WO2016092086A1

WO2016092086A1 - System und verfahren für ein abdichtungsfreies temperieren von kapillaren

Info

Publication number: WO2016092086A1
Application number: PCT/EP2015/079459
Authority: WO
Inventors: Philipp Baaske; Stefan Duhr
Original assignee: Nanotemper Technologies Gmbh
Priority date: 2014-12-12
Filing date: 2015-12-11
Publication date: 2016-06-16
Also published as: AU2015359266A1; US20170361326A1; CN107041129B; US10618051B2; AU2015359266B2; JP2018507387A; JP6718594B2; EP3229966A1; CA2970566C; DE102014018535A1; CN107041129A; JP6895134B2; CA2970566A1; JP2020165959A

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Temperieren mehrerer Kapillaren (10), die auf einem Träger (6) angeordnet sind, wobei der Träger (6) mit einer Länge (L), Breite (B) und Höhe (H) die Kapillaren (1) entlang der Breite des Trägers (6) aufnimmt. Der Träger (6) hat eine Aussparung (61) um darin ein Temperierelement (5) aufzunehmen, sodass die Kapillaren (10) in ihrem mittigen Bereich durch Kontakt mit dem Temperierelement (5) temperiert werden können. Erfindungsgemäß sind die Enden (11, 12) der mit Proben gefüllten Kapillaren (10) während der Temperierung unverschlossen.

Description

System und Verfahren für ein abdichtungsfreies Temperieren von Kapillaren

Die Erfindung betrifft generell ein System und ein Verfahren zur Temperierung von Kapillaren, die mit zu untersuchenden Proben gefüllt sind. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Temperierung von Kapillaren für optische Messungen temperierter Proben in Abhängigkeit von der Temperatur. Vorzugsweise erfolgt die optische Messung im UV-Bereich basierend auf einem Fluorenzverhalten der zu messenden Proben. Zudem betrifft die Erfindung auch ein System, mit dem das erfindungsgemäße Verfahren einfach und effizient durchführbar ist. Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung liegt darin, dass zur Temperierung und optischen Messung der Proben innerhalb der Kapillaren auf eine Abdichtung der Kapillaren verzichtet werden kann.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

In der Biophysik, Biochemie, Biologie, Pharmazie, molekularen Diagnostik und der Analytik im Allgemeinen werden Proben häufig verschiedenen Temperaturen ausgesetzt, um sie anhand ihres Verhaltens bei verschiedenen Temperaturen zu charakterisieren.

Beispielsweise sind Schmelzkurvenanalysen, thermische Stabilitätsmessungen,„Thermal Shift Assays" (TFA) und Differential Scanning Fluorimetry (DSF) wichtige Werkzeuge, um die Stabilität und das Aggregationsverhalten von Proteinen und Wirkstoffformulierungen qualitativ und quantitativ zu erfassen.

Ein weiteres Beispiel ist die MicroScale Thermophoresis (Thermo-optical particle characterization), bei der beispielsweise Affinitäten (Kd, EC50) von Interaktionen bei verschiedenen Temperaturen gemessen werden, um aus den Messergebnissen beispielsweise anhand eines van't Hoff Plots die thermodynami sehen Größen dl i und dS abzuleiten.

In der Biophysik. Biochemie, Biologie, Pharmazie, molekularen Diagnostik und der

Analytik (z.B. Lebensmittelanalytik, Kosmetik,..) werden vor allem wässrige Lösungen wie Puffer, Lysate, Urin, Seren. Vollblut, usw., bzw. Flüssigkeiten im Allgemeinen eingesetzt. In diesem Bereich erstreckt sich der zu untersuchende Temperaturbereich beispielsweise von 0°C bis 100°C, bzw. auf den jeweiligen Bereich, in dem die jeweilige Flüssigkeit in ihrer flüssigen Form vorliegt.

Kapillaren als Probenbehältcr sind für diese Anwendungen sehr interessant, da sie ein sehr kleines und sehr gut definiertes Volumen aufweisen. Zudem lassen sich Kapillaren selbstständig durch Kapillarkräfte mit Flüssigkeiten befüllen, und man kann daher beispielsweise auf Pumpen verzichten. Darüber hinaus sind Kapillaren, beispielsweise aus Borosilikat 3.3. Quarz, Synthetic Fused Silica. usw., auch hinsichtlich ihrer optischen Eigenschaften, insbesondere ihrer Transparenz, Reinheit und Autofluoreszenz, vorteilhaft. Insbesondere sind kurze Kapillaren mit einem geringen Innen- und Außendurchmesser, beispielweise mit einem Außendurchmesser nicht größer als 1mm und einem Innendurchmesser von nicht größer als 0,8mm, vorzugsweise mit 0,65mm Außendurchmesser und 0,5mm Innendurchmesser, vorteilhaft, da sie nur ein kleines Volumen aufweisen und somit Probenmaterial sparen.

Um die beschriebenen Messmethoden, wie beispielsweise eine Schmelzkurvenanalyse durchzuführen, muss man die Kapillaren temperieren, beispielsweise von 10°C bis 100°C. Bei dieser Temperierung beobachtet man typischerweise ein starkes Verdampfen der Flüssigkeit bei erhöhten Temperaturen. Diese Verdampfung bzw. Verdunstung führt zu störenden Strömungen in der Flüssigkeit und insbesondere zu einem so starken Flüssigkeitsverlust, dass Messungen bei erhöhten Temperaturen über einen längeren Zeitraum nicht möglich sind.

Man kann diese Verdampfung zwar vermeiden bzw. reduzieren, indem man die Enden der Kapillaren beispielsweise mit Wachs abdichtet oder mit einer Flamme zuschweißt. Diese Abdichtverfahren haben aber massive Nachteile. Das Zuschweißen der Kapillaren bedingt, insbesondere bei Quarz (welches aufgrund seiner guten optischen Eigenschaften, insbesondere der geringen Autofluoreszenz, vorteilhaft für Messungen mit elektromagnetischer Strahlung im UV-Bereich ist), so hohe Temperaturen, dass die zu untersuchenden Moleküle beim Verschweißen verändert oder zerstört werden und damit nicht mehr untersucht werden können. Darüber hinaus hat fast kein Anwender die notwendigen Ausstattungen, um Flammen zu erzeugen, die heiß genug und definiert genug sind, um die Enden von Quarzkapiiiaren definiert und lokal zu verschweißen.

Das Abdichten der Kapillaren mit einem zusätzlichen Material, beispielsweise mit einem Wachs, birgt immer das Risiko die Flüssigkeit/Probe mit dem abdichtenden Material zu verunreinigen und somit die Messungen zu verfälschen. Desweiteren ist zu beobachten, dass Abdichtungen, wie beispielsweise Wachs, bei erhöhten Temperaturen durch den Dampfdruck in der Kapillare aus der Kapillare herausgedrückt werden können und somit ihre Funktionalität verlieren.

Es sind auch Systeme bekannt, bei denen Kapillaren in Form von Micro Cuvette Arrays (MCA) bereitgestellt werden. Diese Micro Cuvettes werden in einem Rahmen eingespannt, wobei dieser Rahmen die Cuvetten mittels Silikonstreifen an beiden Enden abdichtet. Um Kontaminationen zu vermeiden, müssen diese Silikonstreifen und/oder der Rahmen regelmäßig ausgetauscht werden, was zusätzliche Kosten verursacht. Da es insbesondere für Biomoleküle, beispielsweise Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, DNA, RNA. Antikörper aber auch Zellen, Bakterien, Nanodiscs, Vesikel, Viren usw. wünschenswert ist, mit sehr kleinen Volumina im Mikroliter-Maßstab zu arbeiten, sind kurze, sehr dünne Kapillaren von Vorteil. Darüber hinaus ist es von Vorteil, dünnwandige Kapillaren zu verwenden, da beispielsweise Autofluoreszenz und andere Artefakte durch diese Dünnwandigkeit minimiert werden können.

Dünne, dünnwandige Kapillaren, d.h., Kapillaren mit einem kleinen Durchmesser und einer dünnen Wandung haben allerdings den Nachteil, sehr zerbrechlich zu sein. Aus diesem Grund ist das zerstörungsfreie mechanische Abdichten der Kapillaren, beispielsweise durch einen Pfropfen oder eine Kappe, nicht oder nur mit erheblichem, und damit nicht mehr wirtschaftlichem Aufwand möglich.

Es besteht daher der Bedarf an einem einfachen oder verbesserten Verfahren mit dem optische Messungen bei höheren Temperaturen auch über einen längeren Zeitraum durchgeführt werden können.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Das erfindungsgemäße Verfahren sowie das erfmdungsgemäße System werden durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche definiert. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, mit dem sich Flüssigkeiten in einer Kapillare ohne Abdichtung der Kapillare temperieren und optisch untersuchen lassen. Vorzugweise werden mehrere Kapillaren ohne Abdichtung der Kapillaren gleichzeitig temperiert und gleichzeitig oder nacheinander optisch untersucht. Bevorzugte Vorteile des erfindungsgemäßen abdichtungsfreien Verfahrens können stichpunktartig wie folgt beschrieben werden. Das Risiko, dass eine Kapillare zerbrechen kann, ist deutlich reduziert, da üblicherweise das Risiko eines Zerbrechens beim Verschließen der Kapillare am größten bzw. groß ist. Zudem werden Arbeitsschritte zum Abdichten gespart, da nicht jede Kapillare an beiden Enden abgedichtet werden muss. Die erfindungsgemäße Lösung ist somit nicht nur schneller, sondern auch weniger kostenintensiv, d.h., günstiger, und eine Kontamination durch V e rsc h 1 u s sm at e r i a 1 kann zudem noch vermieden werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Temperieren mindestens einer, vorzugsweise mehrerer Kapillaren. Für eine einfachere Handhabung wird/werden die Kapillare/Kapillaren beispielsweise auf einem Träger angeordnet. Der Träger hat vorzugsweise eine Länge L, Breite B und Höhe H (siehe beispielsweise Fig. 3). Vorzugsweise sind die Kapillaren entlang der Breite des Trägers auf dem Träger angeordnet. Der Träger hat vorzugsweise eine Aussparung, in die beispielsweise ein Temperierelement einfügbar ist. Zudem ist es bevorzugt, dass die Kapillaren vom Träger nur außerhalb des Temperierelements gehalten werden, sodass die gesamte Breite des Temperierelements für Messungen zur Verfügung steht. Die Kapillaren sollen vorzugsweise in ihrem mittigen Bereich durch Kontakt mit dem Temperierelement temperiert werden, wobei die Enden der mit Proben gefüllten Kapillaren während der Temperierung unverschlossen sind. Vorzugsweise ist es zudem vorteilhaft, die Anordnung der Kapillaren in Bezug auf das Temperierelement auch in Hinblick auf die Füllmenge zu berücksichtigen. Das Temperierelement kann erfindungsgemäß erwärmt bzw. erhitzt und/oder abgekühlt werden, wobei der Bezugspunkt vorzugsweise die Umgebungstemperatur ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich der Temperaturbereich der Probe in der Kapillare beispielsweise von 0°C bis 100°C, bzw. auf den jeweiligen Bereich, in dem die jeweilige Flüssigkeit in ihrer flüssigen Form vorliegt. Mit anderen Worten, für den Fall, dass es sich bei der Probe um eine wässrige Lösung handelt und die Messung der Probe in der flüssigen Phase durchgeführt werden soll, dann ist es bevorzugt, die Probe in einem Bereich von 0°C bis 100°C zu temperieren. Falls es sich bei der Probenflüssigkeit um eine Flüssigkeit mit einem niedrigeren Schmelzpunkt handelt, beispielsweise eine Flüssigkeit die andere Lösungsmittel, beispielsweise organische Lösungsmittel, beispielweise Alkohole enthält oder im Wesentlichen vollständig aus diesen Substanzen besteht, dann kann die bevorzugte untere Grenze des Temperierbereichs auch tiefer, beispielsweise unter 0°C liegen. Beispielsweise kann der bevorzugte Temperaturbereich einer wässrigen Lösung die beispielweise Puffer, Salze, Detergenzien, Lipide, Tenside, Polymere, DMSO, Saccharose oder Glycerol enthält auch einen größeren oder kleineren Temperaturbereich als 0°C bis 100°C betragen. Beispielsweise kann bei wässrigen Lösungen mit hohem Gehalt an Salzen und/oder Detergenzien die bevorzugte untere Grenze des Temperierbereichs auch tiefer, beispielsweise unter 0°C, liegen. Beispielsweise kann bei wässrigen Lösungen mit hohem Gehalt an Salzen und/oder Detergenzien die bevorzugte obere Grenze des Temperierbereichs auch höher, beispielsweise über 100°C, liegen.

Beispielsweise können erfindungsgemäß auch unterkühlte Flüssigkeiten verwendet werden.

Zudem kann gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die untere Grenze des

Temperierbereichs für wässrige Flüssigkeiten unter 0°C liegen, bzw. unterhalb des Gefrierpunktes, wenn ein gefrieren der Flüssigkeit erwünscht ist. Da die Kapillaren erfindungsgemäß nicht abgedichtet bzw. nicht verschlossen sind, können auch Temperaturen unter 0°C verwendet werden, ohne dass die Kapillare aufgrund der Ausdehnung der wässrigen Lösung (Anomalie des Wassers) die Kapillare zum Platzen bringt. Im Gegensatz dazu könnte eine gefrorene wässrige Lösung in einer abgedichteten Kapillare die Kapillare aufgrund der Volumenvergrößerung sprengen. Bei den erfindungsgemäßen abdichtungsfreien Kapillaren stellt die Volumenvergrößerung jedoch kein Problem dar, da eine Ausdehnung der gefrorenen Flüssigkeit aufgrund der fehlenden Abdichtung möglich ist. Die erfmdungsgemäßen abdichtungsfreien Kapillaren überstehen auch wiederholte Einfrier- und Auftauvorgänge der wässrigen Lösung die beispielsweise durchgeführt werden, um zu überprüfen ob wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu einer Entfaltung und/oder Aggregierung von Biomolekülen in der wässrigen Lösung führt. Beispielsweise werden wässrigen Lösungen mit Biomolekülen bei - 20°C oder -80°C gelagert. Vor der Einlagerung liegen diese wässrigen Lösungen mit Biomolekülen in flüssiger Form vor, bei Einlagerung bei beispielweise -20°C oder -80°C gefrieren diese wässrigen Lösungen, zur Verwendung werden sie wieder aus der Gefriertruhe entnommen und aufgetaut, um sie wieder in flüssiger Form zu verwenden. Für die Denaturierung/Entfaltung und/oder Aggregierung der Biomoleküle in der wässrigen Lösung spielt beispielsweise nicht nur die absolute Temperatur des Einfrierens eine Rolle, sondern beispielsweise auch mit weicher Abkühlrate und Aufwärmrate das Einfrieren und Auftauen erfolgt und/oder wie oft dieser Vorgang durchgeführt/wiederholt wird.

Erfindungsgemäß wird die zu untersuchende Probe in eine Kapillare gefüllt, wobei die Kapillare meist nicht von Ende zu Ende mit der Flüssigkeit der Probe gefüllt wird. Der Teil der Kapillare, der mit der Flüssigkeit der Probe gefüllt ist wird im Folgenden als Flüssigkeitssäule bezeichnet. Vorzugsweise ist die Flüssigkeitssäule der Kapillare so zu dem Temperierelement auszurichten, dass die beiden Enden der Flüssigkeitssäule über das Temperierelement überstehen.

Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen röhrenförmigen Kapillaren eine Länge zwischen 40 - 75mm, vorzugsweise zwischen 45-55mm, weiter bevorzugt ca. 50mm.

Die Breite des Temperierelements beträgt vorzugsweise zwischen 5 - 34mm. weiter bevorzugt zwischen 20 - 0mm. weiter bevorzugt 20 - 25mm, weiter bevorzugt ca. 25mm. Als Temperierelement wird vorzugsweise Silizium, vorzugsweise reines Silizium verwendet.

Gemäß besonderer Ausführungsformen kann es vorteilhat sein, das Temperierelement entlang der Breite einstückig auszubilden, oder mehrere voneinander getrennte Temperierbereiche entlang der Breite auszugestalten, wobei diese mehreren Temperierbereiche sich gegenseitig kontaktieren können oder ein Zwischenraum dazwischen ausgebildet sein kann.

Um eine zuverlässige Temperierung der Kapillaren zu gewährleisten kann es zudem vorteilhaft sein, die Kapillare bzw. die Kapillaren mit Hilfe eines Deckels auf das Temperierelement zu drücken, um so den Kontakt zwischen Kapillare und Temperierelement sicherzustellen. Der Deckel kann teilweise über dem Temperierbereich angeordnet werden und/oder außerhalb des Temperierbereichs eine Kraft auf die Kapillaren ausüben.

Die einzelnen Kapillaren sind erfindungsgemäß mit einer Flüssigkeit gefüllt, vorzugsweise mit einer wässrigen Probenlösung, insbesondere Pufferlösungen für biochemische/biologische Messungen. Zusätzlich oder alternativ können auch nicht wässrige Lösungsmittel verwendet oder beigemischt werden, beispielsweise organische Lösungsmittel.

Probenlösungen können einen Analyt, vorzugsweise ein Protein, in einer geeigneten wässrigen Lösung, z.B. einer Pufferlösung, aber auch in einem organischen Lösungsmittel (z.B. Alkohole wie Ethanol, Oktanol, Isopropanol) oder in Wasser oder einem Gemisch aus Wasser mit einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln (wie Ethanol, Oktanol oder Isopropanol), enthalten.

Bei der erfindungsgemäßen Probenlösung bzw. Probenflüssigkeit die in die Kapillaren gefüllt wird, kann es sich auch um Öle, Emulsionen, Dispersionen oder andere Stoffe oder Gemische handeln, die in zumindest einem der bevorzugten Temperaturbereiche in flüssiger Phase vorliegen und sich in die Kapillare füllen lassen.

Die Länge der Flüssigkeitssäule in der Kapillare beträgt vorzugsweise mindestens das 1,1- fache der Breite des Temperierelements, vorzugsweise mindestens das 1 ,2-fache, vorzugsweise mindestens das 1,3 -fache, weiter bevorzugt mindestens das 1,35 -fache, weiter bevorzugt mindestens das 1,4-fache, weiter bevorzugt mindestens das 1,45-fache, weiter bevorzugt mindestens das 1.5 -fache, weiter bevorzugt mindestens das 1,6-fache, weiter bevorzugt mindestens das 1,7-fache der Breite des Temperierelements.

Die Kapillaren haben vorzugsweise einen Innendurchmesser von 0,02 bis 0,9 mm. Vorzugsweise haben die Kapillaren einen Außendurchmesser von 0,1 bis 2 mm.

Die Kapillaren können beispielsweise aus Glas, vorzugsweise aus Borosilikat 3.3. Quarz oder Synthetic Fused Silica hergestellt sein, ohne darauf beschränkt zu sein.

Wie bekannt sind Kapillaren im Allgemeinen Röhrchen mit sehr kleinen Innendurchmessern. Durch die im Vergleich zu größeren Rohren stark in den V ordergrund tretenden Oberflächeneffekte tritt in Kapillaren die Kapillarität auf. ein physikalischer Effekt. Flüssigkeiten mit hoher Oberflächenspannung steigen in Kapillaren auf.

Zudem sind die erlindungsgcniäßen Kapillaren nicht auf eine bestimmte Querschnittsform beschränkt. Die meisten Kapillaren werden rund ausgebildet. Erfindungsgemäß kann der Querschnitt einer Kapillare auch oval, dreieckig, viereckig, fünfeckig, sechseckig, achteckig, halbrund, oder trapezförmig sein, oder eine andere unregelmäßige Form aufweisen. Auch ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Kapillaren aus einem festen, vorzugsweise nicht deformierbaren Material wie beispielsweise Glas hergestellt sind und sich die Querschnittsform der Kapillaren für bzw. während einer Messung nicht ändert. Beispielsweise ist die Querschnittsform beim Befüllen gleich wie während der Messung. Ein Zusammenpressen des Querschnitts zum Messen wird vorzugsweise vermieden, beispielsweise auch weil der innere und äußere Durchmesser der Kapillaren auch Fluoreszenzmessungen, Absorptionsmessungen, Extinktionsmessungen oder Streulichtmessungen beeinflusst. Da die Kapillaren erfindungsgemäß auf zumindest einer Seite nicht verschlossen sind, kann eine Deforaiierung der Kapillaren auch zu einem Herausdrücken der zu untersuchen Probenflüssigkeit führen, was vorzugsweise vermieden werden soll.

Zudem betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur optischen Untersuchen von in Kapillaren gefüllten Proben. Zunächst werden die Kapillaren mit der Probe gefüllt. Dann werden die Kapillaren auf dem Temperierelement zum Temperieren positioniert. Vorzugsweise werden hierzu mehrere Kapillaren zunächst auf einem Träger angeordnet, und der Träger mit den mehreren Kapillaren wird dann auf dem Temperierelement positioniert. Anschließend können die Kapillaren wie oben beschrieben temperiert werden. Um die optische Messung schließlich durchzuführen, können die Proben beispielsweise mit Licht angeregt werden. Die Anregung mit Licht ist nicht auf eine bestimmte Wellenlänge des Lichts beschränkt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann beispielsweise eine Anregung mittels UV-Licht erfolgen. Anschließend wird das von der Probe ausgestrahlte Licht gemessen. Auch bei der Messung des ausgesendeten Lichts ist die vorliegende Erfindung nicht auf eine bestimmte Wellenlänge beschränkt.

Die vorliegende Erfindung betrifft neben dem erfmdungsgemäßen Verfahren auch ein System zur optischen Untersuchung von Proben in Kapillaren. Das erfindungsgemäße System umfasst vorzugsweise eine Temperiervorrichtung zum Temperieren der Kapillaren. Zudem kann es bevorzugt sein, einen Träger zum Halten der Kapillaren bereitzustellen. Zusätzlich oder alternativ kann das erfindungsgemäße System auch ein optisches Messsystem zum Aussenden von Licht und Detektieren von Licht aufweisen. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das System mindestens ei e Kapillare aufweisen. Vorzugsweise eine nicht deformierbare und vorzugsweise röhrenförmige Kapillare.

Unter dem Ausdruck "nicht deformierbar" ist insbesondere zu verstehen, dass der Querschnitt der Kapillare unter einem ausgeübten Druck im Wesentlichen gleich bleibt. Vorzugsweise ist der Ausdruck "nicht deformierbar" als„makroskopisch nicht deformierbar^"' zu verstehen. Insbesondere ist die Kapillare vorzugsweise hart. Zudem ist es bevorzugt, wenn während einer Messung kein Druck bzw. ein so geringer Druck auf die Kapillare ausgeübt wird, dass der Querschnitt der Kapillare sich im Wesentlichen nicht verändert.

Beispielsweise kann das erfindungsgemäße System auch dazu verwendet werden, Thermophorese-Effekte in Proben zu messen.

Die erfindungsgemäßen Verfahren und Systeme sind insbesondere geeignet für

Proteinfaltungs- und -entfaltungsexperimente und die Untersuchung der Stabilität von Biomolekülen wie Proteinen. Hierbei wird die Struktur des zu untersuchenden Biomoleküls, insbesondere Proteins oder Proteinkomplexes, durch Zugabe geeigneter Chemikalien, z.B. Chaotropen wie Harnstoff oder Guanidiniumhydrochlorid oder organischen Lösungsmitteln, oder durch Veränderung der Temperatur (d.h. z.B.„Schmelzen" durch Erhöhen der Temperatur), geändert. Die Sekundär- und Tertiärstruktur von Biomolekülen wie Proteinen und Nukleinsäuren ist oft auch abhängig von der Gegenwart von Liganden oder Cofaktoren wie Ionen (z.B. Mg²⁺ oder Ca²⁺). Dies kann etwa durch Messung der Fluoreszenz (vorzugsweise Typtophan-Fluoreszenz im Falle von Proteinen) bei verschieden Konzentrationen der Liganden und/oder Cofaktoren erfolgen.

Das Biomolekül, vorzugsweise Protein, kann chemisch oder thermisch denaturiert werden, und strukturelle Änderungen können durch intrinsische Fluoreszenz (vorzugsweise Typtophan- Fluoreszenz im Falle von Proteinen) gemessen werden. Dabei können z.B. Änderungen der Fluoreszenzintensität oder Verschiebung von Fluoreszenzmaxima usw. detektiert werden. Auch der Schmelzpunkt des zu untersuchenden Biomoleküls, z.B. Proteins, kann bestimmt werden. Der Schmelzpunkt ist der Zustand, in dem das zu untersuchende Biomolekül, z.B. Protein, zur Hälfte gefaltet und zur Hälfte ungefaltet vorliegt. Im Falle der Untersuchung von Proteinen kann beispielsweise die Tryptophan-Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 330 nm und/oder 350 nm gemessen werden. Dabei kann die Änderung der Intensität der Fluoreszenz z.B. in Abhängigkeit von der Temperatur oder der Zugabe eines Denaturants oder Cofaktors/Liganden bestimmt werden und/oder ein zeitlicher Verlauf aufgenommen werden. Der Quotient der Fluoreszenzintensität bei 330 nm zur Fluoreszenzintensität bei 350 nm (F330/F350) ist eine bevorzugte Messgröße. Beispielsweise kann der Schmelzpunkt aus dem Maximum der ersten Ableitung der F330/F350-Kurve bestimmt werden.

Auch das Aufschmelzen von Nukleinsäuren oder deren Komplexen kann mittels

Fluoreszenzmessung verfolgt werden. Neben Fluoreszenzmessungen kommt z.B. auch die Messung des Circulardichroismus (CD) in Frage.

Neben der thermischen, chemischen, enzymatischen oder zeitlichen Denaturierung von Biomolekülen, insbesondere von Proteinen wie beispielsweise Membranproteinen oder Antikörpern, kann auch das Aggregierungsverhalten der Biomoleküle gemessen werden. Die Messung des Aggregierungsverhaltens ist insbesondere aber nicht nur für die Zulassung von Medikamenten interessant. Diese Aggregierung kann beispielsweise mittels der Änderung der intrinsischen Fluoreszenz, beispielsweise der Änderung der Fluoreszenzintensität und/oder der Verschiebung des Fluoreszenzemissionsmaximums gemessen werden. Beispielsweise kann diese Aggregierung auch mittels Messung der Fluoreszenzanisotropie der Biomoleküle gemessen werden. Vorzugsweise erlaubt es die Messung der Fluoreszenzanisotropie auch, eine Größenänderung der Biomoleküle zu messen und so beispielsweise die Größe von entstehenden Aggregaten zu messen oder auch den Zerfall von Multimeren von Biomolekülen zu messen, beispielsweise den thermisch bedingten Zerfall eines Tetramers in seine vier Monomere.

Beispielsweise können die thermisch, chemisch, enzymatisch oder zeitlich induzierten Veränderungen in der Größe der Biomoleküle und damit auch deren Aggregierungen bzw. Multimerisierungen mittels Lichtstreuung gemessen werden.

Mögliche Anwendungen der erfindungsgemäßen Verfahren und Systeme sind etwa im Bereich des „Protein Engineering" (insbesondere „Antibody Engineering") oder bei der Untersuchung von Membranproteinen, in der Qualitätskontrolle oder bei der Entwicklung von Biologika in der pharmazeutischen Industrie zu finden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Im Folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter

Bezugnahme auf die Figuren beschrieben. Es zeigen:

ein Diagramm einer prozentualen Verdunstung bei einer 50mm Kapillare in Abhängigkeit von der Breite der Auflagefläche eines Temperierkörpers/Temperierelements; ähnlich wie Fig. 1 ein Diagramm einer prozentualen Verdunstung in Abhängigkeit von der Breite der Auflagefläche eines Temperierkörpers/Temperierelements, jedoch bei einer Kapillare mit 32mm Länge; eine Explosionsansicht einer Temper iervo rri c htung mit einem Träger zum Halten der Kapillaren; Fig. 4 eine schematische Draufsicht auf sechs verschiedene Kapillaren unterschiedlichen Füllungsgrads, die auf einem Temperierelement liegen;

Fig. 5 eine schematische Darstellung einer optischen Messung mit mehreren

Kapillaren auf einem Temperierelement und einer optischen Anregung bei 280nm mittels LED;

Fig. 6 ein Messdiagramm, das mit einer optischen Messung nach Fig. 5 erstellt wurde, wobei jeder Peak einer Kapillare entspricht;

Fig. 7 den Verlauf einer Schmelzkurve bei einem Emissionsfenster von 330 nm;

Fig. 8 den entsprechenden Verlauf der Schmelzkurve nach Fig. 7, jedoch bei einem Emissionsfester von 350nm;

Fig. 9 den Quotient der beiden optischen Detektionskanäle aus Fig. 7 und 8;

Fig. 10a- lOi Kapillaren unterschiedlicher Geometrien bzw. Querschnitte;

Fig. 1 1 A ein Beispiel für ein typisches Puffer-Screening aus der Antikörperforschung;

Fig. I I B ein Beispiel für eine Änderung der thermischen Stabilität eines Proteins durch Bindung von kleinen Molekülen;

Fig. 12-17 Illustrationen aus einem erfindungsgemäßen Anwendungsbeispiel; und Fig. 18 ähnlich wie Fig. 5 eine schematische Darstellung einer optischen Messung mit 48 Kapillaren auf einem Temperierkörper.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Erfindung betrifft generell ein System und ein Verfahren zur Temperierung einer Kapillare, vorzugsweise mehrerer Kapillaren gleichzeitig, die mit zu untersuchenden Proben gefüllt sind. Erfmdungsgemäß sind die Kapillaren aus Glas hergestellt. Vorzugsweise sind die Kapillaren aus einem Material mit einer ähnlichen, nicht viel geringeren und/oder nicht sehr viel/deutlich höheren Wärmeleitfähigkeit als die Flüssigkeit in den Kapillaren hergestellt. Glas ist auch aus diesem Grund bevorzugt, da es eine ähnliche Wärmeleitfähigkeit wie eine wässrige Lösung hat. Insbesondere ist es bevorzugt weil die Wärme erfmdungsgemäß mittels Glas auf die Lösung übertragen wird, d.h., ist die Wärmeleitfähigkeit des Kapillarmaterials zu gering, wird die Lösung in den Kapillaren nicht richtig und/oder nicht schnell genug temperiert. Ist die Wärmeleitfähigkeit zu hoch, wird die Wärme zu den Enden der Kapillare transportiert und führt dann wieder zu einer erhöhten Verdunstung. Rein beispielhaft wird nachfolgend die Wärmekapazität einiger Materialien aufgeführt: Polypropylen (PP) 0,23 W / (m*K); Wasser: 0,5562 W / (m*K); Glas: 0,76 W / (m*K); Quarz: 12 W/ (m*K) bis 1,4 W / (m*K); Stahl: 48 W/ (m*K) bis 58 W/ (m*K)

Abhängig von der Messung bzw. der Messdauer können erfindungsgemäß auch Materialen mit Wärmeleitfähigkeiten verwendet werden, die sich von Wasser deutlich unterscheiden. So ist es prinzipiell bevorzugt, ein Material für die Kapillaren zu verwenden das im Bereich von 0,15 W / (m*K) bis 60 W / (m *K) liegt. So fallen beispielsweise in den Bereich der unteren Grenze Werkstoffe wie PMMA / Plexiglas, Polypropylen, PEEK und Teflon. Ein weiterer bevorzugter Bereich für Glas als Material wird abhängig von verschiedenen Glassorten gebildet und erstreckt sich beispielsweise von ca. 0,5 W / (m*K) bis 1,6 W / (m*K).

Die Kapillaren können aus Glas und/oder einem Polymer und/oder zumindest einem der Elemente aus Borosilikatglas, Borosilikat-3.3- Glas (zum Beispiel Duranglas), Quarzglas wie Suprasil-, Infrasil-, synthetisch hergestelltes Quarzglas, Kalknatronglas, Bk-7-, ASTM Type 1 Klasse A Glas, ASTM Type 1 Klasse B Glas hergestellt sein. Die Polymere können enthalten: PTFE, PMMA, Zeonor™, Zeonex™, Teflon AF, PC, PE, PET, PPS, PVDF, PFA, FEP und/oder Acrylglas.

Insbesondere ist es bevorzugt, dass zumindest ein Bereich der Kapillaren für Licht der Wellenlänge von 200nm bis lOOOnm, vorzugsweise von 250nm bis 900nm transparent ist. Insbesondere bevorzugt, aber nicht darauf beschränkt, ist dieses mindestens eine Segment auch für Licht der folgenden Wellenlängenbereiche transparent: von 940nm bis 1040nm (vorzugsweise 980nm +/-10nm), von 1150nm bis 1210mn, von 1280nm bis 1600nm (vorzugsweise 1450nm +/-20nm und/oder 1480nm +/-20nm und/oder 1550nm +/-20nm), von 1900nm bis 2000nm (vorzugsweise 1930nm +/-20nm). Der Fachmann versteht, dass der/die transparente) n) Bereich(e) sich auch über die gesamte röhrenförmige Struktur erstrecken kann/können. Mit anderen Worten, die Kapillare kann transparent sein.

Die Lichtdurchlässigkeit des Segments erlaubt die Durchführung von Lumineszenz/Fluoreszenz/Phosphoreszenz-Messungen und/oder optischen

Untersuchungen/Messungen (beispielsweise Interferenz, Polarisation, Absorption, Dichroismus. Ellipsometrie, Anisotropie. Raman, Mikroskopie. Dunkelfeld, Lichtstreuung, FRET, MicroScalc Thermophoresis, thermo-optical particle characterization) und/oder Manipulationen der Lösung/der Flüssigkeit in der Kavität der Kapillare. Die Lichtdurchlässigkeit kami ferner die Durchf uhrung von Fluoreszenzmessungen erlauben. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ermöglicht sie ebenfalls die Erwärmung von Fluiden in der röhrenförmigen Struktur mittels elektromagnetischer Strahlung, beispielsweise Licht (vorzugsweise einem Infrarot(IR)-Laser), vorzugsweise die Erwärmung von Wasser und/oder organischen Lösungsmitteln.

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Kapillaren vorzugsweise mit einem Temperierelement in Kontakt gebracht, sodass durch diesen Kontakt ein Temperaturaustausch vom Temperierelement auf die Kapillaren und somit auf die Proben innerhalb der Kapillaren stattfindet. Vorzugsweise werden die Kapillaren in dem Bereich mittels Kontaktwärme temperiert, in dem auch die optische Messung stattfindet. Beispielweise kann in diesem Bereich der Wärmekontakt durch die Auftragung eines Öls, beispielsweise eines Immersionsöls verbessert werden. Die optische Messung ist vorzugsweise nicht auf einen bestimmten Wellenlängenbereich beschränkt, und kann beispielsweise im IR-, sichtbaren oder UV-Bereich stattfinden. Es ist zudem wünschenswert, dass das Temperaturelement selbst keine oder nur geringe Anteile an Fluoreszenz aussendet, die die Messung der Probe verfälschen könnten. Erfindungsgemäß wird als Kontaktmaterial für das Temperierelement, d.h., das Element, das mit der/den Kapillare(n) in Kontakt kommt und die Temperatur durch direkten Kontakt auf die Kapillaren überträgt, vorzugsweise Silizium verwendet.

Die Verwendung von Silizium hat eine Reihe von Vorteilen, wobei hier nur einige Vorteile exemplarisch aufgezählt werden. Zunächst hat Silizium keine oder nur eine extrem geringe Autofluoreszenz, insbesondere bei einem Anregungslicht im Bereich von 260nm bis 700nm. Bei einer typischen Messung von Tryptophan fl uoreszenz wird beispielsweise die Anregung bei 260nm bis 300nm durchgeführt und die Emission bei >320nm gemessen. Somit ist Silizium sehr gut für Fluoreszenzmessungen geeignet, insbesondere auch für Fluoreszenzmessungen im UV-Bereich (Tryptophan-, Tyrosin, Phenylalanin-Fluoreszenz). Der UV-Fluoreszenzbereich ist besonders vorteilhaft, da man so native Biomoleküle mittels ihrer intrinsischen Fluoreszenz messen kann, ohne sie z.B. mittels eines Farbstoffs, modifizieren zu müssen. Ohne die erfindungsgemäße Verwendung von Silizium war im Stand der Technik ein Luftspalt erforderlich, um Autofluoreszenzeffekte zu vermeiden. Das führt dazu, dass ausgerechnet der Bereich, den man optisch mittels Fluoreszenz messen will, nicht gut temperiert wird. Durch das nicht fluoreszierende Silizium kann man erfindungsgemäß den Messbereich in der Kapillare direkt heizen/kühlen (temperieren).

Zudem ist Silizium in hochreiner Form herstellbar und auch erwerbbar. sodass auch eine etwaige Autofluoreszenz von Verunreinigungen und damit eine Beeinflussung der Messergebnisse extrem gering sind. Silizium ist daneben auch ein chemisch inertes Material, sodass auch ein möglicher Kontakt mit einer Messflüssigkeit keine Reaktionen hervorruft, die die optische Messung negativ beeinflussen. Eine Kontaktfläche aus Silizium für ein Temperierelement kaiin sehr glatt hergestellt werden, sodass die Kontaktfläche mit den Kapillaren als Spiegelfläche hergestellt werden kann, wodurch das Anregungslicht und/oder Fluoreszenzlicht der Probe von der Spiegelfläche reflektiert werden kann, was zusätzlich zu einer Verstärkung des Messsignals fuhren kann. Die Spiegelfläche ist auch breitbandig, was zusätzlich vorteilhaft ist. Zudem besitzt Silizium eine sehr gute Wärmeleitfähigkeit und ist äußerst glatt. In das Silizium können auch beispielsweise elektronische

„Schaltungen/Strukturen" integriert werden, beispielsweise durch Dotierung und/oder Ätzen. Diese Strukturen können beispielsweise genutzt werden, um eine Temperatur bzw. Temperaturen zu messen.

Ein weiteres beispielhaftes Material für das Kontaktmaterial ist Metall, vorzugsweise eloxiertes Metall, vorzugsweise eloxiertes Aluminium. So gibt es ein beispielsweise eloxiertes Aluminium, beispielsweise in Schwarz, das im UV-Bereich keine Autofluoreszenz zeigt. Silizium hat gegenüber eloxiertem Aluminium beispielsweise den Vorteil der hohen Reinheit, da die Qualität des Eloxats häufig schwanken kann.

Das Temperierelement selbst wird vorzugsweise von einer Temperiervorrichtung temperiert. Mit anderen Worten, das Temperierelement dient vorzugsweise nur zur gezielten Temperatur- bzw. Wärmeübertragung auf die Kapillare(n). Die vorliegende Erfindung ist nicht auf bestimmte Temperiervorrichtungen beschränkt. Aufgrund der kompakten Bauweise und des geeigneten Temperaturbereichs bieten sich beispielsweise Peltierelemente an. Als Temperiervorrichtung können aber auch elektrische Heizelemente oder mit Flüssigkeit temperierbare Heizschlangen dienen.

Die zu temperierenden Kapillaren sind so anzuordnen, dass zumindest ein Teil der Kapillaren in Kontakt mit dem Temperierelement steht. Vorzugsweise soll nur ein zentraler Bereich, vorzugsweise ein mittiger Bereich einer jeden Kapillare mit dem Temperierelement in Kontakt stehen, d.h., es ist bevorzugt, dass mindestens ein Ende, weiter bevorzugt, beide Enden der Kapillare während der Temperierung nicht in Kontakt mit dem Temperierelement kommt/kommen. In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich mittiger Bereich bzw. die Mitte der Kapillaren auf die Länge der Kapillare, d.h., mittig zwischen den beiden Enden. Mit anderen Worten, es ist bevorzugt, dass ein Ende, vorzugsweise beide Enden nicht temperiert wird/werden.

Gemäß bevorzugten Ausführungsformen sollen die Kapillaren so gehalten werden, dass jede Kapillare nur innerhalb eines schmalen Temperierbereichs temperiert wird. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Kapillaren so angeordnet, dass beide Enden über das Temperierelement überstehen, vorzugsweise symmetrisch überstehen, wodurch die Enden der Kapillaren nicht durch das Temperierelement temperiert werden. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die einzelnen Kapillaren um den Betrag dx länger als der Temperierbereich.

Somit kann sichergestellt werden, dass die Kapillaren nur über einen bestimmten Teil ihrer Länge temperiert werden, was in Verbindung mit der geringen Wärmeleitfähigkeit von Glaskapillaren dazu führt, dass die Enden der Kapillaren praktisch immer auf Raumtemperatur bleiben, wenn nur ausreichend Abstand zum Temperierbereich bzw. zum Temperierelement vorhanden ist. D.h. selbst wenn die Mitte bzw. der mittige Bereich der Kapillare mittels des Temperierelements auf 90°C temperiert ist, beobachtet man an den Enden einer entsprechend langen Kapillare keine stärkere Verdampfung als bei Raumtemperatur. Dies bedeutet, dass man nicht abdichten muss, wenn die Verdampfung bei Raumtemperatur akzeptabel ist.

Bei 50mm langen Kapillaren gilt beispielsweise, dass der Temperierbereich vorzugsweise kleiner/kürzer als 32mm, weiter bevorzugt, kürzer als 25mm sein soll, d.h. nicht mehr als 25mm Länge der Kapillare sollen mittig temperiert sein. Anders ausgedrückt, auf beiden Seiten des Temperierbereichs sollen vorzugsweise 12,5mm nicht temperierte Kapillarlänge überstehen.

Als untere theoretische Grenze des Temperierbereichs ist 1mm zu nennen, wobei die Länge aus praktischen Gründen vorzugsweise nicht kleiner als 5mm ist. Die Beispiele der vorliegenden Erfindung werden mit einer Breite des Temperierbereichs von 25mm diskutiert, wobei diese Breite bevorzugt ist. Es hat sich jedoch gezeigt, dass auch ein 20mm breiter Temperierbereich gut funktioniert bzw. handhabbar ist. Ebenso ist auch ein Temperierbereich von 30mm noch gut handhabbar.

Die Beispiele der vorliegenden Erfindung werden mit einer Kapillarlänge von 50mm diskutiert, wobei diese Länge bevorzugt ist. Es hat sich jedoch gezeigt, dass auch 20mm, 25mm, 30mm, 35mm, 45mm lange Kapillaren aber auch gut funktionieren bzw. handhabbar sind. Ebenso sind auch Kapillarlängen von 55, 60, 65. 70, 75, und 80mm noch gut handhabbar.

Da man mit geringen Proben/Substanz-Konzentrationen arbeitet, ist die störende Autofluoreszenz des Materials der Temperierelemente aus dem Stand der Technik oft sehr viel größer als die Fluoreszenz der Probe selbst, d.h. die Messung ist unmöglich. Direkt auf reinem unbehandeltem Aluminium / bzw. mit Aluminium als Unterlage zu messen, ist nahezu unmöglich. Im Stand der Technik musste man daher unter dem Bereich, der gemessen wird, immer eine Aussparung/Messspalt/Luftspalt lassen. Diese Aussparung führte jedoch dazu, dass die Kapillaren gerade in diesem ausgesparten Messbereich eine andere Temperatur annehmen als in dem Bereich, in dem sie aufliegen und über den sie temperiert werden. Dieser Effekt aus dem Stand der Technik wird anhand der folgenden beiden Beispiele anschaulich. A) Die Raumtemperatur/Gerätetemperatur A_Jmgebungstemperatur wird als 25°C angenommen. Die Temperiervorrichtung wird auf 20°C gestellt. Der Bereich der Kapillare, der direkt auf der Temperiervorrichtung aufliegt, hat ca. 20 °C. Der Bereich der Kapillare, der über der Aussparung gemessen, wird hatte teilweise 22°C mit zusätzlichen inhomogenen Temperaturverteilungen.

B) Die Umgebungstemperatur wird wieder als 25°C angenommen. Die Temperiervorrichtung wird diesmal auf 90°C gestellt. Der Bereich der Kapillare, der direkt auf der Temperiervorrichtung aufliegt, hat ca. 90 °C. Der Bereich der Kapillare, der über der Aussparung gemessen wird, hat ca. 82°C + und eine inhomogene Temperatur (je nach Breite des Luftspalts).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden etliche Verdunstungsversuche mit Kapillaren mit verschiedenen Innendurchmessern und Außendurchmessern durchgeführt. Als Teststand wurde ein Temperierelement mit einer Breite von 25mm verwendet. Es wurden 50mm lange Kapillaren verwendet.

Für die Messungen wurden jeweils zwei Lösungen verwendet: MST Puffer mit Tween 20 (zur besseren Messbarkeit mit blauem Farbstoff versetzt) und MST Puffer ohne Tween 20 (zur besseren Messbarkeit mit grünem Farbstoff versetzt).

MST-Puffer (Kinase-Puffer) ohne Tween

- 50mM Tris-HCl

- 150mM NaCl

- 10 mM MgC12

- pH 7.8

Mit Tween:

+0,25% Tween20

Die Testkapillaren wurden wie folgt temperiert: Erhöhung der Temperatur von 20 °C bis 90 °C mit einer Heizrate von 1 °C/min und dann Verbleib für 30 Minuten bei 90 °C. Dies ist ein beispielhafter Verlauf für eine Schmelzkurvenmessung/Messung zur Untersuchung der thermischen Stabilität einer Kapillare.

Ergebnis Verdunstung in

[%] Verdunstung in [%]

Runde Kapillaren, Länge MST- Temperierung Kontrollgruppe bei

50mm Puffer 25mm breit Raumtemperatur

ID 0,5mm, AD 0,65mm m. Tween 9,78 10,67

Borosilikat 3.3 o. Tween 7,57 8,00 ID 0,5mm, AD 1 ,00mm m. Tween 9,90 1 1 ,33

Borosilikat 3.3 o.Tween 8, 12 7,67

ID 0,2mm, AD 1 ,00mm m. Tween 9,04 8,33

Borosilikat 3.3 o.Tween 8,55 8,00

ID 0,8mm, AD 1 ,00mm m. Tween 10,00 10,00

Borosilikat 3.3 o.Tween 6,91 8,00

ID 0, 100mm, AD 0,360mm

Synthetisches Quarz Glas m. Tween 7,34 6,86

Rechteckige Kapillaren,

Länge 50mm

ID 0,05mm x 0,5mm m. Tween 12,79 14,00

ID 0,02mm x 0,2mm m. Tween 13, 12 1 1 ,70

Die Tests wurden mit Kapillaren unterschiedlicher Innendurchmesser (ID) und Außendurchmesser (AD) durchgeführt. Bei runden Kapillaren im Bereich 0,1mm bis 0,8mm ID ist praktisch keine signifikante Abhängigkeit vom Innendurchmesser feststellbar.

Bei rechteckigen Kapillaren (sehr dümiwandig, deshalb keine Angabe des

Außendurchmessers, bzw. AD nicht bekannt) ist eine etwas höhere Verdunstung messbar die aber auch noch im Rahmen liegt, bzw. es ist hier so, dass bei den rechteckigen Kapillaren zwischen der temperierten Kapillare und der nicht temperierten Kapillare bei Raumtemperatur (= Kontrollgruppe) praktisch kein Unterschied messbar ist.

Um einen Kontakt zwischen den Kapillaren und dem Temperierelement sicherzustellen, ist es bevorzugt, die Kapillaren gegen das Temperierelement zu drücken. Dies kann beispielsweise mit einem Deckel erfolgen. Für den Deckel, der die Kapillaren niederhält und dadurch für eine gute Temperierung sorgt, gilt vorzugsweise das gleiche; er sollte auch nicht breiter als 25mm sein. Will man die Temperierfläche des Temperierelements breiter machen, braucht man längere Kapillaren, um ein übermäßiges Verdunsten an den Kapillarenden zu vermeiden bzw. zu verhindern. Längere Kapillaren können wiederum ungünstig sein, da damit ein größerer Probenverbrauch einher geht.

Die Temperierfläche sollte allerdings auch nicht zu schmal sein, da sonst die Kapillaren in ihrem zentralen Messbereich nicht mehr gleichmäßig temperiert sind. bzw. anders temperierte Moleküle von außen in den Messbereich hineindiffundieren.

Experimentell wurden daher obere und/oder untere Grenzen für vorteilhafte Breiten des ^'Temperierelements und/oder Längen vorteilhafter Kapillare, und insbesondere deren wechselseitige Abhängigkeit ermittelt.

Figur 1 zeigt ein Diagramm bei dem die Verdunstung in einer 50mm langen Kapillare mit einem Innendurchmesser von 0,5mm und einem Außendurchmesser von 0,65mm untersucht wurde. Das Diagramm zeigt die prozentuale Verdunstung (Y-Achse) in Abhängigkeit von der Breite des Temperierelements.

Für diese Untersuchungen wurden eine typische Pufferlösung ohne Detergenz (="MST") und die gleiche Pufferlösung mit Detergenz (="Tween") untersucht. Die Untersuchungen wurden mit und ohne Detergenz durchgeführt, da ein Detergenz das Verdunstungsverhalten beeinflussen kann. Dabei wurde die Kontrollgruppe nicht temperiert. Die Temperierung der anderen Gruppe entsprach einer typischen Schmelzkurve: d.h. eine Erhöhung der Temperatur von 20°C auf 90°C innerhalb von 70 Minuten mit einer anschließenden Verweildauer von 30 Minuten bei 90°C.

So ist beispielsweise erkennbar, dass bei einem 40mm breiten Temperierelement

(Temperierkörper) eine Verdunstung zwischen 25-30% stattfindet. Bei einer Breite von ca. 36mm ist die Verdunstung schon im Bereich zwischen 10-15%. Wenn die Breite 34mm oder weniger beträgt, dann ist die Verdunstung unterhalb von 10% und vergleichbar mit einer Verdunstung ohne Temperierelement. D.h., man sieht, dass ab einer Breite des Temperierbereichs von ca. 30mm die Proben der Kontrollgruppe ohne Temperierung und die temperierten Proben übereinstimmen (die Verdunstung ist minimal). Insbesondere ist eine Verdunstung <10% typischerweise akzeptabel, d.h., beträgt die Verdunstung <10%, kann vorzugsweise auf ein Abdichten verzichtet werden.

Basierend auf dieser Untersuchung ist eine bevorzugte Breite der Temperierfläche für 50mm lange Kapillaren kleiner als 30mm, vorzugsweise kleiner als 25mm, wodurch auch noch höhere Temperaturen wie z.B. 100°C möglich sind. Es ist für einen Fachmann erkennbar, dass die maximale Temperatur von der Flüssigkeit abhängt, insbesondere vom Siedepunt der Flüssigkeit bzw. des Lösungsmittels. Insbesondere ist auch die Bildung von Luftblasen bei Erreichen des Siedepunkts ggf. störend für die optischen Messungen. Daher liegt die obere Grenze für wässrige Lösungen vorzugsweise bei 100°C.

Figur 2 zei t ein Diagramm, bei dem die V erdunstung in einer nur 32mm langen Kapillare mit einem Innendurchmesser von 0,5mm und einem Außendurchmesser von 0.65mm untersucht wurde. Es wurden wiederum eine typische Pufferlösung ohne Detergenz (="MST") und die gleiche Pufferlösung mit Detergenz (="Tween") untersucht. Die Kontrollgruppe wurde nicht temperiert. Die Temperierung der anderen Gruppe entsprach einer typischen Schmelzkurve: d.h., eine Erhöhung der Temperatur von 20°C auf 90°C innerhalb von 70 Minuten mit einer anschließenden Verweildauer von 30 Minuten bei 90°C. Es ist sehr eindrücklich zu erkennen, dass es für eine kurze Kapillare der Länge 32mm praktisch nicht möglich ist, die Verdunstung ohne Abdichtung in den Griff zu bekommen. Selbst bei einer Breite des Temperierbereichs von 8mm tritt eine Verdunstung von mehr als 10% auf.

Figur 3 zeigt eine Explosionsansicht einer Vorrichtung zum erfindungsgemäßen Temperieren. Ganz unten sind Kühlkörper 1 zum Abführen von Abwärme angeordnet. Beispielsweise sind die Kühlkörper 1 auf einer beweglichen Einheit angeordnet. Für eine gute Wärmeleitfähigkeit ist vorzugsweise zumindest eine Wärmeleitfolie bzw. eine Wärmeleitpaste zwischen dem Kühlkörper 1 und dem Peltier Element 2 vorhanden. Oberhalb des Peltier- Elements 2 ist ein Heizblock 3 aus Metall (beispielsweise Aluminium oder Kupfer) angeordnet. Dazwischen kann sich wiederum vorzugsweise eine Wärmeleitfolie bzw. Wärmeleitpaste befinden. Oberhalb des Heizblocks 3 ist eine vorzugsweise dünne und schmale Siliziumscheibe 5 zum Temperieren der Kapillaren mittels Kontakt angeordnet. Zwischen dem Heizblock 3 und der Siliziumscheibe 5 ist vorzugsweise eine spezielle Wärmeleitfolie 4 angeordnet. Um die Siliziumscheibe 5 ist ein Kunststoffrahmen 6 (hier Makroion) zum Positionieren der Kapillaren (nicht gezeigt) angeordnet.

Schließlich wird ganz oben ein schmaler, dünner Deckel 7 mit Messspalt für optische

Messungen aufgesetzt. Dieser Deckel 7 soll vorzugsweise nicht breiter als die Siliziumscheibe 5 sein. Vorzugsweise drückt der Deckel 7 die Kapillaren auf die Siliziumscheibe 5. Zudem ist es vorteilhaft, wenn Deckel 7 thermisch isolierend wirkt.

Die Kapillaren sind mittig auf dem Kunststoffrahmen 6 zu positionieren (d.h. auf beiden Seiten stehen die Kapillaren ausreichend weit über, damit Verdampfung minimal ist). Beispielsweise zeigt Fig. 4 eine schematische Draufsicht auf sechs Kapillaren a) - f) mit unterschiedlichem Füllungsgrad bzw. unterschiedlicher Positionierung, die auf dem Kunststoffrahmen/Träger 6 liegen, um von einer darunterliegenden Siliziumscheibe 5 temperiert zu werden. Alle sechs Kapillaren in den Positionen a) - f) haben hier die gleiche oder im Wesentlichen gleiche Länge. Position a) zeigt die Kapillare mittig zentriert, d.h., in Bezug au die Mittelachse„M" des Rahmens 6 bzw. der Siliziumscheibe 5 zentriert. Die Kapillare ist annähernd vollständig gefüllt, d.h., die Kapillare steht symmetrisch nach rechts und links ausreichend mit Flüssigkeit gefüllt über den Rahmen 6 hinaus.

Position b) zeigt ebenfalls eine Kapillare die symmetrisch um die Mittelachse M angeordnet ist. Der Füllgrad dieser Kapillare ist geringer als in der Position a), jedoch immer noch ausreichend, dass eine Verdunstung an den Enden auch eine längere Messung nicht nachteilig stört.

Positions c) zeigt ähnlich wie die Positionen a) und b) eine symmetrisch gefüllte Kapillare, deren Füllgrad jedoch noch geringer ist als in Position b), sodass sowohl auf der linken als auch auf der rechten Seite nur eine kleiner Überstand„A" der Flüssigkeitssäule über den Rahmen 6 hinaus steht. Dieser kleine Überstand führt aber zu Verdunstungen an diesen Enden, die eine optische Messung im Bereich der Siliziumscheibe 5 negativ beeinflussen können. Entsprechend sind nur an den beiden Positionen a) und b) Haken gezeigt, d.h., diese Position und Füllgrad funktionieren ohne Probleme, wohingegen die Positionen c) - f) zu Problemen führen können. So ist der Füllgrad in der Position d) zwar ausreichend und vergleichbar mit der Position a), jedoch ist die Positionierung in Bezug auf die Siliziumscheibe 5 so, dass der Überstand auf der rechten Seite (B) nicht groß genug ist. In der Position e) ist die Kapillare zwar richtig angeordnet, d.h., symmetrisch in Bezug auf die Siliziumscheibe 5 bzw. die Mittelachse M, jedoch ist die Kapillare ungleichmäßig gefüllt. Der Abstand A auf der linken Seite vom Ende der Flüssigkeitssäule bis zum Rahmen bzw. bis zur temperierten Siliziumscheibe 5 ist ausreichend groß, wogegen der Abstand B auf der rechten Seite zu klein ist. Schließlich zeigt die Position f) zwar eine symmetrisch ausgerichtete Kapillare mit symmetrisch ausgerichteter Flüssigkeitssäule, jedoch mit einem zu geringen Füllgrad.

Im Folgenden wird beispielhaft eine optische Messung gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben.

Die zu messenden Proben werden in Kapillaren gefüllt. Dies kann beispielsweise durch die Kapillarkräfte erfolgen, oder die Kapillaren werden beispielsweise mit einer Pipette gefüllt, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Dann werden die Kapillaren auf einem Träger platziert. Anschließend wird der Träger mit den gefüllten Kapillaren auf das erfindungsgemäße Temperierelement gelegt. Vorzugsweise sind die Kapillaren zumindest in einem zentralen Bereich der Kapillaren über eine Länge, die breiter als die Breite des Temperierelements ist, gefüllt. Die Messung der Proben soll mittels Fluoreszenzmessung erfolgen. Hierzu wird die Probe zunächst mittels einer Anregungs-LED im UV-Bereich angeregt, beispielsweise bei 280 nm.

Zu Beginn der Messung wird eine Optik in Messposition gefahren. Mit I iilfe des Temperierelements werden die Proben temperiert. Vorzugsweise wird die Temperatur über eine eingestellte Rampe auf die Endtemperatur gefahren. Währenddessen werden die Proben ständig unter der Optik hindurchgefahren, wobei die Fluoreszenzwerte ausgelesen werden (siehe Fig. 5). In diesem Beispiel wird die Fluoreszenzemission bei 330 und 350nm gemessen. Man erhält somit Fluoreszenzwerte in zwei Wellenlängenbereichen gegen die Temperatur. Sobald die Endtemperatur erreicht ist, werden die Messdaten gespeichert, die Temperierung und Leuchtdiode ausgeschaltet und die Achsen wieder auf ihre Ruhepositionen verfahren. Nach Beenden einer Messung wird eine Datenbankdatei mit den gewonnenen Messdaten erstellt. Mit einer Konvertierungssoftware wird die Datenbank in eine CSV Datei („comma- separated-values") umgewandelt und anschließend in eine Analysesoftware eingelesen. Diese ist in der Lage, über eine Wendepunktanalyse die Schmelzpunkte automatisch zu berechnen. Durch die Bildung des Quotienten der beiden Fluoreszenz-Kanäle 330nm und 350nm entsteht eine sigmoidale Kurve (Fig. 9).

In Fig. 6 wurden insgesamt 15 Proben analysiert. Jede Farbe zeigt die zugehörige Fluoreszenzintensität zu einer bestimmten Temperatur an. Anhand der sehr großen Anzahl von Farben zeigt sich die große Anzahl von Messfahrten und somit auch hohe Temperaturauflösung, da jede Messfahrt eine Temperatur repräsentiert. Die oberste Spitze einer Messkurve stellt das Fluoreszenzsignal bei der Starttemperatur dar, und die unterste Kurve (hier hellblau) repräsentiert das Fluoreszenzsignal bei der Endtemperatur einer Messung. Sehr deutlich ist auch die geringe Autofluoreszenz des Siliziums (Basislinie) zu erkennen.

Es können auch die einzelnen Kurvenverläufe für die beiden Kanäle 330 nm (Fig. 7) und 350 nm (Fig. 8) angezeigt werden. Durch Bildung des Quotienten der beiden Kanäle 350nm/330nm erhält man eine sogenannte ,,Schmelzkurve"/"Denaturierungskurve" (Fig. 9). An den Wendepunkten der jeweiligen Messkurve liegt der Schmelzpunkt des untersuchten Proteins.

Schließlich zeigen die Figuren 10 a) bis 10 i) Beispiele für mögliche Querschnittsformen von Kapillaren. So zeigt Fig. 10 a) eine runde Kapillare mit der Wand 20 und dem Hohlraum bzw. der Kavität 21. Die Figuren 10 f) und 10 g) zeigen ebenfalls runde Ausführungsformen, jedoch mit unterschiedlichen Wandstärken und entsprechend unterschiedlichen Kavitäten bei gleichem Außendurchmesser. Fig. 10 b) zeigt eine halbrunde Ausführungsform; Fig. 10 c) eine sechseckige Ausführungsform; Fig. 10 d) eine viereckige Ausführungsform; Fig. lOe) eine ovale Ausführungsform; Fig. 10 h) ein Beispiel für eine Ausführungsform, bei der sich die Außenform von der Innenform unterscheidet, hier mit einer viereckigen Außenform und einer ovalen bzw. runden Innenform und Fig. 10 i) eine Kombination mit mehreren Kavitäten innerhalb einer äußeren Form.

Figur I I A zeigt ein Beispiel für ein typisches Puffer-Screening aus der Antikörperforschung. Durch die Entfaltung eines Proteins/Biomoleküls verschiebt sich das Emissionsmaximum der Fluoreszenz vom Spektralbereich 330nm +/-5nm zum Spektralbereich 350nm +/-5nm. Diese Verschiebung macht man deutlich, indem man das Verhältnis Fluoreszenz bei 350nm geteilt durch Fluoreszenz bei 330nm misst und aufzeichnet. Gezeigt ist hier die Änderung der Tryptophan-Emission (F350nm+/-5nm geteilt durch F330nm+/-5nm ) eines Antikörpers durch Entfaltung bei erhöhten Temperaturen. Die thermische Entfaltung tritt bei dem gezeigten Antikörper bei pH- Werten <pH 7 bei deutlieh niedrigeren Temperaturen auf, was auf eine Destabil isierun des Antikörpers unter sauren Bedingungen hindeutet.

Figur 11 B zeigt ein Beispiel für eine Änderung der thermischen Stabilität eines Proteins durch Bindung von kleinen Molekülen. Gezeigt ist die Änderung der Tryptophan-Emission (F350nm+/-5nm geteilt durch F330nm+/-5nm ) eines Proteins durch Entfaltung bei erhöhten Temperaturen nach Bindung unterschiedlicher Mengen eines niedermolekularen Liganden. Je mehr Ligand zugegeben wird, desto mehr Ligand bindet an das Protein und desto thermisch stabiler wird dieses Protein.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung sowie das erfindungsgemäße Verfahren umfassen vorzugsweise eines oder mehrere der folgenden Merkmale, insbesondere in nanoDSF Anwendungen (nano DSF applications). Insbesondere können damit ultra-high resolution Proteinstabilitätsmessungen durchgeführt werden.

Bevorzugte Merkmale

• Native DSF: kein Farbstoff erforderlich

· Dual-UV-System: 330-nm- und 350-nm - Fl uoreszenz wird detektiert

• Jeweils 48 Proben

• Ultrahohe Auflösung: 48 Kapillaren in 7 Sekunden messen und mehr

Entfaltungsübergänge beobachten

• Breiter Konzentrationsbereich: von 5 μg/ml bis 150 mg/ml

* Temperaturbereich: von 15 °C bis 100 °C

• Thermische und chemische Denaturierung

• Wartungsfreies Instrument und/oder

• Einfache Handhabung: einfache Probenaufbereitung und Software mit intuitiver Benut/ersc hn ittstelle

Die Vorrichtung, nachstehend Prometheus NT.48 genannt, kann 48 Kapillaren unterbringen. Vorzugsweise werden die Kapillaren mit der Probe durch Kapillarkraftwirkung befüllt, daher taucht man die Kapillaren einfach nur in die Probe ein und platziert sie im Instrument. Das Instrument ist vorzugsweise wartungsfrei und enthält keinerlei Schläuche, Ventile oder Pumpen. Da die Kapillaren vorzugsweise zum einmaligen Gebrauch bestimmt sind, ist keine Äquilibrierung oder Reinigung erforderlich.

Für thermische Entfaltungsexperimente ist keine Assay-Entwicklung oder mühsame Probenaufbereitung notwendig. Man taucht die Kapillaren zum Füllen einfach in die Proteinlösungen ein und belädt den Kapillarträger mit ihnen. Durchgeführt wird ein Ermittlungs- Scan mit hoher Geschwindigkeit zur Bestimmung optimaler Anregungs- und Detektionseinstellungen. Danach wird einfach die Temperaturrampe eingestellt und das Experiment gestartet.

Puffer- und Formulierungs-Screens lassen sich leicht durchführen, indem das Protein mit den interessierenden Lösungen gemischt wird. Verfügbar sind Kapillarfülleinrichtungen, um Kapillaren in Sekundenschnelle aus Mikrotiterplatten zu füllen.

Probenannotationen können bequem eingegeben werden, während das Experiment läuft. Für chemische Entfaltungsexperimente werden unterschiedliche Konzentrationen von Denaturant mit dem interessierenden Protein gemischt und zur Aquilibrierung inkubiert. Die Proben werden in Kapillaren gefüllt und dann durch den Prometheus NT.48 analysiert.

Beispielsweise dauert das Scannen einer chemischen Den aturi erun sre i he mit 48 Proben nur 7 Sekunden.

Bei der nanoDSF handelt es sich um ein fortgeschrittenes Verfahren zur Differenzial- Scann i ng- F 1 uorimet ri e. um die Proteinstabilität mit ultrahoher Auflösung mit Hilfe von intrinsischer Tryptophan 11 uoreszenz bei Anwendungen im Antikörper-Engineering, in der Membranproteinforschung, der Formulierungs- und Qualitätskontrolle zu messen.

Mit den Vorrichtungen der Erfindung steht die nanoDSi -Technologie zur Verfügung, die das Verfahren der Wahl für die leichte, schnelle und genaue Analyse der Proteinfaltung und -Stabilität bei Anwendungen im Protein-Engineering, in der Formulierungsentwicklung und Qualitätskontrolle ist.

Indem Änderungen der Fluoreszenz der Aminosäure Tryptophan verfolgt werden, lassen sich chemische und thermische Stabilität auf wirklich markerfreie Weise bewerten. Weiterhin ermöglicht eine bevorzugte Dual-UV-Technologie on-i/ze- / -Fluoreszenzdetektion, was für eine unübertroffene Scanning-Geschwindigkeit und Datenpunktdichte und damit für eine ultrahohe Auflösung von Entfaltungskurven sorgt, wodurch selbst kleinste Entfaltungssignale detektiert werden können.

Da zudem keine sekundären Reporterfluorophore erforderlich sind, können Proteinlösungen unabhängig von Pufferzusammensetzungen und über einen maximalen Proteinkonzentrationsbereich analysiert werden, vorzugsweise von 150 mg/ml bis nur 5 μg/ml, wodurch sich detergenssolubilisierte Mein branprot ei ne wie auch hochkonzentrierte Antikörperformulierungen analysieren lassen.

Weitverbreitete Verfahren zur Quantifizierung der Strukturstabilität eines Proteins sind thermische und chemische Entfaltungsexperimente. Während thermische Entfaltungsexperimente eine konstant steigende Temperatur verwenden, um Proteinkonformationsänderungen im zeitlichen Verlauf zu überwachen, verwenden chemische Entfaltungsexperimente Konzentrationsgradienten von Pufferadditiven. gewöhnlich Chaotropen, /.. B. Harnstoff, um Proteine in unterschiedlichen Graden zu entfalten.

Bei vielen Proteinen kommt es zu thermischer Entfaltung über einen engen

Temperaturbereich. Der Mittelpunkt des Übergangs von gefaltet zu entfaltet, als „Schmelztemperatur''' oder .. I m" bezeichnet, dient als Maß für die Proteinstabilität. Besonders populär sind thermische Entfaltungsexperimente im Protein-Engineering, in der Form u 1 i erungsentwic k 1 un und in Screening- Verfahren, da mit ihnen eine große Anzahl von Proben schnell parallel bewertet werden kann.

Ähnliche Entfaltungskurven lassen sich aus chemischen Denaturierungsexperimenten erhalten, die zusätzlich zu thermischen Entfaltungsexperimenten Informationen über thermodynamische Parameter und Gleichgewichte bei der Proteinfaltung und -entfaltung liefern können.

Die Fluoreszenz der Tryptophane in einem Protein hängt stark von ihrer nahen

Umgebung ab. Normalerw eise beeinflussen Änderungen der Proteinstruktur sowohl die Intensität als auch die Emissionswellenlänge der Tryptophanfluoreszenz. Die V rrichtung der Erfindung ist vorzugsweise mit Fluoreszenzdetektoren ausgestattet, die die Fluoreszenzintensität bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen, 330 nm und 350 nm, messen, wodurch sie sowohl gegenüber der Änderung der Fluoreszenzintensität als auch der Verschiebung des Fluoreszenzmaximums bei Entfaltung empfindlich ist.

Proteindenaturierungskurven kommen zum Einsatz, um wichtige Stabilitätsparameter abzuleiten. Normalerweise beschreibt man die thermische Stabilität eines vorgegebenen Proteins durch die Schmelztemperatur Tm, bei der die Hälfte der Proteinpopulalion entfaltet ist. Berechnen lässt sich Tm anhand der Änderungen der Tryptophanfluoreszenzmtensität oder anhand des Verhältnisses der Tryptophanemission bei 330 und 350 nm, das die Verschiebung der Tryptophanemission bei Entfaltung beschreibt. Typi seherweise ergibt der Quotient 350/330 nm Daten mit wohldefinierten Übergängen bei Proteinentfaltung, wogegen man mit der Einzelwellenlängendetektion Tm nicht immer ableiten kann. Somit sorgt das Dual- Wellenlängensystem der Vorrichtung für eine empfindliche Detektion von Entfaltungsprozessen.

Die Vorrichtung der Erfindung (z. B. Prometheus NT.48) kann in Labors zur Formulierungs- und Qualitätskontrolle zum Einsatz kommen. Durch den breiten Konzentrationsbereich können Biopharmaka mit sehr hohen Konzentrationen untersucht werden, die bei der Formulierung normalerweise verwendet werden. Besonders geeignet ist die von der Prometheus- Vorrichtung verwendete nanoDSF-Technologie für Anwendungen im Antikörper-Engineering, da die ultrahohe Auflösung ermöglicht, multiple Übergänge und Entfaltungsereignisse zu detektieren und zu analysieren. Ferner ist es mit nanoDSF möglich, die Stabilität von Membranproteinen in Detergenzien zu messen, da diese Methode wirklich markerfrei ist und keinen fluoreszierenden Farbstoff erfordert.

Zudem wird im Folgenden ein bevorzugtes Anwendungsbeispiel diskutiert.

Eine detaillierte Analyse der Proteinstabilität ist eine Voraussetzung sowohl für das grundsätzliche Verständnis von Proteinfaltungsmechanismen als auch für die erfolgreiche Entwicklung von Biologika in der pharmazeutischen Industrie. Nachstehend wird die Leistung des neuen Instruments Prometheus NT.48 demonstriert, das intrinsische Proteinfluoreszenzänderungen bei thermischer oder chemischer Entfaltung von bis zu 48 Proben parallel detektiert.

Einleitung

Die Abschätzung der Proteinstabilität ist ein integraler Bestandteil der

Grundlagenforschung, Wirkstoffforschung und Arzneimitteientwicklung [1]. Beispielsweise werden Verschiebungen der Schmelztemperatur ( I m) eines Zielproteins bei Bindung an einen n i ederm ol ek u 1 aren Ligand in Primär-Sereens im Wirkstoffforschungsprozess routinemäßig verwendet [2]. Zusätzlich wird oft die thermische und chemische Stabilität von Biologika, z. B. Antikörpern, überwacht, um optimale Bedingungen für die Großproduktion und .ang/.eitlagerung zu schaffen [3, 4]. Weiterhin kann die sorgfältige Analyse von Entfaltungs- und Rückfaltungsmechanismen von Proteinen wichtige Einsichten in die t h e rm o dy n am i s c h e n Ursprünge der Proteinfaltung liefern, was dazu beiträgt, die molekulare Basis solcher degenerativer Erkrankungen wie Alzheimer. Parkinson oder Diabetes aufzuklären.

Die Grundlage von markerfreier lluorimetrischer Analyse der Protein faltung liegt in den Eigenschaften der fluoreszierenden Aminosäure Tryptophan. Da Tryptophan eine hydrophobe Aminosäure ist. liegt es meist im hydrophoben Kern von Proteinen vor, wo es gegenüber dem umgebenden wässrigen Lösungsmittel abgeschirmt ist. Nach Entfaltung liegt Tryptophan aber frei, was seine p hot op hy s i k a 1 i s c h e n Eigenschaften ändert [6]. Durch Detektieren v on Änderungen der Fluoreszenzintensität von Tryptophan und ihrer Verschiebung des Emissionspeaks kann der Übergang eines Proteins vom gefalteten in den ungefalteten Zustand präzise rekapituliert werden. Auf diese Weise lassen sich die Schmelztemperatur (Tm) und t h e rm ody n am i s ch e Eigenschaften bestimmen [7]. Nachstehend wird die Leistung des Prometheus NT.48 bei der Überwachung der thermischen Entfaltung von Proteinen in einem Formulierungs-Screeningprojekt demonstriert. Das Instrument Prometheus NT.48 kann bis zu 48 Proben parallel messen und verwendet Hochpräzisionskapillaren, die mit nur 10 μΐ Probe gefüllt sind. Mit Hilfe eines Detektors, der speziell gestaltet ist, Änderungen des Emissionsspektrums von Tryptophan mit maximaler Empfindlichkeit und Geschwindigkeit zu überwachen, wird eine höchste Datenpunktdichte und Präzision erreicht. Proteine der α-Amylasefamilie haben sich zur Analyse der Proteinfaltung bewährt [8]. Den meisten Amy lasen sind sehr ähnliche tertiäre Strukturen mit drei (ß/a)-Barrel-Domänen und mindestens einer konservierten Ca^" - Bindungsstelle gemeinsam (Fig. 12). Fig. 12 zeigt die Struktur von α-Amylase aus Schweinepankreas ( PA, grün ) und α-Amylase aus Aspergillus oryzae (TAKA, blau). Die rote Kugel stellt ein Ca -Ion dar.

Gleichzeitig zeigen sie aber einen extrem breiten Bereich von Schmelztemperaturen (von 40 °C bis 1 10 °C), was sie zu perfekten Kandidaten für die Grundlagenforschung an den Determinanten der thermischen Stabilität von Proteinen werden lässt [9]. Neben ihrem Wert für die medizinische Grundlagenforschung kommen Ann lasen kommerziell bei der Herstellung von Ethanol in Zuckern in der Großproduktion zum Einsatz.

Im vorliegenden Beispiel wurde die thermische Entfaltung von α-Amylase aus Säugetieren (α-Amylase aus Schweinepankreas, PPA) und Pilzen (ct-Amylase aus Aspergillus oryzae, TAKA) untersucht. Rekapituliert wurden die Stabilisierungseffekte von Calciumionen auf die Proteinkonformation, und abschließend wurden Formulierungs- Screens mit unterschiedlichen Additiven durchgeführt, die die thermische Stabilität in unterschiedlichen Graden verbessern.

Das Instrument Prometheus T.48 überwacht die Verschiebung der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz von Proteinen bei Entfaltung durch Detektieren der Fluoreszenz bei einer Emissionswellenlänge von 330 und 350 nm. Zur Bestimmung des Proteinschmelzpunkts (Tin, bei dem die Hälfte des Proteins gefaltet und die andere Hälfte entfaltet ist) kann die Flu o re s/.e n /. n d er u n g in einem der beiden Kan le verwendet werden, oder alternativ kann das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten (F330/F350-Quotient) aufgetragen werden.

Für die meisten Proteine ist der letztgenannte Weg bevorzugt, da der Fluoreszenzquotient beides überwacht, die Änderung der Tryptophanfluoreszenzintensität wie auch eine Verschiebung des Emissionsmaximums der Fluoreszenz zu höheren Wellenlängen („Rotverschiebung") oder niedrigeren Wellenlängen („Blauverschiebung"). Die thermische Entfaltung von PPA und TAKA wurde mit einer Aufheizgeschwindigkeit von 1 °C/Minute durchgeführt, was eine Datenpunktdichte von 10 Punkten/°C ergab, die eine genaue Bestimmung des Beginns der Proteinentfaltung sowie eine genaue Anpassung des Übergangs von gefaltet zu entfaltet durch mathematische Modelle ermöglicht.

Fig. 13 zeigt die Änderungen der Tryptophanfluoreszenz von PPA und TAKA bei thermischer Entfaltung. Besonders für TAKA zeigen die Fluoreszenzrohdaten von beiden Wellenlängen einen klaren Übergang von gefaltet zu entfaltet (Fig. 13A, links), der direkt zur Tm-Analyse verwendet werden könnte. Dagegen ist dieser Übergang anhand der Rohdaten für PPA nicht evident (Fig. 13B, links). Während außerdem TAKA ein typisches Entfaltungsprofil mit einer Verschiebung der Tryptophanfluoreszenz zu höheren Wellenlängen (Rotverschiebung) zeigte, wies PPA eine weniger verbreitete Verschiebung der Tryptophanfluoreszenz zu niedrigeren Wellenlängen auf (Blauverschiebung).

Trug man den Fluoreszenzquotient F330/F350 beider Proteine als Funktion er Temperatur auf, ergaben sich klare Schmelzkurven, die zum Analysieren der jeweiligen Schmelztemperatur der Amylase-Isoformen verwendet werden konnten. Die Bestimmung der Schmelztemperatur kann mit unterschiedlichen Verfahren erfolgen: Für die Mediananalyse werden zunächst eine untere und eine obere Basislinie definiert, und eine Medianlinie wird eingefügt. Der Kreuzungspunkt zwischen experimenteller Kurve und der Medianlinie wird als Tm definiert (Fig. 13A und B, Mitte). Ein alternativer Weg ist, das Maximum der ersten Ableitung des Absorbanzsignals zu bestimmen. Mit diesem Verfahren umgeht man die etwas subjektive Bestimmung der Basislinienwerte (Fig. 13A und B, rechts), und es ermöglicht zudem die Bestimmung mehrerer Schmelzpunkte, z. B. zur Antikörperentfaltung oder für komplexere Multi -Domänen-Proteine.

Als Wichtigstes liegt die Standardabweichung der Ergebnisse in der Tabelle in Fig.

14B aus der Analyse der ersten Ableitung im Bereich des Anpassungsfehlers, was die maximale Reproduzierbarkeit der Ergebnisse demonstriert. Somit lässt sich das Instrument Prometheus NT.48 einsetzen, Tm- Werte mit einem Minimum an Proben- und Zeitaufwand genau zu bestimmen.

Aus den Ergebnissen geht hervor, dass sowohl Reproduzierbarkeit als auch

Genauigkeit der thermischen Entfaltungsexperimente mit PPA und TAKA sehr hoch waren ( Fig. 14 A und B). Die erhaltenen Tm- Werte glichen stark den in der Literatur zitierten Werten [9].

Ca -Abhängigkeit der thermischen Amy lasestabil hat In einem zweiten Satz von Experimenten wurde darauf abgezielt, die Stabilisierungseffekte von Ca² -Ionen auf beide α-Amylase-Isoformen zu rekapitulieren. Es wurde bereits nachgewiesen, dass CV ^'-Ionen für erhöhte Tm-Werte unterschiedlicher Amylase-Isoformen im Bereich von praktisch keinerlei Effekt für Amylase aus Alteromonas bis zu einer Tm-Zunahme um 50 °C für Amylase aus Bacillus Licheniformis erforderlich sind [9].

Zur Untersuchung der Wirkungen von Ca -Ionen auf die PPA- und TAKA- Stabilität wurden beide Proteine in Puffer mit 5 mM ED TA inkubiert, um gebundenes Ca 30 Minuten vor thermischen Entfaltungsexperimenten zu entfernen. Erwartungsgemäß führte die Entfernung von Ca²⁺-Ionen durch EDTA zu einem deutlichen Tm-Anstieg für beide Amylase-Isoformen (Fig. 15). Für PPA war ATm ausgeprägter (-16.6 °C) als für TAKA (-12 °C) was mit früher veröffentlichten Ergebnissen (PPA -17 °C, TAKA -14 °C) [10, 1 1] gut korreliert.

Effekte von Pufferadditiven auf die thermische Amylasestabilität

Ein Screening nach Additiven und Pufferbedingungen, die die Proteinstabilität verbessern, auch Formulierungs-Screening genannt, ist von zentraler Bedeutung für eine maximale Lagerfähigkeit von Antikörpern und anderen Biologika. Mit Hilfe des Prometheus NT.48 wurden die Auswirkungen unterschiedlicher Pufferadditive getestet, für die bereits gezeigt wurde, dass sie die Proteinstabilität erhöhen, d. Ii., Glycerol, Sucrose, Trehalose und Sorbitol mit Konzentrationen im Bereich von 10 % bis 40 % (Gewicht pro Volumen) an PPA und TAKA.

Der Formulierungs-Screen von 16 unterschiedlichen Pufferbedingungen für jede Amylase-Isoform wurde in einem einzigen Durchlauf mit einem Temperaturbereich von 20 °C bis 90 °C und einer Aufheizgeschwindigkeit von 1 °C/min durchgeführt. Messungen erfolgten innerhalb von etwa 70 Minuten mit einem Gesamtprobenverbrauch von 400 μΐ (10 μΐ für jede Pufferbedingung plus 4 Kontrollexperimente für jede Isoform ohne Additiv) und einer Gesamtproteinmenge von gerade 80 Lig.

Die Plots der Tryptophanfluoreszenzquotienten zeigen deutlich, dass jedes Additiv den Tm von PPA und TAKA konzentrations abhängig erhöhte. Für PPA war Trehalose bereits bei Konzentrationen von 30 % am effektivsten (+12 °C), während Glycerol am ineffektivsten war und den Tm bei einer Konzentration von 40 % um nur 7,5 °C erhöhte (Fig. 16A und B). Für TAKA erwies sich die Zugabe von 40 % Sucrose bei der Tm- Erhöhung am wirksamsten (+12 °C), während Glycerol und Trehalose den kleinsten Effekt zeigten (+7,5 °C bzw. +8 °C) (Fig. 17A und B). Diese Ergebnisse stimmen gut mit einer früheren Studie überein. die den Effekt von Additiven auf die thermische Entfaltung von

Bacillus-cc-Amylase untersuchte [12].

Schlussfolgerungen

In dieser Fallstudie wurde die Leistung des Instruments Prometheus NT.48 bei der Bestimmung thermischer Entfaltungseigenschaften zweier a-Amylase-ls ormen in Screening- Anwendungen demonstriert.

Durch Detektieren von Änderungen der Tryptophanfluoreszenz bei zwei definierten Wellenlängen konnten Tm- Werte der Amylaseproteine unter unterschiedlichen Bedingungen bestimmt werden. Alle Ergebnisse zeigen eine gute Übereinstimmung mit veröffentlichten Werten. Verglichen mit Verfahren, die Standard-Fluorimeter verwenden, ist aber am wichtigsten, dass sowohl Probenverbrauch als auch Zeitaufwand zur Durchführung der Experimente mit Hilfe des Prometheus NT.48 dramatisch reduziert sind.

Das Kapillarformat des Instruments ermöglicht eine flexible Gestaltung von Experimenten, wobei jede Anzahl von Proben zwischen 1 und 48 gleichzeitig gemessen wird. Wichtig ist, das der Gebrauch von Prometheus-Kapillaren eine noch höhere Präzision der UV- Fluoreszenzdetektion als Hochleistungs-Quarzküvetten bietet, wozu die Vorteile von niedrigem Probenverbrauch, hohem Durchsatz und großer Vielseitigkeit kommen. Zudem verhindert das auf Kapillaren basierende Vorgehen Kreuzkontamination, und es sind keine mühsamen und zeitraubenden Reinigungsschritte erforderlich. Weiterhin ermöglichen hohe Scanning- Geschwindigkeiten und damit eine hohe Datendichte eine robuste Analyse von Schmelzkurven durch mathematische Anpassungsalgorithmen und ermöglichen ferner eine präzise Bestimmung einsetzender Entfaltungen.

Zusätzlich hat die direkte Detektion von Tr ptophanfluoreszenz zur Überwachung der Proteinentfaltung mehrere Nutzeffekte im Vergleich mit anderen Verfahren, die routinemäßig zum Einsatz kommen, um thermische Entfaltung zu überwachen, z. B. D i ITe enzi al - Scanning- Fluorimetrie (DSF) oder Thermofluor- Assays. Diese Assays verwenden externe Fluorophore, die sich an hydrophobe Stellen des Proteins binden, die gewöhnlich im Kern des Proteins vergraben sind. Bei Entfaltung werden diese Stellen freigelegt, und der Fluorophor lagert sich an, was zu steigender Fluoreszenz führt. Allerdings sind diese Assays nicht für eine detaillierte Analyse der Faltungsthermodynamik geeignet, da sie die Faltungs-Entfaltungs-Gleichgewichte durch direkte Wechselwirkung mit den Proteinen stören. Außerdem sind die externen Fluorophore mit einer Anzahl von Puffern (darunter z. B. Detergenzien) oder Proteintypen, z. B. Membranproteinen, inkompatibel. Und schließlich können, obwohl die DSF routinemäßig in Primär-Screenings im Wirkstoffforschungsprozess zur Anwendung kommt, externe Fluorophore mit Verbindungen interagieren oder Bindungsstellen blockieren und falsch negative sowie falsch positive Ergebnisse hervorbringen.

Neben seinen Fähigkeiten bei der parallelen Überwachung der thermischen Entfaltung einer großen Anzahl von Proben kann das Instrument Prometheus NT.48 auch dazu dienen, chemische Denaturierung von Proteinen sekundenschnell zu analysieren. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass das Instrument Prometheus NT.48 außerordentlich gut für eine schnelle, präzise und kostengünstige Charakterisierung der Proteinstabilität sowohl im akademischen als auch im industriellen Umfeld geeignet ist. Durch seine Flexibilität und Geschwindigkeit wird es zu einem wertvollen Werkzeug für eine Fülle unterschiedlicher experimenteller Verfahren, die von gründlicher Charakterisierung der Proteinfaltung bis zu Screening-Projekten mit hohem Durchsatz reichen.

Materialien und Verfahren

Probenaufbereitung

α-Amylase vom Schwein (α-Amylase aus Schweinepankreas, PPA, Roche) und a- Ann läse aus Aspergillus oryzae (TAKA, Sigma) wurden in 30 mM Hepes, 50 mM NaCl, 2 mM CaCli, pH 7,4 mit Konzentrationen von 10 mg/ml gelöst. Endkonzentrationen in thermischen Entfaltungsexperimenten betrugen 10 μΜ. Zur Entfernung von Restspuren von Ammoniumsulfat oder anderen Kontaminanten wurde ein Pufferaustausch mit Hilfe von Pufferaustausch-Schleuderkolonnen (NanoTemper Technologies) durchgeführt. Zur Bestimmung der Ca²⁺-Abhängigkeit der α-Amylasestabilität erfolgte ein zweiter Pufferaustausch zu Puffer ohne CaCF, aber mit 5 mM EDTA.

Für den Formulierungs-Screen wurden die Proteine in 20 mM Na-Citrat-Puffer. pH 5,9 mit den jeweiligen Konzentrationen von Sucrose. Sorbitol. Trehalose oder Glycerol überführt.

Thermische Entfaltungsexperimente

Für thermische Entfaltungsexperimente wurden die Proteine auf eine Endkonzentration von 10 μΜ verdünnt. Für jede Bedingung wurden 10 μΐ Probe pro Kapillare vorbereitet. Die Proben wurden in UV-Kapillaren (NanoTemper Technologies) aufgegeben, und Experimente wurden mit Hilfe des Prometheus NT.48 durchgeführt. Der Temperaturgradient war auf einen Anstieg von 1 °C/min in einem Bereich von 20 °C bis 90 °C eingestellt. Die Proteinentfaltung wurde durch Detektieren der temperaturabhängigen Änderung der Tryptophanfluoreszenz bei Emissionswellenlängen von 330 und 350 nm gemessen.

Datenanalyse Schmelztemperaturen wurden durch Delektieren des Maximums der ersten Ableitung der Fluoreszenzquotienten (F330/F350) bestimmt. Dafür wurde eine polynome Anpassung 8. Ordnung für die Übergangsregion berechnet. Als Nächstes wurde die erste Ableitung der Anpassung gebildet, und die Peakposition (bei Tm) wurde bestimmt.

Fig. 13: Analyse von TA A- und PPA-Schmelzkurven. (A) Plot des Abklingens der

Tryptophan fl uores/enz bei thermischer Entfaltung von TAKA (links). Der Übergang vom gefalteten zum entfalteten Zustand ist bereits in den Fluoreszenzrohdaten bei Emissionswellenlängen von 330 und 350 nm sichtbar. Das Nebenbild demonstriert die hohe Datenpunktdichte des Prometheus NT.48. Um Tm zu bestimmen, können zwei Verfahren angewendet werden. Bei der Mediananalyse (Mitte) wird eine Medianlinie zwischen einer oberen und unteren Basislinie definiert. Ihr Querschnitt mit den experimentellen Daten repräsentiert Tm. Alternativ können die experimentellen Daten mit einer Polynomfunktion angepasst werden. Deren erste Ableitung zeigt einen Peak am Punkt der maximalen Steilheit, der Tm entspricht (rechts). (B) Äquivalente Analyse von Tm für PPA. Zu beachten ist, dass im Gegensatz zu TAKA der Übergang vom gefalteten zum entfalteten Protein nicht in den Fluoreszenzroh daten (links) sichtbar ist, während sich Tm anhand der Auftragungen der Fluoreszenzquotienten (rechts) problemlos bestimmen lässt.

Fig. 14: Genauigkeit und Reprodu/.ierbarkeit der Entfaltungsdaten des Prometheus NT.48. (A) Die Plots repräsentieren eine Überlagerung von 10 unabhängig registrierten Schmelzkurven von PPA bzw. TAKA. (B) Die Tm-Bestimmung für beide Proteine zeigt eine kleine S t a n da r da b \v e i c h u n g zwischen den Experimenten (<0,2 °C) und eine gute Korrelation mit veröffentlichten Ergebnissen [9] .

Fig. 15: Ca²⁺-Effekte auf die Amylasestabililät. Durch Entfernung von Ca² -Ionen kommt es zu einer merklichen Destabilisierung beider A m y 1 a s e- 1 so form en . worauf die Verschiebung von Tm zu niedrigeren Werten verweist.

Fig. 16: Formulierun gs-Screening von PPA. Zur Ermittlung von Opt i m a 1 bed i ngungen für eine erhöhte thermische Stabilität von PPA wurde dessen thermische Entfallung unter 16 unterschiedlichen Additivbedingungen überwacht. Eine deutliche Verschiebung von Tm zu höheren Werten ist in den Austragungen, der Fluoreszenzquotienten für jedes Additiv zu beobachten. Durch Quantifizierung von Tm unter unterschiedlichen Bedingungen zeigt sich, dass die Zugabe von 30 % Trehalose am effektivsten ist, während Glyeerol die schwächste Wirkung hat.

Fig. 1 7: Formal ierungs-Screening von TAKA. Zur Ermittlung von Opt im al bed i ngungen für eine erhöhte thermische Stabilität von TAKA wurde dessen thermische Entfaltung unter 16 unterschiedlichen Additivbedingungen überwacht. Eine deutliche Verschiebung von Tm zu höheren Werten ist in den Auftragungen der Fiuoreszenzquotienten für jedes Additiv zu beobachten. Durch Quantifizierung von Tm unter unterschiedlichen Bedingungen zeigt sich, dass die Zugabe von 40 % Sucrose am effektivsten ist, während Glycerol und Trehalose die schwächste Wirkung haben.

Literatur

Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel für eine erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. ein erfindungsgemäßes System, im Folgenden auch wieder Prometheus NT.48 mit nanoDSF Technologie genannt, ist beschrieben.

Mit der Prometheus-Serie offeriert NanoTemper Technologies die nanoDSF-Technologie, d. h., das Verfahren der Wahl für die leichte, schnelle und genaue Analyse der Proteinfaltung und - Stabilität mit Anwendungen im Protein-Engineering, in der Formulierungsentwicklung und Qualitätskontrolle.

Bevorzugte Nutzeffekte der nanoDSF:

• Von nativer DSF profitieren - kein Farbstoff, Puffer- und Detergensunabhängigkeit

• Mehr Übergänge beobachten - wegen hoher Auflösung

• Schneller Ergebnisse erhalten - mit kleineren Probenmengen arbeiten

· In breitem Konzentrationsbereich von 5 μg/ml bis 150 mg/ml messen

Bei der nanoDSF handelt es sich um eine fortgeschrittene Technologie der Differenzial- Scann i ng-F 1 uori metri e auf der Grundlage der Detektion kleinster Änderungen der intrinsischen Fluoreszenz der Aminosäure Tryptophan.

Die Fluoreszenz der Tryptophane in einem Protein hängt stark von ihrer nahen Umgebung ab. Durch Nachverfolgen von Änderungen der Fluoreszenz der Aminosäure Tryptophan lassen sich chemische und thermische Stabilität wahrhaft markerfrei bewerten.

Da zudem keine sekundären Reporterfluorophore erforderlich sind, können Proteinlösungen unabhängig von Pufferzusammensetzungen und über einen maximalen Proteinkonzentrationsbereich von 150 mg/ml bis gerade einmal 5 μg/ml analysiert werden, wodurch sich detergenssol ubi 1 i sierte Membranproteine wie auch hochkonzentrierte Antikörperformulierungen analysieren lassen.

Die Dual-UV-Technologie von NanoTemper ermöglicht o«-i ze-_/7y-Fluoreszenzdetektion, was für eine unübertroffene Scanning-Geschwindigkeit und Datenpunktdichte und damit für eine ultrahohe Auflösung von Entfaltungskurven sorgt, wodurch selbst kleinste Entfaltungssignale delektiert werden können.

In der nachstehenden Tabelle sind bevorzugte technische Merkmale zusammengefasst:

Zur Ableitung wichtiger Stabilitätsparameter werden Proteindenaturierungskurven verwendet. Normalerweise beschreibt man die thermische Stabilität eines vorgegebenen Proteins durch die Schmelztemperatur Tm, bei der die I Iälftc der Proteinpopulation entfaltet ist.

Berechnen lässt sich Tm anhand der Änderungen der Tryptophanfluoreszenzintensität oder anhand des Verhältnisses der Tryptophanemission bei 30 und 350 nm, das die

Verschiebung der Tryptophanemission bei Entfaltung beschreibt.

Typischerweise ergibt der Quotient 350/330 nm Daten mit wohldefinierten Übergängen bei der Proteinentfaltung, wogegen man mit der Einzelwellenlängendetektion Tm nicht immer ableiten kann. Somit sieht das Dual-Wellenlängensystem des Prometheus NT.48 eine empfindliche Detektion von Entfaltungsprozessen vor.

Die Erfindung umfasst ebenfalls die genauen oder exakten Ausdrücke, Merkmale, numerischen Werte oder Bereiche usw., wenn vorstehend oder nachfolgend diese Ausdrücke, Merkmale, numerischen Werte oder Bereiche im Zusammenhang mit Ausdrücken wie z.B. „etwa, ca., um, im Wesentlichen, im Allgemeinen, zumindest, mindestens" usw. genannt wurden (also„etwa 3" soll ebenfalls„3" oder„im Wesentlichen radial" soll auch„radial" umfassen). Der Ausdruck„bzw." bedeutet überdies„und/oder".

Claims

Patentansprüche

Verfahren zum Temperieren mindestens einer Kapillare (10), die zumindest teilweise mit einer Flüssigkeitssäule gefüllt und auf einem Träger (6) angeordnet ist,

wobei der Träger (6) mit einer Länge (L), Breite (B) und Höhe (H) die Kapillare

(10) entlang der Breite des Trägers (6) aufnimmt, und

die Flüssigkeitssäule der Kapillare (10) zwei Enden aufweist und so zu einem Temperierelement (5) ausgerichtet ist, dass mindestens ein Ende der Flüssigkeitssäule über das Temperierelement (5) übersteht und die Kapillare (10) mit dem Temperierelement (5) in Kontakt ist, sodass zumindest ein Teil der Kapillare und die darin liegende Flüssigkeitssäule temperiert wird,

dadurch gekennzeichnet, dass

die Enden (1 1, 12) der Kapillare (10) während der Temperierung unverschlossen sind.

Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine Kapillare (10) eine Länge zwischen 40 - 75mm aufweist, vorzugsweise zwischen 45-55mm, weiter bevorzugt ca. 50mm.

Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei als Temperierelement (5) Silizium verwendet wird.

Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Breite des Temperierelements (5) zwischen 5 - 34mm beträgt, vorzugsweise zwischen 20 - 30mm beträgt, weiter bevorzugt 20 - 25mm, weiter bevorzugt ca. 25mm beträgt.

Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Temperierelement (5) entlang der Breite einstückig ist oder mehrere voneinander getrennte Temperierbereiche aufweist, die auf Kontakt aneinander liegen können oder mit mindestens einem Zwischenraum die Breite des Temperiereiemets (5) überdecken. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine Kapillare (10) durch einen Deckel auf das Temperierelement (5) gedrückt wird, um einen Kontakt zwischen Kapillare (10) und Temperierelement (5) sicherzustellen.

Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kapillare (10) mit einer wässrigen Probenlösung oder Lösungsmittel gefüllt ist, insbesondere mit Pufferlösungen für biochemische/biologische Messungen.

Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Länge der Flüssigkeitssäule in der Kapillare (10) mindestens das 1,1 -fache der Breite des Temperierelements (5) beträgt, vorzugsweise mindestens das 1.2-fache. vorzugsweise mindestens das 1 ,3 -fache.

Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kapillaren (10)

i) einen Innendurchmesser von 0,02 bis 0,9 mm aufweisen, und/oder

;\ einen Außendurchmesser von 0,1 bis 2 mm aufweisen.

Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kapillaren (10) aus Glas, vorzugsweise aus Borosilikat 3.3. Quarz oder Synthetic Fused Silica, hergestellt sind.

Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der der Querschnitt einer Kapillare rund, oval, dreieckig, viereckig, fünfeckig, sechseckig, achteckig, halbrund, trapezförmig sein kann, oder eine andere unregelmäßige Form aufweisen kann.

Verfahren zum optischen Untersuchen von in Kapillaren gefüllten Proben mit den Schritten:

Befüllen von Kapillaren (10) mit Proben;

Anordnen der Kapillaren (10) auf einem Träger (6);

Temperieren der Kapillaren (10) nach einem Verfahren der vorhergehenden Ansprüche:

Anregen der Proben mit Licht, vorzugsweise UV-Licht; und

Messen von Licht, das von den Proben in den Kapillaren ausgesendet wird.

13. Temperiervorrichtung zum Temperieren mehrerer Kapillaren, insbesondere nach einem der vorhergehenden Verfahrensansprüche, wobei die Vorrichtung aufweist:

einen Träger (6) zum Aufnehmen von mehreren Kapillaren (10), und eine Temperiervorrichtung zum Temperieren der Kapillaren.

14. Temperiervorrichtung nach Anspruch 13, wobei der Träger 48 Kapillaren (10) aufnehmen kann und die Temperiervorrichtung (5) vorzugsweise aus Silizium hergestellt ist.

15. System zur optischen Untersuchung von Proben in Kapillaren (10) mit:

einer Temperiervorrichtung zum Temperieren der Kapillaren (10) nach einem der Ansprüche 13- 14;

mindestens einer Kapillaren (10), vorzugsweise einer nicht deformierbaren Kapillaren; und/oder

einem optischen Messsystem zum Aussenden von Licht, vorzugsweise UV-Licht und Detektieren von Licht, vorzugsweise im UV-Bereich, das von den Proben in den Kapillaren (10) ausgesendet wird.

16. Verwendung einer Kapillare bzw. einer Temperiervorrichtung gemäß einem Verfahren nach den Ansprüchen 1-12, insbesondere für nanoDSF Anwendungen.