JP2016077284A - 1,4−ジオキサン分解菌の培養方法、培地、1,4−ジオキサン分解菌を利用する1,4−ジオキサン処理方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ジエチレングリコールを含有する培地を用いて1,4−ジオキサン分解菌を増やすことを特徴とする1,4−ジオキサン分解菌の培養方法。
【選択図】図1
Description
2.前記培地が液体培地であることを特徴とする1.に記載の培養方法。
3.前記ジエチレングリコールの濃度が0.01mg/L〜100g/Lであることを特徴とする2.に記載の培養方法。
4.前記培地が、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンの少なくとも1種を含有することを特徴とする1.〜3.のいずれかに記載の培養方法。
5.前記1,4−ジオキサン分解菌が、Mycobacterium sp. D11(受託番号:NITE BP−01926)、Pseudonocardia sp. D17(受託番号:NITE BP−01927)、Pseudonocardia dioxanivorans CB1190の少なくとも1種であることを特徴とする1.〜4.のいずれかに記載の培養方法。
6.液体培地を供給しながら、該液体培地の供給量と同量の培養液を取り出す連続培養であることを特徴とする2.〜5.のいずれかに記載の培養方法。
7.ジエチレングリコールを含有することを特徴とする培地。
8.液体培地であることを特徴とする7.に記載の培地。
9.前記ジエチレングリコールの濃度が0.01mg/L〜100g/Lであることを特徴とする8.に記載の培地。
10.コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンの少なくとも1種を含有することを特徴とする7.〜9.のいずれかに記載の培地。
11.1,4−ジオキサンを含む水に、1.〜6.のいずれかに記載の培養方法で培養した1,4−ジオキサン分解菌を注入することを特徴とする水処理方法。
12.前記1,4−ジオキサン分解菌とともに、ジエチレングリコールを注入することを特徴とする11.に記載の水処理方法。
13.1,4−ジオキサンを含む土壌に、1.〜6.のいずれかに記載の培養方法で培養した1,4−ジオキサン分解菌を注入することを特徴とする土壌処理方法。
14.前記1,4−ジオキサン分解菌とともに、ジエチレングリコールを注入することを特徴とする13.に記載の土壌処理方法。
15.1.〜6.のいずれかに記載の培養方法により培養した1,4−ジオキサン分解菌。
16.15.に記載の1,4−ジオキサン分解菌を固定化した固定化担体。
17.1,4−ジオキサンを含む水、または土壌に、ジエチレングリコールを注入し、
前記1,4−ジオキサンを含む水、または土壌中に存在する1,4−ジオキサン分解菌の増殖を促進することを特徴とする1,4−ジオキサン処理方法。
本発明は、分解菌が、ジエチレングリコール存在下で他の微生物よりも優れた増殖性を示すという、これまでに知られていない全く新規な知見に基づくものである。分解菌が、ジエチレングリコール存在下で増殖性に優れている理由は不明であるが、分解菌は、他の微生物よりもジエチレングリコールを炭素源として利用する能力に優れているため、ジエチレングリコール存在下で優先的に増殖することができると推測される。そのため、ジエチレングリコール存在下では、他の微生物が生息していても分解菌を増やすことができる。すなわち、ジエチレングリコール存在下では、他の微生物を滅菌することなく、分解菌を増やすことができる。
Pseudonocardia dioxanivorans CB1190(以下、CB1190株という。)は、米国ATCCから購入することができる(ATCC 55486)。また、米国ATCCの他に、JCM(独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室)やドイツのDSMにおいても購入可能である。
分解菌を大量に増やすためには液体培地を使用することが好ましく、液体培地を供給しながら、液体培地の供給量と同量の分解菌を含む培養液を取り出す連続培養で1,4−ジオキサン分解菌を増やすことがさらに好ましい。
CB1190株、D11株、D17株を1,4−ジオキサン分解菌として使用した。1,4−ジオキサンを500mg/Lの濃度で含むCGY培地(カシトン:5g/L、グリセリン:5g/L、酵母エキス:1g/L)を用いて各分解菌を10日間培養した。培養後、遠心分離機にて集菌・洗浄し、菌体を20mLの生理食塩水と混合したものを植菌液とした。なお、植菌液は、分光光度計を用いて濁度を統一したもの(OD600:およそ10)を用いた。
D17株を、MGY培地(Malt Extract:10g/L、グルコース:4g/L、Yeast Extract:4g/L)で2週間培養した。
1,4−ジオキサンを含む実地下水(pH:7.38、1,4−ジオキサン:0.16mg/L、リン酸イオン:0.08mg/L、全窒素:36.5mg/L、全有機炭素量:11mg/L、化学的酸素要求量:33mg/L)に、硫酸アンモニウムおよびリン酸水素二カリウムをそれぞれ1g/Lの濃度になるように添加した後、ジエチレングリコールを20g/Lになるように加えて培養液を作成した。
この培養液650mLを1L容量のリアクターに加え、D17株を添加して(菌体濃度:157mg−dry cell/L)、6日間培養を行った。培養中は、28℃、pH7.0に制御し、0.65L/minのエアレーションを行った。
ジエチレングリコールをグルコースとした以外は実施例2と同様にして、分解菌を培養した。
実施例2、比較例1の培養液から、それぞれ1mLサンプリングし、1,4−ジオキサン分解活性を測定した。サンプリングは培養開始直後と、培養開始してから1〜6日目に行った。分解活性の測定方法は以下のとおりである。
=(C0−C24)×20mL/1000mL
C0(mg/L):培養液を添加していないブランク系を、24時間回転振盪培養した後の1,4−ジオキサン濃度。
C24(mg/L):培養液を添加した系を、24時間回転振盪培養した後の1,4−ジオキサン濃度。
300mL容量のバッフル付の三角フラスコに、1g/Lジエチレングリコールを含む液体培地(培地組成:K2HPO4:1g/L、(NH4)2SO4:1g/L、NaCl:50mg/L、MgSO4・7H2O:200mg/L、FeCl3:10mg/L、CaCl2:50mg/L、pH:7.3)を100mL加え、事前にMGY培地で培養したD17株を植菌して(初期菌体濃度:111mg−dry cell/L)、28℃、120rpmにて7日間、回転振盪培養を行った。
液体培地中のジエチレングリコールの濃度を5g/Lとした以外は実施例3と同様にして、分解菌を培養した。
「実施例5」
液体培地中のジエチレングリコールの濃度を10g/Lとした以外は実施例3と同様にして、分解菌を培養した。
「実施例6」
液体培地中のジエチレングリコールの濃度を20g/Lとした以外は実施例3と同様にして、分解菌を培養した。
「実施例7」
液体培地中のジエチレングリコールの濃度を30g/Lとした以外は実施例3と同様にして、分解菌を培養した。
培養終了後、吸引濾過にて培養液中の菌体をろ物として回収し、105℃で一晩乾燥した後、回収した菌体重量を測定した。測定した菌体重量値から、菌体濃度(mg−dry cell/L)を求めた。なお、各実施例では、同様の試験系を2本準備し、その平均値を菌体密度とした。培養7日目の菌体濃度から初期菌体濃度を差し引いたΔ菌体濃度により、菌体の増殖性を評価した。図5にΔ菌体濃度を示す。
実施例2で用いた1,4−ジオキサンを含む実地下水に、硫酸アンモニウムおよびリン酸水素二カリウムをそれぞれ1g/Lの濃度になるように添加した後、10g/Lになるように所定濃度のジエチレングリコール溶液を加えて培養液を作成した。
この培養液8Lを10L容量のリアクターに加え、D17株を添加して(初期菌体濃度:43.2mg−dry cell/L)、4L/minのエアレーションを行いながら、28℃にて9日間培養した。また、培養4日目に、コーンスティープリカーを濃度が5g/Lになるように一度のみ添加した。なお、培養期間中は、pH7.0±0.2に制御した。
培養液から1mLサンプリングし、1,4−ジオキサン分解活性を上記「1,4−ジオキサン分解活性の測定1」と同様にして測定した。サンプリングは培養開始直後と、培養開始してから1、2、3、4、5、7、9日目に行った。なお、4日目のサンプリングは、CSLを添加する直前に行った。測定結果を図6に示す。
上記「1,4−ジオキサン分解活性の測定2」でサンプリングした培養液中のジエチレングリコール濃度を、高速液体クロマトグラフィー(Waters Alliance 2695 検出器:RID)を用いて測定した。
「菌体濃度の測定」
培養開始直後と、培養開始してから4日目と9日目に培養液を150mLサンプリングし、メスシリンダーにて正確に100mL秤取った後、吸引濾過にて菌体をすべて回収・洗浄し、105℃で一晩乾燥した。なお、4日目のサンプリングは、コーンスティープリカーを添加する直前に行った。その後、乾燥重量を測定し、菌体濃度として算出した。
ジエチレングリコール濃度、および菌体濃度の経時変化を図7に示す。
菌体濃度は、培養0日目では94mg−dry cell/L、4日目では288mg−dry cell/Lであったが、培養9日目には2043mg−dry cell/Lと増加した。そのためジエチレングリコール以外の有機物質を添加することで分解菌を高濃度に含む培養液を得られることが明らかとなった。
1,4−ジオキサン汚染サイトの異なる場所から採取した7種類の土壌において、ジエチレングリコールを添加した培地での培養によるSDIMO保有菌の増殖を調査した。なお、SDIMO保有菌の増殖を、SDIMOをコードする遺伝子(SDIMO遺伝子)に由来する約420bpのPCR増幅産物の増加によって評価した。
90mlの液体培地(培地組成:K2HPO4:1g/L、(NH4)2SO4:1g/L、NaCl:50mg/L、MgSO4・7H2O:200mg/L、FeCl3:10mg/L、CaCl2:50mg/L、pH:7.0)を入れた300ml三角フラスコに、湿重量10gの土壌を投入し、ジエチレングリコールを終濃度20g/Lになるように添加して、28℃、120rpmで回転振盪培養を行った。
Claims (17)
- ジエチレングリコールを含有する培地を用いて1,4−ジオキサン分解菌を増やすことを特徴とする1,4−ジオキサン分解菌の培養方法。
- 前記培地が液体培地であることを特徴とする請求項1に記載の培養方法。
- 前記ジエチレングリコールの濃度が0.01mg/L〜100g/Lであることを特徴とする請求項2に記載の培養方法。
- 前記培地が、コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンの少なくとも1種を含有することを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の培養方法。
- 前記1,4−ジオキサン分解菌が、Mycobacterium sp. D11(受託番号:NITE BP−01926)、Pseudonocardia sp. D17(受託番号:NITE BP−01927)、Pseudonocardia dioxanivorans CB1190の少なくとも1種であることを特徴とする請求項
1〜4のいずれかに記載の培養方法。 - 液体培地を供給しながら、該液体培地の供給量と同量の培養液を取り出す連続培養であることを特徴とする請求項2〜5のいずれかに記載の培養方法。
- ジエチレングリコールを含有することを特徴とする培地。
- 液体培地であることを特徴とする請求項7に記載の培地。
- 前記ジエチレングリコールの濃度が0.01mg/L〜100g/Lであることを特徴とする請求項8に記載の培地。
- コーンスティープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンの少なくとも1種を含有することを特徴とする請求項7〜9のいずれかに記載の培地。
- 1,4−ジオキサンを含む水に、請求項1〜6のいずれかに記載の培養方法で培養した1,4−ジオキサン分解菌を注入することを特徴とする水処理方法。
- 前記1,4−ジオキサン分解菌とともに、ジエチレングリコールを注入することを特徴とする請求項11に記載の水処理方法。
- 1,4−ジオキサンを含む土壌に、請求項1〜6のいずれかに記載の培養方法で培養した1,4−ジオキサン分解菌を注入することを特徴とする土壌処理方法。
- 前記1,4−ジオキサン分解菌とともに、ジエチレングリコールを注入することを特徴とする請求項13に記載の土壌処理方法。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の培養方法により培養した1,4−ジオキサン分解菌。
- 請求項15に記載の1,4−ジオキサン分解菌を固定化した固定化担体。
- 1,4−ジオキサンを含む水、または土壌に、ジエチレングリコールを注入し、
前記1,4−ジオキサンを含む水、または土壌に存在する1,4−ジオキサン分解菌の増殖を促進することを特徴とする1,4−ジオキサン処理方法。
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