TW201615228A - 配體結合纖維及使用該纖維之細胞培養基材 - Google Patents

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Taito Nishino
Ayako Aihara
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Abstract

本發明之目的在於提供一種配體結合纖維及細胞培養基材，該配體結合纖維係將對細胞膜受體有親和性之配體固定於纖維前驅物而成，該細胞培養基材於生物體外反覆表現出特定細胞膜受體之細胞擴增。 本發明之配體結合纖維包含對細胞膜受體有親和性之配體，及與該配體結合之纖維前驅物。

Description

配體結合纖維及使用該纖維之細胞培養基材
本發明係關於一種包含對細胞膜受體有親和性之配體及與該配體結合之纖維前驅物之配體結合纖維、以及使用該配體結合纖維之細胞培養基材。
於多細胞生物之細胞表面存在數量較多之細胞膜受體，擔當接收自細胞外部給予之資訊，轉換為對細胞內之資訊之作用。將細胞膜受體作為標的之生理性細胞外(間)資訊傳遞物質(即配體)可分類為神經傳導物質、內分泌物質(激素)、低分子物質、細胞增生、分化因子(細胞激素等)、細胞黏著因子，分別以不同分泌形式與作為標的之受體特異地具有親和性。
自先前起，利用細胞膜受體與配體之反應性進行各種研究。例如，有如下報告：惡性淋巴瘤等之治療中，有自血液中採取作為於骨髓中較多、於血液中略有存在之未分化之造血幹細胞之CD34陽性細胞，進行移植之方法，藉由使用使存在於CD34陽性細胞之膜表面之血小板生成素(TPO)受體活化之配體(抗體)，可促進CD34陽性細胞之增殖或分化之促進、對骨髓之成活之增加、造血能力之回復(專利文獻1)。
然而，若使TPO受體活化之配體吸收入體內，該配體之血藥濃度發生變化，則有引起其他疾病之危險性。
另一方面，報告為了維持CD34陽性細胞之未分化性不變而於活 體外增殖，使配體(凹口配體δ1)於樹脂上固定化之方法(專利文獻2)。
然而，藉由上述方法，有如下問題：為了使配體於通常之有機樹脂(聚甲基丙烯酸甲酯等)上固定化，變得必須對樹脂進行預處理，花費作業之工夫。
另一方面，專利文獻3中報告具備鍵結於聚合物之活體分子之活體功能纖維。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2007/145227號
[專利文獻2]日本專利特開2005-102656號公報
[專利文獻3]日本專利特表2004-529740號公報
本發明之目的在於提供一種對細胞膜受體有親和性之配體於配體結合纖維前驅物上固定化之配體結合纖維，及提供一種可使用該配體結合纖維，使表現細胞膜受體之細胞之擴增於活體外反覆進行之細胞培養基材。尤其，本發明之目的之一在於提供一種較佳地用於表現TPO受體之細胞(例如造血幹細胞、造血前驅細胞、巨核細胞前驅細胞、巨核細胞、血小板等)之活體外培養之細胞培養基材。
本發明者等人努力研究，結果發現：將含有在支鏈具有活性酯基及羥基之高分子化合物、交聯劑、酸化合物、及溶劑之纖維前驅物製造用組合物紡絲而製造之配體結合纖維前驅物具有充分之有機溶劑耐性，可使對細胞膜受體有親和性之配體(例如，對TPO受體有親和性之配體等)固定化，進而，發現如此獲得之配體結合纖維可用作可使表現細胞膜受體(例如TPO受體等)之細胞之擴增於活體外反覆進行 之細胞培養基材。
又，本發明者等人發現：上述纖維前驅物製造用組合物之紡絲係將於支鏈具有活性酯基及羥基之高分子化合物與交聯劑及酸化合物一併紡絲，故藉由高分子化合物所含之羥基彼此經由交聯劑發生交聯反應，高分子化合物彼此交聯，結果可獲得具有有機溶劑耐性、及液體培養基耐性之纖維前驅物。
又，本發明者等人發現關於本發明之纖維前驅物，藉由實施加熱處理，表現更優異之有機溶劑耐性、液體培養基耐性。
基於該等見解，本發明者等人從而完成本發明。
即，本發明如下所述。
[1]一種配體結合纖維，其包含對細胞膜受體有親和性之配體、及與該配體結合之配體結合纖維前驅物(以下稱為纖維前驅物)。
[2]如[1]之配體結合纖維，其中上述細胞膜受體為血小板生成素(TPO)受體。
[3]如[1]或[2]之配體結合纖維，其中上述纖維前驅物含有包含通式(1)所表示之單元結構、及通式(2)所表示之單元結構之高分子化合物，
[式中，R1表示氫原子或甲基， Q1表示酯鍵或醯胺鍵，R2表示至少1個氫原子經羥基取代之碳原子數1~10之烷基或碳原子數6~10之芳香族烴基]
[式中，R3表示氫原子或甲基，Q2表示活性酯基]。
[4]如[3]之配體結合纖維，其中上述配體具有胺基，該胺基與上述Q2鍵結。
[5]如[3]或[4]之配體結合纖維，其中上述Q2由通式(3)所表示，
[式中，Q3表示N-丁二醯亞胺基、對硝基苯基或五氟苯基]。
[6]如[3]至[5]中任一項之配體結合纖維，其中上述纖維前驅物進而含有交聯劑及酸化合物。
[7]如[3]至[6]中任一項之配體結合纖維，其中上述纖維前驅物為將含有上述高分子化合物、交聯劑、酸化合物及溶劑之纖維前驅物製造用組合物紡絲而製造者。
[8]如[7]之配體結合纖維，其中上述纖維前驅物為將上述纖維前驅物製造用組合物於已實施表面處理之基板上紡絲而製造者。
[9]如[3]至[8]中任一項之配體結合纖維，其中上述高分子化合物之重量平均分子量為1,000~1,000,000。
[10]如[1]至[9]中任一項之配體結合纖維，其中上述纖維前驅物為於70~300℃下加熱而製造者。
[11]如[1]至[10]中任一項之配體結合纖維，其中上述配體為通式(4)所表示之化合物，
[式中，X1表示3,4-二氯苯基、4-三氟甲基苯基或4-第三丁基苯基，X2表示亦可經取代之胺基，L1表示單鍵或-CH2-C6H4-，L2表示單鍵或-CONH-，L3表示碳原子數2~6之伸烷基]。
[12]如[11]之配體結合纖維，其中X1為4-第三丁基苯基，X2為胺基。
[13]一種細胞培養基材，其含有如[1]至[12]中任一項之配體結合纖維。
根據本發明，可提供一種可用作可使表現細胞膜受體(例如TPO受體等)之細胞之擴增於活體外反覆進行之細胞培養基材等之優異之配體結合纖維。
本發明之配體結合纖維之主要特徵在於：包含對細胞膜受體有親和性之配體、及與該配體結合之配體結合纖維前驅物(以下稱為纖維前驅物)。
1. 纖維前驅物
關於本發明之配體結合纖維所含之纖維前驅物(本發明之配體結合纖維之前驅物即配體結合前之纖維)，只要為可結合對細胞膜受體有親和性之配體者，則並無特別限制，較佳為含有(A)包含通式(1)所表示之單元結構及通式(2)所表示之單元結構之高分子化合物，更佳為進而含有(B)交聯劑及(C)酸化合物之纖維前驅物(以下亦稱為「本發明之纖維前驅物」)。
就本發明之纖維前驅物可含有之各成分，於以下詳細說明。
[成分A]
本發明之纖維前驅物較佳為含有包含通式(1)所表示之單元結構及通式(2)所表示之單元結構之高分子化合物(以下，亦稱為「成分A之高分子化合物」或簡稱為「成分A」)作為成分A。成分A所含之通式(1)所表示之單元結構於支鏈具有羥基，故藉由將成分A與交聯劑及酸化合物一併紡絲，羥基彼此經由交聯劑發生交聯反應，藉此，高分子化合物彼此交聯，可獲得具有有機溶劑耐性之纖維。又，成分A所含之通式(2)所表示之單元結構於支鏈具有活性酯基，故而可藉由與任意胺(尤佳為一級烷基胺)之親核取代反應，使下述配體等於高分子 化合物上固定化。
[式中，R1表示氫原子或甲基，Q1表示酯鍵或醯胺鍵，R2表示至少1個氫原子經羥基取代之碳原子數1~10之烷基或碳原子數6~10之芳香族烴基]
[式中，R3表示氫原子或甲基，Q2表示活性酯基]
關於通式(1)及通式(2)中之各基之定義，於以下詳細說明。
R1表示氫原子或甲基。
Q1表示酯鍵或醯胺鍵，就成分A之高分子化合物對於溶劑之溶解性之觀點而言，較佳為酯鍵。
Q2表示活性酯基。所謂「活性酯基」，意指藉由於酯基之一方具有拉電子性之取代基，羰基經活化(易於受到親核攻擊)之酯基，具體 而言，為通式(3)所表示之酯基。
式中，Q3表示形成活性酯基之一價有機基(拉電子基)，作為其具體例，可列舉N-丁二醯亞胺基、對硝基苯基及五氟苯基，就細胞親和性之觀點而言，較佳為N-丁二醯亞胺基。
R2表示至少1個氫原子經羥基取代之碳原子數1~10之烷基或碳原子數6~10之芳香族烴基。該碳原子數1~10之烷基可為直鏈狀或支鏈狀之任一者，作為其具體例，可列舉：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、異戊基、新戊基、第三戊基、1-乙基丙基、己基、異己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、辛基、壬基、癸基等。該烷基之碳原子數較佳為1~6，更佳為1~4。
又，作為R2之至少1個氫原子經羥基取代之碳原子數6~10之芳香族烴基之「碳原子數6~10之芳香族烴基」，例如可列舉：苯基、1-萘基、2-萘基等。
就纖維前驅物製造時之交聯反應效率、或所製造之纖維前驅物之細胞親和性之觀點而言，R2較佳為至少1個氫原子經羥基之碳原子數1~10(更佳為1~6、尤佳為1~4)之烷基或至少1個氫原子經羥基取代之苯基。
R3表示氫原子或甲基。
關於通式(1)所表示之單元結構，較佳為R1為氫原子或甲基，Q1為酯鍵，R2為至少1個氫原子經羥基取代之碳原子數1~10(更佳為1~ 6、尤佳為1~4)之烷基或至少1個氫原子經羥基取代之苯基。
通式(1)所表示之單元結構較佳為通式(5)所表示之單元結構。
[式中，R4與上述R1為同義，R5與上述R2為同義]
通式(2)所表示之單元結構較佳為通式(6)所表示之單元結構。
[式中，R6為氫原子或甲基]
關於成分A之高分子化合物，通式(1)所表示之單元結構與通式(2)所表示之單元結構之組成比就合成之容易度、對於溶劑之溶解性、纖維形成之容易度、使任意胺固定化時之效果之觀點而言，較佳為(通式(1)所表示之單元結構)/(通式(2)所表示之單元結構)=(35~95莫耳%)/(5~65莫耳%)。該等單元結構之組成比藉由13C-NMR測定。
關於成分A之高分子化合物，只要無損本發明之目的，則亦可含 有通式(1)所表示之單元結構及通式(2)所表示之單元結構以外之單元結構，就成分A之高分子化合物之聚合性之觀點而言，相對於成分A之高分子化合物之全部單元結構的通式(1)所表示之單元結構之比率(莫耳%)較佳為35~95莫耳%，通式(2)所表示之單元結構之比率(莫耳%)較佳為5~65莫耳%。又，關於相對於成分A之高分子化合物之全部單元結構的通式(1)所表示之單元結構之比率與通式(2)所表示之單元結構之比率之合計(莫耳%)，就成分A之高分子化合物之聚合性之觀點而言，較佳為超過90莫耳%，更佳為95莫耳%以上，尤佳為100莫耳%。相對於成分A之高分子化合物之全部單元結構的各單元結構之比率可根據藉由13C-NMR所測定之各單元結構之組成比算出。
關於成分A之重量平均分子量，就纖維前驅物之有機溶劑耐性之觀點而言，較佳為1,000~1,000,000之範圍，更佳為5,000~500,000之範圍，尤佳為10,000~300,000之範圍。本發明中所謂「重量平均分子量」，意指利用凝膠滲透層析法(GPC)測定之聚苯乙烯換算之分子量。
成分A可藉由就其本身而言為公知之方法或依據其之方法而製造。例如，可藉由使用適當之聚合起始劑(例如2,2'-偶氮雙(異丁酸)二甲酯等)使對應於通式(1)所表示之單元結構之單體及對應於通式(2)所表示之單元結構之單體於適當之溶劑(例如乙腈等)中聚合等而製造，但並不限定於此。亦可使用市售品。
作為對應於通式(1)所表示之單元結構之單體，例如可列舉：(甲基)丙烯酸2-羥基乙酯(例如CAS編號：868-77-9之化合物)、(甲基)丙烯酸2-羥基丙酯(例如CAS編號：923-26-2之化合物)、(甲基)丙烯酸4-羥基丁酯(例如CAS編號：2478-10-6之化合物)、N-羥基甲基(甲基)丙烯醯胺(例如CAS編號：923-02-4之化合物)、N-(2-羥基乙基)(甲基)丙烯醯胺(例如CAS編號：5238-56-2之化合物)、N-(2-羥基丙基)(甲基)丙烯醯胺(例如CAS編號：26099-09-2之化合物)、對羥基(甲基)丙烯醯 苯胺(例如CAS編號：19243-95-9之化合物)等，較佳為(甲基)丙烯酸2-羥基乙酯或(甲基)丙烯酸2-羥基丙酯，最佳為(甲基)丙烯酸2-羥基丙酯。
再者，本發明中，所謂「(甲基)丙烯酸酯化合物」，意指丙烯酸酯化合物及甲基丙烯酸酯化合物兩者。例如(甲基)丙烯酸意指丙烯酸及甲基丙烯酸兩者。
作為對應於通式(2)所表示之單元結構之單體，較佳為(甲基)丙烯酸對硝基苯酯(例如CAS編號：16522-41-1之化合物)、丙烯酸五氟苯酯(例如CAS編號：13642-97-2之化合物)、N-丙烯醯氧基丁二醯亞胺(CAS編號：38862-24-7之化合物)、甲基丙烯酸N-丁二醯亞胺酯(CAS編號：38862-25-8之化合物)，最佳為甲基丙烯酸N-丁二醯亞胺酯。
[成分B]
本發明之纖維前驅物較佳為含有交聯劑(以下亦稱為「成分B之交聯劑」或簡稱為「成分B」)作為成分B。成分B藉由與下述成分C併用，可使成分A之羥基彼此經由成分B自身而交聯，藉此對纖維前驅物賦予有機溶劑耐性。
成分B之交聯劑只要為可於酸存在下與羥基反應者，則並無特別限制，例如可列舉：1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲、1,3,4,6-四(丁氧甲基)甘脲等胺基樹脂交聯劑；2,2-雙(4-羥基-3,5-二羥基甲基苯基)丙烷等酚醛樹脂交聯劑；六亞甲基二異氰酸酯等異氰酸酯交聯劑；1,4-雙(乙烯氧基)丁烷等乙烯醚交聯劑等。
成分B較佳為胺基塑膠交聯劑，較佳為1,3,4,6-四(羥基甲基)甘脲(CAS編號：5395-50-6)、1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲(CAS編號：17464-88-9)、1,3,4,6-四(乙氧基甲基)甘脲(CAS編號：65952-06-9)、1,3,4,6-四(1-甲基乙氧基)甘脲(CAS編號：508220-69-7)、1,3,4,6-四(1,1-二甲基乙氧基)甘脲(CAS編號：547744-08-1)或1,3,4,6-四(丁氧基 甲基)甘脲(CAS編號：15968-37-3)，更佳為1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲。
成分B可單獨使用，亦可併用2種以上。
成分B之交聯劑可藉由就其本身而言為公知之方法或依據其之方法而製造。又，亦可使用市售品。
[成分C]
本發明之纖維前驅物較佳為含有酸化合物(以下亦稱為「成分C之酸化合物」或簡稱為「成分C」)作為成分C。該酸化合物可為鹽之態樣，即，本發明之所謂「酸化合物」之用語為亦包含鹽之概念。成分C藉由與成分B併用，可於成分A之羥基彼此經由成分B而交聯反應時促進該交聯反應。
作為成分C之酸化合物，例如可列舉磺酸化合物、羧酸化合物等有機酸化合物；鹽酸、磷酸、硫酸、硝酸、氫溴酸等無機酸化合物等。
成分C較佳為有機酸化合物，更佳為磺酸化合物。作為磺酸化合物，例如可列舉對甲苯磺酸、吡啶鎓-對甲苯磺酸鹽、三氟甲磺酸等，較佳為吡啶鎓-對甲苯磺酸鹽。
成分C可單獨使用，亦可併用2種以上。
成分C之酸化合物可藉由就其本身而言為公知之方法或依據其之方法而製造。又，亦可使用市售品。
關於本發明之纖維前驅物，只要不顯著地有損本發明之目的，則除成分A~C以外，亦可視需要於纖維前驅物中含有通常使用之添加劑。作為該添加劑，例如可列舉界面活性劑、流變調整劑、藥劑、微粒子等。
本發明之纖維前驅物之種類並無特別限制，例如於將本發明之配體結合纖維用於活體適合材料(例如細胞培養基材等)等之情形時， 本發明之纖維前驅物較佳為具有奈米級(例如1~1000nm)之直徑之纖維前驅物(奈米纖維前驅物)、或具有微米級(例如1~1000μm)之直徑之纖維前驅物(微米纖維前驅物)等，更佳為奈米纖維前驅物。
本發明之纖維前驅物之直徑(纖維前驅物之纖維徑)根據配體結合纖維之用途等適當調整即可，就下述纖維前驅物製造用組合物之濃度、及紡絲之容易度之觀點而言，較佳為1~1000nm，更佳為10~1000nm。本發明中，纖維前驅物之直徑係利用掃描型電子顯微鏡(SEM)測定。
本發明之纖維前驅物之長度較期望為相對於上述纖維前驅物之直徑為1000倍以上。
纖維前驅物之每單位面積之重量(單位面積重量)例如為7μg/cm2以上，較佳為10μg/cm2以上。
本發明之纖維前驅物之製造方法只要根據其成分或種類等適當選擇就其本身而言為公知之方法即可，並無特別限制，例如於本發明之纖維前驅物為含有上述成分A~C者之情形時，該纖維前驅物可藉由將含有成分A~C及溶劑之纖維前驅物製造用組合物紡絲而製造。
本發明中所使用之溶劑只要可為至少使上述成分A~C均勻地溶解或分散，且不與各成分反應者，則並無特別限制，就成分A~C之溶解性之觀點而言，較佳為極性溶劑。
作為該極性溶劑，例如可列舉：水、甲醇、乙醇、2-丙醇、丙二醇單甲醚、丙酮、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮等，為了組合物之紡絲容易度，較佳為丙酮與二甲基乙醯胺之混合溶劑，其較佳之混合比率(重量%)為丙酮/二甲基乙醯胺=(90重量%~60重量%)/(10重量%~40重量%)。
溶劑可單獨使用，亦可併用2種以上。
就製造具有適度之粗度之纖維前驅物之觀點而言，纖維前驅物 製造用組合物之成分A之含有比率較佳為5~50重量%，更佳為10~40重量%。
就與成分A之反應效率之觀點而言，纖維前驅物製造用組合物之成分B之含有比率較佳為0.1~5重量%，更佳為0.2~4.5重量%。
就製造纖維前驅物時之反應效率之觀點而言，纖維前驅物製造用組合物所含之成分A與成分B之重量比(成分A之重量/成分B之重量)較佳為5~65，更佳為5~25。
就交聯反應速度、交聯反應效率之觀點而言，纖維前驅物製造用之成分C之含有比率較佳為0.01~1.0重量%，更佳為0.05~0.5重量%，尤佳為0.07~0.4重量%。
就交聯反應速度、交聯反應效率之觀點而言，纖維前驅物製造用組合物所含之分A與成分C之重量比(成分A之重量/成分C之重量)較佳為20~120，更佳為80~115。
纖維前驅物製造用組合物除成分A~C及溶劑以外，亦可含有與纖維前驅物亦可含有之添加劑相同之添加劑。
纖維前驅物製造用組合物可藉由將上述成分A~C及溶劑或者成分A~C、溶劑及上述添加劑混合而製備。混合方法並無特別限制，藉由就其本身而言為公知之方法或依據其之方法混合即可。
纖維前驅物製造用組合物之紡絲方法只要為可形成纖維前驅物者，則並無特別限制，例如可列舉融熔流動法、複合熔融紡絲法、電場紡絲法等，就纖維形成能力之觀點而言，較佳為電場紡絲法。
電場紡絲法為公知之紡絲方法，可使用公知之電場紡絲裝置進行。使本發明之纖維前驅物製造用組合物自噴嘴(例如針等)之前端噴出之速度(噴出速度)、施加電壓、自使纖維前驅物製造用組合物噴出之噴嘴之前端至接收其之基板(集極部)為止之距離(噴出距離)等各種條件可根據所製造之纖維前驅物之直徑等適當設定。噴出速度通常為 0.1~100μl/min，較佳為0.5~50μl/min，更佳為1~20μl/min。施加電壓通常為0.5~80kV，較佳為1~60kV，更佳為3~40kV。噴出距離通常為1~60cm，較佳為2~40cm，更佳為3~30cm。
形成有纖維前驅物之基板(集極部)可為導電性，亦可無導電性，例如可列舉：樹脂基板(例如聚苯乙烯基板、丙烯酸系基板、聚碳酸酯基板、聚乙烯基板、氯乙烯基板、聚對苯二甲酸乙二酯基板等)、金屬基板(例如可列舉金基板、銀基板、鉑基板等，亦包含表面經金屬覆蓋(鍍敷)之基板)、玻璃基板、矽基板、陶瓷基板等，作為細胞培養基材，就基材之耐破損性或細胞觀察之容易度之觀點而言，較佳為樹脂基板。
又，形成有纖維前驅物之基板亦可實施表面處理。作為該表面處理，例如可列舉金屬(例如Pt、Pd、Au、Ag、Cu等)蒸鍍處理、UV臭氧處理等。關於導電性較低之基板(例如樹脂基板等)，藉由對其表面實施金屬蒸鍍處理，與不實施金屬蒸鍍處理之情形相比，可形成大量纖維前驅物。
本發明之纖維前驅物較佳為於基板上形成為層狀，亦可為其以外之構造。
本發明之纖維前驅物可與形成有纖維前驅物之基板一併使用，或者亦可自基板分離而使用。於本發明之纖維前驅物與基板一併使用之情形時，基板之纖維前驅物之單位面積重量(基板上之每單位面積之擔載量)通常為7μg/cm2以上，較佳為10μg/cm2以上，更佳為13μg/cm2以上，最佳為15μg/cm2以上。基板之纖維前驅物之單位面積重量之上限值並無特別限制，通常為15000μg/cm2。
較佳為於使纖維前驅物製造用組合物紡絲後，將該紡絲之纖維前驅物於特定之溫度下加熱。藉由將紡絲之纖維前驅物於特定之溫度下加熱，可表現出更優異之有機溶劑耐性。
加熱紡絲之纖維前驅物之溫度通常為70~300℃，就成分B之交聯劑之反應性、及成分A之高分子化合物之耐熱性之觀點而言，較佳為80~250℃，更佳為90~200℃。若該溫度未達70℃，則有成分A彼此之交聯反應不充分，所製造之纖維前驅物之有機溶劑耐性變低之傾向，若超過300℃，則成分A之高分子化合物自身發生熱所導致之分解或溶解等，無法形成纖維前驅物。
關於紡絲之纖維前驅物之加熱方法，只要為可於上述加熱溫度下加熱者，則並無特別限制，可藉由就其本身而言為公知之方法或依據其之方法適當加熱。作為該加熱方法之具體例，可列舉於大氣下使用加熱板或烘箱等之方法等。
加熱紡絲之纖維前驅物之時間可根據加熱溫度等適當設定，就交聯反應速度、生產效率之觀點而言，較佳為1分鐘~48小時，更佳為5分鐘~36小時，尤佳為10分鐘~24小時。
2. 對細胞膜受體有親和性之配體
本發明之配體結合纖維所含之配體較佳為對細胞膜受體有親和性，且可與纖維前驅物結合者。又，該配體亦可為合成配體。此處，所謂「合成配體」，意指僅藉由自天然中不存在之有機物利用化學合成法人工地製造而得之配體。因此，例如合成肽並非本說明書中所述之「合成配體」。
作為本發明中使用之配體，可列舉例如蛋白質、肽、胺基酸、胺基酸衍生物及糖類等。
上述配體可為天然者，或者亦可為人工合成而得者、藉由基因操作而得者之任一者。
作為上述蛋白質，例如可列舉：癌胚抗原、鱗狀細胞癌關聯抗原、細胞角蛋白19片段、唾液酸化糖鏈抗原KL-6、利尿鈉肽、肌鈣蛋白、肌血球素等疾病標記、介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、介白 素-3(IL-3)、介白素-4(IL-4)、介白素-5(IL-5)、介白素-6(IL-6)、介白素-7(IL-7)、介白素-8(IL-8)、介白素-9(IL-9)、介白素-10(IL-10)、介白素-11(IL-11)、介白素-12(IL-12)、介白素-13(IL-13)、介白素-14(IL-14)、介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)、介白素-21(IL-21)、干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)、顆粒球菌落刺激因子(G-CSF)、單球菌落刺激因子(M-CSF)、顆粒球-巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)、幹細胞因子(SCF)、flk2/flt3配體(FL)、白血病細胞抑制因子(LIF)、腫瘤抑制素M(OM)、紅血球生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、轉化生長因子-α(TGF-α)、轉化生長因子-β(TGF-β)、巨噬細胞炎症蛋白質-1α(MIP-1α)、上皮細胞增生因子(EGF)、纖維芽細胞增生因子-1、2、3、4、5、6、7、8、或9(FGF-1、2、3、4、5、6、7、8、或9)、神經細胞增生因子(NGF)肝細胞增生因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)、蛋白酶連結素I、蛋白酶連結素II、血小板源性生長因子(PDGF)、膽鹼能激動性分化因子(CDF)、趨化素、Notch配體(Delta1等)、Wnt蛋白質、血管生成素樣蛋白質2、3、5或7(Angpt2、3、5或7)、類胰島素生長因子(IGF)、類胰島素生長因子結合蛋白質(IGFBP)、多效生長因子(Pleiotrophin)、胰島素、生長激素等細胞增生因子、及膠原蛋白I至XIX、纖維黏連蛋白、玻璃黏連蛋白、層黏連蛋白-1至12、層黏連蛋白511、層黏連蛋白521、Nitgen、肌腱蛋白、凝血酶致敏蛋白、馮威里氏(von Willebrand)因子、骨調素、血纖維蛋白原、各種彈力蛋白、各種蛋白多糖、各種鈣黏素、橋粒糖蛋白、橋粒芯蛋白、各種整合素、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、L-選擇蛋白、免疫球蛋白超家族、基質膠、聚-D-離胺酸、聚-L-離胺酸等細胞黏著因子、IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等各種抗體等。
作為上述肽，例如可列舉：血管收縮素I至IV、緩激肽、血纖維蛋白肽、利尿鈉肽、尿擴張素、鳥苷蛋白、內皮素1至3、Salusin、尾 體素、催產素、神經垂體素、血管加壓素、腎上腺皮質刺激激素、黑色素細胞刺激激素、腦內啡、促脂素、尿皮素1至3、黃體形成激素釋出激素、生長激素釋出激素、生長抑素、Cortistatin、泌乳素釋出肽、Metastin、速激肽、P物質、神經激肽、Endokinin、神經調壓素、神經介素、Zenin、饑餓肽、肥胖抑制素、黑色素凝聚激素、下丘泌素、神經肽、強啡肽、新腦內啡、內嗎啡肽、痛敏肽、焦化RF醯胺肽、甘丙胺素、肽胃泌素、膽囊收縮素、分泌素、鬆弛素、胰高血糖激素、腸高血糖素、腎上腺髓素、芸香素、降血鈣素、副甲狀腺激素、抵禦素、胸腺素、YIGSR肽等。
作為上述胺基酸，可列舉：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬醯胺酸、半胱胺酸、麩醯胺、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯基丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸、胱胺酸、羥基脯胺酸、羥基離胺酸、二羥基苯基丙胺酸、甲狀腺素、磷酸基絲胺酸、鎖鏈素、β-丙胺酸、肌胺酸、鳥胺酸、肌酸、γ-胺基丁酸、茶胺酸、紅藻胺酸、軟骨藻酸、鵝膏蕈胺酸等。
作為上述胺基酸衍生物，可列舉：血清素、去甲腎上腺素、腎上腺素、酪胺(CAS編號：51-67-2之化合物)、多巴胺(CAS編號：51-61-6之化合物)等。
作為上述糖類，例如可列舉：D-葡萄糖胺、D-半乳胺糖、神經胺糖酸、玻尿酸、硫酸軟骨素、硫酸乙醯肝素、肝素等。
又，本發明亦可使用蛋白質、肽、胺基酸、胺基酸衍生物及糖類以外之化學物質作為配體。作為此種化學物質，例如可列舉：2-二甲基胺基乙基胺(CAS編號：108-00-9之化合物)、N-(2-羥基乙基)乙二胺(CAS編號：111-41-1之化合物)、N-(2-胺基乙基)哌(CAS編號：140-31-8之化合物)、4-(2-胺基乙基)啉(CAS編號：2038-03-1之化合 物)、1-(2-胺基乙基)-2-咪唑烷酮(CAS編號：6281-42-1之化合物)、色胺(CAS編號：61-54-1之化合物)、組織胺二鹽酸鹽(CAS編號：56-92-8之化合物)等一級胺；乙二胺二鹽酸鹽(CAS編號：333-18-6之化合物)、1,6-二胺基己烷(CAS編號：124-09-4之化合物)、N,N'-雙(胺基丙基)哌(CAS編號：7209-38-3之化合物)之一級二胺等。
本發明亦可使用對血小板生成素(TPO)受體有親和性之配體作為配體。作為對血小板生成素(TPO)受體有親和性之配體，例如可列舉日本專利特開平11-1477號公報、日本專利特開平11-152276號公報、國際公開第01/07423號、國際公開第01/53267號、國際公開第02/059099號、國際公開第02/059100號、國際公開第00/35446號、國際公開第00/66112號、國際公開第01/34585號、國際公開第01/17349號、國際公開第01/39773號、國際公開第01/21180號、國際公開第01/89457號、國際公開第02/49413號、國際公開第02/085343號、日本專利特開2001-97948號公報、國際公開第99/11262號、國際公開第02/062775號、國際公開第03/062233號、日本專利特開2003-238565號公報等所記載之化合物。又，下述式(7)~式(15)所表示之化合物亦可用作對血小板生成素(TPO)受體有親和性之配體。
關於本發明之纖維前驅物與配體之結合之形態，只要兩者結合，則並無特別限制。作為一態樣，於本發明之纖維前驅物含有成分A之高分子化合物，配體具有胺基之情形時，配體之胺基與成分A之Q2可藉由親核取代反應而結合。
作為具有胺基之配體之具體例，例如可列舉將上述例示之化合物之羧酸轉換為羧酸醯胺後，藉由何夫曼重排反應等而胺基化之化合物。
又，作為本發明中所使用之配體，亦可將上述所例示之化合物之取代基之一部分藉由就其本身而言為公知之方法胺基化後用作本發 明之配體。
作為具有胺基之配體之尤佳一態樣，可列舉通式(4)所表示之化合物(以下亦稱為「化合物(4)」)。
[式中，X1表示3,4-二氯苯基、4-三氟甲基苯基或4-第三丁基苯基，X2表示亦可經取代之胺基，L1表示單鍵或-CH2-C6H4-，L2表示單鍵或-CONH-，L3表示碳原子數2~6之伸烷基]
就通式(4)之各基之定義，於以下詳細說明。
X1表示3,4-二氯苯基、4-三氟甲基苯基或4-第三丁基苯基，較佳為4-第三丁基苯基。
X2表示亦可經取代之胺基。本說明書中，所謂「亦可經取代」，除特別規定之情形以外，意指亦可具有1個以上取代基，作為該「取代基」，例如可列舉甲基、乙基、正丙基、異丙基、第三丁基、烯丙基、苯基、苄基等。
X2較佳為胺基。
L1表示單鍵或-CH2-C6H4-，較佳為單鍵。
L2表示單鍵或-CONH-，較佳為單鍵。
L3表示碳原子數2~6之伸烷基。碳原子數2~6之伸烷基可為直 鏈、支鏈及環狀之任一者，例如可列舉：伸乙基、正伸丙基、四亞甲基、伸戊基、六亞甲基、二甲基亞甲基、甲基伸乙基、二甲基伸乙基、二甲基伸丙基、伸環丙基、伸環己基等。其中，較佳為碳原子數2~4之伸烷基，更佳為碳原子數2~3之伸烷基。
作為較佳之化合物(4)，係X1為4-第三丁基苯基，X2較佳為胺基，L1為單鍵或-CH2-C6H4-(較佳為單鍵)，L2為單鍵或-CONH-(較佳為單鍵)，L3為碳原子數2~6(較佳為2~4、更佳為2~3)之伸烷基之化合物(4)。
作為較佳之化合物(4)之具體例，可列舉下述式(16)~(18)所表示之化合物等。
化合物(4)例如可藉由日本專利第4386072號公報所記載之方法、或依據其之方法而製造。
3. 配體結合纖維之製造(配體對纖維前驅物之固定化)
本發明中，關於纖維前驅物與配體之結合之形態，只要兩者結合，則並無特別限制，作為一態樣，於使用具有活性酯基之纖維前驅物(例如本發明之纖維前驅物等)之情形時，對細胞膜受體有親和性之配體可藉由存在於纖維前驅物之活性酯基與配體之反應，於上述纖維前驅物固定化。活性酯基於中性條件下與游離胺基反應。關於胺之鹼性，烷基胺強於芳香族胺，烷基胺藉由與活性酯之反應而適合。於水溶性較低之胺之情形時，較佳為溶解於乙醇或二甲基亞碸等般之有機溶劑，進行反應。於使用本發明之纖維前驅物之情形時，活性酯基與配體之反應可於製備纖維前驅物製造用組合物時進行。又，可於使纖維前驅物製造用組合物紡絲，製造纖維前驅物後進行，亦可於對纖維前驅物實施加熱處理後進行。反應條件較佳為於0℃~80℃下1~48小時，進而較佳為於0℃~60℃下1~24小時，最佳為於0℃~50℃下1~24小時。
本發明之配體結合纖維之直徑根據其用途等適當調整即可，較佳為1~1000nm，更佳為10~1000nm。本發明中，配體結合纖維之直徑係藉由掃描型電子顯微鏡(SEM)測定。
又，本發明之配體結合纖維之長度較期望為相對於上述直徑為 1000倍以上。
本發明之配體結合纖維可於擔載於基板上之狀態下使用。於該情形時，基板之配體結合纖維之單位面積重量(基板上之每單位面積之擔載量)通常為7μg/cm2以上，較佳為10μg/cm2以上，更佳為13μg/cm2以上，最佳為15μg/cm2以上。基板之配體結合纖維之單位面積重量之上限值並無特別限制，通常為15000μg/cm2。
通常，纖維前驅物之單位面積重量與配體結合纖維之單位面積重量之值大致相同(誤差範圍內)。
本發明之配體結合纖維之用途並無特別限制，由於如下述實施例所示般，本發明之配體結合纖維具有優異之有機溶劑耐性，作為細胞培養基材具有充分之功能，故而尤其適於細胞培養基材(例如細胞培養支架材料等)。
4. 細胞培養基材
本發明之細胞培養基材之主要特徵在於含有本發明之配體結合纖維。本發明中，所謂「細胞培養基材」，意指對於細胞不造成壞影響，可選擇性地僅培養特定之細胞之材料。
作為本發明之細胞培養基材，例如可列舉：對玻璃、金屬、及聚苯乙烯等塑膠上吹送本發明之配體結合纖維而成之細胞培養基材(例如六孔平底微孔盤等)、導入本發明之配體結合纖維之培養包裝等。
所謂使用本發明之細胞培養基材而培養之「細胞」，為構成動物或植物之最基本之單位，為於細胞膜之內部具有細胞質及各種細胞小器官作為其要素者。此時，內包DNA之核可含於細胞內部，亦可不含於細胞內部。
本發明之細胞培養基材例如可用於源自動物之細胞之培養。本發明之源自動物之細胞中含有精子或卵子等生殖細胞、構成活體之體細胞、幹細胞(包含多能性幹細胞等)、前驅細胞、自活體分離之癌細 胞、自活體分離且獲得不死化能力，於體外穩定地維持之細胞(即，細胞株(包含癌細胞株))、自活體分離且人為地進行基因改變之細胞、自活體分離且人為地交換核之細胞等。
作為構成活體之體細胞之例，並不限定於以下，可列舉：纖維芽細胞、骨髓細胞、B淋巴球、T淋巴球、嗜中性球、紅血球、血小板、巨噬細胞、單球、骨細胞、骨髓細胞、周皮細胞、樹狀細胞、角質形成細胞、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、內皮細胞、血管內皮細胞、肝實質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神經系細胞、神經膠細胞、神經元、少樹突神經膠細胞、微神經膠、星狀膠細胞、心臟細胞、食道細胞、肌肉細胞(例如平滑肌細胞或骨格肌細胞)、胰腺β細胞、黑色素細胞、造血前驅細胞(例如源自臍帶血之CD34陽性細胞)、及單核細胞等。該體細胞例如可自皮膚、腎臟、脾臟、腎上腺、肝臟、肺、卵巣、胰腺、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液(包含臍帶血)、骨髓、心臟、眼、腦或神經組織等任意組織採取。
所謂幹細胞，為兼具複製自身之能力及分化為其他複數個系統之細胞之能力之細胞，作為其例，並不限定於以下，可列舉：胚性幹細胞(ES細胞)、胚性腫瘤細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、神經幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、胰幹細胞、肌幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛囊幹細胞等。作為多能性幹細胞，例如上述幹細胞之中，可列舉ES細胞、胚性生殖幹細胞、iPS細胞等。
所謂前驅細胞，為處於自上述幹細胞分化為特定之體細胞或生殖細胞之中途之階段之細胞。又，所謂癌細胞，為自體細胞衍生，獲得無限之增殖能力之細胞。
作為細胞株之例，並不限定於以下，可列舉：HEK293(人類胎兒 腎細胞)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、AE-1、3D9、Ns0/1、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(註冊商標)、Vero等。
作為癌細胞株之例，並不限定於以下，作為人類乳腺癌細胞株，可列舉HBC-4、BSY-1、BSY-2、MCF-7、MCF-7/ADR RES、HS578T、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-N、BT-549、T47D，作為人類宮頸癌細胞株，可列舉HeLa，作為人類肺癌細胞株，可列舉A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522、DMS273、DMS114，作為人類大腸癌細胞株，可列舉Caco-2、COLO-205、HCC-2998、HCT-15、HCT-116、HT-29、KM-12、SW-620、WiDr，作為人類前列腺癌細胞株，可列舉DU-145、PC-3、LNCaP，作為人類中樞神經系癌細胞株，可列舉U251、SF-295、SF-539、SF-268、SNB-75、SNB-78、SNB-19，作為人類卵巣癌細胞株，可列舉OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3、IGROV-1，作為人類腎癌細胞株，可列舉RXF-631L、ACHN、UO-31、SN-12C、A498、CAKI-1、RXF-393L、786-0、TK-10，作為人類胃癌細胞株，可列舉MKN45、MKN28、St-4、MKN-1、MKN-7、MKN-74，作為皮膚癌細胞株，可列舉LOX-IMVI、LOX、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、UACC-257、M14，作為白血病細胞株，可列舉CCRF-CRM、K562、MOLT-4、HL-60TB、RPMI8226、SR、UT7/TPO、Jurkat等。
該等細胞之中，作為使用含有利用對TPO受體有親和性之配體之本發明之配體結合纖維的細胞培養基材(例如細胞培養支架材料等)而培養之細胞，例如可列舉表現TPO受體之造血幹細胞、造血前驅細胞、巨核細胞前驅細胞、巨核細胞、血小板、UT7/TPO細胞等。
本發明之細胞培養基材使用本發明之配體結合纖維作為原材料之一，可藉由就其本身而言為公知之方法或依據其之方法製造。
[實施例]
以下，說明本發明之具體例，但本發明並不受此之任何限定。
[高分子化合物1之重量平均分子量之測定]
下述高分子化合物1之重量平均分子量係藉由凝膠滲透層析法(GPC)測定。用於測定之裝置、測定條件如下所述。
裝置：TOSOH HLC-8320GPC system
管柱：Shodex(註冊商標)KF-803L、KF-802及KF-801
管柱溫度：40℃
溶離液：DMF
流量：0.6ml/min
檢測器：RI
標準試樣：聚苯乙烯
[高分子化合物1之13C-NMR測定]
下述高分子化合物1之單元結構之組成比係藉由13C-NMR測定。用於測定及解析之裝置、條件如下所述。
裝置：日本電子股份有限公司JNM-ECA500、Delta V5.0
測定核：13C閘門去偶合
累計次數：18000
測定溫度：室溫
檢測峰：69~71ppm(源自HPMA)、 25~27ppm(源自NSuMA)
測定溶劑：氘化二甲基亞碸(DMSO-d6)、750uL
樣本量：0.1g
鬆弛試劑：乙醯丙酮鉻(III)、4mg
[配體化合物之1H-NMR測定]
配體化合物係藉由1H-NMR鑑定。條件如下所述。
裝置：Varian NMR System 400 NB(400MHz)
測定溶劑：CDCl3
基準物質：四甲基矽烷(TMS)(δ0.0ppm、1H)
(合成例1：高分子化合物1)
使甲基丙烯酸2-羥基丙酯(HPMA；東京化成工業股份有限公司製造)18.37g、甲基丙烯酸N-丁二醯亞胺酯(NsuMA；東京化成工業股份有限公司製造)10.00g、及2,2'-偶氮雙(異丁酸)二甲酯(MAIB；和光純藥工業股份有限公司製造)0.03g溶解於乙腈66.25g，於氮氣環境下，滴加至經加熱回流之乙腈47.32g中。滴加結束後，一面保持加熱回流，一面反應18小時。其後，將該反應混合液滴加至乙醚中，使聚合物析出。取出聚合物後，於減壓下乾燥，藉此獲得高分子化合物1 19.9g。該高分子化合物1之重量平均分子量以聚苯乙烯換算為235,000。藉由13C-NMR測定之組成比為HPMA/NSuMA=63莫耳%/37莫耳%。
(合成例2：配體化合物[4]之合成)
<化合物[1]之合成>
於具備磁力攪拌器之50ml四口燒瓶中添加5-(氯羰基)噻吩-2-羧酸甲酯(TEC)1.00g(4.89mmol)及乙腈12g，內溫保持為5℃。於該混合物中滴加N-(第三丁氧基羰)-1,2-二胺基乙烷(0.783g，4.89mmol)及三乙基胺(1.088g，10.75mmol)之乙腈(8g)溶液後，以室溫攪拌17小時。於反應液中加入乙酸乙酯30g、純水30g，進行分液，回收有機相。對該有機相添加硫酸鈉5g，靜置30分鐘後，將其過濾。繼而，將過濾液濃縮乾燥，獲得化合物[1]1.39g(4.23mmol)(產率：87%，性狀：淺棕色固體)。
1H-NMR(400MHz)in CDCl3：1.43ppm(s,9H),3.37-3.44ppm(m,2H),3.51-3.56ppm(m,2H),3.90ppm(s,3H),4.99-5.11ppm(m,1H),7.32ppm(d,J=3.5Hz,1H),0.98-1.12ppm(m,1H),8.03ppm(d,J=3.5Hz,1H)
<化合物[2]之合成>
於具備磁力攪拌器之50ml四口燒瓶中添加化合物[1]1.36g(4.14mmol)、肼一水合物2.073g(41.42mmol)、2-丙醇23.20g，以內溫80℃攪拌6小時。其後，於減壓下將反應液濃縮乾燥，獲得化合物[2]1.29g(3.93mmol)(產率：95%，性狀：黃色結晶)。
1H-NMR(400MHz)in d6-DMSO：1.37ppm(s,9H),3.07ppm(q,J=6.3Hz,2H),3.24ppm(q,J=6.3Hz,2H),4.26-4.78ppm(br,2H),6.93ppm(t,J=5.5Hz,1H),7.63-7.67ppm(m,2H),8.62ppm(t,J=5.5Hz,1H),9.78-10.06ppm(br,1H)
<化合物[3]之合成>
於具備磁力攪拌器之50ml四口燒瓶中添加化合物[2]1.29g(3.93mmol)、KHBT(依照國際公開第2004/108683號或美國專利公開第2006/094694號所記載之方法合成)1.13g(4.13mmol)、二甲基亞碸11.90g，以內溫110℃攪拌5小時。其後，於反應液中添加純水50g， 將析出之結晶減壓抽氣過濾。進而，利用二異丙醚6g清洗該結晶後，進行減壓乾燥，獲得化合物[3]1.63g(2.79mmol)(產率：71%，性狀：黃色結晶)。
1H-NMR(400MHz)in d6-DMSO：1.30ppm(s,9H),1.38ppm(s,9H),2.48ppm(s,3H),3.08-3.14ppm(m,2H),3.22-3.33ppm(m,2H),6.94ppm(t,J=5.5Hz,1H),7.42ppm(d,J=8.4Hz,2H),7.69ppm(d,J=8.4Hz,2H),7.77ppm(d,J=3.7Hz,1H),7.98ppm(s,1H),8.00ppm(d,J=3.7Hz,1H),8.72ppm(t,J=5.7Hz,1H),11.24-11.55ppm(br,1H),11.98-12.22ppm(br,1H)
<化合物[4]之合成>
於具備磁力攪拌器之50ml四口燒瓶中添加化合物[3]1.38g(2.35mmol)、98%甲酸14.00g，以內溫40℃攪拌1小時。其後，於減壓下自反應液將甲酸蒸餾去除，添加二異丙醚7g、四氫呋喃1.4g，將析出之結晶減壓抽氣過濾。繼而，將該結晶減壓乾燥，獲得化合物[4]1.07g(2.21mol)(產率：94%，性狀：黃色結晶)。
1H-NMR(400MHz)in d6-DMSO：1.30ppm(s,9H),2.47ppm(s,3H),2.96ppm(t,J=6.0Hz,2H),3.48ppm(q,J=5.7Hz,2H),7.41ppm(d,J=8.6Hz,2H),7.70ppm(d,J=8.6Hz,2H),7.82ppm(d,J=4.0Hz,1H),7.93ppm(s,1H),7.96ppm(d,J=4.0Hz,1H),8.32ppm(s,1H),9.22ppm(t,J=5.1Hz,1H),12.05-12.95(br,1H)
<纖維前驅物製造用組合物(溶液)之製備> (纖維前驅物製造用組合物1)
將高分子化合物1：1.70g、1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲0.34g、吡啶鎓-對甲苯磺酸鹽0.017g、二甲基乙醯胺1.57g、及丙酮4.50g混合後，利用旋轉混合器VMR-5(AS ONE股份有限公司製造)以100rpm進行攪拌直至溶解，獲得纖維前驅物製造用組合物1。該纖維前驅物製 造用組合物1之高分子化合物1之含有比率為約21重量%。
[藉由電場紡絲法之纖維前驅物之製造]
藉由電場紡絲法之纖維前驅物之製造係使用Esprayer ES-2000(Fuence股份有限公司製造)實施。纖維前驅物製造用組合物1注入至1ml之鎖定式玻璃注射筒(AS ONE股份有限公司製造)，安裝針長13mm之鎖定式金屬製針24G(Musashi Engineering股份有限公司製造)。將自針前端至接收纖維之基板為止之距離(噴出距離)設為20cm。施加電壓設為25kV，噴出速度設為10μl/min。
[纖維前驅物之形狀之確認方法]
纖維前驅物之形狀之確認係藉由利用離子濺射機(E-1030，Hitachi High-Technologies股份有限公司製造)將Pt-Pd蒸鍍於纖維前驅物1分鐘後，使用掃描型電子顯微鏡(SEM)(S-4800，Hitachi High-Technologies股份有限公司製造)以放大倍率10,000倍觀察而進行。
[纖維前驅物之纖維徑之測定方法]
纖維前驅物之纖維徑(纖維前驅物之粗度)之測定係使用掃描型電子顯微鏡(SEM)(S-4800，Hitachi High-Technologies股份有限公司製造)，拍攝及保存放大倍率10,000倍之圖像後，藉由附屬之測長工具而進行。
[聚苯乙烯(PSt)基板之表面處理A]
利用離子濺射機(E-1030，Hitachi High-Technologies股份有限公司製造)對由Acrysunday股份有限公司製造之「Plaban」(商品名，厚度0.2mm)自製之Φ30mm聚苯乙烯(PSt)基板之單面進行30秒鐘Pt-Pd蒸鍍。
[聚苯乙烯(PSt)基板之表面處理B]
利用UV臭氧清潔器UV253E(Filgen股份有限公司製造)對由Acrysunday股份有限公司製造之「Plaban」(商品名，厚度0.2mm)自 製之Φ30mm聚苯乙烯(PSt)基板之單面進行10分鐘處理。
[實施例1]
藉由電場紡絲法將纖維前驅物製造用組合物1紡絲，對進行上述表面處理A之Φ30mmPSt基板上吹送20分鐘後，以80℃進行48小時加熱處理。利用乙醇清洗所獲得之纖維前驅物(纖維前驅物1)，進行風乾後，利用掃描型電子顯微鏡(SEM)確認該纖維前驅物1之形狀。纖維前驅物1之纖維徑為約700nm。對該纖維前驅物1利用下述方法進行配體化合物[4]之固定化，獲得配體化合物[4]經固定化之纖維前驅物1(配體結合纖維1)。
[實施例2]
使用進行上述表面處理B之Φ30mm PSt基板代替進行上述表面處理A之Φ30mm PSt基板，除此以外，利用與實施例1相同之方法獲得纖維前驅物2。纖維前驅物2之纖維徑為約700nm。對該纖維前驅物2利用下述方法進行配體化合物[4]之固定化，獲得配體化合物[4]經固定化之纖維前驅物2(配體結合纖維2)。
[實施例3]
使用未處理之Φ30mm PSt基板代替進行上述表面處理A之Φ30mm PSt基板，除此以外，利用與實施例1相同之方法獲得纖維前驅物3。纖維前驅物3之纖維徑為約570nm。對該纖維前驅物3利用下述方法進行配體化合物[4]之固定化，獲得配體化合物[4]經固定化之纖維前驅物3(配體結合纖維3)。
[比較例1]
不對實施例1所獲得之纖維前驅物1進行配體化合物[4]之固定化，用作比較例1之纖維。
再者，實施例1~3之配體結合纖維1~3及比較例1之纖維與形成有纖維前驅物之基板一併使用。
[比較例2]
將進行上述表面處理A之Φ30mm PSt基板用作比較例2之基板。
將實施例1~3之配體結合纖維1~3及比較例1之纖維之各纖維前驅物重量示於表1。關於配體結合纖維1~3之纖維前驅物重量及比較例1之纖維之纖維前驅物重量，測定纖維前驅物及擔載該纖維前驅物之PSt基板之整體重量，由該重量減去PSt基板之重量而算出。
[配體化合物[4]之固定化]
對六孔平底微孔盤(AS ONE股份有限公司製造)配置實施例1~3之纖維前驅物1~3。對於配置有各纖維前驅物之孔，添加配體化合物[4](0.9mg)之二甲基亞碸(2.0mL)溶液，以室溫靜置6小時。其後，除去溶液，利用二甲基亞碸及乙醇清洗各纖維前驅物，將其風乾。
<試驗例1：細胞培養評價>
關於實施例1之配體結合纖維1及比較例1之纖維，進行細胞培養評價。於該評價之對照中，使用配置有PSt基板之系統(陽性對照：於培養基中添加血小板生成素(TPO)10ng/mL，陰性對照：僅培養基)。再者，以下，CO2培養箱之CO2之濃度(%)以氣體氛圍中之CO2之體積%表示。
[細胞之製備]
細胞係使用TPO依存性人類巨核細胞性白血病細胞株(UT-7/TPO；Komatsu等人，Blood，1996，87，pp.4552-4560)。細胞之培養中，使用含有10%(v/v)FBS及10ng/mL之TPO(血小板生成素，Peprotech股份有限公司製造)之IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)培養基(Sigma-Aldrich股份有限公司製造)。細胞以於37℃ CO2培養箱內保持5%二氧化碳濃度之狀態培養2天以上。將所獲得之培養液離心分離(TOMY SEIKO股份有限公司製造，LC-200，1500rpm/3min，室溫)後，除去上清液，添加除去TPO之上述IMDM培養基，製備細胞懸浮液。再者，此處所謂「FBS」，意指胎牛血清(Biological Industries公司製造)。
[基材之殺菌]
對六孔平底微孔盤(AS ONE股份有限公司製造)配置實施例1之配體結合纖維、比較例1之纖維、及PSt基板(陽性對照用及陰性對照用)，分別添加70%乙醇2mL，以室溫浸漬5分鐘後，進行10分鐘風乾。
[細胞培養第1次]
對六孔平底微孔盤配置已殺菌之實施例1~3之配體結合纖維1~3、比較例1之纖維、比較例2之基板、以及陽性對照用及陰性對照用之PSt基板，利用IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)培養基(Sigma-Aldrich股份有限公司製造)2mL清洗2次。其後，添加製備為8.0×104cells/4mL/well之UT-7/TPO之細胞懸浮液。配置有PSt基板之孔中，於配置有陽性對照用之PSt基板之孔中添加TPO，設為最終濃度10ng/mL。其後，以保持為5%二氧化碳濃度之狀態於37℃下於CO2培養箱內靜置6天。
[使用WST-8之細胞數計測]
於6天之細胞培養後，自配置有實施例1~3之配體結合纖維1~ 3、比較例1之纖維、比較例2之基板、以及陽性對照用及陰性對照用之PSt基板之各孔回收細胞培養液。進行各細胞培養液之移液後，將其100μL移至96孔培養盤(Corning股份有限公司製造)，進而添加10μL之WST-8試劑(Kishida化學股份有限公司製造)。以37℃於CO2培養箱內靜置120分鐘後，利用吸光度計(molecular device公司製造，SpectraMax)測定450nm之吸光度。
[細胞培養第2次及第3次]
於第1次細胞培養後，利用磷酸鹽緩衝液(PBS)4mL將實施例1~3之配體結合纖維1~3、以及陽性對照用及陰性對照用之PSt基板清洗2次。其後，添加製備為8.0×104cells/4mL/well之UT-7/TPO之細胞懸浮液。於配置有陽性對照用之PSt基板之孔中添加TPO，設為最終濃度10ng/mL。其後，以保持為5%二氧化碳濃度之狀態於37℃下於CO2培養箱內靜置6天。
於6天之培養後，與上述相同地使用WST-8進行細胞數之計測。
於第2次細胞培養及細胞數計測後，與此相同地進行第3次細胞培養(6天)及細胞數計測。
將結果示於表2及表3。再者，各樣本之細胞數換算為將陽性對照之細胞數設為100%之百分率而比較。
根據表3所示之結果可明確，關於實施例1及實施例2之配體結合纖維，可獲得與陽性對照相同以上之細胞數。可認為其原因在於：所含有之纖維前驅物之量多於實施例3之配體結合纖維，故而可使較多配體固定化，其結果是，活躍地進行對細胞增生必需之訊號傳遞。
又，關於實施例1及實施例2之配體結合纖維，配體固定化於纖維前驅物，故而即便反覆進行細胞培養，亦可獲得每次相同之細胞數。另一方面，陽性對照中，每次細胞培養時，必須添加TPO。
進而，若配體結合纖維之纖維徑為100nm以上，且基板之纖維前驅物之單位面積重量為10μg/cm2以上，更佳為13μg/cm2以上，最佳為15μg/cm2以上，則可獲得與陽性對照相同以上之細胞數。
[產業上之可利用性]
根據本發明，可提供將配體固定化於纖維前驅物而成之配體結合纖維，關於該配體結合纖維，可僅使目標細胞有效地反覆增殖，於再生醫學之領域中，作為細胞培養基材表現先前未有之優異功能。
本申請案將於日本提出申請之日本專利特願2014-223736(提出申請日：2014年10月31日)作為基礎，其內容全部包含於本說明書中。

Claims (13)

  1. 一種配體結合纖維，其包含對細胞膜受體有親和性之配體、及與該配體結合之配體結合纖維前驅物(以下稱為纖維前驅物)。
  2. 如請求項1之配體結合纖維，其中上述細胞膜受體為血小板生成素(TPO)受體。
  3. 如請求項1或2之配體結合纖維，其中上述纖維前驅物含有高分子化合物，該高分子化合物包含通式(1)所表示之單元結構、及通式(2)所表示之單元結構： [式中，R1表示氫原子或甲基，Q1表示酯鍵或醯胺鍵，R2表示至少1個氫原子經羥基取代之碳原子數1~10之烷基或碳原子數6~10之芳香族烴基]； [式中，R3表示氫原子或甲基， Q2表示活性酯基]。
  4. 如請求項3之配體結合纖維，其中上述配體具有胺基，該胺基與上述Q2鍵結。
  5. 如請求項3或4之配體結合纖維，其中上述Q2由通式(3)所表示， [式中，Q3表示N-丁二醯亞胺基、對硝基苯基或五氟苯基]。
  6. 如請求項3至5中任一項之配體結合纖維，其中上述纖維前驅物進而含有交聯劑及酸化合物。
  7. 如請求項3至6中任一項之配體結合纖維，其中上述纖維前驅物為將含有上述高分子化合物、交聯劑、酸化合物及溶劑之纖維前驅物製造用組合物紡絲而製造者。
  8. 如請求項7之配體結合纖維，其中上述纖維前驅物為將上述纖維前驅物製造用組合物於已實施表面處理之基板上紡絲而製造者。
  9. 如請求項3至8中任一項之配體結合纖維，其中上述高分子化合物之重量平均分子量為1,000~1,000,000。
  10. 如請求項1至9中任一項之配體結合纖維，其中上述纖維前驅物為於70~300℃下加熱而製造者。
  11. 如請求項1至10中任一項之配體結合纖維，其中上述配體為通式(4)所表示之化合物： [式中，X1表示3,4-二氯苯基、4-三氟甲基苯基或4-第三丁基苯基，X2表示亦可經取代之胺基，L1表示單鍵或-CH2-C6H4-，L2表示單鍵或-CONH-，L3表示碳原子數2~6之伸烷基]。
  12. 如請求項11之配體結合纖維，其中X1為4-第三丁基苯基，X2為胺基。
  13. 一種細胞培養基材，其含有如請求項1至12中任一項之配體結合纖維。
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