KR102498199B1 - 1,4-디옥산 분해균의 배양방법, 배지, 1,4-디옥산 분해균을 이용하는 1,4-디옥산 처리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 1,4-디옥산 분해균의 효율적인 배양방법의 제공을 과제로 한다. 해결 수단으로서는 디에틸렌글리콜을 함유하는 배지를 사용하여 1,4-디옥산 분해균을 늘리는 것을 특징으로 하는 1,4-디옥산 분해균의 배양방법을 제공하는 것이다.

Description

1,4-디옥산 분해균의 배양방법, 배지, 1,4-디옥산 분해균을 이용하는 1,4-디옥산 처리방법{Method for culturing 1,4-dioxane-decomposing bacteria, culture medium, and 1,4-dioxane treatment method using 1,4-dioxane-decomposing bacteria}

본 발명은 1,4-디옥산 분해균의 배양방법, 배지, 1,4-디옥산 분해균을 이용하는 1,4-디옥산 처리방법에 관한 것이다.

1,4-디옥산은 하기 화학식 1로 표시되는 환상 에테르이다. 1,4-디옥산은 물이나 유기용매와의 상용성이 우수하여, 주로 유기합성의 반응용제로서 사용되고 있다.

2010년도 일본에서의 1,4-디옥산의 제조·수입량은 약 4,500 t/년이며, 약 300 t/년이 환경 중에 방출된 것으로 추측된다. 1,4-디옥산은 수용성이기 때문에 수환경 중에 방출되면 광역으로 확산되어 버린다. 또한 휘발성, 고체에 대한 흡착성, 광분해성, 가수분해성, 생분해성이 모두 낮기 때문에 수중으로부터의 제거가 곤란하다. 1,4-디옥산은 급성 독성 및 만성 독성을 가질뿐더러 발암성도 지적되고 있는 것으로부터, 1,4-디옥산에 의한 수환경의 오염은 사람이나 동식물에 악영향을 미칠 것이 우려되고 있다. 그렇기 때문에 일본에서는 수도수질기준(0.05 ㎎/L 이하), 환경기준(0.05 ㎎/L 이하) 및 폐수기준(0.5 ㎎/L 이하)에 의해 1,4-디옥산의 규제가 이루어지고 있다.

종래의 활성오니법이나 활성탄흡착법 등의 처리방법의 경우는, 수중으로부터 1,4-디옥산을 충분히 제거하는 것이 불가능하다. 과산화수소를 첨가한 오존처리(O₃/H₂O₂), 자외선 조사 하에서의 오존처리(O₃/UV), 방사선이나 초음파 조사 하에서의 오존처리 등, 복수의 물리화학적인 산화방법을 병용하는 촉진산화법에 있어서만 1,4-디옥산 처리의 유효성이 확인되고 있다. 그러나, 촉진산화법은 초기 투자비 및 운전비가 높기 때문에 보급에 이르지 못하였다. 또한 비특허문헌 1에서는 1,4-디옥산 이외의 유기물이 존재하면 촉진산화법에 의한 1,4-디옥산의 처리효율이 저하된다고 보고되어 있다.

저비용이면서 또한 안정적으로 1,4-디옥산을 포함하는 물을 처리하는 방법이 요구되고 있어, 특허문헌 1, 비특허문헌 2에서는 1,4-디옥산 분해균에 의한 생물처리가 제안되어 있다.

1,4-디옥산 분해균은 1,4-디옥산을 단일 탄소원으로 하여 분해 및 자화 가능한 균(자화균)과, 테트라히드로푸란 등의 다른 성분의 존재 하에서 공대사 반응에 의해 1,4-디옥산의 분해를 행하는 균(공대사균)의 2종으로 크게 구별되며, 자화균은 추가로 1,4-디옥산 분해효소의 유도 유무에 따라 유도형과 구성형으로 나누어진다. 비특허문헌 3, 4에서는 이들의 1,4-디옥산 분해균이 갖는 THF 모노옥시게나제가 1,4-디옥산의 분해에 관여하고 있는 것이 보고되어 있다. THF 모노옥시게나제는 다양한 탄화수소류의 첫 산화를 담당하고 있는 가용성 철(Ⅱ) 모노옥시게나제(SDIMO)의 일종으로 분류되어 있으며, SDIMO에는 그 밖에 메탄/프로판 모노옥시게나제 등이 포함되어 있다(비특허문헌 5). 또한 비특허문헌 6에서는 THF 모노옥시게나제 이외의 SDIMO를 갖는 균도 1,4-디옥산을 분해할 가능성이 있는 것이 보고되어 있다.

1,4-디옥산 분해균은 증식이 극히 느려 다른 미생물이 혼입되어 있으면 다른 미생물이 우선적으로 증식되어 버리기 때문에, 1,4-디옥산 분해균을 배양하려면 다른 잡균이 혼입되지 않도록 사전에 배양장치와 배지를 충분히 멸균할 필요가 있다. 멸균처리에는 오토클레이브를 사용하는 증기 멸균, 오븐 등으로 가열하는 건열 멸균, 감마선을 사용하는 방사선 멸균, 에틸렌옥사이드 가스를 사용하는 화학 멸균 등의 방법이 있다. 그러나, 멸균을 위한 설비가 지나치게 대규모가 되어 버리거나, 에너지 비용이 지나치게 들거나, 사용하는 약품량이 방대해져 비용·안전성의 측면에서 문제가 있는 등, 어떤 멸균방법도 대규모 스케일로 행하는 것은 곤란하다. 그렇기 때문에 실제의 1,4-디옥산 오염현장에서 필요로 하는 만큼의 대량의 1,4-디옥산 분해균을 공급하는 것은 곤란하다.

일본국 특허공개 제2008-306939호 공보

K. KOSAKA, H. YAMADA, S. MATSUI, and K. SHISHIDA: The effects of the co-existing compounds on the decomposition of micropollutants using the ozone/hydrogen peroxide process. Water Sci. Technol., 42, pp.353-361, 2000. 세이 카즈나리, 이케 미치히코：1,4-디옥산 분해균을 사용한 오염 지하수의 생물처리·정화기술의 가능성, 용수와 폐수, Vol.53, No.7, 2011. H. MASUDA, K. McCLAY, R. J. STEFFAN, and G. J. ZYLSTRA: Biodegradation of tetrahydrofuran and 1,4-dioxane by soluble diiron monooxygenase in Pseudonocardia sp. strain ENV478. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 22(5), pp.312-316, 2012. A. GROSTERN, C. M. SALES, W. -Q. ZHUANG, O. ERBILGIN, and L. ALVAREZ-COHEN: Glyoxylate metabolism is a key feature of the metabolic degradation of 1,4-dioxane by Pseudonocardia dioxanivorans strain CB1190. Appl. Environ. Microbiol., 78(9), pp.3298-3308, 2012. N. V. COLEMAN, N. B. BUI, and A. J. HOLMES: Soluble di-iron monooxygenase gene diversity in soils, sediments and ethane enrichments. Environ. Microbiol., 8(7), pp.1228-1239, 2006. S. MAHENDRA, and L. ALVAREZ-COHEN: Kinetics of 1,4-dioxane biodegradation by monooxygenase-expressing bacteria. Environ. Sci. Technol., 40(17), pp.5435-5442, 2006.

1,4-디옥산 분해균의 효율적인 배양방법을 제공한다.

1. 디에틸렌글리콜을 1.0 wt% 이상 10.0 wt% 이하의 농도로 함유하는 배지를 사용하여 1,4-디옥산 분해균을 늘리는 것을 특징으로 하는 1,4-디옥산 분해균의 배양방법.

2. 상기 배지가 액체배지인 것을 특징으로 하는 1.에 기재된 배양방법.

3. 상기 배지가 옥수수 침지액(corn steep liquor), 카사미노산(casamino acid), 효모 추출물, 펩톤 중 1종 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 1. 또는 2.에 기재된 배양방법.

4. 상기 1,4-디옥산 분해균이 미코박테륨속(Mycobacterium sp.) 또는 슈도노카디아속(Pseudonocardia sp.)인 것을 특징으로 하는 1. 내지 3. 중 어느 하나에 기재된 배양방법.

5. 상기 1,4-디옥산 분해균이 미코박테륨속(Mycobacterium sp.) D11(수탁번호：NITE BP-01926), 슈도노카디아속(Pseudonocardia sp.) D17(수탁번호：NITE BP-01927), 슈도노카디아 디옥사니보란스(Pseudonocardia dioxanivorans) CB1190 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 1. 내지 4. 중 어느 하나에 기재된 배양방법.

6. 액체배지를 공급하면서, 이 액체배지의 공급량과 동량의 배양액을 추출하는 연속 배양인 것을 특징으로 하는 2. 내지 5. 중 어느 하나에 기재된 배양방법.

7. 디에틸렌글리콜을 1.0 wt% 이상 10.0 wt% 이하의 농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 배지.

8. 액체배지인 것을 특징으로 하는 7.에 기재된 배지.

9. 옥수수 침지액, 카사미노산, 효모 추출물, 펩톤 중 1종 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 7. 또는 8.에 기재된 배지.

10. 1,4-디옥산을 포함하는 물에 1. 내지 6. 중 어느 하나에 기재된 배양방법으로 배양한 1,4-디옥산 분해균을 주입하는 것을 특징으로 하는 수처리방법.

11. 상기 1,4-디옥산 분해균과 함께 디에틸렌글리콜을 주입하는 것을 특징으로 하는 10.에 기재된 수처리방법.

12. 1,4-디옥산을 포함하는 토양에 1. 내지 6. 중 어느 하나에 기재된 배양방법으로 배양한 1,4-디옥산 분해균을 주입하는 것을 특징으로 하는 토양처리방법.

13. 상기 1,4-디옥산 분해균과 함께 디에틸렌글리콜을 주입하는 것을 특징으로 하는 12.에 기재된 토양처리방법.

14. 1. 내지 6. 중 어느 하나에 기재된 배양방법으로 배양한 1,4-디옥산 분해균.

15. 14.에 기재된 1,4-디옥산 분해균을 고정화한 고정화 담체.

16. 1,4-디옥산을 포함하는 물 또는 토양에 디에틸렌글리콜을 주입하여,

상기 1,4-디옥산을 포함하는 물 또는 토양에 존재하는 1,4-디옥산 분해균의 증식을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 1,4-디옥산 처리방법.

본 발명의 배양방법에 의해 1,4-디옥산 분해균을 효율적으로 늘리는 것이 가능하다. 다른 미생물이 존재해도 1,4-디옥산 분해균을 우선적으로 늘리는 것이 가능하여 멸균설비가 불필요하기 때문에, 대규모설비로 1,4-디옥산 분해균을 늘리는 것이 가능하여 하수처리장, 공장폐수처리시설, 오염현장 등에 있어서 1,4-디옥산 처리에 필요한 대량의 1,4-디옥산 분해균을 공급하는 것이 가능하다. 배양한 1,4-디옥산 분해균을 물 또는 토양에 주입하는 것만으로 1,4-디옥산을 처리하는 것이 가능하기 때문에, 간편하고 저비용으로 1,4-디옥산을 처리하는 것이 가능하다.

1,4-디옥산으로 오염된 물 또는 토양에 디에틸렌글리콜을 주입함으로써 오염 환경 하에 종래 존재하고 있는 분해균의 증식을 촉진시켜 분해균을 우선적으로 늘리는 것이 가능하다. 그리고 분해균의 균체량이 늘어남으로써 분해균에 의한 1,4-디옥산 처리를 촉진시키는 것이 가능하다. 디에틸렌글리콜을 첨가하기만 하면 되기 때문에 매우 저비용이다. 또한 종래 존재하고 있는 분해균을 늘릴 뿐이기 때문에 생태계로의 영향을 억제하는 것이 가능하다.

도 1은 표준 활성오니법에 있어서의 오염수 처리 플로차트이다.
도 2는 1,4-디옥산 분해균에 있어서 디에틸렌글리콜 존재 하에서의 증식성을 나타내는 도면이다.
도 3은 1,4-디옥산 분해균에 있어서 1,4-디옥산 분해활성의 시간 경과에 따른 변화를 나타내는 도면이다.
도 4의 우측은 디에틸렌글리콜, 좌측은 글루코오스를 함유하는 배양액 중에서 1,4-디옥산 분해균을 배양 중인 리액터 사진이다.
도 5는 배양액 중의 디에틸렌글리콜 농도와 1,4-디옥산 분해균의 △균체 농도의 관계를 나타내는 도면이다.
도 6은 1,4-디옥산 분해균의 배양 중에 옥수수 침지액을 첨가했을 때의 1,4-디옥산 분해활성의 시간 경과에 따른 변화를 나타내는 도면이다.
도 7은 1,4-디옥산 분해균의 배양 중에 옥수수 침지액을 첨가했을 때의 디에틸렌글리콜 농도와 균체 농도의 시간 경과에 따른 변화를 나타내는 도면이다.
도 8은 디에틸렌글리콜을 첨가한 액체배지 중에 있어서 토양시료 1~7의 배양 전후(0일, 6일 후)의 SDIMO 유전자의 PCR 증폭산물의 전기영동 결과를 나타내는 도면이다.

아래에 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 디에틸렌글리콜을 함유하는 배지를 사용하여 1,4-디옥산 분해균을 늘리는 것을 특징으로 한다.

종래 1,4-디옥산 분해균(이하, 분해균이라 한다.)을 늘리기 위해서는 다른 미생물이 혼입되지 않도록 사전에 충분히 멸균할 필요가 있었다.

본 발명은 분해균이 디에틸렌글리콜 존재 하에서 다른 미생물보다도 우수한 증식성을 나타낸다는 지금까지 알려지지 않은 완전히 신규한 지견(知見)에 기초한 것이다. 분해균이 디에틸렌글리콜 존재 하에서 증식성이 우수한 이유는 불명확하지만, 분해균은 다른 미생물보다도 디에틸렌글리콜을 탄소원으로서 이용하는 능력이 우수하기 때문에, 디에틸렌글리콜 존재 하에서 우선적으로 증식시키는 것이 가능할 것으로 추측된다. 그렇기 때문에, 디에틸렌글리콜 존재 하에서는 다른 미생물이 서식하고 있어도 분해균을 늘리는 것이 가능하다. 즉, 디에틸렌글리콜 존재 하에서는 다른 미생물을 멸균하지 않고 분해균을 늘리는 것이 가능하다.

디에틸렌글리콜은 하기 화학식 2로 표시되는 글리콜이다.

디에틸렌글리콜은 환경 중에서 분해되는 생분해성이 우수한 화합물이다. 환경 중에 존재하는 많은 미생물은 디에틸렌글리콜을 탄소원으로서 이용하는 것이 가능하고, 분해균도 당연히 디에틸렌글리콜을 탄소원으로서 이용하는 것이 가능하다. 그리고 분해균은 디옥산 분해능을 갖지 않는 미생물과 비교하여 디에틸렌글리콜을 탄소원으로서 이용하는 능력이 우수하다.

분해균은 자연계에 존재하고 있어, 1,4-디옥산으로 오염된 수중이나 토양 중에서 채취한 오니 등을 탄소원으로서 1,4-디옥산만을 포함하는 배지에서 배양함으로써 스크리닝하는 것이 가능하다. 본 발명에서 사용하는 분해균으로서는 특별히 제한되지 않고, 미코박테륨속(Mycobacterium sp.), 슈도노카디아속(Pseudonocardia sp.), 아피피아속(Afipia sp.), 로도코커스속(Rhodococcus sp.), 플라보박테륨속(Flavobacterium sp.), 메틸로시너스속(Methylosinus sp.), 버크홀데리아속(Burkholderia sp.), 랄스토니아속(Ralstonia sp.), 동충하초속(Cordyceps sp.), 크산토박터속(Xanthobacter sp.), 아시네토박터속(Acinetobacter sp.) 등에 속하는 것을 사용하는 것이 가능하다.

분해균에는 1,4-디옥산을 단일 탄소원으로서 분해 및 자화 가능한 균과, 테트라히드로푸란 등의 다른 성분의 존재 하에서 공대사반응에 의해 1,4-디옥산의 분해를 행하는 균의 2종으로 크게 구별된다. 본 발명에서 사용하는 분해균으로서는 특별히 제한되지 않지만, 미코박테륨속(Mycobacterium sp.) D11, 슈도노카디아속(Pseudonocardia sp.) D17, 미코박테륨속(Mycobacterium sp.) D6, 슈도노카디아 디옥사니보란스(Pseudonocardia dioxanivorans) CB1190, 아피피아속(Afipia sp.) D1, 미코박테륨속(Mycobacterium sp.) PH-06, 슈도노카디아 벤제니보란스(Pseudonocardia benzenivorans) B5, 플라보박테륨속(Flavobacterium sp.), 슈도노카디아속(Pseudonocardia sp.) ENV478, 슈도노카디아 테트라히드로푸란옥시단스(Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans) K1, 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber) T1, 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber) T5, 메틸로시너스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium) OB3b, 미코박테륨 백케이(Mycobacterium vaccae) JOB5, 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) G4, 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina) KR1, 슈도노카디아 테트라히드로푸란옥시단스(Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans) K1, 랄스토니아 피케티(Ralstonia pickettii) PKO1, 로도코커스속(Rhodococcus sp.) RR1, 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter Baumannii) DD1, 로도코커스속(Rhodococcus sp.) 219, 슈도노카디아 안타크티카(Pseudonocardia antarctica) DVS 5a1, 동충하초(Cordyceps sinensis) A, 로도코커스 애테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JCM14343 등이 바람직하다. 이들 중에서 1,4-디옥산의 분해능이 비교적 높은 슈도노카디아속(Pseudonocardia sp.) D17, 미코박테륨속(Mycobacterium sp.) D11 및 슈도노카디아 디옥사니보란스(Pseudonocardia dioxanivorans) CB1190이 바람직하다.

미코박테륨속(Mycobacterium sp.) D11, 슈도노카디아속(Pseudonocardia sp.) D17은 각각 수탁번호 NITE BP-01926, 수탁번호 NITE BP-01927로서, 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터(NPMD)(일본국 치바현 키사라즈시 카즈사 카마타리 2-5-8(우편번호 292-0818))에 2014년 8월 29일자로 국제기탁되어 있다.

슈도노카디아 디옥사니보란스(Pseudonocardia dioxanivorans) CB1190(이하, CB1190주라 한다.)은 미국 ATCC로부터 구입하는 것이 가능하다(ATCC 55486). 또한 미국 ATCC 외에도 JCM(독립행정법인 이화학연구소 바이오리소스센터 미생물재료개발실)이나 독일의 DSM에서도 구입 가능하다.

로도코커스 애테리보란스(Rhodococcus aetherivorans) JCM14343은 JCM(독립행정법인 이화학연구소 바이오리소스센터 미생물재료개발실)으로부터 구입하는 것이 가능하다(JCM 14343). 또한 독일의 DSM, 영국의 NCIMB, 프랑스의 CIP에서도 구입 가능하다.

분해균을 늘리는 조건은 디에틸렌글리콜이 존재하는 환경 하라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면 액체배지, 고체배지를 들 수 있다. 또한 멸균처리되지 않아 다른 미생물이 존재하고 있어도 된다. 배지로서는 분해균을 배양할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않고, MGY 배지나 CGY 배지 등의 공지의 배지에 디에틸렌글리콜을 첨가한 것을 사용하는 것이 가능하다.

분해균을 대량으로 늘리기 위해서는 액체배지를 사용하는 것이 바람직하며, 액체배지를 공급하면서 액체배지의 공급량과 동량의 분해균을 포함하는 배양액을 추출하는 연속 배양으로 1,4-디옥산 분해균을 늘리는 것이 더욱 바람직하다.

분해균을 늘릴 때의 디에틸렌글리콜 농도는 특별히 한정되지 않으나, 액체배지의 경우는 0.01 ㎎/L 이상 100 g/L 이하(1.0×10^-8 wt% 이상 10.0 wt% 이하)가 바람직하다. 액체배지의 디에틸렌글리콜 농도의 하한치는 1 g/L 이상(0.1 wt% 이상)인 것이 보다 바람직하고, 5 g/L 이상(0.5 wt% 이상)인 것이 더욱 바람직하며, 10 g/L 이상(1.0 wt% 이상)인 것이 가장 바람직하다. 디에틸렌글리콜 농도의 상한치는 60 g/L 이하(6.0 wt% 이하)인 것이 보다 바람직하고, 30 g/L 이하(3.0 wt% 이하)인 것이 더욱 바람직하며, 20 g(2.0 wt% 이하)/L 이하인 것이 가장 바람직하다. 또한 고체배지의 경우는 0.1 wt% 이상 10.0 wt% 이하가 바람직하다. 고체배지의 디에틸렌글리콜 농도의 하한치는 1.0 wt% 이상인 것이 보다 바람직하고, 1.5 wt% 이상인 것이 더욱 바람직하며, 2.0 wt% 이상인 것이 가장 바람직하다. 디에틸렌글리콜 농도의 상한치는 9.0 wt% 이하인 것이 보다 바람직하고, 8.0 wt% 이하인 것이 더욱 바람직하며, 7.0 wt% 이하인 것이 가장 바람직하다.

분해균을 늘릴 때에는 분해균의 활동에 필요한 무기물질이나 유기물질을 첨가하는 것이 가능하다. 미생물의 활동량은 필요한 영양소 등의 인자 중에서 가장 적은 인자에 의해 제한되기 때문에, 부족한 영양소를 첨가함으로써 증식을 촉진시키는 것이 가능하다. 첨가하는 무기물질로서는 특별히 제한되지 않고 K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄·7H₂O, FeCl₃, CaCl₂, NaCl 등을 들 수 있다.

첨가하는 유기물질로서는 특별히 제한되지 않지만, 옥수수 침지액, 카사미노산, 효모 추출물, 펩톤이 바람직하다. 디에틸렌글리콜 이외의 유기물질을 첨가함으로써 분해균의 증식속도를 빠르게 하는 것이 가능하다. 디에틸렌글리콜과, 디에틸렌글리콜 이외의 첨가하는 유기물질의 중량비는 60：40~99：1인 것이 바람직하고, 70：30~98：2인 것이 보다 바람직하며, 75：25~95：5인 것이 더욱 바람직하고, 80：20~90：10인 것이 가장 바람직하다.

분해균의 배양은 15~45℃에서 행하는 것이 바람직하다. 20~40℃가 보다 바람직하며, 25~35℃가 가장 바람직하다. 또한 pH는 5~8이 바람직하며, 6~8이 보다 바람직하다. 배양시간은 필요한 균체량을 얻을 수 있다면 특별히 제한되지 않는다. 폐쇄형 시스템으로 분해균을 늘리는 경우, 3~30일간이 바람직하다.

본 발명의 배양방법은 다른 미생물을 멸균하지 않고 분해균을 늘리는 것이 가능하여 멸균장치가 불필요하다. 그렇기 때문에, 대규모 스케일에서의 배양이 용이하여, 하수처리장이나 공장폐수처리시설, 오염토양의 처리현장 등에서의 1,4-디옥산 처리에 필요한 대량의 균체를 공급하는 것이 가능하다.

디옥산 분해균은 배양액으로부터 여과 분별한 균체, 동결보존한 균체, L-건조보존한 균체, 동결건조한 균체, 디옥산 분해균을 수지 등에 고정화한 고정화 담체 또는 배양액이나 그의 농축액 등의 디옥산 분해균을 포함하는 현탁액 등의 임의의 형태로 1,4-디옥산 처리에 사용하는 것이 가능하다.

배양한 분해균을 1,4-디옥산으로 오염된 물에 주입하여 호기적 환경 하로 함으로써, 분해균에 의한 1,4-디옥산의 생물처리를 행하는 것이 가능하다. 일반적인 하수나 공장 폐수 등의 물은 K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄·7H₂O, FeCl₃, CaCl₂, NaCl 등의 영양염류를 포함하고 있는 경우가 많으나, 영양염류의 농도가 낮으면 필요한 영양염류를 주입함으로써 분해균의 대사·자화에 의한 1,4-디옥산 처리를 촉진시키는 것이 가능하다. 또한 분해균과 함께 디에틸렌글리콜을 주입함으로써 다른 미생물도 존재하는 수중에 있어서도 분해균의 1,4-디옥산 분해활성을 유지하는 것이 가능하다. 또한 디에틸렌글리콜은 생분해성이 우수하여 환경 중에서 빠르게 분해되기 때문에, 디에틸렌글리콜에 의한 환경으로의 부하는 매우 작다.

오염수 중에 있어서의 디에틸렌글리콜 농도는 1.0×10^-8 wt% 이상 10.0 wt% 이하인 것이 바람직하다. 디에틸렌글리콜 농도의 하한치는 0.1 wt% 이상인 것이 보다 바람직하고, 0.5 wt% 이상인 것이 더욱 바람직하며, 1.0 wt% 이상인 것이 가장 바람직하다. 디에틸렌글리콜 농도의 상한치는 6.0 wt% 이하인 것이 보다 바람직하고, 3.0 wt% 이하인 것이 더욱 바람직하며, 2.0 wt% 이하인 것이 가장 바람직하다.

도 1에 폭기조를 사용하는 표준 활성오니법에 있어서의 오염수 처리 흐름을 나타낸다. 표준 활성오니법에서는 폭기조에 있어서 유용 미생물에 의한 생물처리를 행하고 있다. 폭기조에는 산기관이 설치되어 있어 산기관으로부터 기포가 폭기조 내의 물에 공급되어 이 기포로부터 수중에 산소가 용해되고, 유용 미생물에 의한 대사·자화에 의해 유기물이 처리된다. 폭기조는 호기적 환경 하이기 때문에, 폭기조에 분해균을 주입하는 것만으로 오염수 중에 포함되는 1,4-디옥산을 처리하는 것이 가능하다. 도 1에는 분해균을 포함하는 배양액을 주입하는 흐름을 나타냈지만, 연속 배양에 의해 추출한 배양액을 연속적으로 주입해도 된다. 또한 배양액이 아니라 배양액으로부터 여과 분별 등을 행한 분해균을 그대로 동결보존한 균체, L-건조보존한 균체, 동결건조한 균체, 분해균을 수지 등에 고정화한 고정화 담체 또는 배양액을 농축한 현탁액 등으로서 주입해도 된다.

배양한 분해균을 폭기조에 주입하는 것만으로 1,4-디옥산 처리를 행하는 것이 가능하기 때문에, 종래의 표준 활성오니법에서 사용되는 설비를 거의 그대로 활용하는 것이 가능하다. 본 발명의 배양방법은 멸균처리를 위한 설비나 약품이 불필요하기 때문에 초기 투자비, 운전비 모두 억제하는 것이 가능하다. 그렇기 때문에, 본 발명의 배양방법으로 배양한 분해균에 의한 생물처리법은 복수의 산화제를 사용하는 촉진산화법과 비교하여 저비용이다. 또한 분해균의 배양장치도 시판하는 것을 그대로 이용하는 것이 가능하기 때문에 저비용이다.

배양한 분해균을 1,4-디옥산으로 오염된 토양 중에 주입하여 1,4-디옥산을 처리하는 것이 가능하다. 통상의 토양처리방법은 현장 플랜트의 건설, 토양의 굴착, 무해화, 되메움 등 방대한 수고와 비용이 필요하지만, 본 발명의 방법의 경우는 토양 중에 분해균을 주입하는 것만으로 1,4-디옥산을 생물처리하는 것이 가능하다. 일반적으로 토양 중에는 영양소가 부족하기 때문에 분해균과 함께 디에틸렌글리콜을 주입하는 것이 바람직하다. 또한 K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄·7H₂O, FeCl₃, CaCl₂, NaCl 등의 무기물질, 옥수수 침지액, 카사미노산, 효모 추출물, 펩톤 등의 유기물질 중 어느 하나 또는 양쪽을 주입해도 된다.

오염 토양 중에 있어서의 디에틸렌글리콜 농도는 0.1 wt% 이상 10 wt% 이하가 되도록 첨가하는 것이 바람직하다. 디에틸렌글리콜 농도의 하한치는 1.0 wt% 이상인 것이 보다 바람직하고, 1.5 wt% 이상인 것이 더욱 바람직하며, 2 wt% 이상인 것이 가장 바람직하다. 디에틸렌글리콜 농도의 상한치는 9.0 wt% 이하인 것이 보다 바람직하고, 8.0 wt% 이하인 것이 더욱 바람직하며, 7.0 wt% 이하인 것이 가장 바람직하다.

상기한 바와 같이 분해균은 자연계에 존재하고 있다. 1,4-디옥산으로 오염된 물 또는 토양에 디에틸렌글리콜을 주입함으로써 자연계에 존재하는 분해균의 증식을 촉진시켜 분해균을 우선적으로 늘리는 것이 가능하다. 분해균의 균체량이 늘어나면 분해균에 의한 1,4-디옥산 처리가 촉진된다. 디에틸렌글리콜을 첨가하기만 하면 되고, 분해균을 배양할 필요가 없기 때문에 매우 저비용이다. 또한 종래 존재하고 있는 분해균을 늘릴 뿐으로 새로운 분해균을 이입하는 경우가 없기 때문에 생태계로의 영향을 억제하는 것이 가능하다.

이때 오염수 또는 오염토양 중에 있어서의 디에틸렌글리콜 농도가 1.0×10^-8 wt% 이상 10.0 wt% 이하가 되도록 주입하는 것이 바람직하다. 디에틸렌글리콜 농도의 하한치는 0.1 wt% 이상인 것이 보다 바람직하고, 0.5 wt% 이상인 것이 더욱 바람직하며, 1.0 wt% 이상인 것이 가장 바람직하다. 디에틸렌글리콜 농도의 상한치는 9.0 wt% 이하인 것이 보다 바람직하고, 8.0 wt% 이하인 것이 더욱 바람직하며, 7.0 wt% 이하인 것이 가장 바람직하다.

또한 오염환경 중에 서식하고 있는 분해균이나 다른 분해균을 배양하여 디에틸렌글리콜과 함께 주입해도 된다.

다음으로 본 발명을 실시예에 기초하여 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에만 한정되는 것은 아니다.

실시예

「실시예 1」

CB1190주, D11주, D17주를 1,4-디옥산 분해균으로서 사용하였다. 1,4-디옥산을 500 ㎎/L의 농도로 포함하는 CGY 배지(카시톤：5 g/L, 글리세린：5 g/L, 효모 추출물：1 g/L)를 사용하여 각 분해균을 10일간 배양하였다. 배양 후 원심분리기로 집균·세정하여 균체를 20 mL의 생리식염수와 혼합한 것을 식균액(植菌液)으로 하였다. 또한 식균액은 분광광도계를 사용하여 탁도를 통일한 것(OD600：대략 10)을 사용하였다.

300 mL 용량의 배플이 딸린 삼각 플라스크에 액체배지(배지 조성：K₂HPO₄：1 g/L, (NH₄)₂SO₄：1 g/L, NaCl：50 ㎎/L, MgSO₄·7H₂O：200 ㎎/L, FeCl₃：10 ㎎/L, CaCl₂：50 ㎎/L, pH：7.3)를 100 mL 첨가하여 오토클레이브로 멸균하였다. 그 후, 1 g/L가 되도록 소정 농도의 디에틸렌글리콜 용액을 첨가한 후, 식균액을 1 mL 첨가하여 28℃, 120 rpm으로 회전 진탕배양을 9일간 행하였다.

배양종료 후에 흡인 여과로 배양액 중의 균체를 여과물로서 회수하고 105℃에서 하룻밤 건조한 후, 균체 중량을 측정하여 균체 농도(㎎-dry cell/L)를 구하였다. 배양 9일째의 균체 농도에서 초기 균체 농도를 뺀 △균체 농도로 균체의 증식성을 평가하였다.

도 2에 각 분해균의 디에틸렌글리콜 존재 하에서의 증식성을 나타낸다. 모든 분해균에 있어서 균체 농도가 증가하고 있어, 분해균이 디에틸렌글리콜을 탄소원으로서 이용하여 증식할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 특히, D17주는 매우 높은 증식성을 나타내었다.

「실시예 2」

D17주를 MGY 배지(맥아 추출물：10 g/L, 글루코오스：4 g/L, 효모 추출물：4 g/L)에서 2주간 배양하였다.

1,4-디옥산을 포함하는 실제 지하수(pH：7.38, 1,4-디옥산：0.16 ㎎/L, 인산 이온：0.08 ㎎/L, 전체 질소：36.5 ㎎/L, 전체 유기탄소량：11 ㎎/L, 화학적 산소요구량：33 ㎎/L)에 황산암모늄 및 인산수소이칼륨을 각각 1 g/L의 농도가 되도록 첨가한 후, 디에틸렌글리콜을 20 g/L가 되도록 첨가하여 배양액을 만들었다.

이 배양액 650 mL를 1 L 용량의 리액터에 첨가하고, D17주를 첨가하여(균체 농도：157 ㎎-dry cell/L) 6일간 배양을 행하였다. 배양 중에는 28℃, pH 7.0으로 제어하여, 0.65 L/min의 에어레이션을 행하였다.

「비교예 1」

디에틸렌글리콜을 글루코오스로 한 것 이외에는 실시예 2와 동일하게 하여 분해균을 배양하였다.

「1,4-디옥산 분해활성의 측정 1」

실시예 2, 비교예 1의 배양액으로부터 각각 1 mL 샘플링하여 1,4-디옥산 분해활성을 측정하였다. 샘플링은 배양개시 직후와 배양개시 후 1~6일째에 행하였다. 분해활성의 측정방법은 아래와 같다.

100 mL 용량의 배플이 딸린 삼각 플라스크에 100 ㎎/L의 1,4-디옥산을 포함하는 액체배지(배지 조성：K₂HPO₄：1 g/L, (NH₄)₂SO₄：1 g/L, NaCl：50 ㎎/L, MgSO₄·7H₂O：200 ㎎/L, FeCl₃：10 ㎎/L, CaCl₂：50 ㎎/L, pH：7.3) 19 mL와, 샘플링한 배양액 1 mL를 첨가하여 28℃, 120 rpm으로 24시간 회전 진탕배양을 행하였다. 또한 삼각 플라스크는 전부 3개 준비하여 동일한 순서로 시험을 실시하였다.

배양종료 후의 용액 중 1,4-디옥산 농도를 헤드스페이스 가스크로마토그래프 질량분석계(시마즈제작소：GC/MS-QP2010 PLUS, TURBOMATRIX HS40)로 측정하였다. 또한 배양액을 첨가하지 않는 블랭크계도 동일한 순서로 시험을 실시하여 하기 식으로 1,4-디옥산의 분해활성을 구하였다. 본 측정방법에 있어서 분해활성은 1 ㎖의 배양액이 24시간에 분해한 1,4-디옥산의 양을 나타낸다. 측정결과의 산술평균치(n=3)를 도 3에 나타낸다. 또한 배양 3일째의 리액터 사진을 도 4에 나타낸다. 도 4에서 우측이 디에틸렌글리콜을 사용한 실시예 2, 좌측이 글루코오스를 사용한 비교예 1의 리액터이다.

1,4-디옥산 분해활성(㎎-1,4-Dioxane/mL-배양액)

=(C0-C24)×20 mL/1,000 mL

C0(㎎/L)：배양액을 첨가하지 않은 블랭크계를 24시간 회전 진탕배양한 후의 1,4-디옥산 농도.

C24(㎎/L)：배양액을 첨가한 계를 24시간 회전 진탕배양한 후의 1,4-디옥산 농도.

디에틸렌글리콜을 탄소원으로 하는 실시예 2는 배양개시 직후 0.04였던 분해활성이 일수의 경과와 함께 상승하여 배양 6일째에는 1.63까지 상승하였다. 가열 등의 멸균처리를 행하지 않았기 때문에 실제 지하수 중에 서식하고 있던 다른 미생물은 멸균되지 않았으나, 분해활성이 상승한 것으로부터 디에틸렌글리콜 존재 하에서 D17주가 우선적으로 증식하고 있는 것이 명확해졌다. 또한 도 4의 우측에 나타내는 바와 같이 배양 3일째의 배양액은 약간 백탁되어 있었으나 투명성을 갖고 있었다.

글루코오스를 탄소원으로 하는 비교예 1은 배양기간 중의 분해활성은 0.15~0.29의 범위에서 변동되었으나 분해활성의 상승은 확인되지 않았다. 이는 D17주가 실제 지하수 중에 존재하고 있는 다른 미생물보다도 글루코오스를 이용하는 능력이 떨어져 D17주를 증식시킬 수 없었기 때문이다. 또한 배양액은 서서히 탁해지기 시작해 3일째의 배양액은 도 4의 좌측에 나타내는 바와 같이 현저히 백탁되었다. 이는 그 밖의 미생물이 우선적으로 증식했기 때문이다.

배양 6일째의 분해활성은 실시예 2가 1.63, 비교예 1이 0.20으로, 실시예 2는 비교예 1에 비해 8배 이상 우수하였다. 이는 D17주가 다른 미생물에 비해 디에틸렌글리콜을 탄소원으로서 이용하는 능력이 우수하여 D17주의 균체량이 증가했기 때문인 것으로 생각된다.

「실시예 3」

300 mL 용량의 배플이 딸린 삼각 플라스크에 1 g/L 디에틸렌글리콜을 포함하는 액체배지(배지 조성：K₂HPO₄：1 g/L, (NH₄)₂SO₄：1 g/L, NaCl：50 ㎎/L, MgSO₄·7H₂O：200 ㎎/L, FeCl₃：10 ㎎/L, CaCl₂：50 ㎎/L, pH：7.3)를 100 mL 첨가하고, 사전에 MGY 배지에서 배양한 D17주를 식균하여(초기 균체 농도：111 ㎎-dry cell/L), 28℃, 120 rpm으로 7일간 회전 진탕배양을 행하였다.

「실시예 4」

액체배지 중 디에틸렌글리콜의 농도를 5 g/L로 한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 하여 분해균을 배양하였다.

「실시예 5」

액체배지 중 디에틸렌글리콜의 농도를 10 g/L로 한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 하여 분해균을 배양하였다.

「실시예 6」

액체배지 중 디에틸렌글리콜의 농도를 20 g/L로 한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 하여 분해균을 배양하였다.

「실시예 7」

액체배지 중 디에틸렌글리콜의 농도를 30 g/L로 한 것 이외에는 실시예 3과 동일하게 하여 분해균을 배양하였다.

「균체 농도 측정」

배양종료 후, 흡인 여과로 배양액 중의 균체를 여과물로서 회수하고 105℃에서 하룻밤 건조한 후, 회수한 균체 중량을 측정하였다. 측정한 균체 중량치로부터 균체 농도(㎎-dry cell/L)를 구하였다. 또한 각 실시예에서는 동일한 시험계를 2개 준비하여 그 평균치를 균체 밀도로 하였다. 배양 7일째의 균체 농도에서 초기 균체 농도를 뺀 △균체 농도로 균체의 증식성을 평가하였다. 도 5에 △균체 농도를 나타낸다.

디에틸렌글리콜 농도가 1 g/L~10 g/L로 진해짐에 따라 균체 농도가 상승하였다. 디에틸렌글리콜 농도가 10 g/L~30 g/L인 실시예 5~7에서는 디에틸렌글리콜 농도가 커져도 균체 농도가 거의 변하지 않았다. 실시예 5~7의 배양종료 후의 pH를 측정한 바 pH가 3.42~3.91을 나타내고 있어, pH 저하에 의해 증식이 저해되었기 때문에 균체 농도가 같은 정도가 된 것으로 추측된다.

「실시예 8」

실시예 2에서 사용한 1,4-디옥산을 포함하는 실제 지하수에 황산암모늄 및 인산수소이칼륨을 각각 1 g/L의 농도가 되도록 첨가한 후, 10 g/L가 되도록 소정 농도의 디에틸렌글리콜 용액을 첨가하여 배양액을 만들었다.

이 배양액 8 L를 10 L 용량의 리액터에 첨가하고, D17주를 첨가하여(초기 균체 농도：43.2 ㎎-dry cell/L), 4 L/min의 에어레이션을 행하면서 28℃에서 9일간 배양하였다. 또한 배양 4일째에 옥수수 침지액을 농도가 5 g/L가 되도록 한 번만 첨가하였다. 또한 배양기간 중에는 pH 7.0±0.2로 제어하였다.

「1,4-디옥산 분해활성의 측정 2」

배양액으로부터 1 mL 샘플링하여 1,4-디옥산 분해활성을 상기 「1,4-디옥산 분해활성의 측정 1」과 동일하게 하여 측정하였다. 샘플링은 배양개시 직후와 배양개시 후 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9일째에 행하였다. 또한 4일째의 샘플링은 CSL을 첨가하기 직전에 행하였다. 측정결과를 도 6에 나타낸다.

「디에틸렌글리콜 농도의 측정」

상기 「1,4-디옥산 분해활성의 측정 2」에서 샘플링한 배양액 중의 디에틸렌글리콜 농도를 고속액체 크로마토그래피(Waters Alliance 2695 검출기：RID)를 사용하여 측정하였다.

「균체 농도의 측정」

배양개시 직후와 배양개시 후 4일째 및 9일째에 배양액을 150 mL 샘플링하여 메스실린더로 정확히 100 mL 칭량하여 덜어낸 후, 흡인 여과로 균체를 모두 회수·세정하여 105℃에서 하룻밤 건조하였다. 또한 4일째의 샘플링은 옥수수 침지액을 첨가하기 직전에 행하였다. 그 후, 건조중량을 측정하여 균체 농도로서 산출하였다.

디에틸렌글리콜 농도 및 균체 농도의 시간 경과에 따른 변화를 도 7에 나타낸다.

배양 직후의 분해활성은 0.02로 작았으나, 배양 1일째의 분해활성은 0.38, 배양 4일째의 분해활성은 0.93까지 상승하였다. 옥수수 침지액을 첨가하고 24시간 후인 배양 5일째의 분해활성은 1.61로 크게 상승하고, 7일째, 9일째의 분해활성은 1.73이었다. 7일째 이후의 분해활성은 실제로는 더욱 상승하였으나, 1,4-디옥산 농도가 정량 한계치 미만까지 저하되었기 때문에 정확한 활성치로서의 산출은 불가능하였다. 이 사실로부터 옥수수 침지액을 첨가함으로써 1,4-디옥산의 분해활성이 높아지는 것이 확실해졌다. 또한 본 시험방법에서의 1,4-디옥산의 첨가 농도는 100 ㎎/L이며, 블랭크계에서의 감소를 고려한 분해활성치의 상한은 약 1.73이다.

디에틸렌글리콜 농도는 시험 개시로부터 4일째까지는 완만하게 감소하였다. 배양 4일째 이후는 디에틸렌글리콜 농도의 저하가 빨라져, 옥수수 침지액을 첨가함으로써 디에틸렌글리콜의 자화속도, 즉 분해균의 증식속도가 빨라진 것을 확인하였다.

균체 농도는 배양 0일째에서는 94 ㎎-dry cell/L, 4일째에서는 288 ㎎-dry cell/L였으나, 배양 9일째에는 2,043 ㎎-dry cell/L로 증가하였다. 그렇기 때문에 디에틸렌글리콜 이외의 유기물질을 첨가함으로써 분해균을 고농도로 포함하는 배양액을 얻을 수 있는 것이 명확해졌다.

「실시예 9」

1,4-디옥산 오염 사이트가 다른 장소에서 채취한 7종류의 토양에 있어서 디에틸렌글리콜을 첨가한 배지에서의 배양에 의한 SDIMO 보유균의 증식을 조사하였다. 또한 SDIMO 보유균의 증식을 SDIMO를 코드하는 유전자(SDIMO 유전자)에 유래하는 약 420 bp의 PCR 증폭산물의 증가로 평가하였다.

90 ㎖의 액체배지(배지 조성：K₂HPO₄：1 g/L, (NH₄)₂SO₄：1 g/L, NaCl：50 ㎎/L, MgSO₄·7H₂O：200 ㎎/L, FeCl₃：10 ㎎/L, CaCl₂：50 ㎎/L, pH：7.0)를 넣은 300 ㎖ 삼각 플라스크에 습중량 10 g의 토양을 투입하고, 디에틸렌글리콜을 최종농도 20 g/L가 되도록 첨가하여 28℃, 120 rpm으로 회전 진탕배양을 행하였다.

디에틸렌글리콜 첨가 직후 및 6일 후에 5 ㎖를 채취하여 원심분리(10,000×g, 4℃, 5분)에 의해 상청을 제거한 후, 토양 0.5 g(습중량)으로부터 DNA를 회수하였다. DNA 추출에는 토양 DNA 추출 키트(닛폰·진 주식회사 제조, 상품명：ISOIL for Beads Beating)를 사용하고, 추출한 DNA는 DNA 프래그먼트 정제 키트(도요보 주식회사 제조, 상품명：MagExtractor-PCR ＆ Gel Clean up-)를 사용하여 정제하였다.

SDIMO 유전자의 검출은 상기 비특허문헌 5에 기재된 프라이머 세트［NVC57, NVC66］를 사용한 PCR에 의해 행하였다. 이 프라이머 세트를 사용한 PCR에 의해 시료 중에 SDIMO 유전자가 존재하는 경우에는 약 420 bp의 PCR 증폭산물이 특이적으로 증폭되었다. PCR의 반응계는 50 ㎕(SapphireAmp Fast PCR Master Mix(다카라바이오 주식회사 제조) 25 ㎕, 프라이머 각 0.5 μM, DNA 1 ㎕, 멸균 초순수로 50 ㎕로 희석)로 하여, PCR 증폭은 94℃, 5분의 열변성 후, 94℃, 30초의 열변성, 57℃, 30초의 어닐링, 72℃, 1분의 신장을 35사이클 반복하고, 마지막에 72℃, 5분의 신장을 행하는 조건으로 실시하였다. PCR 후의 샘플은 1.5% 아가로스겔을 사용한 전기영동(100 V, 30분)을 행하고, SYBR Green I에 의해 15분간 염색한 후 자외선을 조사하여 약 420 bp의 PCR 증폭산물의 유무와 강도를 조사하였다. 도 8에 디에틸렌글리콜을 첨가한 액체배지 중에 있어서의 토양시료 1~7의 배양 전후(0일, 6일 후)의 SDIMO 유전자의 PCR 증폭결과를 나타낸다. 또한 도 8에 있어서 M으로 나타내어지는 레인은 DNA 래더 마커(다카라바이오 주식회사 제조, 상품명：100 bp DNA ladder), P로 나타내어지는 레인은 1,4-디옥산 자화균인 슈도노카디아속(Pseudonocardia sp.) D17의 DNA, N으로 나타내어지는 레인은 DNA 없는 음성 대조군이다.

배양 전의 토양에서는 대부분의 경우에 약 420 bp의 PCR 증폭산물은 극히 조금 검출되었을 뿐이었다. 한편, 배양 후의 토양에서는 모든 시료에 있어서 약 420 bp의 PCR 증폭산물이 명확하게 검출되었다. 배양 전후에 있어서의 약 420 bp의 PCR 증폭산물량을 비교하면, 배양 전에 증폭산물량이 많았던 토양시료 4 이외에는 배양 후에 증폭산물량이 현저히 늘어 있는 것이 확인되었다. 이상의 결과로부터, 디에틸렌글리콜을 사용하여 배양함으로써 토양 중에 극히 조금 존재하는 SDIMO 보유균이 우선적으로 증식한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 1,4-디옥산으로 오염된 물 또는 토양에 디에틸렌글리콜을 주입함으로써 오염환경 하에 종래 존재하고 있는 분해균을 우선적으로 늘리는 것이 가능하여, 분해균의 균체량이 늘어남으로써 1,4-디옥산 처리의 분해를 촉진시킬 수 있는 것이 확실해졌다.

(독립행정법인) 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터 NPMDNITEBP-01926 20140829 (독립행정법인) 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터 NPMDNITEBP-01927 20140829

Claims (16)

1. 디에틸렌글리콜을 1.0 wt% 이상 10.0 wt% 이하의 농도로 함유하는 배지를 사용하여, 미코박테륨속 D11(Mycobacterium sp. D11)(수탁번호：NITE BP-01926), 슈도노카디아속 D17(Pseudonocardia sp. D17)(수탁번호：NITE BP-01927), 슈도노카디아 디옥사니보란스(Pseudonocardia dioxanivorans) CB1190 중 1종 이상인 1,4-디옥산 분해균을 늘리는 것을 특징으로 하는 1,4-디옥산 분해균의 배양방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 배지가 액체배지인 것을 특징으로 하는 배양방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 배지가 옥수수 침지액, 카사미노산, 효모 추출물, 펩톤 중 1종 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
4. 제2항에 있어서,
   액체배지를 공급하면서 해당 액체배지의 공급량과 동량의 배양액을 추출하는 연속 배양인 것을 특징으로 하는 배양방법.
5. 1,4-디옥산을 포함하는 물에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 배양방법으로 배양한 미코박테륨속 D11(Mycobacterium sp. D11)(수탁번호：NITE BP-01926), 슈도노카디아속 D17(Pseudonocardia sp. D17)(수탁번호：NITE BP-01927), 슈도노카디아 디옥사니보란스(Pseudonocardia dioxanivorans) CB1190 중 1종 이상인 1,4-디옥산 분해균을 주입하고,
   상기 1,4-디옥산 분해균에 의해, 수중의 1,4-디옥산을 분해하는 것을 특징으로 하는 수처리방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 1,4-디옥산 분해균과 함께 디에틸렌글리콜을 주입하는 것을 특징으로 하는 수처리방법.
7. 1,4-디옥산을 포함하는 토양에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 배양방법으로 배양한 미코박테륨속 D11(Mycobacterium sp. D11)(수탁번호：NITE BP-01926), 슈도노카디아속 D17(Pseudonocardia sp. D17)(수탁번호：NITE BP-01927), 슈도노카디아 디옥사니보란스(Pseudonocardia dioxanivorans) CB1190 중 1종 이상인 1,4-디옥산 분해균을 주입하고,
   상기 1,4-디옥산 분해균에 의해, 토양 중의 1,4-디옥산을 분해하는 것을 특징으로 하는 토양처리방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 1,4-디옥산 분해균과 함께 디에틸렌글리콜을 주입하는 것을 특징으로 하는 토양처리방법.
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