WO2016076231A1 - アシル－ａｃｐチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法 - Google Patents

アシル－ａｃｐチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2016076231A1
WO2016076231A1 PCT/JP2015/081356 JP2015081356W WO2016076231A1 WO 2016076231 A1 WO2016076231 A1 WO 2016076231A1 JP 2015081356 W JP2015081356 W JP 2015081356W WO 2016076231 A1 WO2016076231 A1 WO 2016076231A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
amino acid
acid sequence
seq
acyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2015/081356
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
達郎 尾崎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kao Corp
Original Assignee
Kao Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kao Corp filed Critical Kao Corp
Priority to AU2015347886A priority Critical patent/AU2015347886B2/en
Priority to MYPI2017000570A priority patent/MY182519A/en
Priority to JP2016559023A priority patent/JP6629749B2/ja
Priority to US15/520,138 priority patent/US10280440B2/en
Publication of WO2016076231A1 publication Critical patent/WO2016076231A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
    • C12Y301/02014—Oleoyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase (3.1.2.14), i.e. ACP-thioesterase

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a lipid using acyl-ACP thioesterase.
  • the present invention also relates to an acyl-ACP thioesterase used in the method, a gene encoding the same, and a transformant into which the gene has been introduced.
  • Fatty acids are one of the main constituents of lipids, and constitute lipids such as triacylglycerol produced by ester bonds with glycerin in vivo. In many animals and plants, fatty acids are also stored and used as energy sources. Fatty acids and lipids stored in animals and plants are widely used for food or industry. For example, derivatives of higher alcohols obtained by reducing higher fatty acids having about 12 to 18 carbon atoms are used as surfactants. Alkyl sulfate esters and alkylbenzene sulfonates are used as anionic surfactants. Polyoxyalkylene alkyl ethers, alkyl polyglycosides, and the like are used as nonionic surfactants.
  • surfactants are used as cleaning agents or disinfectants.
  • Alkylamine salts and mono- or dialkyl quaternary amine salts as derivatives of the same higher alcohol are routinely used for fiber treatment agents, hair rinse agents, disinfectants, and the like.
  • Benzalkonium-type quaternary ammonium salts are routinely used as bactericides and preservatives.
  • higher alcohols having about 18 carbon atoms are useful as plant growth promoters.
  • fatty acids and lipids are widely used, and therefore, attempts have been made to improve the productivity of fatty acids and lipids in vivo in plants and the like. Furthermore, since the use and usefulness of fatty acids depend on the number of carbon atoms, attempts have been made to control the number of carbon atoms of fatty acids, that is, the chain length. For example, a method of accumulating fatty acids having 12 carbon atoms by introducing acyl-ACP thioesterase derived from bay ( Umbellularia californica (California bay)) has been proposed (Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
  • the present invention relates to a method for producing lipid, in which a transformant in which a gene encoding any one of the following proteins (A) to (C) is introduced into a host and lipid is collected from the culture.
  • a protein comprising the amino acid sequence of positions 91 to 348 of SEQ ID NO: 1.
  • B A protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence at positions 91 to 348 of SEQ ID NO: 1 and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • C A protein having the amino acid sequence of the protein (A) or (B) and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • the present invention also relates to the proteins (A) to (C) (hereinafter also referred to as the protein of the present invention or acyl-ACP thioesterase).
  • the present invention also relates to a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) (hereinafter also referred to as the gene of the present invention).
  • the present invention also relates to a transformant obtained by introducing a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) into a host.
  • the present invention relates to the provision of a method for producing a lipid using an algae-derived acyl-ACP thioesterase, which improves the productivity of a medium-chain fatty acid or a lipid comprising the medium-chain fatty acid.
  • the present invention relates to a novel algae-derived acyl-ACP thioesterase that can be suitably used in the above-described method, and a gene encoding the same.
  • the present invention also relates to the provision of a transformant that promotes the expression of the gene and changes lipid productivity or fatty acid composition.
  • the present inventor has studied a new acyl-ACP thioesterase derived from algae.
  • a novel acyl-ACP thioesterase and an acyl-ACP thioesterase gene encoding the same were found from algae belonging to the genus Nannochloropsis.
  • the present inventors have found that the content of specific fatty acids in the total fatty acid component in the lipid is significantly improved in the transformant.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • a novel acyl-ACP thioesterase, a gene encoding the same, and a transformant into which the gene is introduced can be provided.
  • the production method of the present invention using the transformant is excellent in productivity of medium-chain fatty acids or lipids comprising the same.
  • the production method of the present invention has a carbon number of 8 to 16, preferably 12 to 16, more preferably 12 to 14, more preferably 12 and 14, and more preferably carbon number. Is excellent in productivity of 14 fatty acids or lipids containing these as constituents.
  • the acyl-ACP thioesterase, gene encoding the same, transformant, and production method of the present invention can be suitably used for industrial production of fatty acids or lipids.
  • lipid includes simple lipids, complex lipids and derived lipids, and specifically includes fatty acids, fatty alcohols, hydrocarbons (alkanes, etc.), neutral lipids (triacylglycerols, etc.). , Wax, ceramide, phospholipid, glycolipid, sulfolipid and the like.
  • Cx: y in the notation of fatty acids and acyl groups constituting fatty acids means that the number of carbon atoms is x and the number of double bonds is y.
  • Cx represents a fatty acid or acyl group having x carbon atoms.
  • the identity of a base sequence and an amino acid sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, vol. 227, p. 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis assuming that Unit size to compare (ktup) is 2 using the homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win.
  • “stringent conditions” include, for example, Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W., et al. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press].
  • a numerical range expressed using “to” means a range including numerical values described before and after “to” as a lower limit value and an upper limit value.
  • the “medium chain” means that the fatty acid or the fatty acid residue has 8 to 16 carbon atoms.
  • Acyl-ACP thioesterase The protein of the present invention is a protein having an amino acid sequence of at least positions 91 to 348 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a protein functionally equivalent to the protein.
  • Acyl-ACP (acyl carrier protein) thioesterase is an enzyme involved in the biosynthesis system of fatty acids and derivatives thereof (such as triacylglycerol (triglyceride)).
  • the enzyme contains acyl-ACP (an acyl group that is a fatty acid residue), which is an intermediate in the process of fatty acid biosynthesis, in plastids such as chloroplasts in plants and algae, and in the cytoplasm in bacteria, fungi, and animals.
  • acyl-ACP thioesterase activity refers to an activity of hydrolyzing the thioester bond of acyl-ACP.
  • proteins include the following proteins (A) to (C).
  • a protein comprising the amino acid sequence of positions 91 to 348 of SEQ ID NO: 1.
  • B A protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence at positions 91 to 348 of SEQ ID NO: 1 and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • C A protein having the amino acid sequence of the protein (A) or (B) and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence of an acyl-ACP thioesterase (hereinafter also abbreviated as NoTE2 ) derived from an algae belonging to the genus Nannochloropsis, Nannochloropsis oculata .
  • NoTE2 acyl-ACP thioesterase
  • the inventor believes that in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the region from position 91 to position 348 is important for functioning as an acyl-ACP thioesterase, and is a sufficient region to exhibit acyl-ACP thioesterase activity. I found. That is, a protein consisting of the amino acid sequence at positions 91 to 348 of SEQ ID NO: 1 and a protein consisting of an amino acid sequence containing the sequence have acyl-ACP thioesterase activity. Protein (A) has sufficient region for this acyl-ACP thioesterase activity and functions as an acyl-ACP thioesterase.
  • Protein (B) consists of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence at positions 91 to 348 of SEQ ID NO: 1, and has acyl-ACP thioesterase activity.
  • an amino acid sequence encoding an enzyme protein does not necessarily indicate enzyme activity unless the sequence of the entire region is conserved, and there are regions that do not affect enzyme activity even if the amino acid sequence changes. It is known to exist. In such a region that is not essential for enzyme activity, the original activity of the enzyme can be maintained even if a mutation such as amino acid deletion, substitution, insertion or addition is introduced.
  • a protein that retains acyl-ACP thioesterase activity and has a partially mutated amino acid sequence can also be used.
  • the identity with the amino acid sequence at positions 91 to 348 of SEQ ID NO: 1 is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and more than 95% Is more preferable, 96% or more is more preferable, 97% or more is further more preferable, 98% or more is further more preferable, and 99% or more is further more preferable.
  • the amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence at positions 91 to 348 of SEQ ID NO: 1 is one or several in the amino acid sequence at positions 91 to 348 of SEQ ID NO: 1. 1 or more, preferably 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, still more preferably 1 or more and 10 or less, still more preferably 1 or more and 8 or less, and even more preferably 1 or more 5 or less, more preferably 1 or more and 4 or less, still more preferably 1 or more and 3 or less, and even more preferably 1 or 2 amino acids are deleted, substituted, inserted or added.
  • Examples include sequences.
  • Examples of a method for introducing mutation such as deletion, substitution, insertion, addition, etc. into the amino acid sequence include a method of introducing mutation into the base sequence encoding the amino acid sequence. A method for introducing a mutation into the base sequence will be described later.
  • the protein (C) contains the amino acid sequence of the protein (A) or (B) as part of its amino acid sequence, and exhibits acyl-ACP thioesterase activity.
  • the protein (C) may contain a sequence other than the amino acid sequence of the protein (A) or (B).
  • examples of the sequence other than the amino acid sequence of the protein (A) or (B) include, for example, any amino acid sequence other than positions 91 to 348 of SEQ ID NO: 1,
  • the identity with any amino acid sequence other than positions 91 to 348 of number 1 is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and still more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, more preferably 99% or more amino acid sequences, or one or several amino acids in these sequences, preferably 1 or more and 20 or less More preferably, it is 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more and 10 or less, more preferably 1 or more and 8 or less, more preferably 1 or more and 5 or less.
  • the protein (C) is also preferably a protein comprising an amino acid sequence in which a signal peptide involved in protein transport or secretion is added to the amino acid sequence of the protein (A) or (B).
  • signal peptide addition include addition of a chloroplast translocation signal peptide to the N-terminus.
  • the protein (C) may be a protein consisting of an amino acid sequence in which the amino acid at the N-terminal side is deleted at any position from 1 to 90 in SEQ ID NO: 1. Furthermore, the following proteins (C1) to (C7) are preferable as the protein (C) from the viewpoint of productivity of specific fatty acids, for example, medium chain fatty acids, specifically, fatty acids having 12 or 14 carbon atoms. .
  • (C1) A protein comprising the amino acid sequence of positions 1 to 348 of SEQ ID NO: 1.
  • C2 A protein comprising the amino acid sequence of positions 61 to 348 of SEQ ID NO: 1.
  • C3 A protein comprising the amino acid sequence of positions 71 to 348 of SEQ ID NO: 1.
  • (C4) A protein comprising the amino acid sequence of positions 74 to 348 of SEQ ID NO: 1.
  • (C5) A protein comprising the amino acid sequence of positions 81 to 348 of SEQ ID NO: 1.
  • (C6) The identity with any one amino acid sequence of the proteins (C1) to (C5) is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, more More preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more amino acid sequence, and a protein having acyl-ACP thioesterase activity.
  • (C7) One or several, preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more in any one amino acid sequence of the proteins (C1) to (C5) 10 or less, more preferably 1 or more and 8 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 4 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, more preferably 1 or 2 Protein having an acyl-ACP thioesterase activity, comprising an amino acid sequence in which a single amino acid is deleted, substituted, inserted, or added. The present inventors have confirmed that the proteins (C1) to (C5) have acyl-ACP thioesterase activity.
  • a protein has acyl-ACP thioesterase activity means that, for example, a DNA in which an acyl-ACP thioesterase gene is linked downstream of a promoter that functions in a host cell such as E. coli is introduced into a host cell that lacks the fatty acid degradation system. It can be confirmed by culturing under conditions where the introduced acyl-ACP thioesterase gene is expressed, and analyzing changes in the fatty acid composition in the host cell or culture solution using a method such as gas chromatography analysis. .
  • acyl-ACP thioesterase gene linked downstream of a promoter that functions in a host cell such as Escherichia coli into the host cell and culturing the cell under conditions such that the introduced acyl-ACP thioesterase gene is expressed.
  • Various acyls prepared by the method of Yuan et al. (Yuan L, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92 (23), p. 10639-10643).
  • -Acyl-ACP thioesterase activity can be measured by carrying out a reaction using ACP as a substrate.
  • a protein derived from a natural product can be obtained by isolation, purification or the like from Nannochloropsis oculata.
  • protein synthesis may be performed by chemical synthesis, or a recombinant protein may be produced by a gene recombination technique.
  • the acyl-ACP thioesterase gene described later can be used.
  • Algae belonging to the genus Nannochloropsis such as Nannochloropsis oculata can also be obtained from a preservation organization such as a private or public laboratory.
  • the acyl-ACP thioesterase gene of the present invention is a gene encoding any one of the proteins (A) to (C).
  • An example of a gene encoding any one of proteins (A) to (C) is a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is an example of the base sequence of the gene encoding acyl-ACP thioesterase derived from Nannochloropsis oculiata, and encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence from positions 271 to 1044 of SEQ ID NO: 2 encodes the amino acid sequence from positions 91 to 348 of SEQ ID NO: 1. Note that the nucleotide sequence from position 1045 to position 1047 of SEQ ID NO: 2 is a stop codon and does not correspond to an amino acid.
  • a gene consisting of any one of the following DNAs (a) to (c) can be exemplified.
  • the present invention is not limited to these.
  • DNA (b) from the viewpoint of acyl-ACP thioesterase activity, the identity with the nucleotide sequence at positions 271 to 1047 of SEQ ID NO: 2 is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and more than 95% Is more preferable, 96% or more is more preferable, 97% or more is further more preferable, 98% or more is further more preferable, and 99% or more is further more preferable.
  • the nucleotide sequence having 80% or more identity with the nucleotide sequence of positions 271 to 1047 of SEQ ID NO: 2 is one or several in the nucleotide sequence of positions 271 to 1047 of SEQ ID NO: 2.
  • More preferred is a base sequence in which 1 to 4 or less, more preferably 1 to 3 or less, more preferably 1 or 2 bases are deleted, substituted, inserted or added. Examples of methods for introducing mutations such as deletion, substitution, insertion and addition into the base sequence include site-specific mutagenesis.
  • kits such as Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Km Kit (Takara Bio), Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Clonetech), KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo) may be used. it can.
  • the target gene after giving a random gene mutation, the target gene can also be obtained by performing enzyme activity evaluation and gene analysis by an appropriate method.
  • DNA (b) DNA that hybridizes with DNA consisting of a base sequence complementary to DNA (a) under stringent conditions and encodes a protein having acyl-ACP thioesterase activity is also preferable.
  • DNA (c) contains the base sequence of DNA (a) or (b) as part of its base sequence, and encodes a protein having acyl-ACP thioesterase activity.
  • the DNA (c) may contain a sequence other than the base sequence of the DNA (a) or (b).
  • sequences other than the base sequence of DNA (a) or (b) in the base sequence of DNA (c) include, for example, any base sequence other than positions 271 to 1047 in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and still more preferably 96%, with any nucleotide sequence other than positions 271 to 1047 Or more, more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, or any nucleotide sequence other than positions 271 to 1047 in SEQ ID NO: 2 Or several, preferably 1 to 20 or less, more preferably 1 to 15 or less, more preferably 1 to 10 or less, more preferably 1 to 8 or less, more preferably 1 or less.
  • a base sequence encoding a signal peptide involved in protein transport or secretion is also preferable.
  • the signal peptide include those described for the protein (C). These sequences are preferably added to the 5 ′ end side of the base sequence of the DNA (a) or (b).
  • the DNA (c) may be a DNA consisting of a base sequence in which the 5 ′ end is deleted at any position from positions 1 to 270 of SEQ ID NO: 2. Furthermore, from the viewpoint of productivity of specific fatty acids, for example, medium chain fatty acids, specifically, fatty acids having 12 or 14 carbon atoms, the following DNA (c1) to (c7) are preferable as the DNA (c). .
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 220 to 1047 of SEQ ID NO: 2.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 241 to 1047 of SEQ ID NO: 2.
  • the identity with any one of the base sequences of DNA (c1) to (c5) is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, more More preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and encodes a protein having acyl-ACP thioesterase activity DNA.
  • (c7) One or several, preferably 1 or more, 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more, in any one of the base sequences of DNA (c1) to (c5) 10 or less, more preferably 1 or more and 8 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 4 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, more preferably 1 or 2
  • the method for obtaining the acyl-ACP thioesterase gene of the present invention is not particularly limited, and can be obtained by ordinary genetic engineering techniques.
  • a gene can be obtained by artificial synthesis based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • services such as Eurofin Genomics can be used for artificial gene synthesis.
  • It can also be obtained by cloning from Nannochloropsis oculata, for example, by the method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)] be able to.
  • a first aspect of the transformant of the present invention is a transformant in which expression of a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) is promoted. It is.
  • the ability to produce lipids particularly the ability to produce medium chain fatty acids having 12 to 16 carbon atoms or lipids comprising them (the production amount and production of lipids comprising medium chain fatty acids or these constituents)
  • the proportion of medium chain fatty acids in the total fatty acids produced and the proportion of lipids comprising the medium chain fatty acids in the total lipid produced as a constituent) are significantly improved.
  • the present invention using the transformant is a specific lipid, particularly a medium chain fatty acid or a lipid comprising this, preferably a fatty acid having 8 to 16 carbon atoms or a lipid comprising this.
  • the fatty acid having 12 or more and 16 or less carbon atoms or a lipid comprising the same more preferably a fatty acid having 12 or more and 14 or less carbon atoms or a lipid comprising the same, more preferably 12 or 14 carbon atoms.
  • acyl-ACP thioesterase to produce fatty acids or lipids can be measured by the method used in the examples.
  • those in which the expression of the gene encoding the target protein is promoted are also referred to as “transformants”, and those in which the expression of the gene encoding the target protein is not promoted are “host” or “ Also referred to as “wild strain”.
  • the method for promoting the expression of the acyl-ACP thioesterase gene can be appropriately selected from conventional methods. For example, a method of introducing the acyl-ACP thioesterase gene into a host, a method of modifying an expression control region (promoter, terminator, etc.) of the gene in a host having the acyl-ACP thioesterase gene on the genome, etc. Can be mentioned.
  • a method for promoting the expression of the gene by introducing the acyl-ACP thioesterase gene into the host will be described.
  • a transformant that can be preferably used in the present invention can be obtained by introducing a gene encoding an acyl-ACP thioesterase into a host by an ordinary genetic engineering method. Specifically, by preparing an expression vector or gene expression cassette capable of expressing a gene encoding an acyl-ACP thioesterase in a host cell, and introducing the gene into a host cell to transform the host cell. Can be made.
  • the host of the transformant is not particularly limited and can be appropriately selected from those usually used.
  • microorganisms including algae and microalgae
  • plants, or animals can be used.
  • the host is preferably a microorganism or a plant, and more preferably a microorganism.
  • the microorganism may be either prokaryotic, eukaryotic, Escherichia (Escherichia) microorganism belonging to the genus microorganism belonging to Bacillus (Bacillus) genus Synechocystis (Synechocystis) microorganism of the genus, Synechococcus (Synechococcus) microorganisms of the genus Or eukaryotic microorganisms such as yeast and filamentous fungi can be used. Among them, from the viewpoint of the lipid productivity, E.
  • Escherichia coli is a microorganism belonging to Escherichia
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • red yeast is a microorganism belonging to yeast (Rhodosporidium toruloides), Or Mortierella sp.
  • which is a microorganism belonging to filamentous fungi is preferable, and Escherichia coli is more preferable.
  • algae belonging to the genus Chlamydomonas from the viewpoint of establishing genetic recombination techniques, algae belonging to the genus Chlamydomonas , algae belonging to the genus Chlorella , algae belonging to the genus Phaeodactylum , Or algae belonging to the genus Nannochloropsis are preferable, and algae belonging to the genus Nannochloropsis are more preferable.
  • Nannochloropsis gaditana Specific algae belonging to the genus Nannochloropsis are Nannochloropsis gaditana , Nannochloropsis salina , Nannochloropsis oceanica , Nannochloropsis oceanica , Nannochloropsis oceanina , Examples thereof include Nannochloropsis atomus , Nannochloropsis maculata , Nannochloropsis granulata , Nannochloropsis sp., And the like. Among these, from the viewpoint of lipid productivity, Nannochloropsis oculata or Nannochloropsis gaditana is preferable, and Nannochloropsis oculata is more preferable.
  • the plant body is preferably Arabidopsis thaliana , rapeseed, coconut palm, palm, coffea, or jatropha, more preferably Arabidopsis , from the viewpoint of high lipid content in the seed.
  • a gene encoding acyl-ACP thioesterase can be introduced into a host, and the gene can be expressed in the host cell.
  • Any vector may be used.
  • a vector having an expression regulatory region such as a promoter or terminator according to the type of host to be introduced, and a vector having a replication origin or a selection marker can be used.
  • it may be a vector that autonomously grows and replicates outside the chromosome, such as a plasmid, or a vector that is integrated into the chromosome.
  • pBluescript II SK ( ⁇ ) or pMW218 / 219 is preferably used.
  • algae for example, pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc.), P66 (Chlamydomonas Center), P-322 (Chlamydomonas Center), pPha-T1 (Yangmin Gong, et al., Journal of Basic Microbiology, 2011) , Vol.51, p.666-672), or pJET1 (manufactured by Cosmo Bio).
  • a host when the host is an algae belonging to the genus Nannochloropsis, pUC19, pPha-T1, or pJET1 is preferably used.
  • a host When the host is an algae belonging to the genus Nannochloropsis, Oliver Kilian, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol.
  • a host can also be transformed with a DNA fragment (gene expression cassette) comprising the gene, promoter and terminator of the present invention.
  • the DNA fragment include a DNA fragment amplified by PCR and a restriction enzyme-cleaved DNA fragment.
  • a pRI vector manufactured by Takara Bio Inc.
  • a pBI vector manufactured by Clontech
  • an IN3 vector manufactured by Implanta Innovations
  • the host is Arabidopsis thaliana
  • pRI vectors or pBI vectors are preferably used.
  • the type of promoter or terminator that regulates the expression of the gene encoding the target protein incorporated above can also be appropriately selected according to the type of host used.
  • a promoter that can be preferably used in the present invention for example, by adding lac promoter, trp promoter, tac promoter, trc promoter, T7 promoter, SpoVG promoter, isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Promoters related to inducible derivatives, Rubisco operon (rbc), PSI reaction center protein (psaAB), PSII D1 protein (psbA), cauliflower mosaic virus 35SRNA promoter, housekeeping gene promoter (eg tubulin promoter, actin promoter, ubiquitin) Promoter, rapeseed-derived Napin gene promoter, plant-derived Rubisco promoter, violaxanthin / chlorophyll a-binding protein VCP1 gene promoter from the genus Nannochloropsis (V
  • LDSP lipid droplet surface protein
  • the type of selectable marker for confirming that the gene encoding the target protein has been incorporated can be appropriately selected according to the type of host used.
  • Selectable markers that can be preferably used in the present invention include ampicillin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, blasticidin S Examples include drug resistance genes such as resistance genes, bialaphos resistance genes, zeocin resistance genes, paromomycin resistance genes, or hygromycin resistance genes. Furthermore, it is also possible to use a gene defect associated with auxotrophy as a selection marker gene.
  • Introduction of a gene encoding a target protein into the vector can be performed by a usual technique such as restriction enzyme treatment or ligation.
  • sequences useful for translation of the gene for example, sequences corresponding to a start codon and a stop codon can be appropriately supplemented.
  • the transformation method is not particularly limited as long as it is a method capable of introducing a target gene into a host. For example, a method using calcium ions, a general competent cell transformation method (J. Bacterial. 93, 1925 (1967)), a protoplast transformation method (Mol. Gen. Genet.
  • ⁇ Selection of transformant introduced with target gene fragment> can be performed by using a selection marker or the like.
  • the drug resistance gene acquired by the transformant as a result of introducing a vector-derived drug resistance gene into the host cell together with the target DNA fragment at the time of transformation can be used as an indicator.
  • the introduction of the target DNA fragment can also be confirmed by PCR method using a genome as a template.
  • “Expression regulatory region” refers to a promoter or terminator, and these sequences are generally involved in regulating the expression level (transcription level, translation level) of adjacent genes.
  • “Expression regulatory region” refers to a promoter or terminator, and these sequences are generally involved in regulating the expression level (transcription level, translation level) of adjacent genes.
  • Examples of the method for modifying the expression regulatory region include promoter replacement.
  • the acyl-ACP thioesterase gene promoter (hereinafter also referred to as “acyl-ACP thioesterase promoter”) is replaced with a promoter having a higher transcriptional activity, whereby the acyl- Expression of the ACP thioesterase gene can be promoted.
  • an acyl-ACP thioesterase is directly under the DNA sequence consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 37.
  • the gene is present, and a promoter region is present in the DNA sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 37.
  • the promoter used for replacement of the acyl-ACP thioesterase promoter is not particularly limited, and is appropriately selected from those having higher transcription activity than the acyl-ACP thioesterase promoter and suitable for the production of medium-chain fatty acids or lipids comprising them. You can choose.
  • the promoter of the LDSP gene can be preferably used. From the viewpoint of improving the productivity of medium-chain fatty acids or lipids containing these as constituents, the promoter of violaxanthin / chlorophyll a-binding protein gene and the promoter of LDSP gene are more preferable.
  • the above-described promoter modification can be performed according to a conventional method such as homologous recombination. Specifically, a linear DNA fragment containing upstream and downstream regions of the target promoter and containing another promoter instead of the target promoter is constructed and incorporated into the host cell, and the target promoter of the host genome Two homologous recombination occurs at the upstream and downstream side of. As a result, the target promoter on the genome is replaced with another promoter fragment, and the promoter can be modified.
  • a method for modifying a target promoter by homologous recombination is described in, for example, Besher et al., Methods in molecular biology, 1995, vol. 47, p. Reference can be made to documents such as 291-302.
  • a second aspect of the transformant of the present invention is a transformant in which the gene is deleted, mutated or expression-suppressed in a host having the acyl-ACP thioesterase gene of the present invention. is there.
  • the transformant (hereinafter also referred to as “transformant of the second aspect”) is a deletion, mutation, or mutation of a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) in the host. It is obtained by suppressing expression.
  • the host of the transformant of the second aspect is not particularly limited as long as it has the acyl-ACP thioesterase gene of the present invention, and microorganisms, plants, or animals can be used.
  • microorganisms are preferable, and Escherichia coli or microalgae are more preferable.
  • the microalgae are preferably algae belonging to the genus Nannochloropsis from the viewpoint of lipid productivity.
  • Nannochloropsis oculata examples include Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis gaditana, Nannochloropsis salina, Nannochloropsis oceanica, Nannochloropsis Atoms, Nannochloropsis maculata, Nanno Chloropsis granulata or Nannochloropsis sp.
  • Nannochloropsis oculata or Nannochloropsis gaditana is preferable, and Nannochloropsis oculata is more preferable.
  • a part or all of the target gene is removed from the genome or replaced with another gene.
  • This method can be carried out by inserting a DNA fragment of this gene, or by mutating the active site, substrate binding site or transcription / translation initiation region of the gene.
  • the above-described deletion / mutation / expression suppression method can be performed using, for example, homologous recombination.
  • a linear DNA fragment that contains upstream and downstream regions of the target gene but does not contain the target gene is constructed by a method such as PCR, and is incorporated into the host cell to upstream of the target gene in the host genome.
  • the target gene on the genome can be deleted or replaced with another gene fragment by causing homologous recombination twice on the side and downstream.
  • a target gene into which a mutation such as base substitution or base insertion has been introduced is constructed by a method such as PCR, and this is incorporated into a host cell, and twice at two locations outside the mutation site in the target gene of the host genome.
  • a circular recombinant plasmid obtained by cloning a DNA fragment containing a part of the target gene into an appropriate plasmid vector is incorporated into the host cell, and the host genome is obtained by homologous recombination in a part of the target gene.
  • the target gene above can be disrupted to reduce or eliminate its function.
  • target gene deletion / mutation / expression suppression methods by homologous recombination are described in, for example, Besher et al., Methods in molecular biology, 1995, vol. 47, p.291-302.
  • the host is an algae belonging to the genus Nannochloropsis
  • homology with reference to documents such as Oliver Kilian, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108 (52)
  • Specific genes in the genome can be deleted or destroyed by recombinant methods.
  • genomic DNA is extracted from the transformants and PCR is performed on the region containing the target gene site, or a DNA probe that binds to the target gene region is used.
  • the Southern blotting method can be used.
  • the fatty acid composition of the produced lipid is considered to change from the original composition of the host. That is, the transformant can produce a lipid having a modified fatty acid composition in the lipid.
  • the transformant of the first aspect of the present invention has improved productivity of medium chain fatty acids or lipids comprising this as a constituent, compared to the host. Therefore, if the transformant of the present invention is cultured under appropriate conditions, and then the medium chain fatty acid or the lipid comprising this as a constituent component is recovered from the obtained culture, the medium chain fatty acid or the lipid comprising this constituent is obtained. Can be manufactured efficiently.
  • the method for producing a lipid of the present invention comprises a step of culturing a transformant introduced with a gene encoding acyl-ACP thioesterase under appropriate conditions to obtain a culture from the viewpoint of improving lipid productivity, and It is preferable to include a step of collecting lipid from the obtained culture.
  • culturing a transformant means culturing and growing a microorganism, algae, a plant, an animal, and cells and tissues thereof, and includes cultivating the plant in soil or the like.
  • the “culture” includes, in addition to the culture solution, the transformant itself after culturing and the like.
  • Culture conditions can be appropriately selected depending on the host of the transformant, and culture conditions generally used for the host can be used. From the viewpoint of lipid production efficiency, for example, glycerol, acetic acid, malonic acid or the like may be added to the medium as a substrate of acyl-ACP thioesterase or a precursor involved in the fatty acid biosynthesis system.
  • a transformant using Escherichia coli as a host culturing in an LB medium or Overnight Express Instant TB Medium (Novagen) at 30 to 37 ° C. for 0.5 to 1 day can be mentioned.
  • a transformant using Arabidopsis as a host it is cultivated for 1 to 2 months in soil under a temperature condition of 20 to 25 ° C. and under a light condition such as continuous irradiation with white light or a light period of 16 hours and a dark period of 8 hours. Can be mentioned.
  • the culture medium may be based on natural seawater or artificial seawater, or a commercially available culture medium may be used.
  • the medium include f / 2 medium, ESM medium, Daigo IMK medium, L1 medium, and MNK medium.
  • f / 2 medium, ESM medium, or Daigo IMK medium is preferable, f / 2 medium or Daigo IMK medium is more preferable, and f / 2 medium is further included. preferable.
  • nitrogen sources, phosphorus sources, metal salts, vitamins, trace metals, and the like can be appropriately added to the medium.
  • the amount of algae inoculated on the medium is not particularly limited, but is preferably 1 to 50% (vol / vol), more preferably 1 to 10% (vol / vol) per medium from the viewpoint of growth.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of algae, but it is usually in the range of 5 to 40 ° C. From the viewpoint of promoting the growth of algae, improving the productivity of fatty acids, and reducing the production cost, the temperature is preferably 10 to 35 ° C, more preferably 15 to 30 ° C.
  • the light irradiation may be performed under conditions that allow photosynthesis, and may be artificial light or sunlight.
  • the illuminance during light irradiation is preferably in the range of 100 to 50000 lux, more preferably in the range of 300 to 10000 lux, and still more preferably in the range of 1000 to 6000 lux, from the viewpoint of promoting the growth of algae and improving the productivity of fatty acids. It is. Further, the light irradiation interval is not particularly limited, but from the same viewpoint as described above, it is preferably performed in a light / dark cycle, and the light period in 24 hours is preferably 8 to 24 hours, more preferably 10 to 18 hours, More preferably, it is 12 hours.
  • the concentration of carbon dioxide in the gas is not particularly limited, but is preferably 0.03 (similar to atmospheric conditions) to 10%, more preferably 0.05 to 5%, from the viewpoint of promoting growth and improving the productivity of fatty acids. More preferably, it is 0.1 to 3%, and still more preferably 0.3 to 1%.
  • the concentration of the carbonate is not particularly limited. For example, when sodium bicarbonate is used, it is preferably 0.01 to 5% by mass, more preferably 0.05 to 2% by mass, from the viewpoint of promoting growth and improving the productivity of fatty acids.
  • the content is 0.1 to 1% by mass.
  • the culture time is not particularly limited, and may be performed for a long period of time (for example, about 150 days) so that algal bodies that accumulate lipids at a high concentration can grow at a high concentration.
  • the culture period is preferably 3 to 90 days, more preferably 3 to 30 days, and even more preferably 7 to 30 days.
  • culture cultivation may be any of aeration stirring culture, shaking culture, or stationary culture, and aeration stirring culture is preferable from the viewpoint of improving aeration.
  • a method for collecting lipid produced in the transformant a method usually used for isolating lipid components in a living body, for example, filtration, centrifugation, cell culture from the aforementioned culture or transformant
  • a lipid component is isolated and recovered by crushing, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, chloroform / methanol extraction method, hexane extraction method or ethanol extraction method.
  • oil can be recovered from the culture or transformant by pressing or extraction, and then subjected to general purification such as degumming, deoxidation, decolorization, dewaxing, and deodorization to obtain lipids. .
  • a fatty acid can be obtained by hydrolyzing the isolated lipid.
  • the method for isolating the fatty acid from the lipid component include a method of treating at a high temperature of about 70 ° C. in an alkaline solution, a method of treating with lipase, a method of decomposing using high-pressure hot water, and the like.
  • the acyl-ACP thioesterase of the present invention has high specificity for medium chain acyl-ACP, further C12-C16 acyl-ACP, especially C12 and C14 acyl-ACP.
  • the production method of the present invention using the transformant is suitable for lipid production, particularly medium chain fatty acids, preferably fatty acids having 8 to 16 carbon atoms, more preferably fatty acids having 12 to 16 carbon atoms, more preferably carbon numbers. It can be suitably used for the production of fatty acids having 12 to 14 fatty acids, more preferably fatty acids having 12 and 14 carbon atoms, more preferably fatty acids having 14 carbon atoms, or lipids composed thereof.
  • the lipid produced in the production method of the present invention preferably contains a fatty acid or a fatty acid compound, and more preferably contains a fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, from the viewpoint of its availability.
  • the lipid produced in the production method of the present invention is preferably a fatty acid having 8 to 16 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 12 to 16 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof. More preferably, the fatty acid having 12 to 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 12 and 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof. including.
  • the fatty acid or fatty acid ester compound contained in the lipid is preferably a fatty acid having 8 to 16 carbon atoms or a fatty acid ester thereof, more preferably a fatty acid ester having 12 to 16 carbon atoms or a fatty acid ester thereof, from the viewpoint of availability to a surfactant or the like.
  • a fatty acid having 12 to 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof is more preferable
  • a fatty acid having 12 or 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof is more preferable
  • a fatty acid having 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof is more preferable.
  • the fatty acid ester compound is preferably a simple lipid or a complex lipid, more preferably a simple lipid, and even more preferably triacylglycerol.
  • Fatty acids and lipids obtained by the production method of the present invention and transformants are used as food, as emulsifiers for cosmetics, detergents such as soaps and detergents, fiber treatment agents, hair rinse agents, or bactericides and preservatives. Can be used.
  • the present invention further discloses the following methods, transformants, proteins, and genes.
  • a method for producing lipid comprising culturing a transformant into which a gene encoding any one of the following proteins (A) to (C) is introduced into a host, and collecting the lipid from the culture.
  • a protein comprising the amino acid sequence of positions 91 to 348 of SEQ ID NO: 1.
  • B A protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence at positions 91 to 348 of SEQ ID NO: 1 and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • C A protein having the amino acid sequence of the protein (A) or (B) and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • ⁇ 2> Fatty acid produced in the cells of the transformant or lipid comprising this as a constituent, comprising the step of introducing a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) into the host A way to increase productivity.
  • lipid is a medium-chain fatty acid or a lipid containing this as a constituent.
  • a medium-chain fatty acid produced in a cell of the transformant comprising a step of introducing a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) into the host to obtain a transformant,
  • a method for modifying a lipid composition which improves the productivity of lipids comprising this as a constituent component, and modifies the total fatty acids produced or the composition of fatty acids or lipids in the total lipids.
  • ⁇ 5> A method for producing lipid, comprising culturing a transformant in which expression of a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) is promoted, and collecting lipid from the culture.
  • ⁇ 6> A fatty acid produced in a cell of a transformant or a lipid comprising the same, comprising a step of promoting the expression of a gene encoding any one of the proteins (A) to (C). A way to increase productivity.
  • ⁇ 7> The method according to ⁇ 6>, wherein the lipid is a medium-chain fatty acid or a lipid comprising this as a constituent.
  • ⁇ 8> Medium chain fatty acids produced in cells of transformants by promoting the expression of a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) or lipids comprising the same
  • a method for modifying the composition of lipids which improves productivity and modifies the composition of fatty acids or lipids in total fatty acids or total lipids produced.
  • ⁇ 9> The method according to any one of ⁇ 5> to ⁇ 9>, wherein a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) is introduced into a host to promote expression of the gene. Method.
  • the identity with the amino acid sequence at positions 91 to 348 of SEQ ID NO: 1 is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more.
  • the protein (B) has one or several, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 15, more preferably 1 to 15 amino acid sequences of SEQ ID NO: 1.
  • ⁇ 12> The protein according to any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 9>, wherein the protein (C) is composed of an amino acid sequence in which the amino acid at the N-terminal side is deleted at any position from 1 to 90 in SEQ ID NO: 1.
  • the method described. ⁇ 13> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, wherein the protein (C) is any one of the following proteins (C1) to (C7).
  • C1 A protein comprising the amino acid sequence of positions 1 to 348 of SEQ ID NO: 1.
  • C2 A protein comprising the amino acid sequence of positions 61 to 348 of SEQ ID NO: 1.
  • C3 A protein comprising the amino acid sequence of positions 71 to 348 of SEQ ID NO: 1.
  • (C4) A protein comprising the amino acid sequence of positions 74 to 348 of SEQ ID NO: 1.
  • (C5) A protein comprising the amino acid sequence of positions 81 to 348 of SEQ ID NO: 1.
  • (C6) The identity with any one amino acid sequence of the proteins (C1) to (C5) is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably Is a protein having an amino acid sequence of 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more, and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • (C7) One or several, preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more in any one amino acid sequence of the proteins (C1) to (C5) 10 or less, more preferably 1 or more and 8 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 4 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, more preferably 1 or 2 Protein having an acyl-ACP thioesterase activity, comprising an amino acid sequence in which a single amino acid is deleted, substituted, inserted, or added.
  • ⁇ 14> The above ⁇ 1> to ⁇ 13, wherein the gene encoding any one of the proteins (A) to (C) is a gene consisting of any one of the following DNA (a) to (c): The method of any one of>.
  • DNA encoding a protein having the base sequence of DNA (a) or (b) and having acyl-ACP thioesterase activity (c) DNA encoding a protein having the base sequence of DNA (a) or (b) and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • the DNA (b) has one or more, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 15, more preferably 1 or more nucleotide sequences in the DNA (a).
  • DNA (c) comprises a base sequence deleted at the 5′-terminal side at any position from positions 1 to 270 of SEQ ID NO: 2.
  • DNA (c) is any one of the following DNA (c1) to (c7).
  • (c1) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1 to 1047 of SEQ ID NO: 2.
  • c2 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 181 to 1047 of SEQ ID NO: 2.
  • c3 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 211 to 1047 of SEQ ID NO: 2.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 220 to 1047 of SEQ ID NO: 2.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 241 to 1047 of SEQ ID NO: 2.
  • the identity with any one of the base sequences of DNA (c1) to (c5) is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, more More preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and encodes a protein having acyl-ACP thioesterase activity DNA.
  • (c7) One or several, preferably 1 or more, 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more, in any one of the base sequences of DNA (c1) to (c5) 10 or less, more preferably 1 or more and 8 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 4 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, more preferably 1 or 2
  • ⁇ 18> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 17>, wherein the host of the transformant is a microorganism. ⁇ 19> The method according to ⁇ 18>, wherein the microorganism is Escherichia coli. ⁇ 20> The method according to ⁇ 18>, wherein the microorganism is a microalgae. ⁇ 21> The method according to ⁇ 20>, wherein the microalgae are algae belonging to the genus Nannochloropsis, preferably Nannochloropsis oculata.
  • the lipid is a medium-chain fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, preferably a fatty acid having 8 to 16 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 12 to 16 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably.
  • a fatty acid having 12 to 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof more preferably a fatty acid having 12 and 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, still more preferably a fatty acid having 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof,
  • the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 21>.
  • ⁇ 24> A gene encoding the protein according to ⁇ 23>.
  • ⁇ 25> A gene comprising any one of DNA (a) to (c) defined in any one of ⁇ 1> to ⁇ 22>.
  • ⁇ 26> A recombinant vector containing the gene according to ⁇ 24> or ⁇ 25>.
  • ⁇ 27> A transformant obtained by introducing the gene according to ⁇ 24> or ⁇ 25> or the recombinant vector according to ⁇ 26> into a host.
  • ⁇ 28> A method for producing a transformant, wherein the gene according to ⁇ 24> or ⁇ 25> or the recombinant vector according to ⁇ 26> is introduced into a host.
  • ⁇ 29> A transformant that promotes the expression of the gene according to ⁇ 24> or ⁇ 25>.
  • ⁇ 30> The transformant according to any one of ⁇ 27> to ⁇ 29> or a method for producing the transformant, wherein a host of the transformant is a microorganism.
  • ⁇ 31> The transformant according to ⁇ 30> or the method for producing the same, wherein the microorganism is Escherichia coli.
  • ⁇ 32> The transformant according to ⁇ 30> or a method for producing the same, wherein the microorganism is a microalgae.
  • ⁇ 33> The transformant according to ⁇ 32> or the method for producing the same, wherein the microalgae is an algae belonging to the genus Nannochloropsis, preferably Nannochloropsis oculata.
  • the lipid is a medium chain fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, preferably a fatty acid having 8 to 16 carbon atoms or a fatty acid ester thereof, more preferably a fatty acid having 12 to 16 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, More preferably a fatty acid having 12 to 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 12 and 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, still more preferably a fatty acid having 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof,
  • the use according to ⁇ 34> above, comprising ⁇ 36> A method for modifying a fatty acid composition in a lipid, comprising a step
  • Example 1 Acquisition of acyl-ACP thioesterase gene, transformation of E. coli, and production of lipid by transformant
  • Acquisition of acyl-ACP thioesterase gene derived from Nannochloropsis oculata Nannochloropsis oculata NIES2145 strain Total RNA from National Institute for Environmental Studies (NIES) is extracted, and cDNA is obtained by reverse transcription using SuperScript TM III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR (manufactured by Invitrogen). It was.
  • cDNA Using this cDNA as a template, a gene fragment consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 was obtained by PCR using the primer pair of primer No. 3 and primer No. 4 shown in Table 1.
  • NoTE2 gene this gene is referred to as NoTE2 gene, and the protein encoded by the gene is referred to as NoTE2 (SEQ ID NO: 1).
  • pBluescriptII SK (-) was amplified by PCR using the plasmid vector pBluescriptII SK (-) (manufactured by Stratagene) as a template and the primer pair of primer number 5 and primer number 6 shown in Table 1, and the restriction enzyme Dpn I
  • the mold was digested by treatment (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). These two fragments were purified using High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science) and then fused using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech).
  • Transformation into a competent cell manufactured by Takara Bio Inc.
  • plasmid extraction and confirmation of the base sequence of the cloned fragment were performed to prepare a plasmid in which the full length of the NoTE2 gene was cloned.
  • NoTE2 gene expression plasmid In the amino acid sequence of NoTE2 shown in SEQ ID NO: 1, the vicinity of N-terminal positions 1 to 73 was estimated to be a chloroplast translocation signal sequence. Therefore, a plurality of NoTE2 gene expression plasmids were constructed in which the N-terminal region containing the putative chloroplast transition signal sequence was deleted at various lengths. Using the plasmid as a template, PCR was performed using a primer pair of any one of the primer numbers 7 to 12 shown in Table 1 and the primer number 5 primer, and the resulting gene fragment was obtained in the same manner as described above.
  • plasmids NoTE2_61, NoTE2_71, NoTE2_74, NoTE2_81, NoTE2_91, and NoTE2_101 for NoTE2 gene expression were constructed.
  • the plasmid NoTE2_61 was constructed so as to remove the amino acid sequence from the 1st to 60th positions on the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the NoTE2 gene was converted into the amino acid sequence from positions 61 to 348 of SEQ ID NO: 1. It has the corresponding nucleotide sequence and nucleotide sequence from position 181 to position 1047 of SEQ ID NO: 2 corresponding to the stop codon.
  • the plasmid NoTE2_71, the plasmid NoTE2_74, the plasmid NoTE2_81, the plasmid NoTE2_91, and the plasmid NoTE2_101 are 1 to 70 positions, 1 to 73 positions, 1 to 80 positions, and 1 to 90 positions on the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Or an amino acid sequence at positions 1 to 100 was removed.
  • the amino acid sequence at positions 1 to 29 on the N-terminal side of the LacZ protein derived from the plasmid vector pBluescriptII SK (-) is upstream of the site from which the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has been removed. It was constructed to express the fused protein.
  • the obtained colonies were inoculated into 2 mL of Overnight Express Instant TB Medium (Novagen) (containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin sodium), and cultured with shaking at 160 ° C. (160 rpm). After 24 hours of culture, the lipid components contained in the culture solution were analyzed by the following method. As a negative control, the same experiment was performed for E. coli K27 strain transformed with the plasmid vector pBluescriptII SK (-).
  • Nitrogen gas was blown onto the resulting chloroform layer to dry it, 0.7 mL of 0.5N potassium hydroxide / methanol solution was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 1 mL of a methanol solution of 14% boron trifluoride (manufactured by SIGMA) was added and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 0.5 mL each of hexane and saturated saline was added and stirred vigorously. After standing at room temperature for 10 minutes or longer, the upper hexane layer was recovered to obtain a fatty acid methyl ester.
  • the fatty acid methyl ester was identified by subjecting the sample to gas chromatograph mass spectrometry analysis under the same conditions.
  • the amount of methyl ester of each fatty acid was quantified from the peak area of the waveform data obtained by gas chromatography analysis.
  • Each peak area was compared with the peak area of 7-pentadecanone, which is an internal standard, to correct between samples, and the amount of each fatty acid per liter of culture solution was calculated.
  • the sum total of each fatty acid amount was made into the total fatty acid amount, and the ratio of each fatty acid amount which occupies for the total fatty acid amount was computed.
  • Table 3 The results are shown in Table 3.
  • TFA represents the total fatty acid content
  • Fatty Acid Composition (% TFA)” represents the ratio (weight percent) of each fatty acid to the total fatty acid.
  • Cx: y represents a fatty acid having x carbon atoms and y double bonds
  • C17: 0 ⁇ ” and “C19: 0 ⁇ ” are cis-9,10-methylenehexadecanoic acid, respectively. (Cis-9,10-Methylen-hexadecanoic acid) and cis-11,12-methyleneoctadecanoic acid.
  • the proportions of C12: 0 fatty acid, C14: 1 fatty acid, C14: 0 fatty acid, and C16: 1 fatty acid in the fatty acid increased greatly.
  • the ratio of C14 fatty acids was significantly increased.
  • the total fatty acid amount (TFA) was also increased in these NoTE2 gene expression plasmid-introduced strains. From these results, it was confirmed that the protein encoded by the gene introduced into plasmid NoTE2_61, NoTE2_71, NoTE2_74, NoTE2_81, or NoTE2_91 has acyl-ACP thioesterase activity. In addition, since these proteins markedly increased the ratio and production amount of C12 fatty acid and C14 fatty acid, they are considered to be acyl-ACP thioesterases having high specificity for C12 fatty acid and C14 fatty acid, particularly C14 fatty acid. .
  • the fatty acid composition hardly changed and the total fatty acid amount did not increase as compared with the negative control. From this, it is considered that the protein encoded by the gene introduced into the plasmid NoTE2_101 has almost no acyl-ACP thioesterase activity. From the above results, it is recognized that a protein having at least the 91st to 348th regions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 exhibits acyl-ACP thioesterase activity.
  • Example 2 Transformation of Nannochloropsis oculata with an acyl-ACP thioesterase gene derived from Nannochloropsis oculata, and production of lipid by the transformant (1) Construction of plasmid for expression of zeocin resistance gene Zeocin resistance gene (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 13) and a tubulin promoter sequence (SEQ ID NO: 14) derived from the Nannochloropsis gaditana CCMP526 strain described in the literature (Randor Radakovits, et al., Nature Communications, DOI: 10.1038 / ncomms1688, 2012).
  • PCR was performed using the primer pair of primer number 15 and primer number 16 and the primer pair of primer number 17 and primer number 18 shown in Table 2, and the zeocin resistance gene and the tubulin promoter sequence were obtained. Each was amplified. Further, PCR was performed using the genome of Nannochloropsis oculata NIES2145 strain as a template and the primer pair of primer number 19 and primer number 20 shown in Table 2 to amplify the heat shock protein terminator sequence (SEQ ID NO: 21).
  • PCR was carried out using the primer pair of primer number 22 and primer number 23 shown in Table 2 to amplify the plasmid vector pUC19.
  • PCR was performed using the above-mentioned zeocin resistance gene expression plasmid as a template and the primer pair of primer number 32 and primer number 23 shown in Table 2, and a zeocin resistance gene expression cassette (tubulin promoter sequence, zeocin resistance gene, heat The fragment consisting of the shock protein terminator sequence) and the pUC19 sequence was amplified.
  • NoTE2 gene expression plasmid (NoTE2-Nanno).
  • the plasmid consists of an LDSP promoter sequence, a NoTE2 gene, a VCP1 terminator sequence, a tubulin promoter sequence, a zeocin resistance gene, and a heat shock protein terminator sequence in that order, and a pUC19 vector sequence.
  • a gene fragment was obtained by PCR using the NoTE2 gene expression plasmid (NoTE2-Nanno) as a template and the primer pair of primer number 33 and primer number 27 shown in Table 2. Further, PCR using the primer pair of primer number 34 and primer number 35 shown in Table 2 was performed using the cDNA of Nannochloropsis oculata strain NIES2145 as a template, and a VCP1 chloroplast transition signal (SEQ ID NO: 36) was obtained. . These fragments were fused in the same manner as described above to construct a NoTE2 gene Nannochloropsis expression plasmid (NoTE2_74-Nanno).
  • This plasmid is a NoTE2 gene (hereinafter referred to as “NoTE2_74 gene”) in which the LDSP promoter sequence and VCP1 chloroplast translocation signal are linked to the 5 ′ end of the nucleotide sequence encoding positions 74 to 348 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. "), A VCP1 terminator sequence, a tubulin promoter sequence, a zeocin resistance gene, a heat shock protein terminator sequence in that order, and a pUC19 vector sequence.
  • NoTE2 gene expression cassette into Nannochloropsis oculata Primers No. 20 and No. 26 shown in Table 2 using the aforementioned NoTE2 gene expression plasmids (NoTE2-Nanno and NoTE2_74-Nanno) as templates, respectively.
  • PCR using the pair was performed to amplify the NoTE2 gene expression cassette (DNA fragment consisting of LDSP promoter sequence, NoTE2 gene or NoTE2_74 gene, VCP1 terminator sequence, tubulin promoter sequence, zeocin resistance gene, heat shock protein terminator sequence).
  • the amplified DNA fragment was purified using High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science). Note that sterilized water was used for elution during purification, not the elution buffer included in the kit.
  • Nannochloropsis oculata strain NIES2145 were washed with a 384 mM sorbitol solution to completely remove salts, and used as host cells for transformation.
  • About 500 ng of the NoTE2 gene expression cassette amplified above was mixed with the host cells, and electroporation was performed under the conditions of 50 ⁇ F, 500 ⁇ , and 2,200 v / 2 mm.
  • the mixture was applied to a 2 ⁇ g / mL zeocin-containing f / 2 agar medium, and cultured at 25 ° C. in a 0.3% CO 2 atmosphere under 12 h / 12 h light / dark conditions for 2 to 3 weeks.
  • those containing the NoTE2 gene expression cassette were selected by PCR.
  • N15P5 medium a nitrogen concentration of f / 2 medium increased 15 times and a phosphorus concentration increased 5 times.
  • the seed culture solution was cultured under shaking at 25 ° C. in a 0.3% CO 2 atmosphere for 12 weeks under 12 h / 12 h light / dark conditions.
  • 2 mL of the seed culture solution was transferred to 18 mL of N15P5 medium, and cultured with shaking for 1 week in a 12 h / 12 h light / dark condition at 25 ° C. in a 0.3% CO 2 atmosphere.
  • Nitrogen gas was blown onto the resulting chloroform layer to dry it, 0.7 mL of 0.5N potassium hydroxide / methanol solution was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 1 mL of 14% boron trifluoride methanol solution (manufactured by SIGMA) was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 0.5 mL of hexane and 1 mL of saturated saline were added and stirred vigorously, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. The upper hexane layer was recovered to obtain a fatty acid methyl ester.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

【課題】中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法を提供する。 【解決手段】宿主に下記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が導入されている形質転換体を培養し、培養物から脂質を採取する、脂質の製造方法。 (A)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。 (B)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。 (C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。

Description

アシル－ＡＣＰチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法
　本発明は、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法に関する。また、本発明は当該方法に用いるアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ、これをコードする遺伝子、及び該遺伝子を導入した形質転換体に関する。
　脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
　例えば、炭素数１２～１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤又は殺菌剤に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤等に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤として日常的に利用されている。さらに、炭素数１８前後の高級アルコールは植物の成長促進剤としても有用である。
　このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたり、そのため植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素数に依存するため、脂肪酸の炭素数、即ち鎖長を制御する試みも行われている。
　例えば、ゲッケイジュ（Umbellularia　californica（California　bay））由来のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼの導入により炭素数１２の脂肪酸を蓄積させる方法（特許文献１、非特許文献１）等が提案されている。
　近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。
　藻類の脂質合成メカニズムやそれを応用した生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。例えば、上述のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼについても、現在のところ、藻類由来のものはほとんど報告されておらず、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属等でわずかに報告例があるのみである（例えば、特許文献２）。
国際公開第９２／２０２３６号 国際公開第２０１４／１０３９３０号
Voelker　TA，et　al.，Science，1992，vol．257(5066)，p．72-74
　本発明は、宿主に下記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が導入されている形質転換体を培養し、培養物から脂質を採取する、脂質の製造方法に関する。
(A)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
　また、本発明は、前記タンパク質(A)～(C)（以下、本発明のタンパク質又はアシル－ＡＣＰチオエステラーゼともいう。）に関する。
　また、本発明は、前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子（以下、本発明の遺伝子ともいう。）に関する。
　また、本発明は、前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を宿主に導入してなる形質転換体に関する。
　本発明の上記及び他の特徴及び利点は、下記の記載からより明らかになるであろう。
　本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、藻類由来のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法の提供に関する。
　また、本発明は、前記方法に好適に用いることができる、藻類由来の新規アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ、及びこれをコードする遺伝子の提供に関する。
　また、本発明は、前記遺伝子の発現を促進させ、脂質の生産性又は脂肪酸組成が変化した形質転換体の提供に関する。
　本発明者は、藻類由来の新たなアシル－ＡＣＰチオエステラーゼについて研究を行った。その結果、ナンノクロロプシス属に属する藻類から、新規のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ及びこれをコードするアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を見出した。そして、当該アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を用いて形質転換を行った結果、形質転換体において、脂質中の総脂肪酸成分における特定の脂肪酸の含有率が有意に向上することを見出した。
　本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
　本発明によれば、新規アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ、これをコードする遺伝子、及び当該遺伝子が導入されている形質転換体を提供することができる。当該形質転換体を用いた本発明の製造方法は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。特に、本発明の製造方法は、炭素数が８～１６、好ましくは炭素数が１２～１６、より好ましくは炭素数が１２～１４、より好ましくは炭素数が１２及び１４、より好ましくは炭素数が１４の脂肪酸、又はこれらを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
　本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ、これをコードする遺伝子、形質転換体、及び製造方法は、脂肪酸又は脂質の工業的生産に好適に用いることができる。
　本発明において「脂質」には、単純脂質、複合脂質及び誘導脂質が含まれ、具体的には、脂肪酸、脂肪族アルコール類、炭化水素類（アルカン等）、中性脂質（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等が含まれる。
　また本明細書において、脂肪酸や脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数がｘで二重結合の数がｙであることを表す。「Ｃｘ」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
　さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search　homology）プログラムを用いて、Unit　size　to　compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
　また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular　Cloning－A　LABORATORY　MANUAL　THIRD　EDITION［Joseph　Sambrook，David　W．Russell.，Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
　また、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。
　さらに本明細書において「中鎖」とは、脂肪酸又は脂肪酸残基の炭素数が８以上１６以下であることをいう。
　以下、本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ、これを用いた形質転換体及び脂質の製造方法について順に説明する。
１．アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ
　本発明のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列中の少なくとも９１位～３４８位までのアミノ酸配列を有するタンパク質、及び当該タンパク質と機能的に均等なタンパク質である。
　アシル－ＡＣＰ（アシルキャリヤープロテイン）チオエステラーゼは、脂肪酸やその誘導体（トリアシルグリセロール（トリグリセリド）等）の生合成系に関与する酵素である。当該酵素は、植物体や藻類では葉緑体等の色素体内において、細菌・真菌や動物体では細胞質内において、脂肪酸生合成過程の中間体であるアシル－ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリヤープロテインとからなる複合体）のチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する。アシル－ＡＣＰチオエステラーゼの作用によって、ＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。
　アシル－ＡＣＰチオエステラーゼには、基質であるアシル－ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼが存在していることが知られている。よってアシル－ＡＣＰチオエステラーゼは、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
　本発明において、「アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性」とは、アシル－ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
　本発明のタンパク質として、具体的には以下のタンパク質(A)～(C)が挙げられる。
(A)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
　配列番号１は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis　oculata）由来のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、NoTE2とも略記する）のアミノ酸配列である。
　本発明者は、配列番号１のアミノ酸配列中、９１位～３４８位の領域がアシル－ＡＣＰチオエステラーゼとして機能するために重要で、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を示すために十分な領域であることを見出した。すなわち、配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質、及び当該配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質は、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する。
　タンパク質(A)は、このアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性にとって十分な領域を有し、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼとして機能する。
　タンパク質(B)は、配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する。
　一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
　タンパク質(B)において、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性の点から、配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列との同一性は、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９６％以上がよりさらに好ましく、９７％以上がよりさらに好ましく、９８％以上がよりさらに好ましく、９９％以上がよりさらに好ましい。
　また、タンパク質(B)において、配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列としては、配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列において１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、よりさらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上８個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上４個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下、よりさらに好ましくは１又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列が挙げられる。
　なお、アミノ酸配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法については、後述する。
　タンパク質(C)は、そのアミノ酸配列の一部として前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を含み、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を示す。タンパク質(C)は、前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列以外の配列を含んでいてもよい。
　タンパク質(C)を構成するアミノ酸配列中、前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列以外の配列としては、例えば、配列番号１のうちの９１位～３４８位以外の任意のアミノ酸配列、配列番号１のうちの９１位～３４８位以外の任意のアミノ酸配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１若しくは数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１若しくは２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列、等が挙げられる。これらの配列は、前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列のＮ末端側に付加されることが好ましい。
　また、タンパク質(C)として、前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列にタンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も好ましい。シグナルペプチドの付加の例としては、葉緑体移行シグナルペプチドのＮ末端への付加等が挙げられる。
　前記タンパク質(C)として、配列番号１の１～９０位の任意の位置でＮ末端側のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
　さらに、特定の脂肪酸、例えば中鎖脂肪酸、具体的には炭素数が１２又は１４の脂肪酸、の生産性の点からは、タンパク質(C)としては、下記タンパク質(C1)～(C7)が好ましい。
(C1)配列番号１の１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C2)配列番号１の６１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C3)配列番号１の７１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C4)配列番号１の７４位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C5)配列番号１の８１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C6)前記タンパク質(C1)～(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(C7)前記タンパク質(C1)～(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
　なお、前記タンパク質(C1)～(C5)がアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは、本発明者により確認されている。
　タンパク質がアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結したＤＮＡを脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
　また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入したアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan　L，et　al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1995，vol．92(23)，p．10639-10643）によって調製した各種アシル－ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を測定することができる。
　本発明のタンパク質の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的或いは遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、化学合成によりタンパク質合成を行ってもよく、遺伝子組み換え技術により組換えタンパク質を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を用いることができる。
　また、ナンノクロロプシス・オキュラータ等のナンノクロロプシス属に属する藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することもできる。例えば、The　culture　collection　of　algae　at　University　of　Texas　at　Austin（UTEX）、独立行政法人国立環境研究所（NIES）、National　Center　for　Marine　Algae　and　Microbiota（NCMA：旧CCMP)、Culture　Collection　of　Algae　and　Protozoa（CCAP）、Australian　National　Algae　Culture　Collection（CSIRO）等から入手できる。
２．アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子
　本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子は、前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子である。
　タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の例として、配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。配列番号２に示す塩基配列は、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の塩基配列の一例であり、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする。そして配列番号２の２７１位～１０４４位の塩基配列は、配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列をコードする。なお、配列番号２の１０４５位～１０４７位の塩基配列は終止コドンであり、アミノ酸には対応していない。
　前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の具体例として、下記ＤＮＡ(a)～(c)のいずれか１つからなる遺伝子が例示できる。しかし、本発明はこれらに限定されるものではない。
(a)配列番号２の２７１位～１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(b)配列番号２の２７１位～１０４７位の塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c)前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　ＤＮＡ(b)において、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性の点から、配列番号２の２７１位～１０４７位の塩基配列との同一性は、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９６％以上がよりさらに好ましく、９７％以上がよりさらに好ましく、９８％以上がよりさらに好ましく、９９％以上がよりさらに好ましい。
　また、ＤＮＡ(b)において、配列番号２の２７１位～１０４７位の塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列としては、配列番号２の２７１位～１０４７位の塩基配列において１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列が挙げられる。
　塩基配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing　overlap　extension（SOE）PCR（Horton　et　al.，Gene，1989，vol．77，p．61-68）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh　et　al.，Gene，1995，vol．152，p．271-276）、Kunkel法（Kunkel，T．A.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1985，vol．82，p．488）等が挙げられる。また、Site-Directed　Mutagenesis　System　Mutan-SuperExpress　Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer　TM　Site-Directed　Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis　Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
　さらにＤＮＡ(b)として、ＤＮＡ(a)と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　ＤＮＡ(c)は、その塩基配列の一部として前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列を含み、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。ＤＮＡ(c)は、前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列以外の配列を含んでいてもよい。
　ＤＮＡ(c)の塩基配列中、前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列以外の配列としては、例えば、配列番号２のうちの２７１位～１０４７位以外の任意の塩基配列、配列番号２のうちの２７１位～１０４７位以外の任意の塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列、又は配列番号２のうちの２７１位～１０４７位以外の任意の塩基配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１若しくは２個、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列、等が挙げられる。
　また、前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列以外の配列としては、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドをコードする塩基配列も好ましい。シグナルペプチドとしては、前記タンパク質(C)で述べたものが挙げられる。
　これらの配列は、前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列の5'末端側に付加されることが好ましい。
　前記ＤＮＡ(c)として、配列番号２の１～２７０位の任意の位置で5'末端側が欠失した塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。
　さらに、特定の脂肪酸、例えば中鎖脂肪酸、具体的には炭素数が１２又は１４の脂肪酸、の生産性の点からは、ＤＮＡ(c)としては、下記ＤＮＡ(c1)～(c7)が好ましい。
(c1)配列番号２の１位～１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c2)配列番号２の１８１位～１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c3)配列番号２の２１１位～１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c4)配列番号２の２２０位～１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c5)配列番号２の２４１位～１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c6)前記ＤＮＡ(c1)～(c5)のいずれか１つの塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c7)前記ＤＮＡ(c1)～(c5)のいずれか１つの塩基配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　なお、前記ＤＮＡ(c1)～(c5)のいずれか１つからなる遺伝子がアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードしていることは、本発明者により確認されている。
　本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の取得方法としては、特に制限されず、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいて、人工合成により遺伝子を取得することができる。遺伝子の人工合成は、例えば、ユーロフィンジェノミクス社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス・オキュラータからクローニングによって取得することもでき、例えば、Molecular　Cloning－A　LABORATORY　MANUAL　THIRD　EDITION［Joseph　Sambrook，David　W.　Russell，Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
３．形質転換体
（１）第１の態様
　本発明の形質転換体の第１の態様は、前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体である。
　当該形質転換体では、脂質の生産能、特に炭素数が１２～１６の中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産能（中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産量、生産される全脂肪酸に占める中鎖脂肪酸の割合、生産される全脂質に占める中鎖脂肪酸を構成成分とする脂質の割合）が有意に向上する。また、当該形質転換体では、宿主と比べ、脂質中の脂肪酸組成（生産される全脂肪酸に対する特定の脂肪酸の割合、生産される全脂質に占める特定の脂肪酸を構成成分とする脂質の割合）が変化する。そのため、当該形質転換体を用いた本発明は、特定の脂質、特に中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素数８以上１６以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素数１２以上１６以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素数が１２以上１４以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、よりさらに好ましくは炭素数が１２及び１４の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、よりさらに好ましくは炭素数が１４の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、の生産に好適に用いることができる。
　さらに、本態様の形質転換体は、宿主自体に比べ、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上する。そのため、当該形質転換体を用いた本発明は、脂質の生産に好適に用いることができる。
　なお、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼの脂肪酸又は脂質の生産能については、実施例で用いた方法により測定することができる。また本明細書において、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させたものを「形質転換体」ともいい、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
　アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現を促進させる方法としては、常法より適宜選択することができる。例えば、前記アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を宿主に導入する方法、前記アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域（プロモーター、ターミネーター等）を改変する方法、などが挙げられる。
　アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
　本発明で好ましく用いることができる形質転換体は、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することで得られる。具体的には、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
　形質転換体の宿主としては特に限定されず、通常用いられるものより適宜選択することができる。例えば、微生物（藻類や微細藻類を含む）、植物体、又は動物体を用いることができる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましい。
　前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物、バシラス（Bacillus）属に属する微生物、シネコシスティス（Synechocystis）属の微生物、シネココッカス（Synechococcus）属の微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、エシェリキア属に属する微生物である大腸菌（Escherichia　coli）、バシラス属に属する微生物である枯草菌（Bacillus　subtilis）、酵母に属する微生物である赤色酵母（Rhodosporidium　toruloides）、又は糸状菌に属する微生物であるモルチエレラ・エスピー（Mortierella　sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
　前記藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属に属する藻類、クロレラ（Chlorella）属に属する藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属に属する藻類、又はナンノクロロプシス属に属する藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属に属する藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属に属する藻類として具体的には、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis　gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis　salina）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis　oceanica）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis　atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis　maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis　granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis　sp．）、等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
　前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis　thaliana）、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
　遺伝子発現用プラスミドベクター又は遺伝子発現カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
　具体的なベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS）　II　SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T．et　al.,（1986），Plasmid　15（2）；p．93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、又はpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript　II　SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
　藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas　Center）、P-322（Chlamydomonas　Center）、pPha-T1（Yangmin　Gong，et　al.，Journal　of　Basic　Microbiology，2011，vol．51，p．666-672参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver　Kilian,　et　al.，Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences　of　the　United　States　of　America，2011，vol．108(52)記載の方法を参考にして、本発明の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片や制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。
　植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、又はIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
　また、前記に組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターやターミネーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、カリフラワーモザイクウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質ＶＣＰ１遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Oliver　Kilian，et　al.，Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences　of　the　United　States　of　America，2011，vol．108(52)）、又はナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ（lipid　droplet　surface　protein）遺伝子のプロモーター（Astrid　Vieler，et　al.，PLOS　Genetics，2012;8(11):e1003064．doi：10.1371）が挙げられる。
　また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
　目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって行うことができる。また、発現ベクターを構築する際には、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子に加え、当該遺伝子の翻訳に有用な配列、例えば開始コドンや終止コドンに相当する配列等を適宜補うことができる。
　形質転換方法としては、宿主に目的遺伝子を導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS　Microbiol．Lett．55，135（1990））又はLP形質転換方法（T．Akamatsu，et　al.，Archives　of　Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu，et　al.，Bioscience，Biotechnology，and　Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）等を用いることができる。宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Randor　Radakovits，et　al.，Nature　Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012、に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
　目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
　アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域を改変して、前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
　「発現調節領域」とは、プロモーターやターミネーターを示し、これらの配列は一般に隣接する遺伝子の発現量（転写量、翻訳量）の調節に関与している。ゲノム上に前述のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を有する宿主においては、当該遺伝子の発現調節領域を改変して前記アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現を促進させることで、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
　発現調節領域の改変方法としては、例えばプロモーターの入れ替えが挙げられる。ゲノム上に前述のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子のプロモーター（以下、「アシル－ＡＣＰチオエステラーゼプロモーター」ともいう）を、より転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現を促進させることができる。例えば、ゲノム上にアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を有する宿主の１つであるナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株においては、配列番号３７に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が存在しており、配列番号３７に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にプロモーター領域が存在している。この配列番号３７に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の一部又は全部をより転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現を促進させることができる。
　アシル－ＡＣＰチオエステラーゼプロモーターの入れ替えに用いるプロモーターとしては特に限定されず、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼプロモーターよりも転写活性が高く、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産に適したものから適宜選択することができる。
　宿主としてナンノクロロプシスを用いる場合には、チューブリンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、上述のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）、及びナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターを好ましく用いることができる。中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性向上の観点から、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター及びＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターがより好ましい。
　前述のプロモーターの改変は、相同組換えなどの常法に従い行うことができる。具体的には、標的とするプロモーターの上流、下流領域を含み、標的プロモーターに代えて別のプロモーターを含む直鎖状のDNA断片を構築し、これを宿主細胞に取り込ませ、宿主ゲノムの標的プロモーターの上流側と下流側とで２回交差の相同組換えを起こす。その結果、ゲノム上の標的プロモーターが別のプロモーター断片と置換され、プロモーターを改変することができる。
　このような相同組換えによる標的プロモーターの改変方法は、例えば、Besher　et　al.，Methods　in　molecular　biology，1995，vol．47，p．291-302等の文献を参考に行うことができる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Oliver　Kilian，et　al.，Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences　of　the　United　States　of　America，2011，vol．108(52)等の文献を参考にして、相同組換え法によりゲノム中の特定の領域を改変することができる。
（２）第２の態様
　本発明の形質転換体の第２の態様は、本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制された形質転換体である。当該形質転換体（以下、「第２の態様の形質転換体」ともいう）は、宿主中の前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を、欠失、変異又は発現抑制することで得られる。
　第２の態様の形質転換体の宿主としては、本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を有するものであればよく、微生物、植物体、又は動物体を用いることができる。なかでも、脂質の製造効率の点から、微生物が好ましく、大腸菌又は微細藻類がより好ましい。
　前記微細藻類としては、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス属に属する藻類が好ましい。ナンノクロロプシス属に属する藻類として具体的には、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・アトムス、ナンノクロロプシス・マキュラタ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、又はナンノクロロプシス・エスピー、等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
　宿主ゲノムから本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を欠失、変異又は発現抑制する方法としては、標的遺伝子の一部若しくは全部をゲノム中から除去する又は他の遺伝子と置き換える、当該遺伝子中に他のＤＮＡ断片を挿入する、当該遺伝子の活性部位・基質結合部位又は転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行うことができる。
　上記の欠失・変異・発現抑制方法は、例えば、相同組換えを用いて行うことができる。具体的には、標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを宿主細胞内に取り込ませて宿主ゲノムの標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失あるいは他の遺伝子断片と置換させることができる。また、塩基置換や塩基挿入等の変異を導入した標的遺伝子をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを宿主細胞内に取り込ませて宿主ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子の機能を低下又は消失させることができる。また、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを宿主細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって宿主ゲノム上の標的遺伝子を分断して、その機能を低下又は消失させることができる。
　このような相同組換えによる標的遺伝子の欠失・変異・発現抑制方法は、例えば、Besher　et　al.,　Methods　in　molecular　biology，1995，vol．47，p.291-302等の文献を参考に行うことができる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Oliver　Kilian，et　al.，Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences　of　the　United　States　of　America，2011，108(52)等の文献を参考にして、相同組換え法によりゲノム中の特定の遺伝子を欠失又は破壊することができる。
　目的遺伝子が欠失等した形質転換体の選択は、形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出して、目的遺伝子部位を含む領域を対象としてＰＣＲを行う方法、又は目的遺伝子領域に結合するＤＮＡプローブを用いたサザンブロッティング法、等により行うことができる。
　第２の態様の形質転換体は、本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が機能しないため、産出される脂質の脂肪酸組成が宿主本来の組成から変化すると考えられる。すなわち、当該形質転換体は、脂質中の脂肪酸組成が改変された脂質を生産することができる。
４．脂質の製造方法
　本発明の第１の態様の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を効率よく製造することができる。
　本発明の脂質の製造方法は、脂質の生産性向上の観点から、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体を適切な条件にて培養して培養物を得る工程、及び得られた培養物から脂質を採取する工程を含むことが好ましい。
　なお、本発明において形質転換体を培養するとは、微生物、藻類、植物体、動物体、及びそれらの細胞や組織を培養、生育することをいい、植物体を土壌等で栽培することも含まれる。ここで「培養物」とは、培養液の他に、培養等した後の形質転換体そのものも含まれる。
　培養条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。
　また、脂質の生産効率の点から、培地中に、例えばアシル－ＡＣＰチオエステラーゼの基質或いは脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
　一例として、大腸菌を宿主として用いた形質転換体の場合、ＬＢ培地又はOvernight　Express　Instant　TB　Medium（Novagen社）で、３０～３７℃、０．５～１日間培養を行うことが挙げられる。
　また、シロイヌナズナを宿主として用いた形質転換体の場合、土壌で温度条件２０～２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１～２か月間栽培を行うことが挙げられる。
　形質転換の宿主が藻類の場合、培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、生育性の点から、培地当り１～５０％（vol/vol）が好ましく、１～１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５～４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０～３５℃であり、より好ましくは１５～３０℃である。
　また、藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１００～５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００～１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００～６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８～２４時間、より好ましくは１０～１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
　また、藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）～１０％が好ましく、より好ましくは０．０５～５％、さらに好ましくは０．１～３％、よりさらに好ましくは０．３～１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１～５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５～２質量％、さらに好ましくは０．１～１質量％である。
　培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３～９０日間、より好ましくは３～３０日間、さらに好ましくは７～３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気攪拌培養が好ましい。
　形質転換体において産生された脂質を採取する方法としては、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法、例えば、前述の培養物や形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物や形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
　本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼは、中鎖アシル－ＡＣＰ、さらにはＣ１２～Ｃ１６アシル－ＡＣＰ、特にＣ１２とＣ１４アシル－ＡＣＰに対する特異性が高い。本発明の第１の態様の形質転換体では、総脂肪酸成分における炭素数８～１６の脂肪酸、好ましくは炭素数１２～１６の脂肪酸の含有率、より好ましくは炭素数１２～１４の脂肪酸、より好ましくは炭素数１２と１４の脂肪酸、より好ましくは炭素数１４の脂肪酸、の含有率が増加する。そのため、当該形質転換体を用いた本発明の製造方法は、脂質生産、特に中鎖脂肪酸、好ましくは炭素数８～１６の脂肪酸、より好ましくは炭素数１２～１６の脂肪酸、より好ましくは炭素数１２～１４の脂肪酸、より好ましくは炭素数１２及び１４の脂肪酸、より好ましくは炭素数１４の脂肪酸、又はこれを構成成分とする脂質の生産に好適に用いることができる。
　本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。具体的には本発明の製造方法において製造される脂質は、好ましくは炭素数が８以上１６以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２以上１６以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２及び１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む。脂質中に含まれる脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物は、界面活性剤等への利用性から炭素数８～１６の脂肪酸又はその脂肪酸エステルが好ましく、炭素数１２～１６の脂肪酸又はその脂肪酸エステルがより好ましく、炭素数１２～１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素数１２及び炭素数１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素数１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましい。
　脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、トリアシルグリセロールがさらにより好ましい。
　本発明の製造方法、形質転換体により得られる脂肪酸や脂質は、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
　上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、形質転換体、タンパク質、遺伝子を開示する。
＜１＞　宿主に下記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が導入されている形質転換体を培養し、培養物から脂質を採取する、脂質の製造方法。
(A)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
＜２＞　宿主に前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を導入する工程を含む、形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる方法。
＜３＞　前記脂質が中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質である、前記＜２＞記載の方法。
＜４＞　宿主に前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
＜５＞　前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の発現が促進されている形質転換体を培養し、培養物から脂質を採取する、脂質の製造方法。
＜６＞　前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させる工程を含む、形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる方法。
＜７＞　前記脂質が中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質である、前記＜６＞記載の方法。
＜８＞　前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させて、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
＜９＞　前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる、前記＜５＞～＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１０＞　前記タンパク質(B)において、配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列との同一性が８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上である、前記＜１＞～＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞　前記タンパク質(B)が、配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、よりさらに好ましくは１又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、前記＜１＞～＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
＜１２＞　前記タンパク質(C)が、配列番号１の１～９０位の任意の位置でＮ末端側のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなる、前記＜１＞～＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１３＞　前記タンパク質(C)が下記タンパク質(C1)～(C7)のいずれか１つである、前記＜１＞～＜９＞のいずれか１項記載の方法。
(C1)配列番号１の１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C2)配列番号１の６１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C3)配列番号１の７１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C4)配列番号１の７４位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C5)配列番号１の８１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C6)前記タンパク質(C1)～(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(C7)前記タンパク質(C1)～(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
＜１４＞　前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ(a)～(c)のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜１＞～＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
(a)配列番号２の２７１位～１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(b)配列番号２の２７１位～１０４７位の塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c)前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１５＞　前記ＤＮＡ(b)が、前記ＤＮＡ(a)の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１若しくは２個、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ(a)と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、である、前記＜１４＞項記載の方法。
＜１６＞　前記ＤＮＡ(c)が、配列番号２の１～２７０位の任意の位置で5'末端側が欠失した塩基配列からなる、前記＜１４＞項記載の方法。
＜１７＞　前記ＤＮＡ(c)が、下記ＤＮＡ(c1)～(c7)のいずれか１つである、前記＜１４＞項記載の方法。
(c1)配列番号２の１位～１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c2)配列番号２の１８１位～１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c3)配列番号２の２１１位～１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c4)配列番号２の２２０位～１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c5)配列番号２の２４１位～１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c6)前記ＤＮＡ(c1)～(c5)のいずれか１つの塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c7)前記ＤＮＡ(c1)～(c5)のいずれか１つの塩基配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１８＞　前記形質転換体の宿主が微生物である、前記＜１＞～＜１７＞のいずれか１項記載の方法。
＜１９＞　前記微生物が大腸菌である、前記＜１８＞項記載の方法。
＜２０＞　前記微生物が微細藻類である、前記＜１８＞項記載の方法。
＜２１＞　前記微細藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜２０＞項記載の方法。
＜２２＞　前記脂質が、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素数が８以上１６以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは１２以上１６以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２及び１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、よりさらに好ましくは炭素数１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、前記＜１＞～＜２１＞のいずれか１項記載の方法。
＜２３＞　前記＜１＞～＜２２＞のいずれか１項で規定した、タンパク質(A)～(C)。
＜２４＞　前記＜２３＞項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜２５＞　前記＜１＞～＜２２＞のいずれか１項で規定した、ＤＮＡ(a)～(c)のいずれか１つからなる遺伝子。
＜２６＞　前記＜２４＞又は＜２５＞項記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
＜２７＞　前記＜２４＞若しくは＜２５＞項記載の遺伝子、又は前記＜２６＞項記載の組換えベクターを、宿主に導入してなる形質転換体。
＜２８＞　前記＜２４＞若しくは＜２５＞項記載の遺伝子、又は前記＜２６＞項記載の組換えベクターを宿主に導入する、形質転換体の作製方法。
＜２９＞　前記＜２４＞又は＜２５＞項記載の遺伝子の発現を促進させた形質転換体。
＜３０＞　前記形質転換体の宿主が微生物である、前記＜２７＞～＜２９＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３１＞　前記微生物が大腸菌である、前記＜３０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３２＞　前記微生物が微細藻類である、前記＜３０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３３＞　前記微細藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜３２＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３４＞　脂質を製造するための、前記＜２３＞～＜３３＞のいずれか１項記載のタンパク質、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、又は形質転換体の作製方法により得られた形質転換体の使用。
＜３５＞　前記脂質が、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素数が８以上１６以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル、より好ましくは炭素数が１２以上１６以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２及び１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、よりさらに好ましくは炭素数１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜３４＞項記載の使用。
＜３６＞　前記＜２４＞又は＜２５＞項記載の遺伝子を有する宿主から、当該遺伝子を欠失、変異又は発現抑制する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
　以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１及び２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例１　アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の取得、大腸菌の形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）ナンノクロロプシス・オキュラータ由来アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の取得
　ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（独立行政法人国立環境研究所(NIES)より入手）の全ＲＮＡを抽出し、SuperScript（商標）　III　First-Strand　Synthesis　SuperMix　for　qRT-PCR（invitrogen社製）を用いて逆転写を行ってｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー番号３及びプライマー番号４のプライマー対を用いたＰＣＲにより、配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子断片を取得した。以下、この遺伝子をNoTE2遺伝子といい、当該遺伝子がコードするタンパク質をNoTE2（配列番号１）という。
　また、プラスミドベクターpBluescriptII　SK(-)（Stratagene社製）を鋳型として、表１に示すプライマー番号５及びプライマー番号６のプライマー対を用いたＰＣＲによりpBluescriptII　SK(-)を増幅し、制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）処理により鋳型の消化を行った。
　これら２つの断片を、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製）を用いて精製した後に、In-Fusion　HD　Cloning　Kit（Clontech社製）を用いて融合し、常法に従い大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（タカラバイオ社製）への形質転換、プラスミド抽出、及びクローニング断片の塩基配列確認を行い、NoTE2遺伝子の全長をクローニングしたプラスミドを作製した。
（２）NoTE2遺伝子発現プラスミドの構築
　配列番号１に示すNoTE2のアミノ酸配列において、Ｎ末端１～７３位付近は葉緑体移行シグナル配列と推定された。そこで、推定葉緑体移行シグナル配列を含むＮ末端領域を種々の長さで削除した複数のNoTE2遺伝子発現プラスミドを構築した。
　前記プラスミドを鋳型とし、表１に示すプライマー番号７～１２のいずれか１つと、プライマー番号５のプライマーとのプライマー対を用いてＰＣＲを行い、得られた遺伝子断片を前記の方法と同様にして精製・融合し、NoTE2遺伝子発現用プラスミドNoTE2_61、NoTE2_71、NoTE2_74、NoTE2_81、NoTE2_91、及びNoTE2_101をそれぞれ構築した。
　ここで、プラスミドNoTE2_61は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端側１～６０位のアミノ酸配列を除去するように構築され、NoTE2遺伝子として、配列番号１の６１位～３４８位のアミノ酸配列に相当する塩基配列及び終止コドンに対応する配列番号２の１８１位～１０４７位の塩基配列を有する。同様に、プラスミドNoTE2_71、プラスミドNoTE2_74、プラスミドNoTE2_81、プラスミドNoTE2_91、及びプラスミドNoTE2_101は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端側１～７０位、１～７３位、１～８０位、１～９０位、又は１～１００位のアミノ酸配列をそれぞれ除去するように構築した。さらに、これらのプラスミドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端側を除去した部位の上流に、プラスミドベクターpBluescriptII　SK(-)由来のLacZタンパク質のＮ末端側１位～２９位のアミノ酸配列が融合したタンパク質を発現させるように構築した。
（３）NoTE2遺伝子発現プラスミドの大腸菌への導入
　前記の各種NoTE2遺伝子発現プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株であるK27株（fadD88）（Overath　et　al，Eur．J．Biochem．7，559-574，1969）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をした大腸菌K27株を50μg/mLアンピシリンナトリウム含有ＬＢ寒天培地（Bacto　Trypton　1%、Yeast　Extract　0.5%、NaCl　1%、Agar　1.5%）に播種して30℃で一晩静置した。得られたコロニーを、2mLのOvernight　Express　Instant　TB　Medium（Novagen社）（アンピシリンナトリウム50μg/mL含有）に接種し、30℃で振とう培養（160rpm）した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、下記方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpBluescriptII　SK(-)で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。
（４）培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
　培養液1mLに、内部標準として1mg/mLの7-ペンタデカノン（メタノール溶液）50μLを添加後、クロロホルム0.5mL及びメタノール1mLを培養液に添加して激しく攪拌し、10分間以上静置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%KCl　0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて5分間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
　得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、0.5N水酸化カリウム／メタノール溶液0.7mLを添加し、80℃で30分間恒温した。続いて14%三フッ化ホウ素のメタノール溶液（SIGMA社製）1mLを添加し、80℃にて10分間恒温した。その後、ヘキサン及び飽和食塩水を各0.5mL添加し激しく撹拌し、室温にて10分間以上静置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
　下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
キャピラリーカラム：DB-1　MS（30m×200μm×0.25μm、J＆W　Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
カラム内流量：1.0mL/分
昇温プログラム：100℃（1分間）→10℃／分→300℃（5分間）
平衡化時間：1分間
注入口：スプリット注入（スプリット比：100:1）
圧力：14.49psi，104mL/分
注入量：1μL
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出器温度：300℃
　また、脂肪酸メチルエステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
　ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液1Lあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
　結果を表３に示す。なお下記の表において、「ＴＦＡ」は総脂肪酸量を、「脂肪酸組成（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸の重量の割合（重量パーセント）を示す。また「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数ｘで二重結合数がｙの脂肪酸を表し、「Ｃ１７：０Δ」及び「Ｃ１９：０Δ」はそれぞれ、cis-9,10-メチレンヘキサデカン酸（cis-9,10-Methylen-hexadecanoic　acid）及びcis-11,12-メチレンオクタデカン酸（cis-11,12-Methylen-octadecanoic　acid）を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３から明らかなように、NoTE2遺伝子発現プラスミドNoTE2_61、NoTE2_71、NoTE2_74、NoTE2_81、又はNoTE2_91導入株では、陰性対照であるプラスミドベクターpBluescriptII　SK(-)導入株（表中「pBS」）と比べ、総脂肪酸に占めるＣ１２：０脂肪酸、Ｃ１４：１脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸、Ｃ１６：１脂肪酸の割合が大きく増加した。特に、Ｃ１４脂肪酸（Ｃ１４：１脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸）の割合が顕著に増加した。さらに、これらNoTE2遺伝子発現プラスミドの導入株では、総脂肪酸量（ＴＦＡ）も増加していた。これらの結果から、プラスミドNoTE2_61、NoTE2_71、NoTE2_74、NoTE2_81、又はNoTE2_91に導入した遺伝子がコードするタンパク質は、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することが確認された。また、これらのタンパク質はＣ１２脂肪酸及びＣ１４脂肪酸の割合及び生産量を顕著に増加させたことから、Ｃ１２脂肪酸やＣ１４脂肪酸、特にＣ１４脂肪酸に高い特異性を持つアシル－ＡＣＰチオエステラーゼであると考えられる。
　一方、プラスミドNoTE2_101導入株では、陰性対照と比べても、脂肪酸組成がほとんど変化せず、総脂肪酸量も増加しなかった。このことから、プラスミドNoTE2_101に導入した遺伝子がコードするタンパク質は、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性をほぼ有しないと考えられる。
　以上の結果から、配列番号１で示されるアミノ酸配列中、少なくとも９１位～３４８位の領域を有するタンパク質は、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を示すと認められる。
実施例２　ナンノクロロプシス・オキュラータ由来アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子によるナンノクロロプシス・オキュラータの形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
　ゼオシン耐性遺伝子（配列番号１３）、及び文献（Randor　Radakovits，et　al.，Nature　Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012）記載のナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来チューブリンプロモーター配列（配列番号１４）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示すプライマー番号１５及びプライマー番号１６のプライマー対、並びにプライマー番号１７及びプライマー番号１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ増幅した。
　また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表２に示すプライマー番号１９及びプライマー番号２０のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列（配列番号２１）を増幅した。
　さらに、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表２に示すプライマー番号２２及びプライマー番号２３のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
　これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡社製）にて処理し、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製）を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion　HD　Cloning　Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（２）NoTE2遺伝子発現用プラスミドの構築
　実施例１で調製したナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のｃＤＮＡを鋳型として、表２に示すプライマー番号２４及びプライマー番号２５のプライマー対を用いたＰＣＲにより、配列番号２の塩基配列からなる遺伝子断片を取得した。
　また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表２に示すプライマー番号２６及びプライマー番号２７のプライマー対、並びにプライマー番号２８及びプライマー番号２９のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、LDSPプロモーター配列（配列番号３０）及びVCP1ターミネーター配列（配列番号３１）を取得した。
　さらに、前述のゼオシン耐性遺伝子発現プラスミドを鋳型として、表２に示すプライマー番号３２及びプライマー番号２３のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）及びpUC19配列からなる断片を増幅した。
　これら４つの増幅断片を、前述の方法と同様の方法にて融合し、NoTE2遺伝子発現用プラスミド（NoTE2-Nanno）を構築した。
　なお、本プラスミドはLDSPプロモーター配列、NoTE2遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
　さらに、前記NoTE2遺伝子発現用プラスミド（NoTE2-Nanno）を鋳型とし、表２に示すプライマー番号３３及びプライマー番号２７のプライマー対を用いたＰＣＲにより、遺伝子断片を取得した。
　また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のｃＤＮＡを鋳型として、表２に示すプライマー番号３４及びプライマー番号３５のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、VCP1葉緑体移行シグナル（配列番号３６）を取得した。
　これらの断片を前述の方法と同様の方法にて融合し、NoTE2遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミド（NoTE2_74-Nanno）を構築した。
　なお、本プラスミドはLDSPプロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナルを配列番号１に示すアミノ酸配列の７４～３４８位をコードする塩基配列の５’末端側に連結させたNoTE2遺伝子（以下、「NoTE2_74遺伝子」ともいう）、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（３）NoTE2遺伝子発現カセットのナンノクロロプシス・オキュラータへの導入
　前述のNoTE2遺伝子発現用プラスミド（NoTE2-Nanno及びNoTE2_74-Nanno）をそれぞれ鋳型として、表２に示すプライマー番号２０及びプライマー番号２６のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、NoTE2遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、NoTE2遺伝子若しくはNoTE2_74遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるDNA断片）を増幅した。
　増幅したDNA断片を、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製）を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
　約1×109細胞のナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株を、384mMのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したNoTE2遺伝子発現カセット約500ngを宿主細胞と混和し、50μF、500Ω、2,200v/2mmの条件でエレクトロポレーションを行った。
　ｆ／２液体培地（NaNO3　75mg、NaH2PO4・2H2O　6mg、ビタミンB12　0.5μg、ビオチン　0.5μg、チアミン　100μg、Na2SiO3・9H2O　10mg、Na2EDTA・2H2O　4.4mg、FeCl3・6H2O　3.16mg、FeCl3・6H2O　12μg、ZnSO4・7H2O　21μg、MnCl2・4H2O　180μg、CuSO4・5H2O　7μg、Na2MoO4・2H2O　7μg／人工海水1L）にて２４時間回復培養を行った。その後に、2μg/mLのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて2～3週間培養した。得られたコロニーの中から、NoTE2遺伝子発現カセットを含むものをＰＣＲにより選抜した。
（４）培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
　選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を15倍、リン濃度を5倍に増強した培地（以下、「Ｎ１５Ｐ５培地」という）20mLに播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて4週間振盪培養し、種培養液とした。種培養液2mLを、Ｎ１５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて１週間振盪培養し、前培養液１とした。前培養液１　2mLを、Ｎ１５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて１週間培養し、前培養液２とした。前培養液２　2mLを、海水培地（ダイゴ人工海水SP、和光純薬社製）18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて12日間振盪培養した。
　なお、陰性対照として、野生株であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（WT）についても同様に実験を行った。
　培養液の濁度（OD660nm）を測定した後に、下記に示す脂質の抽出と、構成脂肪酸の分析を行った。
　培養液1mLに、内部標準として1mg/mLの7-ペンタデカノン（メタノール溶液）を50μL添加後、クロロホルム0.5mL及びメタノール1mLを培養液に添加して激しく攪拌し、10分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%KCl　0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて5分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
　得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、0.5N水酸化カリウム／メタノール溶液0.7mLを添加し、80℃で30分間恒温した。続いて14%三フッ化ホウ素メタノール溶液（SIGMA社製）1mLを添加し、80℃にて10分間恒温した。その後、ヘキサン0.5mL、及び飽和食塩水1mLを添加し激しく撹拌し、室温にて10分間放置し、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
　下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：7890A（Agilent　technology社製）
キャピラリーカラム：DB-1　MS（30m×200μm×0.25μm、J＆W　Scientific社製）
移動層：高純度ヘリウム
オーブン温度：150℃　保持0.5分→150～220℃（40℃/min昇温）→220～320℃（20℃/min昇温）→320℃　保持2分（ポストラン2分）
注入口温度：300℃
注入方法：スプリット注入（スプリット比：75:1）
注入量：1μL
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出方法：ＦＩＤ
検出器温度：300℃
　脂肪酸メチルエステルの同定及び定量は、実施例１と同様の方法で行った。その結果を表４に示す。
　なお、表４において「ｎ」は０～５の整数を示し、例えば「Ｃ１８：ｎ」と記載した場合には、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ１８：４及びＣ１８：５の脂肪酸の総和を表す。
　さらに、培養液の濁度当たりの総脂肪酸量（TFA/OD660nm）も併せて算出し、結果を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４から明らかなように、NoTE2遺伝子を導入した形質転換体（表４中の「NoTE2-Nanno」）では、野生株（表４中の「WT」）と比べ、Ｃ１２：０脂肪酸とＣ１４：０脂肪酸の割合が有意に増加し、これらの脂肪酸の生産量が増加していた。また、この形質転換体では、培養液の濁度当たりの総脂肪酸量（TFA/OD660nm）が野生株と比べて増加しており、細胞当たりの脂肪酸生産性が向上していることが示唆された。
　さらに、NoTE2_74遺伝子を導入した形質転換体（表４中の「NoTE2_74-Nanno」）においても、野生株と比べ、Ｃ１２：０脂肪酸とＣ１４：０脂肪酸の割合が有意に増加し、これらの脂肪酸の生産量が増加していた。さらに、この形質転換体でも、培養液の濁度当たりの総脂肪酸量が野生株と比べて増加しており、細胞当たりの脂肪酸生産性が向上していることが示唆された。この結果から、配列番号１で示されるアミノ酸配列中、配列番号１に示すアミノ酸配列の１～７３位のアミノ酸は、酵素活性に必須ではないことが分かった。さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列のN末端側には、葉緑体への局在に必要な葉緑体移行シグナル配列が存在していることが示唆された。
　以上のように、本発明で規定するアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現を促進させることで、中鎖脂肪酸の生産性及び生産される全脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、中鎖脂肪酸の生産性を向上させることができる。
　本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
　本願は、2014年11月14日に日本国で特許出願された特願2014-231355に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。

Claims (20)

  1. 　宿主に下記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が導入されている形質転換体を培養し、培養物から脂質を採取する、脂質の製造方法。
    (A)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (B)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    (C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
  2. 　宿主に下記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を導入する工程を含む、形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる方法。
    (A)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (B)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    (C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
  3. 　宿主に下記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
    (A)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (B)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    (C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
  4. 　前記タンパク質(C)が下記タンパク質(C1)～(C7)のいずれか１つである、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
    (C1)配列番号１の１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C2)配列番号１の６１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C3)配列番号１の７１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C4)配列番号１の７４位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C5)配列番号１の８１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C6)前記タンパク質(C1)～(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列との同一性が８０％以上からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    (C7)前記タンパク質(C1)～(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
  5. 　前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ(a)～(c)のいずれか１つからなる遺伝子である、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
    (a)配列番号２の２７１位～１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
    (b)配列番号２の２７１位～１０４７位の塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    (c)前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  6. 　前記宿主が微生物である、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　前記微生物が大腸菌である、請求項６記載の方法。
  8. 　前記微生物が微細藻類である、請求項６記載の方法。
  9. 　前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項８記載の方法。
  10. 　前記脂質が炭素数１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、請求項１～９のいずれか１項記載の方法。
  11. 　下記タンパク質(A)～(C)。
    (A)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (B)配列番号１の９１位～３４８位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    (C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
  12. 　前記タンパク質(C)が下記タンパク質(C1)～(C7)のいずれか１つである、請求項１１記載のタンパク質。
    (C1)配列番号１の１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C2)配列番号１の６１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C3)配列番号１の７１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C4)配列番号１の７４位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C5)配列番号１の８１位～３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C6)前記タンパク質(C1)～(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列との同一性が８０％以上からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    (C7)前記タンパク質(C1)～(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
  13. 　請求項１１又は１２記載のタンパク質をコードする遺伝子。
  14. 　下記ＤＮＡ(a)～(c)のいずれか１つからなる遺伝子。
    (a)配列番号２の２７１位～１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
    (b)配列番号２の２７１位～１０４７位の塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    (c)前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  15. 　請求項１３又は１４記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
  16. 　請求項１３若しくは１４記載の遺伝子、又は請求項１５記載の組換えベクターを、宿主に導入してなる形質転換体。
  17. 　前記宿主が微生物である、請求項１６記載の形質転換体。
  18. 　前記微生物が大腸菌である、請求項１７記載の形質転換体。
  19. 　前記微生物が微細藻類である、請求項１７記載の形質転換体。
  20. 　前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項１９記載の形質転換体。
PCT/JP2015/081356 2014-11-14 2015-11-06 アシル－ａｃｐチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法 Ceased WO2016076231A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2015347886A AU2015347886B2 (en) 2014-11-14 2015-11-06 Method of producing lipid using acyl-acp thioesterase
MYPI2017000570A MY182519A (en) 2014-11-14 2015-11-06 Method for producing lipid using acyl-acp thioesterase
JP2016559023A JP6629749B2 (ja) 2014-11-14 2015-11-06 アシル−ａｃｐチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法
US15/520,138 US10280440B2 (en) 2014-11-14 2015-11-06 Method of producing lipid using acyl-ACP thioesterase

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014-231355 2014-11-14
JP2014231355 2014-11-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016076231A1 true WO2016076231A1 (ja) 2016-05-19

Family

ID=55954318

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/081356 Ceased WO2016076231A1 (ja) 2014-11-14 2015-11-06 アシル－ａｃｐチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10280440B2 (ja)
JP (1) JP6629749B2 (ja)
AU (1) AU2015347886B2 (ja)
MY (1) MY182519A (ja)
WO (1) WO2016076231A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017209101A (ja) * 2016-05-24 2017-11-30 花王株式会社 藻類の処理方法
WO2018105420A1 (ja) * 2016-12-07 2018-06-14 花王株式会社 形質転換体の製造方法
US10066248B2 (en) 2014-03-03 2018-09-04 Kao Corporation Method of producing lipid by using β-ketoacyl-ACP synthase
US10087428B2 (en) 2012-12-27 2018-10-02 Kao Corporation Acyl-ACP thioesterase
US10508292B2 (en) 2015-05-22 2019-12-17 Kao Corporation Method of producing lipid
US10550412B2 (en) 2014-06-20 2020-02-04 Kao Corporation Method of producing lipid

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014103930A1 (ja) * 2012-12-27 2014-07-03 花王株式会社 アシル－ａｃｐチオエステラーゼ
WO2015133305A1 (ja) * 2014-03-03 2015-09-11 花王株式会社 β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼを用いた脂質の製造方法
JP2015177771A (ja) * 2014-03-19 2015-10-08 花王株式会社 アシル−ａｃｐチオエステラーゼ改変体を用いた脂質の製造方法
WO2015194628A1 (ja) * 2014-06-20 2015-12-23 花王株式会社 脂質の製造方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5512482A (en) 1990-04-26 1996-04-30 Calgene, Inc. Plant thioesterases

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014103930A1 (ja) * 2012-12-27 2014-07-03 花王株式会社 アシル－ａｃｐチオエステラーゼ
WO2015133305A1 (ja) * 2014-03-03 2015-09-11 花王株式会社 β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼを用いた脂質の製造方法
JP2015177771A (ja) * 2014-03-19 2015-10-08 花王株式会社 アシル−ａｃｐチオエステラーゼ改変体を用いた脂質の製造方法
WO2015194628A1 (ja) * 2014-06-20 2015-12-23 花王株式会社 脂質の製造方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GONG, Y. ET AL.: "Characterization of a novel thioesterase(PtTE) from Phaeodactylum tricornutum.", J. BASIC MICROBIOL., vol. 51, no. 6, December 2011 (2011-12-01), pages 666 - 672, ISSN: 1521-4028 *
RADAKOVITS, R. ET AL.: "4-hydroxybenzoyl- thioesterase family active site protein [Nannochloropsis gaditana CCMP526", NCBI REFERENCE SEQUENCE, 28 October 2013 (2013-10-28), XP005853517, Retrieved from the Internet <URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/553181119?sat=21&satkey=8186544> [retrieved on 20160204] *
RADAKOVITS, R. ET AL.: "Draft genome sequence and genetic transformation of the oleaginous alga Nannochloropsis gaditana.", NATURE COMMUN., vol. 3, no. 686, February 2012 (2012-02-01), pages 1 - 10, ISSN: 2041-1723 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10087428B2 (en) 2012-12-27 2018-10-02 Kao Corporation Acyl-ACP thioesterase
US10597646B2 (en) 2012-12-27 2020-03-24 Kao Corporation Acyl-ACP thioesterase
US10066248B2 (en) 2014-03-03 2018-09-04 Kao Corporation Method of producing lipid by using β-ketoacyl-ACP synthase
US10550412B2 (en) 2014-06-20 2020-02-04 Kao Corporation Method of producing lipid
US10508292B2 (en) 2015-05-22 2019-12-17 Kao Corporation Method of producing lipid
JP2017209101A (ja) * 2016-05-24 2017-11-30 花王株式会社 藻類の処理方法
WO2018105420A1 (ja) * 2016-12-07 2018-06-14 花王株式会社 形質転換体の製造方法
JP2018088902A (ja) * 2016-12-07 2018-06-14 花王株式会社 相同組換えが生じた形質転換体の取得確率を向上させる方法
US11306320B2 (en) 2016-12-07 2022-04-19 Kao Corporation Method for promoting homologous recombination

Also Published As

Publication number Publication date
US10280440B2 (en) 2019-05-07
AU2015347886A1 (en) 2017-05-18
AU2015347886B2 (en) 2019-07-18
JP6629749B2 (ja) 2020-01-15
US20170335354A1 (en) 2017-11-23
JPWO2016076231A1 (ja) 2017-08-24
MY182519A (en) 2021-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6491881B2 (ja) アシル−ａｃｐチオエステラーゼ
JP6310544B2 (ja) β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼを用いた脂質の製造方法
JP6592434B2 (ja) 脂質の製造方法
JP6629749B2 (ja) アシル−ａｃｐチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法
JP6779652B2 (ja) 脂質の製造方法
JP6381139B2 (ja) アシル−ａｃｐチオエステラーゼ
US10337037B2 (en) Method of producing lipid
JP6709169B2 (ja) アシル−ａｃｐチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法
JP6779664B2 (ja) 脂質の製造方法
JP6580912B2 (ja) 脂質の製造方法
JP6587468B2 (ja) 脂質の製造方法
WO2019069969A1 (ja) 脂質の製造方法
JP6332855B2 (ja) アシル−ａｃｐチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法
JP7450329B2 (ja) 脂質の製造方法
WO2020071265A1 (ja) 脂質の製造方法
WO2017022587A1 (ja) 脂質の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15859167

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016559023

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015347886

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20151106

Kind code of ref document: A

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15859167

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1