WO2016056592A1 - １，４－ジオキサン分解菌の培養方法、培地、１，４－ジオキサン分解菌を利用する１，４－ジオキサン処理方法 - Google Patents

１，４－ジオキサン分解菌の培養方法、培地、１，４－ジオキサン分解菌を利用する１，４－ジオキサン処理方法 Download PDF

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degrading bacteria
medium
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山本　哲史
斎藤　祐二
道彦 池
真史 黒田
和成 清
大介 井上
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大成建設株式会社
国立大学法人大阪大学
学校法人北里研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a culture method for 1,4-dioxane degrading bacteria, a medium, and a 1,4-dioxane treatment method using 1,4-dioxane degrading bacteria.
  • 1,4-dioxane is a cyclic ether represented by the following formula (1).
  • 1,4-Dioxane is excellent in compatibility with water and organic solvents, and is mainly used as a reaction solvent for organic synthesis.
  • 1,4-dioxane The amount of 1,4-dioxane produced and imported in Japan in FY2010 was about 4500 t / year, and it is estimated that about 300 t / year was released into the environment. Since 1,4-dioxane is water-soluble, when it is released into the water environment, it diffuses over a wide area. Moreover, since all of volatile property, adsorptivity to solid, photodegradability, hydrolyzability, and biodegradability are low, removal from water is difficult. Since 1,4-dioxane has acute toxicity and chronic toxicity, and carcinogenicity has been pointed out, there is a concern that pollution of the water environment by 1,4-dioxane may adversely affect humans, animals and plants. . Therefore, in Japan, 1,4-dioxane is regulated by tap water quality standards (0.05 mg / L or less), environmental standards (0.05 mg / L or less) and wastewater standards (0.5 mg / L or less). ing.
  • Non-Patent Document 1 reports that the treatment efficiency of 1,4-dioxane by the accelerated oxidation method decreases when an organic substance other than 1,4-dioxane exists.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 propose biological treatment with 1,4-dioxane-degrading bacteria.
  • 1,4-Dioxane-degrading bacteria are produced by co-metabolism reaction in the presence of bacteria that can be decomposed and assimilated using 1,4-dioxane as a single carbon source (assimilating bacteria) and other components such as tetrahydrofuran. It is roughly divided into two types, bacteria that co-degrade 4-dioxane (co-metabolites), and assimilated bacteria are further classified into inducible and constitutive types depending on whether 1,4-dioxane degrading enzyme is induced or not.
  • Non-Patent Documents 3 and 4 report that THF monooxygenase possessed by these 1,4-dioxane degrading bacteria is involved in the degradation of 1,4-dioxane.
  • THF monooxygenase is classified as a kind of soluble iron (II) monooxygenase (SDIMO) responsible for the initial oxidation of various hydrocarbons, and SDIMO includes methane / propane monooxygenase and others.
  • Non-Patent Document 5 Non-Patent Document 6 reports that bacteria having SDIMO other than THF monooxygenase may also degrade 1,4-dioxane.
  • 1,4-dioxane-degrading bacteria grow very slowly, and when other microorganisms are mixed, other microorganisms preferentially grow. It is necessary to sterilize the culture apparatus and the culture medium in advance so that various germs are not mixed.
  • the sterilization includes methods such as steam sterilization using an autoclave, dry heat sterilization using an oven, radiation sterilization using gamma rays, and chemical sterilization using ethylene oxide gas.
  • all sterilization methods are performed on a large scale, such as sterilization facilities are too large, energy costs are too high, the amount of chemicals used is enormous, and there are problems in terms of cost and safety. It is difficult. For this reason, it is difficult to supply a large amount of 1,4-dioxane degrading bacteria necessary for actual 1,4-dioxane contamination sites.
  • K. KOSAKA, H. YAMADA, S.MATSUI, and K. SHISHIDA The effects of the co-existing compounds on the decomposition of micropollutants using the ozone / hydrogen peroxide process.
  • ZYLSTRA Biodegradation of tetrahydrofuran and 1,4-dioxane by soluble diiron monooxygenase in Pseudonocardia sp. Sol ENV478. Nol. (5), pp. 312-316, 2012.
  • ALVAREZ-COHEN Glyoxylate metabolism is a key feature of the metabolic degradation of 1,4-dioxane by 190 CB Appl. Environ. Microbiol., 78 (9), pp. 3298-3308, 2012.
  • HOLMES ESSoluble di-iron monooxygenase gene diversity in soils, sediments and ethane enrichments. Environ. Microbiol., 8 (7), pp. 1228-1239 2006.
  • S. MAHENDRA, and L. ALVAREZ-COHEN Kinetics of 1,4-dioxane biodegradation by monooxygenase-expressing bacteria. Environ. Sci. Technol., 40 (17), pp. 5435-5442, 2006.
  • a method for culturing 1,4-dioxane degrading bacteria comprising increasing 1,4-dioxane degrading bacteria using a medium containing diethylene glycol at a concentration of 1.0 wt% to 10.0 wt%.
  • the medium is a liquid medium.
  • the culture method according to 1. 3.
  • the medium contains at least one of corn steep liquor, casamino acid, yeast extract, and peptone. Or 2.
  • the 1,4-dioxane-degrading bacterium is Mycobacterium sp. Or Pseudonocardia sp. ⁇ 3.
  • the 1,4-dioxane-degrading bacteria are Mycobacterium sp. D11 (Accession number: NITE BP-01926), Pseudonocardia sp. D17 (Accession number: NITE BP-01927), 1. Pseudonocardia dioxanivorans CB1190, characterized in that it is at least one kind. ⁇ 4.
  • the culture method according to any one of the above. 6). 1. A continuous culture in which a liquid medium is supplied and a culture medium of the same amount as that of the liquid medium is taken out. ⁇ 5.
  • the culture method according to any one of the above. 7). A medium containing diethylene glycol at a concentration of 1.0 wt% to 10.0 wt%. 8). 6.
  • Diethylene glycol is injected together with the 1,4-dioxane degrading bacteria.
  • a soil treatment method comprising injecting 1,4-dioxane-degrading bacteria cultured by the culture method according to any one of the above. 13 11.
  • Diethylene glycol is injected together with the 1,4-dioxane degrading bacterium.
  • the soil treatment method as described in. 14.1. ⁇ 6.
  • 1,4-dioxane degrading bacteria cultured by the culture method according to any one of the above.
  • 16. Inject diethylene glycol into water or soil containing 1,4-dioxane, A method for treating 1,4-dioxane characterized by promoting the growth of 1,4-dioxane-degrading bacteria present in water or soil containing 1,4-dioxane.
  • the culture method of the present invention can efficiently increase 1,4-dioxane-degrading bacteria. Even if other microorganisms are present, 1,4-dioxane-degrading bacteria can be increased preferentially, and sterilization equipment is unnecessary, so it is possible to increase 1,4-dioxane-degrading bacteria in large-scale facilities. Yes, it can supply a large amount of 1,4-dioxane-degrading bacteria required for 1,4-dioxane treatment in sewage treatment plants, factory wastewater treatment facilities, contaminated sites, etc. Since 1,4-dioxane can be treated simply by injecting the cultured 1,4-dioxane-degrading bacterium into water or soil, 1,4-dioxane can be treated easily and at low cost.
  • Contaminated water treatment flow chart in the standard activated sludge method The figure which shows the growth property in the presence of diethylene glycol in 1,4-dioxane degrading bacteria. The figure which shows the time-dependent change of 1, 4- dioxane decomposing activity in 1, 4- dioxane decomposing bacteria. (Right) Photograph of a reactor in which 1,4-dioxane degrading bacteria are being cultured in a culture solution containing diethylene glycol and (left) glucose. The figure which shows the relationship between the diethylene glycol density
  • cultivation of a 1, 4- dioxane degrading bacterium The figure which shows the time-dependent change of the diethylene glycol density
  • the present invention is characterized by increasing 1,4-dioxane-degrading bacteria using a medium containing diethylene glycol.
  • degrading bacteria 1,4-dioxane degrading bacteria
  • the present invention is based on a completely novel finding that has not been known so far, in which a degrading bacterium exhibits superior growth properties compared to other microorganisms in the presence of diethylene glycol.
  • the reason why the degrading bacteria are excellent in growth in the presence of diethylene glycol is unknown, but the degrading bacteria are superior to other microorganisms in their ability to use diethylene glycol as a carbon source, so they are preferred in the presence of diethylene glycol. It is speculated that it can proliferate. Therefore, in the presence of diethylene glycol, decomposing bacteria can be increased even if other microorganisms live. That is, in the presence of diethylene glycol, decomposing bacteria can be increased without sterilizing other microorganisms.
  • Diethylene glycol is a glycol represented by the following formula (2).
  • Diethylene glycol is a compound with excellent biodegradability that is decomposed in the environment. Many microorganisms present in the environment can use diethylene glycol as a carbon source, and degrading bacteria can naturally use diethylene glycol as a carbon source. And decomposing bacteria are excellent in the ability to utilize diethylene glycol as a carbon source compared with microorganisms which do not have dioxane resolution.
  • Degrading bacteria exist in nature, and screening is performed by culturing sludge collected from water or soil contaminated with 1,4-dioxane in a medium containing only 1,4-dioxane as a carbon source. Can do.
  • the degrading bacteria used in the present invention are not particularly limited, and include Mycobacterium sp., Pseudonocardia sp, Afipia sp, Rhodococcus sp, Flavobacterium sp., Methylosinus sp., Burkholderia sp., Ralstonia sp., Cordyceps sp., Xanthobacter sp.), Acinetobacter sp., etc. can be used.
  • Degradable bacteria include bacteria that can be decomposed and assimilated using 1,4-dioxane as a single carbon source, and bacteria that decompose 1,4-dioxane by co-metabolism in the presence of other components such as tetrahydrofuran.
  • Pseudonocardia antarctica DVS 5a1 Cordyceps sinesis A
  • Rhodococcus aetherivorans JCM14343 and the like are preferable.
  • Pseudonocardia sp. D17, Mycobacterium sp. D11 and Pseudonocardia dioxanivorans CB1190 which have relatively high resolution of 1,4-dioxane, are preferable.
  • Mycobacterium sp. D11 and Pseudonocardia sp. D17 are under the accession number NITE BP-01926 and the accession number NITE BP-01927, respectively. It has been deposited internationally on August 29, 2014 in 2-5-8 (Kamajia 2-8-8).
  • Pseudonocardia dioxanivorans CB1190 (hereinafter referred to as CB1190 strain) can be purchased from the US ATCC (ATCC 55486). In addition to US ATCC, it can also be purchased at JCM (RIKEN BioResource Center, Microbial Materials Development Office) and DSM in Germany.
  • Rhodococcus aetherivorans JCM14343 can be purchased from JCM (RIKEN BioResource Center, Microbial Materials Development Office) (JCM14343). It can also be purchased at DSM in Germany, NCIMB in the UK, and CIP in France.
  • Conditions for increasing the degrading bacteria are not particularly limited as long as they are in an environment where diethylene glycol is present.
  • a liquid culture medium and a solid culture medium are mentioned. Moreover, it is not sterilized and other microorganisms may exist.
  • the medium is not particularly limited as long as it can cultivate degrading bacteria, and a medium obtained by adding diethylene glycol to a known medium such as an MGY medium or a CGY medium can be used.
  • a liquid medium While supplying the liquid medium, 1,4-dioxane is used in continuous culture in which a culture solution containing the same amount of degrading bacteria as the liquid medium is supplied. More preferably, the number of degrading bacteria is increased.
  • the concentration of diethylene glycol when increasing the number of degrading bacteria is not particularly limited, but is preferably 0.01 mg / L or more and 100 g / L or less (1.0 ⁇ 10 ⁇ 8 wt% or more and 10.0 wt% or less) in the case of a liquid medium.
  • the lower limit value of the diethylene glycol concentration in the liquid medium is more preferably 1 g / L or more (0.1 wt% or more), more preferably 5 g / L or more (0.5 wt% or more), and 10 g / L or more. (1.0 wt% or more) is most preferable.
  • the upper limit of the diethylene glycol concentration is more preferably 60 g / L or less (6.0 wt% or less), further preferably 30 g / L or less (3.0 wt% or less), and 20 g (2.0 wt% or less). / L or less is most preferable. Moreover, if it is a solid culture medium, 0.1 wt% or more and 10.0 wt% or less are preferable.
  • the lower limit of the diethylene glycol concentration of the solid medium is more preferably 1.0 wt% or more, more preferably 1.5 wt% or more, and most preferably 2.0 wt% or more.
  • the upper limit value of the diethylene glycol concentration is more preferably 9.0 wt% or less, further preferably 8.0 wt% or less, and most preferably 7.0 wt% or less.
  • inorganic substances and organic substances necessary for the activity of the degrading bacteria can be added. Since the activity amount of microorganisms is limited by the smallest factor among necessary factors such as nutrients, the growth can be promoted by adding insufficient nutrients.
  • the inorganic substance to be added is not particularly limited, and examples thereof include K 2 HPO 4 , (NH 4 ) 2 SO 4 , MgSO 4 .7H 2 O, FeCl 3 , CaCl 2 and NaCl.
  • the organic substance to be added is not particularly limited, but corn steep liquor, casamino acid, yeast extract and peptone are preferable.
  • the weight ratio of diethylene glycol to the organic substance added other than diethylene glycol is preferably 60:40 to 99: 1, more preferably 70:30 to 98: 2, and 75:25 to 95: 5. More preferably, it is most preferably 80:20 to 90:10.
  • the degrading bacteria It is preferable to culture the degrading bacteria at 15 to 45 ° C. 20 to 40 ° C is more preferable, and 25 to 35 ° C is most preferable.
  • the pH is preferably 5 to 8, more preferably 6 to 8.
  • the culture time is not particularly limited as long as a necessary amount of cells can be obtained. When increasing the number of degrading bacteria in a closed system, 3 to 30 days is preferable.
  • the culture method of the present invention can increase the number of degrading bacteria without sterilizing other microorganisms, and does not require a sterilizer. Therefore, cultivation on a large scale is easy, and a large amount of cells necessary for 1,4-dioxane treatment at a sewage treatment plant, a factory wastewater treatment facility, a contaminated soil treatment site, and the like can be supplied.
  • Dioxane-decomposing bacteria can be filtered from the culture medium, cryopreserved cells, L-dried cells, freeze-dried cells, an immobilization carrier in which dioxane-degrading bacteria are immobilized on a resin, or culture. It can be used for 1,4-dioxane treatment in any form such as a suspension containing a dioxane-degrading bacterium such as a liquid or a concentrated liquid thereof.
  • Water such as general sewage and factory effluent often contains nutrient salts such as K 2 HPO 4 , (NH 4 ) 2 SO 4 , MgSO 4 .7H 2 O, FeCl 3 , CaCl 2 , and NaCl.
  • nutrient salts such as K 2 HPO 4 , (NH 4 ) 2 SO 4 , MgSO 4 .7H 2 O, FeCl 3 , CaCl 2 , and NaCl.
  • concentration of nutrients is low, injection of necessary nutrients can promote 1,4-dioxane treatment by metabolism and utilization of degrading bacteria.
  • diethylene glycol is excellent in biodegradability and is rapidly decomposed in the environment, the environmental load by diethylene glycol is very small.
  • the diethylene glycol concentration in the contaminated water is preferably 1.0 ⁇ 10 ⁇ 8 wt% or more and 10.0 wt% or less.
  • the lower limit value of the diethylene glycol concentration is more preferably 0.1 wt% or more, more preferably 0.5 wt% or more, and most preferably 1.0 wt% or more.
  • the upper limit value of the diethylene glycol concentration is more preferably 6.0 wt% or less, further preferably 3.0 wt% or less, and most preferably 2.0 wt% or less.
  • Fig. 1 shows the contaminated water treatment flow in the standard activated sludge method using an aeration tank.
  • biological treatment with useful microorganisms is performed in an aeration tank.
  • the aeration tank is equipped with a diffuser tube, and bubbles are supplied from the diffuser tube to the water in the aeration tank.
  • Oxygen is dissolved in the water from the bubbles, and organic matter is processed by metabolism and utilization by useful microorganisms. Is done. Since the aeration tank is in an aerobic environment, 1,4-dioxane contained in the contaminated water can be treated simply by injecting decomposing bacteria into the aeration tank.
  • the culture solution taken out by continuous culture may be continuously injected.
  • the 1,4-dioxane treatment can be performed simply by injecting the cultured degrading bacteria into the aeration tank, the equipment used in the conventional standard activated sludge method can be used almost as it is. Since the culture method of the present invention does not require sterilization equipment and chemicals, both initial cost and running cost can be suppressed. Therefore, the biological treatment method using the degrading bacteria cultured by the culture method of the present invention is lower in cost than the accelerated oxidation method using a plurality of oxidizing agents. In addition, a commercially available apparatus for decomposing bacteria can be used as it is, so that the cost is low.
  • the cultured degrading bacteria can be injected into soil contaminated with 1,4-dioxane to treat 1,4-dioxane.
  • the ordinary soil treatment method requires enormous labor and cost such as construction of a plant on site, excavation of soil, detoxification, backfilling, etc.
  • 1,4-Dioxane can be biologically treated. Since nutrients are generally insufficient in soil, it is preferable to inject diethylene glycol together with decomposing bacteria.
  • inorganic substances such as K 2 HPO 4 , (NH 4 ) 2 SO 4 , MgSO 4 .7H 2 O, FeCl 3 , CaCl 2 , NaCl, organic substances such as corn steep liquor, casamino acid, yeast extract, peptone, etc. Either or both may be injected.
  • degrading bacteria exist in nature. By injecting diethylene glycol into water or soil contaminated with 1,4-dioxane, it is possible to promote the growth of degrading bacteria existing in nature and increase the number of degrading bacteria preferentially. When the amount of decomposing bacteria increases, 1,4-dioxane treatment by the degrading bacteria is promoted. Since it is only necessary to add diethylene glycol and there is no need to culture degrading bacteria, the cost is very low. Moreover, since only the existing degrading bacteria are increased and no new degrading bacteria are transferred, the influence on the ecosystem can be suppressed.
  • the diethylene glycol concentration in the contaminated water or the contaminated soil is 1.0 ⁇ 10 ⁇ 8 wt% or more and 10.0 wt% or less.
  • the lower limit value of the diethylene glycol concentration is more preferably 0.1 wt% or more, more preferably 0.5 wt% or more, and most preferably 1.0 wt% or more.
  • the upper limit value of the diethylene glycol concentration is more preferably 9.0 wt% or less, further preferably 8.0 wt% or less, and most preferably 7.0 wt% or less.
  • Example 1 CB1190 strain, D11 strain, and D17 strain were used as 1,4-dioxane degrading bacteria.
  • Each degrading bacterium was cultured for 10 days using a CGY medium (casitone: 5 g / L, glycerin: 5 g / L, yeast extract: 1 g / L) containing 1,4-dioxane at a concentration of 500 mg / L. After culturing, the cells were collected and washed with a centrifuge, and the cells were mixed with 20 mL of physiological saline as an inoculum. In addition, the inoculation liquid used what unified turbidity using a spectrophotometer (OD600: about 10).
  • Liquid medium (medium composition: K 2 HPO 4 : 1 g / L, (NH 4 ) 2 SO 4 : 1 g / L, NaCl: 50 mg / L, MgSO 4 .7H 2 O: 200 mg) / L, FeCl 3 : 10 mg / L, CaCl 2 : 50 mg / L, pH: 7.3) was added and sterilized by autoclaving. Then, after adding the diethylene glycol solution of predetermined concentration so that it might become 1 g / L, 1 mL of inoculation liquids were added, and rotation shaking culture was performed at 28 degreeC and 120 rpm for 9 days.
  • the bacterial cells in the culture solution were collected as a filtrate by suction filtration and dried overnight at 105 ° C., and then the bacterial cell weight was measured to determine the bacterial cell concentration (mg-dry cell / L).
  • the proliferation of the bacterial cells was evaluated by the ⁇ bacterial cell concentration obtained by subtracting the initial bacterial cell concentration from the bacterial cell concentration on the 9th day of culture.
  • Fig. 2 shows the growth of each degrading bacterium in the presence of diethylene glycol.
  • the cell concentration increased in all degrading bacteria, and it was confirmed that the degrading bacteria can grow using diethylene glycol as a carbon source.
  • the D17 strain showed a very high growth ability.
  • Example 2 The D17 strain was cultured for 2 weeks in MGY medium (Mal Extract: 10 g / L, glucose: 4 g / L, Yeast Extract: 4 g / L). Actual groundwater containing 1,4-dioxane (pH: 7.38, 1,4-dioxane: 0.16 mg / L, phosphate ion: 0.08 mg / L, total nitrogen: 36.5 mg / L, total organic carbon (Amount: 11 mg / L, chemical oxygen demand: 33 mg / L) After adding ammonium sulfate and dipotassium hydrogen phosphate to a concentration of 1 g / L, respectively, add diethylene glycol to 20 g / L. A culture solution was prepared.
  • a liquid medium containing 100 mg / L 1,4-dioxane (medium composition: K 2 HPO 4 : 1 g / L, (NH 4 ) 2 SO 4 : 1 g / L, NaCl: 50 mg / L, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O: 200 mg / L, FeCl 3 : 10 mg / L, CaCl 2 : 50 mg / L, pH: 7.3) 19 mL and 1 mL of the sampled culture solution are added, and 28 ° C., 120 rpm Rotating shaking culture was performed for 24 hours. In addition, a total of three Erlenmeyer flasks were prepared, and the test was carried out in the same procedure.
  • the 1,4-dioxane concentration in the solution after completion of the culture was measured with a headspace gas chromatograph mass spectrometer (Shimadzu Corporation: GC / MS-QP2010, PLUS, TURBOMATRIX HS40).
  • a blank system to which no culture solution was added was also tested in the same procedure, and the decomposition activity of 1,4-dioxane was determined by the following formula.
  • the decomposing activity represents the amount of 1,4-dioxane decomposed in 1 ml of the culture solution in 24 hours.
  • a photograph of the reactor on the third day of culture is shown in FIG.
  • the reactor on the right is Example 2 using diethylene glycol and the left is Comparative Example 1 using glucose.
  • Example 2 using diethylene glycol as a carbon source, the degradation activity, which was 0.04 immediately after the start of culture, increased with the passage of days, and increased to 1.63 on the sixth day of culture. Since no sterilization such as heating is performed, other microorganisms that lived in the actual groundwater are not sterilized, but because the degradation activity has increased, strain D17 preferentially grows in the presence of diethylene glycol. It became clear that Moreover, as shown in FIG. 4 (right), the culture solution on the third day of the culture was slightly cloudy but had transparency.
  • Example 2 The degradation activity on the 6th day of culture was 1.63 in Example 2 and 0.20 in Comparative Example 1, and Example 2 was 8 times or more superior to Comparative Example 1. This is probably because the D17 strain is superior in ability to use diethylene glycol as a carbon source compared to other microorganisms, and the amount of the D17 strain increased.
  • Example 3 In a conical flask with a 300 mL capacity baffle, a liquid medium containing 1 g / L diethylene glycol (medium composition: K 2 HPO 4 : 1 g / L, (NH 4 ) 2SO 4 : 1 g / L, NaCl: 50 mg / L, MgSO 4 Add 100 mL of 7H 2 O: 200 mg / L, FeCl 3 : 10 mg / L, CaCl 2 : 50 mg / L, pH: 7.3), and inoculate the D17 strain previously cultured in MGY medium (early bacteria) (Body concentration: 111 mg-dry cell / L) at 28 ° C. and 120 rpm for 7 days.
  • MGY medium head-bacterial
  • Example 4 The degrading bacteria were cultured in the same manner as in Example 3 except that the concentration of diethylene glycol in the liquid medium was changed to 5 g / L.
  • Example 5" The degrading bacteria were cultured in the same manner as in Example 3 except that the concentration of diethylene glycol in the liquid medium was 10 g / L.
  • Example 6 The degrading bacteria were cultured in the same manner as in Example 3 except that the concentration of diethylene glycol in the liquid medium was 20 g / L.
  • Example 7 The degrading bacteria were cultured in the same manner as in Example 3 except that the concentration of diethylene glycol in the liquid medium was changed to 30 g / L.
  • Bacteria concentration measurement After completion of the culture, the bacterial cells in the culture solution were collected as a filtrate by suction filtration, dried at 105 ° C. overnight, and the weight of the collected bacterial cells was measured. The cell concentration (mg-dry cell / L) was determined from the measured cell weight value. In each example, two similar test systems were prepared, and the average value was defined as the cell density. The proliferation of the bacterial cells was evaluated by the ⁇ bacterial cell concentration obtained by subtracting the initial bacterial cell concentration from the bacterial cell concentration on the seventh day of culture. FIG. 5 shows the ⁇ bacterial cell concentration.
  • the bacterial cell concentration increased.
  • the bacterial cell concentration was hardly changed even when the diethylene glycol concentration was increased.
  • the pH after completion of the cultivation in Examples 5 to 7 was measured, it showed a pH of 3.42 to 3.91, and it was estimated that the bacterial cell concentration was comparable because the growth was inhibited by the decrease in pH.
  • Example 8 Ammonium sulfate and dipotassium hydrogen phosphate were added to the actual groundwater containing 1,4-dioxane used in Example 2 so as to have a concentration of 1 g / L, respectively, and then diethylene glycol having a predetermined concentration of 10 g / L. The solution was added to prepare a culture solution. 8 L of this culture solution was added to a 10 L reactor, strain D17 was added (initial cell concentration: 43.2 mg-dry cell / L), and cultured for 9 days at 28 ° C. while aeration at 4 L / min. did. On the fourth day of culture, corn steep liquor was added only once so that the concentration was 5 g / L. During the culture period, the pH was controlled to 7.0 ⁇ 0.2.
  • the degradation activity immediately after the culture was as small as 0.02, but the degradation activity on the first day of culture rose to 0.38 and increased to 0.93 on the fourth day of culture.
  • the degradation activity on the fifth day of culture 24 hours after the addition of corn steep liquor increased significantly to 1.61, and the degradation activity on the seventh and ninth days was 1.73.
  • the degradation activity after the 7th day actually increased further, but since the 1,4-dioxane concentration decreased below the limit of quantification, it could not be calculated as an accurate activity value. From this, it was confirmed that the decomposition activity of 1,4-dioxane was increased by adding corn steep liquor. In this test method, the charged concentration of 1,4-dioxane is 100 mg / L, and the upper limit of the decomposition activity value considering reduction in the blank system is about 1.73.
  • Example 9 The growth of SDIMO-carrying bacteria by culturing in a medium supplemented with diethylene glycol was investigated in seven types of soil collected from different sites of 1,4-dioxane-contaminated sites. The growth of SDIMO-carrying bacteria was evaluated by an increase in the PCR amplification product of about 420 bp derived from the gene encoding SDIMO (SDIMO gene).
  • Soil DNA extraction kit product name: ISOIL for Beads Beating
  • DNA fragment purification kit product name: MagExtractor-PCR & Gel Clean, manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • the detection of the SDIMO gene was performed by PCR using the primer set [NVC57, NVC66] described in Non-Patent Document 5 above.
  • PCR using this primer set a PCR amplification product of about 420 bp is specifically amplified when the SDIMO gene is present in the sample.
  • the PCR reaction system was 50 ⁇ l (Sapphire Amp Fast PCR Master Mix (manufactured by Takara Bio Inc.) 25 ⁇ l, each primer 0.5 ⁇ M, DNA 1 ⁇ l, up to 50 ⁇ l with sterile ultrapure water), and PCR amplification was performed at 94 ° C., 5 After heat denaturation for 30 minutes, heat denaturation at 94 ° C.
  • FIG. 8 shows the results of PCR amplification of the SDIMO gene before and after culturing soil samples 1 to 7 in a liquid medium supplemented with diethylene glycol (after 0 and 6 days).
  • the lane indicated by M is a DNA ladder marker (trade name: 100 bp DNA ladder, manufactured by Takara Bio Inc.), and the lane indicated by P is Pseudonocardia sp., which is a 1,4-dioxane-assimilating bacterium.
  • the lane indicated by D17 DNA, N is a negative control without DNA.

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Abstract

　１，４－ジオキサン分解菌の効率的な培養方法の提供を課題とする。解決手段としてはジエチレングリコールを含有する培地を用いて１，４－ジオキサン分解菌を増やすことを特徴とする１，４－ジオキサン分解菌の培養方法の提供することである。

Description

１，４－ジオキサン分解菌の培養方法、培地、１，４－ジオキサン分解菌を利用する１，４－ジオキサン処理方法
　本発明は、１，４－ジオキサン分解菌の培養方法、培地、１，４－ジオキサン分解菌を利用する１，４－ジオキサン処理方法に関する。
　１，４－ジオキサンは、下記式（１）で表される環状エーテルである。１，４－ジオキサンは、水や有機溶媒との相溶性に優れており、主に有機合成の反応溶剤として使用されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　２０１０年度の日本国における１，４－ジオキサンの製造・輸入量は、約４５００ｔ／年であり、約３００ｔ／年が環境中へ放出されたと推測される。１，４－ジオキサンは、水溶性であるため、水環境中へ放出されると広域に拡散してしまう。また、揮発性、固体への吸着性、光分解性、加水分解性、生分解性がいずれも低いため、水中からの除去が困難である。１，４－ジオキサンは急性毒性及び慢性毒性を有する上、発がん性も指摘されていることから、１，４－ジオキサンによる水環境の汚染は、人や動植物に悪影響を及ぼすことが懸念されている。そのため、日本国では、水道水質基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）、環境基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）及び排水基準（０．５ｍｇ／Ｌ以下）により、１，４－ジオキサンの規制がなされている。
　従来の活性汚泥法や活性炭吸着法等の処理方法では、水中から１，４－ジオキサンを十分に除去することができない。過酸化水素を添加してのオゾン処理（Ｏ3／Ｈ2Ｏ2）、紫外線照射下でのオゾン処理（Ｏ3／ＵＶ）、放射線や超音波照射下でのオゾン処理等、複数の物理化学的な酸化方法を併用する促進酸化法においてのみ、１，４－ジオキサン処理の有効性が確認されている。しかし、促進酸化法はイニシャルコストおよびランニングコストが高いことから普及に至っていない。また、非特許文献１では、１，４－ジオキサン以外の有機物が存在すると、促進酸化法による１，４－ジオキサンの処理効率が低下すると報告されている。
　低コストかつ安定的に１，４－ジオキサンを含む水を処理する方法が求められており、特許文献１、非特許文献２では、１，４－ジオキサン分解菌による生物処理が提案されている。
　１，４－ジオキサン分解菌は、１，４－ジオキサンを単一炭素源として分解及び資化可能な菌（資化菌）と、テトラヒドロフランなどの他の成分の存在下で共代謝反応によって１，４－ジオキサンの分解を行う菌（共代謝菌）との２種に大別され、資化菌はさらに１，４－ジオキサン分解酵素の誘導の有無によって、誘導型と構成型に分けられる。非特許文献３、４では、これらの１，４－ジオキサン分解菌が有するＴＨＦモノオキシゲナーゼが１，４－ジオキサンの分解に関与していることが報告されている。ＴＨＦモノオキシゲナーゼは、多様な炭化水素類の初発酸化を担っている可溶性鉄（II）モノオキシゲナーゼ（ＳＤＩＭＯ）の一種に分類されており、ＳＤＩＭＯには他にメタン／プロパンモノオキシゲナーゼ等が含まれている（非特許文献５）。また、非特許文献６では、ＴＨＦモノオキシゲナーゼ以外のＳＤＩＭＯを有する菌も１，４－ジオキサンを分解する可能性のあることが報告されている。
　１，４－ジオキサン分解菌は増殖が極めて遅く、他の微生物が混入していると他の微生物が優先的に増殖してしまうため、１，４－ジオキサン分解菌を培養するには、他の雑菌が混入しないように、事前に培養装置や培地を十分に滅菌する必要がある。滅菌処理には、オートクレーブを用いる蒸気滅菌、オーブン等で加熱する乾熱滅菌、ガンマ線を用いる放射線滅菌、エチレンオキサイドガスを用いる化学滅菌等の方法がある。しかし、滅菌のための設備が大規模になりすぎる、エネルギーコストがかかりすぎる、使用する薬品量が膨大となりコスト・安全性の点で問題がある等、いずれの滅菌方法も、大規模スケールで行うことは困難である。そのため、実際の１，４－ジオキサン汚染現場で必要とされるだけの大量の１，４－ジオキサン分解菌を供給するのは困難である。
特開２００８－３０６９３９号公報
K. KOSAKA, H. YAMADA, S.MATSUI, and K. SHISHIDA: The effects of the co-existing compounds on the decomposition of micropollutants using the ozone/hydrogen peroxide process. Water Sci. Technol., 42, pp.353-361, 2000. 清和成、池道彦：１，４－ジオキサン分解菌を用いた汚染地下水の生物処理・浄化技術の可能性，用水と廃水，Vol.53, No.7, 2011. H. MASUDA, K. McCLAY, R. J. STEFFAN, and G. J. ZYLSTRA: Biodegradation of tetrahydrofuran and 1,4-dioxane by soluble diiron monooxygenase in Pseudonocardia sp. strain ENV478. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 22(5), pp. 312-316, 2012. A. GROSTERN, C. M. SALES, W.-Q. ZHUANG, O. ERBILGIN, and L. ALVAREZ-COHEN: Glyoxylate metabolism is a key feature of the metabolic degradation of 1,4-dioxane by Pseudonocardia dioxanivorans strain CB1190. Appl. Environ. Microbiol., 78(9), pp. 3298-3308, 2012. N. V. COLEMAN, N. B. BUI, and A. J. HOLMES:  Soluble di-iron monooxygenase gene diversity in soils, sediments and ethane enrichments. Environ. Microbiol., 8(7), pp. 1228-1239, 2006. S. MAHENDRA, and L. ALVAREZ-COHEN: Kinetics of 1,4-dioxane biodegradation by monooxygenase-expressing bacteria. Environ. Sci. Technol., 40(17), pp. 5435-5442, 2006.
　１，４－ジオキサン分解菌の効率的な培養方法を提供する。
１．ジエチレングリコールを１．０ｗｔ％以上１０．０ｗｔ％以下の濃度で含有する培地を用いて１，４－ジオキサン分解菌を増やすことを特徴とする１，４－ジオキサン分解菌の培養方法。
２．前記培地が液体培地であることを特徴とする１．に記載の培養方法。
３．前記培地が、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンの少なくとも１種を含有することを特徴とする１．または２．に記載の培養方法。
４．前記１，４－ジオキサン分解菌が、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）、またはシュードノカルディア属（Pseudonocardia sp.）であることを特徴とする１．～３．のいずれかに記載の培養方法。
５．前記１，４－ジオキサン分解菌が、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.） D11（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９２６）、シュードノカルディア属（Pseudonocardia sp.） D17（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９２７）、シュードノカルディア　ジオキサニヴォランズ（Pseudonocardia dioxanivorans） CB1190、の少なくとも１種であることを特徴とする１．～４．のいずれかに記載の培養方法。
６．液体培地を供給しながら、該液体培地の供給量と同量の培養液を取り出す連続培養であることを特徴とする２．～５．のいずれかに記載の培養方法。
７．ジエチレングリコールを１．０ｗｔ％以上１０．０ｗｔ％以下の濃度で含有することを特徴とする培地。
８．液体培地であることを特徴とする７．に記載の培地。
９．コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンの少なくとも１種を含有することを特徴とする７．または８．に記載の培地。
１０．１，４－ジオキサンを含む水に、１．～６．のいずれかに記載の培養方法で培養した１，４－ジオキサン分解菌を注入することを特徴とする水処理方法。
１１．前記１，４－ジオキサン分解菌とともに、ジエチレングリコールを注入することを特徴とする１０．に記載の水処理方法。
１２．１，４－ジオキサンを含む土壌に、１．～６．のいずれかに記載の培養方法で培養した１，４－ジオキサン分解菌を注入することを特徴とする土壌処理方法。
１３．前記１，４－ジオキサン分解菌とともに、ジエチレングリコールを注入することを特徴とする１２．に記載の土壌処理方法。
１４．１．～６．のいずれかに記載の培養方法により培養した１，４－ジオキサン分解菌。
１５．１４に記載の１，４－ジオキサン分解菌を固定化した固定化担体。
１６．１，４－ジオキサンを含む水、または土壌に、ジエチレングリコールを注入し、
前記１，４－ジオキサンを含む水、または土壌に存在する１，４－ジオキサン分解菌の増殖を促進することを特徴とする１，４－ジオキサン処理方法。
　本発明の培養方法により、１，４－ジオキサン分解菌を効率よく増やすことができる。他の微生物が存在しても、１，４－ジオキサン分解菌を優先的に増やすことができ、滅菌設備が不要なため、大規模設備にて１，４－ジオキサン分解菌を増やすことが可能であり、下水処理場、工場排水処理施設、汚染現場等における１，４－ジオキサン処理に必要とされる大量の１，４－ジオキサン分解菌を供給することができる。培養した１，４－ジオキサン分解菌を水、または土壌に注入するだけで１，４－ジオキサンを処理することができるため、簡便で低コストに１，４－ジオキサンを処理することができる。
　１，４－ジオキサンで汚染された水、または土壌に、ジエチレングリコールを注入することで、汚染環境下に従来存在している分解菌の増殖を促進し、分解菌を優先的に増やすことができる。そして、分解菌の菌体量が増えることにより、分解菌による１，４－ジオキサン処理を促進することができる。ジエチレングリコールを加えるだけでよいため、非常に低コストである。また、従来存在している分解菌を増やすだけであるため、生態系への影響を抑えることができる。
標準活性汚泥法における汚染水処理フロー図。 １，４－ジオキサン分解菌におけるジエチレングリコール存在下での増殖性を示す図。 １，４－ジオキサン分解菌における１，４－ジオキサン分解活性の経時変化を示す図。 （右）ジエチレングリコール、（左）グルコースを含有する培養液中で１，４－ジオキサン分解菌を培養中のリアクターの写真。 培養液中のジエチレングリコール濃度と１，４－ジオキサン分解菌のΔ菌体濃度の関係を示す図。 １，４－ジオキサン分解菌の培養中に、コーンスティープリカーを添加した時の１，４－ジオキサン分解活性の経時変化を示す図。 １，４－ジオキサン分解菌の培養中に、コーンスティープリカーを添加した時のジエチレングリコール濃度と菌体濃度の経時変化を示す図。 ジエチレングリコールを添加した液体培地中における土壌試料１～７の培養前後（０日、６日後）におけるＳＤＩＭＯ遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動の結果を示す図。
　以下に、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、ジエチレングリコールを含有する培地を用いて１，４－ジオキサン分解菌を増やすことを特徴とする。
　従来、１，４－ジオキサン分解菌（以下、分解菌という。）を増やすには、他の微生物が混入しないように、事前に十分に滅菌する必要があった。
　本発明は、分解菌が、ジエチレングリコール存在下で他の微生物よりも優れた増殖性を示すという、これまでに知られていない全く新規な知見に基づくものである。分解菌が、ジエチレングリコール存在下で増殖性に優れている理由は不明であるが、分解菌は、他の微生物よりもジエチレングリコールを炭素源として利用する能力に優れているため、ジエチレングリコール存在下で優先的に増殖することができると推測される。そのため、ジエチレングリコール存在下では、他の微生物が生息していても分解菌を増やすことができる。すなわち、ジエチレングリコール存在下では、他の微生物を滅菌することなく、分解菌を増やすことができる。
　ジエチレングリコールは、下記式（２）で表されるグリコールである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　ジエチレングリコールは、環境中で分解される生分解性に優れた化合物である。環境中に存在する多くの微生物は、ジエチレングリコールを炭素源として利用することができ、分解菌も、当然にジエチレングリコールを炭素源として利用することができる。そして、分解菌は、ジオキサン分解能を有さない微生物と比較して、ジエチレングリコールを炭素源として利用する能力に優れている。
　分解菌は自然界に存在しており、１，４－ジオキサンで汚染された水中や土壌中から採取した汚泥等を、炭素源として１，４－ジオキサンのみを含む培地で培養することでスクリーニングすることができる。本発明で使用する分解菌としては特に制限されず、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）、シュードノカルディア属（Pseudonocardia sp.）、アフピア属（Afipia sp.）、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）、フラボバクテリュウム属（Flavobacterium sp.）、メチロサイナス属（Methylosinus sp.）、バークホルデリア属（Burkholderia sp.）、ラルストニア属（Ralstonia sp.）、コルディセプス属（Cordyceps sp.）、キサントバクター属（Xanthobacter sp.）、アシネトバクター属（Acinetobacter sp.）、等に属するものを用いることができる。
　分解菌には、１，４－ジオキサンを単一炭素源として分解及び資化可能な菌と、テトラヒドロフランなどの他の成分の存在下で共代謝反応によって１，４－ジオキサンの分解を行う菌との２種に大別される。本発明で使用する分解菌としては特に制限されないが、Mycobacterium sp. D11、Pseudonocardia sp. D17、Mycobacterium sp. D6、Pseudonocardia dioxanivorans CB1190、Afipia sp. D1、Mycobacterium sp. PH-06、Pseudonocardia benzenivorans B5、Flavobacterium sp.、Pseudonocardia sp. ENV478、Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans K1、Rhodococcus ruber T1、Rhodococcus ruber T5、Methylosinus trichosporium OB3b、Mycobacterium vaccae JOB5、Burkholderia cepacia G4、Pseudomonas mendocina KR1、Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans K1、Ralstonia pickettii PKO1、Rhodococcus sp. RR1、Acinetobacter Baumannii DD1、Rhodococcus sp. 219、Pseudonocardia antarctica DVS 5a1、Cordyceps sinesis A、Rhodococcus aetherivorans JCM14343などが好ましい。これらの中で、１，４－ジオキサンの分解能が比較的高いPseudonocardia sp. D17、Mycobacterium sp. D11及びPseudonocardia dioxanivorans CB1190が好ましい。
　Mycobacterium sp. D11、Pseudonocardia sp. D17は、それぞれ受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９２６、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９２７として、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８））に、２０１４年８月２９日付で国際寄託されている。
　Pseudonocardia dioxanivorans CB1190（以下、ＣＢ１１９０株という。）は、米国ＡＴＣＣから購入することができる（ＡＴＣＣ　５５４８６）。また、米国ＡＴＣＣの他に、ＪＣＭ（独立行政法人　理化学研究所　バイオリソースセンター　微生物材料開発室）やドイツのＤＳＭにおいても購入可能である。
　Rhodococcus aetherivorans JCM14343は、ＪＣＭ（独立行政法人　理化学研究所　バイオリソースセンター　微生物材料開発室）から購入することができる（ＪＣＭ　１４３４３）。また、ドイツのＤＳＭ、英国のＮＣＩＭＢ、フランスのＣＩＰにおいても購入可能である。
　分解菌を増やす条件は、ジエチレングリコールが存在する環境下であれば特に制限されない。例えば、液体培地、固体培地が挙げられる。また、滅菌処理されておらず、他の微生物が存在していてもよい。培地としては、分解菌を培養できるものであれば特に限定されず、ＭＧＹ培地やＣＧＹ培地等の公知の培地に、ジエチレングリコールを添加したものを使用することができる。
　分解菌を大量に増やすためには液体培地を使用することが好ましく、液体培地を供給しながら、液体培地の供給量と同量の分解菌を含む培養液を取り出す連続培養で１，４－ジオキサン分解菌を増やすことがさらに好ましい。
　分解菌を増やす際のジエチレングリコール濃度は特に限定されないが、液体培地であれば０．０１ｍｇ／Ｌ以上１００ｇ／Ｌ以下（１．０×１０-8ｗｔ％以上１０．０ｗｔ％以下）が好ましい。液体培地のジエチレングリコール濃度の下限値は、１ｇ／Ｌ以上（０．１ｗｔ％以上）であることがより好ましく、５ｇ／Ｌ以上（０．５ｗｔ％以上）であることがより好ましく、１０ｇ／Ｌ以上（１．０ｗｔ％以上）であることが最も好ましい。ジエチレングリコール濃度の上限値は６０ｇ／Ｌ以下（６．０ｗｔ％以下）であることがより好ましく、３０ｇ／Ｌ以下（３．０ｗｔ％以下）であることがさらに好ましく、２０ｇ（２．０ｗｔ％以下）／Ｌ以下であることが最も好ましい。また、固体培地であれば０．１ｗｔ％以上１０．０ｗｔ％以下が好ましい。固体培地のジエチレングリコール濃度の下限値は、１．０ｗｔ％以上であることがより好ましく、１．５ｗｔ％以上であることがより好ましく、２．０ｗｔ％以上であることが最も好ましい。ジエチレングリコール濃度の上限値は９．０ｗｔ％以下であることがより好ましく、８．０ｗｔ％以下であることがさらに好ましく、７．０ｗｔ％以下であることが最も好ましい。
　分解菌を増やす際には、分解菌の活動に必要な無機物質や有機物質を添加することができる。微生物の活動量は、必要な栄養素等の因子のうち、最も少ない因子によって制限されるので、不足する栄養素を添加することで、増殖を促進することができる。添加する無機物質としては特に制限されず、Ｋ2ＨＰＯ4、（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＦｅＣｌ3、ＣａＣｌ2、ＮａＣｌなどが挙げられる。
　添加する有機物質としては、特に制限されないが、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンが好ましい。ジエチレングリコール以外の有機物質を添加することで分解菌の増殖速度を早くすることができる。ジエチレングリコールと、ジエチレングリコール以外の添加する有機物質との重量比は、６０：４０～９９：１であることが好ましく、７０：３０～９８：２であることがより好ましく、７５：２５～９５：５であることがさらに好ましく、８０：２０～９０：１０であることが最も好ましい。
　分解菌の培養は１５～４５℃で行うことが好ましい。２０～４０℃がより好ましく、２５～３５℃が最も好ましい。また、ｐＨは５～８が好ましく、６～８がより好ましい。培養時間は、必要な菌体量が得られるならば、特に制限されない。閉鎖系で分解菌を増やす場合、３～３０日間が好ましい。
　本発明の培養方法は、他の微生物を滅菌することなく分解菌を増やすことができ、滅菌装置が不要である。そのため、大規模スケールでの培養が容易であり、下水処理場や工場排水処理施設、汚染土壌の処理現場等での１，４－ジオキサン処理に必要な大量の菌体を供給することができる。
　ジオキサン分解菌は、培養液からろ別した菌体、凍結保存した菌体、Ｌ－乾燥保存した菌体、凍結乾燥した菌体、ジオキサン分解菌を樹脂等に固定化した固定化担体、あるいは培養液やその濃縮液等のジオキサン分解菌を含む懸濁液等の任意の形態で、１，４－ジオキサン処理に用いることができる。
　培養した分解菌を、１，４－ジオキサンで汚染された水に注入し、好気的環境下とすることで、分解菌による１，４－ジオキサンの生物処理を行うことができる。一般的な下水や工場排水等の水は、Ｋ2ＨＰＯ4、（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＦｅＣｌ3、ＣａＣｌ2、ＮａＣｌ等の栄養塩類を含んでいることが多いが、栄養塩類の濃度が低ければ必要な栄養塩類を注入することで、分解菌の代謝・資化による１，４－ジオキサン処理を促進することができる。また、分解菌とともにジエチレングリコールを注入することで、他の微生物も存在する水中においても分解菌の１，４－ジオキサン分解活性を維持することができる。なお、ジエチレングリコールは、生分解性に優れており環境中で素早く分解されるため、ジエチレングリコールによる環境への負荷は非常に小さい。
　汚染水中におけるジエチレングリコール濃度は、１．０×１０-8ｗｔ％以上１０．０ｗｔ％以下であることが好ましい。ジエチレングリコール濃度の下限値は、０．１ｗｔ％以上であることがより好ましく、０．５ｗｔ％以上であることがより好ましく、１．０ｗｔ％以上であることが最も好ましい。ジエチレングリコール濃度の上限値は６．０ｗｔ％以下であることがより好ましく、３．０ｗｔ％以下であることがさらに好ましく、２．０ｗｔ％以下であることが最も好ましい。
　図１に、曝気槽を用いる標準活性汚泥法における汚染水処理フローを示す。標準活性汚泥法では、曝気槽において有用微生物による生物処理を行っている。曝気槽には、散気管が配設されており、散気管から気泡が曝気槽内の水に供給され、この気泡から水中に酸素が溶解し、有用微生物による代謝・資化により、有機物が処理される。曝気槽は好気的環境下であるため、曝気槽に分解菌を注入するだけで、汚染水中に含まれる１，４－ジオキサンを処理することができる。図１には、分解菌を含む培養液を注入するフローを示したが、連続培養により取り出した培養液を連続的に注入してもよい。また、培養液ではなく、培養液からろ別等した分解菌をそのまま、凍結保存した菌体、Ｌ－乾燥保存した菌体、凍結乾燥した菌体、分解菌を樹脂等に固定化した固定化担体、または、培養液を濃縮した懸濁液等として注入してもよい。
　培養した分解菌を曝気槽に注入するだけで、１，４－ジオキサン処理を行うことができるため、従来の標準活性汚泥法で用いられる設備をほとんどそのまま活用することができる。本発明の培養方法は、滅菌処理のための設備や薬品が不要なため、イニシャルコスト、ランニングコストともに抑えることができる。そのため、本発明の培養方法で培養した分解菌による生物処理法は、複数の酸化剤を用いる促進酸化法と比較して低コストである。また、分解菌の培養装置も市販のものをそのまま利用することができるため、低コストである。
　培養した分解菌を、１，４－ジオキサンで汚染された土壌中に注入して１，４－ジオキサンを処理することができる。通常の土壌処理方法は、現場プラントの建設、土壌の掘削、無害化、埋め戻し等、膨大な手間とコストが必要であるが、本発明の方法では、土壌中に分解菌を注入するだけで１，４－ジオキサンを生物処理することができる。一般に土壌中には栄養素が不足しているため、分解菌とともにジエチレングリコールを注入することが好ましい。また、Ｋ2ＨＰＯ4、（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＦｅＣｌ3、ＣａＣｌ2、ＮａＣｌ等の無機物質、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトン等の有機物質等のいずれか、または両方を注入してもよい。
　汚染土壌中におけるジエチレングリコール濃度は、０．１ｗｔ％以上１０ｗｔ％以下となるように加えることが好ましい。ジエチレングリコール濃度の下限値は、１．０ｗｔ％以上であることがより好ましく、１．５ｗｔ％以上であることがより好ましく、２ｗｔ％以上であることが最も好ましい。ジエチレングリコール濃度の上限値は９．０ｗｔ％以下であることがより好ましく、８．０ｗｔ％以下であることがさらに好ましく、７．０ｗｔ％以下であることが最も好ましい。
　上記したように、分解菌は自然界に存在している。１，４－ジオキサンで汚染された水、または土壌にジエチレングリコールを注入することにより、自然界に存在する分解菌の増殖を促進し、分解菌を優先的に増やすことができる。分解菌の菌体量が増えると、分解菌による１，４－ジオキサン処理が促進される。ジエチレングリコールを加えるだけでよく、分解菌を培養する必要がないため、非常に低コストである。また、従来存在している分解菌を増やすだけであり、新たな分解菌を移入することがないため、生態系への影響を抑えることができる。
　この際、汚染水、または汚染土壌中におけるジエチレングリコール濃度が１．０×１０-8ｗｔ％以上１０．０ｗｔ％以下となるように注入することが好ましい。ジエチレングリコール濃度の下限値は、０．１ｗｔ％以上であることがより好ましく、０．５ｗｔ％以上であることがより好ましく、１．０ｗｔ％以上であることが最も好ましい。ジエチレングリコール濃度の上限値は９．０ｗｔ％以下であることがより好ましく、８．０ｗｔ％以下であることがさらに好ましく、７．０ｗｔ％以下であることが最も好ましい。
　なお、汚染環境中に生息している分解菌や、他の分解菌を培養して、ジエチレングリコールとともに注入してもよい。
　次に、本発明を実施例に基づいて、さらに具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
「実施例１」
　ＣＢ１１９０株、Ｄ１１株、Ｄ１７株を１，４－ジオキサン分解菌として使用した。１，４－ジオキサンを５００ｍｇ／Ｌの濃度で含むＣＧＹ培地（カシトン：５ｇ／Ｌ、グリセリン：５ｇ／Ｌ、酵母エキス：１ｇ／Ｌ）を用いて各分解菌を１０日間培養した。培養後、遠心分離機にて集菌・洗浄し、菌体を２０ｍＬの生理食塩水と混合したものを植菌液とした。なお、植菌液は、分光光度計を用いて濁度を統一したもの（ＯＤ６００：およそ１０）を用いた。
　３００ｍＬ容量のバッフル付の三角フラスコに液体培地（培地組成：Ｋ2ＨＰＯ4：１ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２００ｍｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ3：１０ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ2：５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ：７．３）を１００ｍＬ加え、オートクレーブで滅菌した。その後、１ｇ／Ｌになるように所定濃度のジエチレングリコール溶液を添加した後、植菌液を１ｍＬ加えて２８℃、１２０ｒｐｍにて回転振盪培養を９日間行った。
　培養終了後に吸引濾過にて培養液中の菌体をろ物として回収し、１０５℃で一晩乾燥した後、菌体重量を測定し菌体濃度（ｍｇ-ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／Ｌ）を求めた。培養９日目の菌体濃度から初期菌体濃度を差し引いたΔ菌体濃度により、菌体の増殖性を評価した。
　図２に各分解菌のジエチレングリコール存在下での増殖性を示す。すべての分解菌において菌体濃度が増加しており、分解菌がジエチレングリコールを炭素源として利用し、増殖できることを確認できた。特に、Ｄ１７株は非常に高い増殖性を示した。
「実施例２」
　Ｄ１７株を、ＭＧＹ培地（Ｍａｌｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ：１０ｇ／Ｌ、グルコース：４ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ：４ｇ／Ｌ）で２週間培養した。
　１，４－ジオキサンを含む実地下水（ｐＨ：７．３８、１，４－ジオキサン：０．１６ｍｇ／Ｌ、リン酸イオン：０．０８ｍｇ／Ｌ、全窒素：３６．５ｍｇ／Ｌ、全有機炭素量：１１ｍｇ／Ｌ、化学的酸素要求量：３３ｍｇ／Ｌ）に、硫酸アンモニウムおよびリン酸水素二カリウムをそれぞれ１ｇ／Ｌの濃度になるように添加した後、ジエチレングリコールを２０ｇ／Ｌになるように加えて培養液を作成した。
　この培養液６５０ｍＬを１Ｌ容量のリアクターに加え、Ｄ１７株を添加して（菌体濃度：１５７ｍｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／Ｌ）、６日間培養を行った。培養中は、２８℃、ｐＨ７．０に制御し、０．６５Ｌ／ｍｉｎのエアレーションを行った。
「比較例１」
　ジエチレングリコールをグルコースとした以外は実施例２と同様にして、分解菌を培養した。
「１，４－ジオキサン分解活性の測定１」
　実施例２、比較例１の培養液から、それぞれ１ｍＬサンプリングし、１，４－ジオキサン分解活性を測定した。サンプリングは培養開始直後と、培養開始してから１～６日目に行った。分解活性の測定方法は以下のとおりである。
　１００ｍＬ容量のバッフル付の三角フラスコに、１００ｍｇ／Ｌの１，４－ジオキサンを含む液体培地（培地組成：Ｋ2ＨＰＯ4：１ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２００ｍｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ3：１０ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ2：５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ：７．３）１９ｍＬと、サンプリングした培養液１ｍＬを加え、２８℃、１２０ｒｐｍにて２４時間、回転振盪培養を行った。なお、三角フラスコは全部で３本用意し、同様の手順で試験を実施した。
　培養終了後の溶液中の１，４－ジオキサン濃度をヘッドスペースガスクロマトグラフ質量分析計（島津製作所：ＧＣ／ＭＳ－ＱＰ２０１０　ＰＬＵＳ、ＴＵＲＢＯＭＡＴＲＩＸ　ＨＳ４０）にて測定した。また、培養液を添加しないブランク系も同様の手順にて試験を実施し、下記の式にて、１，４－ジオキサンの分解活性を求めた。本測定方法において、分解活性は、１ｍｌの培養液が２４時間で分解した１，４－ジオキサンの量を表す。測定結果の相加平均値（ｎ＝３）を図３に示す。また、培養３日目のリアクターの写真を図４に示す。図４において、右がジエチレングリコールを用いた実施例２、左がグルコースを用いた比較例１のリアクターである。
　１，４－ジオキサン分解活性（ｍｇ－１，４－Ｄｉｏｘａｎｅ／ｍＬ－培養液）
＝（Ｃ０－Ｃ２４）×２０ｍＬ／１０００ｍＬ
Ｃ０（ｍｇ／Ｌ）：培養液を添加していないブランク系を、２４時間回転振盪培養した後の１，４－ジオキサン濃度。
Ｃ２４（ｍｇ／Ｌ）：培養液を添加した系を、２４時間回転振盪培養した後の１，４－ジオキサン濃度。
　ジエチレングリコールを炭素源とする実施例２は、培養開始直後０．０４であった分解活性が日数の経過とともに上昇し、培養６日目には１．６３まで上昇した。加熱等の滅菌処理を行っていないため、実地下水中に生息していた他の微生物は滅菌されていないが、分解活性が上昇していることから、ジエチレングリコール存在下でＤ１７株が優先的に増殖していることが明らかとなった。また、図４（右）に示すように、培養３日目の培養液は若干白濁していたが、透明性を有していた。
　グルコースを炭素源とする比較例１は、培養期間中の分解活性は０．１５～０．２９の範囲で変動したものの、分解活性の上昇は認められなかった。これは、Ｄ１７株が実地下水中に存在している他の微生物よりもグルコースを利用する能力に劣るため、Ｄ１７株が増殖できなかったためである。また、培養液は徐々に濁り始め、３日目の培養液は、図４（左）に示すように著しく白濁した。これは、その他の微生物が優先的に増殖したためである。
　培養６日目の分解活性は、実施例２が１．６３、比較例１が０．２０と、実施例２は比較例１に比べて８倍以上優れていた。これは、Ｄ１７株が他の微生物と比べて、ジエチレングリコールを炭素源として利用する能力に優れており、Ｄ１７株の菌体量が増加したためであると考えられる。
「実施例３」
　３００ｍＬ容量のバッフル付の三角フラスコに、１ｇ／Ｌジエチレングリコールを含む液体培地（培地組成：Ｋ2ＨＰＯ4：１ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）２ＳＯ4：１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２００ｍｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ3：１０ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ2：５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ：７．３）を１００ｍＬ加え、事前にＭＧＹ培地で培養したＤ１７株を植菌して（初期菌体濃度：１１１ｍｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／Ｌ）、２８℃、１２０ｒｐｍにて７日間、回転振盪培養を行った。
「実施例４」
　液体培地中のジエチレングリコールの濃度を５ｇ／Ｌとした以外は実施例３と同様にして、分解菌を培養した。
「実施例５」
　液体培地中のジエチレングリコールの濃度を１０ｇ／Ｌとした以外は実施例３と同様にして、分解菌を培養した。
「実施例６」
　液体培地中のジエチレングリコールの濃度を２０ｇ／Ｌとした以外は実施例３と同様にして、分解菌を培養した。
「実施例７」
　液体培地中のジエチレングリコールの濃度を３０ｇ／Ｌとした以外は実施例３と同様にして、分解菌を培養した。
「菌体濃度測定」
　培養終了後、吸引濾過にて培養液中の菌体をろ物として回収し、１０５℃で一晩乾燥した後、回収した菌体重量を測定した。測定した菌体重量値から、菌体濃度（ｍｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／Ｌ）を求めた。なお、各実施例では、同様の試験系を２本準備し、その平均値を菌体密度とした。培養７日目の菌体濃度から初期菌体濃度を差し引いたΔ菌体濃度により、菌体の増殖性を評価した。図５にΔ菌体濃度を示す。
　ジエチレングルコール濃度が１ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌと濃くなるにつれて、菌体濃度が上昇した。ジエチレングリコール濃度が１０ｇ／Ｌ～３０ｇ／Ｌである実施例５～７では、ジエチレングリコール濃度が大きくなっても菌体濃度がほとんど変わらなかった。実施例５～７の培養終了後のｐＨを測定したところ、ｐＨが３．４２～３．９１を示しており、ｐＨ低下によって増殖が阻害されたため、菌体濃度が同程度となったと推測される。
「実施例８」
　実施例２で用いた１，４－ジオキサンを含む実地下水に、硫酸アンモニウムおよびリン酸水素二カリウムをそれぞれ１ｇ／Ｌの濃度になるように添加した後、１０ｇ／Ｌになるように所定濃度のジエチレングリコール溶液を加えて培養液を作成した。
　この培養液８Ｌを１０Ｌ容量のリアクターに加え、Ｄ１７株を添加して（初期菌体濃度：４３．２ｍｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／Ｌ）、４Ｌ／ｍｉｎのエアレーションを行いながら、２８℃にて９日間培養した。また、培養４日目に、コーンスティープリカーを濃度が５ｇ／Ｌになるように一度のみ添加した。なお、培養期間中は、ｐＨ７．０±０．２に制御した。
「１，４－ジオキサン分解活性の測定２」
　培養液から１ｍＬサンプリングし、１，４－ジオキサン分解活性を上記「１，４－ジオキサン分解活性の測定１」と同様にして測定した。サンプリングは培養開始直後と、培養開始してから１、２、３、４、５、７、９日目に行った。なお、４日目のサンプリングは、ＣＳＬを添加する直前に行った。測定結果を図６に示す。
「ジエチレングリコール濃度の測定」
　上記「１，４－ジオキサン分解活性の測定２」でサンプリングした培養液中のジエチレングリコール濃度を、高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｌｌｉａｎｃｅ　２６９５　検出器：ＲＩＤ）を用いて測定した。
「菌体濃度の測定」
　培養開始直後と、培養開始してから４日目と９日目に培養液を１５０ｍＬサンプリングし、メスシリンダーにて正確に１００ｍＬ秤取った後、吸引濾過にて菌体をすべて回収・洗浄し、１０５℃で一晩乾燥した。なお、４日目のサンプリングは、コーンスティープリカーを添加する直前に行った。その後、乾燥重量を測定し、菌体濃度として算出した。
　ジエチレングリコール濃度、および菌体濃度の経時変化を図７に示す。
　培養直後の分解活性は０．０２と小さかったが、培養１日目の分解活性は０．３８、培養４日目の０．９３まで上昇した。コーンスティープリカーを添加してから２４時間後である培養５日目の分解活性は１．６１と大きく上昇し、７日目、９日目の分解活性は１．７３であった。７日目以降の分解活性は、実際にはさらに上昇しているが、１，４－ジオキサン濃度が定量限界値未満まで低下したため、正確な活性値として算出できなかった。このことから、コーンスティープリカーを添加することで、１，４－ジオキサンの分解活性が高まることが確かめられた。なお、本試験方法での１，４－ジオキサンの仕込み濃度は１００ｍｇ／Ｌであり、ブランク系での減少を考慮した分解活性値の上限は約１．７３である。
　ジエチレングリコール濃度は、試験開始から４日目までは緩やかに減少した。培養４日目以降はジエチレングリコール濃度の低下が早まっており、コーンスティープリカーを添加することで、ジエチレングリコールの資化速度、すなわち、分解菌の増殖速度が早くなったことを確認した。
　菌体濃度は、培養０日目では９４ｍｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／Ｌ、４日目では２８８ｍｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／Ｌであったが、培養９日目には２０４３ｍｇ－ｄｒｙ　ｃｅｌｌ／Ｌと増加した。そのためジエチレングリコール以外の有機物質を添加することで分解菌を高濃度に含む培養液を得られることが明らかとなった。
「実施例９」
　１，４－ジオキサン汚染サイトの異なる場所から採取した７種類の土壌において、ジエチレングリコールを添加した培地での培養によるＳＤＩＭＯ保有菌の増殖を調査した。なお、ＳＤＩＭＯ保有菌の増殖を、ＳＤＩＭＯをコードする遺伝子（ＳＤＩＭＯ遺伝子）に由来する約４２０ｂｐのＰＣＲ増幅産物の増加によって評価した。
　９０ｍｌの液体培地（培地組成：Ｋ2ＨＰＯ4：１ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２００ｍｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ3：１０ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ2：５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ：７．０）を入れた３００ｍｌ三角フラスコに、湿重量１０ｇの土壌を投入し、ジエチレングリコールを終濃度２０ｇ／Ｌになるように添加して、２８℃、１２０ｒｐｍで回転振盪培養を行った。
　ジエチレングリコール添加直後および６日後に５ｍｌを採取し、遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、５分）によって上清を除去した後、土壌０．５ｇ（湿重量）からＤＮＡを回収した。ＤＮＡ抽出には土壌ＤＮＡ抽出キット（株式会社ニッポン・ジーン製、商品名：ＩＳＯＩＬ　ｆｏｒ　Ｂｅａｄｓ　Ｂｅａｔｉｎｇ）を用い、抽出したＤＮＡはＤＮＡフラグメント精製キット（東洋紡株式会社製、商品名：ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ－ＰＣＲ　＆　Ｇｅｌ　Ｃｌｅａｎ　ｕｐ－）を用いて精製した。
　ＳＤＩＭＯ遺伝子の検出は、上記非特許文献５に記載されたプライマーセット［ＮＶＣ５７，ＮＶＣ６６］を用いたＰＣＲによって行った。このプライマーセットを用いたＰＣＲにより、試料中にＳＤＩＭＯ遺伝子が存在する場合には約４２０ｂｐのＰＣＲ増幅産物が特異的に増幅される。ＰＣＲの反応系は５０μｌ（ＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ　Ｆａｓｔ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）２５μｌ、プライマー各０．５μＭ、ＤＮＡ１μｌ、滅菌超純水にて５０μｌにメスアップ）とし、ＰＣＲ増幅は、９４℃、５分の熱変性の後、９４℃、３０秒の熱変性、５７℃、３０秒のアニーリング、７２℃、１分の伸長を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃、５分の伸長を行う条件で実施した。ＰＣＲ後のサンプルは、１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動（１００Ｖ、３０分）を行い、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉにより１５分間染色した後、紫外線を照射して、約４２０ｂｐのＰＣＲ増幅産物の有無と強度を調べた。図８にジエチレングリコールを添加した液体培地中における土壌試料１～７の培養前後（０日、６日後）におけるＳＤＩＭＯ遺伝子のＰＣＲ増幅結果を示す。なお、図８において、Ｍで示されるレーンは、ＤＮＡラダーマーカー（タカラバイオ株式会社製、商品名：１００ｂｐ　ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ）、Ｐで示されるレーンは１，４－ジオキサン資化菌であるPseudonocardia sp. D17のＤＮＡ、Ｎで示されるレーンはＤＮＡなしのネガティブコントロールである。
　培養前の土壌では、多くの場合に約４２０ｂｐのＰＣＲ増幅産物はごく僅かに検出されたのみであった。一方、培養後の土壌では、全ての試料において約４２０ｂｐのＰＣＲ増幅産物が明確に検出された。培養前後における約４２０ｂｐのＰＣＲ増幅産物量を比較すると、培養前に増幅産物量が多かった土壌試料４以外では、培養後に増幅産物量が顕著に増えていることが確認された。以上の結果から、ジエチレングリコールを用いて培養することで、土壌中にごく僅か存在するＳＤＩＭＯ保有菌が優先的に増殖したことが確認できた。すなわち、１，４－ジオキサンで汚染された水、または土壌に、ジエチレングリコールを注入することで、汚染環境下に従来存在している分解菌を優先的に増やすことができ、分解菌の菌体量が増えることで１，４－ジオキサン処理の分解を促進できることが確かめられた。

Claims (16)

  1. 　ジエチレングリコールを１．０ｗｔ％以上１０．０ｗｔ％以下の濃度で含有する培地を用いて１，４－ジオキサン分解菌を増やすことを特徴とする１，４－ジオキサン分解菌の培養方法。
  2. 　前記培地が液体培地であることを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
  3. 　前記培地が、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンの少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項１、または２に記載の培養方法。
  4. 　前記１，４－ジオキサン分解菌が、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）、またはシュードノカルディア属（Pseudonocardia sp.）であることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の培養方法。
  5. 　前記１，４－ジオキサン分解菌が、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.） D11（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９２６）、シュードノカルディア属（Pseudonocardia sp.） D17（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９２７）、シュードノカルディア　ジオキサニヴォランズ（Pseudonocardia dioxanivorans） CB1190の少なくとも１種であることを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の培養方法。
  6. 　液体培地を供給しながら、該液体培地の供給量と同量の培養液を取り出す連続培養であることを特徴とする請求項２～５のいずれかに記載の培養方法。
  7. 　ジエチレングリコールを１．０ｗｔ％以上１０．０ｗｔ％以下の濃度で含有することを特徴とする培地。
  8. 　液体培地であることを特徴とする請求項７に記載の培地。
  9. 　コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンの少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項７、または８に記載の培地。
  10. 　１，４－ジオキサンを含む水に、請求項１～６のいずれかに記載の培養方法で培養した１，４－ジオキサン分解菌を注入することを特徴とする水処理方法。
  11. 　前記１，４－ジオキサン分解菌とともに、ジエチレングリコールを注入することを特徴とする請求項１０に記載の水処理方法。
  12. 　１，４－ジオキサンを含む土壌に、請求項１～６のいずれかに記載の培養方法で培養した１，４－ジオキサン分解菌を注入することを特徴とする土壌処理方法。
  13. 　前記１，４－ジオキサン分解菌とともに、ジエチレングリコールを注入することを特徴とする請求項１２に記載の土壌処理方法。
  14. 　請求項１～６のいずれかに記載の培養方法により培養した１，４－ジオキサン分解菌。
  15. 　請求項１４に記載の１，４－ジオキサン分解菌を固定化した固定化担体。
  16. 　１，４－ジオキサンを含む水、または土壌に、ジエチレングリコールを注入し、
    前記１，４－ジオキサンを含む水、または土壌に存在する１，４－ジオキサン分解菌の増殖を促進することを特徴とする１，４－ジオキサン処理方法。
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