CN112062812B - 多肽、抗溶菌酶人工抗体及其应用 - Google Patents

多肽、抗溶菌酶人工抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多肽、抗溶菌酶人工抗体及其应用，本发明设计了一段特定序列的多肽，并使用此多肽成功制备了一种新型抗溶菌酶人工抗体。该人工抗体由特定序列的多肽和金纳米颗粒骨架共同构成，具有制备过程简单、热稳定性高、与溶菌酶结合能力强等优点。该人工抗体可作为溶菌酶的非竞争型抑制剂，并可用于溶菌酶检测等应用。

Description

多肽、抗溶菌酶人工抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种人工抗体的多肽、人工抗体及其应用，应用于纳米生物材料及生物医学技术领域。
背景技术
溶菌酶又被称为胞壁质酶是一种碱性的糖苷水解酶，能够作用于N-乙酰氨基葡萄糖及N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键，从而将某些细菌细胞壁中的黏多糖分解成为糖肽，具备很强的杀菌能力。溶菌酶种类繁多，其中人体内的溶菌酶是多种疾病的标志物，比如胃癌患者体内的溶菌酶表达与癌细胞的分化水平密切相关。基于以上认识，需要开发能够对体液或血清中溶菌酶含量进行特异性快速检测的试剂。
抗体具有专一、高效、以及能够进行特异性识别等优点，能够实现对其靶向抗原的特异性快速检测。目前开发出的可用于溶菌酶含量检测的试剂包括单克隆抗体、基因免疫抗体等，但这些抗体普遍存在制备过程复杂、稳定性差等缺点。因此，需要开发一种制备过程简单且稳定性高的抗溶菌酶抗体。
随着纳米技术与生物技术的不断融合发展，纳米材料被广泛地应用于生物医学领域如生物传感分析等。多肽自身并不能识别并结合溶菌酶，需将多肽固定到纳米骨架上并对其构象进行调控使其形成特定的构象后，才能实现对溶菌酶的特异性识别与结合。现有技术以金纳米颗粒(AuNPs)作为载体，制备出了一种靶向溶菌酶活性位点的抗溶菌酶人工抗体，可以作为一种溶菌酶的竞争性抑制剂。参见[1]Yan G H et al.Artificialantibody created by conformational reconstruction of the complementary-determining region on gold nanoparticles[J].PNAS,2018,115(1),E34-E43。
发明内容
为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种多肽、抗溶菌酶人工抗体及其应用，本发明抗溶菌酶人工抗体可作为溶菌酶的非竞争型抑制剂，并能用于溶菌酶检测。本发明人工抗体由特定序列的多肽和金纳米颗粒骨架共同构成，具有制备过程简单、热稳定性高、与溶菌酶结合能力强等优点。该人工抗体可作为溶菌酶的非竞争型抑制剂，并可用于溶菌酶检测等应用。
为达到上述发明创造目的，本发明采用如下技术方案：
一种多肽CL2，为如下(A)或(B)中的任意一种多肽：
(A)含有序列1所示的氨基酸序列的多肽；
(B)在不改变关键结合残基的条件下，将序列1所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失、和/或添加、和/或延长的由含有序列1所示的氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
作为本发明优选的技术方案，所述序列1所示的多肽序列如下：
Gly-Tyr-Cys-Gly-Thr-Asn-Pro-Asn-Tyr-Phe-Ser-Cys-Asp。
一种抗溶菌酶人工抗体，为如下(1)和(2)中的任意一种人工抗体：
(1)用含有序列1所示氨基酸序列的多肽功能化纳米粒子，得到的抗溶菌酶人工抗体；
(2)在不改变关键结合残基的条件下，将序列1所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失、和/或添加、和/或延长的由含有序列1所示的氨基酸序列的多肽衍生的多肽，通过功能化纳米粒子，得到的抗溶菌酶人工抗体。
作为本发明优选的技术方案，在多肽序列中间特定位置结合了两个半胱氨酸，并通过这两个半胱氨酸中的巯基与金纳米颗粒表面上金原子间形成两个Au-S共价键进行固定，使多肽在金纳米颗粒表面形成特定的构象；并通过调整金纳米颗粒表面多肽的密度调控多肽的构象和人工抗体的活性，制备得到抗溶菌酶人工抗体AuNP+CL2。
一种抗溶菌酶人工抗体在制备溶菌酶检测试剂中的应用。
一种抗溶菌酶人工抗体在制备溶菌酶的非竞争型抑制剂中的应用。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
1.本发明中在靶向溶菌酶活性位点的抗溶菌酶人工抗体的基础上，发明了一种靶向溶菌酶上非活性位点抗原表位的抗溶菌酶人工抗体，可作为一种溶菌酶的非竞争性抑制剂；
2.本发明将在多肽中间特定位置设计了两个半胱氨酸，并通过两个半胱氨酸的巯基与金纳米颗粒表面上金原子间的两个Au-S共价键进行固定，使多肽在金纳米颗粒表面形成特定的构象；这和现有技术将两个半胱氨酸放置到多肽序列的头尾显著不同，并由此带来对多肽构象的不同调控，制备出新型抗溶菌酶人工抗体；该人工抗体能够特异性地识别并结合溶菌酶活性位点侧面的表位，可作为溶菌酶的非竞争型抑制剂及溶菌酶检测试剂。
附图说明
图1为本发明优选实施例通过调整多肽密度调控多肽构象和人工抗体活性。
图2为本发明优选实施例人工抗体AuNP+CL2的紫外光谱图。
图3为本发明优选实施例人工抗体AuNP+CL2的DLS粒径分布图。
图4为本发明优选实施例人工抗体AuNP+CL2与溶菌酶的特异性结合性能表征。
图5为本发明优选实施例人工抗体AuNP+CL2与溶菌酶的结合动力学性能表征。
图6为本发明优选实施例人工抗体AuNP+CL2对溶菌酶的非竞争性抑制表征。
图7为本发明优选实施例人工抗体AuNP+CL2的热力学稳定性检测。
具体实施方式
以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
在本实施例中，进行多肽和抗溶菌酶人工抗体的设计如下：
1.多肽序列的设计
设计了多肽序列CL2:
Gly-Tyr-Cys-Gly-Thr-Asn-Pro-Asn-Tyr-Phe-Ser-Cys-Asp。
该多肽通过序列中的半胱氨酸的巯基固定在金纳米颗粒表面，并形成特定的构象。
2.人工抗体AuNP+CL2的制备
参照公开专利文献号为CN105884888A基于金纳米粒子的人工抗体构建方法，将设计的多肽序列嫁接在金纳米颗粒表面制备抗溶菌酶人工抗体AuNP+CL2。
3.通过调整多肽密度调控多肽构象和人工抗体活性
为实现对人工抗体中多肽构象的调控，通过调整金纳米颗粒表面多肽密度对其构象进行调控。将不同数量的多肽CL2固定在金纳米颗粒表面，并使用BiacoreT200对其与溶菌酶的结合能力进行了测定，如图1所示。金纳米颗粒表面的多肽密度影响了多肽的构象进而影响了与溶菌酶结合的能力，当3.6纳米的金纳米颗粒表面修饰10～30条多肽时，能够得到与溶菌酶具有较理想的结合能力的人工抗体。当金纳米颗粒表面修饰20条多肽时能够得到与溶菌酶具有较强结合能力的人工抗体AuNP+CL2。
4.多肽嫁接后金纳米颗粒的粒径表征
准备金纳米溶胶和表面接上多肽的人工抗体两份样品，分别用紫外-可见分光光度计以及动态光散射粒径检测仪(DLS)进行表征。图2是多肽嫁接前后金纳米颗粒的紫外吸收光谱，结果表明多肽嫁接后金纳米颗粒的表面等离子共振吸收峰发生红移，证明多肽在金纳米颗粒表面的成功嫁接。图3是多肽嫁接前后金纳米颗粒水合的粒径表征，结果表明多肽嫁接后纳米颗粒的粒径明显增加，再次证明了多肽在金纳米颗粒表面的成功嫁接。
5.人工抗体AuNP+CL2与溶菌酶的特异性结合表征
为检测人工抗体AuNP+CL2与溶菌酶的特异性结合性能，使用BiacoreT200检测了AuNP+CL2与溶菌酶(HEWL)、牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白(IgG)的结合能力，如图4所示。人工抗体AuNP+CL2与溶菌酶之间有明显的结合，但是与BSA和IgG没有明显的结合，说明人工抗体AuNP+CL2能够与溶菌酶进行特异性结合。
6.人工抗体AuNP+CL2与溶菌酶的结合强度表征
为测定人工抗体AuNP+CL2与溶菌酶的结合强度，使用BiacoreT200检测了AuNP+CL2与溶菌酶结合的动力学谱图和平衡解离常数KD，如图5所示。人工抗体AuNP+CL2与溶菌酶的平衡解离常数KD＝5.74E-11，通过对比发现人工抗体AuNP+CL2与溶菌酶的结合强度比天然抗体与溶菌酶的结合强度高出三个数量级。这些证明了人工抗体AuNP+CL2具有比天然抗体更好的结合溶菌酶的能力。
7.人工抗体AuNP+CL2对溶菌酶的非竞争性抑制表征
为测定人工抗体AuNP+CL2对溶菌酶的非竞争性抑制，将不同浓度的AuNP+CL2作为抑制剂参与溶菌酶酶促动力学曲线的测定，并通过米氏方程对酶促动力学曲线进行拟合，如图6所示。人工抗体AuNP+CL2浓度的改变只影响酶促反应的最大反应速度Vmax，并不会对米氏常数Km造成影响。不同浓度的AuNP+CL2对溶菌酶活性的抑制作用符合非竞争性抑制的特点，这说明人工抗体AuNP+CL2可作为溶菌酶的非竞争型抑制剂，同时也说明人工抗体不是直接结合到溶菌酶的活性口袋，这也和公开专利文献号为CN105884888A基于金纳米粒子的人工抗体构建方法的结合位点显著不同。
8.人工抗体AuNP+CL2的热力学稳定性
为测试人工抗体AuNP+CL2的热力学稳定性，首先将AuNP+CL2放入沸水中水浴30min，然后测定水浴前后人工抗体与溶菌酶的结合能力，如图7所示。通过对比人工抗体AuNP+CL2水浴前后对溶菌酶活性的抑制效果，发现沸水浴后的人工抗体AuNP+CL2结合溶菌酶的性能较之前几乎没有变化。大多数天然抗体经过高温处理之后会导致抗体结构发生不可逆的变化从而失去活性，因此该人工抗体相比于天然抗体具有优良的热稳定性。
在靶向溶菌酶活性位点的抗溶菌酶人工抗体的基础上，本实施例靶向溶菌酶上不同抗原表位的抗溶菌酶人工抗体，可作为一种溶菌酶的非竞争性抑制剂，对医工结合的纳米生物材料及生物医学技术发展具有重要意义。
上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明多肽、抗溶菌酶人工抗体及其应用的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海大学
<120> 多肽、抗溶菌酶人工抗体及其应用
<141> 2020-06-11
<160> 1
<210> 1
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Tyr Cys Gly Thr Asn Pro Asn Tyr Phe Ser Cys Asp
1 5 10 15

Claims (5)

1.一种多肽CL2，其特征在于，所述多肽CL2的氨基酸序列如序列1所示，所述序列1所示的多肽序列如下：
Gly-Tyr-Cys-Gly-Thr-Asn-Pro-Asn-Tyr-Phe-Ser-Cys-Asp。
2.一种抗溶菌酶人工抗体，其特征在于，为如下人工抗体：
采用序列1所示氨基酸序列的多肽功能化纳米粒子，使3.6nm的金纳米粒子表面修饰10～30条多肽，得到的抗溶菌酶人工抗体。
3.根据权利要求2所述抗溶菌酶人工抗体，其特征在于：在多肽序列中间特定位置结合了两个半胱氨酸，并通过这两个半胱氨酸中的巯基与金纳米颗粒表面上金原子间形成两个Au-S共价键进行固定，使多肽在金纳米颗粒表面形成特定的构象；并通过调整金纳米颗粒表面多肽的密度调控多肽的构象和人工抗体的活性，制备得到抗溶菌酶人工抗体AuNP +CL2。
4.一种权利要求2所述抗溶菌酶人工抗体在制备溶菌酶检测试剂中的应用。
5.一种权利要求2所述抗溶菌酶人工抗体在制备溶菌酶的非竞争型抑制剂中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114316054A (zh) * 2021-12-28 2022-04-12 上海大学 一种基于银纳米粒子的人工抗体及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102014217793A1 (de) * 2014-09-05 2016-03-10 Jörg Labahn Fusionsprotein und Aufreinigungsverfahren
CN105884888A (zh) * 2016-04-14 2016-08-24 上海大学 一种基于金纳米粒子的人工抗体构建方法
CN106699890A (zh) * 2016-10-31 2017-05-24 上海大学 基于金纳米粒子的靶向表皮生长因子受体egfr的人工抗体及其制备方法
CN108822214A (zh) * 2018-06-18 2018-11-16 上海大学 一种多肽及其抗弹性蛋白酶的金纳米抗体

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102014217793A1 (de) * 2014-09-05 2016-03-10 Jörg Labahn Fusionsprotein und Aufreinigungsverfahren
CN105884888A (zh) * 2016-04-14 2016-08-24 上海大学 一种基于金纳米粒子的人工抗体构建方法
CN106699890A (zh) * 2016-10-31 2017-05-24 上海大学 基于金纳米粒子的靶向表皮生长因子受体egfr的人工抗体及其制备方法
CN108822214A (zh) * 2018-06-18 2018-11-16 上海大学 一种多肽及其抗弹性蛋白酶的金纳米抗体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Strong in Vivo Maturation Compensates for Structurally Restricted H3 Loops in Antibody Repertoires;Erwin De Genst et al.;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20050119;第280卷(第14期);14114-14121 *

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