CN114316054A - 一种基于银纳米粒子的人工抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于银纳米粒子的人工抗体及其制备方法，以银纳米粒子充当多肽骨架，通过构象工程方法重建多肽片段的天然构象，进而在银纳米粒子上重现溶菌酶天然抗体的功能，进一步验证了构象工程方法的普适性，拓展了应用范围。该方法制备的人工抗体与对应抗原结合特异性强，稳定性好，更具经济性，为靶向治疗、人工抗体和纳米载药等方面提供了一种全新思路，在生物医学领域有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及纳米医学领域，特别是涉及一种以银纳米粒子作为多肽骨架，基于银纳米粒子的人工抗体及其制备方法。
背景技术
随着纳米技术的发展，纳米材料在医学领域的应用也越来越广泛。贵金属纳米材料比如金、银、铂等因为合成方法简单、表面易功能化和具有较低生物毒性等优点，在生物成像，药物递送与靶向，以及疾病治疗等领域具有巨大的应用前景。
公开号为CN105884888A的专利文献公开的“构象工程”这一设计方法，其中一个实例就是将来源于溶菌酶天然抗体互补决定簇区的、单独存在时并没有功能的多肽片段的两端锚定在金纳米粒子表面，通过调节多肽两端在金纳米粒子表面的跨度，成功实现对这一段柔性多肽构象的控制，制备出了可以特异性结合溶菌酶的纳米人工抗体—金抗体。
金抗体的研制成功证明了利用构象工程方法去开发人工抗体的可行性，但是金本身成本过高，寻求金纳米粒子的替代物可大大降低经济成本。贵金属纳米材料中银纳米粒子较金纳米粒子活泼，具有与金纳米粒子相似的物理化学特性，也可通过与半胱氨酸形成Ag-S键将多肽修饰在表面，价格较低,极具开发前景和应用价值。但目前尚未有关于利用银纳米粒子制备纳米人工抗体的相关报道。
发明内容
本发明的目的是通过构象工程方法进一步探索在金纳米粒子以外的纳米粒子上进行多肽片段构象重建的可能性，寻求金纳米粒子的替代物，可作为多肽的骨架，从而降低成本，提供一种基于银纳米粒子的人工抗体及其制备方法。然而受限于自身特性，并不是所有金属纳米粒子都可应用此构象工程方法,通过大量实验摸索,本发明开发了以银纳米粒子作为多肽片段的骨架的人工抗体—银抗体,可用于溶菌酶检测等应用。银抗体相比金抗体的开发可进一步降低生产成本,更具经济性。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种基于银纳米粒子的人工抗体，将取自溶菌酶天然抗体决定簇互补区的多肽进行改造,两端加上半胱氨酸,通过S-Ag键锚定在银纳米粒子上,通过调整多肽两端在银纳米粒子表面跨度，重建多肽天然构象,从而在银纳米粒子上再现抗溶菌酶天然抗体的功能,以银纳米粒子作为骨架，形成可特异性结合溶菌酶的抗溶菌酶纳米人工抗体。
优选地，所述多肽在银纳米颗粒表面的密度范围为0.2-2条/平方纳米表面积。
优选地，调整多肽两端跨度方法通过改变多肽在银纳米粒子表面密度，或者使用带巯基分子如聚乙二醇、半胱氨酸中的至少一种共价结合在银纳米粒子表面。
一种本发明基于银纳米粒子的人工抗体的制备方法，包括以下步骤：将银纳米粒子与取自天然抗体决定簇互补区的无功能多肽溶液混合反应，通过构象工程方法进行调控,使多肽分子两端锚定在银纳米粒子表面，得到基于银纳米粒子的人工抗体。
优选地，采用颗粒直径为2-200nm的银纳米粒子，按照在1nm2银纳米粒子表面积上锚定0.2-2个多肽的比例，将银纳米粒子与多肽溶液混合进行反应，使多肽分子两端锚定在银纳米粒子表面，得到基于银纳米粒子的人工抗体。
优选地，在室温下，将银纳米粒子与多肽溶液混合搅拌至少600-720min，进行反应。
优选地，采用颗粒直径为4.5-100nm的银纳米粒子，按照在1nm2银纳米粒子表面积上锚定1.1-2个多肽的比例，将银纳米粒子与多肽溶液进行混合。
一种本发明基于银纳米粒子的人工抗体在制备溶菌酶检测试剂中的应用。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
1.本发明首次在银纳米粒子表面，采用构象工程方法重建无功能多肽天然构象，合成了可特异性结合抗原的银抗体,更具经济性，在溶菌酶检测等具有应用价值；
2.本发明抗溶菌酶银纳米抗体和HEWL可发生极强的特异性结合，提高了基于银纳米粒子的人工抗体的应用前景，应用场景更加丰富；
3.本发明方法多肽在在银纳米粒子上接枝率高，易于控制，成本较低。
附图说明
图1为本发明基于银纳米粒子制备靶向溶菌酶人工抗体设计原理图。
图2为本发明优选实施例的多肽嫁接到银纳米粒子前后游离多肽的荧光光谱图。
图3为本发明优选实施例制备抗溶菌酶银纳米抗体通过测活验证特异性结合溶菌酶图。
图4为本发明优选实施例制备的抗溶菌酶银纳米抗体通过SPR验证特异性结合溶菌酶图。
图5为本发明优选实施例制备的抗溶菌酶银纳米抗体的结合示意图。
具体实施方式图
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明优选实施例使用公开号为CN105884888A的专利文献公开的，根据cAb-Lys3的CDR3的多肽片段设计的Pep1,序列为
Cys-Gly-Ser-Thr-Ile-Tyr-Ala-Ser-Tyr-Tyr-Glu-Ser-Gly-His-Gly-Cys。
本发明优选实施例通过S-Ag键将多肽修饰到银纳米粒子的表面，采用构象工程方法调控多肽两端在银纳米粒子表面跨度，从而重建Pep1天然构象，在银纳米粒子上重现天然抗体的功能，制备出以银纳米粒子作为骨架的人工抗体。
本发明优选实施例基于银纳米粒子的人工抗体按如下方法制备：2-100nm的银纳米粒子合成结束后，按照1nm2银纳米粒子0.2-2个多肽比例，立即与一定浓度多肽溶液混合，室温下反应1-720min，使多肽分子两端锚定在银纳米粒子表面，得到基于银纳米粒子的人工抗体。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
抗溶菌酶银纳米抗体及其制备方法
1.多肽环区的选取：
使用公开号为CN105884888A的专利文献公开的，来源于骆驼的抗溶菌酶抗体(cAb-Lys3)的抗体决定簇互补区(CDR3)的多肽片段，如图1和图5所示，P1对应Pep1，P1s对应Pep2，P1m为去掉P1中一端半胱氨酸，和P1s均作为P1的对照。
2.抗溶菌酶银纳米抗体的制备：
使用柠檬酸根保护的直径为4.5nm的银纳米粒子。取合成的银纳米粒子溶液按银纳米粒子表面积1nm2嫁接1.1个多肽比例在室温下混合搅拌12h，多肽通过自身氨基酸序列带有的巯基通过S-Ag键嫁接到银纳米粒子上，制备出抗溶菌酶银纳米抗体Ag-P1以及两个对照组Ag-P1m和Ag-P1s。图2是多肽按银纳米粒子表面积1nm2嫁接2个多肽比例嫁接前后的荧光强度，可知反应后溶液中几乎不含游离的多肽，多肽在所述密度范围内在银纳米粒子上接枝率近100％。
3.抗溶菌酶银纳米抗体的生物活性：
抗溶菌酶银纳米抗体可与溶菌酶(HEWL)结合，并且是特异性结合，在溶菌酶紫外测活实验中，如图3所示，使用和溶菌酶性质相似的核糖核酸酶(RNaseA)作为干扰，可见抗溶菌酶银纳米抗体AgNP-60P1在5倍浓度RNaseA和HEWL无论是共同孵育还是先加入RNaseA作为干扰，均能够强烈的抑制溶菌酶的活性，对照肽P1s修饰后的银纳米粒子对溶菌酶的结合为非特异性，AgNP-60P1s对于溶菌酶的抑制明显低于AgNP-60P1。此外，通过SPR技术测定人工抗体与蛋白的结合强度，BSA、IgG和Fib为血清中含量比较丰富的三种蛋白，作为对照蛋白，与目标蛋白HEWL分别固定在CM5芯片不同通道上，流动相为AgNP-60P1和其对照组AgNP-60P1m、AgNP-60P1s，如图4所示，与对照组相比，抗溶菌酶银纳米抗体与目标蛋白HEWL产生较强结合，再次表明了抗溶菌酶银纳米抗体可与HEWL结合，并且结合是特异性的。
综上所述，通过溶菌酶紫外测活方法与SPR技术证明抗溶菌酶银纳米抗体和HEWL可发生极强的特异性结合。本实施例基于银纳米粒子的人工抗体及其制备方法，以银纳米粒子充当多肽骨架，通过构象工程方法重建多肽片段的天然构象，进而在银纳米粒子上重现溶菌酶天然抗体的功能，进一步验证了构象工程方法的普适性，拓展了应用范围。本发明方法制备的人工抗体与对应抗原结合特异性强，稳定性好，更具经济性，为靶向治疗、人工抗体和纳米载药等方面提供了一种全新思路，在生物医学领域有广阔的应用前景。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种基于银纳米粒子的人工抗体，其特征在于，将取自溶菌酶天然抗体决定簇互补区的多肽进行改造,两端加上半胱氨酸,通过S-Ag键锚定在银纳米粒子上,通过调整多肽两端在银纳米粒子表面跨度，重建多肽天然构象,从而在银纳米粒子上再现抗溶菌酶天然抗体的功能,以银纳米粒子作为骨架，形成可特异性结合溶菌酶的抗溶菌酶纳米人工抗体。
2.根据权利要求1所述基于银纳米粒子的人工抗体,其特征在于：所述多肽在银纳米颗粒表面的密度范围为0.2-2条/平方纳米表面积。
3.根据权利要求1所述基于银纳米粒子的人工抗体,其特征在于：调整多肽两端跨度方法通过改变多肽在银纳米粒子表面密度，或者使用带巯基分子如聚乙二醇、半胱氨酸中的至少一种共价结合在银纳米粒子表面。
4.一种权利要求1所述基于银纳米粒子的人工抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将银纳米粒子与取自天然抗体决定簇互补区的无功能多肽溶液混合反应，通过构象工程方法进行调控,使多肽分子两端锚定在银纳米粒子表面，得到基于银纳米粒子的人工抗体。
5.根据权利要求4所述基于银纳米粒子的人工抗体的制备方法,其特征在于：采用颗粒直径为2-200nm的银纳米粒子，按照在1nm2银纳米粒子表面积上锚定0.2-2个多肽的比例，将银纳米粒子与多肽溶液混合进行反应，使多肽分子两端锚定在银纳米粒子表面，得到基于银纳米粒子的人工抗体。
6.根据权利要求4所述基于银纳米粒子的人工抗体的制备方法,其特征在于：在室温下，将银纳米粒子与多肽溶液混合搅拌至少600-720min，进行反应。
7.根据权利要求4所述基于银纳米粒子的人工抗体的制备方法,其特征在于：采用颗粒直径为4.5-100nm的银纳米粒子，按照在1nm2银纳米粒子表面积上锚定1.1-2个多肽的比例，将银纳米粒子与多肽溶液进行混合。
8.一种权利要求1所述基于银纳米粒子的人工抗体在制备溶菌酶检测试剂中的应用。
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