WO2016071985A1 - 発光粒子解析方法 - Google Patents

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luminescent
light
luminescent particles
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particles
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田邊　哲也
山口　光城
克典 小江
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Olympus Corp
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Olympus Corp
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing luminescent particles.
  • Biomolecules to be analyzed include luminescent particles and fluorescent particles.
  • Luminescent luminance differs between the luminescent particles and the fluorescent particles.
  • the fluorescent dye emits photons of, for example, about 30 to 110 [kHz] when excited by being irradiated with light.
  • particles (luciferin) that emit light using luciferase as a typical luminescent particle as an enzyme emit photons of about 7 [Hz] (4.2 ⁇ 1024 [photons / s / mol]).
  • the brightness per unit time of the luminescent particles is about 1/4000 to 1/16000 times that of fluorescent molecules excited by irradiation with light.
  • a luminometer (lumino counter) is known as an apparatus for detecting luminescent or fluorescent particles (see Non-Patent Document 1).
  • methods for analyzing the diffusion characteristics of fluorescent molecules at the level of one particle methods described in Non-Patent Documents 2 and 3 are known.
  • Non-Patent Documents 2 and 3 are methods for analyzing the diffusion characteristics of fluorescent particles at a single particle level with high sensitivity. When these methods are applied to luminescent particles, the concentration of the luminescent particles is changed. It was difficult to analyze with high sensitivity. In these methods, the number of photons obtained while one fluorescent particle stays in the observation region is about several to several tens. On the other hand, when a luminescent particle is observed, one or less photons can be observed. Because it becomes.
  • One embodiment of the present invention includes a step of preparing a sample including luminescent particles and a confocal microscope in which the volume of an observation region is set to be equal to or larger than the volume of a sphere having a radius of 30 [ ⁇ m].
  • a luminescent particle analysis method comprising: a step of calculating a value; and a step of deriving a value indicating the concentration of the luminescent particle based on the calculated index value.
  • the present invention it is possible to provide a luminescent particle analysis method capable of performing analysis on luminescent particles with high accuracy.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of a luminescent particle analysis system 1 for carrying out the luminescent particle analysis method.
  • the luminescent particle analysis system 1 is a combination of an optical system of a confocal microscope and a photodetector.
  • the measurement container 10 the objective lens 20, the optical scanning unit 30, the barrier filter 40, and the light collection.
  • a lens 50, an optical fiber 60, an optical sensor 70, and a control / analysis device 80 are provided.
  • the measurement container 10 is formed with the glass bottom plate 12 as the bottom.
  • a measurement sample F is accommodated in the measurement container 10.
  • the measurement sample F is a liquid in which luminescent particles are dispersed or dissolved. The luminescent particles will be described later.
  • the objective lens 20 converts light emitted from the luminescent particles in the measurement sample F into parallel light, and guides the parallel light to the optical scanning unit 30.
  • the objective lens 20 is a water immersion objective lens, an oil immersion objective lens, a silicone immersion objective lens, a dry (air immersion) objective lens, or the like.
  • the light detection area (observation area OA) of the objective lens 20 may be moved in the vertical direction by moving the objective lens 20 in the vertical direction (Z direction in the figure). Good.
  • the light scanning unit 30 reflects the light guided from the objective lens 20 toward the barrier filter 40.
  • the barrier filter 40 allows only light having a specific frequency component of light reflected by the optical scanning unit 30 to pass therethrough and guides only the light having the specific frequency component to the incident surface of the condenser lens 50.
  • the condensing lens 50 collects the light that has passed through the barrier filter 40 and causes the collected light to enter the incident surface of the optical fiber 60.
  • the optical fiber 60 causes the light incident on the incident surface to enter the optical sensor 70.
  • the optical sensor 70 converts the incident light into an electrical signal, and outputs the converted electrical signal to the control / analysis device 80.
  • the optical sensor 70 is preferably capable of detecting weak light from one luminescent particle. For example, an ultrasensitive optical sensor that can be used for photon counting is used as the optical sensor 70.
  • the incident surface of the optical fiber 60 is arranged at a position conjugate with the focal position of the objective lens 20. Thereby, only the light emitted from within the observation area OA enters the optical fiber 60, and the light from other than the observation area OA is blocked.
  • the observation area OA is an elliptical sphere that is long in the depth direction when viewed from the objective lens 20 side (from the ⁇ Z direction).
  • the observation area OA may have a shape that can be regarded as a sphere. Details of the observation area OA will be described later.
  • the luminescent particle analysis system 1 periodically moves the observation region OA in the measurement sample F by driving the optical scanning unit 30, for example.
  • the optical scanning unit 30 includes, for example, a mirror deflector similar to a galvanometer mirror device provided in a laser scanning microscope.
  • the optical scanning unit 30 changes the direction of the mirror deflector under the control of the control / analysis device 80, and accordingly moves the observation area OA in, for example, the horizontal direction (in the direction on the XY plane in the drawing).
  • the movement trajectory of the observation area OA may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof (so that various movement patterns can be selected in the program executed by the control / analysis device 80). It may be) In the following description of the present embodiment, it is assumed that the movement locus of the observation area OA is circular.
  • the measurement container 10 may be moved in the horizontal direction.
  • the control / analysis device 80 is a computer device including a storage unit 90 such as a CPU (Central Processing Unit), a RAM (Random Access Memory), a ROM (Read Only Memory), a HDD (Hard Disk Drive), and a flash memory. .
  • the control / analysis apparatus 80 includes a drive control unit 81, an information collection unit 82, an autocorrelation calculation unit 83, a fitting unit 84, and an analysis unit 85 as functional configurations.
  • the drive control unit 81 drives the optical scanning unit 30 to control the position of the observation area OA.
  • the information collecting unit 82 samples the output value (light intensity) of the optical sensor 70 in time series.
  • the autocorrelation calculation unit 83 calculates an autocorrelation function based on the output value sampled by the information collection unit 82.
  • the fitting unit 84 obtains the average number N of luminescent particles by fitting the autocorrelation function calculated by the autocorrelation calculating unit 83 using a predetermined formula.
  • the analysis unit 85 calculates the brightness CPP (Count per particle) per particle based on the light intensity, the average number of luminescent particles, and the like.
  • These functional units are, for example, software functional units that function when the CPU executes a program. Some or all of these functional units may be hardware functional units such as LSI (Large Scale Integration) and ASIC (Application Specific Integrated Circuit).
  • LSI Large Scale Integration
  • ASIC Application Specific Integrated Circuit
  • FIG. 2 is a flowchart illustrating an example of a processing flow according to the luminescent particle analysis method.
  • a measurement solution containing a luminescent enzyme such as luciferase is prepared (step S100).
  • a luminescent substrate is added to the measurement solution to obtain a measurement sample F (step S102).
  • FIG. 3 is a view of the movement path of the observation area OA as viewed from the objective lens 20 side.
  • the observation area OA is substantially circular when viewed from the objective lens 20 side, and moves in a circular orbit to form a donut-shaped periodic observation area POA.
  • the observation area OA has a size that does not deviate due to Brownian motion and includes several light emitting particles, and considers the need to capture the faint light of the light emitting particles, and observes one light emitting particle for a long time.
  • the applicant of the present application has stated that the minimum size is a volume of a sphere having a radius of 30 [ ⁇ m], that is, ⁇ (4/3) ⁇ ⁇ ⁇ 30 [ ⁇ m] 3 ⁇ 113097 [ ⁇ m]. 3 ⁇ was obtained.
  • the observation region OA having such a size is moved with a dilute luminescent particle solution having only a few luminescent particles in the observation region OA, the number of the luminescent particles in the observation region OA changes, and the observation region OA is changed.
  • the intensity of the light detected from the light also varies depending on the number of the luminescent particles.
  • the information collection unit 82 samples the output value of the optical sensor 70 until the scanning period in which the observation area OA is moved and the measurement sample F is scanned ends.
  • Time series data in which the integrated value of the output values measured within the sampling period is associated with the measurement time (or data input time) is stored in the storage unit 90 (step S106).
  • the autocorrelation calculation unit 83 calculates an autocorrelation function with the original time series data while shifting the measurement time with respect to the time series data (step S108).
  • FIG. 4 is a bar graph schematically showing the contents of time series data.
  • the white bars indicate the output value (hereinafter referred to as light intensity F (t)) of the light sensor by the luminescent particles to be measured, and the black bars are due to noise of the avalanche photodiode of the light sensor 70 or the like.
  • the light intensity F (t) is shown.
  • the light intensity F (t) due to the luminescent particles appears at a period substantially coincident with the period T for moving the observation area OA, whereas the light intensity F (t) due to noise generally appears at random timing.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating the transition of the autocorrelation function g (dt). In the figure, dt is a shift time.
  • the autocorrelation function g (dt) is expressed by, for example, Expression (1).
  • g (dt) ⁇ F (t) ⁇ F (dt) ⁇ F 2 ⁇ / F 2 (1)
  • the autocorrelation function g (dt) when periodically scanned is expressed by Expression (2).
  • N is the average number of luminescent particles present in the observation area OA throughout the scanning period, that is, a value indicating the concentration of the luminescent particles
  • D is a diffusion constant
  • T 0 is the scanning period
  • r is the radius of the observation area OA (here, the observation area OA can be regarded as a sphere, but in the case of an ellipse, the radius of the circle of the maximum section cut along the XY plane).
  • g (dt) (1 / N) ⁇ ⁇ 1+ (4 ⁇ k ⁇ D ⁇ T 0 / w 2 ) ⁇ ⁇ 1 (2)
  • the fitting unit 84 derives the average number N of luminescent particles by fitting the autocorrelation function g (dt) calculated by the autocorrelation calculating unit 83 into the equation (2) (step S112).
  • the fitting unit 84 can derive the average number N of luminescent particles that does not depend on the particle diffusion characteristics by obtaining the reciprocal of the Y-intercept of the autocorrelation function. Further, the fitting unit 84 calculates the diffusion constant D by substituting the derived N into the equation (2).
  • the analysis unit 85 divides the total value ⁇ F (t) of the light intensity F (t) by the observation time T and the average number N of luminescent particles in accordance with the equation (3), so Brightness CPP is calculated (step S114).
  • CPP ⁇ F (t) / (T ⁇ N) (3)
  • step S106 and step S108 does not need to be performed continuously, for example, the process which moves observation area OA and stores time series data in the memory
  • the processing from step S108 onward may be performed collectively on a plurality of sets of time-series data at a later date.
  • control / analyzer 80 determines the average number of luminescent particles based on the elapsed time from the time when the luminescent substrate is added to the solution containing the luminescent enzyme to the time when the measurement of the light intensity F (t) is started. N or the like may be corrected. It is known that the luminance of bioluminescence decays from the reaction start time, and typically decays as shown in FIG. FIG. 6 is a diagram illustrating an example of attenuation of luminance of bioluminescence. The decay rate varies depending on the luminescent substrate and luminescent particles used, but by measuring in advance, the concentration of the luminescent particles can be corrected using the time elapsed from the start of the reaction.
  • the control / analysis device 80 maintains a map in which the elapsed time and the light attenuation rate are associated with each other, and corrects the average number N of luminescent particles by multiplying the correction coefficient having the opposite relationship. .
  • the applicant of the present application performed a simulation to confirm the effect of the embodiment described above.
  • the luminescent particles use luciferase
  • a solution with a luciferase concentration of 5 [am] is prepared
  • the measurement bin time (sampling period) is 100 [ ⁇ s]
  • the radius of the observation area OA is 0.4 [mm].
  • a measurement for 900 seconds was assumed at a scanning speed of 0.25 [mm / s] (scanning cycle 2 [s]).
  • FIG. 7 is a diagram showing the transition of the light intensity F (t) obtained as a simulation result.
  • the autocorrelation function g (dt) is obtained. As shown in FIG. 7, the shift times 2 [s], 4 [s], 6 equal to an integral multiple of the scanning period are obtained. It was found that the peak of the autocorrelation function g (dt) occurred in [s], and the luminescent particles could be detected with high accuracy.
  • FIG. 8 is a diagram showing a transition of the autocorrelation function g (dt) obtained as a simulation result.
  • the observation region in the sample containing the luminescent particles using the confocal microscope in which the volume of the observation region OA is set to be equal to or larger than the volume of a sphere having a radius of 30 [ ⁇ m].
  • the light intensity F (t) emitted from the observation area OA is measured while periodically moving the OA, and the autocorrelation function g (dt) is obtained while shifting the measurement time for the obtained light intensity F (t).
  • the value N indicating the concentration of the luminescent particles, the diffusion constant D, and the brightness CPP per one particle are obtained. It can be carried out.
  • Non-Patent Document 2 the method described in Non-Patent Document 2 is to analyze the fluctuation of the signal by periodically observing the same coordinates, but in order to increase the number of photons that can be observed, If the length is long (scanning is performed at a low speed), it becomes impossible to perform analysis with high sensitivity due to Raman scattering in the solution. Therefore, the configuration of the luminescent particle analysis system 1 in which the volume of the observation area OA is equal to or larger than the volume of a sphere having a radius of 30 [ ⁇ m] cannot be applied when observing fluorescent particles.
  • the intensity of Raman scattering of water is 8 [kHz] when the radius of the confocal optical system is 2 [ ⁇ m] in the apparatus having the configuration shown in Japanese Patent No. 5250152. From this, the Raman scattering intensity per molecule of water is 8.9 [Hz / molecule]. Further, the light emission amount of one molecule of the fluorescent dye is about 200-500 [kHz]. Therefore, when the fluorescence is observed by particle measurement as in the present application, the Raman scattering as the background light and the signal intensity of the fluorescent dye coincide with each other when the radius of the observation region is about 2 [ ⁇ m] (see FIG. 9).
  • FIG. 9 is a diagram illustrating a correspondence relationship between the fluorescence luminance and the observation region.
  • the radius of the observation region is about 20 [ ⁇ m]
  • the Raman scattering intensity of the background light and the signal intensity derived from the fluorescent dye coincide with each other, and 30 [ ⁇ m] or more. In such a large observation area, fluorescence measurement cannot be established.
  • the present invention can be used in industries such as chemistry, medical equipment, and computer software.
  • Luminescent particle analysis system 10 Measuring container 20 Objective lens 30 Optical scanning unit 40 Barrier filter 50 Condensing lens 60 Optical fiber 70 Optical sensor 80 Control / analysis apparatus 81 Drive control part 82 Information collection part 83 Autocorrelation calculation part 84 Fitting part 85 Analysis unit 90 Storage unit OA Observation area

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Abstract

　観測領域の体積が半径３０［μｍ］の球体の体積以上である共焦点顕微鏡を用いて、発光粒子を含む試料中で前記観測領域を周期的に移動させながら、前記観測領域から発せられる光の強度を測定する工程と、前記測定する工程において得られた光の強度について、測定時刻をずらしながら自己相関を示す指標値を算出する工程と、前記算出された指標値に基づいて、前記発光粒子の濃度を示す値を導出する工程と、を備える発光粒子解析方法。

Description

発光粒子解析方法
　本発明は、発光粒子解析方法に関する。
　溶液中における低濃度の生体分子の存在や特性を高感度に解析する方法は、物質の分析や病気の診断の分野で有用である。解析対象となる生体分子には、発光粒子と蛍光粒子が含まれる。発光粒子と蛍光粒子では、発光輝度が異なる。蛍光色素は、光が照射されて励起されると、例えば３０～１１０［ｋＨｚ］程度の光子を放出する。一方、典型的な発光粒子であるルシフェラーゼを酵素として発光する粒子（ルシフェリン）は、７［Ｈｚ］程度（４．２×１０２４［ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓ／ｍｏｌ］）の光子を放出する。発光粒子の単位時間当りの明るさは、光が照射されて励起された蛍光分子の１／４０００～１／１６０００倍程度となる。
　発光または蛍光する粒子を検出する装置として、ルミノメータ（ルミノカウンタ）が知られている（非特許文献１参照）。また、蛍光分子の拡散特性を１粒子レベルで解析する方法として、非特許文献２、３に記載の方法が知られている。
高感度微弱発光測定装置「ルミ・カウンターＮＹ２６００」カタログ、株式会社マイクロテック・ニチオン エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年　204-224項 "PARTICLE　COUNTING　BY　FLUORESCENCE　CORRELATION　SPECTROSCOPY"、Meyer　T、Schindler　H、BIOPHYSICAL　JOURNAL　VOLUME　54　1988、p983-993
　ルミノメータを用いた従来の手法では、単位時間あたりに光センサで受光した光子を、検出対象粒子から発せられたものかノイズに由来するものかを区別せず積算して光強度を算出していた。この結果、ノイズの影響が大きく、発光粒子の濃度を高精度に解析することができない場合があった。
　また、非特許文献２、３に記載の手法は、蛍光粒子の拡散特性を１粒子レベルで高感度に解析する方法であるが、これらの手法を発光粒子に適用した場合、発光粒子の濃度を高感度に解析するのが困難であった。これらの手法において、蛍光を発する１粒子が観測領域に滞在する間に得られる光子は、数個～数十個程度となるのに対し、発光粒子を観測した場合、観測できる光子が１個以下になってしまうからである。
　本発明の一態様は、発光粒子を含む試料を用意する工程と、観測領域の体積を半径３０［μｍ］の球体の体積以上に設定した共焦点顕微鏡を用いて、前記発光粒子を含む試料中で前記観測領域を周期的に移動させながら、前記観測領域から発せられる光の強度を測定する工程と、前記測定する工程において得られた光の強度について、測定時刻をずらしながら自己相関を示す指標値を算出する工程と、前記算出された指標値に基づいて、前記発光粒子の濃度を示す値を導出する工程と、を備える発光粒子解析方法である。
　本発明によれば、発光粒子に関する解析を高精度に行うことが可能な発光粒子解析方法を提供することができる。
発光粒子解析方法を実施するための発光粒子解析システム１の構成図である。 発光粒子解析方法に係る処理の流れの一例を示すフローチャートである。 観測領域ＯＡの移動経路を、対物レンズ２０の側から見た図である。 時系列データの内容を模式的に示す棒グラフである。 自己相関関数ｇ（ｄｔ）の推移を例示した図である。 生物発光の輝度の減衰例を示す図である。 シミュレーション結果として得られた光強度Ｆ（ｔ）の推移を示す図である。 シミュレーション結果として得られた自己相関関数ｇ（ｄｔ）の推移を示す図である。 蛍光輝度と観測領域との対応関係を示す図である。
　以下、発光粒子解析方法の実施形態について説明する。必要に応じて、ＸＹＺ座標系を用いて説明する。図１は、発光粒子解析方法を実施するための発光粒子解析システム１の構成図である。発光粒子解析システム１は、共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせたものであり、例えば、測定容器１０と、対物レンズ２０と、光走査ユニット３０と、バリアフィルタ４０と、集光レンズ５０と、光ファイバ６０と、光センサ７０と、制御・解析装置８０とを備える。
　測定容器１０は、ガラスボトムプレート１２を底部として形成される。測定容器１０には、測定試料Ｆが収容される。測定試料Ｆは、発光粒子が分散又は溶解された液体である。発光粒子に関しては後述する。
　対物レンズ２０は、測定試料Ｆにおける発光粒子から発せられた光を平行光に変換し、当該平行光を光走査ユニット３０へ導く。この対物レンズ２０は、水浸対物レンズ、油浸対物レンズ、シリコーン浸対物レンズ、ドライ（空浸）対物レンズなどである。水浸対物レンズを使用する場合、対物レンズ２０を上下方向（図中、Ｚ方向）に移動することにより、対物レンズ２０の光検出領域（観測領域ＯＡ）が上下方向に移動するようにしてもよい。
　光走査ユニット３０は、対物レンズ２０から導かれた光を、バリアフィルタ４０の方向へ反射する。バリアフィルタ４０は、光走査ユニット３０により反射された光のうち、特定の周波数成分の光のみを通過させ、当該特定の周波数成分の光のみを集光レンズ５０の入射面に導く。集光レンズ５０は、バリアフィルタ４０を通過した光を集め、集められた光を光ファイバ６０の入射面に入射させる。光ファイバ６０は、入射面に入射した光を、光センサ７０に入射させる。光センサ７０は、入射した光を電気信号に変換し、変換した電気信号を制御・解析装置８０に出力する。光センサ７０は、１つの発光粒子からの微弱光を検出可能なものであると好適である。例えば、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光センサが、光センサ７０として用いられる。
　ここで、光ファイバ６０の入射面は、対物レンズ２０の焦点位置と共役の位置に配置されている。これによって、観測領域ＯＡ内から発せられた光のみが光ファイバ６０に入射し、観測領域ＯＡ以外からの光は遮断される。観測領域ＯＡは、対物レンズ２０側から（－Ｚ方向から）見て奥行き方向に長い楕円球体である。なお、観測領域ＯＡは、球体とみなすことができる程度の形状であってよい。観測領域ＯＡの詳細については後述する。
　発光粒子解析システム１は、例えば、光走査ユニット３０を駆動することにより、測定試料Ｆ内において観測領域ＯＡを周期的に移動させる。光走査ユニット３０は、例えば、レーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様のミラー偏向器を有する。光走査ユニット３０は、制御・解析装置８０の制御によってミラー偏向器の向きを変更し、それに伴い、観測領域ＯＡを、例えば水平方向に（図中、Ｘ－Ｙ平面上の方向に）移動させる。観測領域ＯＡの移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（制御・解析装置８０が実行するプログラムにおいて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい）。本実施形態における以下の説明では、観測領域ＯＡの移動軌跡は、円形であるものとする。
　このように、光学系の光路を変更して観測領域ＯＡを移動させることにより、測定試料Ｆに機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することが抑制され、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。なお、光学系の光路を変更して観測領域ＯＡを移動させるのではなく、測定容器１０を水平方向に移動させる構成を有してもよい。
　制御・解析装置８０は、例えば、ＣＰＵ（Central　Processing　Unit）、ＲＡＭ（Random　Access　Memory）、ＲＯＭ（Read　Only　Memory）、ＨＤＤ（Hard　Disk　Drive）、フラッシュメモリ等の記憶部９０を備えるコンピュータ装置である。制御・解析装置８０は、機能構成として、駆動制御部８１と、情報収集部８２と、自己相関算出部８３と、フィッティング部８４と、解析部８５とを備える。
　駆動制御部８１は、光走査ユニット３０を駆動させ、観測領域ＯＡの位置を制御する。情報収集部８２は、光センサ７０の出力値（光強度）を時系列でサンプリングする。自己相関算出部８３は、情報収集部８２によってサンプリングされた出力値に基づき、自己相関関数を算出する。フィッティング部８４は、自己相関算出部８３により算出された自己相関関数を、所定の式によってフィッティングを行うことで平均的な発光粒子の数Ｎを求める。解析部８５は、光強度や平均的な発光粒子の数等に基づき、１粒子あたりの明るさＣＰＰ（Count　per　particle）を算出する。
　これらの機能部は、例えば、ＣＰＵがプログラムを実行することにより機能するソフトウェア機能部である。また、これらの機能部のうち一部または全部は、ＬＳＩ（Large　Scale　Integration）やＡＳＩＣ（Application　Specific　Integrated　Circuit）等のハードウェア機能部であってもよい。
　以下、発光粒子解析方法について説明する。図２は、発光粒子解析方法に係る処理の流れの一例を示すフローチャートである。まず、ルシフェラーゼ等の発光酵素を含む測定溶液を用意する（ステップＳ１００）。次に、測定溶液中に発光基質を添加して、測定試料Ｆとする（ステップＳ１０２）。
　次に、オペレータの操作等に従い、制御・解析装置８０の駆動制御部８１が、観測領域ＯＡを周期的に移動開始する（ステップＳ１０４）。図３は、観測領域ＯＡの移動経路を、対物レンズ２０の側から見た図である。図示するように、観測領域ＯＡは、対物レンズ２０の側から見ると略円形をなし、これが円軌道で移動することで、ドーナツ状の周期観測領域ＰＯＡが形成される。
　ここで、観測領域ＯＡは、発光粒子が数個入り、ブラウン運動によって逸脱しない程度の大きさ、且つ、発光粒子の微弱な光を捉える必要を考慮し、１つの発光粒子を長時間観測することが可能な大きさに設定する必要がある。後述するように、本出願の出願人は、その最低限の大きさが、半径３０［μｍ］の球体の体積、すなわち｛（４／３）×π×３０［μｍ］３≒１１３０９７［μｍ］３｝程度であるという知見を得た。
　観測領域ＯＡ内に発光粒子が数個しかない希薄な発光粒子の溶液で、このような大きさの観測領域ＯＡを移動させると、観測領域ＯＡ内の発光粒子の数が変動し、観測領域ＯＡから検出される光の強度も、その発光粒子の数に応じて変動する。
　観測領域ＯＡの移動を開始すると、情報収集部８２が、観測領域ＯＡを移動させて測定試料Ｆ内を走査する走査期間が終了するまでの間、光センサ７０の出力値をサンプリングして、各サンプリング期間内に測定された出力値の積算値を測定時刻（またはデータ入力時刻）に対応付けた時系列データを、記憶部９０に格納する（ステップＳ１０６）。
　次に、自己相関算出部８３が、時系列データに対して、測定時刻をずらしながら、元の時系列データとの自己相関関数を算出する（ステップＳ１０８）。
　図４は、時系列データの内容を模式的に示す棒グラフである。図中、白抜き棒は、測定対象である発光粒子による光センサの出力値（以下、光強度Ｆ（ｔ））を示し、黒塗り棒は、光センサ７０のアバランシェ・フォトダイオードのノイズ等による光強度Ｆ（ｔ）を示している。発光粒子による光強度Ｆ（ｔ）は、観測領域ＯＡを移動させる周期Ｔとほぼ一致した周期で現れるのに対し、ノイズによる光強度Ｆ（ｔ）は、一般的にランダムなタイミングで現れる。このため、測定時刻をずらしながら時系列データ同士で自己相関関数ｇ（ｔ）を求めると、発光粒子による光強度Ｆ（ｔ）が支配的要因となり、そのピーク値は、図５に示すように周期Ｔで現れることになる。従って、測定試料Ｆ中を周期的に走査しながら、発光強度の変動を自己相関関数で解析することにより、発光粒子の数、明るさ、拡散特性などを解析することが出来る。図５は、自己相関関数ｇ（ｄｔ）の推移を例示した図である。図中、ｄｔは、ずらし時間である。なお、１つの発光粒子が発する光強度は微弱であるため、観測領域の大きさを粒子のブラウン運動で動く距離よりも十分に大きくする必要がある。このため、蛍光相関分光法のように静止した光学系で発光粒子を解析することは困難である。
　自己相関関数ｇ（ｄｔ）は、例えば式（１）で表される。
　ｇ（ｄｔ）＝｛Ｆ（ｔ）・Ｆ（ｄｔ）－Ｆ２｝／Ｆ２　…（１）
　ここで、周期的に走査した場合の自己相関関数ｇ（ｄｔ）は、式（２）で表されることが判っている。式中、Ｎは、走査期間を通じて観察領域ＯＡ内に存在した平均的な発光粒子の数、すなわち発光粒子の濃度を示す値であり、Ｄは拡散定数であり、Ｔ０は走査周期であり、ｒは観測領域ＯＡの半径（ここでは観測領域ＯＡが球とみなせるものとするが、楕円である場合はＸＹ平面で切断した最大断面の円の半径）である。また、ｋは走査周期の回数（ｋ＝０，１，２，３，…）である。
　ｇ（ｄｔ）＝（１／Ｎ）・｛１＋（４・ｋ・Ｄ・Ｔ０／ｗ２）｝－１　…（２）
　フィッティング部８４は、自己相関算出部８３により算出された自己相関関数ｇ（ｄｔ）を、式（２）にフィッティングすることにより、平均的な発光粒子の数Ｎを導出する（ステップＳ１１２）。フィッティング部８４は、自己相関関数のＹ切片の逆数を求めることにより、粒子拡散特性に依存しない平均的な発光粒子の数Ｎを導出することができる。また、フィッティング部８４は、導出したＮを式（２）に代入することで、拡散定数Ｄを算出する。
　次に、解析部８５は、式（３）に従い、光強度Ｆ（ｔ）の合算値ΣＦ（ｔ）を、観測時間Ｔおよび平均的な発光粒子の数Ｎで除算することにより、１粒子辺りの明るさＣＰＰを算出する（ステップＳ１１４）。
　ＣＰＰ＝ΣＦ（ｔ）／（Ｔ・Ｎ）　…（３）
　なお、ステップＳ１０６とステップＳ１０８以下の処理は、連続して行われる必要はなく、例えば、観測領域ＯＡを移動させて時系列データを記憶部９０に格納する処理を、複数の異なる測定試料Ｆに対して行い、後日、複数セットの時系列データに対してまとめてステップＳ１０８以下の処理が行われてもよい。
　また、制御・解析装置８０は、発光酵素を含む溶液に発光基質を添加した時点から、光の強度Ｆ（ｔ）を測定開始した時点までの経過時間に基づいて、平均的な発光粒子の数Ｎなどを補正してよい。生物発光の輝度は反応開始時刻から減衰していくことが知られており、典型的には図６のように減衰する。図６は、生物発光の輝度の減衰例を示す図である。減衰速度は使用する発光基質、発光粒子に依存し異なるが、事前に計測しておくことにより、反応開始から経た時間を用いて発光粒子の濃度を補正することが可能である。制御・解析装置８０は、経過時間と光の減衰率を対応付けたマップ等を保持し、その逆の関係を有する補正係数を乗算する等によって、平均的な発光粒子の数Ｎなどを補正する。
　本出願の出願人は、上記説明した実施形態の効果を確認するためのシミュレーションを行った。このシミュレーションにおいて、発光粒子はルシフェラーゼを用いたものとし、ルシフェラーゼ濃度５［ａｍ］の溶液を用意し、測定のビンタイム（サンプリング周期）を１００［μｓ］、観測領域ＯＡの半径を０．４［ｍｍ］、走査速度０．２５［ｍｍ／ｓ］（走査周期２［ｓ］）で９００秒間の測定を仮定した。ただし、光検出に用いるアバランシェ・フォトダイオードのノイズを０．２［ｋＨｚ］、発光粒子の発光輝度を４［Ｈｚ］とし、時系列信号の各ビンタイムにおける観測光子数は、ポアソン分布に従う確率でランダムに発生させた。この結果、光強度Ｆ（ｔ）の推移は、図７に示すものとなった。図７は、シミュレーション結果として得られた光強度Ｆ（ｔ）の推移を示す図である。
　これに対し、実施形態で説明したように自己相関関数ｇ（ｄｔ）を求めたところ、図７に示すように、走査周期の整数倍に等しいずらし時間２［ｓ］、４［ｓ］、６［ｓ］に自己相関関数ｇ（ｄｔ）のピークが発生し、発光粒子が精度良く検出できることが判った。図８は、シミュレーション結果として得られた自己相関関数ｇ（ｄｔ）の推移を示す図である。
　以上説明した本実施形態の発光粒子解析方法によれば、観測領域ＯＡの体積が半径３０［μｍ］の球体の体積以上に設定した共焦点顕微鏡を用いて、発光粒子を含む試料中で観測領域ＯＡを周期的に移動させながら、観測領域ＯＡから発せられる光の強度Ｆ（ｔ）を測定し、得られた光の強度Ｆ（ｔ）について、測定時刻をずらしながら自己相関関数ｇ（ｄｔ）を算出し、算出された自己相関関数ｇ（ｄｔ）に基づいて、発光粒子の濃度を示す値Ｎや拡散定数Ｄ、１粒子辺りの明るさＣＰＰを求めるため、発光粒子に関する解析を高精度に行うことができる。
　ここで、非特許文献２に記載の方法は、周期的に同じ座標を観測して信号の揺らぎを解析するものであるが、観測できる光子の数を増やすべく観測領域を大きくしたり、周期を長くする（低速度で走査を行う）と、溶液中のラマン散乱によって高感度に解析を行うことができなくなってしまう。従って、観測領域ＯＡの体積が半径３０［μｍ］の球体の体積以上である発光粒子解析システム１の構成は、蛍光粒子を観測する場合には適用することができない。
　具体的には、水のラマン散乱の強度は、特許第５２５０１５２に示される構成の装置では、共焦点光学系の半径２［μｍ］にした場合、８［ｋＨｚ］である。このことから、水１分子当りのラマン散乱強度は、８．９［Ｈｚ／ｍｏｌｅｃｕｌｅ］である。また、蛍光色素１分子の発光量は２００－５００［ｋＨｚ］程度である。したがって、本願のような粒子測定で蛍光を観測した場合、背景光となるラマン散乱と蛍光色素の信号強度は観測領域の半径が２［μｍ］程度で一致する（図９参照）。図９は、蛍光輝度と観測領域との対応関係を示す図である。１００個程度の複数粒子が存在する条件下を想定しても、観測領域の半径は２０［μｍ］程度で背景光のラマン散乱強度と蛍光色素由来の信号強度は一致し、３０［μｍ］以上のような大きな観測領域では蛍光測定は成立しない。
　本発明は、化学、医療機器、コンピュータソフトウェア等の産業に利用することができる。
１　発光粒子解析システム
１０　測定容器
２０　対物レンズ
３０　光走査ユニット
４０　バリアフィルタ
５０　集光レンズ
６０　光ファイバ
７０　光センサ
８０　制御・解析装置
８１　駆動制御部
８２　情報収集部
８３　自己相関算出部
８４　フィッティング部
８５　解析部
９０　記憶部
ＯＡ　観測領域

Claims (4)

  1. 　発光粒子を含む試料を用意する工程と、
    　観測領域の体積を半径３０［μｍ］の球体の体積以上に設定した共焦点顕微鏡を用いて、前記発光粒子を含む試料中で前記観測領域を周期的に移動させながら、前記観測領域から発せられる光の強度を測定する工程と、
    　前記測定する工程において得られた光の強度について、測定時刻をずらしながら自己相関を示す指標値を算出する工程と、
    　前記算出された指標値に基づいて、前記発光粒子の濃度を示す値を導出する工程と、
    　を備える発光粒子解析方法。
  2. 　前記算出された指標値と、前記発光粒子の濃度を示す値とに基づいて、前記発光粒子の１粒子辺りの明るさを導出する工程を更に備える、
    　請求項１記載の発光粒子解析方法。
  3. 　前記発光粒子を含む試料を生成する工程として、発光酵素を含む溶液に発光基質を添加した時点から、前記光の強度を測定開始した時点までの経過時間に基づいて、前記導出される発光粒子の濃度を示す値を補正する工程を更に備える、
    　請求項１または２記載の発光粒子解析方法。
  4. 　前記観測領域の体積は半径１０００［μｍ］の球体の体積以下に設定される、
    　請求項１から３のうちいずれか１項記載の発光粒子解析方法。
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