WO2016034741A1

WO2016034741A1 - Fusionsprotein und aufreinigungsverfahren

Info

Publication number: WO2016034741A1
Application number: PCT/EP2015/070393
Authority: WO
Inventors: Jörg LABAHN; Johann Kubicek; Frank Schäfer
Original assignee: Labahn Jörg
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2015-09-07
Publication date: 2016-03-10
Also published as: US20170260255A1; DE102014217793A1; EP3201328A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft u.a. ein Fusionsprotein, umfassend ein Protein von Interesse und ein Affinitäts-Tag, das Lysozym bindet. Lysozym kann zur Aufreinigung, Präzipitation oder Unterstützung der Kristallisation eines solchen Fusionsproteins eingesetzt werden. Ferner betrifft die Erfindung ein Bindungsagens, das eine Zielverbindung spezifisch bindet, wobei das Bindungsagens einen CDR3-Bereich aufweist, der von einem Einzeldomänen-Antikörper abgeleitet ist, aber keine Gerüstbereiche oder andere Elemente zur Stabilisierung des CDR3-Bereichs aufweist und wobei das Bindungsagens die Zielverbindung über den CDR3-Bereich bindet.

Description

„Fusionsprotein und Aufreinigungsverfahren"

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Bindungsagenzien, die eine Zielverbindung binden können. Die Bindungsagenzien sind insbesondere für die Therapie und als Nachweisagenzien zwecks Nachweis einer Zielverbindung verwendbar, beispielsweise in Assays für diagnostische Zwecke. Die Bindungsagenzien können zudem als Affinitäts-Tag verwendet werden.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Capture-System, umfassend ein Affinitäts-Tag und einen Affinitätsliganden, das zur Aufreinigung eines Proteins von Interesse verwendbar ist. Ferner werden spezifische Verwendungen des entsprechenden Systems beschrieben, insbesondere zur Kristallisation oder Aufreinigung eines Proteins von Interesse.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Im Stand der Technik besteht anhaltender Bedarf an der Bereitstellung neuer Bindungsagenzien die eine Bindungsaffinität für eine Zielverbindung aufweisen. Insbesondere besteht Bedarf an kleinen bindenden Verbindungen, die auf einfache Weise synthetisch und/oder rekombinant hergestellt werden können und die trotz ihrer kleinen Größe spezifisch an eine Zielverbindung binden können. Entsprechende kleine bindende Moleküle bieten auch den Vorteil, dass sie fähig sein könnten, Barrieren im Körper zu durchdringen, wie z. B. die Blut-Hirn-Schranke, die von herkömmlichen Bindungsagenzien (beispielsweise Antikörpern) aufgrund ihrer Größe nicht durchdrungen werden können. Entsprechende kleine Bindungsagenzien würden auf therapeutischen und diagnostischen Gebieten daher erhebliche Vorteile aufweisen. Somit ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von Verbindungen, die spezifisch an eine Zielverbindung binden können, die aber kleiner sind als beispielsweise Antikörper oder gewöhnlich verwendete Antikörperfragmente. Die rekombinante-DNA-Technologie ermöglicht die Herstellung gewünschter Proteine von Interesse in Wirtszellen. Derartige durch Wirtszellen hergestellte Polypeptide werden typischerweise vor ihrer Verwendung von den Proteinen der Wirtszelle abgetrennt, um sie in reiner Form zu erhalten. Auf Affinitätschromatographie basierte Verfahren sind oftmals für die Proteinaufreinigung bevorzugt. Affinitätschromotographie kann dazu verwendet werden, um Proteine mit hoher Ausbeute aus komplexen Gemischen zu reinigen. Die Affinitätschromatographie basiert auf der Fähigkeit von Proteinen, nichtkovalent aber dennoch spezifisch zu binden, beispielsweise an einen auf einem Träger immobilisierten Liganden für das gewünschte Protein, beispielsweise an einen Antikörper, der das aufzureinigende Protein bindet. Wenn das Protein von Interesse Affinität für ein Metallion aufweist, kann die Isolierung unter Verwendung von Metallaffinitätschromatographie durchgeführt werden, wie es beispielsweise bei IMAC-Verfahren der Fall ist.

Ferner wird ein Protein von Interesse oft durch Expression des Proteins von Interesse als Fusionsprotein gereinigt, wobei das Fusionsprotein das Protein von Interesse und ein oder mehrere Affinitäts-Tags aufweist. Das Affinitäts-Tag ermöglicht die Reinigung des Proteins von Interesse nach generalisierten Protokollen im Gegensatz zu den hochspezifischen Verfahren, die mit herkömmlicher Chromatographie verbunden sind. Diese Tags bieten die großen Vorteile bspw. herkömmlicher Metallaffinitäts-Tags (beispielsweise bei Verwendung eines poly-His-Tags), nämlich die Eignung zur kostengünstigen Reinigung im großen Maßstab sowie eine mögliche Reinigung unter denaturierenden Bedingungen und so weiter.

Im Stand der Technik sind mehrere derartiger Reinigungs-Tags bekannt, beispielsweise poly-His-Tag, Streptavidin-Tag, SBP-Tag, GST-Tag und ähnliche Reinigungs-Tags, die die Isolierung verschiedener Proteine über das gleiche Affinitäts-Tag ermöglichen. Trotz der zahlreichen Affinitäts-Tags, die bereits erhältlich sind, besteht im Stand der Technik weiterhin Bedarf an verbesserten Reinigungsverfahren, insbesondere an Verfahren, die das Reinigen des Proteins von Interesse unter Verwendung eines Affinitätsliganden erlauben, der entweder an einen festen Träger gebunden sein kann oder der die Aufreinigung des Proteins von Interesse ohne die Verwendung eines festen Trägers erlaubt.

Somit ist ferner eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Aufreinigung eines Proteins von Interesse.

Ferner ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von Mitteln zur Unterstützung der Kristallisation eines Proteins von Interesse. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung basiert auf der überraschenden Entdeckung, dass der isolierte CDR3-Bereich von Schwere-Ketten-Antikörpern (heavy chain antibodies), insbesondere der von Cameliden-Antikörpern abgeleiteten CDR3-Bereich (auch CDR3- Region genannt), als Bindungsagens zur Bindung einer Zielverbindung verwendet werden kann, sogar wenn die stabilisierenden Gerüstbereiche des Schwere-Ketten-Antikörpers (und/oder andere gewöhnlich verwendete stabilisierende Strukturen) entfernt sind bzw. nicht verwendet werden. Diese Entdeckung ist sehr überraschend, da bisher angenommen wurde, dass die stabilisierenden Gerüstbereiche oder ähnliche stabilisierende Mittel zwingend erforderlich sind, um dem CD3-Bereich die korrekte Konformation bzw. 3D-Struktur zu verleihen, um die Bindung des CDR3-Bereichs an seine Zielverbindung zu ermöglichen. Nun wurde aber gefunden, dass der CDR3-Bereich allein - ohne konformationsstabilisierende Strukturen - fähig ist, mit im Wesentlichen der gleichen Spezifität und/oder Affinität wie der Schwere-Ketten-Antikörper, von dem der CDR3-Bereich abgeleitet ist, an eine Zielverbindung zu binden. Diese Entdeckung ermöglicht die Bereitstellung von Bindungsagenzien, die sogar kleiner sind als herkömmliche Schwere-Ketten-Antikörper, die aber ihre Zielverbindung immer noch mit der gewünschten Spezifität und/oder Affinität binden.

Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung daher ein Bindungsagens bereit, das eine Zielverbindung spezifisch bindet, wobei das Bindungsagens einen CDR3-Bereich aufweist, der von einem Schwere-Ketten-Antikörper abgeleitet ist, aber keine Gerüstbereiche zur Stabilisierung des CDR3-Bereichs oder andere stabilisierende Strukturen zur Stabilisierung des CDR3-Bereichs aufweist und wobei das Bindungsagens die

Zielverbindung über den CDR3-Bereich bindet. Ferner wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein entsprechendes Bindungsagens aufweist.

Ein weiterer wesentlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung basiert auf dem Gedanken, ein spezifisches Affinitäts-Tag basiertes System zu verwenden, das es ermöglicht, ein Protein von Interesse zu reinigen, zu präzipitieren und/oder zu kristallisieren. Dieses System basiert auf der Verwendung von Lysozym als Affinitätsligand und der Verwendung eines Lysozym bindenden Affinitäts-Tags. Die Erfinder haben herausgefunden, dass diese spezifische Kombination eines Affinitäts-Tags, das Lysozym bindet, und Lysozym als Affinitätsligand erhebliche Vorteile bei der Reinigung, Präzipitation und/oder Kristallisation eines Proteins von Interesse bietet.

Ferner wird ein Fusionsprotein bereitgestellt, das ein Protein von Interesse und ein Affinitäts- Tag, das spezifisch Lysozym bindet, aufweist. Vorzugsweise wird das Fusionsprotein rekombinant hergestellt. Ferner wird ein Verfahren zur Aufreinigung eines Fusionsproteins bereitgestellt, das ein Protein von Interesse und ein Affinitäts-Tag, das spezifisch Lysozym bindet, aufweist, wobei das Verfahren einen Schritt aufweist, bei dem Lysozym als Affinitätsligand eingesetzt wird, der an das Affinitäts-Tag des Fusionsproteins bindet. Dadurch wird ein Komplex gebildet, der Lysozym und das aus der Probe zu reinigende Fusionsprotein aufweist. Der Komplex kann dann von der restlichen Probe abgetrennt und das Fusionsprotein aus dem Komplex freigesetzt werden. Lysozym kann in freier Form zu der das Fusionsprotein aufweisenden Probe gegeben werden, oder aber an einen Träger, wie bspw. einer Säule, immobilisiert vorliegen.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Komplex, der Lysozym als Affinitätsliganden aufweist, wobei das Lysozym an ein Fusionsprotein gebunden ist, welches ein Protein von Interesse und ein Lysozym bindendes Affinitäts-Tag aufweist. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor zur Expression eines Fusionsproteins, wobei das Fusionsprotein ein Protein von Interesse und ein Affinitäts-Tag, das spezifisch Lysozym bindet, aufweist. Ferner wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die einen entsprechenden Expressionsvektor aufweist. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Lysozym zwecks Unterstützung und/oder Ermöglichen der Kristallisation eines Fusionsproteins, das ein Protein von Interesse und ein Affinitäts-Tag, das Lysozym bindet, aufweist.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Lysozym zur Aufreinigung eines Fusionsproteins, das ein Protein von Interesse und ein Affinitäts-Tag, das Lysozym bindet, aufweist.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Lysozym zur Präzipitation eines Fusionsproteins, das ein Protein von Interesse und ein Affinitäts-Tag, das Lysozym bindet, aufweist.

Weitere Aufgaben, Merkmale, Vorteile und Erscheinungsformen der vorliegenden Anmeldung werden dem Fachmann aus der folgenden Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen ersichtlich werden. Es ist jedoch zu beachten, dass die folgende Beschreibung, die anhängenden Ansprüche und die spezifischen Beispiele, wenn sie bevorzugte Ausführungsformen der Anmeldung angeben, nur zur Veranschaulichung gegeben werden. Dem Fachmann werden nach dem Lesen des Folgenden verschiedene Veränderungen und Modifikationen im Umfang und Geist der offenbarten Erfindung nahe liegen. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder haben entdeckt, dass es im Gegensatz zu Ansichten im Stand der Technik möglich ist, den von einem Schwere-Ketten-Antikörper abgeleiteten CDR3-Bereich ohne seine Gerüstbereiche oder andere konformationsstabilisierende Strukturen als Bindungsagens zwecks Bindung einer Zielverbindung zu verwenden.

Somit wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Bindungsagens bereitgestellt, das spezifisch eine Zielverbindung bindet, wobei das Bindungsagens einen CDR3-Bereich aufweist, der von einem Schwere-Ketten-Antikörper abgeleitet ist, aber nicht die entsprechenden Gerüstbereiche oder andere Strukturen aufweist, die den CDR3-Bereich stabilisieren, und wobei das Bindungsagens die Zielverbindung über den CDR3-Bereich bindet. Der CDR3-Bereich gemäß der Erfindung ist aus einem Schwere-Kette-Antikörper abgeleitet. Der CDR3-Bereich ist vorzugsweise aus einem Schwere-Kette-Antikörper von Cameliden (wie z. B. Dromedaren, Kamelen oder Alpakas) abgeleitet, kann aber auch aus einem Schwere-Kette-Antikörper aus anderen Tieren abgeleitet sein, die entsprechende Antikörper erzeugen, wie z. B. Haie. Ein CDR3-Bereich ist von einem derartigen Schwere-Ketten- Antikörper„abgeleitet", wenn der CDR3-Bereich über seine gesamte Länge eine Homologie oder Identität mit dem entsprechenden CDR3-Bereich des Referenz-Schwere- Ketten- Antikörper von wenigstens 80 %, wenigstens 85 %, wenigstens 90 %, wenigstens 93 %, wenigstens 95 %, wenigstens 97 %, wenigstens 98 %, wenigstens 99 % oder 100 % aufweist. Der für die Zielverbindung spezifische CDR3-Bereich kann beispielsweise aus den vorstehend genannten Antikörpern erhalten werden. Verfahren mittels derer entsprechende

Schwere-Ketten-Antikörper gegen eine Zielverbindung erhalten werden können, sind dem Fachmann bekannt, beispielsweise durch Verwendung im Fachgebiet bekannter Immunisierungsverfahren. Beispielsweise kann das Dromedar, das Kamel oder der Hai mit der gewünschten Zielverbindung als Antigen immunisiert und die mRNA, die Schwere-Kette- Antikörper kodiert, anschließend isoliert werden. Durch reverse Transkription und

Polymerase-Kettenreaktion kann eine Genbibliothek von Einzeldomänen-Antikörpern, die mehrere Millionen Klone enthalten, erzeugt werden. Auch Screening-Verfahren, wie z. B. Phage-Display und Ribosomen-Display, können verwendet werden, um die das Antigen bindenden Klone zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung umfasst ferner den Erhalt geeigneter bindender CDR3-Bereiche aus Schwere-Kette-Antikörperbibliotheken mithilfe von Screening-Verfahren. Wenn ein geeigneter CDR3-Bereich identifiziert ist, kann er dank seiner kurzen Länge auch synthetisch hergestellt werden. Dies stellt einen beträchtlichen Vorteil gegenüber Bindungsagenzien des Standes der Technik dar, die aufgrund ihrer Größe üblicherweise rekombinant hergestellt werden müssen. Gemäß einer Ausführungsform weist der CDR3-Bereich eine Länge von 10 bis 30, vorzugsweise 12 bis 25 Aminosäuren auf. Der CDR3-Bereich entsprechender Schwere- Ketten-Antikörper verfügt über die ungewöhnliche Fähigkeit, fingerartige Ausläufer zu bilden, die in Hohlräume von Antigenen ragen können, beispielsweise in die Furche des aktiven Zentrums eines Enzyms. Der CDR3-Bereich kann beispielsweise konvexe Ausläufer oder Vorsprünge bilden, die beispielsweise die Furche einer Zielverbindung besetzen können. Somit bindet der CDR3-Bereich gemäß einer Ausführungsform an eine Furche, eine Tasche oder einen Canyon einer Zielverbindung. Der nichtstabilisierte CDR3-Bereich gemäß der vorliegenden Erfindung dringt in die Furche, die Tasche oder den Canyon der Zielverbindung ein und wird so durch die molekularen Wechselwirkungen zwischen dem CDR3-Bereich und den auskleidenden Aminosäuren der Furche, der Tasche oder des Canyons stabilisiert. Gemäß einer Ausführungsform kann der CDR3-Bereich die Bindung des natürlichen Substrats an die Tasche, Furche oder den Canyon der Zielverbindung, an den der CDR3- Bereich bindet, nachahmen.

Gemäß einer Ausführungsform ist der CDR3-Bereich nicht durch intramolekulare Bindungen, wie z.B. Disulfidbindungen, cyclisiert. Gemäß einer Ausführungsform enthält der CDR3- Bereich keine amino- und/oder carboxyterminalen Aminosäurereste, die eine Cyclisierung und damit Stabilisierung des CDR3-Bereichs ermöglichen würden. Gemäß einer Ausführungsform enthält der CDR3-Bereich keine Cysteinreste. Somit weist der CDR3- Bereich gemäß dieser Ausführungsform keinen Cysteinrest auf. Ein Cysteinrest im CDR3- Bereich erhöht das Risiko unspezifischer Reaktionen über den Cysteinrest (beispielsweise durch Bilden von Disulfidbindungen). Daher ist es bevorzugt, etwaige Cysteinreste, die in dem zur Bindung verwendeten CDR3-Bereich vorhanden sind, zu entfernen oder zu ersetzen. Beispielsweise kann ein in dem CDR3-Bereich vorhandener Cysteinrest durch andere Aminosäuren ersetzt werden, wie z.B. durch Serin oder Alanin oder andere geeigneten Aminosäuren. Vorzugsweise wird zur Substitution eine Aminosäure gewählt, die die Bindungsfähigkeit erhält oder sogar verbessert. Gemäß einer Ausführungsform besteht das Bindungsagens aus dem CDR3-Bereich. Der

Schutzbereich der vorliegenden Erfindung umfasst jedoch, den CDR3-Bereich an andere Verbindungen und/oder Strukturen zu konjugieren bzw. anzuheften, beispielsweise an Verbindungen, die die Halbwertszeit des CDR3-Bereichs verlängern, wie z.B. HSA, HES oder PEG, Markerverbindungen oder zytotoxische Agenzien. Auch ist eine Anheftung an andere Protein- oder Peptidverbindungen möglich, wobei beispielsweise der CDR3-Bereich über einen synthetischen Linker oder über einen Glycin- oder Alanin-Linker oder durch andere Verbindungsmittel zu einem Fusionskonstrukt konjugiert oder fusioniert ist. Die Konjugation und/oder Bindung kann kovalent oder nichtkovalent sein. Gemäß einer Ausführungsform führt die Konjugation aber nicht zu einer Stabilisierung der Konformation des CDR3-Bereichs, der als Bindungsagens verwendet wird. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bindet das Bindungsagens über den CDR3- Bereich mit der gleichen Spezifität und/oder Affinität an seine Zielverbindung wie der Schwere-Ketten-Antikörper, aus dem er abgeleitet ist und der die entsprechenden Gerüstbereiche aufweist. Wie vorstehend diskutiert, haben die Erfinder überraschend gefunden, dass der CDR3-Bereich von Schwere-Ketten-Antikörpern, der gemäß der vorliegenden Erfindung zur Bindung der Zielverbindung verwendet wird, seine Bindungsspezifität trotz des Umstands behält, dass die Konformation des CDR3-Bereichs nicht durch die Gerüstbereiche des Schwere- Kette- Antikörpers oder andere stabilisierende Strukturen stabilisiert wird. Dies hat den Vorteil, dass das Bindungsagens klein gestaltet werden kann und seine Herstellung zudem erheblich vereinfacht wird, da es synthetisch hergestellt werden kann und es nicht notwendig ist, beispielsweise den CDR3-Bereich zu cyclisieren oder konformationsstabilisierende Strukturen anzufügen.

Gemäß einer Ausführungsform bindet das Bindungsagens über den CDR3-Bereich Lysozym als Zielverbindung. Wie ausgeführt, kann das Bindungsagens auch aus dem CDR3-Bereich bestehen.

Zwecks Bindung von Lysozym weist das Bindungsagens gemäß einer Ausführungsform einen CDR3-Bereich auf, der eine Sequenz aufweist oder aus dieser besteht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

SEQ ID NO 1 : DSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDS

SEQ ID NO 2: DTSTWYRG YCGTN P N YFS Y

SEQ ID NO 3: GWSSLGSCGTNRNRYNY

SEQ ID NO 4: GYRNYGQCATRY

SEQ ID NO 5: GYRNYGQSATRY

SEQ ID NO 6: TRKYVPVRFALDQSSYDY

Die Beispiele dieser Anmeldung zeigen, dass die vorstehenden isolierten CDR3-Bereiche von Schwere-Kette-Antikörpern Lysozym binden können und daher als Bindungsagenzien für Lysozym eingesetzt werden können. Diese Bindungsagenzien, die wie ausgeführt auch aus einer der obigen Sequenzen bestehen können, können in vorteilhafter Weise auch als Affinitäts-Tag verwendet werden, das eine Affinität zu Lysozym aufweist. Dies ist nachfolgend noch im Detail beschrieben.

Ferner stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische oder diagnostische Zusammensetzung bereit, die ein Bindungsagens gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist. Aufgrund der kleinen Größe des Bindungsagens weist eine entsprechende pharmazeutische oder diagnostische Zusammensetzung mehrere Vorteile auf. Zunächst ist ihre einfache und sichere Herstellung für therapeutische und diagnostische Verwendungen von Vorteil. Ferner erlaubt die kleine Größe des Bindungsagens beispielsweise das Durchdringen von Barrieren im Körper, wie z.B. der Blut-Hirn-Schranke, die von größeren Molekülen, wie z.B. Antikörpern, nicht durchdrungen werden können. Das Bindungsagens gemäß der vorliegenden Erfindung kann analog zu herkömmlichen Antikörpern und Bindungsagenzien bei der Therapie und Diagnose verwendet werden. Beispielsweise kann das Bindungsagens zum Nachweis einer Zielverbindung verwendet werden, um so eine Diagnose auf der Grundlage des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins der Zielverbindung zu ermöglichen.

Ferner kann das Bindungsagens gemäß der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise als Affinitäts-Tag verwendet werden, das die einfache Isolierung eines Proteins von Interesse ermöglicht, wenn das Affinitäts-Tag an das Protein von Interesse fusioniert ist. Eine solche rekombinante Fusion kann beispielsweise durch Expression des Proteins von Interesse und des Affinitäts-Tags als Fusionskonstrukt erzielt werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung gemäß einer Ausführungsform ein Fusionsprotein bereit, das ein Protein von Interesse und ein Affinitäts-Tag aufweist, wobei das Affinitäts-Tag einen CDR3- Bereich aufweist oder daraus besteht, der von einem Schwere-Ketten-Antikörper abgeleitet ist, der jedoch keine Gerüstbereiche zur Stabilisierung des CDR3-Bereichs enthält. Vorzugsweise weist der CDR3-Bereich auch keine anderen stabilisierenden Strukturen auf. Wie vorstehend diskutiert, weisen die von entsprechenden Schwere-Ketten-Antikörpern abgeleiteten CDR3-Bereiche mehrere Vorteile auf, die sie zur Verwendung als Affinitäts-Tag besonders geeignet machen. Sie sind klein und benötigen überraschenderweise keine stabilisierenden Gerüstbereiche oder andere konformationsstabilisierenden Strukturen, um mit hoher Spezifität an eine Zielverbindung und somit einen Affinitätsliganden zu binden. Somit können sie leicht als Fusionsprotein zusammen mit dem Protein von Interesse exprimiert werden. Wie vorstehend diskutiert, weist der CDR3-Bereich, der die

Bindungsfunktion ausübt und damit als Affinitäts-Tag dienen kann, vorzugsweise eine Länge von 10 bis 30, besonders bevorzugt 12 bis 25 Aminosäuren auf. Gemäß einer Ausführungsform bildet der CDR3-Bereich einen fingerartigen Ausläufer oder Vorsprung, der in den Hohlraum, die Furche oder die Tasche eines Affinitätsliganden ragen kann, beispielsweise in die Furche des aktiven Zentrums eines Enzyms. Somit bindet der CDR3-

Bereich gemäß einer Ausführungsform an eine Furche, eine Tasche oder einen Canyon einer Zielverbindung, die als Affinitätsligand eingesetzt wird. Die Bindung wird erzielt, indem der CDR3-Bereich beispielsweise in die Furche, die Tasche oder den Canyon der Zielverbindung eindringt und durch die molekularen Wechselwirkungen zwischen dem CDR3-Bereich und den Aminosäuren, die die Furche, die Tasche oder den Canyon auskleiden, stabilisiert wird. Der Affinitätsligand weist daher vorzugsweise eine(n) entsprechende(n) Furche, Tasche oder Canyon auf und ist höchst bevorzugt ein Enzym, wie z.B. Lysozym. Diese bevorzugte Ausführungsform wird nachstehend ausführlicher beschrieben. Das Affinitäts-Tag ist vorzugsweise mit dem Protein von Interesse nicht verwandt und wird daher natürlich nicht als ein entsprechendes Fusionsprotein exprimiert.

Das rekombinante Fusionsprotein kann dann über den als Affinitäts-Tag dienenden CDR3- Bereich isoliert werden, der spezifisch an den entsprechenden Affinitätsliganden bindet. Der Affinitätsligand kann beispielsweise an einen festen Träger wie bspw. einer Säule immobilisiert sein oder er kann direkt in freier Form zu einem das Fusionsprotein aufweisenden Gemisch zugegeben werden, um das Fusionsprotein zu präzipitieren, wie nachfolgend für das bevorzugte Beispiel von Lysozym als Affinitätsligand beschrieben wird.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Äff initäts- Tag/Affinitätsligand-System, das auf der Verwendung von Lysozym als Affinitätsligand und einem spezifisch an Lysozym bindenden Affinitäts-Tag basiert. Dieses neue Äff initäts- Tag/Affinitätsligand-System, das auf der Verwendung von Lysozym als Affinitätsligand basiert, weist mehrere Vorteile und weitreichende Einsatzmöglichkeiten auf dem Gebiet der Proteinreinigung, Proteinpräzipitation und/oder Proteinkristallisation auf.

Gemäß einem weiteren Aspekt wird ein Fusionsprotein bereitgestellt, das ein Protein von Interesse und ein Affinitäts-Tag aufweist, das Lysozym binden kann. Ein solches Fusionsprotein, das bspw. rekombinant hergestellt werden kann, kann leicht durch das

Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Lysozym als Affinitätsligand aufgereinigt werden. Das Lysozym-bindende Affinitäts-Tag ist natürlicherweise nicht mit dem Protein von Interesse verbunden, sondern das Fusionskonstrukt wird bspw. durch rekombinante DNA-Technologie generiert.

Das Fusionsprotein gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung weist ein spezifisches Affinitäts-Tag, das an Lysozym bindet, auf und ermöglicht dadurch eine spezifische, affinitätsbasierte Isolierung des Fusionsproteins. Gemäß einer Ausführungsform ist das an Lysozym bindende Affinitäts-Tag entweder am N-Terminus oder am C-Terminus des Fusionsproteins angeordnet. Vorzugsweise ist das Affinitäts-Tag gemäß der vorliegenden

Erfindung am C-Terminus angeordnet. Die Lokalisation des Affinitäts-Tags kann aber von dem zu exprimierenden Fusionsprotein und seiner vorgesehenen Verwendung abhängen. Einer der Vorteile der Verwendung eines N-terminal angeordneten Affinitäts-Tags liegt darin, dass die Ausbeute des exprimierten Fusionsproteins erhöht ist, da ein zuverlässiger Kontext für eine wirkungsvolle Translation geboten wird. Die Verwendung eines N-terminalen

Affinitäts-Tags führt aber nicht immer zur Aufreinigung von Proteinen voller Länge, da fehlerhafte Translationsprodukte, die das Protein von Interesse nicht in voller Länge enthalten, aufgrund des N-terminalen Affinitäts-Tags mit aufgereinigt werden. Daher wird für die meisten Anwendungen ein am C-Terminus angeordnetes Affinitäts-Tag vorteilhaft sein, weil eine Aufreinigung des Fusionsproteins mit voller Länge im Vergleich zu Fusionen mit N- terminalem Affinitäts-Tag erhöht ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bindet das Affinitäts-Tag an das aktive Zentrum von Lysozym. Die Erfinder haben herausgefunden, dass es von Vorteil ist, wenn das Affinitäts-Tag an das aktive Zentrum von Lysozym bindet, da so eine hohe Spezifität für den Affinitätsliganden Lysozym erzielt wird. Ferner ermöglicht das Binden des Affinitäts-Tags an das aktive Zentrum von Lysozym die Verwendung milder Elutionsbedingungen bei der Aufreinigung des Fusionsproteins, beispielsweise bei Einsatz von Zuckern, die von Lysozym gebunden werden. Entsprechende Zucker können das Fusionsprotein bzw. das Affinitäts- Tag von dem aktiven Zentrum des Lysozyms verdrängen und es dadurch aus dem Komplex freisetzen. Dadurch kann das Fusionsprotein von dem Affinitätsliganden Lysozym getrennt werden, wie nachfolgend in Verbindung mit dem Aufreinigungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben wird. Dies fördert die Elution.

Gemäß einer Ausführungsform weist das Affinitäts-Tag ein Immunoglobulin-Molekül oder ein funktionelles Fragment davon, das Lysozym bindet, auf oder besteht daraus. Insbesondere kann das Immunoglobulin-Molekül ein Antikörper sein.

Der Begriff „Antikörper" bezeichnet insbesondere ein Protein, das wenigstens zwei schwere Ketten und zwei leichte Ketten aufweist, die durch Disulfidbindungen verbunden sind. Der Begriff „Antikörper" umfasst natürlich vorkommende Antikörper sowie alle rekombinanten Formen von Antikörpern, beispielsweise in Prokaryoten exprimierte Antikörper, nichtglycosylierte Antikörper, humanisierte Antikörper und chimäre Antikörper. Jede schwere Kette besteht aus einem Schwere-Kette-variablen-Bereich (VH) und einem Schwere- Kettekonstanten-Bereich (CH). Jede leichte Kette besteht aus einem Leichte-Kette-variablen- Bereich (VL) und einem Leichte-Kette-konstanten-Bereich (CL). Der Schwere-Kette- konstante-Bereich umfasst drei oder - im Fall von Antikörpern des IgM- oder IgE-Typs - vier

Schwere-Kette-konstante-Domänen (CH1 , CH2, CH3 und CH4), wobei die erste konstante Domäne CH1 dem variablen Bereich benachbart ist und durch einen Gelenkbereich mit der zweiten konstanten Domäne CH2 verbunden sein kann. Der Leichte-Kette-konstante-Bereich besteht nur aus einer konstanten Domäne. Die variablen Bereiche können ferner in Bereiche mit Hypervariabilität, die komplementaritätsbestimmende Bereiche (CDRs) genannt werden, mit dazwischen liegenden, stärker konservierten Bereichen, die Gerüstbereiche (FR) genannt werden, eingeteilt werden, wobei jeder variable Bereich drei CDRs und vier FRs aufweist. Die variablen Bereiche der schweren und leichten Ketten enthalten eine Bindungsdomäne, die mit einem Antigen wechselwirkt. Die konstanten Bereiche der Antikörper können die Bindung des Immunoglobulins an Wirtsgewebe oder -faktoren vermitteln, einschließlich an verschiedene Zellen des Immunsystems (beispielsweise Effektorzellen) und die erste Komponente (C1 q) des klassischen Komplementsystems.

Ferner umfasst der Begriff Immunoglobulin-Molekül oder ein funktionelles Fragment davon insbesondere, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Protein oder Glycoprotein, das aus einem

Antikörper abgeleitet ist und fähig ist, an das gleiche Antigen, insbesondere an das gleiche Epitop wie der Antikörper zu binden. Somit bezeichnet ein Fragment oder Derivat eines Antikörpers wie hier verwendet allgemein ein funktionelles Fragment oder Derivat, das an das Antigen binden kann. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist das Fragment oder Derivat eines Antikörpers einen Schwere-Kette-variablen-Bereich auf. Es wurde gezeigt, dass die Antigen-bindende Funktion eines Antikörpers auch von Fragmenten eines Antikörpers voller Länge oder Derivaten davon ausgeübt werden kann. Beispiele von Fragmenten oder Derivaten eines Antikörpers umfassen (i) Fab-Fragmente, monovalente Fragmente, die aus dem variablen Bereich und der ersten konstanten Domäne, jeweils von der schweren und der leichten Kette, bestehen; (ii) F(ab)₂-Fragmente, bivalente Fragmente, die zwei Fab-Fragmente umfassen, die am Scharnierbereich durch eine Disulfidbrücke verbunden sind; (iii) Fd-Fragmente, die aus dem variablen Bereich und der ersten konstanten Domäne CH1 der schweren Kette bestehen; (iv) Fv-Fragmente, die aus dem Schwere- Kette- und dem Leichte-Kette-variablen-Bereich eines einzelnen Arm eines Antikörpers bestehen; (v) scFv-Fragmente, Fv-Fragmente, die aus einer einzelnen Polypeptidkette bestehen; (vi) (Fv)₂-Fragmente, die aus zwei Fv-Fragmenten bestehen, die kovalent miteinander verbunden sind; (vii) eine Schwere-Kette-variable-Domäne; und (viii) Mehrfachkörper, die aus einem Schwere-Kette-variablen-Bereich und einem Leichte- Kette-variablen-Bereich bestehen, die kovalent derart miteinander verknüpft sind, dass die Verbindung des Schwere- Kette- und des Leichte-Kette-variablen-Bereichs intermolekular aber nicht intramolekular erfolgen kann. Diese Antikörperfragmente und -derivate können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, erhalten werden.

Vorzugsweise ist das Affinitäts-Tag von einem Schwere-Ketten-Antikörper abgeleitet. Schwere-Ketten-Antikörper sind im Fachgebiet gut bekannt und können beispielsweise, wie vorstehend ausführlich beschrieben, von Cameliden erhalten werden. Die Verwendung entsprechender Schwere-Ketten-Antikörper hat den Vorteil, dass diese vorzugsweise an das aktive Zentrum des Enzyms binden, gegen das sie erzeugt wurden. Daher sind entsprechende Schwere-Ketten-Antikörper als Affinitäts-Tag zur Bindung an das aktive Zentrum von Lysozym besonders geeignet. Ferner hat die Verwendung von Schwere-Ketten-

Antikörpern oder funktionellen, d.h. Lysozym-bindenden, Fragmenten davon den Vorteil, dass diese Affinitäts-Tags vergleichsweise klein sind, was ein Vorteil für ein Affinitäts-Tag ist, da die produzierende Wirtszelle nur wenig Kapazitäten für die Herstellung des Affinitäts-Tags einsetzen muss und so die Expression des Proteins von Interesse mit hoher Ausbeute gewährleistet wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist das in dem Fusionsprotein enthaltene Affinitäts-Tag ein oder mehrere Merkmale des vorstehend beschriebenen Bindungsagens auf, das einen CDR3-Bereich eines Schwere-Ketten-Antikörpers aufweist. Somit ist das Affinitäts-Tag vorzugsweise ein von einem Schwere-Kette-Antikörper abgeleiteter CDR3-

Bereich. Die Merkmale und bevorzugten Ausführungsformen des CDR3-Bereichs sind oben ausführlich beschrieben und es wird auf die obige Offenbarung verwiesen, die auch hier gilt. Wie vorstehend diskutiert, weist der isolierte CDR3-Bereich entsprechender Schwere- Ketten- Antikörper mehrere Vorteile auf, die ihn für die Verwendung als Affinitäts-Tag geeignet machen. Er ist klein und muss überraschenderweise nicht von Gerüstbereichen oder anderen Strukturen stabilisiert werden, um mit hoher Spezifität eine Zielverbindung und damit einen Affinitätsliganden binden zu können. Somit kann ein solcher CDR3-Bereich leicht als Fusionsprotein zusammen mit dem Protein von Interesse exprimiert werden und hier als Affinitäts-Tag dienen. Wie vorstehend diskutiert, weist der CDR3-Bereich, der die Bindungsfunktion an den Affinitätsliganden ausübt, vorzugsweise eine Länge von 10 bis 30, vorzugsweise 12 bis 25 Aminosäuren auf. Gemäß einer Ausführungsform bildet der CDR3- Bereich wenigstens einen fingerartigen Ausläufer oder Vorsprung, der in den Hohlraum, die Furche oder die Tasche des Affinitätsliganden Lysozym ragen kann. Somit bindet der CDR3- Bereich gemäß einer Ausführungsform an eine Furche, eine Tasche oder einen Canyon eines Lysozyms, das als Affinitätsligand verwendet wird. Die Bindung wird erzielt, indem der CDR3-Bereich beispielsweise in die Furche, die Tasche oder den Canyon von Lysozym eindringt und durch molekulare Wechselwirkungen zwischen dem CDR3-Bereich und den Aminosäuren, die die Furche, die Tasche oder den Canyon auskleiden, stabilisiert wird.

Gemäß einer Ausführungsform weist das Affinitäts-Tag eine Sequenz auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

SEQ ID NO 1 : DSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDS

SEQ ID NO 2: DTSTWYRG YCGTN P N YFS Y

SEQ ID NO 3: GWSSLGSCGTNRNRYNY

SEQ ID NO 4: GYRNYGQCATRY

SEQ ID NO 5: GYRNYGQSATRY

SEQ ID NO 6: TRKYVPVRFALDQSSYDY oder das Affinitäts-Tag besteht aus einer solchen Sequenz. Wie in den Beispielen gezeigt ist, binden die entsprechenden isolierten, nichtstabilisierten CDR3-Bereiche spezifisch an

Lysozym und sind somit für die Verwendung als Affinitäts-Tag geeignet. In SEQ ID NO: 5 wurde im Vergleich mit SEQ ID NO: 4 ein Cystein gegen ein Serum ausgetauscht.

Gemäß einer Ausführungsform weist das Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung eine proteolytische Schnittstelle auf. Vorzugsweise trennt die proteolytische Schnittstelle das

Protein von Interesse von dem Affinitäts-Tag und ermöglicht damit die Entfernung des Affinitäts-Tags von dem Fusionsprotein, um so das Protein von Interesse ohne Affinitäts-Tag zu erhalten. Vorzugsweise ist die proteolytische Schnittstelle eine Peptidsequenz, die typischerweise etwa 5-30 Aminosäuren aufweist und ein Erkennungsmotiv darstellt, das eine Schnittstelle enthält. Vorzugsweise wird eine proteolytische Schnittstelle verwendet, die von keiner Protease der Wirtszelle erkannt wird, in der das Fusionsprotein mittels eines Expressionsvektors exprimiert wird. Dies um zu gewährleisten, dass das Fusionsprotein mit dem Affinitäts-Tag exprimiert wird, um so die Isolierung des Fusionsproteins zu ermöglichen und nicht zuvor von den Proteasen der Wirtszelle gespalten wird. Es gibt verschiedene Proteasen, die später zur Freisetzung bzw. Abspaltung des Affinitäts-Tags von dem Fusionsprotein verwendet werden können, so dass anschließend das Protein von Interesse ohne Affinitäts-Tag aufgereinigt werden kann. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor zur Expression eines Fusionsproteins, das ein Protein von Interesse und einen Lysozym bindenden Affinitäts-Tag aufweist. Wie vorstehend beschrieben, kann das Affinitäts-Tag gemäß einer Ausführungsform einen CDR3-Bereich aufweisen oder aus einem CDR3-Bereich bestehen, der aus einem Schwere-Ketten-Antikörper abgeleitet ist, aber nicht mit den entsprechenden Gerüstbereichen zur Stabilisierung des CDR3-Bereichs verbunden ist. Das Affinitäts-Tag kann Lysozym binden. Der Expressionsvektor ermöglicht die Expression eines Fusionsproteins, das ein Protein von Interesse und ein Lysozym bindendes Affinitäts-Tag gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist. Der Expressionsvektor weist ein oder mehrere funktionelle Elemente auf, die die Expression des Fusionsproteins in einer Wirtszelle ermöglichen. Diese funktionellen Elemente können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus einem Promoter, einem Enhancer, einer Transkriptionsterminations-Signalsequenz, einer Poly(A)-Stelle, einem Intron zum Erhöhen der Expression des Fusionsproteins und einer sekretorischen Signalsequenz zum Sekretieren des Fusionsproteins. Eine sekretorische Signalsequenz ist eine Peptidsequenz, die typischerweise etwa 10 bis 30 Aminosäuren aufweist, vorzugsweise etwa 15 bis 30 Aminosäuren. Die sekretorische Signalsequenz ist gewöhnlich am N-Terminus des Expressions-Fusionsproteins angeordnet und ermöglicht die Sekretion des Fusionsproteins, d. h. den Durchtritt durch eine Zellmembran, beispielsweise in die Zellkultur oder extrazelluläres Medium hinein oder in den periplasmatischen Raum. Hierbei wird die

Signalsequenz üblicherweise abgespalten, so dass dann das Fusionsprotein sekretiert wird. Im Fachgebiet sind mehrere geeignete sekretorische Signalsequenzen bekannt, die die Sekretion aus eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen erlauben. Geeignete sekretorische Signalsequenzen werden beispielsweise in WO 2008/000445, dessen Offenbarung durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird, beschrieben.

Geeignete Promoter, die die Expression der Fusionsproteine in prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen ermöglichen, sind dem Fachmann gut bekannt und müssen daher nicht weiter beschrieben werden. Geeignete Promoter umfassen bspw. den CMV-Promoter, den SV40-Promoter, den lacZ-Promoter, den Ubiquitin-Promoter, regulierbare Promoter oder konstitutive Promoter und dergleichen. Auch Enhancersequenzen zum Hochregulieren der Expression eines Fusionsproteins sind dem Fachmann bekannt. Enhancersequenzen können aus jedem eukaryotischen oder prokaryotischen Wirt erhalten werden, vorzugsweise in Verbindung mit dem entsprechenden Promoter, der verwendet wird. Enhancerelemente können CMV-Enhancer oder einen oder mehrere glucoseabhängige Elemente und dergleichen umfassen. Entsprechende Enhancerelemente sind im Fachgebiet sehr gut bekannt, ebenso wie Promoter/Enhancer- Kombinationen, die ebenfalls gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.

Ferner kann der vorstehend beschriebene Expressionsvektor weitere Transkriptionsund/oder Translationssignale enthalten, die vorzugsweise von dem entsprechenden Wirt erkannt werden, wie z. B. transkriptionsregulatorische Signale und Translationsinitiationssignale. Transkriptions- und/oder Translationssignale können aus jedem eukaryotischen, prokaryotischen, viralen, bakteriellen, fungalen oder pflanzlichen Ursprung stammen, vorzugsweise aus menschlichen Wirten oder Tierwirten, beispielsweise Säugerwirten, vorzugsweise in Verbindung mit den entsprechenden Promotern, die verwendet werden. Zu diesem Zweck kann abhängig von der Beschaffenheit der Wirtszellen eine breite Vielfalt an transkriptions- und translationsregulatorischen Sequenzen eingesetzt werden. Soweit die Wirtszelle die transkriptionsregulatorischen Signale und Translationsinitiationssignale erkennt, die in dem Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten sind, können auch die natürlich vorkommenden 5'-Bereiche, die benachbart zu Komponenten des Fusionsproteins liegen, im Expressionsvektor erhalten bleiben und für die Translationsregulation gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Es können aber auch andere regulatorischen Signale verwendet werden. Die Gestaltung entsprechender Expressionsvektoren ist dem Fachmann bekannt.

Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen regulatorischen Sequenzen kann der Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung einen Replikationsursprung umfassen. Geeignete Replikationsursprünge umfassen beispielsweise, sind aber nicht darauf beschränkt, ColE1 -, pSC101 -, SV40-, ori-pMP1 - und M13-Replikationsursprünge. Abhängig von der verwendeten Wirtszelle sollte der Replikationsursprung entweder in prokaryotischen oder in eukaryotischen Wirtszellen oder in beiden aktiv sein.

Geeignete Wirtszellen umfassen bspw. prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen, beispielsweise bakterielle, fungale, pflanzliche, menschliche und tierische Wirtszellen.

Bevorzugte prokaryotische Wirtszellen können beispielsweise aus Bakterien abgeleitet sein, wie z. B. aus Escherichia coli, B. subtilis, Salmonella, Pneumococcus und so weiter, oder aus Algen, Pilzen und so weiter. Ferner können eukaryotische Wirtszellen verwendet werden, wie z. B. tierische Zellen oder menschliche Zellen, beispielsweise Nagerzellen, wie z. B. CHO-Zellen. Zellen aus eukaryotischen Organismen sind besonders bevorzugt, wenn posttranslationale Modifikationen, beispielsweise spezifische Glycosylierungen, des Proteins von Interesse erforderlich sind. Die Wirtszelle kann auch aus Hefe abgeleitet sein. Geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann auch bekannt.

Ferner kann der eukaryotische Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung ein oder mehrere selektierbare Markergene aufweisen. Geeignete Selektionsmarker sind im Fachgebiet gut bekannt und können bspw. aus der Gruppe von eukaryotischen oder prokaryotischen Selektionsmarkern ausgewählt werden. Die Selektionsmarker können bspw. eine Resistenz gegen Antibiotika wie bspw. Ampicillin, Hygromycin, Kanamycin, Neomycin oder dergleichen verleihen. Weitere Selektionsmarker umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, bspw. DHFR, GS und dergleichen.

Ferner wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor aufweist. Dieser wurde im Detail oben beschrieben und es wird auf die entsprechende Offenbarung verwiesen.

Ferner wird ein Verfahren zur Aufreinigung eines Fusionsproteins bereitgestellt, das ein Protein von Interesse und ein Bindungsagens gemäß der vorliegenden Erfindung als Affinitäts-Tag aufweist, wobei ein Affinitätsligand, der das Affinitäts-Tag des Fusionsproteins binden kann, zur Aufreinigung des Fusionsproteins verwendet wird. Das Fusionsprotein und insbesondere das enthaltende Affinitäts-Tag weisen vorzugsweise die vorstehend beschriebenen Merkmale auf. Es wird auf die obige Offenbarung verwiesen. Wie vorstehend erläutert, weist das Bindungsagens, das als Affinitäts-Tag verwendet wird, einen CDR3- Bereich auf, der von einem Schwere-Ketten-Antikörper abgeleitet ist, enthält aber keine Gerüstbereiche und vorzugsweise auch keine anderen Strukturen zur Stabilisierung des CDR3-Bereichs. Gemäß einer Ausführungsform besteht das als Affinitäts-Tag verwendete

Bindungsagens aus einem solchen CDR3-Bereich. Der Affinitätsligand und das Fusionsprotein bilden einen Komplex aus, der von der restlichen Probe abgetrennt werden kann, um so das Fusionsprotein zu isolieren. Wie ausgeführt, kann das Affinitäts-Tag gemäß einer Ausführungsform Lysozym binden. Geeignete, an Lysozym bindende Sequenzen wurden vorstehend offenbart.

Ferner wird ein Verfahren zur Aufreinigung eines Fusionsproteins aus einer das Fusionsprotein aufweisenden Probe bereitgestellt, wobei das Fusionsprotein ein Protein von Interesse und ein Affinitäts-Tag aufweist, das Lysozym bindet. Das Fusionsprotein und insbesondere das Affinitäts-Tag weisen vorzugsweise die vorstehend beschriebenen

Merkmale auf. Es wird auf die vorstehende Offenbarung verwiesen, die auch hier gilt.

Ein wichtiges Merkmal des Verfahrens ist es, dass Lysozym als Affinitätsligand eingesetzt wird, um das Affinitäts-Tag des Fusionsproteins spezifisch zu binden. Der Affinitätsligand Lysozym wird durch das Affinitäts-Tag des Fusionsproteins gebunden, wodurch ein Komplex gebildet wird, der das Fusionsprotein und Lysozym aufweist. Zur Aufreinigung des Fusionsproteins kann der Komplex von der restlichen Probe abgetrennt werden.

Wie vorstehend beschrieben, kann das entsprechende Fusionsprotein leicht unter Verwendung von Lysozym als Affinitätsligand gereinigt werden. Das verwendete Lysozym kann ein c-Typ-, g-Typ- oder i-Typ-Lysozym sein. Vorzugsweise ist das Lysozym ausgewählt aus der Gruppe von c-Typ-Lysozymen, die die Fähigkeit aufweisen, beta-(1 ,4)- glycosidischen Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure und N-Acetylglcosamin innerhalb von Peptidoglycanen spalten zu können. Besonders bevorzugt stammt das c-Typ- Lysozym von einem Säuger, Vogel oder Reptil, bevorzugter von einem Vogel- und höchst bevorzugt von Hühnern. Das als Affinitätsligand verwendete Lysozym kann aus natürlichen Quellen erhalten oder auch rekombinant hergestellt werden.

Gemäß einer Ausführungsform wird Lysozym zu einer Probe zugegeben, die das Fusionsprotein aufweist. Die Probe kann beispielsweise ein Lysat sein, vorzugsweise ein geklärtes Lysat, oder aber ein Kulturmedium, das das Fusionsprotein aufweist. Die Zugabe von Lysozym zu der Probe hat zur Folge, dass das Fusionsprotein in Form eines Komplexes, der das Fusionsprotein und Lysozym aufweist, präzipitiert wird. Entsprechend wird Lysozym in einer Menge bzw. Konzentration eingesetzt, so dass es zur Ausfällung der Komplexe kommt. Hier kommt es wohl zu einer Konformationsänderung, die die Fällung begünstigt. Diese Ausführungsform, bei der das Lysozym in freier Form zu der Probe gegeben wird, hat den Vorteil, dass das Fusionsprotein ohne die Verwendung einer festen Matrix, wie sie bei herkömmlichen Affinitätschromatographien oftmals verwendet wird, die auf den Einsatz von Affinitätsliganden basieren, aufgereinigt werden kann. Daher erlaubt diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Aufreinigungsverfahrens, die keinen festen Träger zur Aufreinigung verwendet, die kostenbewußte Aufreinigung eines Proteins von Interesse durch Nutzung des Umstands, dass Lysozym ein Fusionsprotein präzipitieren kann, sofern das Fusionsprotein einen Affinitäts-Tag aufweist, insbesondere einen CDR3-Bereich eines Schwere-Ketten- Antikörpers, das Lysozym bindet.

Gemäß einer Ausführungsform liegt das Lysozym, das als Affinitätsligand verwendet wird, jedoch immobilisiert an einen festen Träger vor. Auch hier wird ein Komplex an dem Träger ausgebildet. Ein entsprechendes Reinigungsverfahren kann gemäß dem gut bekannten Prinzip von Affinitätssystemen (wie bspw. His-Tag basierten Systemen), bei denen das Target mittels an Säulen immobilisierten Affinitätsliganden gebunden wird, durchgeführt werden. Lysozym kann direkt oder bspw. über ein Linkermolekül an den festen Träger gebunden werden. Geeignete feste Träger, die bei einem entsprechenden Affinitätschromatographie-Reinigungsverfahren verwendet werden können, wie bspw. Säulen oder Partikel, sind im Fachgebiet bekannt und benötigen daher keine weitere Beschreibung. Die restliche Probe kann dann von dem gebildeten Komplex abgetrennt werden. Sofern gewünscht, kann der Komplex gegebenenfalls vor Trennung des Fusionsproteins von dem Affinitätsliganden Lysozym gewaschen werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Fusionsprotein von dem Lysozym abgetrennt und somit aus dem Komplex freigesetzt. Gemäß einer Ausführungsform wird die Freisetzung, hier auch als„Elution" bezeichnet, durch die Verwendung einer Elutionslösung erzielt. Die Elution kann auf verschiedene Arten erzielt werden. Bspw. können Zucker, Peptide, an Lysozym bindende Affinitäts-Tags in freier Form sowie andere Agenzien eingesetzt werden, die eine Affinität gegen die Bindungsstelle von Lysozym haben und daher das über den Affinitäts-Tag gebundene Fusionsprotein aus dem Komplex verdrängen können. Gemäß einer Ausführungsform, die eine sehr milde Elution des Fusionsproteins erlaubt, wird eine Elutionslösung verwendet, die wenigstens einen Zucker aufweist, der durch das aktive Zentrum von Lysozym gebunden wird. Diese Ausführungsform ist besonders geeignet, wenn ein Affinitäts-Tag verwendet wird, das an das aktive Zentrum von Lysozym bindet. Vorzugsweise ist ein solcher Affinitäts-Tag ein CDR3-Bereich, der von einem wie vorstehend beschriebenen Schwere-Ketten-Antikörper abgeleitet ist. Es wird auf die obige Offenbarung verwiesen, die auch hier gilt. Die Elutionslösung kann das natürliche Substrat des Enzyms enthalten, bspw. ausgewählt aus der Gruppe von Peptidoglycanen, insbesondere aus der Gruppe von Peptidoglycanen, die 1 ,4-beta-Verknüpfungen zwischen N-Acetylmuraminsäure- und N-Acetyl-D-glucosaminresten aufweisen. Vorzugsweise ist der Zucker in der Elutionslösung im Überschuss enthalten, um die Freisetzung des Affinitäts- Tags aus dem aktiven Zentrum des Lysozyms zu fördern. Dies ist besonders bevorzugt, wenn ein Affinitäts-Tag verwendet wird, das an das aktive Zentrum von Lysozym bindet, da der Überschuss an Zucker das Fusionsprotein leicht von dem Lysozym verdrängen kann, wodurch das Fusionsprotein aus dem Komplex freigesetzt wird.

Ferner wird mit der vorliegenden Erfindung ein Komplex bereitgestellt, der Lysozym und ein Fusionsprotein aufweist, das ein Protein von Interesse und ein Lysozym bindendes Affinitäts- Tag aufweist. Ein entsprechender Komplex kann beispielsweise in vorteilhafter Weise zur

Kristallisation des enthaltenen Fusionsproteins verwendet werden, um die Analyse des Proteins von Interesse zu ermöglichen. Lysozym ist ein Protein, das leicht kristallisiert werden kann, und es wurde gefunden, dass es zur Unterstützung der Kristallisation eines Fusionsproteins verwendet werden kann, das ein Protein von Interesse und ein Lysozym bindendes Affinitäts-Tag aufweist. Diese Merkmale erlauben selbst die Kristallisation eines

Proteins von Interesse, das anderweitig nicht oder nur schwer zu Kristallisieren ist. Der Komplex gemäß der vorliegenden Erfindung kann daher auch für diesen Zweck verwendet werden. Die vorstehend beschriebene Verwendung eines lysozymbindenden CDR3-Bereichs eines Schwere-Ketten-Antikörpers als Affinitäts-Tag stellt eine bevorzugte Ausführungsform dar, die den Vorteil hat, dass das Affinitäts-Tag sehr klein ist, wodurch das Risiko gesenkt wird, dass die dreidimensionale Struktur des Proteins von Interesse verändert wird. Geeignete, an Lysozym bindende Sequenzen wurden oben beschrieben.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Lysozym zur Aufreinigung eines Fusionsproteins, das ein Protein von Interesse und ein Lysozym bindendes Affinitäts-Tag aufweist. Die Einzelheiten des entsprechenden Reinigungsverfahrens sind vorstehend beschrieben und es wird auf die vorstehende Offenbarung verwiesen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Lysozym zur Präzipitation eines Fusionsproteins, das ein Protein von Interesse und ein Affinitäts-Tag aufweist, das Lysozym bindet. Wie in den Beispielen gezeigt wird, führt die Bindung des mit einem Lysozym bindenden Affinitäts-Tag versehenen Fusionsproteins an Lysozym zu Konformationsänderungen, die zu einer verringerten Löslichkeit des Lysozym- Fusionsprotein-Komplexes führen, so dass der Komplex dann präzipitiert. Die Präzipitation erfolgt schnell und umfassend. Daher kann die verringerte Löslichkeit des Proteinkomplexes auf einfache Weise dazu genutzt werden, den Komplex von der restlichen Probe durch verschiedene Mittel, wie z. B. Zentrifugation, Sedimentation u.ä. abzutrennen. Wie vorstehend beschrieben, ist eine entsprechende präzipitationsbasierte Reinigung sehr kosten effektiv und zeitsparend und ermöglicht die Aufreinigung des Fusionsproteins ohne die Notwendigkeit einer affinitätsbasierten Säulenchromatographie.

Ferner ist ein entsprechendes Präzipitationsverfahren zum Nachweis eines Proteins bspw. in einem Assay von Vorteil. Hier kann eine entsprechende Präzipitation beispielsweise dazu verwendet werden, um die lokale Konzentration des nachzuweisenden Proteins und dadurch die Empfindlichkeit des Assays zu erhöhen. Es kann auch zur Quantifizierung eines Proteins von Interesse durch Hinzufügen einer zweiten enzymatischen oder biochemischen Reaktion zu dem vorstehend beschriebenen Präzipitationsvorgang verwendet werden. Entsprechende Verfahren können auch für diagnostische Zwecke verwendet werden.

Beispiele für die Verwendung der vorliegenden Erfindung in diagnostischen Assays umfassen bspw. die Bestimmung der Konzentration eines Proteins oder einer Verbindung von Interesse in klinischen Proben, wie bspw. Enzyme, die für bestimmte Typen von Erkrankung indikativ sind, Entzündungsvorgänge- oder Markerproteine aus Pathogenen, wie z. B. Viren, die gewöhnlich in nur geringer Konzentration vorhanden sind. Ein

Präzipitationsvorgang gemäß der Erfindung würde daher die Empfindlichkeit von Assays dieses besonderen Typs erhöhen.

Das Fusionsprotein weist vorzugsweise ein oder mehrere der vorstehend erläuterten Merkmale auf. Es wird auf die entsprechende Offenbarung verwiesen. Das Protein von Interesse kann von jeder Art sein. Der Begriff „Protein" bezeichnet ein Molekül, das ein Polymer von Aminosäuren aufweist, die durch Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Der Begriff „Protein" umfasst Polypeptide jeder Länge (beispielsweise mit mehr als 50 Aminosäuren) und Peptide (beispielsweise 2-49 Aminosäuren). Der Begriff umfasst Polypeptide und/oder Peptide mit jeder Aktivität oder Bioaktivität, einschließlich beispielsweise bioaktive Polypeptide, wie z. B. enzymatische Proteine oder Peptide (beispielsweise Proteasen, Kinasen, Phosphatasen), Rezeptorproteine oder -peptide, Transporterproteine oder -peptide, bakterizide und/oder endotoxinbindende Proteine, Strukturproteine oder -peptide, Immun-Polypeptide, Toxine, Antibiotika, Hormone, Wachstumsfaktoren, Impfstoffe und dergleichen. Das Polypeptid kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Peptidhormonen, Interleukinen, Gewebeplasminogenaktivatoren, Zytokinen, Immunoglobulinen, insbesondere Antikörpern oder Antikörperfragmenten oder Varianten davon. Das Immunoglobulin kann von jedem Isotyp sein. Sehr oft werden IgG- Moleküle (beispielsweise lgG1 ) als therapeutische Proteine hergestellt oder benötigt. Ein Antikörperfragment ist jedes Fragment eines Antikörpers, das wenigstens 20 Aminosäuren des gesamten Antikörpers aufweist, vorzugsweise wenigstens 100 Aminosäuren, und das die Fähigkeit aufweist, ein Antigen zu binden. Das Antikörperfragment kann bspw. den Bindungsbereich eines Antikörpers umfassen, wie z. B. ein Fab-Fragment, ein F(ab)2- Fragment, Mehrfachkörper, die mehrere Bindungsdomänen umfassen, wie z. B. Diabodies, Triabodies oder Tetrabodies, Einzeldomänen-Antikörper oder Affibodies. Eine Antikörpervariante ist bspw. ein Derivat eines Antikörpers oder Antikörperfragments mit der gleichen Bindungsfunktion aber beispielsweise einer veränderten Aminosäuresequenz. Der Antikörper und/oder das Antikörperfragment kann eine murine leichte Kette, eine menschliche leichte Kette, eine humanisierte leichte Kette, eine menschliche schwere Kette und/oder eine murine schwere Kette umfassen, sowie aktive Fragmente oder Derivate davon. Somit kann er/es beispielsweise murin, menschlich, chimär oder humanisiert sein. Das Protein von Interesse ist vorzugsweise ursprünglich nicht mit dem in dem Fusionsprotein verwendeten Affinitäts-Tag verbunden und ist vorzugsweise kein Schwere-Ketten-Antikörper oder Fragment davon, wenn ein von einem Schwere-Ketten-Antikörper abgeleiteter CDR3- Bereich als Affinitäts-Tag verwendet wird.

BEISPIELE

Beispiel 1

Die Affinität der von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Lysozym-bindenden Peptide, die als Affinitäts-Tag eingesetzt werden können, wurde untersucht. Die Aminosäuresequenz der Affinitäts-Tags P2 - P6 entspricht den als SEQ ID NO: 2 - 6 gezeigten Sequenzen und sind aus einem CDR3-Bereich eines Schwere-Kette-Antikörpers abgeleitet. Die Affinitäts-Tags P2 bis P6 wurden N-terminal an GFP als Modellprotein von Interesse fusioniert, so dass ein Fusionsprotein erzeugt wurde, das GFP (Protein von Interesse) und einen Lysozym bindenden Affinitäts-Tag (P2 bis P6) aufwies. Das GFP- Protein wies zusätzlich ein His-Tag am C-Terminus auf. Die Affinität der erhaltenen GFP- Fusionsproteine für Lysozym wurde bestimmt. Die Ergebnisse der Messungen sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt:

Die Ergebnisse zeigen, dass die kleinen Affinitäts-Tags gemäß der vorliegenden Erfindung, die aus dem CDR3-Bereich eines Schwere-Ketten-Antikörpers bestehen bzw. davon abgeleitet sind, trotz des Umstands, dass sie nicht von Gerüstbereichen oder anderen stabilisierenden Strukturen stabilisiert werden, Lysozym mit hoher Affinität binden können. Die Affinität kann durch geeignete Aminosäuresubstitutionen in der Peptidsequenz des Affinitäts-Tags weiter erhöht werden. Dies kann beispielsweise durch Molecular Modeling unterstützt werden.

Beispiel 2:

Beispiel 2 zeigt, dass das Lysozym-bindende Affinitäts-Tag gemäß der vorliegenden

Erfindung zur Präzipitation und somit zur Aufreinigung eines Fusionsproteins verwendet werden kann, welches ein Protein von Interesse und das Affinitäts-Tag aufweist. Das Fusionsprotein P5-GFP weist am N-Terminus einen für Lysozym spezifischen Affinitäts-Tag auf. Bei dem Affinitäts-Tag P5 (siehe SEQ ID NO: 5) wurde im Vergleich zu dem Äff initäts- Tag P4 (siehe SEQ ID NO: 4) ein Cystein gegen ein Serin ausgetauscht. Das Fusionsprotein

P5-GFP wies zusätzlich C-terminal einen His-Tag auf und wurde in E. coli exprimiert. Anschließend wurde Lysozym zur Präzipitation des P5-GFP-Fusionsproteins verwendet. Dabei wurden zwei Proben geprüft. Eine Probe wies das geklärte bakterielle Lysat auf (Probe 1 ), während die andere Probe P5-GFP enthielt, das unter Verwendung von Ni-NTA- Superflow-Harz (Qiagen) gemäß Anleitung des Herstellers vorgereinigt und damit konzentriert war (Probe 2). Anschließend wurde das Gemisch zentrifugiert. Wie in Fig. 1 gezeigt, präzipitiert Lysozym das P5-GFP-Fusionsprotein. Die Bindung von Lysozym an das Affinitäts-Tag des P5-GFP-Fusionsproteins führt zu einem Komplex, der aufgrund einer Konformationsänderung des Lysozyms präzipitiert. Der präzipitierte Komplex ist in Fig. 1 als gelbes Pellet sichtbar. Probe 2, die das über den zusätzlichen His-Tag vorgereinigte P5- GFP-Fusionsprotein enthielt, führte aufgrund der höheren Konzentration des Fusionsproteins zu einem größeren Pellet. Wie in Fig. 1 gezeigt, führt die Zugabe von Lysozym zu dem geklärten Lysat ebenfalls zu einer Präzipitation des Fusionsproteins und ermöglicht damit die schnelle und einfache Isolierung des Fusionsproteins.

Die erhaltenen P5-GFP-Lysozym-Komplexe wurden dann durch Gelfiltration gereinigt und mittels SDS-Page und Coomassie-Färbung sowie photometrische Analyse einzelner Fraktionen bei OD = 509 nm analysiert. Fig. 2 zeigt die photometrische Analyse einzelner, durch Gelfiltration gereinigter Fraktionen. Die relative Fluoreszenz wurde als Funktion der Wellenlänge aufgetragen. Die höchste Absorbanz wurde in Einklang mit dem Anregungs- Emissionsspektrum von GFP bei OH = 509 nm beobachtet. Es wurden verschiedene Konzentrationen geprüft. Die Ergebnisse zeigen, dass bei einer bestimmten Konzentration die sofortige Präzipitation der Komplexe erfolgt. Hierdurch werden über 90 % und sogar über 95 % des Proteins von Interesse ausgefällt.

Beispiel 3:

Hier wurde die Verwendung und die Spezifität des Affinitäts-Tags für Lysozym (Lysotag) zur Proteinreinigung bestimmt. 1000 μΙ GFP-His, GFP-Strep und P5-GFP, gepuffert in 100 mM NaCI, 50 mM Tris, pH-Wert = 7,5 wurden in Eppendorf-Röhrchen gegeben, dann wurde Lysozym zugegeben und die Proben wurden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zugabe von Lysozym führte zu einer erhöhten Trübung der P5-GFP-Probe, die bei den GFP-His- und GFP-Strep-Proben nicht beobachtet wurde. Anschließend wurden die Proben 15 Minuten bei 4 ^<Ό zentrifugiert, was zu einer Pelletierung der P5-GFP enthaltenden Probe führte, nicht jedoch bei GFP-His und GFP-Strep. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt, die die Spezifität der Präzipitation von P5-GFP durch

Zugabe von Lysozym belegt. (1 ) GFP-His, (2) GFP-Strep, (3) P5-GFP. A: Proben vor der Zugabe von Lysozym. B: Proben nach der Zugabe von Lysozym. Die P5-GFP Probe erscheint nach der Zugabe von Lysozym trübe. C: Proben nach Zentrifugation mit 12.000 g bei 4 ^<Ό. Die Zugabe von Lysozym führte zur Präzipitation der P5-GFP Probe, was an dem gelblichen Pellet nach der Zentrifugation ersichtlich ist. Das Pellet enthält die gebildeten

Komplexe. Bei den Kontrollproben wurde kein Effekt beobachtet. Die His-GFP Probe war auch nach der Zentrifugation klar, bei der Strep-GFP Probe zeigte sich ein weißliches Pellet nach der Zentrifugation. Dies belegt, dass die Präzipitation spezifisch durch die Interaktion des Lysozyms mit dem P5-Tag hervorgerufen wurde und nicht durch eine unspezifische Proteinaggregation induziert wurde, die bspw. durch die Zugabe von Lysozym zu der Probe hervorgerufen wird. Es ist anzumerken, dass das GFP bei dem Präzipitationsvorgang nicht denaturiert wird und seine Fluoreszenz während des gesamten Reinigungsvorgangs bewahrt. Im Überstand war GFP auch kaum noch nachweisbar, was die Effizienz der Methode unterstreicht. Damit wird ein schnelles, kostengünstiges und effektives Reinigungsverfahren bereitgestellt, das ohne Trägermaterialien wie bspw. Säulen durchführbar ist.

Beispiel 4:

Weitere Untersuchungen wurden durchgeführt, um zu zeigen, dass die Präzipitation auch nicht durch eine unspezifische Wechselwirkung zwischen Lysozym und GFP verursacht wird, sondern auf eine spezifische Interaktion zwischen dem Lysozym und dem Affinitäts-Tag zurückzuführen ist. Ferner sollte gezeigt werden, dass das Konzept der vorliegenden Erfindung mit verschiedenen Proteinen von Interesse umsetzbar ist.

In Beispiel 4 wurde Interferon-alpha als Protein von Interesse verwendet, das N-terminal mit dem Lysozym-bindenden Affinitäts-Tag P5 (siehe SEQ ID NO: 5) versehen wurde. Hierdurch wurde ein Fusionsprotein erhalten, das Interferon-alpha (Protein von Interesse) und einen Lysozym bindenden Affinitäts-Tag (P5) aufwies. Die Zugabe von Lysozym führte zu einer sofortigen Präzipitation des den Lysozym-bindenden Affinitäts-Tag aufweisenden Fusionsproteins. Die Präzipitation des Komplexes wurde durch Zentrifugation unterstützt, so das eine Art Pellet erzeugt wurde, das die gebildeten Komplexe enthält. Die Ergebnisse der

Gelelektrophorese sind in Fig. 4 gezeigt.

In der ersten Bahn (neben dem Marker) wurde die Probe, die Lysozym und das mit einem Tag versehene Fusionsprotein enthielt (vor der Zentrifugation) auf das Gel tragen. Wie zu sehen ist, umfasst die Probe Lysozym und das mit dem Affinitäts-Tag versehene

Fusionsprotein. In der dritten Bahn neben dem Marker (die zweite Bahn ist frei) wurde der Überstand aufgebracht. Wie zu sehen ist, umfasst der Überstand überschüssiges Lysozym und nur geringe Restmengen des Fusionsproteins. Dies zeigt, dass durch die Zugabe von Lysozym beinahe das gesamte Fusionsprotein enthaltend Interferon-alpha wirkungsvoll präzipitiert wurde. Benachbart dazu wurden verschiedene Konzentrationen des Pellets auf das Gel aufgetragen. Wie zu sehen ist, umfasst das präzipitierte Pellet das Interferon-alpha enthaltende Fusionsprotein und Lysozym.

Claims

ANSPRÜCHE

1 . Fusionsprotein, umfassend ein Protein von Interesse und ein Affinitäts-Tag, das Lysozym bindet.

2. Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 , wobei das Affinitäts-Tag des Fusionsproteins eines oder mehrere der in den Ansprüchen 8 bis 1 1 definierten Merkmale des CDR3- Bereichs aufweist.

3. Verfahren zur Aufreinigung eines Fusionsproteins gemäß Anspruch 1 oder 2 aus einer das Fusionsprotein aufweisenden Probe, wobei bei dem Verfahren Lysozym als Affinitätsligand eingesetzt wird und wobei das Affinitäts-Tag des Fusionsproteins an Lysozym bindet, um so einen Komplex zu bilden.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei a) das Lysozym mit der Probe in Kontakt gebracht wird, um so den das Fusionsprotein und Lysozym aufweisenden Komplex zu präzipitieren oder

b) das Lysozym immobilisiert an einen Träger vorliegt und das Fusionsprotein über das Lysozym an den Träger gebunden wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei die restliche Probe abgetrennt wird und vorzugsweise das Fusionsprotein aus dem Komplex freigesetzt wird.

6. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 5, wobei das

Fusionsprotein unter Verwendung einer Elutionslösung freigesetzt wird, die einen Zucker aufweist, der durch Lysozym gebundenen wird.

7. Bindungsagens, das eine Zielverbindung spezifisch bindet, wobei das Bindungsagens einen CDR3-Bereich aufweist, der von einem Schwere-Kette-Antikörper abgeleitet ist, aber keine Gerüstbereiche oder andere Elemente zur Stabilisierung des CDR3- Bereichs aufweist und wobei das Bindungsagens die Zielverbindung über den CDR3- Bereich bindet.

8. Bindungsagens gemäß Anspruch 7, wobei das Bindungsagens aus dem CDR3- Bereich besteht.

9. Bindungsagens gemäß Anspruch 7 oder 8 mit einem oder mehreren der folgenden Merkmale: a) der CDR3-Bereich des Bindungsagens bindet die Zielverbindung mit der gleichen Spezifität und/oder Affinität wie ein Schwere-Ketten-Antikörper, der die Gerüstbereiche aufweist;

b) der CDR3-Bereich weist eine Länge von 10 bis 30, vorzugsweise 12 bis 25, Aminosäuren auf;

c) der CDR3-Bereich bindet an eine Furche, eine Tasche oder einen Canyon einer Zielverbindung;

d) der CDR3-Bereich enthält keine amino- und/oder carboxyterminalen Aminosäurereste, die eine Cyclisierung ermöglichen würden;

e) der CDR3-Bereich ahmt die natürliche Substratbindung an die Tasche, die Furche oder den Canyon der Zielverbindung nach, an die der CDR3-Bereich bindet, und/oder

f) der CDR3-Bereich weist keinen Cysteinrest auf.

10. Bindungsagens gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 9, wobei das Bindungsagens über den CDR3-Bereich Lysozym als Zielverbindung bindet.

1 1 . Bindungsagens gemäß Anspruch 10, wobei das Bindungsagens einen CDR3-Bereich aufweist, der eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis 6 aufweist oder aus einer dieser Sequenzen besteht.

12. Fusionsprotein, umfassend ein Protein von Interesse und ein Affinitäts-Tag, wobei das Affinitäts-Tag einen CDR3-Bereich aufweist, der von einem Schwere-Ketten-Antikörper abgeleitet ist, aber keine Gerüstbereiche zur Stabilisierung des CDR3-Bereichs aufweist, wobei der CDR3-Bereich vorzugsweise eines oder mehrere der in den

Ansprüchen 8 bis 1 1 definierten Merkmale des CDR3-Bereichs aufweist.

13. Verwendung von Lysozym zur Aufreinigung, Präzipitation oder Unterstützung der Kristallisation eines Fusionsproteins gemäß Anspruch 1 oder 2.