WO2016068270A1 - リガンド結合繊維及び当該繊維を用いた細胞培養基材 - Google Patents

リガンド結合繊維及び当該繊維を用いた細胞培養基材 Download PDF

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group
fiber
fiber precursor
binding
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真紀子 梅嵜
高広 岸岡
泰斗 西野
彩子 相原
俊介 岩本
大輔 佐久間
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日産化学工業株式会社
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    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F6/00—Monocomponent artificial filaments or the like of synthetic polymers; Manufacture thereof

Definitions

  • the present invention relates to a ligand-binding fiber containing a ligand having affinity for a cell membrane receptor and a fiber precursor bound to the ligand, and a cell culture substrate using the ligand-binding fiber.
  • Physiological extracellular (inter) information transmitters ie, ligands
  • target cell membrane receptors are neurotransmitters, endocrine substances (hormones), low-molecular substances, cell growth / differentiation factors (cytokines, etc.), cell adhesion They can be classified into factors, each with a specific affinity for the target receptor in different secretory forms.
  • CD34 positive cells which are undifferentiated hematopoietic stem cells that are abundant in the bone marrow and slightly present in the blood.
  • TPO thrombopoietin
  • Patent Document 3 reports a biofunctional fiber including a biomolecule bonded to a polymer.
  • An object of the present invention is to provide a ligand-binding fiber in which a ligand having affinity for a cell membrane receptor is immobilized on a ligand-binding fiber precursor, and to express a cell membrane receptor using the ligand-binding fiber. It is to provide a cell culture substrate capable of repeatedly amplifying existing cells in vitro.
  • the present invention provides a cell culture substrate suitably used for in vitro culture of cells expressing a TPO receptor (for example, hematopoietic stem cells, hematopoietic progenitor cells, megakaryocyte progenitor cells, megakaryocytes, platelets, etc.).
  • TPO receptor for example, hematopoietic stem cells, hematopoietic progenitor cells, megakaryocyte progenitor cells, megakaryocytes, platelets, etc.
  • a ligand-binding fiber precursor As a result of intensive studies by the present inventors, it was produced by spinning a composition for producing a fiber precursor containing a polymer compound having an active ester group and a hydroxy group in the side chain, a crosslinking agent, an acid compound, and a solvent. It has been found that a ligand-binding fiber precursor has sufficient organic solvent resistance and can immobilize a ligand having affinity for a cell membrane receptor (for example, a ligand having affinity for a TPO receptor, etc.) It was found that the ligand-binding fiber thus obtained can be used as a cell culture substrate capable of repeatedly amplifying cells expressing a cell membrane receptor (eg, TPO receptor) in vitro. .
  • a cell membrane receptor eg, TPO receptor
  • the present inventors have spun the above-mentioned composition for producing a fiber precursor by spinning a polymer compound having an active ester group and a hydroxy group in the side chain together with a crosslinking agent and an acid compound.
  • a crosslinking agent As a result of cross-linking reaction between the hydroxy groups contained via a cross-linking agent, the polymer compounds cross-link each other, and as a result, it was found that a fiber precursor having organic solvent resistance and liquid medium resistance can be obtained.
  • the present inventors have found that the fiber precursor of the present invention expresses better organic solvent resistance and liquid medium resistance by performing heat treatment. Based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a ligand-binding fiber comprising a ligand having affinity for a cell membrane receptor and a ligand-binding fiber precursor (hereinafter referred to as a fiber precursor) bound to the ligand.
  • a fiber precursor a ligand-binding fiber precursor bound to the ligand.
  • TPO thrombopoietin
  • R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • Q 1 represents an ester bond or an amide bond
  • R 2 represents an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms or an aromatic hydrocarbon group having 6 to 10 carbon atoms in which at least one hydrogen atom is substituted with a hydroxy group.
  • R 3 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • Q 2 represents an active ester group.
  • the ligand is represented by the general formula (4):
  • X 1 represents a 3,4-dichlorophenyl group, a 4-trifluoromethylphenyl group, or a 4-t-butylphenyl group
  • X 2 represents an optionally substituted amino group
  • L 1 represents a single bond or —CH 2 —C 6 H 4 —
  • L 2 represents a single bond or —CONH—
  • L 3 represents an alkylene group having 2 to 6 carbon atoms.
  • the ligand-binding fiber according to any one of [1] to [10] which is a compound represented by: [12]
  • a cell culture substrate comprising the ligand-binding fiber according to any one of [1] to [12].
  • an excellent ligand-binding fiber that can be used as a cell culture substrate or the like that can repeatedly amplify cells expressing a cell membrane receptor (eg, TPO receptor) in vitro.
  • a cell membrane receptor eg, TPO receptor
  • the ligand-binding fiber of the present invention is mainly characterized by containing a ligand having affinity for a cell membrane receptor and a ligand-binding fiber precursor (hereinafter referred to as a fiber precursor) bound to the ligand.
  • Fiber precursor The fiber precursor contained in the ligand-binding fiber of the present invention (the precursor of the ligand-binding fiber of the present invention, that is, the fiber before binding of the ligand) can be bound by a ligand having affinity for the cell membrane receptor.
  • a ligand having affinity for the cell membrane receptor Preferably it contains the high molecular compound containing the unit structure represented by the unit structure represented by (A) general formula (1), and general formula (2), More preferably (B) A fiber precursor containing a crosslinking agent and (C) an acid compound (hereinafter also referred to as “fiber precursor of the present invention”).
  • fiber precursor of the present invention contains the high molecular compound containing the unit structure represented by the unit structure represented by (A) general formula (1), and general formula (2), More preferably (B) A fiber precursor containing a crosslinking agent and (C) an acid compound (hereinafter also referred to as “fiber precursor of the present invention”).
  • the fiber precursor of the present invention contains, as component A, a polymer compound containing a unit structure represented by general formula (1) and a unit structure represented by general formula (2) (hereinafter referred to as “polymer compound of component A”). Or simply referred to as “component A”). Since the unit structure represented by the general formula (1) contained in Component A has a hydroxy group in the side chain, by spinning Component A together with a cross-linking agent and an acid compound, the hydroxy groups are linked via the cross-linking agent. By crosslinking reaction, the polymer compounds are crosslinked with each other, and a fiber having organic solvent resistance is obtained.
  • the unit structure represented by the general formula (2) contained in Component A has an active ester group in the side chain, by a nucleophilic substitution reaction with an arbitrary amine (particularly, a primary alkylamine is preferable), A ligand or the like described later can be immobilized on the polymer compound.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • Q 1 represents an ester bond or an amide bond
  • R 2 represents an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms or an aromatic hydrocarbon group having 6 to 10 carbon atoms in which at least one hydrogen atom is substituted with a hydroxy group.
  • R 3 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • Q 2 represents an active ester group
  • R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group.
  • Q 1 represents an ester bond or an amide bond, and is preferably an ester bond from the viewpoint of solubility of the polymer compound of Component A in a solvent.
  • Q 2 represents an active ester group.
  • An “active ester group” refers to an ester group in which a carbonyl group is activated (susceptible to nucleophilic attack) by having an electron-withdrawing substituent on one side of the ester group. It is an ester group represented by Formula (3).
  • Q 3 represents a monovalent organic group (electron withdrawing group) that forms an active ester group, and specific examples thereof include an N-succinimide group, a p-nitrophenyl group, and a pentafluorophenyl group. However, from the viewpoint of cell affinity, an N-succinimide group is preferable.
  • R 2 represents an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms or an aromatic hydrocarbon group having 6 to 10 carbon atoms in which at least one hydrogen atom is substituted with a hydroxy group.
  • the alkyl group having 1 to 10 carbon atoms may be linear or branched, and specific examples thereof include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, butyl group, isobutyl group, sec-butyl.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group is preferably 1-6, more preferably 1-4.
  • Examples of the “aromatic hydrocarbon group having 6 to 10 carbon atoms” of the aromatic hydrocarbon group having 6 to 10 carbon atoms in which at least one hydrogen atom in R 2 is substituted with a hydroxy group include: , Phenyl group, 1-naphthyl group, 2-naphthyl group and the like.
  • R 2 is preferably a carbon atom number of 1 in which at least one hydrogen atom is substituted with a hydroxy group, from the viewpoint of the crosslinking reaction efficiency in the production of the fiber precursor and the cell affinity of the produced fiber precursor.
  • R 3 represents a hydrogen atom or a methyl group.
  • R 1 is a hydrogen atom or a methyl group
  • Q 1 is an ester bond
  • R 2 is substituted with at least one hydrogen atom by a hydroxy group.
  • the unit structure represented by the general formula (1) is preferably a unit structure represented by the general formula (5).
  • R 4 has the same meaning as R 1 above, and R 5 has the same meaning as R 2 above.
  • the unit structure represented by the general formula (2) is preferably a unit structure represented by the general formula (6).
  • R 6 represents a hydrogen atom or a methyl group.
  • the polymer compound of component A may contain a unit structure other than the unit structure represented by the general formula (1) and the unit structure represented by the general formula (2), as long as the object of the present invention is not impaired.
  • the ratio (mol%) of the unit structure represented by the general formula (1) to the total unit structure of the component A polymer compound is preferably 35 to 95 mol%.
  • the proportion (mol%) of the unit structure represented by the general formula (2) is preferably 5 to 65 mol%.
  • the total (mol%) of the ratio of the unit structure represented by the general formula (1) and the ratio of the unit structure represented by the general formula (2) to the total unit structure of the polymer compound of component A is From the viewpoint of polymerizability of the polymer compound, it is preferably more than 90 mol%, more preferably 95 mol% or more, and particularly preferably 100 mol%.
  • the ratio of each unit structure to the total unit structure of the polymer compound of component A can be calculated from the composition ratio of each unit structure measured by 13 C-NMR.
  • the weight average molecular weight of component A is preferably in the range of 1,000 to 1,000,000, more preferably in the range of 5,000 to 500,000, from the viewpoint of the organic solvent resistance of the fiber precursor. Particularly preferred is the range of 10,000 to 300,000.
  • “weight average molecular weight” means a molecular weight in terms of polystyrene measured by gel permeation chromatography (GPC).
  • Component A can be produced by a method known per se or a method analogous thereto.
  • a monomer corresponding to the unit structure represented by the general formula (1) and a monomer corresponding to the unit structure represented by the general formula (2) are mixed in an appropriate solvent (eg, acetonitrile).
  • an appropriate solvent eg, acetonitrile
  • It can be produced by polymerization using a suitable polymerization initiator (eg, 2,2′-azobis (isobutyric acid) dimethyl), but is not limited thereto.
  • a suitable polymerization initiator eg, 2,2′-azobis (isobutyric acid) dimethyl
  • Examples of the monomer corresponding to the unit structure represented by the general formula (1) include 2-hydroxyethyl (meth) acrylate (for example, a compound having CAS number: 868-77-9), 2-hydroxypropyl ( (Meth) acrylate (for example, a compound having CAS number: 923-26-2), 4-hydroxybutyl (meth) acrylate (for example, a compound having CAS number: 2478-10-6), N-hydroxymethyl (meth) acrylamide ( For example, a compound having CAS number: 923-02-4), N- (2-hydroxyethyl) (meth) acrylamide (for example, a compound having CAS number: 5238-56-2), N- (2-hydroxypropyl) ( (Meth) acrylamide (for example, a compound having CAS number: 26099-09-2), p-hydroxy (meth) acryl Anilide (for example, a compound having CAS number: 19243-95-9) and the like, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate or
  • Monomers corresponding to the unit structure represented by the general formula (2) include p-nitrophenyl (meth) acrylate (for example, a compound having CAS number: 16522-41-1), pentafluorophenyl (meth) acrylate. (For example, a compound having CAS number: 13642-97-2), N-acryloxysuccinimide (a compound having CAS number: 38862-24-7), N-succinimidyl methacrylate (CAS number: 38862-25-8) Compound), and N-succinimidyl methacrylate is most preferred.
  • p-nitrophenyl (meth) acrylate for example, a compound having CAS number: 16522-41-1
  • pentafluorophenyl (meth) acrylate for example, a compound having CAS number: 13642-97-2
  • N-acryloxysuccinimide a compound having CAS number: 38862-24-7
  • Component B The fiber precursor of the present invention preferably contains a crosslinking agent (hereinafter also referred to as “component B crosslinking agent” or simply “component B”) as component B.
  • component B can confer organic solvent resistance to the fiber precursor by cross-linking the hydroxy groups of component A through component B itself by using together with component C described later.
  • the crosslinking agent of component B is not particularly limited as long as it can react with a hydroxy group in the presence of an acid.
  • 1,3,4,6-tetrakis (methoxymethyl) glycoluril 1,3,4, Aminoplast crosslinking agents such as 6-tetrakis (butoxymethyl) glycoluril
  • phenoplast crosslinking agents such as 2,2-bis (4-hydroxy-3,5-dihydroxymethylphenyl) propane
  • isocyanate crosslinking agents such as hexamethylene diisocyanate
  • a vinyl ether crosslinking agent such as 1,4-bis (vinyloxy) butane
  • Component B is preferably an aminoplast crosslinker, preferably 1,3,4,6-tetrakis (hydroxymethyl) glycoluril (CAS number: 5395-50-6), 1,3,4,6-tetrakis.
  • (Methoxymethyl) glycoluril CAS number: 17464-88-9
  • 1,3,4,6-tetrakis ethoxymethyl glycoluril
  • 1,3,4,6 -Tetrakis (1-methylethoxy) glycoluril (CAS number: 508220-69-7)
  • 1,3,4,6-tetrakis butoxymethyl) glycoluril (CAS number: 15968-37-3)
  • Component B may be used alone or in combination of two or more.
  • the crosslinking agent of component B can be produced by a method known per se or a method analogous thereto. Moreover, you may use a commercial item.
  • the fiber precursor of the present invention preferably contains an acid compound (hereinafter also referred to as “acid compound of component C” or simply “component C”) as component C.
  • the acid compound may be in the form of a salt, that is, the term “acid compound” in the present invention is a concept including a salt.
  • Component C can be used together with Component B to promote the crosslinking reaction when the hydroxyl groups of Component A undergo a crosslinking reaction via Component B.
  • Examples of the acid compound of component C include organic acid compounds such as sulfonic acid compounds and carboxylic acid compounds; inorganic acid compounds such as hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, and hydrobromic acid.
  • Component C is preferably an organic acid compound, more preferably a sulfonic acid compound.
  • the sulfonic acid compound include p-toluenesulfonic acid, pyridinium-p-toluenesulfonate, trifluoromethanesulfonic acid and the like, and pyridinium-p-toluenesulfonate is preferable.
  • Component C may be used alone or in combination of two or more.
  • the acid compound of component C can be produced by a method known per se or a method analogous thereto. Moreover, you may use a commercial item.
  • the fiber precursor of the present invention may contain additives usually used for the fiber precursor as necessary, in addition to the components A to C, as long as the object of the present invention is not significantly impaired.
  • the additive include a surfactant, a rheology modifier, a drug, and fine particles.
  • the type of the fiber precursor of the present invention is not particularly limited.
  • the fiber precursor of the present invention is nano A fiber precursor (nanofiber precursor) having a diameter of metric order (eg, 1 to 1000 nm) or a fiber precursor (microfiber precursor) having a diameter of micrometer order (eg, 1 to 1000 ⁇ m).
  • nanofiber precursor is more preferable.
  • the diameter of the fiber precursor of the present invention may be appropriately adjusted according to the use of the ligand-binding fiber, etc. From the viewpoint of ease, it is preferably 1 to 1000 nm, more preferably 10 to 1000 nm. In the present invention, the diameter of the fiber precursor is measured with a scanning electron microscope (SEM). As for the length of the fiber precursor of this invention, it is desirable that it is 1000 times or more with respect to the diameter of the said fiber precursor.
  • the weight per unit area (weight per unit area) of the fiber precursor is, for example, 7 ⁇ g / cm 2 or more, preferably 10 ⁇ g / cm 2 or more.
  • the method for producing the fiber precursor of the present invention is not particularly limited as long as a method known per se is appropriately selected according to the components, types, and the like.
  • the fiber precursor of the present invention contains the components A to C described above.
  • the fiber precursor can be produced by spinning a composition for producing a fiber precursor containing components A to C and a solvent.
  • the solvent used in the present invention is not particularly limited as long as it can uniformly dissolve or disperse at least the components A to C and does not react with each component, but from the viewpoint of solubility of the components A to C, A polar solvent is preferred.
  • the polar solvent include water, methanol, ethanol, 2-propanol, propylene glycol monomethyl ether, acetone, dimethylformamide, dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, and the like for ease of spinning the composition.
  • Solvents may be used alone or in combination of two or more.
  • the content ratio of component A in the composition for producing a fiber precursor is preferably 5 to 50% by weight, more preferably 10 to 40% by weight, from the viewpoint of producing a fiber precursor having an appropriate thickness.
  • the content ratio of Component B in the fiber precursor production composition is preferably 0.1 to 5% by weight, and more preferably 0.2 to 4.5% by weight.
  • the weight ratio of component A to component B (weight of component A / weight of component B) contained in the fiber precursor production composition is preferably 5 to 65 from the viewpoint of reaction efficiency during production of the fiber precursor, 5 to 25 is more preferable.
  • the content ratio of component C in the production of the fiber precursor is preferably 0.01 to 1.0% by weight, more preferably 0.05 to 0.5% by weight, from the viewpoint of the crosslinking reaction rate and the crosslinking reaction efficiency. 0.07 to 0.4% by weight is particularly preferred.
  • the weight ratio of component A to component C (weight of component A / weight of component C) contained in the fiber precursor production composition is preferably 20 to 120, from the viewpoint of crosslinking reaction rate and crosslinking reaction efficiency, preferably 80 to 115 is more preferred.
  • composition for producing a fiber precursor may contain the same additive as the additive that the fiber precursor may contain, in addition to the components A to C and the solvent.
  • the composition for producing a fiber precursor can be prepared by mixing the above components A to C and the solvent, or mixing the components A to C, the solvent and the above additives.
  • the mixing method is not particularly limited, and may be mixed by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the spinning method of the composition for producing a fiber precursor is not particularly limited as long as it can form a fiber precursor, and examples thereof include a melt blow method, a composite melt spinning method, an electrospinning method, and the like from the viewpoint of fiber forming ability.
  • the electrospinning method is preferable.
  • the electrospinning method is a known spinning method and can be performed using a known electrospinning apparatus.
  • Various conditions such as the distance (discharge distance) to the substrate (collector portion) can be appropriately set according to the diameter of the fiber precursor to be manufactured.
  • the discharge rate is usually from 0.1 to 100 ⁇ l / min, preferably from 0.5 to 50 ⁇ l / min, more preferably from 1 to 20 ⁇ l / min.
  • the applied voltage is usually 0.5 to 80 kV, preferably 1 to 60 kV, more preferably 3 to 40 kV.
  • the discharge distance is usually 1 to 60 cm, preferably 2 to 40 cm, more preferably 3 to 30 cm.
  • the substrate (collector part) on which the fiber precursor is formed may or may not be conductive, for example, a resin substrate (eg, polystyrene substrate, acrylic substrate, polycarbonate substrate, polyethylene substrate, vinyl chloride substrate, polyethylene terephthalate).
  • a resin substrate eg, polystyrene substrate, acrylic substrate, polycarbonate substrate, polyethylene substrate, vinyl chloride substrate, polyethylene terephthalate.
  • Substrate eg, gold substrate, silver substrate, platinum substrate, etc., including a substrate whose surface is covered with metal (plated)
  • glass substrate silicon substrate, ceramic substrate, etc.
  • a resin substrate is preferable from the viewpoint of damage resistance of the substrate and ease of cell observation.
  • the substrate on which the fiber precursor is formed may be subjected to a surface treatment.
  • Examples of the surface treatment include metal (eg, Pt, Pd, Au, Ag, Cu, etc.) vapor deposition treatment, UV ozone treatment, and the like.
  • Substrates with low conductivity eg, resin substrates, etc.
  • the fiber precursor of the present invention is preferably formed in a layer on the substrate, but may have other structures.
  • the fiber precursor of the present invention may be used with a substrate on which the fiber precursor is formed, or may be used separately from the substrate.
  • the basis weight of the fiber precursor on the substrate (supported amount per unit area on the substrate) is usually 7 ⁇ g / cm 2 or more, preferably 10 ⁇ g / cm 2. Or more, more preferably 13 ⁇ g / cm 2 or more, and most preferably 15 ⁇ g / cm 2 or more.
  • the upper limit value of the basis weight of the fiber precursor in the substrate is not particularly limited, but is usually 15000 ⁇ g / cm 2 .
  • the spun fiber precursor After spinning the composition for producing a fiber precursor, the spun fiber precursor is preferably heated at a specific temperature. By heating the spun fiber precursor at a specific temperature, more excellent organic solvent resistance can be exhibited.
  • the temperature for heating the spun fiber precursor is usually 70 to 300 ° C., and preferably 80 to 250 ° C. from the viewpoint of the reactivity of the crosslinking agent of component B and the heat resistance of the polymer compound of component A. More preferably, the temperature is 90 to 200 ° C.
  • the temperature is less than 70 ° C., the crosslinking reaction between the components A is insufficient, and the organic solvent resistance of the manufactured fiber precursor tends to be low.
  • the temperature exceeds 300 ° C. the polymer compound of the component A The fiber itself cannot be decomposed or melted to form a fiber precursor.
  • the method for heating the spun fiber precursor is not particularly limited as long as it can be heated at the above heating temperature, and can be appropriately heated by a method known per se or a method analogous thereto.
  • Specific examples of the heating method include a method using a hot plate or an oven in the atmosphere.
  • the time for heating the spun fiber precursor can be appropriately set according to the heating temperature or the like, but from the viewpoint of the crosslinking reaction rate and production efficiency, it is preferably 1 minute to 48 hours, more preferably 5 minutes to 36 hours, 10 minutes to 24 hours are particularly preferred.
  • the ligand contained in the ligand-binding fiber of the present invention is preferably one having affinity for the cell membrane receptor and capable of binding to the fiber precursor.
  • the ligand may be a synthetic ligand.
  • synthetic ligand refers to a ligand obtained only by artificial production from an organic substance that does not exist in nature by a chemical synthesis method.
  • a synthetic peptide is not a “synthetic ligand” as used herein.
  • Examples of the ligand used in the present invention include proteins, peptides, amino acids, amino acid derivatives and saccharides.
  • the ligand may be a natural one, or one obtained by artificial synthesis or one obtained by genetic manipulation.
  • the protein examples include carcinoembryonic antigen, squamous cell carcinoma-related antigen, cytokeratin 19 fragment, sialylated sugar chain antigen KL-6, natriuretic peptide, troponin, myoglobin and other disease markers, interleukin-1 (IL -1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-3 (IL-3), interleukin-4 (IL-4), interleukin-5 (IL-5), interleukin-6 (IL -6), interleukin-7 (IL-7), interleukin-8 (IL-8), interleukin-9 (IL-9), interleukin-10 (IL-10), interleukin-11 (IL -11), interleukin-12 (IL-12), interleukin-13 (IL-13), interleukin-1 (IL-14), interleukin-15 (IL-15), interleukin-18 (IL-18), interleukin-21 (IL-21), interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ), interferon- ⁇ (IFN - ⁇ ), interferon- ⁇ (
  • Examples of the peptide include angiotensin I to IV, bradykinin, fibrinopeptide, natriuretic peptide, urodilatin, guanylin, endothelin 1 to 3, salusin, urotensin, oxytocin, neurophysin, vasopressin, adrenocorticotropic hormone, melanocyte Stimulating hormone, Endorphin, Lipotropin, Urocortin 1 to 3, Luteinizing hormone releasing hormone, Growth hormone releasing hormone, Somatostatin, Cortisatin, Prolactin releasing peptide, Metastin, Tachykinin, Substance P, Neurokinin, Endokinin, Neurotensin, Neuromedin, Zenin , Ghrelin, obestatin, melanin-concentrating hormone, orexin, neuropeptide, dynorphin, neoene Rufin, endomorphin, nociceptin, pyroglutamylated
  • amino acids examples include alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, cystine, hydroxyproline.
  • Hydroxylysine dihydroxyphenylalanine, thyroxine, phosphoserine, desmosine, ⁇ -alanine, sarcosine, ornithine, creatine, ⁇ -aminobutyric acid, theanine, kainic acid, domoic acid, ibotenic acid and the like.
  • amino acid derivatives examples include serotonin, noradrenaline, adrenaline, tyramine (CAS number: 51-67-2 compound), dopamine (CAS number: 51-61-6 compound) and the like.
  • saccharide examples include D-glucosamine, D-galactosamine, neuraminic acid, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, heparan sulfate, and heparin.
  • chemical substances other than proteins, peptides, amino acids, amino acid derivatives, and saccharides may be used as ligands.
  • chemical substances include 2-dimethylaminoethylamine (a compound having CAS number: 108-00-9), N- (2-hydroxyethyl) ethylenediamine (a compound having CAS number: 111-41-1), N- (2-aminoethyl) piperazine (a compound having CAS number: 140-31-8), 4- (2-aminoethyl) morpholine (a compound having CAS number: 2038-03-1), 1- (2-amino Ethyl) -2-imidazolidone (compound with CAS number: 6281-42-1), tryptoamine (compound with CAS number: 61-54-1), histamine dihydrochloride (compound with CAS number: 56-92-8), etc.
  • a ligand having affinity for the thrombopoietin (TPO) receptor may be used as the ligand.
  • ligands having affinity for the thrombopoietin (TPO) receptor include, for example, JP-A-11-1477, JP-A-11-152276, WO01 / 07423, WO01 / 53267, WO 02/059099, WO 02/059100, WO 00/35446, WO 00/66112, WO 01/34585, WO 01/17349, WO 01/17349 01/39773, International Publication No. 01/21180, International Publication No. 01/89457, International Publication No. 02/49413, International Publication No.
  • the form of the bond between the fiber precursor of the present invention and the ligand is not particularly limited as long as both are bonded, but as one aspect, the fiber precursor of the present invention contains the polymer compound of component A, and the ligand When has an amino group, the amino group of the ligand and Q 2 of component A can be coupled by a nucleophilic substitution reaction.
  • the ligand having an amino group include compounds obtained by converting a carboxylic acid of the above-exemplified compounds into a carboxylic acid amide and then amination by a Hofmann rearrangement reaction or the like.
  • a part of the substituents of the compounds exemplified above as the ligand used in the present invention may be aminated by a method known per se and used as the ligand of the present invention.
  • a compound represented by the general formula (4) (hereinafter also referred to as “compound (4)”) may be mentioned.
  • X 1 represents a 3,4-dichlorophenyl group, a 4-trifluoromethylphenyl group, or a 4-t-butylphenyl group
  • X 2 represents an optionally substituted amino group
  • L 1 represents a single bond or —CH 2 —C 6 H 4 —
  • L 2 represents a single bond or —CONH—
  • L 3 represents an alkylene group having 2 to 6 carbon atoms.
  • X 1 represents a 3,4-dichlorophenyl group, a 4-trifluoromethylphenyl group or a 4-t-butylphenyl group, preferably a 4-t-butylphenyl group.
  • X 2 represents an optionally substituted amino group.
  • “optionally substituted” means that it may have one or more substituents unless otherwise specified.
  • substituents include Methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, t-butyl group, allyl group, phenyl group, benzyl group, and the like.
  • X 2 is preferably an amino group.
  • L 1 represents a single bond or —CH 2 —C 6 H 4 —, and preferably a single bond.
  • L 2 represents a single bond or —CONH—, and preferably a single bond.
  • L 3 represents an alkylene group having 2 to 6 carbon atoms.
  • the alkylene group having 2 to 6 carbon atoms may be linear, branched or cyclic.
  • an alkylene group having 2 to 4 carbon atoms is preferable, and an alkylene group having 2 to 3 carbon atoms is more preferable.
  • Suitable compounds (4) include X 1 is a 4-t-butylphenyl group, X 2 is preferably an amino group, L 1 is a single bond or —CH 2 —C 6 H 4 — (preferably a single bond); L 2 is a single bond or —CONH— (preferably a single bond); In the compound (4), L 3 is an alkylene group having 2 to 6 (preferably 2 to 4, more preferably 2 to 3) carbon atoms.
  • Suitable compound (4) include compounds represented by the following formulas (16) to (18).
  • Compound (4) can be produced, for example, by the method described in Japanese Patent No. 4386072 or a method analogous thereto.
  • the form of bonding between the fiber precursor and the ligand is not particularly limited as long as both are bonded, but as one aspect, a fiber precursor having an active ester group (for example, the fiber precursor of the present invention).
  • the ligand having affinity for the cell membrane receptor can be immobilized on the fiber precursor by the reaction between the active ester group present in the fiber precursor and the ligand.
  • the active ester group reacts with the free amino group under neutral conditions.
  • the basicity of amines is stronger for alkylamines than aromatic amines, and alkylamines are more suitable for reaction with active esters.
  • reaction of an active ester group and a ligand can be performed at the time of preparation of the composition for fiber precursor manufacture. Moreover, it may be performed after spinning the composition for fiber precursor manufacture and manufacturing a fiber precursor, and may be performed after heat-treating a fiber precursor.
  • the reaction conditions are preferably 0 to 80 ° C. for 1 to 48 hours, more preferably 0 to 60 ° C. for 1 to 24 hours, and most preferably 0 to 50 ° C. for 1 to 24 hours. .
  • the diameter of the ligand-binding fiber of the present invention may be appropriately adjusted according to its use and the like, preferably 1 to 1000 nm, more preferably 10 to 1000 nm.
  • the diameter of the ligand-binding fiber is measured with a scanning electron microscope (SEM).
  • the length of the ligand-binding fiber of the present invention is preferably 1000 times or more with respect to the diameter.
  • the ligand-binding fiber of the present invention can be used while being supported on a substrate.
  • the basis weight of the ligand-binding fibers on the substrate (supported amount per unit area on the substrate) is usually 7 ⁇ g / cm 2 or more, preferably 10 ⁇ g / cm 2 or more, more preferably 13 ⁇ g / cm 2. Or more, most preferably 15 ⁇ g / cm 2 or more.
  • the upper limit of the basis weight of the ligand-binding fiber in the substrate is not particularly limited, but is usually 15000 ⁇ g / cm 2 .
  • the basis weight of the fiber precursor and the basis weight of the ligand-binding fiber are almost the same (within an error range).
  • the use of the ligand-binding fiber of the present invention is not particularly limited, but as shown in the examples below, the ligand-binding fiber of the present invention has excellent organic solvent resistance and functions sufficiently as a cell culture substrate. Therefore, it is particularly suitable for cell culture substrates (for example, cell culture scaffold materials).
  • Cell culture substrate The cell culture substrate of the present invention is characterized mainly by containing the ligand-binding fiber of the present invention.
  • the “cell culture substrate” refers to a material that can selectively culture only specific cells without adversely affecting the cells.
  • Examples of the cell culture substrate of the present invention include a cell culture substrate (for example, a 6-well flat-bottom microplate) obtained by spraying the ligand-binding fiber of the present invention on glass, metal, and plastic such as polystyrene. And culture bags into which the ligand-binding fibers are introduced.
  • a cell culture substrate for example, a 6-well flat-bottom microplate
  • glass, metal, and plastic such as polystyrene.
  • plastic such as polystyrene
  • the “cell” cultured using the cell culture substrate of the present invention is the most basic unit constituting an animal or plant, and has as its elements a cytoplasm and various organelles inside the cell membrane. It is. At this time, the nucleus containing DNA may or may not be contained inside the cell.
  • the cell culture substrate of the present invention can be used, for example, for culturing animal-derived cells.
  • the animal-derived cells in the present invention include germ cells such as sperm and eggs, somatic cells constituting the living body, stem cells (including pluripotent stem cells), progenitor cells, cancer cells separated from the living body, and separated from the living body.
  • Cells that have acquired immortalization ability and are stably maintained outside the body ie, cell lines (including cancer cell lines)
  • cells that have been artificially altered by being isolated from living organisms, and isolated from living organisms Includes cells with artificially exchanged nuclei.
  • somatic cells constituting a living body include, but are not limited to, fibroblasts, bone marrow cells, B lymphocytes, T lymphocytes, neutrophils, erythrocytes, platelets, macrophages, monocytes, bones Cells, bone marrow cells, pericytes, dendritic cells, keratinocytes, adipocytes, mesenchymal cells, epithelial cells, epidermal cells, endothelial cells, vascular endothelial cells, hepatocytes, chondrocytes, cumulus cells, nervous system cells, Glial cells, neurons, oligodendrocytes, microglia, astrocytes, heart cells, esophageal cells, muscle cells (eg smooth or skeletal muscle cells), pancreatic beta cells, melanocytes, hematopoietic progenitor cells (eg Umbilical cord blood-derived CD34 positive cells), mononuclear cells and the like.
  • fibroblasts
  • the somatic cells are, for example, skin, kidney, spleen, adrenal gland, liver, lung, ovary, pancreas, uterus, stomach, colon, small intestine, large intestine, bladder, prostate, testis, thymus, muscle, connective tissue, bone, cartilage, blood vessel It can be taken from any tissue such as tissue, blood (including umbilical cord blood), bone marrow, heart, eye, brain or nerve tissue.
  • a stem cell is a cell that has the ability to replicate itself and to differentiate into cells of other multiple lineages. Examples thereof include, but are not limited to, embryonic stem cells (ES cells) Embryonic tumor cells, embryonic germ stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS cells), neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, muscle stem cells, germ stem cells, intestinal stem cells, cancer stem cells, Examples thereof include hair follicle stem cells. Examples of pluripotent stem cells include ES cells, embryonic germ stem cells, iPS cells, etc. among the stem cells.
  • Progenitor cells are cells that are in the process of being differentiated from the stem cells into specific somatic cells or germ cells.
  • Cancer cells are cells that have been derived from somatic cells and have acquired infinite proliferation ability.
  • cell lines include, but are not limited to, HEK293 (human embryonic kidney cells), MDCK, MDBK, BHK, C-33A, AE-1, 3D9, Ns0 / 1, NIH3T3, PC12, S2 , Sf9, Sf21, High Five (registered trademark), Vero, and the like.
  • cancer cell lines include, but are not limited to, human breast cancer cell lines HBC-4, BSY-1, BSY-2, MCF-7, MCF-7 / ADR RES, HS578T, MDA- MB-231, MDA-MB-435, MDA-N, BT-549, T47D, HeLa as human cervical cancer cell line, A549 as human lung cancer cell line, EKVX, HOP-62, HOP-92, NCI-H23 , NCI-H226, NCI-H322M, NCI-H460, NCI-H522, DMS273, DMS114, human colorectal cancer cell lines Caco-2, COLO-205, HCC-2998, HCT-15, HCT-116, HT- 29, KM-12, SW-620, WiDr, DU-145, P as a human prostate cancer cell line -3, LNCaP, U251, SF-295, SF-539, SF-268, SNB-75, SNB-78, SNB
  • cells cultured using a cell culture substrate eg, cell culture scaffold material
  • a cell culture substrate eg, cell culture scaffold material
  • a ligand having affinity for TPO receptor include: , Hematopoietic stem cells, hematopoietic progenitor cells, megakaryocyte progenitor cells, megakaryocytes, platelets, UT7 / TPO cells and the like expressing the TPO receptor.
  • the cell culture substrate of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto, using the ligand-binding fiber of the present invention as one of raw materials.
  • the reaction mixture was dropped into diethyl ether to precipitate a polymer. After taking out the polymer, it was dried under reduced pressure to obtain 19.9 g of polymer compound 1.
  • the weight average molecular weight of the polymer compound 1 was 235,000 in terms of polystyrene.
  • composition 1 for fiber precursor production Polymer compound 1; 1.70 g, 1,3,4,6-tetrakis (methoxymethyl) glycoluril 0.34 g, pyridinium-p-toluenesulfonate 0.017 g, dimethylacetamide 1.57 g, and acetone 4.50 g After mixing, the mixture was stirred at 100 rpm until dissolved with a mix rotor VMR-5 (manufactured by ASONE Co., Ltd.) to obtain a composition 1 for fiber precursor production.
  • the content rate of the high molecular compound 1 in the said fiber precursor manufacturing composition 1 is about 21 weight%.
  • the production of the fiber precursor by the electrospinning method was carried out using Esplayer ES-2000 (manufactured by Fuence Co., Ltd.).
  • the composition 1 for producing a fiber precursor was poured into a 1 ml lock-type glass syringe (manufactured by As One Co., Ltd.), and a lock-type metal needle 24G (manufactured by Musashi Engineering Co., Ltd.) having a needle length of 13 mm was attached.
  • the distance (discharge distance) from the tip of the needle to the substrate that receives the fibers was 20 cm.
  • the applied voltage was 25 kV, and the ejection speed was 10 ⁇ l / min.
  • the fiber diameter of the fiber precursor (the thickness of the fiber precursor) was measured using a scanning electron microscope (SEM) (S-4800, manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation) at an image magnification of 10,000 times. After shooting and storing, the measurement was performed using the attached measuring tool.
  • SEM scanning electron microscope
  • PSt substrate surface treatment A One side of a ⁇ 30mm polystyrene (PSt) substrate made from “Plaban” (trade name; thickness: 0.2mm) manufactured by Acrysanday Co., Ltd. for 30 seconds by ion sputtering (E-1030, manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation). Vapor deposited.
  • Example 1 The fiber precursor production composition 1 was spun by electrospinning and sprayed on a ⁇ 30 mm PSt substrate subjected to the surface treatment A for 20 minutes, followed by heat treatment at 80 ° C. for 48 hours.
  • the obtained fiber precursor (fiber precursor 1) was washed with ethanol and air-dried, and then the shape of the fiber precursor 1 was confirmed with a scanning electron microscope (SEM).
  • the fiber diameter of the fiber precursor 1 was about 700 nm.
  • Ligand compound [4] was immobilized on fiber precursor 1 by the method described later to obtain fiber precursor 1 (ligand-binding fiber 1) on which ligand compound [4] was immobilized.
  • Example 2 A fiber precursor 2 was obtained in the same manner as in Example 1 except that a ⁇ 30 mm PSt substrate subjected to the surface treatment B was used instead of the ⁇ 30 mm PSt substrate subjected to the surface treatment A.
  • the fiber diameter of the fiber precursor 2 was about 700 nm.
  • Ligand compound [4] was immobilized on fiber precursor 2 by a method described later to obtain fiber precursor 2 (ligand-binding fiber 2) on which ligand compound [4] was immobilized.
  • Example 3 A fiber precursor 3 was obtained in the same manner as in Example 1 except that an untreated ⁇ 30 mm PSt substrate was used instead of the ⁇ 30 mm PSt substrate subjected to the surface treatment A.
  • the fiber diameter of the fiber precursor 3 was about 570 nm.
  • Ligand compound [4] was immobilized on fiber precursor 3 by the method described later to obtain fiber precursor 3 (ligand binding fiber 3) on which ligand compound [4] was immobilized.
  • Example 1 The fiber precursor 1 obtained in Example 1 was used as the fiber of Comparative Example 1 without immobilizing the ligand compound [4].
  • the ligand-binding fibers 1 to 3 of Examples 1 to 3 and the fibers of Comparative Example 1 were used together with a substrate on which a fiber precursor was formed.
  • Comparative Example 2 A ⁇ 30 mm PSt substrate subjected to the surface treatment A was used as the substrate of Comparative Example 2.
  • Table 1 shows the fiber precursor weights of the ligand-binding fibers 1 to 3 of Examples 1 to 3 and the fibers of Comparative Example 1.
  • the fiber precursor weight of the ligand-binding fibers 1 to 3 and the fiber precursor weight of the fiber of Comparative Example 1 were determined by measuring the total weight of the fiber precursor and the PSt substrate supporting the fiber precursor, Calculated by subtracting the weight.
  • ⁇ Test Example 1 Cell culture evaluation> Cell culture evaluation was performed on the ligand-binding fiber 1 of Example 1 and the fiber of Comparative Example 1. As a control in the evaluation, a system in which a PSt substrate was placed (positive control: thrombopoietin (TPO) 10 ng / mL was added to the medium, negative control: medium only) was used. In the following, the concentration (%) of CO 2 in the CO 2 incubator is indicated by volume% of CO 2 in the atmosphere.
  • TPO thrombopoietin
  • the cells used were TPO-dependent human megakaryoblastic leukemia cell line (UT-7 / TPO; Komatsu et al., Blood, 1996, 87, pp. 4552-4560).
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • 10% (v / v) FBS and 10 ng / mL TPO (Thrombopoietin, manufactured by Peprotech Co., Ltd.) was used.
  • the cells were cultured for 2 days or more in a state where 5% carbon dioxide concentration was maintained in a 37 ° C. CO 2 incubator.
  • the obtained culture solution is centrifuged (Tomy Seiko Co., Ltd., LC-200, 1500 rpm / 3 minutes, room temperature), then the supernatant is removed, and the above IMDM medium from which TPO is removed is added to the cell suspension.
  • FBS means fetal bovine serum (manufactured by Biological Industries).
  • TPO was added to the well on which the PSt substrate for positive control was placed to a final concentration of 10 ng / mL. Then, it was allowed to stand in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 6 days while maintaining a 5% carbon dioxide concentration.
  • the ligand-binding fibers 1 to 3 of Examples 1 to 3 and the PSt substrates for positive control and negative control were washed twice with 4 mL of phosphate buffered saline (PBS). Thereafter, a cell suspension of UT-7 / TPO prepared to 8.0 ⁇ 10 4 cells / 4 mL / well was added. TPO was added to the well in which the positive control PSt substrate was placed to a final concentration of 10 ng / mL. Then, it was allowed to stand in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 6 days while maintaining a 5% carbon dioxide concentration. After culturing for 6 days, the number of cells was measured using WST-8 in the same manner as described above. After the second cell culture and cell count, the third cell culture (6 days) and cell count were performed in the same manner.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Results are shown in Tables 2 and 3. The number of cells in each sample was compared in terms of percentage with the number of positive control cells as 100%.
  • the fiber diameter of the ligand-binding fiber is 100 nm or more
  • the basis weight of the fiber precursor in the substrate is 10 ⁇ g / cm 2 or more, more preferably 13 ⁇ g / cm 2 or more, most preferably 15 ⁇ g / cm 2 or more.
  • the number of cells equal to or greater than that of the positive control was obtained.
  • a ligand-binding fiber formed by immobilizing a ligand to a fiber precursor, and the ligand-binding fiber can efficiently and repeatedly proliferate only the target cells.
  • the ligand-binding fiber In the field of regenerative medicine, It exhibits excellent functions as a cell culture substrate.

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Abstract

　本発明の目的は、細胞膜受容体に親和性のあるリガンドが繊維前駆体に固定化されてなるリガンド結合繊維を提供すること、及び該リガンド結合繊維を用いて、特定の細胞膜受容体を発現している細胞の増幅を生体外において繰り返し行うことが可能な細胞培養基材を提供することである。　細胞膜受容体に親和性のあるリガンド、及び当該リガンドと結合している繊維前駆体を含む、リガンド結合繊維。

Description

リガンド結合繊維及び当該繊維を用いた細胞培養基材
　本発明は、細胞膜受容体に親和性のあるリガンド及び該リガンドと結合している繊維前駆体を含むリガンド結合繊維、並びに当該リガンド結合繊維を用いた細胞培養基材に関する。
　多細胞生物の細胞表面には数多くの細胞膜受容体が存在し、細胞外部から与えられた情報を受信し、細胞内への情報に変換する役割を担っている。細胞膜受容体を標的とする生理的細胞外（間）情報伝達物質（即ち、リガンド）は、神経伝達物質、内分泌物質（ホルモン）、低分子物質、細胞増殖・分化因子（サイトカインなど）、細胞接着因子に分類でき、それぞれ異なった分泌形式で標的とする受容体と特異的に親和性を持つ。
　細胞膜受容体とリガンドとの反応性を利用して、さまざまな研究が従来より行われている。例えば、悪性リンパ腫などの治療には、骨髄に多く、血液中にわずかに存在する未分化な造血幹細胞であるＣＤ３４陽性細胞を血液中から採取して移植する方法があるが、ＣＤ３４陽性細胞の膜表面に存在するトロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体を活性化するリガンド（抗体）を用いることで、ＣＤ３４陽性細胞の増殖や分化の促進、骨髄への生着の増加、造血能の回復を促進させることができるという報告がある（特許文献１）。
　しかしながら、ＴＰＯ受容体を活性化するリガンドが体内に取り込まれ、当該リガンドの血中濃度が変化すると、別の疾病を引き起こす危険性がある。
　一方、ＣＤ３４陽性細胞の未分化性を維持したまま生体外で増殖させるため、リガンド（ノッチリガンドデルタ１）を樹脂に固定化する方法が報告されている（特許文献２）。
　しかしながら、上述の方法によっては、一般的な有機樹脂（ポリメチルメタクリレートなど）上にリガンドを固定化させるために、樹脂に前処理が必要となり、作業の手間がかかってしまうという問題があった。
　一方、特許文献３には、ポリマーに結合された生体分子を備えた生体機能繊維が報告されている。
国際公開第２００７／１４５２２７号 特開２００５－１０２６５６号公報 特表２００４－５２９７４０号公報
　本発明の目的は、細胞膜受容体に親和性のあるリガンドがリガンド結合繊維前駆体に固定化されたリガンド結合繊維を提供すること、及び該リガンド結合繊維を用いて、細胞膜受容体を発現している細胞の増幅を生体外において繰り返し行うことが可能な細胞培養基材を提供することである。特に、本発明は、ＴＰＯ受容体を発現している細胞（例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、巨核球前駆細胞、巨核球、血小板等）の生体外培養に好適に用いられる細胞培養基材を提供することを目的の一つとする。
　本発明者らが鋭意検討した結果、活性エステル基とヒドロキシ基とを側鎖に有する高分子化合物、架橋剤、酸化合物、及び溶剤を含有する繊維前駆体製造用組成物を紡糸して製造したリガンド結合繊維前駆体は、十分な有機溶媒耐性を有し、細胞膜受容体に親和性のあるリガンド（例えば、ＴＰＯ受容体に親和性のあるリガンド等）を固定化できることを見出し、更には、そのようにして得られたリガンド結合繊維は、細胞膜受容体（例えば、ＴＰＯ受容体等）を発現している細胞の増幅を生体外において繰り返し行うことが可能な細胞培養基材として利用できることを見出した。
　また本発明者らは、上記繊維前駆体製造用組成物の紡糸は、活性エステル基とヒドロキシ基とを側鎖に有する高分子化合物を架橋剤及び酸化合物とともに紡糸することから、高分子化合物に含まれるヒドロキシ基同士が架橋剤を介して架橋反応することにより、高分子化合物同士が架橋する結果、有機溶剤耐性、液体培地耐性を有する繊維前駆体が得られることを見出した。
　また、本発明者らは、本発明の繊維前駆体は、加熱処理を施すことにより、より優れた有機溶剤耐性、液体培地耐性を発現することを見出した。
　これらの知見に基づき、本発明者らは本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］細胞膜受容体に親和性のあるリガンド、及び当該リガンドと結合しているリガンド結合繊維前駆体（以下、繊維前駆体と称する）を含む、リガンド結合繊維。
［２］上記細胞膜受容体が、トロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体である、［１］記載のリガンド結合繊維。
［３］上記繊維前駆体が、一般式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
〔式中、
　Ｒ１は、水素原子又はメチル基を示し、
　Ｑ１は、エステル結合又はアミド結合を示し、
　Ｒ２は、少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数１～１０のアルキル基又は炭素原子数６～１０の芳香族炭化水素基を示す。〕
で表される単位構造、及び一般式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
〔式中、
　Ｒ３は、水素原子又はメチル基を示し、
　Ｑ２は、活性エステル基を示す。〕
で表される単位構造を含む高分子化合物を含有する、［１］又は［２］記載のリガンド結合繊維。
［４］上記リガンドがアミノ基を有し、当該アミノ基と上記Ｑ２とが結合している、［３］記載のリガンド結合繊維。
［５］上記Ｑ２が、一般式（３）で表される、［３］又は［４］記載のリガンド結合繊維。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
〔式中、Ｑ３は、Ｎ－スクシンイミド基、ｐ－ニトロフェニル基又はペンタフルオロフェニル基を示す。〕
［６］上記繊維前駆体が、架橋剤及び酸化合物を更に含有する、［３］～［５］のいずれか１つに記載のリガンド結合繊維。
［７］上記繊維前駆体が、上記高分子化合物、架橋剤、酸化合物及び溶剤を含有する繊維前駆体製造用組成物を紡糸して製造されたものである、［３］～［６］のいずれか１つに記載のリガンド結合繊維。
［８］上記繊維前駆体が、表面処理を施された基板上に上記繊維前駆体製造用組成物を紡糸して製造されたものである、［７］記載のリガンド結合繊維。
［９］上記高分子化合物の重量平均分子量が、１，０００～１，０００，０００である、［３］～［８］のいずれか１つに記載のリガンド結合繊維。
［１０］上記繊維前駆体が、７０～３００℃で加熱されて製造されたものである、［１］～［９］のいずれか１つに記載のリガンド結合繊維。
［１１］上記リガンドが、一般式（４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
〔式中、
　Ｘ１は、３，４－ジクロロフェニル基、４－トリフルオロメチルフェニル基又は４－ｔ－ブチルフェニル基を示し、
　Ｘ２は、置換されていてもよいアミノ基を示し、
　Ｌ１は、単結合又は－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－を示し、
　Ｌ２は、単結合又は－ＣＯＮＨ－を示し、
　Ｌ３は、炭素原子数２～６のアルキレン基を示す。〕
で表される化合物である、［１］～［１０］のいずれか１つに記載のリガンド結合繊維。
［１２］Ｘ１が４－ｔ－ブチルフェニル基であり、Ｘ２がアミノ基である、［１１］記載のリガンド結合繊維。
［１３］［１］～［１２］のいずれか１つに記載のリガンド結合繊維を含む、細胞培養基材。
　本発明によれば、細胞膜受容体（例えば、ＴＰＯ受容体等）を発現している細胞の増幅を生体外において繰り返し行うことが可能な細胞培養基材等として利用し得る優れたリガンド結合繊維を提供できる。
　本発明のリガンド結合繊維は、細胞膜受容体に親和性のあるリガンド、及び当該リガンドと結合しているリガンド結合繊維前駆体（以下、繊維前駆体と称する）を含むことを主たる特徴とする。
１．繊維前駆体
　本発明のリガンド結合繊維に含まれる繊維前駆体（本発明のリガンド結合繊維の前駆体、即ちリガンドが結合する前の繊維）は、細胞膜受容体に親和性のあるリガンドが結合し得るものであれば特に制限されないが、好ましくは（Ａ）一般式（１）で表される単位構造及び一般式（２）で表される単位構造を含む高分子化合物を含有し、より好ましくは更に（Ｂ）架橋剤及び（Ｃ）酸化合物を含有する繊維前駆体（以下、「本発明の繊維前駆体」とも称する）である。
　本発明の繊維前駆体が含有し得る各成分について、以下に詳述する。
［成分Ａ］
　本発明の繊維前駆体は成分Ａとして、一般式（１）で表される単位構造及び一般式（２）で表される単位構造を含む高分子化合物（以下、「成分Ａの高分子化合物」又は単に「成分Ａ」とも称する）を含有することが好ましい。成分Ａに含まれる一般式（１）で表される単位構造は、側鎖にヒドロキシ基を有するため、成分Ａを架橋剤及び酸化合物とともに紡糸することにより、ヒドロキシ基同士が架橋剤を介して架橋反応することにより高分子化合物同士が架橋し、有機溶剤耐性を有する繊維が得られる。また、成分Ａに含まれる一般式（２）で表される単位構造は、側鎖に活性エステル基を有するため、任意のアミン（特に、一級アルキルアミンが好ましい）との求核置換反応によって、後述のリガンド等を高分子化合物に固定化することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
〔式中、
　Ｒ１は、水素原子又はメチル基を示し、
　Ｑ１は、エステル結合又はアミド結合を示し、
　Ｒ２は、少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数１～１０のアルキル基又は炭素原子数６～１０の芳香族炭化水素基を示す。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
〔式中、
　Ｒ３は、水素原子又はメチル基を示し、
　Ｑ２は、活性エステル基を示す。〕
　一般式（１）及び一般式（２）における各基の定義について、以下に詳述する。
　Ｒ１は、水素原子又はメチル基を示す。
　Ｑ１は、エステル結合又はアミド結合を示し、成分Ａの高分子化合物の溶剤に対する溶解性の観点から、好ましくはエステル結合である。
　Ｑ２は、活性エステル基を示す。「活性エステル基」とは、エステル基の片方に電子求引性の置換基を有することによってカルボニル基が活性化された（求核攻撃を受けやすい）エステル基をいい、具体的には、一般式（３）で表されるエステル基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　式中、Ｑ３は活性エステル基を形成する１価の有機基（電子求引性基）を示し、その具体例としては、Ｎ－スクシンイミド基、ｐ－ニトロフェニル基及びペンタフルオロフェニル基が挙げられるが、細胞親和性の観点から、好ましくは、Ｎ－スクシンイミド基である。
　Ｒ２は、少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数１～１０のアルキル基又は炭素原子数６～１０の芳香族炭化水素基を示す。該炭素原子数１～１０のアルキル基は直鎖状又は分岐鎖状のいずれでもよく、その具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、１－エチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、１，１－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、３，３－ジメチルブチル基、２－エチルブチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が挙げられる。該アルキル基の炭素原子数は、好ましくは１～６であり、より好ましくは１～４である。
　また、Ｒ２における少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数６～１０の芳香族炭化水素基の「炭素原子数６～１０の芳香族炭化水素基」としては、例えば、フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基等が挙げられる。
　Ｒ２は、繊維前駆体製造時における架橋反応効率や、製造された繊維前駆体の細胞親和性の観点から、好ましくは、少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数１～１０（より好ましくは１～６、特に好ましくは１～４）のアルキル基又は少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されているフェニル基である。
　Ｒ３は、水素原子又はメチル基を示す。
　一般式（１）で表される単位構造は、Ｒ１が、水素原子又はメチル基であり、Ｑ１が、エステル結合であり、Ｒ２が、少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数１～１０（より好ましくは１～６、特に好ましくは１～４）のアルキル基又は少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されているフェニル基であることが好ましい。
　一般式（１）で表される単位構造は、好ましくは、一般式（５）で表される単位構造である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
［式中、Ｒ４は上記Ｒ１と同義であり、Ｒ５は上記Ｒ２と同義である。］
　一般式（２）で表される単位構造は、好ましくは、一般式（６）で表される単位構造である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
［式中、Ｒ６は水素原子又はメチル基である。］
　成分Ａの高分子化合物において、一般式（１）で表される単位構造と一般式（２）で表される単位構造との組成比は、合成のしやすさ、溶剤に対する溶解性、繊維形成のしやすさ、任意のアミンを固定化した際の効果の観点から、（一般式（１）で表される単位構造）／（一般式（２）で表される単位構造）＝（３５～９５モル％）／（５～６５モル％）が好ましい。これらの単位構造の組成比は、１３Ｃ－ＮＭＲにより測定される。
　成分Ａの高分子化合物は、本発明の目的を損なわない限り、一般式（１）で表される単位構造及び一般式（２）で表される単位構造以外の単位構造を含んでもよいが、成分Ａの高分子化合物の重合性の観点から、成分Ａの高分子化合物の全単位構造に対する一般式（１）で表される単位構造の割合（モル％）は、３５～９５モル％が好ましく、一般式（２）で表される単位構造の割合（モル％）は、５～６５モル％が好ましい。また成分Ａの高分子化合物の全単位構造に対する一般式（１）で表される単位構造の割合と一般式（２）で表される単位構造の割合との合計（モル％）は、成分Ａの高分子化合物の重合性の観点から、９０モル％を超えることが好ましく、９５モル％以上がより好ましく、１００モル％が特に好ましい。成分Ａの高分子化合物の全単位構造に対する各単位構造の割合は、１３Ｃ－ＮＭＲにより測定される各単位構造の組成比から算出できる。
　成分Ａの重量平均分子量は、繊維前駆体の有機溶媒耐性の観点から、好ましくは１，０００～１，０００，０００の範囲であり、より好ましくは５，０００～５００，０００の範囲であり、特に好ましくは１０，０００～３００，０００の範囲である。本発明において「重量平均分子量」とは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）にて測定される、ポリスチレン換算の分子量をいう。
　成分Ａは、自体公知の方法又はそれに準ずる方法によって製造することができる。例えば、一般式（１）で表される単位構造に対応する単量体及び一般式（２）で表される単位構造に対応する単量体を、適当な溶媒（例、アセトニトリル等）中で、適当な重合開始剤（例、２，２’－アゾビス（イソ酪酸）ジメチル等）を使用して重合すること等により製造できるが、これに限定されない。市販品を使用してもよい。
　一般式（１）で表される単位構造に対応する単量体としては、例えば、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート（例えば、ＣＡＳ番号：８６８－７７－９の化合物）、２－ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート（例えば、ＣＡＳ番号：９２３－２６－２の化合物）、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート（例えば、ＣＡＳ番号：２４７８－１０－６の化合物）、Ｎ－ヒドロキシメチル（メタ）アクリルアミド（例えば、ＣＡＳ番号：９２３－０２－４の化合物）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）（メタ）アクリルアミド（例えば、ＣＡＳ番号：５２３８－５６－２の化合物）、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）（メタ）アクリルアミド（例えば、ＣＡＳ番号：２６０９９－０９－２の化合物）、ｐ－ヒドロキシ（メタ）アクリルアニリド（例えば、ＣＡＳ番号：１９２４３－９５－９の化合物）等が挙げられ、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート又は２－ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートが好ましく、２－ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートが最も好ましい。
　なお、本発明において「（メタ）アクリレート化合物」とは、アクリレート化合物とメタクリレート化合物の両方をいう。例えば、（メタ）アクリル酸は、アクリル酸とメタクリル酸の両方をいう。
　一般式（２）で表される単位構造に対応する単量体としては、ｐ－ニトロフェニル（メタ）アクリレート（例えば、ＣＡＳ番号：１６５２２－４１－１の化合物）、ペンタフルオロフェニル（メタ）アクリレート（例えば、ＣＡＳ番号：１３６４２－９７－２の化合物）、Ｎ－アクリルオキシスクシンイミド（ＣＡＳ番号：３８８６２－２４－７の化合物）、Ｎ－スクシンイミジルメタクリレート（ＣＡＳ番号：３８８６２－２５－８の化合物）が好ましく、Ｎ－スクシンイミジルメタクリレートが最も好ましい。
［成分Ｂ］
　本発明の繊維前駆体は成分Ｂとして、架橋剤（以下、「成分Ｂの架橋剤」又は単に「成分Ｂ」とも称する）を含有することが好ましい。成分Ｂは、後述の成分Ｃと併用することにより、成分Ａのヒドロキシ基同士を、成分Ｂ自身を介して架橋させることで、繊維前駆体に有機溶剤耐性を付与することができる。
　成分Ｂの架橋剤は、酸存在下でヒドロキシ基と反応し得るものであれば特に制限されないが、例えば、１，３，４，６－テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリル、１，３，４，６－テトラキス（ブトキシメチル）グリコールウリル等のアミノプラスト架橋剤；２，２－ビス（４－ヒドロキシ－３，５－ジヒドロキシメチルフェニル）プロパン等のフェノプラスト架橋剤；ヘキサメチレンジイソシアネート等のイソシアネート架橋剤；１，４－ビス（ビニルオキシ）ブタン等のビニルエーテル架橋剤；等が挙げられる。
　成分Ｂは、好ましくはアミノプラスト架橋剤であり、好ましくは１，３，４，６－テトラキス（ヒドロキシメチル）グリコールウリル（ＣＡＳ番号：５３９５－５０－６）、１，３，４，６－テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリル（ＣＡＳ番号：１７４６４－８８－９）、１，３，４，６－テトラキス（エトキシメチル）グリコールウリル（ＣＡＳ番号：６５９５２－０６－９）、１，３，４，６－テトラキス（１－メチルエトキシ）グリコールウリル（ＣＡＳ番号：５０８２２０－６９－７）、１，３，４，６－テトラキス（１，１－ジメチルエトキシ）グリコールウリル（ＣＡＳ番号：５４７７４４－０８－１）又は１，３，４，６－テトラキス（ブトキシメチル）グリコールウリル（ＣＡＳ番号：１５９６８－３７－３）であり、より好ましくは１，３，４，６－テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリルである。
　成分Ｂは単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
　成分Ｂの架橋剤は、自体公知の方法又はそれに準ずる方法によって製造することができる。また、市販品を用いてもよい。
［成分Ｃ］
　本発明の繊維前駆体は成分Ｃとして、酸化合物（以下、「成分Ｃの酸化合物」又は単に「成分Ｃ」とも称する）を含有することが好ましい。当該酸化合物は塩の態様であってもよく、即ち、本発明における「酸化合物」なる用語は、塩をも包含する概念である。成分Ｃは、成分Ｂと併用することにより、成分Ａのヒドロキシ基同士が成分Ｂを介して架橋反応する際にその架橋反応を促進させることができる。
　成分Ｃの酸化合物としては、例えば、スルホン酸化合物、カルボン酸化合物等の有機酸化合物；塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸化合物等が挙げられる。
　成分Ｃは、好ましくは有機酸化合物であり、より好ましくはスルホン酸化合物である。スルホン酸化合物としては、例えば、ｐ－トルエンスルホン酸、ピリジニウム－ｐ－トルエンスルホナート、トリフルオロメタンスルホン酸等が挙げられ、好ましくはピリジニウム－ｐ－トルエンスルホナートである。
　成分Ｃは単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
　成分Ｃの酸化合物は、自体公知の方法又はそれに準ずる方法によって製造することができる。また、市販品を用いてもよい。
　本発明の繊維前駆体は、本発明の目的を著しく損なわない限り、成分Ａ～Ｃ以外に、繊維前駆体に通常使用される添加剤を必要に応じて含んでもよい。当該添加剤としては、例えば、界面活性剤、レオロジー調整剤、薬剤、微粒子等が挙げられる。
　本発明の繊維前駆体の種類は特に制限されないが、例えば、本発明のリガンド結合繊維を生体適合材料（例、細胞培養基材等）等に使用する場合、本発明の繊維前駆体は、ナノメートルオーダー（例、１～１０００ｎｍ）の直径を持つ繊維前駆体（ナノ繊維前駆体）、又はマイクロメートルオーダー（例、１～１０００μｍ）の直径を持つ繊維前駆体（マイクロ繊維前駆体）等であることが好ましく、ナノ繊維前駆体がより好ましい。
　本発明の繊維前駆体の直径（繊維前駆体の繊維径）は、リガンド結合繊維の用途等に応じて適宜調整すればよいが、後述の繊維前駆体製造用組成物の濃度、及び紡糸のし易さの観点から、１～１０００ｎｍが好ましく、１０～１０００ｎｍがより好ましい。本発明において、繊維前駆体の直径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）にて測定される。
　本発明の繊維前駆体の長さは、上記繊維前駆体の直径に対し１０００倍以上であることが望ましい。
　繊維前駆体の単位面積あたりの重さ（目付量）は、例えば７μｇ／ｃｍ２以上であり、好ましくは１０μｇ／ｃｍ２以上である。
　本発明の繊維前駆体の製造方法は、その成分や種類等に応じて自体公知の方法を適宜選択すればよく特に制限されないが、例えば、本発明の繊維前駆体が上記の成分Ａ～Ｃを含有するものである場合、当該繊維前駆体は、成分Ａ～Ｃ及び溶剤を含有する繊維前駆体製造用組成物を紡糸することにより製造できる。
　本発明において用いられる溶剤は、少なくとも上記成分Ａ～Ｃを均一に溶解又は分散し得、且つ、各成分と反応しないものであれば特に制限されないが、成分Ａ～Ｃの溶解性の観点から、極性溶剤が好ましい。
　当該極性溶剤としては、例えば、水、メタノール、エタノール、２－プロパノール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン等が挙げられ、組成物の紡糸し易さのため、好ましくはアセトンとジメチルアセトアミドの混合溶媒であり、その好ましい混合比率（重量％）は、アセトン／ジメチルアセトアミド＝（９０重量％～６０重量％）／（１０重量％～４０重量％）である。
　溶剤は単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
　繊維前駆体製造用組成物における成分Ａの含有割合は、適度な太さを有する繊維前駆体製造の観点から、５～５０重量％が好ましく、１０～４０重量％がより好ましい。
　繊維前駆体製造用組成物における成分Ｂの含有割合は、成分Ａとの反応効率の観点から、０．１～５重量％が好ましく、０．２～４．５重量％がより好ましい。
　繊維前駆体製造用組成物に含まれる成分Ａと成分Ｂの重量比（成分Ａの重量／成分Ｂの重量）は、繊維前駆体の製造時の反応効率の観点から、５～６５が好ましく、５～２５がより好ましい。
　繊維前駆体製造用における成分Ｃの含有割合は、架橋反応速度、架橋反応効率の観点から、０．０１～１．０重量％が好ましく、０．０５～０．５重量％がより好ましく、０．０７～０．４重量％が特に好ましい。
　繊維前駆体製造用組成物に含まれる成分Ａと成分Ｃの重量比（成分Ａの重量／成分Ｃの重量）は、架橋反応速度、架橋反応効率の観点から、２０～１２０が好ましく、８０～１１５がより好ましい。
　繊維前駆体製造用組成物は、成分Ａ～Ｃ及び溶剤以外に、繊維前駆体が含んでもよい添加剤と同様の添加剤を含有してよい。
　繊維前駆体製造用組成物は、上記の成分Ａ～Ｃ及び溶剤を、あるいは、成分Ａ～Ｃ、溶剤及び上記の添加剤を、混合することにより調製できる。混合方法は特に制限されず、自体公知の方法又はそれに準ずる方法によって混合すればよい。
　繊維前駆体製造用組成物の紡糸方法は繊維前駆体を形成できるものであれば特に制限されないが、例えば、メルトブロー法、複合溶融紡糸法、電界紡糸法等が挙げられ、繊維形成能の観点から、電界紡糸法が好ましい。
　電界紡糸法は、公知の紡糸方法であり、公知の電界紡糸装置を用いて行うことができる。本発明の繊維前駆体製造用組成物をノズル（例、ニードル等）の先端から吐出する速度（吐出速度）；印加電圧；繊維前駆体製造用組成物を吐出するノズルの先端から、これを受け取る基板（コレクタ部）までの距離（吐出距離）等の各種条件は、製造する繊維前駆体の直径等に応じて適宜設定できる。吐出速度は、通常０．１～１００μｌ／ｍｉｎであり、好ましくは０．５～５０μｌ／ｍｉｎであり、より好ましくは１～２０μｌ／ｍｉｎである。印加電圧は、通常０．５～８０ｋＶであり、好ましくは１～６０ｋＶであり、より好ましくは３～４０ｋＶである。吐出距離は、通常１～６０ｃｍであり、好ましくは２～４０ｃｍであり、より好ましくは３～３０ｃｍである。
　繊維前駆体が形成される基板（コレクタ部）は、導電性であってもなくてもよく、例えば、樹脂基板（例、ポリスチレン基板、アクリル基板、ポリカーボネート基板、ポリエチレン基板、塩化ビニル基板、ポリエチレンテレフタレート基板等）、金属基板（例、金基板、銀基板、白金基板等が挙げられ、表面が金属で覆われた（めっきされた）基板も含む）、ガラス基板、シリコン基板、セラミックス基板等が挙げられるが、細胞培養基材として、基材の耐破損性や細胞観察のしやすさの観点から、樹脂基板が好ましい。
　また繊維前駆体が形成される基板は、表面処理を施されていてもよい。当該表面処理としては、例えば、金属（例、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ等）蒸着処理、ＵＶオゾン処理等が挙げられる。導電性の低い基板（例、樹脂基板等）は、その表面に金属蒸着処理を施すことにより、金属蒸着処理を施していない場合に比べて、多量の繊維前駆体を形成することができる。
　本発明の繊維前駆体は、基板上に層状に形成されることが好ましいが、それ以外の構造であってもよい。
　本発明の繊維前駆体は、繊維前駆体が形成された基板とともに使用してよく、或いは、基板から分離して使用してもよい。本発明の繊維前駆体が基板とともに使用される場合、基板における繊維前駆体の目付量（基板上の単位面積当たりの担持量）は、通常７μｇ／ｃｍ２以上であり、好ましくは１０μｇ／ｃｍ２以上であり、より好ましくは１３μｇ／ｃｍ２以上であり、最も好ましくは１５μｇ／ｃｍ２以上である。基板における繊維前駆体の目付量の上限値は特に制限されないが、通常１５０００μｇ／ｃｍ２である。
　繊維前駆体製造用組成物を紡糸した後に、該紡糸した繊維前駆体を、特定の温度で加熱することが好ましい。紡糸した繊維前駆体を特定の温度で加熱することにより、より優れた有機溶剤耐性を発現させることができる。
　紡糸した繊維前駆体を加熱する温度は、通常７０～３００℃であり、成分Ｂの架橋剤の反応性、及び成分Ａの高分子化合物の耐熱性の観点から、好ましくは８０～２５０℃であり、より好ましくは９０～２００℃である。当該温度が７０℃未満であると、成分Ａ同士の架橋反応が不十分であり、製造した繊維前駆体の有機溶媒耐性が低くなる傾向があり、３００℃を超えると、成分Ａの高分子化合物自体が熱による分解又は溶解等を起こし繊維前駆体が形成できない。
　紡糸した繊維前駆体の加熱方法は、上記の加熱温度で加熱し得るものであれば特に制限されず、自体公知の方法又はそれに準ずる方法で適宜加熱することができる。該加熱方法の具体例としては、大気下にてホットプレート又はオーブン等を使用する方法等が挙げられる。
　紡糸した繊維前駆体を加熱する時間は、加熱温度等に応じて適宜設定し得るが、架橋反応速度、生産効率の観点から、１分間～４８時間が好ましく、５分間～３６時間がより好ましく、１０分間～２４時間が特に好ましい。
２．細胞膜受容体に親和性のあるリガンド
　本発明のリガンド結合繊維に含まれるリガンドは、細胞膜受容体に親和性があり、且つ、繊維前駆体と結合し得るものが好ましい。また当該リガンドは、合成リガンドであってもよい。ここで「合成リガンド」とは、天然には存在していない有機物から化学合成法によって人工的に製造することによってのみ得られるリガンドをいう。ゆえに、例えば合成ペプチドは、本明細書でいう「合成リガンド」ではない。
　本発明において用いられるリガンドとしては、例えば、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、アミノ酸誘導体及び糖類等が挙げられる。
　上記リガンドは、天然のものでもよいし、或いは、人工的に合成して得られるもの、遺伝子操作により得られるもののいずれであってもよい。
　前記蛋白質としては、例えば、癌胎児性抗原、扁平上皮癌関連抗原、サイトケラチン１９フラグメント、シアル化糖鎖抗原ＫＬ－６、ナトリウム利尿ペプチド、トロポニン、ミオグロビン等の疾患マーカー、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン－１４（ＩＬ－１４）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、白血病細胞阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＭ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、マクロファージ炎症蛋白質－１α（ＭＩＰ－１α）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子－１、２、３、４、５、６、７、８、又は９（ＦＧＦ－１、２、３、４、５、６、７、８、又は９）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、ケモカイン、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ１など）、Ｗｎｔ蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質２、３、５または７（Ａｎｇｐｔ２、３、５または７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）、インシュリン、成長ホルモン等の細胞増殖因子、及びコラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン－１乃至１２、ラミニン５１１、ラミニン５２１、ニトジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－Ｌ－リジン等の細胞接着因子、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等の各種抗体等が挙げられる。
　前記ペプチドとしては、例えば、アンジオテンシンＩ乃至IV、ブラジキニン、フィブリノペプチド、ナトリウム利尿ペプチド、ウロディラチン、グアニリン、エンドセリン１乃至３、サリューシン、ウロテンシン、オキシトシン、ニューロフィジン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、エンドルフィン、リポトロピン、ウロコルチン１乃至３、黄体形成ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、コルチスタチン、プロラクチン放出ペプチド、メタスチン、タキキニン、サブスタンスＰ、ニューロキニン、エンドキニン、ニューロテンシン、ニューロメジン、ゼニン、グレリン、オベスタチン、メラニン凝集ホルモン、オレキシン、ニューロペプチド、ダイノルフィン、ネオエンドルフィン、エンドモルフィン、ノシセプチン、ピログルタミル化ＲＦ　アミドペプチド、ガラニン、ガストリン、コレシストキニン、セクレチン、リラキシン、グルカゴン、グリセンチン、アドレノメデュリン、アミリン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ディフェンシン、チモシン、ＹＩＧＳＲペプチド等が挙げられる。
　前記アミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、ジヒドロキシフェニルアラニン、チロキシン、フォスフォセリン、デスモシン、β－アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γ－アミノ酪酸、テアニン、カイニン酸、ドウモイ酸、イボテン酸等が挙げられる。
　前記アミノ酸誘導体としては、セロトニン、ノルアドレナリン、アドレナリン、チラミン（ＣＡＳ番号：５１－６７－２の化合物）、ドーパミン（ＣＡＳ番号：５１－６１－６の化合物）等が挙げられる。
　前記糖類としては、例えば、Ｄ－グルコサミン、Ｄ－ガラクトサミン、ノイラミン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン等が挙げられる。
　また本発明はリガンドとして、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、アミノ酸誘導体及び糖類以外の化学物質を用いてもよい。そのような化学物質としては、例えば、２－ジメチルアミノエチルアミン（ＣＡＳ番号：１０８－００－９の化合物）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン（ＣＡＳ番号：１１１－４１－１の化合物）、Ｎ－（２－アミノエチル）ピペラジン（ＣＡＳ番号：１４０－３１－８の化合物）、４－（２－アミノエチル）モルホリン（ＣＡＳ番号：２０３８－０３－１の化合物）、１－（２－アミノエチル）－２－イミダゾリドン（ＣＡＳ番号：６２８１－４２－１の化合物）、トリプトアミン（ＣＡＳ番号：６１－５４－１の化合物）、ヒスタミン二塩酸塩（ＣＡＳ番号：５６－９２－８の化合物）等の一級アミン；エチレンジアミン二塩酸塩（ＣＡＳ番号：３３３－１８－６の化合物）、１，６－ジアミノヘキサン（ＣＡＳ番号：１２４－０９－４の化合物）、Ｎ，Ｎ’－ビス（アミノプロピル）ピペラジン（ＣＡＳ番号：７２０９－３８－３の化合物）の一級ジアミン等が挙げられる。
　本発明はリガンドとして、トロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体に親和性があるリガンドを用いてもよい。トロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体に親和性があるリガンドとしては、例えば、特開平１１－１４７７号公報、特開平１１－１５２２７６号公報、国際公開第０１／０７４２３号、国際公開第０１／５３２６７号、国際公開第０２／０５９０９９号、国際公開第０２／０５９１００号、国際公開第００／３５４４６号、国際公開第００／６６１１２号、国際公開第０１／３４５８５号、国際公開第０１／１７３４９号、国際公開第０１／３９７７３号、国際公開第０１／２１１８０号、国際公開第０１／８９４５７号、国際公開第０２／４９４１３号、国際公開第０２／０８５３４３号、特開２００１－９７９４８号公報、国際公開第９９／１１２６２号、国際公開第０２／０６２７７５号、国際公開第０３／０６２２３３号、特開２００３－２３８５６５号公報等に記載の化合物が挙げられる。また下記の式（７）～式（１５）で表される化合物も、トロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体に親和性があるリガンドとして用いてよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　本発明の繊維前駆体とリガンドとの結合の形態は、両者が結合してさえいれば特に制限されないが、一態様として、本発明の繊維前駆体が成分Ａの高分子化合物を含有し、リガンドがアミノ基を有する場合、リガンドのアミノ基と成分ＡのＱ２とは、求核置換反応によって結合し得る。
　アミノ基を有するリガンドの具体例としては、例えば上記に例示した化合物のカルボン酸をカルボン酸アミドに変換した後、ホフマン転位反応等によりアミノ化した化合物が挙げられる。
　また、本発明において用いられるリガンドとして上記に例示した化合物の置換基の一部を自体公知の方法によってアミノ化した上で、本発明のリガンドとして使用してもよい。
　アミノ基を有するリガンドの特に好ましい一態様として、一般式（４）で表される化合物（以下、「化合物（４）」とも称する）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
〔式中、
　Ｘ１は、３，４－ジクロロフェニル基、４－トリフルオロメチルフェニル基又は４－ｔ－ブチルフェニル基を示し、
　Ｘ２は、置換されていてもよいアミノ基を示し、
　Ｌ１は、単結合又は－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－を示し、
　Ｌ２は、単結合又は－ＣＯＮＨ－を示し、
　Ｌ３は、炭素原子数２～６のアルキレン基を示す。〕
　一般式（４）における各基の定義について、以下に詳述する。
　Ｘ１は、３，４－ジクロロフェニル基、４－トリフルオロメチルフェニル基又は４－ｔ－ブチルフェニル基を示し、好ましくは４－ｔ－ブチルフェニル基である。
　Ｘ２は、置換されていてもよいアミノ基を示す。本明細書中、「置換されていてもよい」とは、特に規定する場合を除き、１個以上の置換基を有していてもよいことを意味し、該「置換基」としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｔ－ブチル基、アリル基、フェニル基、ベンジル基等が挙げられる。
　Ｘ２は、好ましくはアミノ基である。
　Ｌ１は、単結合又は－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－を示し、好ましくは、単結合である。
　Ｌ２は、単結合又は－ＣＯＮＨ－を示し、好ましくは、単結合である。
　Ｌ３は、炭素原子数２～６のアルキレン基を示す。炭素原子数２～６のアルキレン基は、直鎖、分岐及び環状のいずれでもよく、例えば、エチレン基、ｎ－プロピレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ジメチルメチレン基、メチルエチレン基、ジメチルエチレン基、ジメチルプロピレン基、シクロプロピレン基、シクロヘキシレン基等が挙げられる。中でも、炭素原子数２～４のアルキレン基が好ましく、炭素原子数２～３のアルキレン基がより好ましい。
　好適な化合物（４）としては、
　Ｘ１が、４－ｔ－ブチルフェニル基であり、
　Ｘ２が、好ましくはアミノ基であり、
　Ｌ１が、単結合又は－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－（好ましくは、単結合）であり、
　Ｌ２が、単結合又は－ＣＯＮＨ－（好ましくは、単結合）であり、
　Ｌ３が、炭素原子数２～６（好ましくは２～４、より好ましくは２～３）のアルキレン基である化合物（４）である。
　好適な化合物（４）の具体例としては、下記の式（１６）～（１８）で表される化合物等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　化合物（４）は、例えば、特許第４３８６０７２号公報に記載の方法、又はそれに準じる方法により製造できる。
３．リガンド結合繊維の製造（リガンドの繊維前駆体への固定化）
　本発明において、繊維前駆体とリガンドとの結合の形態は、両者が結合してさえいれば特に制限されないが、一態様として、活性エステル基を有する繊維前駆体（例えば、本発明の繊維前駆体等）を使用する場合、細胞膜受容体に親和性のあるリガンドは、繊維前駆体に存在する活性エステル基とリガンドとの反応により、前記繊維前駆体に固定化できる。活性エステル基は、中性の条件で遊離アミノ基と反応する。アミンの塩基性は、芳香族アミンよりアルキルアミンが強く、アルキルアミンは活性エステルとの反応により適している。水溶性の低いアミンの場合には、エタノールやジメチルスルホキシド等のような有機溶剤に溶解して反応させることが好ましい。本発明の繊維前駆体を用いる場合、活性エステル基とリガンドとの反応は、繊維前駆体製造用組成物の調製時に行うことが可能である。また繊維前駆体製造用組成物を紡糸して繊維前駆体を製造した後に行ってもよく、繊維前駆体に加熱処理を施した後に行ってもよい。反応条件は、好ましくは０℃～８０℃で１～４８時間であり、さらに好ましくは０℃～６０℃で１～２４時間であり、最も好ましくは０℃～５０℃で１～２４時間である。
　本発明のリガンド結合繊維の直径は、その用途等に応じて適宜調整すればよいが、１～１０００ｎｍが好ましく、１０～１０００ｎｍがより好ましい。本発明において、リガンド結合繊維の直径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）にて測定される。
　また本発明のリガンド結合繊維の長さは、上記直径に対し１０００倍以上であることが望ましい。
　本発明のリガンド結合繊維は、基板上に担持された状態で使用され得る。その場合、基板におけるリガンド結合繊維の目付量（基板上の単位面積当たりの担持量）は、通常７μｇ／ｃｍ２以上であり、好ましくは１０μｇ／ｃｍ２以上であり、より好ましくは１３μｇ／ｃｍ２以上であり、最も好ましくは１５μｇ／ｃｍ２以上である。基板におけるリガンド結合繊維の目付量の上限値は特に制限されないが、通常１５０００μｇ／ｃｍ２である。
　通常、繊維前駆体の目付量と、リガンド結合繊維の目付量の値はほぼ同じ（誤差範囲内）である。
　本発明のリガンド結合繊維の用途は特に制限されないが、後述の実施例に示されるように、本発明のリガンド結合繊維は優れた有機溶剤耐性を有しており、細胞培養基材として十分な機能を有することから、特に細胞培養基材（例えば、細胞培養足場材料等）に適している。
４．細胞培養基材
　本発明の細胞培養基材は、本発明のリガンド結合繊維を含むことを、主たる特徴とする。本発明において「細胞培養基材」とは、細胞に対して悪影響を及ぼさず、選択的に特定の細胞のみ培養が可能な材料をいう。
　本発明の細胞培養基材としては、例えば、ガラス、金属、及びポリスチレン等のプラスチック上に本発明のリガンド結合繊維を吹付けた細胞培養基材（例えば、６穴平底マイクロプレート等）、本発明のリガンド結合繊維を導入した培養バック等が挙げられる。
　本発明の細胞培養基材を用いて培養される「細胞」とは、動物或いは植物を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。この際、ＤＮＡを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。
　本発明の細胞培養基材は、例えば、動物由来の細胞の培養に用いることができる。本発明における動物由来の細胞には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞（多能性幹細胞等を含む）、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（即ち、細胞株（癌細胞株を含む））、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。
　生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞または骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞（例えば、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞）、及び単核細胞等が挙げられる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液（臍帯血を含む）、骨髄、心臓、眼、脳または神経組織などの任意の組織から採取できる。
　幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞等が挙げられる。多能性幹細胞としては、例えば前記幹細胞のうち、ＥＳ細胞、胚性生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞等が挙げられる。
　前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。また癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。
　細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ－３３Ａ、ＡＥ－１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ（登録商標）、Ｖｅｒｏ等が挙げられる。
　癌細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ヒト乳がん細胞株としてＨＢＣ－４、ＢＳＹ－１、ＢＳＹ－２、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－７／ＡＤＲ　ＲＥＳ、ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、ＭＤＡ－Ｎ、ＢＴ－５４９、Ｔ４７Ｄ、ヒト子宮頸がん細胞株としてＨｅＬａ、ヒト肺がん細胞株としてＡ５４９、ＥＫＶＸ、ＨＯＰ－６２、ＨＯＰ－９２、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＮＣＩ－Ｈ２２６、ＮＣＩ－Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２２、ＤＭＳ２７３、ＤＭＳ１１４、ヒト大腸がん細胞株としてＣａｃｏ－２、ＣＯＬＯ－２０５、ＨＣＣ－２９９８、ＨＣＴ－１５、ＨＣＴ－１１６、ＨＴ－２９、ＫＭ－１２、ＳＷ－６２０、ＷｉＤｒ、ヒト前立腺がん細胞株としてＤＵ－１４５、ＰＣ－３、ＬＮＣａＰ、ヒト中枢神経系がん細胞株としてＵ２５１、ＳＦ－２９５、ＳＦ－５３９、ＳＦ－２６８、ＳＮＢ－７５、ＳＮＢ－７８、ＳＮＢ－１９、ヒト卵巣がん細胞株としてＯＶＣＡＲ－３、ＯＶＣＡＲ－４、ＯＶＣＡＲ－５、ＯＶＣＡＲ－８、ＳＫ－ＯＶ－３、ＩＧＲＯＶ－１、ヒト腎がん細胞株としてＲＸＦ－６３１Ｌ、ＡＣＨＮ、ＵＯ－３１、ＳＮ－１２Ｃ、Ａ４９８、ＣＡＫＩ－１、ＲＸＦ－３９３Ｌ、７８６－０、ＴＫ－１０、ヒト胃がん細胞株としてＭＫＮ４５、ＭＫＮ２８、Ｓｔ－４、ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－７、ＭＫＮ－７４、皮膚がん細胞株としてＬＯＸ－ＩＭＶＩ、ＬＯＸ、ＭＡＬＭＥ－３Ｍ、ＳＫ－ＭＥＬ－２、ＳＫ－ＭＥＬ－５、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＵＡＣＣ－６２、ＵＡＣＣ－２５７、Ｍ１４、白血病細胞株としてＣＣＲＦ－ＣＲＭ、Ｋ５６２、ＭＯＬＴ－４、ＨＬ－６０ＴＢ、ＲＰＭＩ８２２６、ＳＲ、ＵＴ７／ＴＰＯ、Ｊｕｒｋａｔ等が挙げられる。
　これらの細胞のうち、ＴＰＯ受容体に親和性のあるリガンドを用いた本発明のリガンド結合繊維を含む細胞培養基材（例、細胞培養足場材料等）を用いて培養される細胞としては、例えば、ＴＰＯ受容体を発現している造血幹細胞、造血前駆細胞、巨核球前駆細胞、巨核球、血小板、ＵＴ７／ＴＰＯ細胞等が挙げられる。
　本発明の細胞培養基材は、本発明のリガンド結合繊維を原材料の一つとして使用し、自体公知の方法又はそれに準ずる方法によって製造することができる。
　以下、本発明に係る具体例を説明するが、これによって本発明は何ら限定されるものではない。
［高分子化合物１の重量平均分子量の測定］
　下記の高分子化合物１の重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した。測定に用いた装置、測定条件は次の通りである。
　　装置：ＴＯＳＯＨ　ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣ　ｓｙｓｔｅｍ
　　カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＫＦ－８０３Ｌ、ＫＦ－８０２及びＫＦ－８０１
　　カラム温度：４０℃
　　溶離液：ＤＭＦ
　　流量：０．６ｍｌ／分
　　検出器：ＲＩ
　　標準試料：ポリスチレン
［高分子化合物１の１３Ｃ－ＮＭＲ測定］
　下記の高分子化合物１の単位構造の組成比は、１３Ｃ－ＮＭＲにより測定した。測定及び解析に用いた装置、条件は次の通りである。
　　装置：日本電子株式会社　ＪＮＭ－ＥＣＡ５００、Ｄｅｌｔａ　Ｖ５．０
　　測定核：１３Ｃゲートデカップリング
　　積算回数：１８０００
　　測定温度：室温
　　検出ピーク：６９～７１ｐｐｍ（ＨＰＭＡ由来）、
　　　　　　　　２５～２７ｐｐｍ（ＮＳｕＭＡ由来）
　　測定溶剤：重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ６）、７５０ｕＬ
　　サンプル量：０．１ｇ
　　緩和試薬：クロム（ＩＩＩ）アセチルアセナート、４ｍｇ
［リガンド化合物の１Ｈ－ＮＭＲ測定］
　リガンド化合物は、１Ｈ－ＮＭＲにより同定した。条件は次の通りである。
　　装置：Ｖａｒｉａｎ ＮＭＲ Ｓｙｓｔｅｍ　４００ ＮＢ （４００ＭＨｚ）
　　測定溶媒：ＣＤＣｌ３
　　基準物質：テトラメチルシラン（ＴＭＳ）（δ０．０ｐｐｍ、１Ｈ）
（合成例１：高分子化合物１）
　２－ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ；東京化成工業株式会社製）１８．３７ｇ、Ｎ－スクシンイミジルメタクリレート（ＮＳｕＭＡ；東京化成工業株式会社製）１０．００ｇ、及び２，２’－アゾビス（イソ酪酸）ジメチル（ＭＡＩＢ；和光純薬工業株式会社製）０．０３ｇをアセトニトリル６６．２５ｇに溶解させ、窒素雰囲気下、加熱還流させたアセトニトリル４７．３２ｇ中へ滴下した。滴下終了後、加熱還流を保ちながら、１８時間反応させた。その後、この反応混合液をジエチルエーテル中に滴下してポリマーを析出させた。ポリマーを取り出した後、減圧下で乾燥することで、高分子化合物１を１９．９ｇ得た。当該高分子化合物１の重量平均分子量は、ポリスチレン換算で２３５，０００であった。１３Ｃ－ＮＭＲにて測定した組成比は、ＨＰＭＡ／ＮＳｕＭＡ＝６３モル％／３７モル％であった。
（合成例２：リガンド化合物［４］の合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
＜化合物[１]の合成＞
　マグネチックスターラーを備えた５０ｍｌ四口フラスコに、メチル　５－（クロロカルボニル）チオフェン－２－カルボキシレート（ＴＥＣ）１.００ｇ（４.８９ｍｍｏｌ）とアセトニトリル１２ｇを仕込み、内温５℃に保った。かかる混合物に、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－１，２－ジアミノエタン（０.７８３ｇ、４.８９ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１.０８８ｇ、１０.７５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（８ｇ）溶液を滴下した後、室温にて１７時間攪拌した。反応液に酢酸エチル３０ｇ、純水３０ｇを加え、分液を行い、有機相を回収した。当該有機相に硫酸ナトリウム５ｇを加え、３０分間静置した後、これをろ過した。続いて、ろ液を濃縮乾燥し、化合物［１］１.３９ｇ（４.２３ｍｍｏｌ）を得た（収率：８７％、性状：薄茶色固体）。
1H-NMR(400MHz) in CDCl3：1.43ppm(s, 9H), 3.37-3.44ppm(m, 2H), 3.51-3.56ppm(m, 2H), 3.90ppm(s, 3H), 4.99-5.11ppm(m, 1H), 7.32ppm(d, J= 3.5 Hz, 1H), 0.98-1.12ppm(m, 1H), 8.03ppm(d, J = 3.5 Hz, 1H)
＜化合物[２]の合成＞
　マグネチックスターラーを備えた５０ｍｌ四口フラスコに、化合物［１］１.３６ｇ（４.１４ｍｍｏｌ）、ヒドラジン一水和物２.０７３ｇ（４１.４２ｍｍｏｌ）、２－プロパノール２３.２０ｇを仕込み、内温８０℃にて６時間攪拌した。その後、減圧下、反応液を濃縮乾燥し、化合物［２］１.２９ｇ（３.９３ｍｍｏｌ）を得た（収率：９５％、性状：黄色結晶）。
1H-NMR(400MHz) in d6-DMSO：1.37ppm(s, 9H), 3.07ppm(q, J = 6.3 Hz, 2H), 3.24ppm(q, J = 6.3 Hz, 2H), 4.26-4.78ppm(br, 2H), 6.93ppm(t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.63-7.67ppm(m, 2H), 8.62ppm(t, J = 5.5 Hz, 1H), 9.78-10.06ppm(br, 1H)
＜化合物[３]の合成＞
　マグネチックスターラーを備えた５０ｍｌ四口フラスコに、化合物［２］１.２９ｇ（３.９３ｍｍｏｌ）、ＫＨＢＴ（国際公開第２００４／１０８６８３号又は米国特許公開第２００６／０９４６９４号に記載の方法に従って合成した。）１.１３ｇ（４.１３ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド１１.９０ｇを仕込み、内温１１０℃にて５時間攪拌した。その後、反応液に純水５０ｇを加え、析出した結晶を減圧吸引濾過した。更に、この結晶をジイソプロピルエーテル６ｇで洗浄した後、減圧乾燥し、化合物［３］１.６３ｇ（２.７９ｍｍｏｌ）を得た（収率：７１％、性状：黄色結晶）。
1H-NMR(400MHz) in d6-DMSO：1.30ppm(s, 9H), 1.38ppm(s, 9H), 2.48ppm(s, 3H), 3.08-3.14ppm(m, 2H), 3.22-3.33ppm(m, 2H), 6.94ppm(t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.42ppm(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.69ppm(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.77ppm(d, J = 3.7 Hz, 1H), 7.98ppm(s, 1H), 8.00ppm(d, J = 3.7 Hz, 1H), 8.72ppm(t, J = 5.7 Hz, 1H), 11.24-11.55ppm(br, 1H), 11.98-12.22ppm(br, 1H)
＜化合物[４]の合成＞
　マグネチックスターラーを備えた５０ｍｌ四口フラスコに、化合物［３］１.３８ｇ（２.３５ｍｍｏｌ）、９８％ギ酸１４.００ｇを仕込み、内温４０℃にて１時間攪拌した。その後、減圧下、反応液からギ酸を留去し、ジイソプロピルエーテル７ｇ、テトラヒドロフラン１.４ｇを加え、析出した結晶を減圧吸引濾過した。続いて、この結晶を減圧乾燥し、化合物［４］１.０７ｇ（２.２１ｍｏｌ）を得た（収率：９４％、性状：黄色結晶）。
1H-NMR(400MHz) in d6-DMSO：1.30ppm(s, 9H), 2.47ppm(s, 3H), 2.96ppm(t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.48ppm(q, J = 5.7 Hz, 2H), 7.41ppm(d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.70ppm(d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.82ppm(d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.93ppm(s, 1H), 7.96ppm(d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.32ppm(s, 1H), 9.22ppm(t, J= 5.1 Hz, 1H), 12.05-12.95(br, 1H)
＜繊維前駆体製造用組成物（溶液）の調製＞
（繊維前駆体製造用組成物１）
　高分子化合物１；１．７０ｇ、１，３，４，６－テトラキス（メトキシメチル）グリコールウリル０．３４ｇ、ピリジニウム－ｐ－トルエンスルホナート０．０１７ｇ、ジメチルアセトアミド１．５７ｇ、及びアセトン４．５０ｇを混合した後、ミックスローターＶＭＲ－５（アズワン株式会社製）にて溶解するまで１００ｒｐｍで攪拌し、繊維前駆体製造用組成物１を得た。当該繊維前駆体製造用組成物１における高分子化合物１の含有割合は、約２１重量％である。
［電界紡糸法による繊維前駆体の製造］
　電界紡糸法による繊維前駆体の製造は、エスプレイヤーＥＳ－２０００（株式会社フューエンス製）を用いて実施した。繊維前駆体製造用組成物１は、１ｍｌのロック式ガラス注射筒（アズワン株式会社製）に注入し、針長１３ｍｍのロック式金属製ニードル２４Ｇ（武蔵エンジニアリング株式会社製）を取り付けた。ニードル先端から繊維を受け取る基板までの距離（吐出距離）は２０ｃｍとした。印加電圧は２５ｋＶとし、吐出速度は１０μｌ／ｍｉｎとした。
［繊維前駆体の形状の確認方法］
　繊維前駆体の形状の確認は、イオンスパッター（Ｅ－１０３０、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）にてＰｔ－Ｐｄを繊維前駆体に１分間蒸着した後、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ｓ－４８００、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）を使用して、拡大倍率１０，０００倍で観察することにより行った。
［繊維前駆体の繊維径の測定方法］
　繊維前駆体の繊維径（繊維前駆体の太さ）の測定は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ｓ－４８００、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）を使用して、拡大倍率１０，０００倍の画像を撮影及び保存した後、付属の測長ツールにより行った。
［ポリスチレン（ＰＳｔ）基板の表面処理Ａ］
　アクリサンデー株式会社製「プラバン」（商品名；厚さ０．２ｍｍ）から自作したΦ３０ｍｍポリスチレン（ＰＳｔ）基板の片面をイオンスパッター（Ｅ－１０３０、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）にて３０秒間Ｐｔ－Ｐｄ蒸着した。
［ポリスチレン（ＰＳｔ）基板の表面処理Ｂ］
　アクリサンデー株式会社製「プラバン」（商品名；厚さ０．２ｍｍ）から自作したΦ３０ｍｍポリスチレン（ＰＳｔ）基板の片面をＵＶオゾンクリーナーＵＶ２５３Ｅ（フィルジェン株式会社製）にて１０分間処理した。
［実施例１］
　繊維前駆体製造用組成物１を電界紡糸法により紡糸し、上記表面処理Ａを行ったΦ３０ｍｍＰＳｔ基板上に２０分間吹付けた後、８０℃で４８時間加熱処理を行った。得られた繊維前駆体（繊維前駆体１）をエタノールで洗浄して風乾した後、当該繊維前駆体１の形状を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で確認した。繊維前駆体１の繊維径は約７００ｎｍであった。この繊維前駆体１に後述する方法にてリガンド化合物［４］の固定化を行い、リガンド化合物［４］が固定化された繊維前駆体１（リガンド結合繊維１）を得た。
［実施例２］
　上記表面処理Ａを行ったΦ３０ｍｍＰＳｔ基板に代えて上記表面処理Ｂを行ったΦ３０ｍｍＰＳｔ基板を使用した以外は、実施例１と同様の方法にて、繊維前駆体２を得た。繊維前駆体２の繊維径は約７００ｎｍであった。この繊維前駆体２に後述する方法にてリガンド化合物［４］の固定化を行い、リガンド化合物［４］が固定化された繊維前駆体２（リガンド結合繊維２）を得た。
［実施例３］
　上記表面処理Ａを行ったΦ３０ｍｍＰＳｔ基板に代えて未処理のΦ３０ｍｍＰＳｔ基板を使用した以外は、実施例１と同様の方法にて繊維前駆体３を得た。繊維前駆体３の繊維径は約５７０ｎｍであった。この繊維前駆体３に後述する方法にてリガンド化合物［４］の固定化を行い、リガンド化合物［４］が固定化された繊維前駆体３（リガンド結合繊維３）を得た。
［比較例１］
　実施例１で得られた繊維前駆体１を、リガンド化合物［４］の固定化を行わずに、比較例１の繊維として使用した。
　なお実施例１～３のリガンド結合繊維１～３及び比較例１の繊維は、繊維前駆体が形成された基板とともに使用した。
［比較例２］
　上記表面処理Ａを行ったΦ３０ｍｍＰＳｔ基板を、比較例２の基板として使用した。
　実施例１～３のリガンド結合繊維１～３及び比較例１の繊維の各繊維前駆体重量を表１に示す。リガンド結合繊維１～３の繊維前駆体重量及び比較例１の繊維の繊維前駆体重量は、繊維前駆体及び該繊維前駆体を担持するＰＳｔ基板の全体重量を測定し、該重量からＰＳｔ基板の重量を差し引いて算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
［リガンド化合物［４］の固定化］
　６穴平底マイクロプレート（アズワン株式会社製）に実施例１～３の繊維前駆体１～３を配置した。各繊維前駆体を配置したウェルに対して、リガンド化合物［４］（０．９ｍｇ）のジメチルスルホキシド（２．０ｍＬ）溶液を添加し、室温にて６時間静置した。その後、溶液を除き、各繊維前駆体をジメチルスルホキシド及びエタノールで洗浄し、風乾した。
＜試験例１：細胞培養評価＞
　実施例１のリガンド結合繊維１及び比較例１の繊維について、細胞培養評価を行った。当該評価における対照には、ＰＳｔ基板を配置した系（陽性対照：培地中にトロンボポエチン（ＴＰＯ）１０ｎｇ／ｍＬを添加、陰性対照：培地のみ）を用いた。なお、以下において、ＣＯ２インキュベーターにおけるＣＯ２の濃度（％）は、雰囲気中のＣＯ２の体積％で示した。
［細胞の調製］
　細胞は、ＴＰＯ依存性ヒト巨核芽球性白血病細胞株（ＵＴ－７／ＴＰＯ；Ｋｏｍａｔｓｕら，Ｂｌｏｏｄ，１９９６，８７，ｐｐ．４５５２－４５６０）を用いた。細胞の培養には、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ株式会社製）を含むＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ株式会社製）を用いた。細胞は、３７℃ＣＯ２インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、２日間以上培養した。得られた培養液を遠心分離（株式会社トミー精工製、ＬＣ－２００、１５００ｒｐｍ／３分、室温）した後、上清を除き、ＴＰОを除いた上記のＩＭＤＭ培地を添加して細胞懸濁液を調製した。なお、ここで「ＦＢＳ」とは、牛胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を意味する。
［基材の滅菌］
　６穴平底マイクロプレート（アズワン株式会社製）に、実施例１のリガンド結合繊維、比較例１の繊維、及びＰＳｔ基板（陽性対照用及び陰性対照用）を配置し、それぞれ７０％エタノール２ｍＬを添加し、室温で５分間浸漬した後、１０分間風乾した。
［細胞培養１回目］
　６穴平底マイクロプレートに、滅菌した実施例１～３のリガンド結合繊維１～３、比較例１の繊維、比較例２の基板、並びに、陽性対照用及び陰性対照用のＰＳｔ基板を配置し、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ株式会社製）２ｍＬで２回洗浄した。その後、８．０×１０４ｃｅｌｌｓ／４ｍＬ／ｗｅｌｌに調製したＵＴ－７／ＴＰＯの細胞懸濁液を加えた。ＰＳｔ基板を配置したウェルのうち、陽性対照用のＰＳｔ基板を配置したウェルにＴＰＯを添加し、終濃度１０ｎｇ／ｍＬとした。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃で６日間ＣＯ２インキュベーター内にて静置した。
［ＷＳＴ－８を用いた細胞数計測］
　６日間の細胞培養の後、実施例１～３のリガンド結合繊維１～３、比較例１の繊維、比較例２の基板、並びに、陽性対照用及び陰性対照用のＰＳｔ基板を配置した各ウェルから細胞培養液を回収した。それぞれの細胞培養液のピペッティングを行った後、その１００μＬを９６穴プレート（コーニング株式会社製）に移し、さらに１０μＬのＷＳＴ－８試薬（キシダ化学株式会社製）を添加した。３７℃で１２０分ＣＯ２インキュベーター内にて静置した後、吸光度計（モレキュラーデバイス社製、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
［細胞培養２回目及び３回目］
　１回目の細胞培養の後、実施例１～３のリガンド結合繊維１～３、並びに、陽性対照用及び陰性対照用のＰＳｔ基板をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）４ｍＬで２回洗浄した。その後、８．０×１０４ｃｅｌｌｓ／４ｍＬ／ｗｅｌｌに調製したＵＴ－７／ＴＰＯの細胞懸濁液を加えた。陽性対照用のＰＳｔ基板を配置したウェルにはＴＰＯを添加し、終濃度１０ｎｇ／ｍＬとした。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃で６日間ＣＯ２インキュベーター内にて静置した。
　６日間の培養の後、上記と同様にＷＳＴ－８を用いて細胞数の計測を行った。
　２回目の細胞培養及び細胞数計測の後、これと同様にして３回目の細胞培養（６日間）及び細胞数計測を行った。
　結果を表２及び表３に示す。尚、各サンプルの細胞数は、陽性対照の細胞数を１００％とする百分率に換算して比較した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　表３に示される結果から明らかなように、実施例１及び実施例２のリガンド結合繊維では、陽性対照と同等以上の細胞数が得られた。これは、含有する繊維前駆体の量が実施例３のリガンド結合繊維よりも多いため、多くのリガンドを固定化することができ、その結果、細胞増殖に必要なシグナル伝達が活発に行われたためと考えられる。
　また、実施例１及び実施例２のリガンド結合繊維は、リガンドが繊維前駆体に固定化されているため、繰り返し細胞培養しても、毎回同等の細胞数が得られた。一方、陽性対照では、毎回の細胞培養の際、ＴＰＯを添加する必要があった。
　さらに、リガンド結合繊維の繊維径が１００ｎｍ以上であり、且つ、基板における繊維前駆体の目付量が１０μｇ／ｃｍ２以上、より好ましくは１３μｇ／ｃｍ２以上、最も好ましくは１５μｇ／ｃｍ２以上であれば、陽性対照と同等以上の細胞数が得られた。
　本発明によれば、リガンドを繊維前駆体に固定化してなるリガンド結合繊維を提供でき、当該リガンド結合繊維は、目的の細胞のみを効率的に繰り返し増殖させることができ、再生医療の分野において、細胞培養基材として従来には無い優れた機能を発現する。
　本出願は、日本で出願された特願2014-223736（出願日：2014年10月31日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (13)

  1. 　細胞膜受容体に親和性のあるリガンド、及び当該リガンドと結合しているリガンド結合繊維前駆体（以下、繊維前駆体と称する）を含む、リガンド結合繊維。
  2. 　上記細胞膜受容体が、トロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体である、請求項１記載のリガンド結合繊維。
  3. 　上記繊維前駆体が、一般式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式中、
    　Ｒ１は、水素原子又はメチル基を示し、
    　Ｑ１は、エステル結合又はアミド結合を示し、
    　Ｒ２は、少なくとも１個の水素原子がヒドロキシ基で置換されている炭素原子数１～１０のアルキル基又は炭素原子数６～１０の芳香族炭化水素基を示す。〕
    で表される単位構造、及び一般式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     〔式中、
    　Ｒ３は、水素原子又はメチル基を示し、
    　Ｑ２は、活性エステル基を示す。〕
    で表される単位構造を含む高分子化合物を含有する、請求項１又は２記載のリガンド結合繊維。
  4. 　上記リガンドがアミノ基を有し、当該アミノ基と上記Ｑ２とが結合している、請求項３記載のリガンド結合繊維。
  5. 　上記Ｑ２が、一般式（３）で表される、請求項３又は４記載のリガンド結合繊維。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     〔式中、Ｑ３は、Ｎ－スクシンイミド基、ｐ－ニトロフェニル基又はペンタフルオロフェニル基を示す。〕
  6. 　上記繊維前駆体が、架橋剤及び酸化合物を更に含有する、請求項３～５のいずれか１項に記載のリガンド結合繊維。
  7. 　上記繊維前駆体が、上記高分子化合物、架橋剤、酸化合物及び溶剤を含有する繊維前駆体製造用組成物を紡糸して製造されたものである、請求項３～６のいずれか１項に記載のリガンド結合繊維。
  8. 　上記繊維前駆体が、表面処理を施された基板上に上記繊維前駆体製造用組成物を紡糸して製造されたものである、請求項７記載のリガンド結合繊維。
  9. 　上記高分子化合物の重量平均分子量が、１，０００～１，０００，０００である、請求項３～８のいずれか１項に記載のリガンド結合繊維。
  10. 　上記繊維前駆体が、７０～３００℃で加熱されて製造されたものである、請求項１～９のいずれか１項に記載のリガンド結合繊維。
  11. 　上記リガンドが、一般式（４）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     〔式中、
    　Ｘ１は、３，４－ジクロロフェニル基、４－トリフルオロメチルフェニル基又は４－ｔ－ブチルフェニル基を示し、
    　Ｘ２は、置換されていてもよいアミノ基を示し、
    　Ｌ１は、単結合又は－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－を示し、
    　Ｌ２は、単結合又は－ＣＯＮＨ－を示し、
    　Ｌ３は、炭素原子数２～６のアルキレン基を示す。〕
    で表される化合物である、請求項１～１０のいずれか１項に記載のリガンド結合繊維。
  12. 　Ｘ１が４－ｔ－ブチルフェニル基であり、Ｘ２がアミノ基である、請求項１１記載のリガンド結合繊維。
  13. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載のリガンド結合繊維を含む、細胞培養基材。
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