは1mg/ml未関連対照IgM 1mg/mlで96時間(48時間後に培地交換)処理する(下記の表1参照)。表1に示す投与は2連のT−25フラスコ(各投与につき2×7ml)で行なう。
【0301】
【表1】
表1:抗レチノール結合蛋白受容体抗体P142の増殖亢進性乾癬
ケラチノサイトへの投与
【0302】
終濃度は、Ca2+1.2mM,RBP 0.6μM、免疫グロブリン1mg/mlである。
【0303】
増殖試験
図4は抗レチノール結合蛋白受容体抗体P142を投与した増殖亢進性乾癬ケラチノサイトにおける増殖試験の結果を示す。即ち、RBPはカルシウムの天下(1.2mM)の分化作用を克服して培養増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの増殖を増大させる。この作用は培地にモノクローナル抗体P142を添加した後には退行している。対照のIgMの添加はカルシウムのみ(RBP存在下)を添加した場合と同様の増殖に対する作用を示す。
【0304】
即ち、対照の抗体とは異なり、抗ヒトレチノール結合蛋白受容体抗体の投与は、レチノール結合蛋白を含有する培地中で培養した場合の乾癬ケラチノサイトの増殖を増強する。抗ヒトレチノール結合蛋白受容体抗体は増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの増殖を低減する。
【0305】
分化試験
K1およびK10ケラチン(最終分化の開始のマーカー)に関わるmRNAの合成は定量的逆転写PCR(RT−PCR)により調べる。サイクリンD(細胞増殖のマーカー)に関わるmRNAの合成もまたRT−PCRにより試験する。RT−PCRの標準的プロトコルは各ケラチノサイト培養由来のRNA1μgを用いてPCR装置(PE2400)の製造元の推奨に従って行なう。RT−PCRの適当なプライマーはGenBankに寄託されているK1およびK10のヒト配列に基づいて設計する。ノーザンブロットも同様に行い、即ち、細胞を回収し、RNAを抽出し、RNA20μgをホルムアルデヒド/アガロースゲルの各ウェルに適用する。RNAをキャピラリー移送によりナイロン膜にブロットし、K1 mRNAの発現を放射標識DNAプローブとのノーザンハイブリダイゼーションにより測定する。
【0306】
図5は抗レチノール結合蛋白受容体抗体P142を投与した増殖亢進性乾癬ケラチノサイトによる分化試験の結果を示している。RBPにより引き起こされたケラチノサイトの分化(1.2mMカルシウムの分化圧力下)の抑制はP142抗体の添加により退行する。対照抗体は作用を示さず、即ち、発現はカルシウムとレチノール結合蛋白の場合と同様である。
【0307】
即ち、対照の抗体とは異なり、抗ヒトレチノール結合蛋白受容体抗体の投与は、レチノール結合蛋白を含有する培地中で乾癬ケラチノサイトを培養した場合にK1の発現を増強する。抗ヒトレチノール結合蛋白受容体抗体は増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの分化を促進する。
【0308】
抗体を用いた正常ヒト表皮ケラチノサイトにおけるレチノール結合蛋白受容体活性のブロッキング
増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの代わりに正常ヒト表皮ケラチノサイトを用いた以外は、上記した実験を繰り返す。実験培地は所定のケラチノサイト生育培地(下垂体抽出液非含有)からなるものであり、CaCl2、RBP、P142(抗RBP受容体抗体)または対照IgM含有または非含有のものとする。CaCl2は終濃度1.2mMでdH2O中の120mM(100x)溶液として添加する。RBPは0.2μMまたは0.6μMの終濃度で添加する。P142および対照IgMは1mg/mlの終濃度で添加する。
【0309】
増殖亢進性乾癬ケラチノサイト実験の場合と同様の結果が得られる。対照の抗体とは異なり、抗ヒトレチノール結合蛋白受容体抗体の投与は、レチノール結合蛋白を含有する培地中で培養した場合の正常ヒト表皮ケラチノサイトの増殖を増強する。対照抗体とは異なり、抗ヒトレチノール結合蛋白受容体抗体の投与は、レチノール結合蛋白を含有する培地中で正常ヒト表皮ケラチノサイトを培養した場合にK1の発現を増強する。抗ヒトレチノール結合蛋白受容体抗体は正常ヒト表皮ケラチノサイトの増殖を低減し分化を促進する。
【0310】
実施例5.ペプチド競合を用いた増殖亢進性乾癬ケラチノサイトにおけるレチノール結合蛋白受容体活性のブロッキング
【0311】
意図的に作成されたペプチド
合成ペプチドを知られたレチノール結合蛋白構造のオープニングループに基づき、そして、そのC末端に対して設計され、そしてレチノール結合蛋白受容体活性の抑制を示すかどうか試験する。
【0312】
レチノールが蛋白に出入りすると考えられるレチノール結合蛋白のオープニングは3種のループに包囲されている。これはトランスチレチン結合領域であり、蛋白のレチノール結合蛋白受容体結合領域であると推定されている(Naylor and Newcomer,Biochemistry 1999:38,p.2647−2653; Sivaprasadarao and Findlay,Biochemical Journal 1994:300,p.437−442; Sundaram等、Methods in Molecular Biology 1998:89,p.141−153)。合成ペプチドは、レチノール結合蛋白受容体活性の推定拮抗剤として使用するためにヒトレチノール結合蛋白中のオープニングループペプチドのアミノ酸に相当するように合成してよい。表2に示す2種の特異的ペプチドを試験する。
【0313】
【表2】
表2:RBPループペプチド
【0314】
アミノ酸はCowan等、Proteins: Structure,Function and Genetics 1990:8,p.44−61に記載の通り番号を付した。ペプチド589(Gly−Arg−Val−Arg−Leu−Leu−Asn−Asn−Trp−Asp−Val−Cys−Ala)および592(Met−Lys−Tyr−Trp−Gly−Val−Ala−Ser−Phe−Leu−Gln−Lys−Gly−Asn−Asp)は、シェフィールド大学のArthur MoirによりRBPのその受容体に対する推定結合領域を摸倣するように合成される。
【0315】
次に、実施例3に記載の通り、増殖亢進性表皮ケラチノサイトを入手し、単離し、培養する。増殖亢進性乾癬ケラチノサイトは前述の通り血清非含有培地中、ヒトレチノール結合蛋白2μMの存在下または非存在下に培養する。全面培養となった後、細胞に6μmのペプチドを96時間(48時間後に培地交換)投与する(下記の表3参照)。表3に示す投与は2連のT−25フラスコで行なう(各投与につき2×7ml)。
【0316】
以下の表3はこれらの実験の投与をまとめたものである。
【0317】
【表3】
表3:RBP受容体のペプチド抑制を用いた増殖亢進性乾癬ケラチノサイト
における分化試験の投与
終濃度は、Ca2+1.2mM、RBP 0.6μM、ペプチド6μMである。
【0318】
増殖試験
RBPループペプチドを投与した増殖亢進性乾癬ケラチノサイトにおける増殖試験によれば、カルシウム添加(1.2mM)の分化作用を克服して培養増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの増殖を増大させるRBPの作用は培地にペプチド589またはペプチド592の何れかを添加した後に退行する。対照ペプチドの添加はカルシウム添加のみの場合と同様の増殖に対する作用を示す。
【0319】
分化試験
K1およびK10の発現を上記実施例4に記載の通り測定する。
【0320】
図6はRBPループペプチド589および592を投与した増殖亢進性乾癬ケラチノサイトに対して行なった分化試験の結果を示す。この図によれば、RBPによる乾癬ケラチノサイトにおける分化の抑制はRBP由来のペプチド592またはペプチド389の添加により退行する。
【0321】
即ち、6μMのペプチド589は増殖亢進性乾癬ケラチノサイトにおいて、増殖を低減し、K1およびK10マーカーの発現を増強する。更に、6μMのペプチド592は同じ作用を有する。同じアミノ酸を含むが逆の順序で合成されたペプチドは試験において全て陰性である。
【0322】
K29−Q38およびC174−L183を含む他のペプチドを試験すると、同じ作用を有することが解かる。
【0323】
エピトープディスプレースクリーニングにより単離されたペプチド
増殖亢進性乾癬ケラチノサイトおよび正常ヒト表皮ケラチノサイトの増殖を低減することのできるペプチドはエピトープディスプレーファージライブラリのスクリーニングによっても単離される。
【0324】
ウシRPEミクロソームをBavik等、Journal of Biological Chemistry 266:14978−14985,1991に記載の通り単離する。RPEミクロソーム20mgをファージディスプレーライブラリ10μlと混合する(Scott JK and Smith GP,Science 249:386−390,1990)。混合物を30分間4℃でインキュベートし、本質的にBavik等、Journal of Biological Chemistry 266:14978−14985,1991に記載の通り、ウシ血清アルブミン溶液を用いて遠心分離することによりミクロソームをペレット化する。
【0325】
ペレットを再懸濁し、Scott JK and Smith GP,Science 249:386−390,1990に記載の通りファージを増殖する。ファージの選択と増殖の上記方法は2回反復する。最後に、選択されたファージを20mMヒトRBPとともに新しいRPEミクロソームと混合し、上記した通り遠心分離する。上澄み中に残存するファージを採取し、増殖する。
【0326】
個々のファージは対数期のEsherichia coli K91 Kan培養物を感染することにより単離し、そして25mg/mlのテトラサイクリンを含有するLBプレート上にプレーティングする。個々のファージのDNAを精製し、標準的な方法で配列決定する(Sambrook等、1989)。20個のクローニングされたファージを配列決定すると、独特のディスプレーペプチド配列5群、即ちペプチドA、ペプチドB、ペプチドC、ペプチドD、ペプチドEをコードすることが解かる。単離されたファージによりコードされるものに相当する5つのペプチド(A−E)は前記したとおり合成される。
【0327】
初回の結合試験はペプチドの結合特異性を測定するために構築する。ウシRPEミクロソームへの0.2mM標識ヒトRBPの結合(Bavik等、Journal of Biological Chemistry 266:14978−14985,1991に記載の通り測定)はペプチド(A−E)10μmにより抑制される。同じアミノ酸を含有するが逆順序に合成されたペプチドは試験において全て陰性である。
【0328】
ペプチド(A−E)を前述の通り、増殖亢進性乾癬ケラチノサイトに対する増殖試験および分化試験において試験すると、増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの増殖を防止し、分化を促進する活性が有ることがわかる。
【0329】
ペプチド競合を用いた正常ヒト表皮ケラチノサイトにおけるレチノール結合蛋白受容体活性のブロッキング
増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの代わりに正常ヒト表皮ケラチノサイトを用いる以外は上記の通り実験を反復する。
【0330】
実験培地は所定のケラチノサイト生育培地(下垂体抽出液非含有)からなるものであり、CaCl2,全RBPまたは各ペプチド含有または非含有のものとする。CaCl2は終濃度1.2mMでdH2O中の120mM(100x)溶液として添加し、RBPは終濃度0.6μMで0.25mg/mlの保存溶液として添加する。ペプチドはEtOHに溶解し、終濃度3μMで100X保存溶液として添加した。
【0331】
正常ヒト表皮ケラチノサイトにRBPループペプチドを投与した場合、増殖亢進性乾癬ケラチノサイトを投与した場合と同様の結果が得られる。即ち、6μMペプチド589または6μMは増殖を低減しヒト正常表皮ケラチノサイトにおけるK1およびK10マーカーの発現を増強する。同じアミノ酸を含有するが逆順序に合成されたペプチドは試験において全て陰性である。
【0332】
実施例6.抗体およびペプチド競合を用いた腎癌細胞におけるレチノール結合蛋白受容体活性のブロッキング
腎癌細胞系統(COS1およびCOS7)をEurope Cell Culture Collectionから購入し、解凍し、そして供給元の取扱説明書に従って増殖させる。即ち細胞は20000個/cm2の密度では種子、抗体P142、対照免疫グロブリン、ペプチド589、ペプチド592または対照ペプチドを播種後24時間に一回のみ投与する以外は正常ヒトケラチノサイトの場合と本質的に同様に培養する(上記実施例3)。
【0333】
増殖は上記した通りコールターカウンターで細胞を計数することにより試験する。
【0334】
COS−1およびCOS−7の結果
COS−1およびCOS−7への投与は下記の表4に示す通りである。
【0335】
【表4】
表4:COS−1およびCOS−7細胞系統への投与は以下の通り行なう。
即ち、500μlを各ウェルへの投与に用いた。DMEM培地は10
%ウシ胎児血清および2mM L−グルタミンを含有する。
【0336】
図7は抗レチノール結合蛋白受容体抗体P142、対照抗体、ペプチド589、ペプチド592および対照抗体を投与したCOS−1の増殖試験の結果を示している。この図は投与後24時間(上)および48時間(下)に回収した細胞の数を示すグラフからなる。この図によれば、ペプチド592および589の投与後にCOS−1細胞の増殖が顕著に低減され、そして免疫グロブリンP142の添加後の増殖低減はより少なかった。
【0337】
図8は抗レチノール結合蛋白受容体抗体P142、対照抗体、ペプチド589、ペプチド592および対照抗体を投与したCOS−7の増殖試験の結果を示している。この図は投与後24時間(上)および48時間(下)に回収した細胞の数を示すグラフからなる。この図によれば、ペプチド592および589の投与後にCOS−7細胞の増殖が顕著に低減され、そして免疫グロブリンP142の添加後の増殖低減はより少なかった。
【0338】
実施例7.抗体およびペプチド競合を用いたヒト皮膚線維芽細胞におけるレチノール結合蛋白受容体活性のブロッキング
完全培地で灌流した後に皮膚部分を37℃で16時間50mL遠沈管中DMEM20ml中のコラゲナーゼ(Sigma)1mg/mlとともにインキュベートする以外は、本質的に増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの培養(実施例3)と同様に線維芽細胞の培養を行なう。次に5%ウシ胎児血清および1%抗生物質/抗真菌剤溶液(Gibco)を含有するDMEM20mlを添加し、そして、25cm2細胞培養フラスコ中2500個/cm2の細胞密度でDMEM培地+添加物質中に37℃で播種する。培地は48時間おきに交換し、全面培養時に細胞を継代する。
【0339】
ヒト皮膚線維芽細胞への投与は下記の表5に示すとおりである。
【0340】
【表5】
表5:ヒト線維芽細胞への投与は以下の通り行なう。即ち、500μlを各
ウェルへの投与に用いた。FGM培地は10%ウシ胎児血清を含有し
た。
【0341】
図9は抗レチノール結合蛋白受容体抗体P142、対照抗体、ペプチド589、ペプチド592および対照抗体を投与したCOS−1の増殖試験の結果を示している。この図は投与後24時間(上)および4日(下)に回収した細胞の数を示すグラフからなる。この図によれば、免疫グロブリンP142の添加後の線維芽細胞の増殖は低減され、そしてペプチド592および589の投与後の増殖の低減がより大きかった。
【0342】
実施例8.アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた細胞におけるレチノール結合蛋白受容体活性のブロッキング
kRBPr特異的アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(オリゴ)のレチノール結合蛋白受容体発現およびヒトケラチノサイトの増殖および分化に対する作用を調べる。アンチセンスオリゴの設計はケラチノサイトRBP受容体配列の開始メチオニンを含む領域に相補的なオリゴに基づいて行ってよい。この方法は卵黄嚢レチノール結合蛋白合成の抑制のために良好に用いられている(Bavik等、1996,Proc.Natl.Acad.Sci.93,3110−3114)。
【0343】
Met1および更に下流の17塩基に対する開始コドンのアンチセンス立体配置に相当するオリゴはシェフィールド大学遺伝医学部門の中心施設において合成する。
【0344】
増殖亢進性乾癬ケラチノサイトおよび正常ヒト表皮ケラチノサイトは前述したとおり入手し、培養する。アンチセンスオリゴは24、48および72時間、25、50および100μMの濃度で培地中に含有させる。kRBPrの発現は、Bavik等、Mechanisms of Development 1997:69,p.155−167と本質的に同様にして、SDS−PAGEを用いた細胞の蛋白含有量の分析、および、抗レチノール結合蛋白受容体抗体を用いた蛋白ブロットにより、オリゴ投与後に調べる。
【0345】
48時間75μMアンチセンスオリゴヌクレオチドの増殖亢進性乾癬ケラチノサイトおよび正常ヒト表皮ケラチノサイトへの投与はkRBPrの発現を低減することが解かる。更に、投与の結果として、増殖亢進性乾癬ケラチノサイトと正常ヒト表皮ケラチノサイトの分化、および、K1およびK10マーカーの発現の促進がもたらされる。同様の結果が腎癌細胞系統COS−1およびCOS−7並びに皮膚線維芽細胞系統においても得られる。
【0346】
他の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計して試験する。例えば、アンチセンスオリゴがkRBPrの発現を効果的にブロックできないことが解かった場合、効果的なオリゴが得られるまで5〜10bpより3’側に位置する配列を用いて再度設計する。効果的なアンチセンスオリゴが発見できたら、レチノール結合蛋白オリゴに関して前述した方法と同様にして異なる対照オリゴ2種を設計する(Bavik等、1996,Proc.Natl.Acad.Sci.93,3110−3114)。これらの対照オリゴはkRBPrの発現を不変のままとしなければならない。対照オリゴがkRBPrの発現に影響すれば、オリゴの設計は安定な領域が発見されるまでシフトする可能性がある。更に、オリゴは好ましくはヘアピン形成が回避されるように設計する。ケラチノサイトが1つより多いレチノール結合蛋白受容体遺伝子を有する場合は、その各々に対するアンチセンスオリゴを組み合わせて用いることによりレチノール結合蛋白受容体の発現を効果的にブロックしてよい。
【0347】
実施例9.RAの合成、増殖および分化により試験した乾癬ヒト表皮ケラチノサイトに対するRDH、ADHおよびRalDHの作用
シトラールおよびジスルフィラムはアルデヒドデヒドロゲナーゼの阻害剤である。カルベノキソロンはレチノールデヒドロゲナーゼの阻害剤である。CaCl2を終濃度1.2mMでdH2O中の120mM溶液として添加する。レチノールは終濃度2μMでエタノール中2Mの保存溶液として添加する。実験培地は所定のケラチノサイト生育培地(下垂体抽出液非含有)からなるものであり、CaCl2,全トランスレチノールまたは各阻害剤含有または非含有のものとする。
【0348】
使用したプロトコルはBavik等、Experimental Cell research 1995:216,p.358−362に記載の通りである。簡単に説明すると、継代培養物をKGM中全面培養となるまで生育させる。全面培養に達した当日、2μMホロ−RBP+/−阻害剤(0.6μMカルベノキソロン;50μMフェニルアルシン;10μMシトラール;0.2mM 4−メチルピラゾール;15μMジスルフィラム;10μMシトラール;2mM 3−メルカプトプロピオン酸;または薬剤ベヒクルのみ)を添加したケラチノサイト分化培地(1.2mMCa2+、KDM)に交換する。細胞は4日間生育させ、細胞と培地を回収する。
【0349】
細胞および培地中のRAの濃度をHPLCで直接分析する。本質的には、「培養ヒト表皮ケラチノサイトにおけるレチノール代謝の特性化」、Randolph R.K. and Simon M.,J.Biol.Chem.268:9198−9205,1993に従う。細胞中のRAの濃度はまた、本質的に、Elder等、「ヒト皮膚線維芽細胞におけるCRABPII mRNAのレチノイド誘導:レチノイドバイオアッセイとしての使用」、J.Investigative Dermatology 106:517−521,1996の記載に従って、ケラチノサイト中のCRABPII mRNAのノーザンブロット分析により間接的に分析する。
【0350】
増殖試験
増殖亢進性乾癬ケラチノサイトは2μMヒトレチノール結合蛋白を添加するか添加することなく、血清非含有培地中で、上記した通り培養する。全面培養に達した時点で、レチン酸合成の抑制剤(カルベノックス、ジスルフィラムおよびシトラール)をそれぞれ6μM、15μMおよび10μMとしたものを96時間(培地は48時間後に交換)細胞に投与する(以下の表6参照)。表6に示す投与は2連のT−25フラスコ(各投与につき2×7ml)で行なう。
【0351】
以下の表6は本実験の一部として実施した増殖試験に関する正常ヒト表皮ケラチノサイトの投与を示している。細胞はコールターカウンターで計数する。
【0352】
【表6】
表6:増殖試験に関するレチン酸合成抑制剤の増殖亢進性乾癬ケラチノサイ
トへの投与
【0353】
レチン酸合成抑制剤を投与した増殖亢進性乾癬ケラチノサイトに対する増殖試験の結果を図10に示す。この図によれば、レチノールの添加により、そして純粋なレチン酸の添加により更に高度に誘導されたケラチノサイトの増殖は、RA合成の抑制剤により低減する。特に顕著な作用はカルベノキソロンの添加によりみとめられる。
【0354】
分化試験
以下の表7は本実験の一部として実施した分化試験に関する正常ヒト表皮ケラチノサイトへの投与を示す。
【0355】
【表7】
表7:分化試験に関するレチン酸合成の抑制剤の増殖亢進性乾癬ケラチノサイトへの投与
【0356】
増殖および分化のマーカーに対するmRNAの合成はヒトサイクリン−A、K5、K6、K14、MDM2K1,K10、ベータ1インテグリン、トランスグルタミナーゼおよびインボルクリンに対する標識プローブを用いたノーザンブロットにより調べる。プローブはプライマーの設計の基本としてGenBankに寄託された配列を用いてヒトケラチノサイトRNAのRT−PCRにより生成する(受託番号は下記)。ノーザンブロットは上記したRNAおよびプローブを用いて、本質的にBavik等、「血漿中レチノール結合蛋白に対する網膜色素表皮膜受容体:63kDa蛋白の単離およびcDNAクローニング」、J.B.C.268:20540−20546,1993に記載の方法と同様にして行なう。
【0357】
増殖および分化のマーカーに対するmRNAの合成は半定量的逆転写PCR(RT−PCR)によっても調べる。RT−PCRの標準的プロトコルは各ケラチノサイト培養由来のRNA1μgを用いてPCR装置(PE2400)の製造元の推奨に従って行なう。RT−PCRの適当なプライマーはサイクリン−A、K5、K6、K14、MDM2K1,K10、ベータ1インテグリン、トランスグルタミナーゼおよびインボルクリンのヒト配列に基づいて設計する。
【0358】
上記配列のGenBank受託番号は、以下の通りである。即ち、サイクリンA(NM001237)、ケラチン1(M98776)、ケラチン5(AF274874)、ケラチン6(NM005554)、ケラチン10(NM000421)、ケラチン14(NM00526)、ケラチン16(AF061809)、ケラチン17 MDM2(M92424)、ベータ−1インテグリン(X07979)、トランスグルタミナーゼ(NM000359)、インボルクリン(XM001677)。
【0359】
図11はレチン酸合成抑制剤を投与した増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの分化試験の結果を示すものである。この図によれば、ROLにより誘発されたケラチノサイト中(1.2mMカルシウムの分化圧力下)の分化の抑制はRA合成抑制剤の添加により退行する。対照(エタノールのみ)は作用を有さない。
【0360】
抑制剤を使用した上記した例の各々において、レチン酸濃度は培地中で減少していることが解かる。RBPを含有する培地中で培養されている増殖亢進性乾癬ヒト表皮ケラチノサイトに対するヒトRDH、ADHまたはRalDHの阻害剤の投与はレチン酸の合成を抑制することが解かる。即ち、10μM RAは対照細胞+培地中でみとめられるのに対し、1μM RAはRDH阻害剤の存在下にみとめられる。RDH阻害剤の存在下のCRABPIIの発現濃度は対照と比較して低減する。
【0361】
実施例10.
RAの合成、増殖および分化により試験した正常ヒト表皮ケラチノサイトに対するRDH、ADHおよびRalDHの作用
乾癬ヒト表皮ケラチノサイトの変わりに正常ヒト表皮ケラチノサイトを使用しながら、上記2つの試験を反復する。
【0362】
増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの投与で得られた結果と同様の結果が得られる。即ち、レチン酸合成は6μMまでのカルベノキソロン、15μMまでのジスルフィラムまたは10μMまでのシトラールの添加により抑制される。更に、これらの阻害剤の各々の添加により増殖が抑制され、分化が促進されることがわかる。
【0363】
実施例11.
RAの合成および増殖により試験した培養腎癌細胞系統に対するRDH、ADHおよびRalDHの作用
試験したヒト腎癌細胞4検体中3検体はRBPrを過剰発現する(Ma J.Zhang D,Laser M等、「形質転換された腎細胞におけるRPE65の検出」、FEBS Letters 452 (1999) 199−204)。腎癌細胞系統(HEK293、COS1およびCOS7)はATCCから購入し、解凍し、供給元の取扱説明書に従って増殖させる。
【0364】
腎癌細胞系統中のRBPrの発現は本質的にBavik等の「網膜色素上皮において発現された血漿中レチノール結合蛋白膜受容体の特性化」J.Biological Chemistry 267:23035−23042,1992に記載の通り、ウエスタンブロットにより試験する。
【0365】
腎癌細胞系統(HEK293、COS1およびCOS7)をレチノールデヒドロゲナーゼまたはレチナールデヒドロゲナーゼ阻害剤(0.5mM カルベノキソロン;50μM フェニルアルシン;20μM シトラール;0.2mM 4−メチルピラゾール;10μM ジスルフィラム;10μM シトラール;2mM 3−メルカプトプロピオン酸;または薬剤ベヒクルのみ)の存在下または非存在下に2μM ホロ−RBPを含有する上記培地中で培養する。
【0366】
細胞および培地中のRAの濃度を上記した通りHPLCで直接分析する。レチン酸の合成は抑制されることがわかる。即ち、10μM RAは対照細胞+培地中でみとめられるのに対し、1μMはRDH阻害剤の存在下にみとめられる。RDH阻害剤の存在下のCRABPIIの発現濃度は対照と比較して低減する。
【0367】
上記した通り、サイクリンDに対する標識プローブを用いたノーザンブロットにより増殖および分化のマーカーに対するmRNAの合成を調べる。分化マーカーのビメンチン、ビリン、CALLA/CD10の発現は増強され、増殖マーカーサイクリンDの発現は減少することがノーザンブロットによりわかる。
【0368】
NHEKの増殖および分化のマーカーに対するmRNAの合成はまた半定量的逆転写PCR(RT−PCR)により調べる。RT−PCRの標準的プロトコルは各細胞培養由来のRNA1μgを用いてPCR装置(PE2400)の製造元の推奨に従った。RT−PCRの適当なプライマーはGenBankに寄託されているサイクリンD、ビメンチン、ビリン、CALLA/CD10のヒト配列に基づいて設計した。PCRプロトコルの詳細については前述を参照できる。分化マーカーのビメンチン、ビリン、CALLA/CD10の発現は増強され、増殖マーカーサイクリンDの発現は減少することがRT−PCRによりわかる。
【0369】
ケラチノサイト細胞培養における増殖の測定の場合と本質的に同様にして細胞の増殖を直接細胞計数により調べる。
【0370】
実施例12.
RAの合成、分化および増殖により試験した培養線維芽細胞系統に対するRDH、ADHおよびRalDHの作用
培養線維芽細胞系統に対して実施例11における上記実験を反復する。
【0371】
線維芽細胞培養および実験は、完全培地で灌流したのちに皮膚部分を更に処理する以外は増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの培養(前述)と本質的に同様に行なった。上記した線維芽細胞培養プロトコルを参照できる。
【0372】
ヒトRDH、ADHおよびRalDHの阻害剤をRBP含有培地中で培養しているヒト皮膚線維芽細胞に投与することによりレチン酸の合成が抑制されることがわかる。10μM RAは対照細胞+培地中でみとめられるのに対し、1μM RAはRDH阻害剤の存在下にみとめられる。RDH阻害剤の存在下のCRABPIIの発現濃度は対照と比較して低減する。
【0373】
皮膚線維芽細胞の増殖および分化のマーカーに対するmRNAの合成はGenBankに寄託されているパーオキシダーゼ、CD44およびCD40に対する標識プローブを用いたノーザンブロットにより調べる。ノーザンブロットのプロトコルは前述の通りである。分化マーカーのパーオキシダーゼ、CD44およびCD40の発現が増強され、増殖マーカーサイクリンDの発現は半定量的RT−PCRによれば減少することがわかる。
【0374】
皮膚線維芽細胞の増殖および分化のマーカーに対するmRNAの合成はまた前記した半定量的逆転写PCR(RT−PCR)により調べられる。RT−PCRの適当なプライマーはGenBankに寄託されているパーオキシダーゼ、CD44およびCD40のヒト配列に基づいて設計する(CD44:XM030319)。分化マーカーのパーオキシダーゼ、CD44およびCD40の発現は増強され、増殖マーカーサイクリンDの発現はノーザンブロットにより測定すると減少することがわかる。
【0375】
細胞の増殖はケラチノサイト細胞培養における増殖の測定の場合と本質的に同様にして直接細胞計数により調べる。RDH、ADH、RalDH阻害剤は増殖を低減することがわかる。
【0376】
実施例13.
全哺乳類胚培養におけるレチノール結合蛋白受容体活性のブロッキング
本発明のレチノール結合蛋白受容体機能に対する拮抗剤を哺乳類胚培養物中に導入し、その結果として生じる細胞増殖/分化に対する作用を観察する。結果として生じた胚の奇形は全て報告し、その発病性を検討し、細胞増殖の障害が顕在しているかどうか調べる。哺乳類胚培養物はレチン酸応答遺伝子RAR−β2に対するレポーター構築物を担持しているトランスジェニックなマウスから樹立する(Mendelsohn等、1991,Development 113:723−734)。これはレチノール結合蛋白受容体ブロック後のレチン酸シグナリングに関する情報を更に提供する。
【0377】
胚培養プロトコル:胚の摘出
8.5pcの日に子宮を切開し、妊娠マウスから分離し、予備加温したTyrode食塩水の入ったデッィシュ上に置く。子宮の子宮間膜反対側を慎重に開裂することにより、子宮脱落膜の浮腫を切開顕微鏡下に曝露する。マッチメーカーピンセットの2本を用いて、脱落膜に溝を切り込み、そして一方の二分体を穏やかに引き剥がした。ピンセット1本を用いて胚の入った脱落膜の残存片を固定し、もう1本を用いて胚を取り出す。最後にReichert膜およびその付着体腔側内胚葉細胞層を開裂し、潜伏する卵黄嚢と胎盤外膜錐状体は未損傷のままとした。損傷、発育遅延または奇形の有る胚は全て廃棄し、残ったものをその厳密な体節期に従って分類する。
【0378】
培地と条件
胚をシリコーングリースで気密としたゴム栓で密封した50mlのガラス培養ビン中のTyrode食塩水2.5ml、熱不活性化ラット血清2.5ml、抗生物質1mg/mlの混合物中で24時間培養する。6個までの胚の入った各ビン25%酸素、5%二酸化炭素、残余を窒素とする混合物で4分間通気する。これを24時間の培養時間の途中まで継続する。37℃のインキュベーター中に置いた30rpmで回転する水平ローラー上にビンを置く。
【0379】
血清は雄性Wistarラットから調製する。ガスフード下の特殊チャンバー中でフロタンを用いて動物を麻酔する。各動物は氷上に保持した針およびシリンジを用いて腹部大動脈を穿刺することにより出血させる。血液を8ml容の血清分離バキュエットに移し、4℃で30分間5000rpmで遠心分離する。次に上部の血清層を30分間56℃で熱不活性化し、小分けにして−20℃で保存する。
【0380】
培養ビンの調製
ガラス瓶を機械洗浄し、オートクレーブする。次にこれにクロム酸を入れ、ガスフード下に一夜放置する。翌日ビンを水道水で洗浄し、次に蒸留水で2回洗浄する。内部をジメチルジクロロシランでコーティングし、再度蒸留水で2回洗浄する。次にこれをアルミホイルで被覆し、120℃で30時間、加熱滅菌する。ゴム栓は紙袋中でオートクレーブするまでは70%EtOH中に保持する。
【0381】
拮抗剤の投与方法
RAR−β2−トランスジーンマウスにおけるLacZ発現の低減をもたらす旨適用量を調べるために対数濃度段階を用いてパイロット用量範囲試験において投与濃度を確立する。
【0382】
β−ガラクトシダーゼの検出
9.5pc日齢のトランスジェニックな異型接合マウス胚を氷上で1時間、PBS中の2%ホルムアルデヒド、0.2%グルタルアルデヒド、0.2%NP−40、0.01%デオキシコール酸ナトリウム中に固定する。PBSで洗浄後、1mg/ml Xgal,5mM K3Fe(CN)6,5mM K4Fe(CN)6,2mM MgCl2で暗所37℃で一夜染色することによりβ−ガラクトシダーゼ活性を明らかにする。PBSで洗浄後、歯井を氷上で1時間PBS中4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で後固定する。
【0383】
結果
3から5体節対のトランスジェニックマウス胚(RARB2−RARE−LacZ)を母親から単離し、文献記載の方法と同様の標準的プロトコルを用いて胚の培養用に調製する(Bavik,C.,Ward,S.J.,and Chambon,P.(1996),「卵黄嚢レチノール結合蛋白合成の抑制によるレチン酸枯渇培養マウス胚における発生異常」、Proc.Natl.Acad.Sci.93,3110−3114)。終濃度1mg/mlでPBS中に溶解したP142および対照Ig(非特異的)に胚を曝露する。これを培養直前に培地に添加する。24時間後、培養を停止し、胚をβ−ガラクシド染色用に予備固定する。β−gal染色は文献記載の標準的プロトコルに従って行なう(Mendelsohn,C.,Lohnes,D.,De’cimo,D.,Lufkin,T.,LeMeur,M.,Chambon,P.& Mark,M. (1994),Development 120,2749−2771)。染色後、Lac Z染色強度および発現ドメインをP142投与胚と対照Ig投与胚との間で切開顕微鏡下に比較する。
【0384】
これらの実験の結果を図12に示す。右(明染色)の胚はP142 Ig投与、左(暗染色)の胚は対照Ig投与である。
【0385】
抗体に曝露した胚は全体的なLacZ染色の低下および染色ドメインの変化(後方境界の低減)を示し、核転写を駆動するために使用できるレチン酸の濃度の減少、即ち、機能的ビタミンA欠乏症を示している。これらの結果は卵黄嚢におけるRBP蛋白合成の抑制後に観察されたものと同様である(Bavik,C.,Ward,S.J.,and Chambon,P.(1996),「卵黄嚢レチノール結合蛋白合成の抑制によるレチン酸枯渇培養マウス胚における発生異常」、Proc.Natl.Acad.Sci.93,3110−3114)。
【0386】
胚はレチン酸およびビタミンA欠乏動物において以前に報告されている奇形を示し、文献に報告されている結果を再現した(Bavik,C.,Ward,S.J.,and Chambon,P.(1996),「卵黄嚢レチノール結合蛋白合成の抑制によるレチン酸枯渇培養マウス胚における発生異常」、Proc.Natl.Acad.Sci.93,3110−3114)。例えば、巨視的な形態学的および組織学的試験によれば、水晶体誘導の障害が明らかになる。同様に心筋壁はより薄く、文献に記載されているとおり早期の分化の可能性を示している(Kastner,P.,Messaddeq,N.,Mark,M.,Wendling,O.,Grondona,J.M.,Ward,S.,Ghyselinck,N.and Chambon,P.(1997),「ビタミンA欠乏症およびRXRα、RXRβおよびRARαの突然変異は胚心室心筋細胞の早期の分化をもたらす」、Development 124,4749−4758)。
【0387】
終点評価;遺伝子および形態学
レチン酸濃度に関与することがわかっている遺伝子およびレチン酸不全の状態に応答することがわかっているもの、例えばTGFβ−1、Hoxa−1、RARβ−2およびCRABPIIを、その蛋白および/またはmRNAの分布の変化について調べる。これは定量的RT−PCRまたはインサイチュハイブリダイゼーションにより行なうことができる(例えばISH;ISHによるTGFβ1発現;ISHによるHoxal発現;RARβ2)。これらの遺伝子に対するプローブは広範に入手(例えばプラスミド構築物として市販)できるものであるか、または上記した通りクローニングしてよい。
【0388】
標準的なPCRプロトコルを用いて分化の状態を分析するプローブを発生させる。プローブは以下のプライマー対を用いてK1、K10およびCRABPIIに対して作成する。
【0389】
【0390】
実施例14.
インサイチュハイブリダイゼーション
DIG標識RNA ISH プローブの生成
プローブインサートを含むプラスミドを適切な酵素で切断し、DIG−RNA標識混合物(Boehringer Mannheim 1277073)を用いてDIG標識アンチセンス(AS)ISHプローブを合成する。DIG標識センスプローブもまた非特異的ハイブリダイゼーションのための対照として転写する。
【0391】
ISH用の組織の収集
胚を氷冷PBS中で切開し、直後から2時間から4時間、4℃で穏やかに振とうしながら4%PFA中に固定する。次に漸増濃度のエタノールで脱水し、クロロホルムで一夜清浄化する。翌日組織をパラフィンワックスに包埋する。組織を7μmの切片に切り出し、スライドガラスに連続(6)封入する。封入した切片を42℃で一夜乾燥する。陽性対照として使用するために、成熟マウス網膜も採取し、同じ方法で処理する。
【0392】
ISH法
これはDIG標識RNAプローブを用いた組織切片中のmRNAの検出のためのKomminoth(1996)法に基づく。切片を20分間キシレン中で脱ワックスし、次に漸増濃度のエタノールで再水和し、DEPC−処理H2Oで洗浄する。
【0393】
前ハイブリダイゼーション
切片を5分間PBSで2回インキュベートし、その後100mMグリシン(Sigma)含有PBSで2回5分間インキュベートする。次に切片を0.3%トリトンX‐100(Boehringer Mannheim 789704)を含有するPBSで15分間処理する。切片を5分間PBSで2回洗浄する。切片を1mg/mlプロテイナーゼK(Boehringer Mannheim 1413783)含有TE緩衝液(BDH103704U)を用いて37℃で15分間、浸透性付与処理する。切片を5分間4℃で4%PFAで後固定し、次に5分間PBSで2回洗浄する。切片を2回の5分間インキュベーションにおいて0.25%(v/v)無水酢酸(BDH100022M)を含有する0.1MTEA緩衝液でアセチル化する。切片を37℃の前ハイブリダイゼーション緩衝液(50%(v/v)脱イオンホルムアルデヒド(Fluka47671)含有4xSSC)で最低10分間再インキュベートする。
【0394】
ハイブリダイゼーション
前ハイブリダイゼーション緩衝液をスライドから排出し、各切片を5から10ngDIG標識RNAプローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液(40%ホルムアルデヒド、10%デキストランスルフェート、1X Denhardt溶液、4X SCC,10mM DTT,1mg/ml コウボt−RNA,1mg/ml変性剪断サケ精子DNA)30μlで被覆する。別の対照として一部のスライドを一次プローブに曝露せずにISH実験に付し、抗DIGによる非特異的(バックグラウンド)ハイブリダイゼーションの量を評価する。これらの切片をハイブリダイゼーション緩衝液で被覆する。スライドは全てパラフィルムカバースリップで被覆することにより緩衝液の蒸発を防止し、そして、切片を42℃で湿潤チャンバー中一夜インキュベートする。
【0395】
後ハイブリダイゼーション
スライドを2X SSCに浸積することによりカバースリップを除去する。切片を37℃の振とう水浴中で37℃で2回15分間2X SSCで、そして2回15分間1X SSCで洗浄する。37℃で20mg/mlRNaseA(Boehringer Mannheim 109142)を含有するNTE緩衝液中で30分間切片をインキュベートすることにより未結合のRNAプローブを全て除去する。次に切片を30分間37℃の0.1X SSCで2回洗浄する。
【0396】
免疫学的検出
切片を振とうプラットホーム上で10分間緩衝液1(100mM Tris−HCl (pH7.5),150mM NaCl)で2回洗浄する。切片を30分間ブロッキング溶液(0.1% Triton X−100 および2%正常ヒツジ血清(Sigma S−2382)を含有する緩衝液1)で被覆する。ブロッキング溶液を傾瀉し、切片を0.1% Triton X−100、1%正常ヒツジ血清および1:1000に希釈したヒツジ抗−DIGアルカリホスファターゼ(Fabフラグメント)(Boehringer Mannheim 1093274)を含有する緩衝液1とともに湿潤チャンバー中で2時間インキュベートする。次に切片を緩衝液1で10分間2回洗浄し、その後緩衝液2(100mM Tris−HCl (pH9.5),100mM NaCl,50mM MgCl2)で10分間インキュベートする。この最終インキュベーションの間、10mM緩衝液2、80ml NBT/BCIP保存溶液(Boehringer Mannheim 1175041)および1mMレバミソール(Sigma L9756)を含有する着色溶液を調製する。各溶液を200μLの着色溶液で被覆し、スライドを暗所20時間湿潤チャンバー中でインキュベートする。5分から10分間緩衝液3(10mM Tris−HCl (pH8.1),1mM EDTA)中でスライドをインキュベートすることにより着色反応を停止する。スライドを短時間蒸留水に浸積した後、2分間0.02%Fast Green FCF(Sigma F7258)でスライドを逆染色する。最後に切片を10分間水道水で2回洗浄した後に、グリセルゲル(Dako C563)とともに封入する。
【0397】
フルオレセイン検出
切片を10分間振とうプラットホーム上で緩衝液1で2回洗浄する。切片を30分間ブロッキング溶液(0.1% Triton X−100 および2%正常ヒツジ血清(Sigma S−2382)を含有する緩衝液1)で被覆する。ブロッキング溶液を傾瀉し、切片を0.1% Triton X−100、1%正常ヒツジ血清および1:4〜1:10に希釈したヒツジ抗−DIGフルオレセイン(Fabフラグメント)(Boehringer Mannheim 127741)を含有する緩衝液1とともに湿潤チャンバー中で3時間インキュベートする。切片を抗クエンチング剤(0.1%p−フェニレンジアミン(Sigma P),10% PBS,90% グリセロール(Sigma G6279))を用いてカバースリップし、スライドを4℃暗所に保存する。
【0398】
レチノール結合蛋白受容体拮抗剤に曝露した胚に対してインサイチュハイブリダイゼーションを行う場合は、レチノイド関連遺伝子発現のダウンレギュレーションが検出される。即ち、本発明者等はRARβ2、HoxalおよびTGF−β1のダウンレギュレーションを観察している。
【0399】
実施例15.
インビボレチノール結合蛋白受容体拮抗作用の治療効果−ヒト腎細胞癌異種移植片SCIDマウスに投与した抗レチノール結合蛋白受容体抗体のプラセボコントロール試験
重度複合免疫不全(SCID)マウス(scid,scid)はリンパ形成障害およびナチュラルキラー細胞活性低下を有する二重突然変異マウスの系統である。従ってSCIDマウスはインビボの移植ヒト腫瘍の生育を調べるための異種移植片レシピエントとして使用されている。モデルは移植腫瘍に対する抗癌剤治療の活性を調べるためにも用いられている。本発明者等は、SCIDマウスに移植された腫瘍に対する種々のレチノール結合蛋白受容体拮抗剤の作用を調べた。
【0400】
動物
これらの実験のために使用したscid/scidマウスは4週齢〜8週齢である。μフィルターケージ中で飼育する。全てのケージ、水および飼料はオートクレーブ後に与える。ケージは空調され照明管理(12時間/日)された部屋中に維持し、取扱や操作は層流フード内で行なう。
【0401】
腫瘍の移植
ヒト腎細胞癌の新しい標本は外科的切開直後に入手する。手術前に患者より廃棄された腫瘍組織の使用に関するインフォームドコンセントを得る。腫瘍の切開辺縁部の組織病理学的評価に不完全さが生じないように、実験用の腫瘍試料は専門病理学者が主腫瘍塊から摘出する。腫瘍獲得プロトコルは全て南シェフィールドの地域研究倫理委員会の認可を受ける。
【0402】
新しい腫瘍を培地中滅菌条件下で1.5mmから2.0mm片に粉砕し、これから単細胞懸濁液を調製する。SCIDマウスの右後胴体部に5×105個の腎細胞癌細胞を皮下注射する。腫瘍細胞の試料はレチノール結合蛋白受容体発現濃度の定量のために検査する。
【0403】
抗レチノール結合蛋白受容体拮抗作用
移植した腫瘍が皮膚表面下部で触診可能な大きさ(約5mm3)まで、または皮膚表面より高い更に大型(約50mm3)にまで生育した後、マウスに上記した通り製造した抗レチノール結合蛋白受容体モノクローナル抗体を尾部静脈から注射する。1週間ごとに合計3回の注射を行い、実験は最終注射の6日後に終了する。対照群には通常の生理食塩水または非免疫化動物由来の精製抗体の同じ容量を同じ時点で注射する。SCIDマウスの皮膚上に出現する腫瘍の大きさはカリパスを用いて2次元で測定し、腫瘍の体積は(幅)2(長さ)/2の式により計算する。実験終了時にマウスを屠殺し、計量し、切開する。腫瘍を取り出し、計量する。切開したマウスは転移の徴候について調べる。切除腫瘍および他の臓器の免疫組織化学的検査を行なう。
【0404】
結果
抗レチノール結合蛋白受容体抗体を注射したマウスにおける平均腫瘍体積は実験終了時には同じか低減している。一方、生理食塩水または非免疫化動物由来の精製抗体を注射した対照群においては、実験終了時の平均腫瘍体積は開始時の30倍である。治療の効果は移植時の腫瘍細胞におけるレチノール結合蛋白受容体の発現濃度と正比例している。即ち、抗レチノール結合蛋白受容体抗体の注射はインビボの腫瘍生育を低減することができる。上記した実験をレチノール結合蛋白ループペプチドを用いて実施すると同じ結果が得られる。
【0405】
実施例16.
インビボレチノール結合蛋白受容体拮抗作用の治療効果−ヒト乾癬患部皮膚を移植されたSCIDマウスにおける抗レチノール結合蛋白受容体モノクローナル抗体のプラセボコントロール試験
SCIDマウスはヒト乾癬皮膚の異種移植片のレシピエントとして使用されている。これは新しい治療法の作用を評価することができる乾癬の良好なインビボモデルを与える。移植された乾癬組織を有するSCIDマウスに対する抗レチノール結合蛋白受容体抗体の作用を静脈内注射の後に評価する。これは抗体が表皮バリアを通過するには大きすぎる分子量を有するためである。使用動物は上記実施例において記載したものである。
【0406】
乾癬組織の移植
40歳から60歳の慢性プラーク乾癬患者の下側背部からインフォームドコンセントとともに患部乾癬皮膚を摘出する。皮下脂肪は滅菌切開により真皮から分離する。乾癬患部皮膚の移植片を局所麻酔剤投与後にSCIDマウスに移植する。
【0407】
抗レチノール結合蛋白受容体拮抗作用
乾癬移植片が樹立された後、抗レチノール結合蛋白受容体モノクローナル抗体を尾部静脈からマウスに注射する。1週間ごとに合計3回の注射を行い、実験は最終注射の6日後に終了する。対照群には通常の生理食塩水または非免疫化動物由来の精製抗体の同じ容量を同じ時点で注射する。
【0408】
臨床病理学的評価
移植された乾癬組織の臨床的出現を調べるために、実験終了時にマウスを検査し、写真撮影する。乾癬の程度は抗体注射動物では低減するが、生理食塩水または非免疫化動物由来の精製抗体を注射された動物では低減しない。上記した実験をレチノール結合蛋白ループペプチドを用いて実施すると同じ結果が得られる。
【0409】
実施例17.
2種のSCIDマウス異種移植片モデルにおいて得られたヒトレチノルデヒドロゲナーゼまたはレチナールデヒドロゲナーゼの阻害剤の治療効果のインビボの立証
この実験はヒト腎細胞癌異種移植SCIDマウスに投与されたヒトレチノールデヒドロゲナーゼまたはレチナールデヒドロゲナーゼの阻害剤のプラセボコントロール試験を記載するものである。SCIDマウスおよび腫瘍移植のプロトコルは上記のようにである。SCIDマウスにはヒト腎細胞癌または培養HEK293、COS1またはCOS7細胞の新しい標本を注射する。
【0410】
腎癌の試料中のRBPrの発現濃度は本質的にBavik等の「網膜色素上皮において発現された血漿中レチノール結合蛋白膜受容体の特性化」J.Biological Chemistry 267:23035−23042,1992に記載の通り、ウエスタンブロットにより試験する。SCIDマウスの右後胴体部に5×105個の腎細胞癌細胞を皮下注射する。SCIDマウスの右後胴体部に5×105個のHEK293、COS1またはCOS7細胞を皮下注射する。
【0411】
移植した腫瘍が皮膚表面下部で触診可能な大きさ(約5mm3)まで、または皮膚表面より高い更に大型(約50mm3)にまで生育した後、マウスにレチノールデヒドロゲナーゼまたはレチナールデヒドロゲナーゼ阻害剤(終濃度0.6μMカルベノキソロン;50μMフェニルアルシン;10μMシトラール;0.2mM 4−メチルピラゾール;15μMジスルフィラム;10μMシトラール;2mM 3−メルカプトプロピオン酸;または薬剤ベヒクルのみ)を尾部静脈から注射する。1週間ごとに合計3回の注射を行い、実験は最終注射の6日後に終了する。対照群には通常の生理食塩水の同じ容量を同じ時点で注射する。SCIDマウスの皮膚上に出現する腫瘍の大きさはカリパスを用いて2次元で測定し、腫瘍の体積は(幅)2(長さ)/2の式により推定する。実験終了時にマウスを屠殺し、計量し、切開する。腫瘍を取り出し、計量する。切開したマウスは転移の徴候について調べる。切除腫瘍および他の臓器の免疫組織化学的検査を行なう。
【0412】
レチノールデヒドロゲナーゼまたはレチナールデヒドロゲナーゼ阻害剤を注射したマウスにおける平均腫瘍体積は実験終了時には同じか低減している。一方、生理食塩水を注射した対照群においては、実験終了時の平均腫瘍体積は開始時の30倍である。治療の効果は移植時の腫瘍細胞におけるRBPrの発現濃度と正比例している。
【0413】
実施例18.
ヒト乾癬患部皮膚を移植したSCIDマウスにおけるレチノールデヒドロゲナーゼまたはレチナールデヒドロゲナーゼ阻害剤のプラセボコントロール試験
SCIDマウスはヒト乾癬皮膚の異種移植片のレシピエントとして使用されている。これは新しい治療法の作用を評価することができる乾癬の良好なインビボモデルを与える。レチノールデヒドロゲナーゼまたはレチナールデヒドロゲナーゼの阻害剤の作用を局所適用後に評価する。マウスおよびプロトコルは前記したとおりである。
【0414】
40歳から60歳の慢性プラーク乾癬患者の下側背部からインフォームドコンセントとともに患部乾癬皮膚を摘出する。皮下脂肪は滅菌切開により真皮から分離する。乾癬患部皮膚の移植片を局所麻酔剤投与後にSCIDマウスに移植する。
【0415】
乾癬移植片が樹立された後、レチノールデヒドロゲナーゼまたはレチナールデヒドロゲナーゼの阻害剤を移植片に局所投与する(0.6mM カルベノキソロン;50μMフェニルアルシン;10μMシトラール;0.2mM 4−メチルピラゾール;15μMジスルフィラム;10μMシトラール;2mM 3−メルカプトプロピオン酸;または薬剤ベヒクルのみ)。レチノールデヒドロゲナーゼまたはレチナールデヒドロゲナーゼの阻害剤は一日ごとに投与し、14日間の投与の後に実験を終了する。対照群には同じ時点でベヒクルのみを投与する。移植した乾癬組織の臨床的外観を調べるために実験終了時にマウスを検査し、写真撮影する。移植片の試料を採取して組織学的検査に付す。
【0416】
組織学的検査によれば、レチノールデヒドロゲナーゼまたはレチナールデヒドロゲナーゼの阻害剤を投与した後には正常ヒト皮膚の組織学的特徴が判明したのに対し、対照投与動物は乾癬の表現型を保持している。ケラチン16および7/17は対照投与移植片には免疫組織化学的に検出されるが、阻害剤投与移植片には存在しない。
【0417】
実施例19.
マウス尾部モデルにおいて得られたヒトレチノールデヒドロゲナーゼまたはレチナールデヒドロゲナーゼの阻害剤の治療効果のインビボの立証 マウス尾部モデルは上皮の分化および正常角化に対する薬剤の作用の定量的評価のための形態測定に基づいた感度の高い再現性のある方法である。正常角化は十分に発達した顆粒層の水平長さを個々の尺度内においてその総長に対して相対的に測定することにより調べる(Jarret and Spearman,、皮膚の組織化学的特徴、London University Press;1964;Sebok B等、乾癬の動物モデルとして使用されるマウス尾部試験における表皮細胞分化をタザロテンが誘導する。Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 13:285−91,2000)。
【0418】
動物:これらの実験のために使用するBalb/Cマウスは4週齢〜8週齢である。マウスをレチノールデヒドロゲナーゼまたはレチナールデヒドロゲナーゼの阻害剤(0.6mM カルベノキソロン;50μM フェニルアルシン;10μM シトラール;0.2mM 4−メチルピラゾール;15μM ジスルフィラム;10μMシトラール;2mM 3−メルカプトプロピオン酸;または薬剤ベヒクルのみ)に局所的に曝露する。阻害剤は一日ごとに近位の尾部に局所適用し、14日間の投与の後に実験を終了する。対照群には同じ時点でベヒクルのみを投与する。
【0419】
個々の尺度の正常角化の程度は、その尺度の水平長さで割った個々の尺度内の完全に発達した顆粒層の水平長さのパーセント比率として定義する。正常角化の程度の統計学的分析によれば、レチノールデヒドロゲナーゼまたはレチナールデヒドロゲナーゼの阻害剤の投与は対照投与よりも有意(p<0.05)に高い作用を有する。
【0420】
上記した出願および特許の各々、および上記した出願および特許の各々の実施の間も含めて上記した出願および特許の各々において引用または参照されている各文献(出願引用文献)、および、上記した出願および特許の各々において、および出願引用文献の何れかにおいて引用または言及されている如何なる製品の製造元による取扱説明書やカタログも、参考により本明細書に組み込まれる。更に、本テキストで引用する全ての文献、および本テキストで引用する文献中で引用または参照される全ての文献、本テキストにおいて引用または言及する如何なる製品の製造元による取扱説明書やカタログも、参考により本明細書に組み込まれる。
【0421】
記載した本発明の方法およびシステムの種々の変法や変更が本発明の範囲と精神を逸脱することなく当業者には可能である。本発明は特定の好ましい実施形態を用いて説明したが請求項に記載した本発明はそのような特定の実施形態に制限されない。実際、分子生物学または関連分野の当業者に自明である本発明の実施のための記載した様式の種々の変更は、記載した請求項の範囲内に包含されるものとする。
【0422】
付録1: ビタミンd応答エレメント応答遺伝子およびレチン酸応答エレメント応答遺伝子
【図面の簡単な説明】
【図1】レチノイド療法の現在の形態と本発明の方法の実施形態との間の関連性を示すダイアグラムである。図はレチン酸の漸増濃度に対する、休止状態の増殖、分化または死滅(壊死をもたらす細胞毒性)により測定した、細胞応答を示している(血中のレチノールから誘導されレチノール結合蛋白−レチノール結合蛋白受容体相互作用により細胞に供給された内因性ビタミンAシグナル)。
【図2】正常皮膚におけるレチノール結合蛋白受容体(RBPr)およびレチノールデヒドロゲナーゼ(RoDH)の免疫組織化学的同時局在化を示す。レチン酸シグナルの生成に関与する蛋白は正常皮膚の有棘層の表在辺縁部および顆粒層境界部に共に検出される。
【図3】乾癬プラーク中のレチノール結合蛋白受容体(RBPr)およびレチノールデヒドロゲナーゼ(RoDH)の免疫組織化学的同時局在化を示す。レチン酸シグナルの生成に関与する蛋白は乾癬プラーク内に共に検出される。
【図4】抗RBPr抗体P142を投与した増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの増殖試験の結果を示す。図は抗体投与3日後の増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの細胞数を示している。RBPはカルシウム添加の分化作用を克服するように培養増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの増殖を増大させる(1.2mM)。この作用は培地へのモノクローナル抗体P142の添加後には退行する。対照のIgMの添加はカルシウム添加のみと同様の増殖に対する作用を示す。
【図5】抗RBPr抗体P142を投与した増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの分化試験の結果を示す。ケラチン1プローブを用いて分化についてノーザンブロットをプローブする。RNA20μgを各レーンに適用する。
【図6】ペプチド592およびペプチド592を投与した増殖亢進性乾癬乾癬ケラチノサイトの分化試験の結果である。ケラチン1プローブを用いて分化についてノーザンブロットをプローブする。RNA20μgを各レーンに適用する。
【図7】抗レチノール結合蛋白受容体抗体P142、対照抗体、ペプチド592、ペプチド589および対照ペプチドを投与したCOS−1細胞の増殖試験の結果である。X軸は細胞数を示す。上パネル:投与後24時間の細胞数、下パネル:投与後48時間細胞数。
【図8】抗レチノール結合蛋白受容体抗体P142、対照抗体、ペプチド592、ペプチド589および対照ペプチドを投与したCOS−7細胞の増殖試験の結果である。X軸は細胞数を示す。上パネル:投与後24時間の細胞数、下パネル:投与後48時間細胞数。
【図9】抗レチノール結合蛋白受容体抗体P142、対照抗体、ペプチド592、ペプチド589および対照ペプチドを投与したヒト皮膚腺維芽細胞の増殖試験の結果である。X軸は細胞数を示す。上パネル:投与後24時間の細胞数、下パネル:投与後48時間細胞数。
【図10】レチン酸合成の抑制剤を投与した増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの増殖試験の結果である。X軸は細胞数を示す。
【図11】図11はレチン酸合成の抑制剤を投与した増殖亢進性乾癬ケラチノサイトの分化試験の結果である。ケラチン1プローブを用いて分化についてノーザンブロットをプローブする。RNA20μgを各レーンに適用する。RBPにより生じた(1.2mMカルシウムからの分化圧力下の)乾癬性ヒト表皮ケラチノサイトにおける分化の抑制はRA合成抑制剤の添加により退行する。
【図12】図12は抗レチノール結合蛋白受容体抗体P142(明染色、右側胚)および対照抗体(暗染色、左側胚)を投与したマウス胚の結果である。
Claims (40)
- 方法が、患者の細胞におけるレチン酸(RA)の内因性の濃度または活性を低下させること、を含む増殖亢進性障害または光老化に罹患している患者の治療方法。
- レチン酸の内因性の濃度が増殖亢進性の細胞または該患者の光老化に罹患している細胞において低減される請求項1記載の方法。
- 細胞内のレチン酸の内因性の濃度が、細胞増殖が低減されるか消失するする程度まで、および/または、細胞の分化が活性化または増強される程度まで、低減される請求項1記載の方法。
- 方法がレチノール結合蛋白受容体(RBPr)によるレチノールの取り込みを抑制することを含む先行する請求項の何れかに記載の方法。
- 方法がレチン酸の生合成をもたらす経路のエレメント1つ以上に拮抗することを含む先行する請求項の何れかに記載の方法。
- 方法がレチノールデヒドロゲナーゼ(RDH)、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)またはレチナールデヒドロゲナーゼ(RalDH)を拮抗することを含む請求項5記載の方法。
- 方法が、RoDH1、RoDH2、RoDH3、RoDH4、CRAD1、CRAD2、RDH5およびretSDR1からなる群から選択されるレチノールデヒドロゲナーゼ酵素、または、ADH1、ADH2およびADH4からなる群から選択されるアルコールデヒドロゲナーゼ、またはALDH1、ALDH6、RALDH2およびALDH−tからなる群から選択されるレチナールデヒドロゲナーゼを拮抗することを含む請求項6記載の方法。
- レチノール結合蛋白受容体の拮抗剤が下記物質:
(a)レチノール結合蛋白受容体に結合することのできる免疫グロブリン;
(b)レチノール結合蛋白の受容体結合領域に由来する配列を含むペプチド;
(c)レチノール結合蛋白の配列K29−Q38、G59−A71またはM88−D102を含むペプチド;
(d) レチノール結合蛋白のペプチドG59−A71およびM88−D102からなるヘテロダイマーを含むペプチド;
(e)レチノール結合蛋白受容体の発現を抑制することのできるアンチセンス分子;
(f)アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド;
(g)カルベンオキソロン、フェニルアルシンオキシド、シトラール、3,7−ジメチル−2,6−オクタジエナール、4−メチルピラゾールおよびジスルフィラム;
からなる群から選択される先行する請求項の何れかに記載の方法。 - 方法がレチン酸の生合成を妨害することのできる化合物を患者に投与すること、を含む増殖亢進性障害または光老化に罹患している患者の治療方法。
- 化合物が細胞内へのレチノールの取り込みを抑制することができるか、化合物がレチン酸の生合成に関わる酵素の阻害剤である、請求項9記載の方法。
- 患者における増殖亢進性障害または光老化を治療するための方法において使用するための細胞におけるレチン酸の内因性濃度を低下させることのできる薬剤。
- 増殖亢進性障害または光老化に罹患した患者の治療方法において使用するためのレチノール結合蛋白受容体拮抗剤。
- 増殖亢進性障害または光老化に罹患した患者の治療方法において使用するためのレチン酸合成の抑制剤。
- 拮抗剤がレチン酸前駆体の取り込みを抑制することができるか、またはレチン酸前駆体の生合成を抑制することができる、請求項11、12または13に記載の薬剤または拮抗剤。
- 請求項8の(a)から(g)からなる群から選択される請求項11から14の何れかに記載の拮抗剤。
- 増殖亢進性障害が、乾癬、尋常性挫瘡、しゅさ性挫瘡、光線性角化症、日光性角化症、インシトゥの扁平上皮細胞癌、魚鱗癬、角化亢進症、Darrier症のような角化障害、掌蹠角皮症、毛孔性紅色ひこう疹、表皮母斑様症候群、変異性紅斑角皮症、表皮剥離性角質増殖症、非水疱性魚鱗癬様紅皮症、皮膚エリテマトーデスおよび扁平苔癬性乾癬、尋常性挫瘡、または癌を含む先行する請求項の何れかに記載の方法、薬剤または拮抗剤。
- レチノール結合蛋白受容体の拮抗剤を同定するための方法であって、候補化合物にレチノール結合蛋白受容体を発現する細胞を接触させること、および、該細胞内のレチン酸の濃度が該接触の結果として低下したかどうかを調べること、を含む上記方法。
- 細胞内のレチン酸の内因性濃度を低下させることのできる化合物を同定するための方法であって、候補化合物にレチノール結合蛋白受容体を発現する細胞を接触させること、および、該細胞内のレチン酸の濃度が該接触の結果として低下したかどうかを調べること、を含む上記方法。
- レチノール結合蛋白とレチノール結合蛋白受容体との間の相互作用を抑制することができる化合物を同定するための方法であって、レチノール結合蛋白の存在下、候補化合物にレチノール結合蛋白受容体、または、レチノール結合蛋白に結合することのできるそのフラグメントを接触させること、および、受容体に結合しているレチノール結合蛋白の濃度が低下したかどうか調べることを含む上記方法。
- 請求項16から19の何れかに記載の方法により同定される化合物または拮抗剤。
- 細胞の増殖を防止する方法であって、細胞内のレチン酸(RA)の内因性の濃度または活性を低下させることを含む上記方法。
- 細胞が増殖亢進性細胞である請求項21記載の方法。
- レチン酸の生合成を妨害することのできる化合物に細胞を接触させる請求項21または22に記載の方法。
- 細胞のレチノール結合蛋白受容体の活性を抑制することを含む請求項21、22または23に記載の方法。
- レチノール結合蛋白受容体の拮抗剤に細胞を接触させる請求項21から24の何れかに記載の方法。
- レチン酸の生合成をもたらす経路のエレメント1つ以上の拮抗剤に細胞を接触させる請求項21から25の何れかに記載の方法。
- 細胞の分化をもたらす請求項21から26の何れかに記載の方法。
- 方法が、レチン酸の生合成を妨害することのできる化合物に細胞を接触させること、を含む細胞内の分化プログラムを活性化させる方法。
- 方法が、患者の細胞内のレチン酸(RA)の内因性の濃度または活性を低減すること、を含む障害がレチノイドを投与することにより治療できるレチノイド感受性障害であるか、または、障害がレチノイドの薬理学的濃度を投与することの副作用に相当するものである、障害に罹患した患者の症状を治療または軽減する方法。
- レチノイド感受性障害が、患者にレチノイドの生理学的濃度より高い濃度を投与することにより治療されるか、その症状が軽減される障害である、請求項29記載の方法。
- 方法が、患者の細胞内のレチン酸(RA)の内因性の濃度または活性を低減すること、を含むレチン酸受容体応答エレメント(RARE)応答遺伝子、ビタミンD応答エレメント(VDRE)応答遺伝子、甲状腺ホルモン受容体応答エレメント応答遺伝子またはパーオキシソーム増殖物質−活性化受容体(PPAR)応答エレメント応答遺伝子の異所性、過剰またはその他の異常な発現を特徴とする障害に罹患した患者の症状を治療または軽減する方法。
- 方法が、患者の細胞内のレチン酸(RA)の内因性の濃度または活性を低減すること、を含む増殖と分化との間の不均衡を特徴とする障害に罹患した患者の症状を治療または軽減する方法。
- 患者の細胞内のレチノール結合蛋白受容体の活性を抑制すること、および/または、患者の細胞内のレチン酸の生合成を抑制することを含む請求項29から32の何れかに記載の方法。
- 医薬適合性の担体または希釈剤と共に細胞内のレチン酸の内因性濃度を低減することのできる化合物の治療有効量を含有する、増殖亢進性障害または光老化に罹患した患者を治療するのに適する医薬組成物。
- 医薬適合性の担体または希釈剤と共にレチノール取り込み抑制剤の治療有効量を含有する、増殖亢進性障害または光老化に罹患した患者を治療するのに適する医薬組成物。
- 医薬適合性の担体または希釈剤と共にレチン酸合成抑制剤の治療有効量を含有する、増殖亢進性障害または光老化に罹患した患者を治療するのに適する医薬組成物。
- 候補化合物に細胞を接触させること、細胞内のレチン酸濃度が低下したかどうか調べること、を含む内因性のレチン酸濃度を低減することができる化合物を同定するための方法。
- レチノールデヒドロゲナーゼを発現する細胞を化合物に曝露すること、細胞内のレチナールの濃度が低下したかどうか調べること、を含むレチノールデヒドロゲナーゼを阻害することのできる化合物を同定するための方法。
- レチナールデヒドロゲナーゼを発現する細胞を化合物に曝露すること、細胞内のレチン酸の濃度が低下したかどうか調べること、を含むレチナールデヒドロゲナーゼを阻害することのできる化合物を同定するための方法。
- 該方法が患者の細胞内のレチン酸(RA)の内因性の濃度または活性を低低減することを包含し、該疾患、障害または症状が、ウィルス感染症、HPV、HIV、HSV、HCV感染症、疣贅、術後瘢痕、肥大性およびケロイド性の瘢痕、メラニン生産性障害、色素沈着症、表皮関門機能の亢進または脆弱化、骨成長障害、骨折、骨粗鬆症、高脂血症、肝毒性、肝硬変、感染性肝炎、皮膚掻痒症、脱毛症、不妊症、精子形成障害、卵子移植障害、鬱病、季節性感情障害、アテローム性動脈硬化症および血管形成障害からなる群から選択される、疾患、障害または症状に罹患した患者を治療する方法。
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