WO2016093157A1 - 新規アジュバント - Google Patents

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WO2016093157A1
WO2016093157A1 PCT/JP2015/084096 JP2015084096W WO2016093157A1 WO 2016093157 A1 WO2016093157 A1 WO 2016093157A1 JP 2015084096 W JP2015084096 W JP 2015084096W WO 2016093157 A1 WO2016093157 A1 WO 2016093157A1
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antigen
adjuvant
polymer
virus
swine
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PCT/JP2015/084096
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山本　雅一
佑 舘澤
信幸 堤
篤 大嶋
崇 鎌田
剛 本多
豪一 林田
美香 鈴木
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エヌエーアイ株式会社
一般財団法人日本生物科学研究所
ハイモ株式会社
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an adjuvant and a vaccine composition.
  • inactivated vaccines and subunit vaccines with only bacteria, viruses or parasites as immunogens to animals can produce an immune response high enough to obtain effective protection against pathogen infection. difficult. For this reason, adjuvants are generally added to vaccines to stimulate the immune response.
  • Freund's complete adjuvant including liquid paraffin, surfactant and Mycobacterium tuberculosis killed
  • Freund's incomplete adjuvant not containing these tuberculosis killed bacteria are generally called oil adjuvants.
  • This adjuvant induces immunity against the immunogen by administering it to the animal together with the immunogen and then staying at the site of administration for a long time.
  • side reactions such as granuloma formation are observed due to a long-term residue at the administration site.
  • Aluminum salt adjuvants are known as adjuvants that are less likely to cause side reactions than the above adjuvants.
  • Aluminum hydroxide or aluminum phosphate is used for these aluminum salts.
  • Human vaccines are used, for example, as diphtheria, tetanus toxoid vaccines, etc., and have been widely used as adjuvants for human vaccines up to the present because they are less likely to cause side reactions. However, some immunogens have insufficient immunogenicity as adjuvants.
  • animal vaccine adjuvants exist and are used as products. They are, for example, the aluminum salts and Freund's incomplete adjuvants mentioned above, and polymer adjuvants made of acrylic acid or its salts (for example, polyacrylic acid-based water-soluble polymers also known as Carbopol (registered trademark)), etc. Is also present. Combinations of these adjuvants are also used.
  • the above-mentioned aluminum salt adjuvants When used in animals, the above-mentioned aluminum salt adjuvants may have insufficient immune response and duration of immunity, and oil adjuvants may remain at the site of administration for a long time, causing granulomas, induration, etc. Side reactions have been observed, which is an industrial problem.
  • water (containing the immunogen) is added to the oil adjuvant, so that the viscosity increases, and handling of the vaccine containing the oil adjuvant becomes complicated. For example, it takes time to suck the vaccine into the syringe.
  • the polymer adjuvant remains at the site of administration, and the immunogen incorporated into the polymer particles remains at the administration site until the particles are degraded, and continues to present the immunogen for a long period of time. Therefore, a high immune response can be induced.
  • handling thereof is complicated as with the vaccine containing the oil adjuvant.
  • the object of the present invention is to provide an adjuvant having high immunity-inducing ability and low viscosity.
  • the present inventors have found that by using an acrylic acid-based polymer that is not cross-linked, it is possible to provide an adjuvant with high immunity-inducing ability and low viscosity, leading to the present invention. It was.
  • a polymer adjuvant a water-soluble acrylic acid polymer cross-linked with polyacryl sucrose has been conventionally known.
  • the present invention provides a linear water-soluble acrylic acid water-soluble polymer as an adjuvant.
  • the vaccine composition containing this linear acrylic acid polymer as an adjuvant had a stronger immunity-inducing ability than vaccine compositions containing a prior art polymer adjuvant, which was an unexpected effect.
  • the present invention in one embodiment thereof, provides an adjuvant containing an acrylic acid polymer.
  • the acrylic polymer may be polyacrylic acid or a salt thereof.
  • the acrylic acid polymer may have a weight average molecular weight of 100,000 to 15,000,000 daltons.
  • the 0.2 mass% viscosity may be greater than 64 mP ⁇ s and less than 780 mP ⁇ s.
  • the immunogen may be derived from bacteria, viruses or protozoa.
  • the immunogen is Staphylococcus aureus antigen, Aeromonas antigen, Mycobacterium tuberculosis antigen, Swine erysipelas antigen, Actinobacillus pleuropneumoniae antigen, Mycoplasma hyopneumoniae antigen, Bordetella bronchiseptica antigen, Pasteurella multocida antigen, Hemophilus paraswitzer Antigen, Mycoplasma hyorainis antigen, Escherichia coli antigen, Salmonella cholera swiss antigen, Streptococcal antigen, Influenza virus antigen, SARS virus antigen, AIDS virus antigen, Porcine epidemic diarrhea virus antigen, Infectious gastroenteritis virus antigen, Swine breeding respiration
  • Another embodiment of the present invention is a method of administering a vaccine composition to a non-human mammal.
  • an adjuvant containing an acrylic acid polymer [2] The adjuvant according to [1], wherein the acrylic polymer is polyacrylic acid or a salt thereof. [3] The adjuvant according to [1] or [2], wherein the acrylic acid polymer has a weight average molecular weight of 100,000 to 15,000,000 daltons. [4] The adjuvant according to [1] or [2], wherein the 0.2 mass% viscosity is 90 mP ⁇ s or more and less than 780 mP ⁇ s. [5] A vaccine composition comprising the adjuvant according to any one of [1] to [4] and an immunogen to be administered for immunization.
  • the immunogen is a staphylococcus aureus antigen, an E. aeruginosa antigen, a Mycobacterium tuberculosis antigen, a swine gonococcal antigen, an Actinobacillus pleuropneumoniae antigen, a Mycoplasma hyopneumoniae antigen, a Bordetella bronchiceptica antigen, a Pasteurella multocida antigen, Hemophilus paraswiss antigen, Mycoplasma hyorainis antigen, Escherichia coli antigen, Salmonella cholera swiss antigen, Streptococcus antigen, Influenza virus antigen, SARS virus antigen, AIDS virus antigen, Swine epidemic diarrhea virus antigen, Infectious gastroenteritis virus antigen, Swine reproductive and respiratory syndrome virus antigen,
  • an adjuvant having a high immunity-inducing ability and a low viscosity can be provided.
  • Adjuvants Containing Acrylic Polymers The present invention provides, as one embodiment, an adjuvant characterized by containing a water-soluble acrylic acid polymer and at least one immunogen.
  • an adjuvant refers to a substance that increases antibody production and enhances an immune response when mixed or combined with an immunogen.
  • acrylic acid polymer means polyacrylic acid and its salt.
  • the acrylic acid polymer used in the present invention is a polymer having a monomer selected from acrylic acid, methacrylic acid, maleic acid, and itaconic acid, or a copolymer containing at least one of these monomers as a structural unit, Or these salts are preferable.
  • the adjuvant according to one embodiment of the present invention can be produced using acrylic acid or a salt thereof as a monomer.
  • the polymer can be synthesized by stirring vigorously to form a water-in-oil emulsion and then starting polymerization.
  • oily substances composed of hydrocarbons used as a dispersion medium include paraffins, mineral oils such as kerosene, light oil, and middle oil, or hydrocarbon-based synthetic oils having characteristics such as boiling point and viscosity in substantially the same range as these. Or a mixture thereof.
  • a surfactant having a Hydropile-Lipophile® Balance (HLB) value of 3 to 12 preferably a nonionic surfactant.
  • HLB Hydropile-Lipophile® Balance
  • specific examples thereof include sorbitan monooleate, sorbitan monostearate, sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan trioleate, polyoxyalkylene alkyl ether and the like.
  • the addition rate of these surfactants is 0.5 to 10% by weight, preferably 1 to 5% by weight, based on the total amount of the water-in-oil emulsion.
  • the polymerization concentration is 15 to 50% by mass, preferably 20 to 40% by mass.
  • the polymerization temperature is 0 to 80 ° C., preferably 20 to 55 ° C.
  • the polymerization temperature is appropriately set depending on the polymerization method and the initiator.
  • a radical polymerization initiator may be added to initiate polymerization.
  • These initiators may be either oil-soluble or water-soluble, and can be polymerized by any of azo, peroxide, and redox systems.
  • oil-soluble azo initiators include 2,2′-azobisisobutyronitrile, 1,1′-azobis (cyclohexanecarbonitrile), 2,2′-azobis (2-methylbutyronitrile), Examples include 4,4-azobis (4-methoxy-2,4-dimethyl) valeronitrile, dimethyl-2,2′-azobisisobutyrate and the like, which can be dissolved in a water-miscible solvent and added.
  • water-soluble azo initiators examples include 2,2'-azobis (amidinopropane) dihydrochloride, 2,2'-azobis [2- (5-methyl-2-imidazolin-2-yl) propane] Examples thereof include dihydrochloride and 4,4′-azobis (4-cyanovaleric acid).
  • redox systems include combinations of ammonium peroxodisulfate with sodium sulfite, sodium hydrogen sulfite, trimethylamine, tetramethylethylenediamine, and the like.
  • peroxides include ammonium or potassium peroxodisulfate, hydrogen peroxide, benzoyl peroxide, lauroyl peroxide, octanoyl peroxide, succinic peroxide, and t-butylperoxy 2-ethylhexanoate. I can give you.
  • hydrophilic surfactant called a phase inversion agent
  • the emulsion particles covered with the oil film formed thereby are easy to become familiar with water, and the water-soluble polymer is easily dissolved. Therefore, the emulsion particles can be diluted with water and used.
  • hydrophilic surfactants to be used include cationic surfactants and nonionic surfactants having an HLB value of 9 to 15, polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene alcohol ethers, Alcohol alkoxylates are preferred.
  • Acrylic acid polymer used in the present invention is a 0.2 mass% polymer solution prepared by dissolving a polymer in demineralized water, when the viscosity at 25 ° C. measured by a B-type viscometer is measured at a rotation speed of 30 mm rpm
  • the viscosity may be any value in the range of 90 ⁇ mPa ⁇ s or more and less than 780 ⁇ mPa ⁇ s.
  • the lower limit of the viscosity is 90 mPa ⁇ s or more, more preferably 95 mPa ⁇ s or more, more preferably 98 mPa ⁇ s or more, and the upper limit is 780 mPa ⁇ s.
  • ⁇ mPa ⁇ s less than 750 ⁇ mPa ⁇ s, 700 mPa ⁇ s or less, 650 mPa ⁇ s or less, 600 mPa ⁇ s or less, 550 mPa ⁇ s or less, 500 mPa ⁇ s or less, 450 mPa ⁇ s or less More preferably, it is more preferably 413 mPa ⁇ s or less.
  • the weight average molecular weight of the acrylic acid polymer used in the present invention is preferably 100,000 to 15,000,000 daltons, and more preferably 1,000,000 to 10,000,000 daltons.
  • the weight average molecular weight in the present invention refers to a weight average molecular weight measured by a light scattering method.
  • the present invention provides a vaccine composition containing the above adjuvant composition and at least one immunogen.
  • the immunogen is not particularly limited, and may include any immunogen that is desired to be vaccinated in humans or animals (mammals, fish, etc.).
  • Immunogens include bacteria-derived immunogens, virus-derived immunogens, protozoan-derived immunogens, and the like.
  • bacteria-derived immunogens include Staphylococcus aureus antigens, Aeromonas antigens, Mycobacterium tuberculosis antigens, and porcine-derived pathogenic bacterial antigens.
  • porcine pathogenic bacterial antigens include, for example, porcine erysipelothrix rhusiopathiae antigen, Actinobacillus pleuropneumoniae antigen, Mycoplasma hyopeumoniae antigen, Bordetella bronchie Bordetella bronchiseptica antigen, Pasteurella multocida antigen, Haemophilus parasuis antigen, Mycoplasma hyorhinis antigen, Escherichia coli antigen, Salmonella alui Examples include Streptococcus suis antigen. These pathogenic bacteria are preferably inactivated or attenuated to give immunogens, and inactivated immunogens are particularly preferable.
  • virus-derived immunogens include influenza virus antigens, SARS virus antigens, AIDS virus antigens, and porcine-derived pathogenic virus antigens.
  • porcine pathogenic virus antigens include, for example, porcine epidemic diarrhea virus (Porcine Epidemic Diarrhea virus) antigen, infectious gastroenteritis virus (Transmissible gastroenteritis virus) antigen, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (Porcine reproductive virus) and respiratory syndrome virus) antigen, Japanese encephalitis virus (Japanese encephalitis virus) antigen, porcine parvovirus (porcine parvo ⁇ ⁇ virus) antigen, porcine circovirus (porcine circo virus) antigen, swine influenza virus (swine influenza virus) antigen, Ausky disease Examples include virus (Aujesky's disease virus) antigen. It is preferable to inactivate or attenuate the pathogenic virus to obtain an immunogen, and in particular, an inactivated immunogen is preferable.
  • protozoan-derived immunogen examples include trypanosoma antigen, coccidium antigen, malaria antigen, and Tyreria antigen.
  • a protein secreted out of a bacterial cell a protein extracted or purified from a bacterium or a virus, or a gene derived from the gene and expressed in other organisms such as Escherichia coli and baculovirus Recombinant proteins and the like can also be used.
  • Apx toxins As specific examples, four types of Apx toxins (ApxI, ApxII, ApxIII, ApxIV) produced and secreted by Actinobacillus pleuropneumoniae, or toxins expressed in recombinant form thereof, Shiga toxin produced by Escherichia coli (Stx) ), Or a recombinant toxin thereof expressed in Escherichia coli, a surface defense antigen polypeptide (SpaA, SpaB or SpaC) present on the surface of swine erysipelas cells, or the polypeptide And the like expressed in E. coli, etc., and Patent Document 2 may be referred to regarding the use of the polypeptide.
  • Pasteurella multocida toxin produced by Pasteurella multocida or those expressed in a recombinant form can be mentioned.
  • Patent Document 3 may be referred to.
  • an inactivated protein derived from these bacteria or a recombinant protein can be used as an immunogen.
  • the immunogen is a porcine erysococcus (eg, an inactivated swine gonococcus).
  • the vaccine composition described above can be administered to mammals.
  • animals to be administered include, but are not limited to, pigs, cows, horses, dogs, cats, humans, mice, rats, rabbits, and guinea pigs. More specifically, it is preferably administered to pigs.
  • the administration route includes intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, intraperitoneal administration, transdermal administration, transmucosal administration, intravenous administration, It is not limited to these.
  • the route of administration can be changed based on what kind of immune response is desired against the immunogen. For example, when humoral immunity is produced by producing antibodies, intramuscular injection or subcutaneous injection is possible. When injection can be used and it is desired to generate an immune response on the mucosal surface, oral administration or transmucosal administration can be used to induce mucosal immunity centered on IgA.
  • Example 1 Preparation of polymer adjuvant (1) A reaction vessel equipped with a stirrer and temperature controller was charged with 119.6 g of liquid paraffin with an average molecular weight of 300, 11.2 g of polyoxyethylene sorbitan trioleate (HLB11), and 11.2 g of polyoxyalkylene alkyl ether (HLB11.7) to make it uniform. . After adding 106.6 g of deionized water and 76.6 g of 80% by mass aqueous acrylic acid (AAC), 67.0 g of 48% by mass sodium hydroxide was added while cooling so that the liquid temperature did not exceed 30 ° C., and neutralized.
  • AAC aqueous acrylic acid
  • the sodium acrylate aqueous solution thus obtained was stirred and emulsified at 1000 rpm for 60 minutes.
  • the obtained emulsion was maintained at 52 ° C. and purged with nitrogen for 30 minutes, and then 0.4 ⁇ g of dimethyl-2,2′-azobisisobutyrate was added to initiate the polymerization reaction.
  • Polymerization was carried out at a reaction temperature of 52 ⁇ 2 ° C. for 5 hours, and the reaction was further completed at 70 ° C.
  • Example 2 Preparation of polymer adjuvant (2) A reaction vessel equipped with a stirrer and temperature controller was charged with 149.7 g of liquid paraffin with an average molecular weight of 300, 14.0 g of polyoxyethylene sorbitan trioleate (HLB11), and 14.0 g of polyoxyalkylene alkyl ether (HLB11.7) to make it uniform. . After adding 133.2 g of deionized water and 95.9 g of 80% by weight aqueous acrylic acid (AAC), the solution was neutralized by adding 83.6 g of 48% by weight sodium hydroxide while cooling so that the liquid temperature did not exceed 30 ° C.
  • AAC aqueous acrylic acid
  • the sodium acrylate aqueous solution thus obtained was stirred and emulsified at 1000 rpm for 60 minutes.
  • the obtained emulsion was maintained at 52 ° C. and purged with nitrogen for 30 minutes.
  • 0.25 ⁇ g of dimethyl-2,2′-azobisisobutyrate was added to initiate the polymerization reaction.
  • Polymerization was performed at a reaction temperature of 52 ⁇ 2 ° C. for 5 hours, and the reaction was further completed at 70 ° C.
  • Example 3 Production method of polymer adjuvant (3) A reaction vessel equipped with a stirrer and temperature controller was charged with 149.5 g of liquid paraffin having an average molecular weight of 300, 14.0 g of polyoxyethylene sorbitan trioleate (HLB11), and 14.0 g of polyoxyalkylene alkyl ether (HLB11.7) to make it uniform. . After adding 87.0 g of deionized water and 119.7 g of 80% aqueous acrylic acid (AAC), the mixture was neutralized by adding 102.3 g of 48% sodium hydroxide while cooling so that the liquid temperature did not exceed 30 ° C.
  • AAC aqueous acrylic acid
  • the sodium acrylate aqueous solution thus obtained was stirred and emulsified at 1000 rpm for 60 minutes.
  • the obtained emulsion was kept at 52 ° C. and purged with nitrogen for 30 minutes, and then 0.25 g of dimethyl-2,2′-azobisisobutyrate was added to initiate the polymerization reaction.
  • Polymerization was carried out at a reaction temperature of 52 ⁇ 2 ° C. for 5 hours, and the reaction was further completed at 70 ° C.
  • Example 4 Preparation of polymer adjuvant (4)
  • a reaction vessel equipped with a stirrer and temperature controller was charged with 299.0 g of liquid paraffin with an average molecular weight of 300, 28.0 g of polyoxyethylene sorbitan trioleate (HLB11), and 28.0 g of polyoxyalkylene alkyl ether (HLB11.7) to make it uniform. .
  • AAC 80% aqueous acrylic acid
  • the sodium acrylate aqueous solution thus obtained was stirred and emulsified at 1000 rpm for 60 minutes.
  • the obtained emulsion was maintained at 52 ° C. and purged with nitrogen for 30 minutes, and then 0.50 g of dimethyl-2,2′-azobisisobutyrate was added to initiate the polymerization reaction.
  • Polymerization was carried out at a reaction temperature of 52 ⁇ 2 ° C. for 5 hours, and the reaction was further completed at 70 ° C.
  • Example 5 Preparation method of polymer adjuvant (5)
  • a reaction vessel equipped with a stirrer and temperature controller was charged with 299.0 g of liquid paraffin with an average molecular weight of 300, 28.0 g of polyoxyethylene sorbitan trioleate (HLB11), and 28.0 g of polyoxyalkylene alkyl ether (HLB11.7) to make it uniform. .
  • AAC 80% aqueous acrylic acid
  • the sodium acrylate aqueous solution thus obtained was stirred and emulsified at 1000 rpm for 60 minutes.
  • the obtained emulsion was maintained at 52 ° C. and purged with nitrogen for 30 minutes, and then 0.50 g of dimethyl-2,2′-azobisisobutyrate was added to initiate the polymerization reaction.
  • Polymerization was carried out at a reaction temperature of 52 ⁇ 2 ° C. for 5 hours, and the reaction was further completed at 70 ° C.
  • the inactivated vaccine of swine erysipelas typical as a porcine pathogen was prepared using the above polymer adjuvants with different viscosities, and a test was conducted to confirm the effectiveness using mice.
  • the test system carried out was tested with reference to Non-Patent Document 1, which is the current method for assaying pig vaccines.
  • Experimental Example 1 Effectiveness confirmation test of polymer adjuvanted swine erysipelas inactivated vaccine
  • An experimental vaccine containing an inactivated bacterial solution of swine erysipelas (Tama 96 strain), which is a representative vaccine strain, and a polymer adjuvant was prepared. Tama 96 strain swine erysipelas cultivated at 37 ° C for about 18 hours, added formalin to 0.2 vol%, and sensitized at 37 ° C for 16 hours or more to inactivate it. . Inactivation was confirmed by seeding 0.2 mL of the inactivated bacterial solution on an agar plate and not growing.
  • the number of viable bacteria before inactivation was 3.3 ⁇ 10 9 cfu / mL.
  • Inactivated bacterial solution and polymer adjuvant (polymer content 5% (w / v)) EM-1 and purified EM-1 were mixed in a 10: 1 amount and dispersed.
  • Carbopol registered trademark
  • 934 polymer content 5% (w / v)
  • the number of survivors after challenge was significantly higher in the two groups administered with the vaccine consisting of the polymer adjuvant EM-1 and purified EM-1 in addition to the present invention, compared to the group without adjuvant (inactivated bacteria solution only). .
  • the results obtained clearly show that all polymer adjuvants enhance the immune response to swine erysipelas antigen.
  • Experimental Example 2 Effectiveness confirmation test after 5-fold dilution of polymer adjuvanted swine erysipelas inactivated vaccine
  • the experimental vaccine used in Experimental Example 1 was diluted 5-fold with PBS to give Experimental vaccine 2.
  • Four weeks old SPF mice (female) were immunized with 0.1 mL of experimental vaccine 2 subcutaneously in the inner thigh.
  • Three weeks after immunization about 10 3 live swine erysipelas Fujisawa strain (strongly toxic) was suspended in 1 mL of TPB medium and injected subcutaneously into the inner thigh.
  • Ten animals were attacked in each test group. Observed for 1 week and recorded the number of deaths. Table 2 shows the number of surviving mice one week after the challenge.
  • the number of survivors after the attack was significantly higher than the group not adding the present invention (only inactivated bacterial solution). it was high.
  • a vaccine containing Carbopol (registered trademark) 934 as an adjuvant a sufficient immune response could not be obtained. Therefore, the present invention has been shown to enhance the immune response to swine erysipelas antigen, and obtained an unexpected result that it has higher immunogenicity than the cross-linked acrylic acid polymer Carbopol® 934. In addition, no reaction at the administration site was observed in all mice.
  • mice Four weeks old SPF mice (female) were immunized with 0.1 mL of experimental vaccine 3 subcutaneously in the inner thigh. Three weeks after immunization, about 10 3 live swine erysipelas Fujisawa strain (strongly toxic) was suspended in 1 mL of TPB medium and injected subcutaneously into the inner thigh. 10 animals were attacked under each experimental condition. Observed for 1 week and recorded the number of deaths. Table 3 shows the number of surviving mice one week after the challenge.
  • Carbopol (registered trademark) 934 could not be prepared at a 5-fold dilution because of its high viscosity.
  • EM-1 and purified EM-1 of the present invention could be prepared due to low viscosity.
  • the adjuvant of this invention has a viscosity lower than the conventional adjuvant, the operativity of the adjuvant of this invention is high.
  • Polymer adjuvant (Carbopol (registered trademark) 934 (780 mPa ⁇ s), HyS (viscosity 98 mPa ⁇ s), HyM (224 mPa ⁇ s), HyL (413 mPa ⁇ s) )) (Polymer content 1%) were mixed in a 9: 1 amount and dispersed. Only a bacterial solution containing no adjuvant was used as a control. Four weeks of SPF mice (female) were immunized with 0.1 mL of experimental vaccine subcutaneously in the inner thigh.
  • mice Male
  • mice Female
  • mice were immunized with 0.1 mL of experimental vaccine 5 subcutaneously in the inner thigh.
  • 3 live swine erysipelas Fujisawa strain was suspended in 1 mL of TPB medium and injected subcutaneously into the inner thigh. Observed for 1 week and recorded the number of deaths. (Table 5)

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Abstract

　本発明は、Carbopol（登録商標）等の従来のポリマーアジュバントよりも、免疫惹起能が高く、低い粘性を有するアジュバントを提供する。より具体的には、アクリル酸系ポリマーを含むアジュバント、このアジュバントと免疫化のために投与すべき免疫原とを含有するワクチン組成物、及びこのワクチン組成物を非ヒト哺乳動物に投与する方法を提供する。

Description

新規アジュバント
　本発明は、アジュバント及びワクチン組成物に関する。
　細菌、ウイルス又は寄生虫を弱毒化させたものを抗原として含む生ワクチン、不活性化させた微生物から得た抗原を含む不活化ワクチン、又は微生物の特定の抗原を含むサブユニットワクチンを投与された動物は、これらの抗原を記憶する。このため、投与された抗原と同じ又は類似の抗原を有する病原体に対して速やかな免疫応答を示し、病原体を排除する。
　しかしながら、細菌、ウイルス又は寄生虫のみを免疫原とする不活化ワクチンおよびサブユニットワクチンを動物に投与しても、病原体の感染に対して有効な防御を得る程の高い免疫応答を生じさせることは難しい。このため、一般的に、ワクチンには免疫応答を賦活化させるためにアジュバントを添加する。
　古くは、フロイント完全アジュバント（流動パラフィン、界面活性剤および結核菌死菌を含む）、これの結核死菌を含まないフロイント不完全アジュバントがあり、これらは一般的にオイルアジュバントと呼ばれる。このアジュバントは免疫原と共に動物に投与された後、投与局所に長期間留まることによって、免疫原に対する免疫を誘導する。一方、投与局所での長期間の残留によって、肉芽腫形成などの副反応が認められることも知られている。
　上記のアジュバントと比較して副反応がでにくいアジュバントとしてアルミニウム塩アジュバントが知られている。それらアルミニウム塩には水酸化アルミニウムあるいはリン酸アルミニウムが用いられている。ヒト用のワクチンでは、例えばジフテリア、破傷風トキソイドワクチン等に用いられており、副反応が出にくい特徴から現在までヒト用ワクチンのアジュバントとして広く用いられている。しかしながら、アジュバントとして免疫惹起能が不十分な免疫原も存在する。
　動物用ワクチンのアジュバントは多種多様なものが存在し、製品として利用されている。それらは、例えば、上記に挙げたアルミニウム塩やフロイント不完全アジュバントであり、アクリル酸あるいはその塩類からなるポリマーアジュバント（例えばCarbopol（登録商標）としても公知であるポリアクリル酸系の水溶性ポリマー）等も存在する。また、これらのアジュバントの組み合わせも利用されている。
　動物に利用する場合、上記に示したアルミニウム塩アジュバントでは免疫応答や免疫の持続期間が不十分な場合があり、オイルアジュバントでは投与局所に長期間残存することによって投与部位に肉芽腫、硬結等の副反応が認められ、産業上問題となっている。上記に加えて、オイルアジュバントに水（免疫原を含有する）が加えられることによって、粘性が増し、オイルアジュバントを含むワクチンの取扱いは煩雑となる。例えばワクチンの注射器への吸引に時間がかかる。
　ポリマーアジュバントも同様に投与局所に残留し、ポリマーの粒子に取り込まれた免疫原は粒子が分解されるまで投与部位に残留して、長期間免疫原を提示し続ける。従って高い免疫応答を誘導する事が可能となる。しかしながら、粘性の高さから、上記オイルアジュバントを含むワクチン同様、その取扱いは煩雑である。
　従って、高い免疫反応を誘導し、粘性が低く取扱いも容易である新規アジュバントが必要とされている。
特表2011-500772 特開2006-25659 特開2004-242608
動物用生物学的製剤基準（公益社団法人日本動物用医薬品協会、平成20年3月p311～p315）
　従来技術に認められるワクチンに含まれるアジュバントの免疫惹起能は、動物への病原体の侵入を防御するには不十分なものがある。免疫惹起能の高いオイルアジュバント及びポリマーアジュバントは投与局所に長時間残留することから明らかな様に、高い粘性を有し、取扱いは煩雑である。
　本発明は、免疫惹起能が高く、低い粘性を有するアジュバントを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、架橋させないアクリル酸系ポリマーを用いることにより、免疫惹起能の高く、低い粘性を有するアジュバントを提供できることを見出し、本発明に至った。ポリマーアジュバントとしてはポリアクリルスクロースで架橋されたアクリル酸水溶性ポリマーが従来より知られていたが、それとは異なり本発明では架橋されていない直鎖状のアクリル酸水溶性ポリマーをアジュバントとして提供する。この直鎖状のアクリル酸ポリマーをアジュバントとして含有したワクチン組成物は従来技術のポリマーアジュバントを含むワクチン組成物と比較して免疫惹起能が強く、これは予想外の効果であった。
　すなわち、本発明はその一実施態様において、アクリル酸系ポリマーを含む、アジュバントを提供する。アクリル系ポリマーがポリアクリル酸又はその塩であってもよい。前記アクリル酸系ポリマーの重量平均分子量が100,000～15,000,000ダルトンであってもよい。0.2質量％粘度が64 mP・sより大きく、780 mP・sより小さくてもよい。
　本発明の他の実施態様は、上記アジュバントと、免疫化のために投与すべき免疫原と、を含有するワクチン組成物である。前記免疫原が、細菌、ウイルス又は原虫の由来であってもよい。前記免疫原が、黄色ブドウ球菌抗原、エロモナス菌抗原、結核菌抗原、豚丹毒菌抗原、アクチノバシラス・プルロニューモニエ抗原、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原、ボルデテラ・ブロンキセプチカ抗原、パスツレラ・ムルトシダ抗原、ヘモフィルス・パラスイス抗原、マイコプラズマ・ハイオライニス抗原、大腸菌抗原、サルモネラ・コレラスイス抗原、連鎖球菌抗原、インフルエンザウイルス抗原、SARSウイルス抗原、AIDSウイルス抗原、豚流行性下痢症ウイルス抗原、伝染性胃腸炎ウイルス抗原、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス抗原、日本脳炎ウイルス抗原、豚パルボウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原、豚インフルエンザウイルス抗原、オーエスキー病ウイルス抗原、ApxI、ApxII、ApxIII、ApxIV、Stx、SpaA、SpaB、SpaC、パスツレラ・ムルトシダ毒素、トリパノソーマ抗原、コクシジウム抗原、マラリア抗原、タイレリア抗原から選択されてもよい。
　本発明の他の実施態様は、ワクチン組成物を非ヒト哺乳動物に投与する方法である。
　以上より、本発明は、以下の態様として示される：
　[1]　アクリル酸系ポリマーを含む、アジュバント。
　[2]　アクリル系ポリマーがポリアクリル酸又はその塩である、[1]に記載のアジュバント。
　[3]　前記アクリル酸系ポリマーの重量平均分子量が100,000～15,000,000ダルトンである、[1]又は[2]に記載のアジュバント。
　[4]　0.2質量％粘度が90 mP・s以上であり、そして780 mP・sより小さい、[1]又は[2]に記載のアジュバント。
　[5]　[1]～[4]のいずれか1項に記載のアジュバントと、免疫化のために投与すべき免疫原と、を含有するワクチン組成物。
　[6]　前記免疫原が、細菌、ウイルス又は原虫の由来である、[5]に記載のワクチン組成物。
　[7]　前記免疫原が、黄色ブドウ球菌抗原、エロモナス菌抗原、結核菌抗原、豚丹毒菌抗原、アクチノバシラス・プルロニューモニエ抗原、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原、ボルデテラ・ブロンキセプチカ抗原、パスツレラ・ムルトシダ抗原、ヘモフィルス・パラスイス抗原、マイコプラズマ・ハイオライニス抗原、大腸菌抗原、サルモネラ・コレラスイス抗原、連鎖球菌抗原、インフルエンザウイルス抗原、SARSウイルス抗原、AIDSウイルス抗原、豚流行性下痢症ウイルス抗原、伝染性胃腸炎ウイルス抗原、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス抗原、日本脳炎ウイルス抗原、豚パルボウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原、豚インフルエンザウイルス抗原、オーエスキー病ウイルス抗原、ApxI、ApxII、ApxIII、ApxIV、Stx、SpaA、SpaB、SpaC、パスツレラ・ムルトシダ毒素、トリパノソーマ抗原、コクシジウム抗原、マラリア抗原、タイレリア抗原から選択される、[6]に記載のワクチン組成物。
　[8]　[5]～[7]のいずれか1項に記載のワクチン組成物を非ヒト哺乳動物に投与する方法。
　本発明によれば、免疫惹起能の高く、低い粘性を有するアジュバントを提供することができる。
　アクリル酸系ポリマーを含有するアジュバント
　本発明はその一実施態様として、水溶性アクリル酸系ポリマー、及び、ならびに少なくとも1種の免疫原を含有することを特徴とするアジュバントを提供する。本明細書において、アジュバントとは、免疫原と混合又は組み合わせることで、抗体産生を増大させ、免疫応答の増強を起こす物質をいう。
　本明細書において、アクリル酸系ポリマーとは、ポリアクリル酸及びその塩を意味する。本発明において用いるアクリル酸系ポリマーは、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、イタコン酸から選択されるモノマーを構成単位とするポリマー、若しくはこれらのモノマーの少なくとも1種を構成単位として含む共重合体、又は、これらの塩が好ましい。
　本発明の一実施形態に係るアジュバントは、単量体としてはアクリル酸又はその塩を使用して製造することができる。アクリル酸、イオン交換水、水酸化ナトリウム、水と非混和性の少なくとも一種の炭化水素からなる油状物質、油中水型エマルジョンを形成するに有効な量の少なくとも一種類の界面活性剤を混合し、強攪拌し油中水型エマルジョンを形成させた後、重合開始させることにより合成できる。
　分散媒として使用する炭化水素からなる油状物質の例としては、パラフィン類あるいは灯油、軽油、中油などの鉱油、あるいはこれらと実質的に同じ範囲の沸点や粘度などの特性を有する炭化水素系合成油、あるいはこれらの混合物があげられる。
　界面活性剤の例としては、Hydrophile-Lipophile Balance（HLB）値が、3～12の界面活性剤であり、好ましくはノニオン性界面活性剤である。その具体例としては、ソルビタンモノオレ－ト、ソルビタンモノステアレ－ト、ソルビタンモノパルミテ－ト、ポリオキシエチレンソルビタントリオレート、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルなどがあげられる。これら界面活性剤の添加率としては、油中水型エマルジョン全量に対して0.5～10重量％であり、好ましくは1～5質量％である。
　重合濃度としては、15～50質量％であり、好ましくは20～40質量％である。重合温度としては、0～80℃であり、好ましくは20～55℃であり、重合法、開始剤によって適宜重合温度を設定する。
　重合開始にはラジカル重合開始剤を添加してもよい。これら開始剤は油溶性あるいは水溶性のどちらでも良く、アゾ系、過酸化物系、レドックス系いずれでも重合することが可能である。油溶性アゾ系開始剤の例としては、2,2’-アゾビスイソブチロニトリル、1,1’-アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、2,2’-アゾビス（2-メチルブチロニトリル）、4,4-アゾビス（4-メトキシ-2、4ジメチル）バレロニトリル、ジメチル-2,2’-アゾビスイソブチレートなどがあげられ、これらは水混溶性溶剤に溶解し添加することができる。
　水溶性アゾ系開始剤の例としては、2,2’-アゾビス（アミジノプロパン）二塩化水素化物、2,2’-アゾビス〔2-（5-メチル-2-イミダゾリン-2-イル）プロパン〕二塩化水素化物、4,4’-アゾビス（4-シアノ吉草酸）などがあげられる。またレドックス系の例としては、ペルオキソ二硫酸アンモニウムと亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、トリメチルアミン、テトラメチルエチレンジアミンなどとの組み合わせがあげられる。さらに過酸化物の例としては、ペルオキソ二硫酸アンモニウムあるいはカリウム、過酸化水素、ベンゾイルペルオキサイド、ラウロイルペルオキサイド、オクタノイルペルオキサイド、サクシニックペルオキサイド、t-ブチルペルオキシ2-エチルヘキサノエ－トなどをあげることができる。
　重合後は、転相剤と呼ばれる親水性界面活性剤を添加する。これにより形成される、油の膜で被われたエマルジョン粒子は水になじみ易く、水溶性ポリマーが溶解しやすくなるため、水で希釈して使用することができる。使用する親水性界面活性剤の例としては、カチオン性界面活性剤やＨＬＢ値が9～15のノニオン性界面活性剤が挙げられ、ポリオキシエチレンアルキルエ－テル、ポリオキシエチレンアルコールエ－テル、アルコールアルコキシレートなどが好ましい。
　本発明に使用するアクリル酸系ポリマーは、脱塩水にポリマーを溶解して調製した0.2質量％ポリマー溶液について、B型粘度計により測定される25℃における粘度が、回転数30 rpmで測定した場合に、90 mPa・s以上であり、780 mPa・sより小さい範囲のいずれの値の粘度であってもよい。この粘度の下限値は、90 mPa・s以上のものであり、95 mPa・s以上であることがより好ましく、98 mPa・s以上であることがさらに好ましく、また、上限値は、780 mPa・sより小さいものであり、750 mPa・s以下、700 mPa・s以下、650 mPa・s以下、600 mPa・s以下、550 mPa・s以下、500 mPa・s以下、450 mPa・s以下であることがより好ましく、413 mPa・s以下であることがさらに好ましい。
　本発明に用いるアクリル酸系ポリマーの重量平均分子量は、100,000～15,000,000ダルトンであることが好ましく、1,000,000～10,000,000ダルトンであることがより好ましい。本発明における重量平均分子量とは、光散乱法により測定した重量平均分子量を指す。
　アクリル酸系ポリマーをアジュバントとして含有するワクチン組成物
　本発明は他の実施態様として、上記アジュバント組成物及び少なくとも1種の免疫原を含有するワクチン組成物を提供する。その免疫原には、特に制限はなく、ヒトまたは動物（哺乳動物、魚類など）においてワクチン接種が望まれる免疫原のいずれを含ませてもよい。免疫原としては、細菌由来の免疫原、ウィルス由来の免疫原、原虫由来の免疫原などが含まれる。
　例えば、細菌由来の免疫原として、黄色ブドウ球菌抗原、エロモナス菌抗原、結核菌抗原、豚由来の病原性細菌抗原が挙げられる。具体的な豚由来の病原性細菌抗原としては、例えば、豚丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）抗原、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）抗原、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Mycoplasma hyopeumoniae）抗原、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）抗原、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）抗原、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）抗原、マイコプラズマ・ハイオライニス（Mycoplasma hyorhinis）抗原、大腸菌（Escherichia coli）抗原、サルモネラ・コレラスイス（Salmonella choleraesuis）抗原、連鎖球菌（Streptococcus suis）抗原等が挙げられる。これら病原性細菌を不活性化あるいは弱毒化して免疫原とすることが好ましく、特に不活性化した免疫原が好ましい。
　ウイルス由来の免疫原としては、その具体的な例として、インフルエンザウィルス抗原、SARSウイルス抗原、AIDSウイルス抗原、豚由来の病原性ウイルス抗原が挙げられる。具体的な豚由来の病原性ウイルス抗原としては、例えば、豚流行性下痢症ウイルス（Porcine Epidemic Diarrhea virus）抗原、伝染性胃腸炎ウイルス（Transmissible gastroenteritis virus）抗原、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）抗原、日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus）抗原、豚パルボウイルス（porcine parvo virus）抗原、豚サーコウイルス（porcine circo virus）抗原、豚インフルエンザウイルス（swine influenza virus）抗原、オーエスキー病ウイルス（Aujesky’s disease virus）抗原等が挙げられる。病原性ウイルスを不活性化あるいは弱毒化して免疫原とすることが好ましく、特に不活性化した免疫原が好ましい。
　原虫由来の免疫原としては、その具体的な例として、トリパノソーマ抗原、コクシジウム抗原、マラリア抗原、タイレリア抗原が挙げられる。
　本発明に含まれ得る免疫原として、細菌が菌体外に分泌するタンパク質、あるいは細菌またはウイルスより抽出・精製したもの、あるいはその遺伝子を由来とし大腸菌やバキュロウイルス等の他の生物で発現させた組換えタンパク質等もまた、使用することができる。具体例として、アクチノバシラス・プルロニューモニエが産生・分泌する4種のApx毒素（ApxI、ApxII、ApxIII、ApxIV）、あるいはこれらを組換え体で発現させた毒素、大腸菌が産生する志賀毒素（Stx）、あるいはこれの組換え毒素を大腸菌で発現させたもの、豚丹毒菌の菌体表層に存在する表層防御抗原ポリペプチド（SpaA、SpaBまたはSpaC）を大腸菌で発現させたもの、あるいは当該ポリペプチドを変異させて大腸菌で発現させたもの等が挙げられ、前記ポリペプチドの利用については特許文献2を参照してもよい。またはパスツレラ・ムルトシダが産生するパスツレラ・ムルトシダ毒素、あるいはこれらを組換え体で発現させたもの等が挙げられ、前記組換え毒素の利用については特許文献3を参照してもよい。好ましくはこれらの細菌由来のタンパク質あるいは組換えタンパク質を不活性化したものを免疫原とすることができる。
　特定の実施形態において、上記免疫原は豚丹毒菌（例として不活性化した豚丹毒菌）である。
　上記記載のワクチン組成物は哺乳類動物に投与され得る。その投与される動物の具体的例としては、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモットが挙げられるが、これらの動物には限定されない。さらに具体的にはブタに投与されることが好ましい。
　上記動物に本発明が投与される場合、その投与経路として、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、腹腔内投与、経皮投与、経粘膜投与、静脈内投与が挙げられるが、これらに限定されない。免疫原に対してどの様な免疫反応を生じさせたいかに基づいて、投与経路を変更することもでき、例えば、抗体を産生させて体液性免疫を生じさせたい場合には、筋肉内注射や皮下注射を利用することができ、粘膜面での免疫反応を生じさせたい場合には、IgAを中心とする粘膜免疫を誘導するために経口投与や経粘膜投与を利用することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。下記に示す実施例はいかなる方法によっても本発明を限定するものではない。
　実施例1：ポリマーアジュバントの作製法（1）
　攪拌機および温度制御装置を備えた反応槽に、平均分子量300の流動パラフィン119.6 g、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート（HLB11）11.2 g、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（HLB11.7）11.2 gを仕込み均一にした。脱イオン水106.6 gおよび80質量％水溶液アクリル酸（AAC）76.6 gを添加した後、48%質量水酸化ナトリウム67.0 gを液温が30℃以上にならないよう冷却しながら加え中和した。
　これにより得られたアクリル酸ナトリウム水溶液を1000 rpmで60分間攪拌乳化した。得られた乳化液を52℃に保ち、窒素置換を30分行った後、ジメチル-2,2’-アゾビスイソブチレート0.4 gを加え、重合反応を開始させた。反応温度を52±2℃で5時間重合させ、更に70℃で反応を完結させた。
　重合後、生成した油中水型エマルジョンに転相剤としてアルコールアルコキシレート8.0 gを添加混合した。得られたエマルジョン40 gをアセトン200 mlに添加し、ポリアクリル酸ナトリウムを沈殿させた。沈殿物を回収し、アセトンに溶解した水、オイル、界面活性剤を除去した。この作業を2回繰り返した後、回収した沈殿物を乾燥させ、精製ポリマーを得た。精製ポリマーをポリマー濃度が1質量％になるように生理食塩水に溶解し試料とした。なお、B型粘度計により測定される25℃における、脱塩水にポリマーを溶解して調製した0.2質量％粘度は98 mPa・sであった。このポリマーアジュバントの本明細書中での表記はHySとした。
　実施例2：ポリマーアジュバントの作製法（2）
　攪拌機および温度制御装置を備えた反応槽に、平均分子量300の流動パラフィン149.7 g、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート（HLB11）14.0 g、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（HLB11.7）14.0 gを仕込み均一にした。脱イオン水133.2 gおよび80質量％水溶液アクリル酸（AAC）95.9 gを添加した後、48質量％水酸化ナトリウム83.6 gを液温が30℃以上にならないよう冷却しながら加え中和した。
　これにより得られたアクリル酸ナトリウム水溶液を1000 rpmで60分間攪拌乳化した。得られた乳化液を52℃に保ち、窒素置換を30分行った後、ジメチル-2,2’-アゾビスイソブチレート0.25 ｇを加え、重合反応を開始させた。反応温度を52±2℃で５時間重合させ、更に70℃で反応を完結させた。
　重合後、生成した油中水型エマルジョンに転相剤としてアルコールアルコキシレート10.0 gを添加混合した。得られたエマルジョン40 gをアセトン200 mlに添加し、ポリアクリル酸ナトリウムを沈殿させた。沈殿物を回収し、アセトンに溶解した水、オイル、界面活性剤を除去した。この作業を2回繰り返した後、回収した沈殿物を乾燥させ、精製ポリマーを得た。精製ポリマーをポリマー濃度が1質量％になるように生理食塩水に溶解し試料とした。なお、B型粘度計により測定される25℃における、脱塩水にポリマーを溶解して調製した0.2質量％粘度は224 mPa・sであった。このポリマーアジュバントの本明細書中での表記はHyMとした。
　実施例3：ポリマーアジュバントの作製法（3）
　攪拌機および温度制御装置を備えた反応槽に、平均分子量300の流動パラフィン149.5 g、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート（HLB11）14.0 g、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（HLB11.7）14.0 gを仕込み均一にした。脱イオン水87.0 gおよび80％水溶液アクリル酸（AAC）119.7 gを添加した後、48％水酸化ナトリウム102.3 gを液温が30℃以上にならないよう冷却しながら加え中和した。
　これにより得られたアクリル酸ナトリウム水溶液を1000 rpmで60分間攪拌乳化した。得られた乳化液を52℃に保ち、窒素置換を30分行った後、ジメチル-2,2’-アゾビスイソブチレート0.25 gを加え、重合反応を開始させた。反応温度を52±2℃で5時間重合させ、更に70℃で反応を完結させた。
　重合後、生成した油中水型エマルジョンに転相剤としてアルコールアルコキシレート10.0 gを添加混合した。得られたエマルジョン40 gをアセトン200 mlに添加し、ポリアクリル酸ナトリウムを沈殿させた。沈殿物を回収し、アセトンに溶解した水、オイル、界面活性剤を除去した。この作業を2回繰り返した後、回収した沈殿物を乾燥させ、精製ポリマーを得た。精製ポリマーをポリマー濃度が1％になるように生理食塩水に溶解し試料とした。なお、B型粘度計により測定される25℃における、脱塩水にポリマーを溶解して調製した0.2質量％粘度は413 mPa・sであった。このポリマーアジュバントの本明細書中での表記はHyLとした。
　実施例４：ポリマーアジュバントの作製法（4）
　攪拌機および温度制御装置を備えた反応槽に、平均分子量300の流動パラフィン299.0 g、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート（HLB11）28.0 g、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（HLB11.7）28.0 gを仕込み均一にした。脱イオン水266.2 gおよび80％水溶液アクリル酸（AAC）191.5 gを添加した後、48％水酸化ナトリウム177.3 gを液温が30℃以上にならないよう冷却しながら加え中和した。
　これにより得られたアクリル酸ナトリウム水溶液を1000 rpmで60分間攪拌乳化した。得られた乳化液を52℃に保ち、窒素置換を30分行った後、ジメチル-2,2’-アゾビスイソブチレート0.50 gを加え、重合反応を開始させた。反応温度を52±2℃で5時間重合させ、更に70℃で反応を完結させた。
　重合後、生成した油中水型エマルジョンに転相剤としてアルコールアルコキシレート20.0 gを添加混合した。ポリマー濃度5％になるように脱塩水に希釈し、試料とした。なお、B型粘度計により測定される25℃における、脱塩水にポリマーを溶解して調製した0.2質量％粘度は292 mPa・sであった。このポリマーアジュバントの本明細書中での表記はEM-1とした。
　実施例5：ポリマーアジュバントの作製法（5）
　攪拌機および温度制御装置を備えた反応槽に、平均分子量300の流動パラフィン299.0 g、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート（HLB11）28.0 g、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（HLB11.7）28.0 gを仕込み均一にした。脱イオン水266.2 gおよび80％水溶液アクリル酸（AAC）191.5 gを添加した後、48％水酸化ナトリウム177.3 gを液温が30℃以上にならないよう冷却しながら加え中和した。
　これにより得られたアクリル酸ナトリウム水溶液を1000 rpmで60分間攪拌乳化した。得られた乳化液を52℃に保ち、窒素置換を30分行った後、ジメチル-2,2’-アゾビスイソブチレート0.50 gを加え、重合反応を開始させた。反応温度を52±2℃で5時間重合させ、更に70℃で反応を完結させた。
　重合後、生成した油中水型エマルジョンに転相剤としてアルコールアルコキシレート20.0 gを添加混合した。得られたエマルジョン40 gをアセトン200 mlに添加し、ポリアクリル酸ナトリウムを沈殿させた。沈殿物を回収し、アセトンに溶解した水、オイル、界面活性剤を除去した。この作業を2回繰り返した後、回収した沈殿物を乾燥させ、精製ポリマーを得た。精製ポリマーをポリマー濃度が5％になるように生理食塩水に溶解し試料とした。なお、B型粘度計により測定される25℃における、脱塩水にポリマーを溶解して調製した0.2質量％粘度は292 mPa・sであった。このポリマーアジュバントの本明細書中での表記は精製EM-1とした。
　上記の粘度の異なるポリマーアジュバントを用いて豚の病原体として代表的な豚丹毒菌の不活化ワクチンを作製し、マウスを用いて有効性を確認する試験を実施した。実施した試験系は、現行の豚用ワクチンの検定方法である非特許文献１を参照して試験を実施した。
　実験例1：ポリマーアジュバント加豚丹毒不活化ワクチンの有効性確認試験
　代表的なワクチン株である豚丹毒菌（多摩96株）の不活化菌液とポリマーアジュバントを含有する実験ワクチンを調製した。多摩96株豚丹毒菌を37℃で約18時間培養したものに、ホルマリンを0.2 vol％になるように加え、37℃で16時間以上感作して不活化したものを不活化菌液とした。不活化菌液0.2 mLを寒天平板に播種し、生育しないことにより不活化を確認した。不活化前生菌数は3.3×109 cfu/mLであった。不活化菌液とポリマーアジュバント(ポリマーの含有率5%(w/v))EM-1、精製EM-1をそれぞれ10:1量で混合し、分散した。陽性対照のアジュバントとしてCarbopol（登録商標）934（ポリマーの含有率5%(w/v)）を前記と同じ割合で不活化菌液と混合し分散した。陰性対照としてアジュバントを含有しない不活化菌液のみを用いた。4週齢のSPFマウス（雌）の内股部皮下に実験ワクチンを0.1 mLずつ免疫した。免疫3週後に、約103個の生きた豚丹毒菌藤沢株（強毒）をTPB培地1 mLに浮遊させて内股部皮下へ注射し攻撃した。攻撃の成立を確認するためにワクチン投与を行っていない攻撃対照群を設定した。各試験群でそれぞれ10匹ずつ攻撃した。攻撃後1週間観察し、生死数を記録した。攻撃後1週後のマウス生残数を表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ポリマーアジュバントEM-1、精製EM-1からなる本発明を加えて調製したワクチンを投与した2群ではアジュバントを加えない群(不活化菌液のみ)より、攻撃後、有意に生存数が高かった。得られた結果は、明らかに全てのポリマーアジュバントが豚丹毒抗原に対する免疫応答を高めることを示している。
　実験例2：ポリマーアジュバント加豚丹毒不活化ワクチン5倍希釈後の有効性確認試験
　実験例1で用いた実験ワクチンを、PBSで5倍に希釈したものを実験ワクチン2とした。4週齢のSPFマウス（雌）の内股部皮下に実験ワクチン2を0.1 mLずつ免疫した。免疫3週後に、約103個の生きた豚丹毒菌藤沢株（強毒）をTPB培地1 mLに浮遊させて内股部皮下へ注射し攻撃した。各試験群でそれぞれ10匹ずつ攻撃した。1週間観察し、生死数を記録した。攻撃後1週後のマウス生残数を表2に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明のポリマーアジュバントEM-1、EM-1(精製)を加えて調製したワクチンを投与した2群では本発明を加えない群(不活化菌液のみ)より、攻撃後、有意に生存数が高かった。また、Carbopol（登録商標）934をアジュバントとして含むワクチンを投与された群では、十分な免疫応答が得られなかった。従って、本発明は豚丹毒抗原に対する免疫応答を高めることを示し、架橋されたアクリル酸ポリマーであるCarbopol（登録商標）934より高い免疫惹起能を有するという予想以上の結果を得た。また、全てのマウスにおいて投与局所での反応は認められなかった。
　実験例3：希釈されたポリマーアジュバントを加えた豚丹毒不活化ワクチン有効性確認試験
　ポリマーアジュバント（ポリマーの含有率5%（w/v））（EM-1、精製EM-1）をPBSでそれぞれ5倍（ポリマーの含有率1%（w/v））、10倍（ポリマーの含有率0.5%（w/v））に希釈したものを調整した。Carbopol（登録商標）934（ポリマーの含有率5%(w/v)）は10倍（ポリマーの含有率0.5%(w/v)）に希釈したものを調整した。実験例1で用いた不活化菌液と希釈したポリマーアジュバントをそれぞれ10:1量で混合し、分散した。これらを実験ワクチン3とした。4週齢のSPFマウス（雌）の内股部皮下に実験ワクチン3を0.1 mLずつ免疫した。免疫3週後に、約103個の生きた豚丹毒菌藤沢株（強毒）をTPB培地1 mLに浮遊させて内股部皮下へ注射し攻撃した。各実験条件でそれぞれ10匹ずつ攻撃した。1週間観察し、生死数を記録した。攻撃後1週後のマウス生残数を表3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　この結果から、ポリマーアジュバントは5倍に希釈しても豚丹毒抗原に対する免疫応答を高めることを示している。また、全てのマウスにおいて投与局所での反応は認められなかった。
　Carbopol（登録商標）934は、粘度が高いため5倍の希釈濃度には調製できなかった。これに対し、本発明のEM-1及び精製EM-1は、粘度が低いために調製することができた。このように、本発明のアジュバントは従来のアジュバントよりも粘度が低いため、本発明のアジュバントの操作性は高い。
　実験例4：ポリマーアジュバントを加えた豚丹毒不活化ワクチン有効性確認試験
　次に、豚丹毒菌を37℃で14～20時間培養したものに、ホルマリンを0.2 vol%になるように加え、37℃で16時間以上感作して不活化したものを不活化菌液とした。不活化前生菌数は3.9×109cfu/mLであった。不活化菌液と0.2質量％粘度の異なるポリマーアジュバント（Carbopol（登録商標）934（780 mPa・s）、HyS（粘度98 mPa・s）、HyM（224 mPa・s）、HyL（413 mPa・s））（ポリマーの含有率1%）をそれぞれ9:1量で混合し、分散した。対照としてアジュバントを含有しない菌液のみを用いた。4週齢のSPFマウス（雌）の内股部皮下に実験ワクチンを0.1 mLずつ免疫した。免疫3週後に、約103個の生きた豚丹毒菌藤沢株（強毒）をTPB培地 1 mLに浮遊させて内股部皮下へ注射し攻撃した。各試験群でそれぞれ10匹ずつ攻撃した。1週間観察し、生死数を記録した。攻撃1週後のマウス生残数を表4に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ポリマーアジュバントを加えて調製したワクチンを投与したHyS、HyM、HyL群ではアジュバントを加えない群より、攻撃後、有意に生存数が高かった。この結果から、全てのポリマーアジュバントが豚丹毒抗原に対する免疫応答を高めることを示している。Carbopol（登録商標）934をアジュバントとして添加したワクチンでは、10匹中5匹しか生存せず、豚丹毒菌に対する免疫は不十分であった。ポリマーアジュバントHyS、HyMおよびHyLからなる本発明をアジュバントとして含むワクチンで免疫された群では、10匹中10匹生存し、Carbopol（登録商標）934による免疫より高い免疫応答を示す予想以上の結果を得た。また、全てのマウスにおいて投与局所での反応は認められなかった。
　次に、表4の実験で使用した実験ワクチンを、PBSで5倍に希釈したものを実験ワクチン5とした。4週齢のSPFマウス（雌）の内股部皮下に実験ワクチン5を0.1 mLずつ免疫した。免疫3週後に、約103個の生きた豚丹毒菌藤沢株（強毒）をTPB培地1 mLに浮遊させて内股部皮下へ注射し攻撃した。1週間観察し、生死数を記録した。（表5）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ポリマーアジュバント（HyS、HyMおよびHyL）を加えて調製したワクチンを投与した3群ではアジュバントを加えない群より、攻撃後、有意に生存数が高かった。また、Carbopol（登録商標）934をアジュバントとして添加した群ではアジュバント効果は認められなかった。しかしながら、ポリマーアジュバントHyS、HyMおよびHyLからなる本発明をアジュバントとして含むワクチンで免疫された群では、攻撃対照、Carbopol（登録商標）934および培養菌液のみの群と比べて有意に攻撃後の生存数が高かった。この結果から、ポリマーアジュバント、HyS、HyMおよびHyLが豚丹毒抗原に対する免疫応答を高めることを示し、架橋されたアクリル酸ポリマーであるCarbopol（登録商標）934より高い免疫応答を示す予想以上の結果を得た。また、全てのマウスにおいて投与局所での反応は認められなかった。

Claims (8)

  1. 　アクリル酸系ポリマーを含む、アジュバント。
  2. 　アクリル系ポリマーがポリアクリル酸又はその塩である、請求項1に記載のアジュバント。
  3. 　前記アクリル酸系ポリマーの重量平均分子量が100,000～15,000,000ダルトンである、請求項1又は2に記載のアジュバント。
  4. 　0.2質量％粘度が90 mP・s以上であり、そして780 mP・sより小さい、請求項1又は2に記載のアジュバント。
  5. 　請求項1～4のいずれか１項に記載のアジュバントと、免疫化のために投与すべき免疫原と、を含有するワクチン組成物。
  6. 　前記免疫原が、細菌、ウイルス又は原虫の由来である、請求項５に記載のワクチン組成物。
  7. 　前記免疫原が、黄色ブドウ球菌抗原、エロモナス菌抗原、結核菌抗原、豚丹毒菌抗原、アクチノバシラス・プルロニューモニエ抗原、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原、ボルデテラ・ブロンキセプチカ抗原、パスツレラ・ムルトシダ抗原、ヘモフィルス・パラスイス抗原、マイコプラズマ・ハイオライニス抗原、大腸菌抗原、サルモネラ・コレラスイス抗原、連鎖球菌抗原、インフルエンザウイルス抗原、SARSウイルス抗原、AIDSウイルス抗原、豚流行性下痢症ウイルス抗原、伝染性胃腸炎ウイルス抗原、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス抗原、日本脳炎ウイルス抗原、豚パルボウイルス抗原、豚サーコウイルス抗原、豚インフルエンザウイルス抗原、オーエスキー病ウイルス抗原、ApxI、ApxII、ApxIII、ApxIV、Stx、SpaA、SpaB、SpaC、パスツレラ・ムルトシダ毒素、トリパノソーマ抗原、コクシジウム抗原、マラリア抗原、タイレリア抗原から選択される、請求項6に記載のワクチン組成物。
  8. 　請求項5～7のいずれか1項に記載のワクチン組成物を非ヒト哺乳動物に投与する方法。
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