TWI463979B - 檸檬醛用於製備治療局部腎絲球硬化症之藥物的用途 - Google Patents
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Description
本發明係關於檸檬醛用於製備治療局部腎絲球硬化症之藥物的用途。
局部腎絲球硬化症(Focal Segmental Glomerulosclerosis,FSGS)是一種在腎絲球產生血管硬化現象之腎組織病變疾病。臨床上展現腎病症候群特徵，包含嚴重蛋白尿、高血壓、低白蛋白血症、血尿等(Cattran DC,Rao P.American Journal of Kidney Disease
.21(3)
：344-9,1998.Chun MJ et al.,Journal of the American Society of Nephrology
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：2169,2004.Rydel JJ et al.,American Journal of Kidney Disease
.25(4)
：534-42,1995.)。病理上在初期出現腎臟腎絲球之基底膜變厚、腎絲球之細胞外基質增加、血管內出現玻璃樣沉澱物等病徵，最終形成以膠原蛋白纖維為主的疤痕組織，也有伴隨微血管管壁泡沫細胞堆積、微血管塌陷、臟層上皮細胞增殖與肥大、足突細胞融合等，且隨著疾病進展硬化部位逐漸擴大(D'Agati VD.Curr Opin Nephrol Hypertens
.17(3
)：271-81,2008.Hodgin JB et al.,American Journal of Clinical Pathology
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)：1674-86,2010.Thomas DB.The Archives of Pathology and Laboratory Medicine
.133
(2
)：217-23,2009.)。足突細胞主要分布於腎絲球基底膜，功能為血液的過濾作用，目前利用超顯微技術可發現FSGS患者腎臟腎絲球之足突細胞具受損情形，被認為是導致腎絲球走向硬化的重要原因之一(Kriz W et al.,Kidney International
.54(3
)：687-97,1998.Pagtalunan ME et al.The Journal of Clinical Investigation
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)：342-8,1997.Wiggins JE et al.Journal of the American Society of Nephrology
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)：2953-66,2005.Yang HC et al.,Kidney International
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(10
)：1756-64,2006.)。
局部腎絲球硬化症之患病人數於世界各國皆逐年上升，然疾病機轉仍尚未完全明白，可能由其他腎炎導致，如局部增生型腎炎、血管炎、狼瘡性腎炎、腎臟移植，也可能是毒物傷害造成(Bahiense-Oliveira M et al.Clinical Nephrology
.61
：90-7,2004.D'Agati V.Seminars in Nephrology
.23
：117,2003.)。臨床上使用細胞毒性藥物(如，環磷醯胺(cyclophosphamide))、免疫抑制劑(如，環孢靈素(cyclosporine)、馬替麥考酚酯(Mycophenolate Mofetil))、非類固醇抗發炎藥物(NSAIDs)、血管擴張劑、或單純使用皮質類固醇(如，潑尼松龍(prednisolone))治療，但其中僅有20%至40%患者對類固醇治療有反應，且必須長期服用才能發揮效果，而即使在服用類固醇治療後，患者仍有機會進展至末期腎病(BebaN et al.,Turkish Journal of Pediatric
.52(3
)：255-61,2010.Daskalakis N,Winn MP.Cellular and Molecular Life Sciences
.63
(21
)：2506-11,2006.Gipson DS et al.,Kidney International
.80
(8
)：868-78,2011.Daskalakis N,Winn MP.Cellular and Molecular Life Sciences
.63
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)：2506-11,2006.Gipson DS et al.,Kidney International
.80
(8
)：868-78,2011.Kanjanabuch T et al,Journal of The Medical Association of Thailand
.2
：S262-79,2006.)。此外，這些藥物常產生不良副作用，如抗藥性及腎毒性，對人體產生更大危害，還有停藥後復發之類的問題。
檸檬醛(citral)，即3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛，是含有兩個雙鍵的不飽和鏈狀醛類單萜，分為兩種異構體，結構如下：
通常情況下檸檬醛是以上兩者的混合物，可由柑橘類植物萃取而得，為淡黃色有檸檬香味的油狀易揮發液體，有強烈的檸檬香氣及味道，已廣泛運用於化妝品產業，如香水，亦作為安全的食品添加物，如香料。目前研究亦顯示檸檬醛有具有抑制細菌活性、抗真菌活性，同時也能對抗癌藥物博來霉素(bleomycin)引起的基因毒性(Genotoxicity)(Karabörklü S et al.,Journal of economic entomology
.104
(4
)：1212-9,2011.Molkary Andrea López et al.,Genetics and Molecular Biology
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)：479-488,2011.Singh SA et al.,Natural Product Communications
.6
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)：1221-4,2011.Zore GB et al.,Phytomedicine
.18
(13
)：1181-90,2011.)。然而，並無任何先前技藝文獻揭示使用檸檬醛來治療局部腎絲球硬化症。
本發明首次提出檸檬醛具有治療局部腎絲球硬化症之功效。
因此，本發明提供一種檸檬醛用於製備治療局部腎絲球硬化症之藥物的用途。此外，本發明還提供了一種治療局部腎絲球硬化症的醫藥組合物，其包括治療上有效量的檸檬醛，以及一或多種醫藥上可接受的載體。本發明也提供了將檸檬醛投予有需要的個體以治療局部腎絲球硬化症的方法。
在一具體實例中，檸檬醛可用以改善局部腎絲球硬化症之腎組織病變情形，包括降低腎組織纖維化、淋巴球浸潤或足突細胞損傷。
在另一具體實例中，檸檬醛可用以改善局部腎絲球硬化症之腎病症候群病徵，包括降低蛋白尿、血尿、血清尿素氮或血清肌酸酐。
具體而言，檸檬醛可製備成口服藥物。
在一具體實例中，檸檬醛可與一或多種治療局部腎絲球硬化症之藥劑併用，該藥劑包括但不限於皮質類固醇藥物、非類固醇抗發炎藥物(NSAIDs)、免疫抑制劑、細胞毒性藥物、或血管擴張劑。
本發明之其他特徵將經由以下詳細說明、各個具體實例及申請專利範圍而清楚呈現。
圖式中所示具體實施例係供例示本發明之目的。然則應了解
本發明並不限於所示之較佳具體實施例。在圖式中：圖1顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之尿蛋白及腎功能變化，包括尿蛋白與肌酸酐比例(A)、血清尿素氮含量(B)，以及血清中肌酸酐含量(C)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
圖2顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之組織型態學變化，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組。
圖3顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之組織纖維化情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之染色圖(A)及其量化圖(B)及(C)。*p<0.05，***p<0.001。
圖4顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之腎組織TGF-β表現情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之染色圖(A)及其量化圖(B)及(C)。**p<0.01。
圖5顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之腎組織之纖維連接蛋白(fibronectin)之表現情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之染色圖(A)及其量化圖(B)及(C)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
圖6顯示以檸檬醛療局部腎絲球硬化症小鼠之腎組織之膠原蛋白IV之表現情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之染色圖(A)及其量化圖(B)及(C)。**p<0.01，***p<0.001。
圖7顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之足突細胞受損情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之染色圖(A)及其量化圖(B)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
圖8顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之反應性氧化物(ROS)之表現情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、
局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之血清ROS表現(A)、尿液ROS表現(B)以及腎臟ROS表現(C)。RLU，相對光單位(relative light unit)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
圖9顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之腎組織之反應性氧化物(ROS)之表現情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之染色圖(A)及其量化圖(B)及(C)。白色箭頭標記出腎絲球周圍。***p<0.001。
圖10顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之腎臟組織NADPH p47蛋白之表現情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之西方墨點轉漬法分析結果(A)，及其量化圖(B)。虛線代表第0天結果之延伸線。*p<0.05。
圖11顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之一氧化氮(NO)之表現情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之血清NO表現(A)以及尿液NO表現(B)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
圖12顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之腎臟組織Nrf2之表現情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之西方墨點轉漬法分析結果(A)，及其量化圖(B)。虛線代表第0天結果之延伸線。*p<0.05。
圖13顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之HO-1及NQO-1蛋白之表現情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之HO-1蛋白之ELISA分析結果(A)，以及NQO-1蛋白之西方墨點轉漬法分析結果(B)及其量化圖(C)。虛線代表第0天結果之延伸線。*p<0.05。
圖14顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之腎組織之巨噬細胞浸潤情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之染色圖(A)及其量化圖(B)及(C)。***p<0.001。
圖15顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之腎組織之
T細胞浸潤情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之染色圖(A)及其量化圖(B)及(C)。*p<0.05，**p<0.01。
圖16顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之腎臟組織NF-κB之表現情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之染色圖(A)及其量化圖(B)及(C)，以及NF-κB p65蛋白在細胞核之表現(D)。*p<0.05，**p<0.01。
圖17顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之腎臟組織之Atg-5-12及LC3之表現情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之西方墨點轉漬法分析結果(A)及其量化圖(B)至(E)。*p<0.05，**p<0.01。虛線代表第0天結果之延伸線。
圖18顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之腎組織之細胞凋亡情形，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之染色圖(A)及其量化圖(B)及(C)。**p<0.01，***p<0.001。
圖19顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之細胞凋亡路徑分析結果，包括誘發病變後第7天與第28天之正常控制組、局部腎絲球硬化疾病組、檸檬醛治療組之凋亡酶-3、凋亡酶-8、凋亡酶-9、Bax及Bcl-2之西方墨點轉漬法分析結果(A)及其量化圖(B)至(E)。虛線代表第0天結果之延伸線。*p<0.05。
圖20顯示以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症小鼠之其他器官之組織切片，包括肺臟、肝臟及脾臟。
除非另有限定，本文中使用之所有技術性及科學性辭彙具有熟習本發明所屬技藝之人通常瞭解之意義。如有衝突，則以本文件，包括其定義為主。
當用於此處時，本文所使用之冠詞「一」或「該」意指該冠詞文法上之受詞為一或一以上(亦即至少為一)。舉例而言，「一元件」代
表一元件或多於一元件。
在本發明中，非可預期地發現將檸檬醛投予局部腎絲球硬化症之小鼠有效改善或减缓蛋白尿及、血尿、腎功能、發炎細胞的浸潤、組織纖維化及硬化情形，具有治療局部腎絲球硬化症之優異效果。本發明亦提出檸檬醛之治療機制涉及抑制TFG-β纖維化路徑，經由Nrf2及其下游基因降低氧化壓力，透過NF-kB降低發炎現象，以及降低凋亡酶-9、凋亡酶-3、促凋亡基因Bax而減少細胞凋亡情形。本發明亦指出檸檬醛未對動物產生明顯可見之不良副作用，無安全性之疑慮。
因此，本發明提供一種檸檬醛用於製備治療局部腎絲球硬化症之藥物的用途。此外，本發明還提供了一種治療局部腎絲球硬化症的醫藥組合物，其包括治療上有效量的檸檬醛，以及一或多種醫藥上可接受的載體。本發明也提供了將檸檬醛投予有需要的個體以治療局部腎絲球硬化症的方法。
本發明使用之檸檬醛是一種含有兩個雙鍵的不飽和鏈狀醛類單萜，化學名稱為3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛(3,7-dimethyl-2,6-octadienal)，分子式為C10
H16
O，外觀呈無色或為黃色液體，有濃郁的檸檬香氣，存在兩種異構體，結構如下：
檸檬醛可由商業上獲得，或由天然植物產物萃取而得，包括但不限於，檸檬油、柑橘油、山蒼子油、馬鞭草油。可以採用本領域已熟
知的方法從天然植物精油萃取，例如，蒸餾及有機溶劑萃取，亦可由化學合成，例如，以甲基庚烯酮為原料合成。當本發明描述檸檬醛係可經分離或純化時，可理解為其非指絕對的分離或純化，而是相對的分離或純化。例如，純化的檸檬醛是指相較於天然存在狀態更為純化者。在一具體實例中，一含有純化的檸檬醛之製備物可含有檸檬醛達製備物總量之50%以上，60%以上，70%以上，80%以上，90%以上，或達100%(w/w)。可理解的是，當本文提到特地數值表示比例或劑量時，該數值一般而言包括其上下10%範圍內或更特定而言為上下5%範圍內的劑量。
此處所使用的「個體」乙詞包括人類及非人類動物，例如，伴侶動物(如，狗、貓及類似者)、農場動物(如，牛、羊、豬、馬及類似者)或實驗動物(如，大鼠、小鼠、天竺鼠及類似者)。
此處所使用的「治療」乙詞是指為了治癒、癒合、減輕、舒緩、改變、矯正、改善、改進或影響該疾病、該疾病的症狀、該疾病引起的殘疾或罹患該疾病的傾向的目的，而將包含一或多種活性成分的組合物施用或投與至患有該疾病、該疾病的症狀或有罹患該疾病的傾向的個體。
此處所使用的「治療上有效量」乙詞是指相較於未接受該量的對應個體，一藥物或藥劑可造成治療目的的有效成分的含量。例如，治療局部腎絲球硬化症有效量為可防止、改善或減緩一或多種相關腎組織病變情形之劑量，包括降低腎組織纖維化、淋巴球浸潤或足突細胞損傷之情形，或可防止、改善或減緩一或多種相關腎病症候群病徵之劑量，包括降低蛋白尿或血尿之情形或降低血清尿素氮(BUN)或血清肌酸酐(Cr)之含量。該等病徵可使用本領域已知方法並基於各種與病程相關的指標進行測定及評估，例如，分析尿蛋白、血液或尿素氮及血清肌酸酐的含量或腎切片評估纖維化。治療有效量可視各種因素而變動，例如，投藥途徑及頻率、接受該藥劑的個體的體重及物種，以及投藥目的。本領域技術人員可根據此處的揭示及已建立的方法依經驗決定每一個別案例的劑量。例如，在一具體實例中，本發明使用檸檬醛之口服劑量為每日100至1,000 mg/kg，較特定為每日150至850 mg/kg，更特定為每日200至700 mg/kg，又更特定為每日250至650 mg/kg，再更特定為每日300至500 mg/kg。
根據本發明，檸檬醛可作為治療局部腎絲球硬化症之有效成分。在一具體實例中，治療有效量的有效成分可與醫藥上可接受載體調配成適當劑型的藥物組合物，以達輸送及吸收的目的。視投藥模式而定，本發明的藥物組合物較佳含有約0.1重量%至約100重量%的有效成份，重量百分比是以總組合物計。
此處「醫藥上可接受」是指該載體可與組合物內所含的有效成分相容，其較佳為能穩定該活性成分並且對被治療的個體無害。該載體可作為活性成分的稀釋劑、載體、賦形劑或基質。一些適當賦形劑的實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、褐藻酸鹽、黃蓍樹膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、滅菌水、糖漿和甲基纖維素。組合物可另外包括潤滑劑，例如，滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油；濕潤劑；乳化和懸浮劑；保存劑，例如，羥基苯甲酸甲酯和丙酯；甜味劑；以及調味劑。本發明的組合物通過本領域已知的方法配製後，能在投與至病人後提供活性成分的快速、持續或延遲釋放的效果。
根據本發明該組合物的形式可為錠劑、藥丸、粉末、糖錠、藥包、藥片、酏劑、懸浮液、乳劑、溶劑、糖漿、軟和硬明膠膠囊、栓劑、滅菌注射液和包裝粉末。
本發明的組合物可經由任何生理上可接受途徑，例如，口服、腸道外(例如，肌肉、靜脈、皮下、腹腔內)、經皮、直腸、吸入等方式予以輸送。對於非經腸道的投藥，最佳是以無菌水溶劑形式使用，其可含有其它物質，例如，足夠的鹽或葡萄糖以使此溶液與血液呈等滲壓。水溶液需要時需被適當緩衝(較佳為pH值為3至9)。于無菌條件下製備適合的非經腸道組成物可通過本領域技術人員所熟知的標準藥學技術方法完成，而不需要付出額外的創造性勞動。
根據本發明，檸檬醛或含有檸檬醛為活性成分之組合物可用於治療患有局部腎絲球硬化症之個體。具體而言，可將檸檬醛或含有檸檬醛為活性成分之組合物施用於患有局部腎絲球硬化症之個體，或具有產生局部腎絲球硬化症風險之個體，以避免疾病之發生或改善病徵或延遲病徵
之惡化。在部分具體實施例中，檸檬醛或含有檸檬醛為活性成分之組合物可施用於已罹患或具有可能會導致局部腎絲球硬化症之疾病或狀態之個體，該等疾病或狀態包括但不限於其他腎病，如增生性腎炎、狼瘡性腎炎或逆流性腎病，糖尿病或後天免疫不全症候群(AIDS)，或受毒物或藥物影響，如海洛因，或揮發性有機化合物，如甲醛、甲苯、二甲苯、苯乙烯等，血管炎，或腎臟移植。
根據本發明，檸檬醛或含有檸檬醛為活性成分之組合物可與現有治療方式或藥物併用，例如，血漿過濾術(plasmapheresis)或蛋白質吸收法(protein adsoption)，或藥物治療，包括但不限於，皮質類固醇(corticosteroids)，如潑尼松龍(prednisolone)，非類固醇抗發炎藥物(NSAIDs)，細胞毒性藥物(如，環磷醯胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、硫唑嘌呤(azathioprine))，免疫抑制劑(如，環孢靈素(cyclosporine)、馬替麥考酚酯(Mycophenolate Mofetil))，或血管擴張劑(如，血管緊張素轉換酶抑制劑(ACE inhibitor))等。在一具體實例中，藥物或治療方式之併用可同時(並行)或依序施用。藥物之併用可將藥物混合於相同劑型，或分別置於不同劑型中，如分開的膠囊、片劑、錠劑、注射劑。
現參考以下具體實施例更明確地描述本發明，其目的為用以說明而非作為限制。
雄性BALB/cByJNarl小鼠係購自財團法人國家實驗動物中心(台北，台灣)。待其8週大時將之分為3組，其中1組於尾部靜脈注射一般生理食鹽水作為正常控制組，病理對照組及檸檬醛處理組則於尾部靜脈注射給予單一劑量12.5 mg/kg體重之艾黴素(Adriamycin)誘發小鼠局部腎絲球硬化症，其中檸檬醛處理組於誘發疾病前3日以強餵方式給予500 mg/kg體重之檸檬醛，靜脈注射艾黴素後持續給予300 mg/kg體重之檸檬醛直至犧牲日。每週以代謝籠收集小鼠尿液，並分別於誘發疾病後第7及28天予以犧牲，收集腎臟、肝臟、脾臟、肺臟及血清進行後續分析。
檸檬醛係自植物果實萃取而得，經水蒸氣蒸餾法及水蒸汽蒸餾有機萃取法去除精油後，利用溶劑萃取分離獲得純化的檸檬醛。在動物實驗中，利用艾黴素誘發實驗性局部腎絲球硬化前3日，開始予以口餵灌食檸檬醛500mg/kg，疾病誘發後持續給予檸檬醛300 mg/kg至犧牲日。
每周以代謝籠收集小鼠尿液，先以試紙檢測蛋白尿及血尿，隨後以蛋白質濃度分析套組(BCA Protein Assay Kit,PIERCE)測量蛋白濃度，尿蛋白指數以24小時蛋白尿(尿液蛋白質濃度/尿液肌酸酐濃度)來表示。此外，經眼窩收集血液，分離後取得血清檢體，吸至檢驗試片(Fuji Ori-Chem Slide)並經儀器測量(Fuji Photo Film Co.,Tokyo,Japan)讀取數據。
製備經福馬林固定及石蠟包埋之腎臟切片，以蘇木紫(Hematoxylin,Surgipath Co.,USA)與伊紅(Eosin,Surgipath Co.,U.S.A)染色，封片完置於光學顯微鏡下觀察，進行組織型態評估。另以Schiff試劑及蘇木紫進行過碘酸希瓦夫(Periodic Acid Schiff,PAS)染色，進行組織纖維化評估。
此外，亦進行免疫組織化學分析(IHC)，在腎臟切片上，以針對小鼠CD3(DAKO)、膠原蛋白IV(Collagen IV,South biotech)、肌間線蛋白(Desmin,Millipore,USA)、F4/80(Serotec,NC,USA)、纖維連接蛋白(fibronectin,Chemicon,USA)、NF-κB p65(Cell Signaling Technology,USA)或TGF-β(Santa Cruz,USA)之初級抗體於4℃隔夜反應，接續以鏈接辣根過氧化酶(HRP)之二級抗體(DAKO,Denmark)於室溫反應1小時，隨後以DAB(BioGenex,USA)呈色，並以蘇木紫溶液或甲基綠(Methyl Green,DAKO,Denmark)進行核染色，記錄染結果。
使用核蛋白萃取套組(Active Motif,USA)依據生產商指示由腎臟組織水解物中萃取細胞質及細胞核蛋白質。將蛋白萃取物以電泳分
離並經轉漬後，使用針對小鼠Atg5-12(Santa Cruz,USA)、Bax(Santa Cruz,USA)、Bcl-2(MBL,USA)、凋亡酶-3(Cell Signaling,USA)、凋亡酶-8(Cell Signaling,USA)、凋亡酶-9(Cell Signaling,USA)、Nrf2(Santa Cruz,USA)、NADPH p47(Santa Cruz,USA)、NQO-1(Abcam,USA)、LC3(Sigma,USA)之初級抗體測量目標蛋白質，使用β-肌動蛋白(Santa Cruz)之抗體作為內部對照，加入二級抗體，最後以冷光反應壓片。
依據製造商(R&D,U.S.A.,Active Motif)附上之標準流程進行測定小鼠腎臟組織中的HO-1及NF-κB的含量。
以亮光素(Lucigenin)與尿液與血清中之反應性氧化物進行反應，並以微量冷光儀(Hidex microplate luminometer,Finland)偵測，以每毫克乾重每15分鐘之活性激光單位(RLU)(亦即RLU/15分/mg乾重)表示。腎臟組織中之反應性氧化物以二氫乙啶(DHE)標定法測定，藉由計數每個腎臟橫切面總細胞核中陽性細胞核百分比來定量螢光影像。
使用市售分析套組(Sigma,USA)測定小鼠血清或尿液中一氧化氮濃度，使用ELISA讀盤機測量540 nm之吸光度。
以TUNEL法(末端去氧核苷酸轉移酶去氧尿苷三磷酸切口末端标记，Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)進行腎臟組織細胞凋亡分析，製備經福馬林固定及石蠟包埋之腎臟切片，使用市售套組(ApopTaq Plus Peroxidase in Situ Apoptosis Detection kit，Chemicon,USA)依據生產商指示藉由TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase)酵素將鏈接毛地黃素(digoxigenin)之dUTPs標定於DNA斷裂端點處，接續以鏈接HRP之抗毛地黃素抗體放大訊號並以DAB呈色。
結果係以平均值±SEM表示。兩個組別間之比較係使用
ANOVA或學生氏t試驗進行。小於0.05之p值被認為在統計上具有顯著性。
以檸檬醛處理局部腎絲球硬化症小鼠，分別在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天偵測尿蛋白數值，並且除以肌酸酐作為校正。疾病誘發組第7天測得1.12±0.21 mg/dl、第28天測得1.55±0.36mg/dl、正常控制組測得0.76±0.04 mg/dl。顯示從第7天開始即可在疾病組觀察到蛋白尿濃度除以肌酸酐數值開始有明顯上升的趨勢，和正常控制組相互比較，具有統計學上意義(p<0.05)。
檸檬醛治療組第7天1.14±0.20 mg/dl、第28天0.39±0.10mg/dl與疾病誘發組數值相比較，可發現檸檬醛治療組蛋白尿濃度除以肌酸酐數值均較疾病組低，明顯降低蛋白尿，與疾病組相比具統計差異(p<0.01)(圖1A)。另外，也發現疾病組隨著時間的增加，陸續開始出現血尿、虛弱情形。
這些結果顯示檸檬醛可明顯改善腎絲球硬化小鼠之蛋白尿及血尿之病徵。
腎功能的評估主要可分為監測血中尿素氮和肌酸酐的變化情形兩部份。以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症，在血清尿素氮方面，疾病組各組平均數值分別為疾病誘發第7天26.2±0.01mg/dl、第28天108.1±6.45mg/dl，而正常控制組為29.4±0.68 mg/dl。顯示疾病組從第7天、第28天，血清尿素氮皆有明顯增加情形，而檸檬醛治療組在第7天為20.23±2.09 mg/dl、第28天為20.17±2.50 mg/dl，均較疾病組為低，具統計學上之意義(p<0.01)(圖1B)。
在血清肌酸酐方面，疾病組平均數值分別為疾病誘發第7天0.46±0.01 mg/dl、第28天0.6±0.07 mg/dl，以及正常控制組數值為0.25±0.07 mg/dl。結果顯示，疾病組從第7天開始，血清肌酸酐開始有明顯增加之情形，而這樣升高的情況一直持續到第28天。以檸檬醛治療局部腎
絲球硬化症，第7天0.26±0.014 mg/dl、第28天0.22±0.02 mg/dl，可明顯降低血中肌酸酐，與疾病組具統計差異(p<0.05)(圖1C)。
這些結果顯示檸檬醛可明顯降低腎絲球硬化小鼠之血清尿素氮及血清肌酸酐。
以蘇木紫及伊紅染色，觀察腎絲球的組織型態變化。在疾病誘發後7天，腎絲球開始出現輕度膈細胞增殖，疾病誘發第28天，可以觀察到部分腎絲球微血管消失、臟層上皮細胞與壁細胞死亡，以及大量纖維物質沉積與硬化，而在腎間質可發現蛋白質的沉積(Protein cast)與腎小管萎縮的病理變化。染色結果顯示，檸檬醛治療組於第28天與疾病組相比，可明顯抑制腎臟纖維化及淋巴球浸潤現象(圖2)。
局部腎絲球硬化症是腎絲球硬化、纖維化之腎臟疾病，因此藉由PAS染色觀察腎臟組織纖維化情形。結果顯示，在疾病誘發後7天，腎絲球開始出現輕度纖維化，疾病誘發第28天，可以觀察到嚴重纖維化情形，與正常控制組相比具明顯差異。以檸檬醛治療局部腎絲球硬化症，於第28天可明顯降低纖維化，與疾病組相比，具顯著差異(p<0.001)(圖3)。
相關研究指出TGF-β在組織纖維化上扮演重要角色，使局部腎絲球硬化症更加惡化，在此探討檸檬醛是否藉由降低腎臟TGF-β蛋白表現，來改善腎硬化情形。利用IHC偵測，結果顯示，在疾病組中，在第28天其TGF-β的表現顯著較正常控制組高，與正常控制組相比較具有明顯差異。而檸檬醛治療組，腎臟TGF-β表現量於第28天顯著減少，與疾病組相比具顯著差異(p
<0.01)(圖4)。
此外，纖維化標記纖維連接蛋白(fibronectin)，於疾病誘發後第28天在腎絲球中有明顯表現，與正常控制組相比具明顯差異，而檸檬醛治療組於第28天明顯減少腎絲球之纖維連接蛋白表現量，與疾病組相比，具統計意義(p
<0.001)(圖5)。
另外，TGF-β調控之纖維化蛋白膠原蛋白IV於疾病誘發第
28天之腎組織中明顯增加，與正常控制組相比具明顯差異，而檸檬醛治療組表現量於第28天明顯減少，與疾病組相比具統計差異(p
<0.01)(圖6)。
這些結果顯示檸檬醛可明顯降低腎絲球硬化小鼠之腎臟纖維化現象，各種纖維化指標蛋白均有明顯下降。
局部腎絲球硬化具典型足細胞受損病理變化，因此以足細胞受損標記肌間線蛋白(Desmin)來評估檸檬醛是否可抑制足細胞受損。結果顯示，疾病組從第7天開始即可染上結蛋白，並持續到第28天，與正常控制組相比較具有明顯差異。檸檬醛治療組於第7天以及第28天可明顯抑制結蛋白表現，與疾病組相比具顯著差異(p<0.001)(圖7)。
這些結果顯示檸檬醛可明顯降低腎絲球硬化小鼠之足突細胞損傷。
測量實驗動物之血液及尿液中ROS的表現量。結果顯示，檸檬醛治療組於第7天780.0±16.3 RLU/15min，即明顯抑制血液中ROS，與疾病組1845±69.8 RLU/15min相比，具統計差異(p<0.001)，並持續到第28天2850±69.8 RLU/15min。而尿液中ROS的表現量，以檸檬醛治療第28天ROS含量較低788.7±87.5 RLU/15min，與疾病組相比1478.75±141.1 RLU/15min具統計差異(p<0.001)(圖8)。
接著，以DHE染色直接觀察腎臟組織中ROS含量；結果顯示，疾病組第28天明顯染上DHE，與正常控制組相比較具有明顯差異。而檸檬醛治療組於第28天可明顯降低ROS含量，與疾病組相比具顯著差異(p<0.001)(圖9)。另一方面，也以西方墨點轉漬法偵測腎臟組織中NADPH p47蛋白表現，檸檬醛治療組於第28天可抑制腎臟組織中NADPH p47蛋白表現，具統計差異(p<0.01)(圖10)。
這些結果顯示檸檬醛可明顯降低腎絲球硬化小鼠之ROS表現。
測量實驗動物之血液及尿液中NO的表現量。結果顯示，疾病組第7天763.8±40.3μM，第28天1259.3±42.3μM，正常控制組234.7±65.5μM，即從第7天開始疾病組血清NO表現量有明顯上升，和正常控制組相互比較，具有統計學上意義(p
<0.001)。而檸檬醛治療組血清NO表現量於第7天明顯減少497.1±36.2μM，與疾病組相比具統計差異(p
<0.01)，並且持續到第28天404.8±31.5μM(p
<0.001)(圖11)。
這些結果顯示檸檬醛可明顯降低腎絲球硬化小鼠之NO表現。
測量實驗動物之Nrf2轉錄蛋白及其下游蛋白表現。結果顯示，疾病誘發組於第7天、第28天明顯降低Nrf2核蛋白表現量，與控制組相比具明顯差異(p
<0.05)，而檸檬醛治療組於第7天即明顯增加Nrf2核蛋白表現量，而以檸檬醛治療第28天後，與疾病組相比具統計差異(p
<0.05)(圖12)。
另外，以ELISA偵測Nrf2下游調控基因HO-1的蛋白產生，疾病組第7天2.2±0.7ng/ml，第28天1.3±0.1ng/ml有明顯降低HO-1蛋白表現情形，與正常控制組2.2±0.3ng/ml相比具顯著差異(p
<0.05)，而檸檬醛治療組HO-1表現量於第28天2.5±0.3ng/ml，與疾病組相比具統計差異(p
<0.01)(圖13A)。
同時，也以西方墨點轉漬法偵測Nrf2下游調控基因NQO-1的產生，結果顯示，疾病誘發組於第28天明顯降低NQO-1蛋白表現量，與正常控制組相比具統計差異(p
<0.001)，而檸檬醛治療組於第28天明顯增加NQO-1蛋白表現量，與疾病組相比具統計差異(p
<0.05)(圖13B及C)。
這些結果顯示檸檬醛增加腎絲球硬化小鼠之Nrf2轉錄蛋白及其下游蛋白表現。
測量實驗動物之發炎細胞活化情形。結果顯示，疾病組第28天腎絲球周圍明顯有巨噬細胞浸潤情形，與正常控制組相比具明顯差
異，而檸檬醛治療組於第28天明顯減少浸潤現象，與疾病組相比，具統計意義(p<0.001)(圖14)。
另一方面，疾病組第28天腎絲球周圍明顯有T細胞浸潤情形，與正常控制組相比具明顯差異，而檸檬醛治療組於第28天明顯減少浸潤現象，與疾病組相比，具統計意義(p<0.05)(圖15)。
測量實驗動物之調控發炎轉錄蛋白NF-κB之表現情形。ELISA結果顯示，從第7天開始疾病組NF-κB p65表現量有明顯上升，和正常控制組相互比較，具有統計學上意義(p
<0.01)。檸檬醛治療組NF-κB p65蛋白表現量於第7天明顯減少0.32±0.04ng/ml，與疾病組相比具統計差異(p
<0.05)，並且持續到第28天0.36±0.02ng/ml(p<0.01)。
免疫組織化學染色結果顯示，疾病組第7天、第28天，染色結果強度較控制組明顯，而以檸檬醛治療後第28天，腎臟組織中明顯降低NF-κB表現，與疾病組相比，具統計差異(p
<0.05)(圖16)。
這些結果顯示檸檬醛抑制腎臟組織之NF-κB發炎路徑，降低發炎細胞浸潤。
已知細胞具有自噬作用之功能以清除受損蛋白以修復細胞、維持生理恆定。為評估腎臟組織之受損情形，此處以西方墨點轉漬法量測腎臟組織中自噬小體起始蛋白Atg5-12及外套膜蛋白LC3之表現量。
如圖17所示，疾病組腎臟組織Atg5-12之表現量隨疾病進展顯著上升，投予檸檬醛可顯著抑制Atg5-12之蛋白表現。
此外，亦分析自噬小體之外套膜蛋白LC3-I及其活化態LC3-II之表現量，結果顯示疾病組自噬小體形成增加，及活化程度提升，表示自噬小體的需求量增加，以用於清除受損蛋白。而在檸檬醛治療組中，可由組織型態學等見其發揮療效，推論可能因此降低細胞傷害、減少受損蛋白，進而降低了LC3-I、LC3-II的需求量(圖17)。
腎絲球組織之細胞凋亡已知為局部腎絲球硬化症惡化原因之一，其伴隨胞外基質之產生與沉澱，造成不可逆之生理變化。此處探討
檸檬醛對於腎絲球細胞凋亡之影響。以TUNEL染色評估腎臟組織細胞凋亡情形，圖18之結果顯示誘發疾病後28天腎臟組織出現大量細胞凋亡，而投予檸檬醛可抑制此現象，其腎臟組織之染色表現與正常控制組相當。
進一步分析檸檬醛抑制細胞凋亡之分子機制，以西方墨點轉漬法分析偵測凋亡酶-3、凋亡酶-8、凋亡酶-9、Bcl-2及Bax之表現量，圖19之分析結果顯示疾病組之小鼠腎臟組織中凋亡酶-3及凋亡酶-9之表現量隨疾病進程顯著上升，而在檸檬醛治療組則顯著抑制該等蛋白之表現量，亦即藉由抑制內在路徑凋亡酶-9之表現以降低共同路徑凋亡酶-3之表現。此外，在疾病組中，促凋亡蛋白Bax及凋亡抑制蛋白Bcl-2之表現量同步增加，分別代表大量細胞凋亡及生理回饋作用，而在檸檬醛治療組，該等蛋白之表現均未增加，與正常控制組相當。
這些結果顯示檸檬醛降低凋亡酶-9、凋亡酶-3、促凋亡基因Bax而減少細胞凋亡情形。
在其他主要的藥物代謝器官，如肺臟、肝臟，以及脾臟等部位進行組織切片，顯示檸檬醛在實驗動物發揮療效的同時，不至造成其他組織的損傷(圖20)，且未觀察到明顯可見之不良副作用。
本研究首次證實在局部腎絲球硬化症動物模式中，檸檬醛可改善蛋白尿、血尿、腎功能、發炎細胞的浸潤、組織纖維化及硬化等情形，具有治療局部腎絲球硬化症之效果。在機制的探討上，檸檬醛涉及抑制TFG-β纖維化路徑，經由Nrf2及其下游基因降低氧化壓力，透過NF-kB降低發炎現象，以及降低凋亡酶-9、凋亡酶-3、促凋亡基因Bax而減少細胞凋亡情形。此外，研究亦顯示檸檬醛未對動物產生明顯可見之不良副作用。
因此，本發明提供治療局部腎絲球硬化症之全新、有效且相較安全的藥物治療，具有取代現有藥物之潛力，或與現有藥物併用，以降低藥物劑量減少副作用，提供了治療局部腎絲球硬化症的新選擇。
咸信本發明所屬技藝中具一般知識者基於本文之敘述，無須進一步之例示即可將本發明應用至其最廣泛之範圍。因此，應了解此處所
提供之敘述及申請專利範圍係供例示目的而非以任何方式限制本發明之範疇。
Claims (5)
- 一種檸檬醛用於製備治療局部腎絲球硬化症之藥物的用途。
- 如請求項1之用途，其中該藥物可改善局部腎絲球硬化症之腎組織病變情形，包括降低腎組織纖維化、淋巴球浸潤或足突細胞損傷。
- 如請求項1之用途，其中該藥物可改善局部腎絲球硬化症之腎病症候群病徵，包括降低蛋白尿、血尿、血清尿素氮或血清肌酸酐。
- 如請求項1之用途，其中該藥物為口服。
- 如請求項1之用途，其中該藥物可與一或多種治療局部腎絲球硬化症之藥劑併用，該藥劑包括皮質類固醇、非類固醇抗發炎藥物、細胞毒性藥物或血管擴張劑。
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