WO2013051479A1

WO2013051479A1 - 生体物質又は細胞の付着抑制剤

Info

Publication number: WO2013051479A1
Application number: PCT/JP2012/075120
Authority: WO
Inventors: 木村　茂雄; 高広岸岡; 真紀子梅嵜; 泰斗西野
Original assignee: 日産化学工業株式会社
Priority date: 2011-10-03
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2013-04-11
Also published as: JPWO2013051479A1; TW201328737A

Abstract

【課題】　タンパク質などの生体物質、血小板などの細胞の付着抑制効果を有する被覆膜を形成するための組成物を提供する。【解決手段】　下記式（１）：（１）〔式中、Ｒ₁は芳香族炭化水素又は脂環式炭化水素を１つ又は２つ含む炭素原子数４乃至２０の有機基を表し、２つのｎはそれぞれ５乃至６００の整数を表し、Ｑは下記式（２）、式（３）、式（４）又は式（５）：（２）（式中、Ｑ₁は二価の有機基を表し、２つのｍはそれぞれ独立に０又は１を表す。）（３）（４）（５）（式中、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄及びＲ₅はそれぞれ独立に、水素原子又は有機基を表す。）で表される二価の有機基を表す。〕で表される構造単位を有するポリマー、架橋材及び有機溶媒を含む生体物質又は細胞の付着抑制剤。

Description

生体物質又は細胞の付着抑制剤

　本発明は、シリコン、ガラス等の無機物質、又はポリエチレン等の樹脂に、タンパク質等の生体物質、血小板等の細胞の付着を抑制可能な被覆膜を形成するための組成物に関する。

　生体系は、人工材料など外的なものと接触した場合、当該人工材料を異物として認識するため、時間の経過に伴い血栓形成、免疫反応、炎症反応など様々な異物反応が引き起こされる。そのため、人工臓器などの医療用器具を用いる場合、ヘパリンなどの抗血液凝固剤、免疫抑制剤のような薬剤を併用しなければならない。

　ところが、上記抗血液凝固剤等を使用した場合には、肝臓障害、アレルギー反応などの様々な副反応を生じるおそれがある。

　そこで、これらの課題を解決するために、生体膜と同じ両性型のリン脂質であるホスホリルコリンを高分子鎖の側鎖に有するポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（以下、本明細書ではＭＰＣポリマーという。）を用いた医療用材料が提案されている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。

　また、Ｎ－メタクリロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム－α－Ｎ－メチルカルボキシベタインの高分子量体（以下、本明細書ではＣＭＢポリマーという。）を用いた医療用材料が提案されている（例えば、特許文献３、特許文献４及び特許文献５参照）。

　ＭＰＣポリマー又はＣＭＢポリマーを材料表面に被覆することで、抗血液凝固剤を使用しない場合でも血液凝固を抑えることが可能となる。また、ＭＰＣポリマーについては、細胞の付着を抑制する効果からスフェア（細胞塊）を調製する際の容器の表面処理にも用いられている。

　一方、主鎖にポリエチレンオキサイド鎖を、末端にメルカプト基又はトリアルコキシシリル基を有するポリマーを含む溶液を、複数回接触結合させることにより得られるバイオセンサー表面が、タンパク質の吸着を低下させることが特許文献６に開示されている。

特開昭５４－６３０２５号公報特開２０００－２７９５１２号公報特開２００７－１３０１９４号公報特開２００８－２７４１５１号公報特開２０１０－５７７４５号公報国際公開第０３／０７６９３３号

　しかしながら、ＭＰＣポリマー及びＣＭＢポリマーの合成、さらに当該ポリマーを含む溶液を作製するまでの工程に手間がかかるという問題がある。また、特許文献６に記載のポリマーを含む溶液による表面処理は、簡便な方法とはいえないという問題がある。本発明の課題は、溶液を作製することにより、簡便な方法で直接基材の表面に被覆することが可能であり、しかも、従来のポリマーと同等又はそれ以上の効果を示す生体物質又は細胞の付着抑制剤を提供することである。

　本発明者らは、上記課題を解決するため、酸二無水物及びポリエチレングリコールの反応生成物とジエポキシ化合物とを共重合させて得られたポリマーを含む新規な生体物質付着抑制剤を見出した。
　すなわち、本発明は、下記式（１）：

〔式中、Ｒ₁は芳香族炭化水素又は脂環式炭化水素を１つ又は２つ含む炭素原子数４乃至２０の有機基を表し、２つのｎはそれぞれ５乃至６００の整数を表し、Ｑは下記式（２）、式（３）、式（４）又は式（５）：

（式中、Ｑ₁は炭素原子数１乃至６のアルキレン基、炭素原子数３乃至６の脂環式炭化水素基又は炭素原子数６乃至１０の芳香族炭化水素基を表し、前記芳香族炭化水素基は、炭素原子数１乃至６のアルキル基、ハロゲン原子、炭素原子数１乃至６のアルコキシ基、ニトロ基、シアノ基及び炭素原子数１乃至６のアルキルチオ基からなる群から選ばれる少なくとも一つの基で置換されていてもよく、２つのｍはそれぞれ独立に０又は１を表す。）

（式中、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄及びＲ₅はそれぞれ独立に、水素原子、炭素原子数１乃至６のアルキル基、炭素原子数３乃至６のアルケニル基、ベンジル基又はフェニル基を表し、前記フェニル基は炭素原子数１乃至６のアルキル基、ハロゲン原子、炭素原子数１乃至６のアルコキシ基、ニトロ基、シアノ基及び炭素原子数１乃至６のアルキルチオ基からなる群から選ばれる少なくとも一つの基で置換されていてもよく、Ｒ₆は炭素原子数１乃至６のアルキル基、炭素原子数３乃至６のアルケニル基、ベンジル基又はフェニル基を表し、前記フェニル基は炭素原子数１乃至６のアルキル基、ハロゲン原子、炭素原子数１乃至６のアルコキシ基、ニトロ基、シアノ基及び炭素原子数１乃至６のアルキルチオ基からなる群から選ばれる少なくとも一つの基で置換されていてもよい。）
で表される二価の有機基を表す。〕
で表される構造単位を有するポリマー及び有機溶媒を含む生体物質又は細胞の付着抑制剤である。

　本発明の生体物質又は細胞の付着抑制剤を用いることにより、シリコン、ガラス等の無機物質又はポリエチレン等の樹脂（以下、本明細書では基材という。）の表面に、簡便な方法で被覆膜を形成することができる。そのため、従来のポリマーを用いることなく、上記基材表面にタンパク質等の生体物質、血小板等の細胞を付着させないことができる。

図１は未処理のガラス基板に対するＨｅｋ２９３細胞付着実験の結果を示す顕微鏡写真である。図２は実施例２の膜形成組成物を用いて熱硬化膜を形成したガラス基板に対するＨｅｋ２９３細胞付着実験の結果を示す顕微鏡写真である。

　本発明の生体物質又は細胞の付着抑制剤は、前記式（１）で表される構造単位を有するポリマーを含む。当該式（１）において、芳香族炭化水素又は脂環式炭化水素を１つ又は２つ含む炭素原子数４乃至２０の有機基を表すＲ₁は本発明の場合特に限定されないが、例えば、下記式で表される。これらの式で表される有機基の炭素原子数は４乃至１５である。

　前記式（１）において、Ｑは前記式（２）、式（３）、式（４）又は式（５）で表される二価の有機基を表し、当該Ｑは、例えば、下記式で表される。

　前記式（２）、式（３）、式（４）又は式（５）において、炭素原子数１乃至６のアルキレン基としては例えばメチレン基、エチレン基、ｎ－ブチレン基が挙げられ、炭素原子数３乃至６の脂環式炭化水素基としては例えばシクロヘキシレン基が挙げられ、炭素原子数６乃至１０の芳香族炭化水素基としては例えばフェニレン基、ナフチレン基が挙げられ、ハロゲン原子としては例えばフッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子が挙げられ、炭素原子数１乃至６のアルキル基としては例えばメチル基、エチル基が挙げられ、炭素原子数３乃至６のアルケニル基としては例えばアリル基が挙げられる。

　前記式（１）で表される構造単位を有するポリマーの含有割合は、本発明の生体物質又は細胞の付着抑制剤の質量に対して、例えば、０．５質量％乃至３０質量％である。

　本発明の生体物質又は細胞の付着抑制剤に含まれる有機溶媒としては前記ポリマーを溶解することができれば特に制限されないが、例えば、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、シクロヘキサノン、乳酸エチル、乳酸ブチルが挙げられる。これら有機溶媒のうち、１種のみ又は２種以上の混合物として用いることができる。

　本発明の生体物質又は細胞の付着抑制剤は、必要に応じ、さらに架橋材を含むことができる。前記架橋材としては、例えば、メチロール基、メトキシメチル基などの架橋形成置換基を有する含窒素化合物が挙げられ、その具体例として、テトラメトキシメチルグリコールウリルが挙げられる。前記架橋材の含有割合は、上記式（１）で表される構造単位を有するポリマーの質量に対して、例えば、１０質量％乃至４０質量％である。

　本発明の生体物質又は細胞の付着抑制剤は、必要に応じ、さらに架橋反応を促進させる化合物を含むことができる。当該化合物としては、例えば、ｐ－トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ピリジニウム－ｐ－トルエンスルホナート、カンファースルホン酸、５－スルホサリチル酸、４－クロロベンゼンスルホン酸、４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸、ベンゼンジスルホン酸、１－ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸類が挙げられ、その含有割合は、上記式（１）で表される構造単位を有するポリマーの質量に対して、例えば１質量％乃至１５質量％である。

　本発明の生体物質又は細胞の付着抑制剤を基材である無機物質の表面処理に用いる場合、その無機物質には特に制限がない。例えば、シリコン、銅、鉄、ステンレス、チタニウム、アルミニウム、亜鉛またはそれらの合金、ガラス、シリカ、酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム、酸化マグネシウムが挙げられる。

　本発明の生体物質又は細胞の付着抑制剤を基材である樹脂の表面処理に用いる場合、その樹脂には特に制限がない。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリウレタン、ポリウレア、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸誘導体、ポリアクリロニトリル、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリルアミド誘導体、ポリスルホン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルペンテン、熱可塑性ポリエーテルポリウレタン、シリコーンゴム、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート、セルロース、セルロース誘導体が挙げられる。

　本発明の生体物質又は細胞の付着抑制剤は、医薬品、医薬部外品、医療用器具等の表面処理が可能である。前記医療用器具の例として、ドラッグデリバリーシステム材、成形補助材、包装材、人工血管、血液透析膜、ステント、カテーテル、ガードワイヤー、コンタクトレンズ、血液フィルター、血液保存パック、血液回路、留置針、内視鏡、人工臓器、バイオチップ、細胞培養シート、糖鎖合成機器が挙げられるが、その医療用器具には特に制限がない。

　本発明の生体物質又は細胞の付着抑制剤は、例えば、基材上に塗布しベークする工程を経て、被覆膜を形成することにより当該基材の表面に固定化することができる。前記ベーク温度は、例えば、９０℃乃至１６０℃である。９０℃未満の温度では硬化せず、１６０℃を超える温度では、含有するポリマーの側鎖からポリエチレングリコール鎖が脱離する可能性がある。

　本発明における生体物質とは、生体を構成する基本材料であり、例えば、タンパク質、核酸、各種糖類、アミノ酸、ヌクレオシド、脂質、ビタミンが挙げられる。これらの生体物質の内、本発明の付着抑制剤を用いることにより付着が抑制される生体物質としては、タンパク質、核酸、各種糖類、アミノ酸、ヌクレオシド、脂質、ビタミンが挙げられ、好ましくはタンパク質、核酸、各種糖類が挙げられ、更に好ましくはタンパク質が挙げられる。

　本発明における細胞とは、生体を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。この際、ＤＮＡを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。例えば、本発明における動物由来の細胞には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹枝状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞または骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞、及び単核細胞が含まれる。上記体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、脾臓、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳、神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。上記前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞又は生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。上記癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。上記細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ－３３Ａ、ＨＴ－２９、ＡＥ－１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ、Ｖｅｒｏが含まれる。

　これらの細胞の内、本発明の付着抑制剤を用いることにより付着が抑制される細胞としては、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞が挙げられ、好ましくは生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）が、より好ましくは生体を構成する体細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）が挙げられ、さらに好ましくは生体を構成する体細胞が挙げられ、最も好ましくは血小板が挙げられる。

　本発明の付着抑制剤は、生体物質、細胞の付着を効率よく抑制するため、生体物質、細胞の研究用試薬として用いることができる。例えば、細胞又は組織の分化、増殖を調節する因子を解明する際、細胞と目的の因子を共存させて培養した時の細胞と当該細胞から得られる生体物質の数又は種類、細胞表面分化マーカー、発現遺伝子の変化を解析する。この際に本発明の付着抑制剤を用いることにより生体物質、細胞の付着が抑えられるため、目的の生体物質、細胞を効率よく回収することができる。目的とする因子を解明する際の培養条件、培養装置、培地の種類、付着抑制剤の種類、その含量、添加物の種類、添加物の含量、培養期間、培養温度などは、当事者により適宜選択される。培養により増殖又は出現した細胞は、本発明に係る技術分野にて標準的な顕微鏡を用いて観察することができる。この際、培養した細胞について特異的抗体を用いて染色してもよい。目的の因子により変化した発現遺伝子は、培養した細胞からＤＮＡ（デオキシリボ核酸）又はＲＮＡ（リボ核酸）を抽出しサザンブロッティング法、ノーザンブロッティング法、ＲＴ－ＰＣＲ法などによって検出することができる。また、細胞表面分化マーカーは、特異的抗体を用いてＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリーにより検出し、目的の因子による分化や増殖に対する効果を観察することができる。

　本発明におけるスフェアとは、目的の細胞が、数十乃至数百個から成る凝集塊のことを表わす。本発明の付着抑制剤は、生体物質又は細胞の付着が効率よく抑制されるため、細胞凝集塊（スフェア）を形成させる際の表面処理材料として用いることができる。スフェアを形成させる方法は、特に制限は無く、当業者が適宜選択することができる。例えば、目的の細胞を、本発明の付着抑制剤にて表面処理を施した培養容器中にて培養し、スフェアを形成させることができる。この細胞非接着性培養容器を使用する場合は、まず、目的の細胞を採取した後にその細胞浮遊液を調製し、当該培養容器中に播種して培養を行なう。１日乃至７日間ほど培養を続けると、細胞は自発的にスフェアを形成する。
　上記の培養容器は、一般的に動物細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。
　また、目的とするサイズの均一な細胞凝集塊を得るためには、使用する細胞非付着性培養容器上に、目的とする細胞凝集塊と同一径の複数の凹みを導入することもできる。これらの凹みが互いに接しているか、あるいは目的とする細胞凝集塊の直径の範囲内であれば、細胞を播種した際、播種した細胞は凹みと凹みの間で細胞凝集塊を形成することなく、確実に凹みの中でその容積に応じた大きさの細胞凝集塊を形成し、均一サイズの細胞凝集塊集団を得ることができる。この際の凹みの形状としては半球又は円錐状が好ましい。
　ここで調製されたスフェアは、遠心分離又はろ過処理を行うことにより、回収することができる。例えば、遠心分離する際の重力加速度（Ｇ）は１００Ｇ乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることはない。

　以下、本発明に係る具体例を説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。

　本明細書の下記合成例に示す重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（以下、ＧＰＣと略称する。）による測定結果である。測定には東ソー（株）製ＧＰＣ装置を用い、測定条件等は次のとおりである。
ＧＰＣカラム：Ｓｈｏｄｅｘ〔登録商標〕・Ａｓａｈｉｐａｋ〔登録商標〕（昭和電工（株））
カラム温度：４０℃
溶媒：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
流量：０．６ｍｌ／分
標準試料：ポリスチレン（東ソー（株））
ディテクター：ＲＩ

（合成例１）
　ピロメリット酸二無水物（東京化成工業（株））２．１８ｇに対し、ポリエチレングリコール（純正化学（株）、製品名：ＰＥＧ４００）８．８ｇを加え、１００℃のオイルバスを用いて加熱撹拌した。一時間程度で粉末状であったピロメリット酸二無水物はすべて溶解し、均一な溶液となった。その後さらに加熱撹拌を１２時間継続した。原料のひとつであるＰＥＧ４００の消失度合いから、ピロメリット酸二無水物１モルに対しポリエチレングリコール２モルが反応した下記式（２）で表される化合物が得られたと推定される。

（式中、ｎは７乃至９の整数を表す。）

　得られた溶液に対しパラフタル酸ジグリシジル（ナガセケムテックス（株）、製品名：ＥＸ－７１１）を２．８９ｇ、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（東京化成工業（株））を０．１２ｇ加え、溶媒としてシクロヘキサノンを固形分が２０質量％程度となるように５６ｇ加えた。１００℃のオイルバスを用いて１２時間加熱撹拌し、ポリマーを合成した。得られた溶液は淡黄色であった。ＧＰＣによる分析の結果、標準ポリスチレン換算で重量平均分子量２５，０００、多分散度２．７であった。得られたポリマーの推定構造は下記式（３）で表される。

（式中、ｎは７乃至９の整数を表す。）

（合成例２）
　上記合成例１で加えたポリエチレングリコールをＰＥＧ６００（純正化学（株））１３．２ｇとした以外は合成例１と同様の方法で、ピロメリット酸二無水物とポリエチレングリコールとの反応生成物を含む溶液を得た。本合成例で使用したＰＥＧ６００は、エチレンオキサイドの繰返し数ｎが１１乃至１３の整数である点で、合成例１で使用したＰＥＧ４００と異なる。続くパラフタル酸ジグリシジルとの反応においては、溶媒として加えたシクロヘキサノンの量を７８ｇとした以外は合成例１と同様の方法でポリマーを合成し、得られた溶液は淡黄色の溶液であった。ＧＰＣによる分析の結果、分子量は標準ポリスチレン換算で重量平均分子量３０，０００、多分散度２．６であった。

（合成例３）
　上記合成例１で加えたポリエチレングリコールをＰＥＧ２０００（純正化学（株））４４ｇとした以外は合成例１と同様の方法で、ピロメリット酸二無水物とポリエチレングリコールとの反応生成物を含む溶液を得た。本合成例で使用したＰＥＧ２０００は、エチレンオキサイドの繰返し数ｎが４０乃至４６の整数である点で、合成例１で使用したＰＥＧ４００及び合成例２で使用したＰＥＧ６００と異なる。続くパラフタル酸ジグリシジルとの反応においては、溶媒として加えたシクロヘキサノンの量を固形分が５０質量％となる４９ｇとした以外は合成例１と同様の方法でポリマーを合成し、得られた溶液は淡黄色であった。ＧＰＣによる分析の結果、標準ポリスチレン換算で重量平均分子量３２，０００、多分散度２．６であった。

（合成例４）
　ピロメリット酸二無水物（東京化成工業（株））１．０９ｇに対し、ポリエチレングリコール（純正化学（株）、製品名：ＰＥＧ６０００）９０ｇを加え、１００℃のオイルバスを用いて加熱撹拌した。一時間程度で粉末状であったピロメリット酸二無水物はすべて溶解し、均一な溶液となった。その後さらに加熱撹拌を１２時間継続した。本合成例で使用したＰＥＧ６０００は、エチレンオキサイドの繰返し数ｎが１６５乃至２１０の整数である点で、合成例１で使用したＰＥＧ４００、合成例２で使用したＰＥＧ６００及び合成例３で使用したＰＥＧ２０００と異なる。

　得られた溶液に対し、パラフタル酸ジグリシジル（ナガセケムテックス（株）、製品名：ＥＸ－７１１）を１．４５ｇ、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（東京化成工業（株））を０．０７ｇ加え、溶媒としてシクロヘキサノンを固形分が５０質量％程度となるように９３ｇ加えた。１００℃のオイルバスを用いて１２時間加熱撹拌し、ポリマーを合成した。得られた溶液は無色であった。ＧＰＣによる分析の結果、標準ポリスチレン換算で重量平均分子量４０，０００、多分散度３．０であった。

（合成例５）
　ピロメリット酸二無水物（東京化成工業（株））０．５５ｇに対し、ポリエチレングリコール（純正化学（株）、製品名：ＰＥＧ２００００）１１０ｇを加え、１００℃のオイルバスを用いて加熱撹拌した。一時間程度で粉末状であったピロメリット酸二無水物はすべて溶解し、均一な溶液となった。その後さらに加熱撹拌を１２時間継続した。本合成例で使用したＰＥＧ２００００は、エチレンオキサイドの繰返し数ｎが４１０乃至５７０の整数である点で、合成例１で使用したＰＥＧ４００、合成例２で使用したＰＥＧ６００、合成例３で使用したＰＥＧ２０００及び合成例４で使用したＰＥＧ６０００と異なる。

　得られた溶液に対し、パラフタル酸ジグリシジル（ナガセケムテックス（株）、製品名：ＥＸ－７１１）を０．７３ｇ、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（東京化成工業（株））を０．０４ｇ加え、溶媒としてシクロヘキサノンを固形分が５０質量％程度となるように１１２ｇ加えた。１００℃のオイルバスを用いて１２時間加熱撹拌し、ポリマーを合成した。得られた溶液は無色であった。ＧＰＣによる分析の結果、標準ポリスチレン換算で重量平均分子量４５，０００、多分散度３．０であった。

（合成例６）
　ヘキサフルオロイソプロピリデンビスフェニルカルボン酸無水物（ＡＺエレクトロニックマテリアルズ（株）、製品名：６ＦＤＡ）３．３６ｇに対しポリエチレングリコール（純正化学（株）、製品名：ＰＥＧ６００）１３．２ｇを加え、１００℃のオイルバスを用いて加熱撹拌した。２時間程度で粉末状であった６ＦＤＡはすべて溶解し、均一な溶液となった。その後さらに加熱撹拌を１２時間継続した。

　得られた溶液に対し、パラフタル酸ジグリシジル（ナガセケムテックス（株）、製品名：ＥＸ－７１１）を２．８９ｇ、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（東京化成工業（株））を０．１２ｇ加え、溶媒としてシクロヘキサノンを固形分が２０質量％程度となるよう８０ｇ加えた。１００℃のオイルバスを用いて１２時間加熱撹拌し、ポリマーを合成した。得られた溶液は淡黄色であった。ＧＰＣによる分析の結果、標準ポリスチレン換算で重量平均分子量７０，０００、多分散度３．０であった。

（合成例７）
　ピロメリット酸二無水物（東京化成工業（株））２．１８ｇに対し、ポリエチレングリコール（純正化学（株）、製品名：ＰＥＧ６００）１３．２ｇを加え、１００℃のオイルバスを用いて加熱撹拌した。一時間程度で粉末状であったピロメリット酸二無水物はすべて溶解し、均一な溶液となった。その後さらに加熱撹拌を１２時間継続した。

　得られた溶液に対し、モノアリルイソシアヌル酸ジグリシジル（四国化成工業（株）、製品名：ＭＡＤＧ－ＩＣ）を３．１２ｇ、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（東京化成工業（株））を０．１２ｇ加え、溶媒としてシクロヘキサノンを固形分が２０質量％程度となるように７３ｇ加えた。１００℃のオイルバスを用いて１２時間加熱撹拌し、ポリマーを合成した。得られた溶液は無色であった。ＧＰＣによる分析の結果、分子量は標準ポリスチレン換算で重量平均分子量３０，０００、多分散度２．９であった。

（比較合成例１）
　ピロメリット酸二無水物（東京化成工業（株））２．１８ｇに対し、トリエチレングリコール（東京化成工業（株））３．４ｇを加え、１００℃のオイルバスを用いて加熱撹拌した。一時間程度で粉末状であったピロメリット酸二無水物はすべて溶解し、均一な溶液となった。その後さらに加熱撹拌を１２時間継続した。

　得られた溶液に対し、パラフタル酸ジグリシジル（ナガセケムテックス（株）、製品名：ＥＸ－７１１）を２．８９ｇ、ベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（東京化成工業（株））を０．１２ｇ加え、溶媒としてシクロヘキサノンを固形分が２０質量％程度となるよう３５．２ｇ加えた。１００℃のオイルバスを用いて１２時間加熱撹拌し、ポリマーを合成した。得られた溶液は無色であった。ＧＰＣによる分析の結果、分子量は標準ポリスチレン換算で重量平均分子量１８，０００、多分散度２．５であった。

（実施例１）
　上記合成例１で得られた溶液０．５ｇに、架橋材としてテトラメトキシメチルグリコールウリル（日本サイテックインダストリーズ（株）、商品名：ＰＯＷＤＥＲＬＩＮＫ〔登録商標〕１１７４）０．０２５ｇ及び架橋反応を促進させる化合物（以下、酸触媒と略称する。）としてピリジニウム－ｐ－トルエンスルホナート（東京化成工業（株））０．００２５ｇを加えた。さらに有機溶媒として、プロピレングリコールモノメチルエーテル（以下、ＰＧＭＥと略称する。）を５．６８ｇ及びシクロヘキサノン（以下、ＣＹと略称する。）を０．３ｇ加えて生体物質又は細胞の付着抑制剤（膜形成組成物）を調製した。

　得られた膜形成組成物をシリコンウェハ上にスピン塗布し、１００℃のホットプレートでベークすることで熱硬化膜を形成した。得られた熱硬化膜を水洗し、エアーブラシで水分を乾燥した。光学式干渉膜厚計で膜厚を確認したところ、７５ｎｍであった。また得られた熱硬化膜を有機溶媒に浸漬し、エアーブラシで有機溶媒を乾燥した後に膜厚を確認したところ、７５ｎｍであった。

（実施例２乃至実施例７、比較例１）
　上記実施例１と同様に、上記合成例２乃至合成例７及び比較合成例１で得られたポリマーを用いて生体物質又は細胞の付着抑制剤（膜形成組成物）を調製した。用いたポリマー含有溶液、架橋材、有機溶媒の質量及び硬化膜の膜厚を下記一覧表に示す。実施例２乃至実施例７ではそれぞれ合成例２乃至合成例７で得られた溶液を用い、比較例１では比較合成例１で得られた溶液を用いた。

（蛍光タンパク質付着実験）
　タンパク質の付着性を確認するため、蛍光タンパク質の付着実験を行った。上記実施例１乃至実施例７及び比較例１で調製した生体物質又は細胞の付着抑制剤（膜形成組成物）をそれぞれガラス基板（ＴＥＭＰＡＸ　Ｆｌｏａｔ〔登録商標〕）にスピン塗布し、１００℃でベークして熱硬化膜を作成した。得られた熱硬化膜上に内面積９００ｍｍ²となるように切り出したシリコーンラバーを貼り付けた。

　蛍光標識されたウシ血清アルブミン（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ、シグマアルドリッチ社製）溶液を濃度１００μｇ／ｍＬに調整し、５００μＬを上記シリコーンラバーで囲まれた空隙に滴下した。その状態で３７℃のインキュベーターに３０分間保存した。ここで、上記シリコーンラバーで囲まれた、ＦＩＴＣ－ＢＳＡ溶液との接触部分を蛍光タンパク質付着処理部といい、それ以外の部分をタンパク質未付着部という。３０分経過後ＦＩＴＣ－ＢＳＡ溶液を廃棄し、純粋で十分に洗浄した後風乾した。蛍光顕微鏡（オリンパス（株）製、励起波長４９０ｎｍ、観測波長５２０ｎｍ）を用いて蛍光タンパク質の付着性を確認した。その確認は、蛍光タンパク質付着処理部と蛍光タンパク質未付着部の明度を比較することで行った。明度が高いほど、蛍光タンパク質の付着量が多いことを示している。以下に示す表２に、各実施例及び比較例１で調製した生体物質又は細胞の付着抑制剤（膜形成組成物）を用いた場合、並びに前記生体物質又は細胞の付着抑制剤（膜形成組成物）を塗布しないガラス基板（ＴＥＭＰＡＸ　Ｆｌｏａｔ〔登録商標〕）の明度をそれぞれ示す。

　実施例１乃至実施例７で調製した生体物質又は細胞の付着抑制剤を用いた場合は、蛍光タンパク質付着処理部と蛍光タンパク質未付着部の明度に差異はほとんど見られなかった。一方、前記生体物質又は細胞の付着抑制剤を塗布しないガラス基板の場合及び比較例１で調製した膜形成組成物を用いた場合では、蛍光タンパク質付着処理部の明度が上昇していることがわかった。すなわち、本発明の生体物質又は細胞の付着抑制剤を用いてガラス基板に被覆膜を形成した場合は、蛍光タンパク質付着処理部においてタンパク質の付着量は、蛍光タンパク質未付着部と同等にまで抑制されていることを示している。

（細胞懸濁液の調製）
　後述する細胞付着実験に用いた細胞の種類、培地及び細胞懸濁液の濃度を以下に示す。
ＨＭＳＣ（ヒト間葉系幹細胞、東洋紡績（株）製）
　培地：ＭＦ－ｍｅｄｉｕｍ〔登録商標〕（東洋紡績（株）製）
　濃度：６．７×１０⁴ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ
Ｈｅｋ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＤＳファーマバイオメディカル社製）
　培地：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地（和光純薬工業（株）製）
　濃度：２．５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ
ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞、ＤＳファーマバイオメディカル社製）
　培地：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（和光純薬工業（株）製）
　濃度：２．５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ
ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞、ＤＳファーマバイオメディカル社製）
　培地：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地（和光純薬工業（株）製）
　濃度：２．０×１０⁵ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ
ＭＲＣ５（ヒト胎児肺細胞、ＤＳファーマバイオメディカル社製）
　培地：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＥＭＥＭ培地（和光純薬工業（株）製）
　濃度：２．０×１０⁵ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ
ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＤＳファーマバイオメディカル社製）
　培地：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（シグマアルドリッチ社製）
　濃度：２．５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ
なお、ＣＯ₂インキュベーターにおけるＣＯ₂の濃度（％）は、雰囲気中のＣＯ₂の体積％で示した。また、ＦＢＳは牛胎児血清（バイオロジカルインダストリーズ社製）を意味する。

（細胞付着実験１）
　実施例２で調製した生体物質又は細胞の付着抑制剤（膜形成組成物）をガラス基板（ＴＥＭＰＡＸ　Ｆｌｏａｔ〔登録商標〕）にスピン塗布し、１００℃でベークして熱硬化膜を作成した。熱硬化膜が形成されたガラス基板及び未処理のガラス基板を２４ウェルプレートに配置した。このプレートを７０％エタノール溶液（ｖ／ｖ）１ｍＬに１０分間浸して消毒した後、エタノール溶液を除去し、１時間風乾した。

　上記ガラス基板を配置した２４ウェルプレートに細胞培養の培地を入れ、そのウェルにＨｅｋ２９３細胞懸濁液を１ｍＬずつ加え、５体積％のＣＯ₂濃度で３７℃、２４時間インキュベートした。未処理のガラス基板を参照とし、細胞増殖状況を確認した。未処理のガラス基板上では図１に示すように均一に細胞が接着して増殖したのに対し、熱硬化膜が形成されたガラス基板上で培養した細胞は図２に示すように接着性を示さず細胞塊（スフェア）を形成した。

（細胞付着実験２）
　実施例２で調製した膜形成組成物に代えて実施例５で調製した膜形成組成物を用い、細胞付着実験１と同様の方法によりガラス基板上に熱硬化膜を作成し、そのガラス基板及び未処理のガラス基板に対し、上記６種の細胞の付着実験を行った。細胞付着実験１と同様の方法により２４時間細胞培養した後の各ガラス基板を、２４ウェルプレートの別のウェルに移し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、シグマアルドリッチ社製）１ｍＬで洗浄した後アスピレートで洗浄液を除去した。トリプシン－ＥＤＴＡ溶液５００μＬを加え細胞をはがし、５００μＬの培地を加え１．５ｍＬのマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に移した。１５００ｒｐｍで３分間遠心処理し、上清をアスピレートで除去した。培地１００μＬを加えて懸濁させ、トリパンブルー染色を用いて生細胞数を計数した。その結果を下記表３に示す。

　細胞種によりばらつきはあるが、実施例５で調製した膜形成組成物を用いて熱硬化膜を形成したガラス基板に対する細胞付着数は、未処理ガラス基板に対する細胞付着数と比較して３０％以下に抑制されている。

（血小板溶液の調製）
　３．８質量％クエン酸ナトリウム溶液０．５ｍＬに対して、健康なボランティアより採血した血液４．５ｍＬを混和した後、遠心分離にて［冷却遠心機５９００（（株）久保田製作所製）、１０００ｒｐｍ／１０分、室温］上層の多血小板血漿（ＰＲＰ）を回収した。引き続き、下層について遠心分離を行い（上記遠心機、３５００ｒｐｍ／１０分、室温）、上層の乏血小板血漿（ＰＰＰ）を回収した。多項目自動赤血球分析装置（ＸＴ－２０００ｉ、シスメックス（株）製）にてＰＲＰの血小板数を計測後、ＰＰＰを用いてＰＲＰの血小板濃度が３０×１０⁴ｃｅｌｌｓ／μＬになるように調製した。

（血小板付着実験）
　実施例５で調製した生体物質又は細胞の付着抑制剤（膜形成組成物）をガラス基板（ＴＥＭＰＡＸ　Ｆｌｏａｔ〔登録商標〕）にスピン塗布し、１００℃でベークして熱硬化膜を作成した。熱硬化膜が形成されたガラス基板及び未処理のガラス基板を、２４穴平底マイクロプレート（コーニング社製）に配置した。

　上記ガラス基板を配置したプレート内に、上記血小板濃度に調製したＰＲＰ溶液３００μＬを添加した。５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃で９０分間、２４時間、４８時間の各時間、ＣＯ₂インキュベーター内にて静置した。所定の静置時間が経過した後、プレート内のＰＲＰを除き、ＰＢＳ３ｍＬにて５回洗浄した。その後、２．５体積％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液２ｍＬを添加し、４℃で一昼夜静置後、グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液を除き、超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）３ｍＬで５回洗浄した。さらに、７０％エタノール水（ｖ／ｖ）１ｍＬで３回洗浄し、風乾した。

（電子顕微鏡観察）
　上記血小板付着実験を行った実施例５の膜形成組成物を用いて熱硬化膜が形成されたガラス基板及び未処理ガラス基板に、イオンスパッター（Ｅ－１０３０、（株）日立ハイテクノロジーズ製）にてＰｔ－Ｐｄを１分間蒸着した。その後、電子顕微鏡（Ｓ－４８００、（株）日立ハイテクノロジーズ製）にて血小板の付着を１，０００倍で観察した。

　電子顕微鏡にてガラス基板内５箇所の血小板付着数を計測した。各箇所の計測値を平均することで、血小板付着数とした。それぞれの静置時間毎に血小板付着数を比較することで、実施例５の膜形成組成物を用いて熱硬化膜が形成されたガラス基板及び未処理ガラス基板上の血小板の付着性を確認した。その結果を下記表４に示す。

　血小板付着実験の結果、未処理ガラス基板では静置時間の延長に伴い血小板付着数の大幅な増加が確認された。一方、実施例５の膜形成組成物を用いて熱硬化膜が形成されたガラス基板では、血小板付着数は未処理ガラス基板を用いた結果より明らかに少なく、４８時間後では２０％以下の付着量であった。

Claims

　下記式（１）：

〔式中、Ｒ₁は芳香族炭化水素又は脂環式炭化水素を１つ又は２つ含む炭素原子数４乃至２０の有機基を表し、２つのｎはそれぞれ５乃至６００の整数を表し、Ｑは下記式（２）、式（３）、式（４）又は式（５）：

（式中、Ｑ₁は炭素原子数１乃至６のアルキレン基、炭素原子数３乃至６の脂環式炭化水素基又は炭素原子数６乃至１０の芳香族炭化水素基を表し、前記芳香族炭化水素基は、炭素原子数１乃至６のアルキル基、ハロゲン原子、炭素原子数１乃至６のアルコキシ基、ニトロ基、シアノ基及び炭素原子数１乃至６のアルキルチオ基からなる群から選ばれる少なくとも一つの基で置換されていてもよく、２つのｍはそれぞれ独立に０又は１を表す。）

（式中、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄及びＲ₅はそれぞれ独立に、水素原子、炭素原子数１乃至６のアルキル基、炭素原子数３乃至６のアルケニル基、ベンジル基又はフェニル基を表し、前記フェニル基は炭素原子数１乃至６のアルキル基、ハロゲン原子、炭素原子数１乃至６のアルコキシ基、ニトロ基、シアノ基及び炭素原子数１乃至６のアルキルチオ基からなる群から選ばれる少なくとも一つの基で置換されていてもよく、Ｒ₆は炭素原子数１乃至６のアルキル基、炭素原子数３乃至６のアルケニル基、ベンジル基又はフェニル基を表し、前記フェニル基は炭素原子数１乃至６のアルキル基、ハロゲン原子、炭素原子数１乃至６のアルコキシ基、ニトロ基、シアノ基及び炭素原子数１乃至６のアルキルチオ基からなる群から選ばれる少なくとも一つの基で置換されていてもよい。）
で表される二価の有機基を表す。〕
で表される構造単位を有するポリマー及び有機溶媒を含む生体物質又は細胞の付着抑制剤。
　さらに架橋材を含む請求項１に記載の生体物質又は細胞の付着抑制剤。
　さらに架橋反応を促進させる化合物を含む請求項２に記載の生体物質又は細胞の付着抑制剤。
　請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の生体物質又は細胞の付着抑制剤を基材上に塗布しベークする工程を含む生体物質又は細胞の付着抑制剤の固定化方法。
　請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の生体物質又は細胞の付着抑制剤を用いることを特徴とするスフェアの製造方法。